BR112020023167A2 - polipeptídeos de citocina ativáveis e métodos de uso destes - Google Patents

Abstract

“polipeptídeos de citocina ativáveis e métodos de uso destes''. a divulgação apresenta proteínas de fusão que são variantes condicionalmente ativas de uma citocina de interesse. em um aspecto, os polipeptídeos de comprimento total da invenção têm atividade de ativação do receptor de citocina reduzida ou mínima, embora contenham um polipeptídeo de citocina funcional. após a ativação, por exemplo, por clivagem, de um ligante que se une a uma fração de bloqueio, por exemplo, um polipeptídeo de bloqueio estérico, em sequência à citocina ativa, a citocina pode ligar seu receptor e efetuar a sinalização. normalmente, as proteínas de fusão compreendem ainda um elemento de prolongamento da meia-vida in vivo, que pode ser clivado a partir da citocina no microambiente tumoral.

Description

“POLIPEPTÍDEOS DE CITOCINA ATIVÁVEIS E MÉTODOS DE USO DESTES” PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 62/671,225, depositado em 14 de maio de 2018, Pedido Provisório dos US No. 62/756,504, apresentado em 6 de novembro de 2018, Pedido Provisório US No. 62/756,515, apresentado em 6 de novembro 2018, e o Pedido Provisório US No. 62/756,507, depositado em 6 de novembro de 2018.Os ensinamentos completos dos pedidos acima são incorporados neste documento por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 14 de maio de 2019, é denominada 105365-0020_SL.txt e tem um tamanho de 866.384 bytes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] O desenvolvimento de células linfoides imunocompetentes maduras a partir de precursores menos comprometidos, suas subsequentes respostas imunes dirigidas por antígenos e a supressão dessas e respostas autorreativas indesejadas são altamente dependentes e reguladas por citocinas (incluindo interleucina-2 [IL-2], IL- 4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21) que utilizam receptores na família da cadeia γ comum (γc) (Rochman et al., 2009) e membros da família, incluindo IL-12, 18 e 23. A IL-2 é essencial para o desenvolvimento tímico de células Treg e regula criticamente vários aspectos importantes de células Treg periféricas maduras e células T convencionais ativadas por antígeno. Por causa de sua potente atividade de fator de crescimento de células T in vitro, IL-2 foi extensivamente estudada em parte porque esta atividade ofereceu um meio potencial para aumentar diretamente a imunidade, por exemplo, em pacientes com câncer e AIDS-HIV, ou um alvo para antagonizar respostas indesejadas, por exemplo, rejeição de transplante e doenças autoimunes. Embora estudos in vitro com IL-2 forneçam uma forte justificativa para esses estudos, a função de IL-2 in vivo é claramente muito mais complexa, conforme ilustrado pela primeira vez em camundongos deficientes em IL-2, onde uma síndrome autoimune letal rápida, não falta imunidade, foi observada (Sadlack et al., 1993, 1995). Observações semelhantes foram feitas posteriormente quando os genes que codificam IL-2Rα (Il2ra) e IL-2Rβ (Il2rb) sofreram ablação individual (Suzuki et al., 1995; Willerford et al., 1995).

[004] A presente invenção refere-se a citocinas condicionalmente ativas e/ou direcionadas para uso no tratamento de câncer e outras doenças dependentes de regulação imune positiva ou negativa. Por exemplo, a atividade antitumoral de algumas citocinas é bem conhecida e descrita e algumas citocinas já foram utilizadas terapeuticamente em humanos. Citocinas, como interleucina- 2 (IL-2) e interferon α (IFNα), mostraram atividade antitumoral positiva em pacientes com diferentes tipos de tumores, como carcinoma metastático renal, leucemia de células pilosas, sarcoma de Kaposi, melanoma, mieloma múltiplo e o gostar. Outras citocinas como IFNβ, o Fator de Necrose Tumoral (TNF) α, TNFβ, IL-1, 4, 6, 12, 15 e os CSFs têm mostrado certa atividade antitumoral sobre alguns tipos de tumores e, portanto, são objeto de estudos adicionais.

SUMÁRIO

[005] São fornecidas neste documento proteínas terapêuticas, ácidos nucleicos que codificam as proteínas e composições e métodos de uso das proteínas e ácidos nucleicos para o tratamento de uma doença ou distúrbio, como doença proliferativa, doença tumoral, doença inflamatória, distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, doença do enxerto contra o hospedeiro e semelhantes.

[006] A invenção apresenta proteínas de fusão que são variantes condicionalmente ativas de uma citocina de interesse. Em um aspecto, os polipeptídeos de comprimento total da invenção têm atividade de ativação do receptor de citocina reduzida ou mínima, embora contenham um polipeptídeo de citocina funcional.

Após a ativação, por exemplo, por clivagem de um ligante peptídico que se junta a uma fração de bloqueio, por exemplo, um polipeptídeo bloqueador estérico, em sequência para a citocina ativa, a citocina, por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IFNalfa, IFNbeta, IFNgama, TNFalfa, linfotoxina, TGF-beta1, TGFbeta2, TGFbeta3, GM-CSF, CXCL10, CCL19, CCL20, CCL21 ou fragmento funcional ou muteína de qualquer um dos anterior, pode ligar-se ao seu receptor e efetuar a sinalização.

Se desejado, os polipeptídeos de comprimento total podem incluir uma fração de polipeptídeo de bloqueio que também fornece propriedades vantajosas adicionais.

Por exemplo, o polipeptídeo de comprimento total pode conter uma fração de polipeptídeo de bloqueio que também prolonga a meia-vida sérica e/ou direciona o polipeptídeo de comprimento total para um sítio desejado de atividade de citocina.

Alternativamente, os polipeptídeos de fusão de comprimento total podem conter um elemento de prolongamento da meia-vida sérica e/ou domínio de direcionamento que são distintos da fração de polipeptídeo de bloqueio.

Preferencialmente, a proteína de fusão contém pelo menos um elemento ou domínio capaz de prolongar a meia-vida circulante in vivo.

Preferencialmente, este elemento é removido enzimaticamente na localização corporal desejada (por exemplo, clivagem de protease no microambiente tumoral), restaurando as propriedades farmacocinéticas para a molécula de carga útil (por exemplo, IL2 ou IFNa) substancialmente semelhante à molécula de carga útil de ocorrência natural.

As proteínas de fusão podem ser direcionadas a uma célula ou tecido desejado.

Conforme descrito neste documento, o direcionamento é realizado por meio da ação de uma fração de polipeptídeo de bloqueio que também se liga a um alvo desejado, ou através de um domínio de direcionamento.

O domínio que reconhece um antígeno alvo em um alvo preferido (por exemplo, um antígeno específico de tumor) pode ser anexado à citocina por meio de um ligante peptídico clivável ou não clivável.

Se ligado por um ligante peptídico não clivável, o domínio de direcionamento pode auxiliar ainda mais na retenção da citocina no tumor e pode ser considerado um domínio de retenção.

O domínio de direcionamento não precisa necessariamente estar diretamente ligado à molécula de carga útil e pode ser ligado diretamente a outro elemento da proteína de fusão. Isso é especialmente verdadeiro se o domínio de direcionamento for anexado por meio de um ligante peptídico clivável.

[007] Em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo de fusão compreendendo um polipeptídeo de citocina, ou fragmento funcional ou muteína do mesmo, e uma fração de bloqueio, por exemplo, um domínio de bloqueio estérico. A fração de bloqueio é fundida ao polipeptídeo de citocina, diretamente ou através de um ligante peptídico, e pode ser separada do polipeptídeo de citocina por clivagem (por exemplo, clivagem mediada por protease) do polipeptídeo de fusão no ou próximo ao sítio de fusão ou ligante peptídico ou na fração de bloqueio. Por exemplo, quando o polipeptídeo de citocina é fundido a uma fração de bloqueio através de um ligante peptídico que contém um sítio de clivagem de protease, o polipeptídeo de citocina é liberado da fração de bloqueio e pode ligar seu receptor, mediante clivagem mediada por protease do ligante peptídico. O ligante peptídico é projetado para ser clivado no sítio da atividade de citocina desejada, por exemplo, no microambiente tumoral, evitando a atividade de citocina fora do alvo e reduzindo a toxicidade geral da terapia com citocina.

[008] A fração de bloqueio também pode funcionar como um elemento de prolongamento da meia-vida sérica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende ainda um elemento de prolongamento da meia-vida sérica separado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende ainda um domínio de direcionamento. Em várias modalidades, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica é um polipeptídeo solúvel em água, como polietilenoglicol (PEG) opcionalmente ramificado ou multi-ramificado, albumina sérica humana de comprimento total (HSA) ou um fragmento que preserva a ligação a FcRn, um Fc fragmento, ou um nanobody que se liga a FcRn diretamente ou a albumina de soro humano.

[009] Além dos elementos de prolongamento da meia-vida sérica, as composições farmacêuticas descritas neste documento preferencialmente compreendem pelo menos um ou mais domínios de direcionamento que se ligam a um ou mais antígenos alvo ou uma ou mais regiões em um único antígeno alvo. É contemplado neste documento que um construto polipeptídico da invenção é clivado, por exemplo, em um microambiente específico da doença ou no sangue de um sujeito no sítio de clivagem da protease e que o(s) domínio(s) de direcionamento se ligarão a um antígeno alvo em uma célula-alvo. Pelo menos um antígeno alvo está envolvido e/ou associado a uma doença, distúrbio ou condição. Antígenos alvo exemplificativos incluem aqueles associados a uma doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, uma doença do enxerto contra o hospedeiro ou uma doença do hospedeiro contra o enxerto.

[0010] Em algumas modalidades, um antígeno alvo é uma molécula de superfície celular, como uma proteína, lipídio ou polissacarídeo. Em algumas modalidades, um antígeno alvo é um em uma célula tumoral, célula infectada por vírus, célula infectada por bactérias, glóbulo vermelho danificado, célula de placa arterial ou célula de tecido fibrótico.

[0011] Os antígenos alvo, em alguns casos, são expressos na superfície de uma célula ou tecido doente, por exemplo, um tumor ou uma célula cancerosa. Os antígenos alvo para tumores incluem, mas não estão limitados a proteína alfa de ativação de fibroblastos (FAPa), glicoproteína de trofoblasto (5T4), transdutor de sinal de cálcio associado a tumor 2 (Trop2), Fibronectina EDB (EDB-FN), domínio de fibronectina EIIIB, CGS-2, EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, c-Met, FOLR1, FAP e CEA. As composições farmacêuticas divulgadas neste documento também incluem proteínas que compreendem dois domínios de ligação ao antígeno que se ligam a dois antígenos alvo diferentes conhecidos por serem expressos em uma célula ou tecido doente. Pares exemplares de domínios de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a EGFR/CEA, EpCAM/CEA e HER-2/HER-3.

[0012] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento compreendem independentemente um scFv, um domínio VH, um domínio VL, um domínio não-Ig ou um ligante que se liga especificamente ao antígeno alvo. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam especificamente a uma molécula de superfície celular. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam especificamente a um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam específica e independentemente a um antígeno tumoral selecionado a partir de pelo menos um de EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, cMet, CEA e FOLR1. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam específica e independentemente a dois antígenos diferentes, em que pelo menos um dos antígenos é um antígeno tumoral selecionado de EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, cMet, CEA e FOLR1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de direcionamento serve como um domínio de retenção e é anexado à citocina por meio de um ligante peptídico não clivável.

[0013] Conforme descrito neste documento, a fração de bloqueio de citocina pode se ligar à citocina e, assim, bloquear a ativação do receptor cognato da citocina.

[0014] Esta divulgação também está relacionada a ácidos nucleicos, por exemplo, DNA, RNA, mRNA, que codificam as proteínas condicionalmente ativas aqui descritas, bem como vetores e células hospedeiras que contêm tais ácidos nucleicos.

[0015] Esta divulgação também se refere a composições farmacêuticas que contêm uma proteína condicionalmente ativa, ácido nucleico que codifica a proteína condicionalmente ativa e vetores e células hospedeiras que contêm tais ácidos nucleicos. Normalmente, a composição farmacêutica contém um ou mais carreadores e/ou excipientes fisiologicamente aceitáveis.

[0016] A divulgação também se refere a métodos terapêuticos que incluem a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de uma proteína condicionalmente ativa, ácido nucleico que codifica a proteína condicionalmente ativa, vetor ou células hospedeiras que contêm tal ácido nucleico e composições farmacêuticas de qualquer um dos anteriores. Normalmente, o sujeito tem, ou está em risco de desenvolver, uma doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, um doença do enxerto contra o hospedeiro ou doença do hospedeiro contra o enxerto.

[0017] A divulgação também se refere ao uso de uma proteína condicionalmente ativa, ácido nucleico que codifica a proteína condicionalmente ativa, vetor ou células hospedeiras que contêm tal ácido nucleico e composições farmacêuticas de qualquer um dos anteriores, para o tratamento de um sujeito em necessidade. Normalmente, o sujeito tem, ou está em risco de desenvolver, uma doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, uma doença do enxerto contra o hospedeiro ou doença do hospedeiro contra o enxerto.

[0018] A divulgação também se refere ao uso de uma proteína condicionalmente ativa, ácido nucleico que codifica a proteína condicionalmente ativa, vetor ou células hospedeiras que contêm esse ácido nucleico para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença, como uma doença proliferativa, um doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, uma doença do enxerto contra o hospedeiro ou uma doença do hospedeiro contra o enxerto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0019] A FIG. 1a é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que inclui uma fração de bloqueio. A fração de bloqueio pode opcionalmente funcionar como um domínio de prolongamento da meia-vida sérica. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de um ligante peptídico clivável por protease,

bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, o desenho mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral uma protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor.

[0020] A FIG. 1b é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease em que a HSA (fração de bloqueio) está diretamente ligada à citocina ou quimiocina de interesse, com um sítio de clivagem de protease entre a HSA e a citocina ou quimiocina de interesse. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de um ligante peptídico clivável por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, a protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor.

[0021] A FIG. 1c é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease em que mais de uma HSA (fração de bloqueio) está diretamente ligada à molécula de interesse. Se desejado, um ou mais dos HSA podem ser ligados à citocina ou quimiocina através de um ligante peptídico, tal como um ligante peptídico que contém um sítio de clivagem de protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de um ligante peptídico clivável por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, a protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor. A citocina agora tem propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa (por exemplo, tem meia-vida curta).

[0022] A FIG. 1d é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende mais de uma citocina, do mesmo tipo ou de tipos diferentes, com cada uma das quais estando ligada a um domínio de ligação através de um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de um ligante peptídico clivável por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, o desenho mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral uma protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor.

[0023] A FIG. 2 é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende um polipeptídeo de citocina ou quimiocina, uma fração de bloqueio e um domínio de prolongamento da meia-vida sérica conectados por pelo menos um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de ligantes peptídicos cliváveis por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. Também está ligado a um elemento de prolongamento da meia-vida separado, que prolonga a meia-vida sérica. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, uma protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando assim o elemento de prolongamento da meia-vida sérica e a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor. A citocina agora tem propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa (por exemplo, tem meia-vida curta).

[0024] A FIG. 3 é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende um polipeptídeo de citocina ou quimiocina, uma fração de bloqueio e um domínio de direcionamento conectados por pelo menos um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio e um domínio de direcionamento por meio de um ligante peptídico clivável por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, o desenho mostra que em um microambiente inflamatório ou tumoral uma protease cliva no sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando o domínio de direcionamento e a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor.

[0025] A FIG. 4a é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende um polipeptídeo de citocina ou quimiocina, uma fração de bloqueio, um domínio de direcionamento e um domínio de prolongamento da meia-vida sérica conectados por pelo menos um ligante peptídico clivável por protease, em que o polipeptídeo de citocina e o domínio de direcionamento são conectados por um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que um polipeptídeo de citocina está conectado ao domínio de direcionamento, fração de bloqueio e elemento de prolongamento da meia-vida por meio de peptídeo(s) de ligação clivável(is) por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, a protease cliva em um sítio de clivagem de protease no peptídeo(s) de ligação, liberando o elemento de prolongamento da meia-vida, o domínio de direcionamento e a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor. A citocina agora tem propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa (por exemplo, tem meia-vida curta).

[0026] A FIG. 4b é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende um polipeptídeo de citocina ou quimiocina, uma fração de bloqueio, um domínio de direcionamento e um domínio de prolongamento da meia-vida sérica conectados por pelo menos um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada ao domínio de direcionamento, uma fração de bloqueio e um elemento de prolongamento da meia-vida por meio de peptídeo(s) de ligação clivável(is) por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, a protease cliva em um sítio de clivagem de protease no peptídeo(s) de ligação, liberando o elemento de prolongamento da meia-vida e a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao receptor. A fração de direcionamento permanece ligada, mantendo a citocina no microambiente tumoral. A citocina agora tem propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa (por exemplo, tem meia-vida curta).

[0027] A FIG. 5 é um esquema que ilustra a estrutura de um domínio variável de uma molécula de imunoglobulina. Os domínios variáveis de ambas as cadeias de imunoglobulina leve e pesada contêm três alças hipervariáveis, ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Os três CDRs de um domínio V (CDR1, CDR2, CDR3) agrupam-se em uma extremidade do barril beta. As CDRs são as alças que conectam as fitas beta B-C, C'-C" e F-G da dobra da imunoglobulina, enquanto as alças inferiores que conectam as fitas beta AB, CO, C" -D e E-F da dobra da imunoglobulina, e a alça superior que conecta as fitas D-E da dobra da imunoglobulina são as alças não CDR.

[0028] A FIG. 6 é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende uma citocina ou polipeptídeo de quimiocina, uma fração de bloqueio que é um domínio de ligação de albumina sérica (por exemplo, um dAb) e um ligante peptídico clivável por protease. No exemplo ilustrado, as alças não CDR em um domínio de ligação de albumina sérica (por exemplo, um sdAb) podem formar um sítio de ligação para a citocina IL-2. Neste exemplo, o sítio de ligação para albumina sérica pode ser formado pelas CDRs do domínio de ligação de albumina sérica.

[0029] As FIGs. 7a-7h são uma série de gráficos que mostram a atividade de proteínas de fusão de IL-2 exemplares na linhagem de células linfócitos T citotóxicos dependentes de IL-2 CTLL-2. Cada gráfico mostra os resultados do ensaio de proliferação de IL-2 conforme quantificado pelo ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência CellTiter-Glo® (Promega). Cada ensaio de proliferação foi realizado com (FIGs. 7b, 7d, 7f, 7h) ou sem HSA (FIGs. 7a, 7c, 7e, 7g). Cada proteína de fusão compreende um aglutinante anti- HSA, e ambas as versões não clivada e clivada com protease MMP9 da proteína de fusão foram usadas em cada ensaio.

[0030] As FIGs. 8a-8f são uma série de gráficos que mostram a atividade de proteínas de fusão de IL-2 exemplares na linhagem de células linfócitos T citotóxicos dependentes de IL-2 CTLL-2. Cada gráfico mostra os resultados do ensaio de proliferação de IL-2 conforme quantificado pelo ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência CellTiter-Glo (Promega). Ambas as versões da proteína de fusão não clivada e clivada pela protease MMP9 foram usadas em cada ensaio.

[0031] As FIGs. 9a-9z são uma série de gráficos que mostram a atividade de proteínas de fusão de IL-2 exemplares na linhagem de células linfócitos T citotóxicos dependentes de IL-2 CTLL-2. Cada gráfico mostra os resultados do ensaio de proliferação de IL-2 conforme quantificado pelo ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência CellTiter-Glo (Promega). Ambas as versões da proteína de fusão não clivada e clivada pela protease MMP9 foram usadas em cada ensaio.

[0032] A FIG. 10 mostra os resultados do ensaio de clivagem de proteína. A proteína de fusão ACP16 foi corrida em um gel de SDS-PAGE na forma clivada e não clivada. Como pode ser visto no gel, a clivagem foi completa.

[0033] As FIGs. 11a-11b são gráficos que retratam os resultados de um ensaio com repórter de IL-2 HEK-Blue realizados em proteínas de fusão de IL12 p40 humana/p35 murina antes e após a clivagem pela protease. A análise foi realizada com base na quantificação da atividade da Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP) usando o reagente QUANTI-Blue® (InvivoGen). Os resultados confirmam que as proteínas de fusão da proteína IL12 estão ativas.

[0034] As FIGs. 12a-12f mostram uma série de gráficos que retratam os resultados do ensaio com HEK-blue de quatro proteína de fusão de IL-12, antes e após a clivagem por MMP9. A análise foi realizada com base na quantificação da atividade da Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP) usando o reagente QUANTI-Blue (InvivoGen). Os dados mostram maior atividade na IL12 clivada do que na proteína de fusão completa. Os construtos testados foram ACP06 (FIG. 12a), ACP07 (FIG. 12b), ACP08 (FIG. 12c), ACP08 (FIG. 12b), ACP09 (FIG. 12d), ACP10 (FIG. 12e), ACP11 (FIG. 12f).

[0035] A FIG. 13 mostra os resultados de um ensaio de clivagem de proteína. A proteína de fusão ACP11 foi corrida em um gel de SDS-PAGE na forma clivada e não clivada. Como pode ser visto no gel, a clivagem foi completa.

[0036] A FIG. 14 é um esquema que representa um exemplo não limitativo de uma proteína de citocina induzível, em que o construto é ativado após a clivagem por protease de um ligante peptídico ligado entre duas subunidades da citocina.

[0037] As FIGs. 15a-15d são gráficos que retratam os resultados de um ensaio com HEK-Blue realizado em proteínas de fusão de IL12 p40 humana/p35 murina antes e após a clivagem pela protease. O ensaio foi realizado. Os resultados confirmam que as proteínas de fusão da proteína IL12 estão ativas. Cada ensaio de proliferação foi realizado com HSA ou sem HSA.

[0038] As FIGs. 16a-16f são uma série de gráficos que mostram a atividade de proteínas de fusão de IFNγ exemplares em comparação com a atividade do IFNγ controle de camundongo usando um ensaio de sobrevida de células 279 WEHI. Cada ensaio foi realizado com meio contendo HSA (+HSA) ou não contendo HSA (-HSA). Cada proteína de fusão compreende um aglutinante anti-HSA, e ambas as versões não clivada e clivada com protease MMP9 da proteína de fusão foram usadas em cada ensaio.

[0039] As FIGs. 17a-17f são uma série de gráficos que mostram a atividade de proteínas de fusão de IFNγ exemplares em comparação com a atividade do IFNγ controle de camundongo usando um ensaio com repórter B16. Cada ensaio foi realizado com meio contendo HSA (+HSA) ou não contendo HSA (-HSA). Cada proteína de fusão compreende um aglutinante anti-HSA, e ambas as versões não clivada e clivada com protease MMP9 da proteína de fusão foram usadas em cada ensaio.

[0040] As FIGs. 18a-18b mostram os resultados do ensaio de clivagem de proteína, conforme descrito no Exemplo 2. Dois construtos, ACP31 (proteína de fusão IFN-a; FIG. 8a) e ACP55 (proteína de fusão IFN-g; FIG. 8b), foram corridos em um gel SDS-PAGE em ambas as formas clivada e não clivada.

Como pode ser visto no gel, a clivagem foi completa.

[0041] As FIGs. 19a-19b são uma série de gráficos (19a e 19b) que mostram a atividade de proteínas de fusão de IFNγ exemplares antes e após a clivagem pela protease usando um ensaio com repórter B16. Cada ensaio foi realizado com meio de cultura contendo HSA, e cada proteína de fusão compreende um aglutinante anti-HSA. Ambas as versões da proteína de fusão não clivada e clivada pela protease MMP9 foram usadas em cada ensaio.

[0042] As FIGs. 20a-20b são uma série de gráficos (20a e 20b) que mostram a atividade de proteínas de fusão de IFNa exemplares antes e após a clivagem usando um ensaio com repórter B16. Cada ensaio foi realizado com meio contendo HSA, e cada proteína de fusão compreende um aglutinante anti- HSA. Ambas as versões da proteína de fusão não clivada e clivada pela protease MMP9 foram usadas em cada ensaio.

[0043] As FIGs. 21a-21d são uma série de gráficos que representam os resultados de estudos de crescimento tumoral usando a linhagem celular MC38. As FIGs. 21a-c mostram o efeito das proteínas de fusão IFNγ e IFNγ no crescimento do tumor quando injetadas intraperitonealmente (IP) usando diferentes níveis de dosagem e programas (ug = microgramas, BID = duas vezes ao dia, BIW = duas vezes por semana, QW = semanal). A FIG. 21d mostra o efeito da injeção intratumoral (IT) de IFNγ e IL-2 no crescimento do tumor.

[0044] As FIGs. 22a-22b são uma série de gráficos que mostram a atividade de proteínas de fusão de IFNγ exemplares (ACP51 e ACP52) clivadas pela protease MMP9 em comparação com a atividade de proteínas de fusão não clivadas usando o ensaio com repórter B16. Cada proteína de fusão compreende um ligante anti-HSA e um domínio de direcionamento de tumor.

[0045] As FIGs. 23a-23b são uma série de gráficos que mostram a atividade de proteína de fusão de IFNγ exemplares (ACP53 e ACP54) clivadas pela protease MMP9 em comparação com a atividade de proteínas de fusão não clivadas usando o ensaio com repórter B16. Cada proteína de fusão compreende IFNγ diretamente fundido à albumina.

[0046] As FIGs. 24a-24d são gráficos que retratam os resultados de um ensaio com repórter de IL-2 HEK-Blue realizado em proteínas de fusão de IL-2 e IL2 humana recombinante (Rec hIL-2). A análise foi realizada com base na quantificação da atividade da Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP) usando o reagente QUANTI-Blue (InvivoGen).

[0047] As FIGs. 25a e 25b são dois gráficos que mostram a análise de ACP16 (FIG. 25a) e ACP124 (FIG. 25b) em um ensaio repórter HEKBlue IL-2 na presença de HSA. Os círculos representam a atividade do polipeptídeo não cortado, os quadrados representam a atividade do polipeptídeo cortado. A FIG. 25c é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de proliferação CTLL-

2. As células CTLL2 (ATCC) foram semeadas em suspensão a uma concentração de 500.000 células/poço em meio de cultura com ou sem albumina de soro humano (HSA) 40mg/ml e estimuladas com uma série de diluições de hIL2 ativável por 72 horas a 37C e 5% de CO2. A atividade de ACP16 ativável não clivado e clivado foi testada. A hIL2 ativável clivada foi gerada por incubação com MMP9 ativa. A atividade da célula foi avaliada usando um ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência CellTiter-Glo (Promega). Os círculos representam a proteína de fusão intacta e os quadrados representam a proteína de fusão clivada por protease.

[0048] As FIGs. 26a-26c são uma série de gráficos que mostram a atividade de proteínas de fusão em um ensaio com repórter de IL-2 HEKBlue. A FIG. 26a representa a ativação de IL-12/STAT4 em uma comparação de ACP11 (uma proteína de fusão p40 IL12 humana/p35 murina) com ACP04 (controle negativo). A FIG. 26b é um gráfico que mostra a análise de ACP91 (uma proteína de fusão de IL-12 quimérica). Os quadrados representam a atividade do polipeptídeo ACP91 não cortado e os triângulos representam a atividade do polipeptídeo cortado (ACP91 + MMP9). Os valores de EC50 para cada um são mostrados na tabela. A FIG. 26c é um gráfico que mostra a análise de ACP136 (uma proteína de fusão de IL-12 quimérica). Os quadrados representam a atividade do polipeptídeo ACP136 não cortado e os triângulos representam a atividade do polipeptídeo cortado (ACP136 + MMP9). Os valores de EC50 para cada um são mostrados na tabela em anexo.

[0049] As FIGs. 27a-27f são uma série de gráficos que mostram que polipeptídeos de IFNa1 clivados ACP31 (FIG. 27a), ACP 125 (FIG. 27b), ACP 126 (FIG. 27c) são ativos em um ensaio com repórter HEKBlue. Os valores de EC50 para cada construto de IFNa1 são mostrados na tabela abaixo de cada gráfico.

[0050] As FIGs. 28a-n são uma série de gráficos que retratam a atividade de APC56 (FIG. 28a), APC57 (FIG. 8b) APC58 (FIG. 28c), APC59 (FIG. 28d), APC60 (FIG. 28e), APC61 + HSA (FIG. 28f), ACP30 + HSA (FIG. 28g), ACP73 (FIG. 28h), ACP70 + HSA (FIG. 28i), ACP71 (FIG. 28j), ACO 72 (FIG. 28k), ACP 73 (FIG. 28l), ACP74 (FIG. 28m), e ACP75 (FIG. 28n) em um ensaio com repórter de IFNα B16. Cada fusão foi testada quanto à sua atividade quando cortada (quadrados) e não cortada (círculos). A análise de IFNγ murino está incluída em cada gráfico como um comparador.

[0051] As FIGs. 29a-29b são dois gráficos que mostram os resultados da análise de ACP31 (proteína de fusão IFNα1 de camundongo) e ACP11 (uma proteína de fusão p40 IL12 humana/p35 murina) em um modelo de xenoenxerto tumoral. A FIG. 29a mostra o volume do tumor ao longo do tempo em camundongos tratados com 33 μg ACP31 (círculos), 110 μg ACP31 (triângulos), 330 μg ACP31 (losangos) e como controles 1 μg de IFNa1 de tipo selvagem murino (linha tracejada, quadrados) e 10 μg mIFNa1 (linha tracejada, pequenos círculos). O veículo sozinho é indicado por grandes círculos abertos. Os dados mostram que o volume do tumor diminui ao longo do tempo de uma maneira dependente da dose em camundongos tratados com ACP31. A FIG. 29b mostra o volume do tumor ao longo do tempo em camundongos tratados com 17,5μg ACP11 (quadrados), 175μg ACP31 (triângulos), 525μg ACP31 (círculos) e como controles 2μg ACP04 (linha tracejada, triângulos) e 10 μg ACP04 (linha tracejada, losangos). O veículo sozinho é indicado por grandes círculos abertos.

Os dados mostram que o volume do tumor diminui ao longo do tempo de uma maneira dependente da dose em camundongos tratados com ACP11 e ACP04 (uma proteína de fusão p40 IL12 humana/p35 murina).

[0052] A FIG. 30a-30f são uma série de diagramas de espaguete que mostram o volume tumoral ao longo do tempo em um modelo de tumor de xenoenxerto de camundongo em camundongos tratados apenas com o veículo (FIG. 30a), 2μg ACP04 (FIG. 30b), 10μg ACP04 (FIG. 30c), 17,5μg ACP11 (FIG. 30d), 175μg ACP11 (FIG. 30e), e 525μgACP11 (FIG. 30f). Cada linha representa um único camundongo.

[0053] As FIGs. 31a-31c são três gráficos que mostram os resultados da análise de ACP16 e ACP124 em um modelo de xenoenxerto de tumor. A FIG. 31a mostra o volume tumoral ao longo do tempo em camundongos tratados com 4,4μg ACP16 (quadrados), 17μg ACP16 (triângulos), 70μg ACP16 (triângulos virados para baixo), 232μg ACP16 (círculos escuros), e um comparador com 12μg de IL-2 do tipo selvagem (linha tracejada, triângulos) e com 36μg de IL-2 do tipo selvagem (linha tracejada, losangos. O veículo sozinho é indicado por grandes círculos abertos. Os dados mostram o volume tumoral diminuindo ao longo do tempo de uma forma dependente da dose em camundongos tratados com ACP16 em concentrações maiores. A FIG. 31b mostra o volume tumoral ao longo do tempo em camundongos tratados com 17μg ACP124 (quadrados), 70μg ACP124 (triângulos), 230μg ACP124 (triângulos virados para baixo), e 700μg ACP124. O veículo sozinho está indicado por grandes círculos abertos. A FIG. 31c mostra o volume tumoral ao longo do tempo em camundongos tratados com 17μg ACP16 (triângulos), 70μg ACP16 (círculos), 232μg ACP16 (círculos escuros), e como um comparador 17μg ACP124 (linha tracejada, triângulos) 70μg ACP124 (linha tracejada, losangos), 230μg ACP124 (linha tracejada, losangos). O veículo sozinho é indicado por triângulos escuros para baixo. Os dados mostram que o volume do tumor diminui ao longo do tempo de uma maneira dependente da dose em camundongos tratados com ACP16, mas não com ACP124.

[0054] As FIGs. 32a-32c são uma série de diagramas de espaguete que mostram a atividade de proteínas de fusão em um modelo de xenoenxerto de camundongo MC38 correspondente aos dados mostrados na FIG. 31. Cada linha nos gráficos é um único camundongo.

[0055] A FIG. 33 é um gráfico que mostra o volume do tumor ao longo do tempo em um modelo de xenoenxerto de camundongo que mostra o crescimento do tumor em camundongos de controle (círculos abertos) e camundongos tratados com AP16 (quadrados).

[0056] As FIGs. 34a-34d são uma série de gráficos de sobrevivência mostrando a sobrevivência de camundongos ao longo do tempo após o tratamento com proteínas de fusão cliváveis. A FIG. 34a mostra os dados para camundongos tratados apenas com veículo (linha cinza), 17μg ACP16 (linha escura) e 17μg ACP124 (linha tracejada). A FIG. 34b mostra os dados para camundongos tratados apenas com veículo (linha cinza), 70μg ACP16 (linha escura) e 70μg ACP124 (linha tracejada). A FIG. 34c mostra os dados para camundongos tratados apenas com veículo (linha cinza), 232μg ACP16 (linha escura) e 230μg ACP124 (linha tracejada). A FIG. 34d mostra os dados para camundongos tratados apenas com veículo (linha cinza), 232μg ACP16 (linha escura) e 700μg ACP124 (linha tracejada).

[0057] A FIG. 35 é uma série de diagramas de espaguete que mostram a atividade de proteínas de fusão em um modelo de xenoenxerto de camundongo MC38. Todos os grupos de camundongos receberam quatro doses no total, exceto para as três doses mais altas de APC132, em que a toxicidade fatal foi detectada após 1 semana/2 doses. São mostrados apenas o veículo (parte superior), 17, 55, 70 e 230 μg ACP16 (linha superior completa), 9, 28, 36 e 119 μg ACP132 (linha inteira do meio) e 13, 42, 54 e 177 μg ACP21 (linha inteira inferior). Cada linha nos gráficos representa um animal individual.

[0058] As FIGs. 36-41 ilustram as propriedades dos polipeptídeos TriTAC, que servem como proteínas de fusão cliváveis por protease exemplares.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0059] São divulgados neste documento métodos e composições para projetar e usar construtos que compreendem citocinas induzíveis. As citocinas são potentes agonistas imunológicos, o que as leva a serem consideradas agentes terapêuticos promissores para a oncologia. No entanto, as citocinas provaram ter uma janela terapêutica muito estreita. As citocinas têm meia-vida sérica curta e também são consideradas altamente potentes. Consequentemente, a administração terapêutica de citocinas produziu efeitos sistêmicos indesejáveis e toxicidades. Estes foram exacerbados pela necessidade de administrar grandes quantidades de citocina para atingir os níveis desejados de citocina no sítio pretendido de ação da citocina (por exemplo, um tumor). Infelizmente, devido à biologia das citocinas e à incapacidade de direcionar e controlar efetivamente sua atividade, as citocinas não alcançaram as vantagens clínicas esperadas no tratamento de tumores.

[0060] São divulgadas neste documento proteínas de fusão que superam a toxicidade e os problemas de meia-vida curta que limitaram severamente o uso clínico de citocinas em oncologia. As proteínas de fusão contêm polipeptídeos de citocina que possuem atividade agonista do receptor. Mas, no contexto da proteína de fusão, a atividade agonista do receptor de citocina é atenuada e a meia-vida circulante é prolongada. As proteínas de fusão incluem sítios de clivagem de protease, que são clivados por proteases que estão associadas a um sítio desejado de atividade de citocina (por exemplo, um tumor) e são tipicamente enriquecidos ou seletivamente presentes no sítio de atividade desejada. Assim, as proteínas de fusão são preferencialmente (ou seletivamente) e eficientemente clivadas no sítio de atividade desejado para limitar a atividade da citocina substancialmente ao sítio de atividade desejado, tal como o microambiente tumoral. A clivagem de protease no sítio de atividade desejado, tal como em um microambiente tumoral, libera uma forma da citocina da proteína de fusão que é muito mais ativa como um agonista do receptor de citocina do que a proteína de fusão (tipicamente pelo menos cerca de 100X mais ativa do que o proteína de fusão). A forma da citocina que é liberada após a clivagem das proteases específicas de tumor de fusão libera a atividade total da interleucina no sítio desejado e também a separa do prolongamento da meia- vida da versão não clivada. Nessas modalidades, a interleucina totalmente ativa e livre teria propriedades farmacocinéticas (PK) muito diferentes – uma meia- vida de horas, em vez de semanas. Além disso, a exposição à citocina ativa é limitada ao sítio da atividade desejada da citocina (por exemplo, um sítio inflamatório ou tumor) e a exposição sistêmica à citocina ativa, e toxicidade e efeitos colaterais associados, são reduzidos.

[0061] A menos que definido de outro modo, todos os termos da técnica, notações e outros termos científicos ou terminologia utilizados neste documento são destinados a ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica aos quais pertence esta invenção. Em alguns casos, termos com significados comumente compreendidos são definidos neste documento para clareza e/ou para referência pronta, e a inclusão de tais definições neste documento não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença sobre o que é geralmente entendido na técnica. As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados aqui são geralmente bem compreendidos e comumente empregados usando metodologias convencionais por aqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, as metodologias de clonagem molecular amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4ª ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Conforme apropriado, os procedimentos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis no mercado geralmente são realizados de acordo com os protocolos e condições definidos pelo fabricante, a menos que indicado de outra forma.

[0062] "Citocina" é um termo bem conhecido da técnica que se refere a qualquer uma de uma classe de proteínas imunorreguladoras (como interleucina ou interferon) que são secretadas por células, especialmente do sistema imunológico e que são moduladores do sistema imunológico. Os polipeptídeos de citocina que podem ser usados nas proteínas de fusão aqui divulgadas incluem, mas não estão limitados a fatores de crescimento de transformação, tais como TGF-α e TGF-β (por exemplo, TGFbeta1, TGFbeta2, TGFbeta3); interferons, tais como interferon-α, interferon-β, interferon-γ, interferon-kappa e interferon-ômega; interleucinas, como IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21 e IL- 25; fatores de necrose tumoral, como fator de necrose tumoral alfa e linfotoxina; quimiocinas (por exemplo, quimiocina de motivo C-X-C 10 (CXCL10), CCL19, CCL20, CCL21) e fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CS), bem como fragmentos de tais polipeptídeos que ativam os receptores cognatos para a citocina (ou seja, fragmentos funcionais dos anteriores)."Quimiocina" é um termo da técnica que se refere a qualquer um de uma família de pequenas citocinas com a capacidade de induzir quimiotaxia dirigida em células responsivas próximas.

[0063] As citocinas são bem conhecidas por terem meia-vida sérica curta, que frequentemente é de apenas alguns minutos ou horas. Mesmo as formas de citocinas que têm sequências de aminoácidos alteradas com a intenção de prolongar a meia-vida sérica, mas retêm a atividade do agonista do receptor, normalmente também têm meia-vida sérica curta. Conforme usado neste documento, uma "citocina de meia-vida curta" refere-se a uma citocina que tem uma meia-vida substancialmente breve circulando no soro de um sujeito, como uma meia-vida sérica que é inferior a 10, inferior a 15, menos de 30, menos de 60, menos de 90, menos de 120, menos de 240 ou menos de 480 minutos. Conforme usado neste documento, uma citocina de meia-vida curta inclui citocinas que não foram modificadas em sua sequência para atingir uma meia- vida mais longa do que o normal no corpo de um sujeito e polipeptídeos que têm sequências de aminoácidos alteradas destinadas a prolongar a meia-vida sérica vida ainda retém a atividade agonista do receptor. Este último caso não se destina a incluir a adição de domínios de proteínas heterólogas, como um elemento de prolongamento da meia-vida genuíno, como albumina sérica.

[0064] "Sortases" são transpeptidases que modificam proteínas reconhecendo e clivando um sinal de classificação de terminal carboxila incorporado ou terminalmente ligado a uma proteína ou peptídeo alvo. A Sortase A catalisa a clivagem do motivo LPXTG (onde X é qualquer aminoácido padrão) entre o resíduo Thr e Gly na proteína alvo, com ligação transitória do resíduo Thr ao resíduo Cys do sítio ativo na enzima, formando um intermediário enzima- tioacila. Para completar a transpeptidação e criar o conjugado peptídeo- monômero, uma biomolécula com um grupo nucleofílico N-terminal, tipicamente um motivo de oligoglicina, ataca o intermediário, deslocando a Sortase A e unindo as duas moléculas.

[0065] Conforme usado neste documento, o termo "bloqueador estérico" refere-se a um polipeptídeo ou fração de polipeptídeo que pode ser covalentemente ligado a um polipeptídeo de citocina direta ou indiretamente através de outras frações, tais como ligantes, por exemplo, na forma de um polipeptídeo quimérico (proteína de fusão), mas de outra forma não se liga covalentemente ao polipeptídeo de citocina. Um bloqueador estérico pode se ligar de forma não covalente ao polipeptídeo de citocina, por exemplo, por ligação eletrostática, hidrofóbica, iônica ou de hidrogênio. Um bloqueador estérico normalmente inibe ou bloqueia a atividade da fração de citocina devido à sua proximidade com a fração de citocina e tamanho comparativo. Um bloqueador estérico também pode bloquear em virtude do recrutamento de um grande parceiro de ligação à proteína. Um exemplo disso é um anticorpo que se liga à albumina sérica; enquanto o próprio anticorpo pode ou não ser grande o suficiente para bloquear a ativação ou ligação por conta própria, o recrutamento de albumina permite um bloqueio estérico suficiente.

[0066] Conforme usado e descrito neste documento, um "elemento de prolongamento da meia-vida" é uma parte do polipeptídeo quimérico que aumenta a meia-vida sérica e melhora a pK, por exemplo, alterando seu tamanho (por exemplo, para ficar acima do limite de filtração renal), forma, raio hidrodinâmico, carga ou parâmetros de absorção, biodistribuição, metabolismo e eliminação.

[0067] Conforme usado neste documento, os termos "ativável", "ativar", "induzir" e "indutível" referem-se à capacidade de uma proteína, ou seja, uma citocina, que faz parte de uma proteína de fusão, de se ligar ao seu receptor e efetuar a atividade sobre clivagem de elementos adicionais da proteína de fusão.

[0068] Conforme usado neste documento, "plasmídeos" ou "vetores virais" são agentes que transportam os ácidos nucleicos divulgados para a célula sem degradação e incluem um promotor que produz a expressão da molécula de ácido nucleico e/ou polipeptídeo nas células nas quais é distribuído.

[0069] Conforme usado neste documento, os termos "peptídeo", "polipeptídeo" ou "proteína" são usados de maneira ampla, significando dois ou mais aminoácidos ligados por uma ligação peptídica. Proteína, peptídeo e polipeptídeo também são usados neste documento de maneira intercambiável para se referir a sequências de aminoácidos. Deve-se reconhecer que o termo polipeptídeo não é usado neste documento para sugerir um tamanho ou quantidade específicos de aminoácidos que compreende a molécula e que um peptídeo da invenção pode conter até inúmeros resíduos de aminoácidos ou mais.

[0070] Conforme usado ao longo do documento, "sujeito" pode ser um vertebrado, mais especificamente um mamífero (por exemplo, um humano, cavalo, gato, cachorro, vaca, porco, ovelha, cabra, camundongo, coelho, rato e porquinho-da-índia), aves, répteis, anfíbios, peixes e qualquer outro animal. O termo não denota uma idade ou sexo específico. Assim, sujeitos adultos e recém-nascidos, sejam do sexo masculino ou feminino, devem ser abrangidos.

[0071] Conforme usado neste documento, "paciente" ou "sujeito" pode ser usado alternadamente e pode se referir a um sujeito com uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer). O termo paciente inclui sujeitos humanos e veterinários.

[0072] Conforme usado neste documento, os termos "tratamento", "tratar" ou "tratar" referem-se a um método de redução dos efeitos de uma doença ou condição ou sintoma da doença ou condição. Assim, no método divulgado, o tratamento pode se referir a pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou redução substancialmente completa na gravidade de uma doença ou condição estabelecida ou sintoma da doença ou condição. Por exemplo, um método para tratar uma doença é considerado um tratamento se houver uma redução de 10% em um ou mais sintomas da doença em um sujeito em comparação com um controle. Assim, a redução pode ser de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou qualquer percentual de redução entre 10% e 100% em comparação com os níveis nativos ou de controle. Entende-se que o tratamento não se refere necessariamente à cura ou ablação completa da doença, condição ou sintomas da doença ou condição.

[0073] Conforme usado neste documento, os termos "prevenir", "prevenir" e "prevenção" de uma doença ou distúrbio referem-se a uma ação, por exemplo, a administração do polipeptídeo quimérico ou sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo quimérico, que ocorre antes ou em aproximadamente ao mesmo tempo, um sujeito começa a mostrar um ou mais sintomas da doença ou distúrbio, que inibe ou retarda o início ou a exacerbação de um ou mais sintomas da doença ou distúrbio.

[0074] Conforme usado neste documento, as referências a "diminuir", "reduzir" ou "inibir" incluem uma mudança de pelo menos cerca de 10%, de pelo menos cerca de 20%, de pelo menos cerca de 30%, de pelo menos cerca de 40%, de pelo menos cerca de 50%, de pelo menos cerca de 60%, de pelo menos cerca de 70%, de pelo menos cerca de 80%, de pelo menos cerca de 90% ou mais em comparação com um nível de controle adequado. Esses termos podem incluir, mas não necessariamente incluem a eliminação completa de uma função ou propriedade, como a atividade agonista.

[0075] Um "agonista do receptor de citocina atenuado" é um agonista do receptor de citocina que diminuiu a atividade agonista do receptor em comparação com o agonista de ocorrência natural do receptor de citocina. Um agonista de citocina atenuado pode ter pelo menos cerca de 10X, pelo menos cerca de 50X, pelo menos cerca de 100X, pelo menos cerca de 250X, pelo menos cerca de 500X, pelo menos cerca de 1000X ou menos atividade agonista em comparação com o agonista de ocorrência natural do receptor. Quando uma proteína de fusão que contém um polipeptídeo de citocina, conforme descrito neste documento, é descrita como "atenuada" ou tendo "atividade atenuada", significa que a proteína de fusão é um agonista do receptor de citocina atenuado.

[0076] Uma "proteína de fusão intacta" é uma proteína de fusão na qual nenhum domínio foi removido, por exemplo, por clivagem de protease. Um domínio pode ser removível por clivagem de protease ou outra atividade enzimática, mas quando a proteína de fusão está "intacta", isso não ocorreu.

[0077] Conforme usado neste documento, "fração" se refere a uma fração de uma molécula que tem uma função distinta dentro dessa molécula, e essa função pode ser realizada por essa fração no contexto de outra molécula. Uma fração pode ser uma entidade química com uma função particular ou uma fração de uma molécula biológica com uma função particular. Por exemplo, uma "fração de bloqueio" dentro de uma proteína de fusão é uma fração da proteína de fusão que é capaz de bloquear a atividade de algum ou de todo o polipeptídeo de fusão. Este pode ser um domínio de proteína, como albumina sérica. O bloqueio pode ser realizado por um bloqueador estérico ou um bloqueador específico. Um bloqueador estérico bloqueia em virtude do tamanho e da posição e não com base na ligação específica; um exemplo é a albumina sérica. Um bloqueador específico bloqueia em virtude de interações específicas com a fração a ser bloqueada. Um bloqueador específico deve ser adaptado para a citocina ou domínio ativo específico; um bloqueador estérico pode ser usado independentemente da carga útil, desde que seja grande o suficiente.

[0078] Em geral, o uso terapêutico de citocinas é fortemente limitado por sua toxicidade sistêmica. O TNF, por exemplo, foi originalmente descoberto por sua capacidade de induzir a necrose hemorrágica de alguns tumores e por seu efeito citotóxico in vitro em diferentes linhagens tumorais, mas posteriormente demonstrou possuir forte atividade pró-inflamatória, que pode, no caso de condições de superprodução, afetar perigosamente o corpo humano. Como a toxicidade sistêmica é um problema fundamental com o uso de quantidades farmacologicamente ativas de citocinas em humanos, novos derivados e estratégias terapêuticas estão agora em avaliação, com o objetivo de reduzir os efeitos tóxicos dessa classe de efetores biológicos mantendo sua eficácia terapêutica.

[0079] A IL-2 exerce funções estimulantes e reguladoras no sistema imunológico e é, junto com outros membros da família de citocinas da cadeia γ comum (γc), central para a homeostase imunológica. IL-2 medeia sua ação pela ligação aos receptores de IL-2 (IL-2R), consistindo em receptores triméricos feitos de cadeias IL-2Rα (CD25), IL-2Rβ (CD122) e IL-2Rγ (γc, CD132) ou IL- 2Rs βγ diméricos (1, 3). Ambas as variantes de IL-2R são capazes de transmitir sinais após a ligação de IL-2. No entanto, os IL-2Rs αβγ triméricos têm uma afinidade cerca de 10-100 vezes maior para IL-2 do que os IL-2Rs βγ diméricos (3), implicando que CD25 confere ligação de alta afinidade de IL-2 ao seu receptor, mas não é crucial para transdução de sinal. Os IL-2Rs triméricos são encontrados em células T ativadas e células T reguladoras CD4+ forkhead box P3 (FoxP3)+ (Treg), que são sensíveis à IL-2 in vitro e in vivo. Por outro lado, células experimentadas com antígeno (memória) CD8+, CD44 de alta memória fenótipo (MP) CD8+ e células natural killer (NK) são dotadas de altos níveis de βγ IL-2Rs diméricos, e essas células também respondem vigorosamente a IL-2 em vitro e in vivo.

[0080] A expressão do IL-2R de alta afinidade é crítica para permitir que as células T respondam a baixas concentrações de IL-2 que está transitoriamente disponível in vivo. A expressão de IL-2Rα está ausente nas células T naive e de memória, mas é induzida após a ativação do antígeno. IL- 2Rβ é expresso constitutivamente por células NK, NKT e células T CD8+ de memória, mas também é induzido em células T naive após a ativação do antígeno. O γc é regulado com muito menos rigor e é expresso constitutivamente por todas as células linfoides. Uma vez que o IL-2R de alta afinidade é induzido pelo antígeno, a sinalização de IL-2R regula positivamente a expressão de IL- 2Rα em parte através da regulação dependente de Stat5 da transcrição de Il2ra (Kim et al., 2001). Este processo representa um mecanismo para manter a expressão do IL-2R de alta afinidade e sustentar a sinalização de IL-2 enquanto permanece uma fonte de IL-2.

[0081] IL-2 é capturado por IL-2Rα através de uma grande superfície de ligação hidrofóbica cercada por uma periferia polar que resulta em uma interação relativamente fraca (Kd 10-8 M) com rápida cinética de ligação on-off. No entanto, o complexo binário IL-2Rα-IL-2 leva a uma mudança conformacional muito pequena em IL-2 que promove associação com IL-2Rβ por meio de uma interação polar distinta entre IL-2 e IL-2Rβ. A afinidade pseudoalta do complexo trimérico IL2/α/β (ou seja, Kd~300 pM) indica claramente que o complexo trimérico é mais estável do que IL2 ligado apenas à cadeia α (Kd = 10 nM) ou à cadeia β sozinho (Kd = 450 nM), conforme mostrado pelos dados de Ciardelli. Em qualquer caso, o trímero IL2/α/β recruta então a cadeia γ para o complexo quaternário capaz de sinalizar, o que é facilitado pelo grande sítio de ligação do composto na cadeia β ligada a IL2 para a cadeia γ.

[0082] Em outras palavras, o complexo ternário IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2 recruta γc através de uma interação fraca com IL-2 e uma interação mais forte com IL-2Rβ para produzir um IL-2R quaternário estável de alta afinidade (Kd 10- 11 M que é 10 pM). A formação do complexo quaternário de alta afinidade IL-2- IL-2R leva à transdução de sinal através das tirosina quinases Jak1 e Jak3, que estão associadas a IL-2Rβ e γc, respectivamente (Nelson e Willerford, 1998). O complexo quaternário IL-2-IL-2R é rapidamente internalizado, onde IL-2, IL-2Rβ e γc são rapidamente degradados, mas IL-2Rα é reciclado para a superfície celular (Hémar et al., 1995; Yu e Malek, 2001). Assim, aquelas atividades funcionais que requerem sinalização sustentada de IL-2R requerem uma fonte contínua de IL-2 para envolver IL-2Rα e formar complexos de sinalização IL-2- IL-2R adicionais.

[0083] A interleucina-15 (IL-15), outro membro da família de citocinas do feixe de 4-alfa-hélice, também surgiu como um imunomodulador para o tratamento do câncer. A IL-15 é inicialmente capturada via IL-15Rα, que é expressa em células dendríticas apresentadoras de antígenos, monócitos e macrófagos. IL-15 exibe ampla atividade e induz a diferenciação e proliferação de células T, B e natural killer (NK) via sinalização através de IL-15/IL-2-R-β (CD122) e da cadeia γ comum (CD132). Também aumenta a atividade citolítica das células T CD8+ e induz células T de memória CD8+CD44 com antígeno de longa duração. A IL-15 estimula a diferenciação e a síntese de imunoglobulinas pelas células B e induz a maturação das células dendríticas. Não estimula as células T reguladoras imunossupressoras (Tregs). Assim, o aumento da atividade da IL-15 seletivamente no microambiente tumoral poderia aumentar a imunidade inata e específica e combater tumores (Waldmann et al., 2012). IL-15 foi inicialmente identificada por sua capacidade de estimular a proliferação de células T de uma maneira semelhante a IL-2 por meio de componentes de receptor comuns (IL-2R/15Rβ-γc) e sinalização por JAK1/JAK3 e STAT3/STAT5. Assim como a IL-2, a IL-15 demonstrou estimular a proliferação de células T CD4-CD8-, CD4+ CD8+, CD4+ e CD8+ ativadas, bem como facilitar a indução de linfócitos T citotóxicos e a geração, proliferação e ativação de Células NK (Waldmann et al., 1999). No entanto, ao contrário da IL-2, que é necessária para manter as células Tregs CD4+CD25+ que expressam a caixa forkhead P3 (FOXP3) e para a retenção dessas células na periferia, a IL-15 tem pouco efeito sobre as Tregs (Berger et al., 2009). Isso é importante porque as Tregs CD4+CD25+ que expressam FOXP3 inibem as células T efetoras, inibindo assim as respostas imunológicas, incluindo aquelas dirigidas contra o tumor. A IL-2 também tem um papel crucial no início da morte celular induzida por ativação (AICD), um processo que leva à eliminação de células T autorreativas, enquanto a IL-15 é um fator anti-apoptótico para células T (Marks-Konczalik et al., 2000).

Foi demonstrado que a IL-15 co-distribuída com vacinas de peptídeo de HIV supera a deficiência de células T CD4+, promovendo a longevidade das células T CD8+ específicas do antígeno e bloqueando a apoptose mediada por TRAIL (Oh et al., 2008). Além disso, a IL-15 promove a manutenção a longo prazo das células T de memória CD8+CD44hi (Kanegane et al., 1996).

[0084] A importância de IL-15 e IL-15Rα para o desenvolvimento de células T e NK é ainda destacada pelo fenótipo de camundongos IL-15Rα−/− e IL-15−/−. Camundongos knockout demonstram diminuição do número de células T CD8+ totais e são deficientes em células T CD8+ de fenótipo de memória, células NK, células NK/T e alguns subconjuntos de linfócitos intraepiteliais intestinais, indicando que IL-15 fornece funções homeostáticas positivas essenciais para esses subconjuntos de células (Lodolce et al., 1996; Kennedy et al., 1998). As semelhanças nos fenótipos dessas duas cepas de camundongos knockout sugerem a importância de IL-15Rα na manutenção de sinais de IL-15 fisiologicamente relevantes.

[0085] A IL-15 é apresentada em trans pela cadeia alfa do receptor de IL-15 para o complexo IL-15Rβγc exibido na superfície das células T e células natural killer (NK) (Han et al., 2011). A cadeia de IL-15Ra desempenha um papel de proteína chaperona, estabiliza e aumenta a atividade de IL-15 (Desbois et al., 2016). Foi demonstrado que a IL-15 exógena pode ter um impacto limitado em pacientes com câncer devido a sua dependência de IL-15Ra frequentemente regulada negativamente em pacientes com câncer. Portanto, a proteína de fusão RLI, composta pelo domínio sushi+ de IL15Ra acoplado por meio de um ligante à IL-15, foi sugerida como uma abordagem alternativa para a terapia com IL15 (Bessard et al., 2009). Verificou-se que a administração de complexos solúveis IL-15/IL-15Rα aumentaram muito a meia-vida sérica de IL-15 e a biodisponibilidade in vivo (Stoklasek et al., 2010).

[0086] Além dos efeitos nas células T e NK, a IL-15 também tem vários efeitos em outros componentes do sistema imunológico. A IL-15 protege os neutrófilos da apoptose, modula a fagocitose e estimula a secreção de IL-8 e do antagonista de IL-1R. Funciona através da ativação de JAK2, p38 e ERK1/2 MAPK, Syk quinase e o fator de transcrição NF-kB (Pelletier et al., 2002). Nos mastócitos, a IL-15 pode atuar como fator de crescimento e inibidor da apoptose. Nessas células, a IL-15 ativa a via JAK2/STAT5 sem a necessidade de ligação γc (Tagaya et al., 1996). A IL-15 também induz a proliferação e diferenciação de linfócitos B e aumenta a secreção de imunoglobulina (Armitage et al., 1995). Também previne a apoptose mediada por Fas e permite a indução de respostas de anticorpos parcialmente independentes do CD4-help (Demerci et al., 2004; Steel et al., 2010). Monócitos, macrófagos e células dendríticas efetivamente transcrevem e traduzem IL-15. Eles também respondem à estimulação de IL-15. Os macrófagos respondem aumentando a fagocitose, induzindo a expressão de IL-8, IL-12 e MCP-1 e secretando IL-6, IL-8 e TNF α (Budagian et al., 2006). As células dendríticas incubadas com IL-15 demonstram maturação com expressão aumentada de CD83, CD86, CD40 e MHC de classe II, também são resistentes à apoptose e mostram secreção aumentada de interferon-γ (Anguille et al., 2009).

[0087] IL-15 também demonstrou ter efeitos em células não hematológicas, incluindo miócitos, adipócitos, células endoteliais e neurais. A IL- 15 tem um efeito anabólico no músculo e pode apoiar a diferenciação das células musculares (Quinn et al., 1995). Estimula os miócitos e as fibras musculares a acumularem proteínas contráteis e é capaz de retardar a perda de massa muscular em ratos com caquexia relacionada ao câncer (Figueras et al., 2004). A IL-15 também demonstrou estimular a angiogênese (Angiolillo et al., 1997) e induzir o crescimento e sobrevivência da microglia (Hanisch et al., 1997).

[0088] A interleucina-7 (IL-7), também da família IL-2/IL-15, é uma citocina pleiotrópica bem caracterizada e é expressa por células estromais, células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos, células de músculo liso e queratinócitos, e após a ativação, por células dendríticas (Alpdogan et al., 2005). Embora tenha sido originalmente descrito como um fator de crescimento e diferenciação para linfócitos B precursores, estudos subsequentes mostraram que a IL-7 está criticamente envolvida no desenvolvimento e diferenciação de linfócitos T. A sinalização da interleucina-7 é essencial para a função ideal das células T CD8, homeostase e estabelecimento da memória (Schluns et al., 2000); é necessário para a sobrevivência da maioria dos subconjuntos de células T e sua expressão foi proposta como importante para regular o número de células T.

[0089] A IL-7 se liga a um receptor dimérico, incluindo IL-7Rα e γc para formar um complexo ternário que desempenha papéis fundamentais na remodelação da matriz extracelular, desenvolvimento e homeostase de células T e B (Mazzucchelli e Durum, 2007). A IL-7Rα também apresenta reação cruzada para formar um complexo ternário com linfopoietina estromal tímica (TSLP) e seu receptor (TSLPR), e ativa a via de TSLP, resultando em proliferação de células T e dendríticas em humanos e posterior desenvolvimento de células B em camundongos (Leonard, 2002). A regulação rígida das cascatas de sinalização ativadas pelos complexos são, portanto, cruciais para a função celular normal. A subestimulação da via da IL-7 causada por mutações no ectodomínio IL-7Rα inibe o desenvolvimento de células T e B, resultando em pacientes com uma forma de imunodeficiência combinada grave (SCID) (Giliani et al., 2005; Puel et al., 1998).

[0090] A IL-7 tem um papel potencial no aumento da reconstituição imunológica em pacientes com câncer após quimioterapia citotóxica. A terapia com IL-7 aumenta a reconstituição imunológica e pode aumentar até mesmo a função tímica limitada, facilitando a expansão periférica de até mesmo um pequeno número de emigrantes tímicos recentes. Portanto, a terapia com IL-7 pode potencialmente reparar o sistema imunológico de pacientes que foram esgotados pela quimioterapia citotóxica (Capitini et al., 2010).

[0091] A interleucina-12 (IL-12) é um heterodímero ligado por dissulfeto de duas subunidades codificadas separadamente (p35 e p40), que estão ligadas covalentemente para dar origem à chamada molécula heterodimérica bioativa (p70) (Lieschke et al., 1997; Jana et al., 2014). Além de formar heterodímeros

(IL-12 e IL-23), a subunidade p40 também é segregada como um monômero (p40) e um homodímero (p40 2). É conhecido na técnica que a síntese do heterodímero como uma única cadeia com um ligante conectando o p35 à subunidade p40 preserva a atividade biológica completa do heterodímero. A IL- 12 desempenha um papel crítico na resposta inflamatória inicial à infecção e na geração de células Th1, que favorecem a imunidade mediada por células. Foi descoberto que a superprodução de IL-12 pode ser perigosa para o hospedeiro porque está envolvida na patogênese de uma série de doenças inflamatórias autoimunes (por exemplo, EM, artrite, diabetes tipo 1).

[0092] O receptor de IL-12 (IL-12R) é um complexo heterodimérico que consiste nas cadeias IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2 expressas na superfície de células T ativadas e células natural killer (Trinchieri et al., 2003). A cadeia IL-12Rβ1 se liga à subunidade IL-12p40, enquanto IL-12p35 em associação com IL-12Rβ2 confere uma capacidade de sinalização intracelular (Benson et al., 2011). A transdução de sinal através do IL-12R induz a fosforilação da Janus quinase (Jak2) e da tirosina quinase (Tyk2), que fosforilam e ativam o transdutor de sinal e ativador da transcrição (STAT) 1, STAT3, STAT4 e STAT5. Os efeitos celulares específicos da IL-12 são devidos principalmente à ativação de STAT4. IL-12 induz e células T e natural killer a produzirem citocinas, em particular interferon (IFN)γ, que medeiam muitas das atividades pró-inflamatórias de IL-12, incluindo diferenciação de células T CD4+ em direção ao fenótipo Th1 (Montepaone et al., 2014).

[0093] As células T reguladoras suprimem ativamente a ativação do sistema imunológico e previnem a autorreatividade patológica e a consequente doença autoimune. O desenvolvimento de drogas e métodos para ativar seletivamente células T reguladoras para o tratamento de doenças autoimunes é o assunto de intensa pesquisa e, até o desenvolvimento da presente invenção, que pode distribuir seletivamente interleucinas ativas no local da inflamação, tem sido amplamente malsucedido. As células T reguladoras (Treg) são uma classe de células T CD4+CD25+ que suprimem a atividade de outras células do sistema imunológico. Tregs são centrais para a homeostase do sistema imunológico e desempenham um papel importante na manutenção da tolerância a autoantígenos e na modulação da resposta imunológica a antígenos estranhos. Múltiplas doenças autoimunes e inflamatórias, incluindo diabetes tipo 1 (T1D), lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD), mostraram ter uma deficiência no número de células Treg ou na função Treg.

[0094] Consequentemente, há grande interesse no desenvolvimento de terapias que aumentem o número e/ou função das células Tregs. Uma abordagem de tratamento para doenças autoimunes sendo investigadas é o transplante de células Treg autólogas, ex vivo expandidas (Tang, Q., et al, 2013, Cold Spring Harb. Perspect. Med., 3: 1-15). Embora essa abordagem tenha se mostrado promissora no tratamento de modelos animais de doença e em vários testes clínicos em humanos em estágio inicial, ela requer tratamento personalizado com as próprias células T do paciente, é invasiva e tecnicamente complexa. Outra abordagem é o tratamento com baixa dose de Interleucina-2 (IL-2). As células Treg expressam caracteristicamente altos níveis constitutivos do receptor de alta afinidade IL-2, IL2Rαβγ, que é composto pelas subunidades IL2Rα (CD25), IL2Rβ (CD122) e IL2Rγ (CD132), e o crescimento das células Treg mostrou ser dependente em IL-2 (Malek, TR, et al., 2010, Immunity, 33: 153-65).

[0095] Por outro lado, a ativação imune também foi alcançada usando IL-2, e IL-2 recombinante (Proleukin®) foi aprovado para tratar certos tipos de câncer. A IL-2 em alta dose é usada para o tratamento de pacientes com melanoma metastático e carcinoma de células renais metastático com impacto de longo prazo na sobrevida global.

[0096] Ensaios clínicos de tratamento de dose baixa de IL-2 de GVHD crônica (Koreth, J., et al., 2011, N Engl J Med., 365: 2055-66) e pacientes com vasculite autoimune associada ao VHC (Saadoun, D., et al., 2011, N Engl J Med., 365: 2067-77) demonstraram níveis aumentados de Treg e sinais de eficácia clínica. Novos estudos clínicos investigando a eficácia da IL-2 em várias outras doenças autoimunes e inflamatórias foram iniciados. A justificativa para o uso da chamada dose baixa de IL-2 era explorar a alta afinidade de IL-2 do receptor trimérico de IL-2, que é expresso constitutivamente em Tregs, deixando outras células T que não expressam o receptor de alta afinidade em células inativadas Estado. Aldesleucina (comercializada como Proleukin® por Prometheus Laboratories, San Diego, CA), a forma recombinante de IL-2 usada nesses ensaios, está associada a alta toxicidade. A aldesleucina, em altas doses, é aprovada para o tratamento de melanoma metastático e câncer renal metastático, mas seus efeitos colaterais são tão graves que seu uso só é recomendado em um ambiente hospitalar com acesso a cuidados intensivos (endereço eletrônico: www.proleukin.com/assets/pdf/proleukin.pdf).

[0097] Os ensaios clínicos de IL-2 em doenças autoimunes empregaram doses mais baixas de IL-2 para atingir as células Treg, porque as células Treg respondem a concentrações mais baixas de IL-2 do que muitos outros tipos de células imunes devido à sua expressão de IL2R alfa (Klatzmann D, 2015 Nat Rev Immunol. 15: 283-94). No entanto, mesmo essas doses mais baixas resultaram em problemas de segurança e tolerabilidade, e os tratamentos usados empregaram injeções subcutâneas diárias, cronicamente ou em cursos de tratamento intermitentes de 5 dias. Portanto, há uma necessidade de uma terapia de doença autoimune que potencialize o número e a função das células Treg, que atinja as células Treg mais especificamente do que a IL-2, que seja mais segura e mais tolerável e que seja administrada com menos frequência.

[0098] Uma abordagem que foi sugerida para melhorar o índice terapêutico da terapia baseada em IL-2 para doenças autoimunes é o uso de variantes de IL-2 que são seletivas para células Treg em relação a outras células imunes. Os receptores de IL-2 são expressos em uma variedade de diferentes tipos de células imunes, incluindo células T, células NK, eosinófilos e monócitos, e esse amplo padrão de expressão provavelmente contribui para seu efeito pleiotrópico no sistema imunológico e alta toxicidade sistêmica. Em particular, as células T efetoras ativadas expressam IL2Rαβγ, assim como as células epiteliais pulmonares. Mas, a ativação de células T efetoras vai diretamente contra o objetivo de modulação negativa e controle de uma resposta imune, e a ativação de células epiteliais pulmonares leva a conhecidos efeitos colaterais limitantes da dose de IL-2, incluindo edema pulmonar. Na verdade, o principal efeito colateral da imunoterapia com IL-2 em alta dose é a síndrome de vazamento vascular (VLS), que leva ao acúmulo de fluido intravascular em órgãos como pulmões e fígado com subsequente edema pulmonar e dano às células hepáticas. Não há tratamento de VLS além da retirada de IL-2. Os regimes de dose baixa de IL-2 foram testados em pacientes para evitar VLS, entretanto, às custas de resultados terapêuticos subótimos.

[0099] De acordo com a literatura, acredita-se que a VLS seja causada pela liberação de citocinas pró-inflamatórias de células NK ativadas por IL-2. No entanto, há algumas evidências de que o edema pulmonar resulta da ligação direta de IL-2 às células endoteliais pulmonares, que expressaram níveis baixos a intermediários de IL-2Rs αβγ funcionais. E, o edema pulmonar associado à interação de IL-2 com células endoteliais pulmonares foi anulado pelo bloqueio da ligação a CD25 com um anticorpo monoclonal anti-CD25 (mAb), em camundongos hospedeiros deficientes em CD25 ou pelo uso de complexos IL- 2/anti-IL-2 mAb (IL-2/mAb) específicos para CD122, evitando assim a VLS.

[00100] O tratamento com citocinas de interleucina diferentes de IL-2 tem sido mais limitado. A IL-15 apresenta atividade estimulante de células imunes semelhante à da IL-2, mas sem os mesmos efeitos inibitórios, tornando- a uma candidata imunoterapêutica promissora. Os ensaios clínicos de IL-15 humana recombinante para o tratamento de melanoma maligno metastático ou câncer de células renais demonstraram mudanças apreciáveis na distribuição, proliferação e ativação de células imunes e sugeriram atividade antitumoral potencial (Conlon et. Al., 2014). A IL-15 está atualmente em ensaios clínicos para tratar várias formas de câncer. No entanto, a terapia com IL-15 é conhecida por estar associada a efeitos indesejáveis e tóxicos, como exacerbar certas leucemias, doença do enxerto contra hospedeiro, hipotensão, trombocitopenia e lesão hepática. (Mishra A., et al., Cancer Cell, 2012, 22 (5): 645-55; Alpdogan O. et al., Blood, 2005, 105 (2): 866-73; Conlon KC et al., J Clin Oncol, 2015, 33 (1): 74-82.)

[00101] A IL-7 promove o desenvolvimento de linfócitos no timo e mantém a sobrevivência da homeostase das células T naive e de memória na periferia. Além disso, é importante para a organogênese dos linfonodos (LN) e para a manutenção de células T ativadas recrutadas para os órgãos linfoides secundários (SLOs) (Gao et. Al., 2015). Em ensaios clínicos de IL-7, os pacientes que receberam IL-7 mostraram aumentos nas células T CD4+ e CD8+, sem aumento significativo no número de células T reguladoras monitoradas pela expressão de FoxP3 (Sportes et al., 2008). Em ensaios clínicos relatados em 2006, 2008 e 2010, pacientes com diferentes tipos de câncer, como melanoma metastático ou sarcoma, foram injetados por via subcutânea com diferentes doses de IL-7. Pouca toxicidade foi observada, exceto por febres transitórias e eritema leve. Os níveis circulantes de células T CD4+ e CD8+ aumentaram significativamente e o número de Tregs foi reduzido. A diversidade do repertório de TCR aumentou após a terapia com IL-7. No entanto, a atividade antitumoral de IL-7 não foi bem avaliada (Gao et. Al., 2015). Os resultados sugerem que a terapia com IL-7 pode aumentar e ampliar as respostas imunológicas.

[00102] A IL-12 é uma citocina pleiotrópica, cujas ações criam uma interconexão entre a imunidade inata e adaptativa. A IL-12 foi descrita pela primeira vez como um fator secretado por linhas de células B transformadas por EBV induzidas por PMA. Com base em suas ações, a IL-12 foi designada como fator de maturação de linfócitos citotóxicos e fator estimulante de células natural killer. Devido à ligação entre a imunidade inata e adaptativa e ao estímulo potente da produção de IFNγ, uma citocina que coordena os mecanismos naturais de defesa anticâncer, a IL-12 parecia a candidata ideal para a imunoterapia tumoral em humanos. No entanto, os efeitos colaterais graves associados à administração sistêmica de IL-12 em investigações clínicas e o índice terapêutico muito estreito dessa citocina diminuíram acentuadamente o entusiasmo pelo uso desta citocina em pacientes com câncer (Lasek et. Al., 2014). Abordagens para terapia com IL-12 em que a distribuição da citocina é direcionada ao tumor, o que pode diminuir alguns dos problemas anteriores com terapia com IL-12, estão atualmente em ensaios clínicos para câncer.

[00103] O uso direto da IL-2 como agonista para ligar-se ao IL-2R e modular as respostas imunes terapeuticamente tem sido problemático devido aos seus riscos terapêuticos bem documentados, por exemplo, sua meia-vida sérica curta e alta toxicidade. Esses riscos também limitaram o desenvolvimento terapêutico e o uso de outras citocinas. São necessárias novas formas de citocinas que reduzam esses riscos. São divulgados neste documento composições e métodos compreendendo IL-2 e IL-15 e outras citocinas, fragmentos funcionais e muteínas de citocinas, bem como citocinas condicionalmente ativas projetadas para abordar esses riscos e fornecer a terapêutica imunomoduladora necessária.

[00104] A presente invenção é projetada para abordar as deficiências da terapia direta com IL-2 e terapia usando outras citocinas, por exemplo, usando frações de bloqueio de citocinas, por exemplo, polipeptídeos de bloqueio estérico, polipeptídeos de prolongamento da meia-vida do soro, polipeptídeos de direcionamento, polipeptídeos de ligação, incluindo ligantes peptídicos cliváveis por protease, e combinações dos mesmos. Citocinas, incluindo interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 IL-23), interferons (IFNs, incluindo IFNalfa, IFNbeta e IFNgama), fatores de necrose tumoral (por exemplo, TNFalfa, linfotoxina), fatores de crescimento de transformação (por exemplo, TGFbeta1, TGFbeta2, TGFbeta3), quimiocinas (motivo C-X-C quimiocina 10 (CXCL10), CCL19, CCL20, CCL21) e fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CS) são altamente potentes quando administrados a pacientes. Conforme usado neste documento, "quimiocina" significa uma família de pequenas citocinas com a capacidade de induzir quimiotaxia dirigida em células responsivas próximas. As citocinas podem fornecer terapia poderosa, mas são acompanhadas por efeitos indesejáveis que são difíceis de controlar clinicamente e que limitaram o uso clínico de citocinas. Esta divulgação se refere a novas formas de citocinas que podem ser usadas em pacientes com efeitos indesejados reduzidos ou eliminados. Em particular, esta divulgação se refere a composições farmacêuticas, incluindo polipeptídeos quiméricos (proteínas de fusão), ácidos nucleicos que codificam proteínas de fusão e formulações farmacêuticas das anteriores que contêm citocinas ou fragmentos ativos ou muteínas de citocinas que têm atividade de ativação de receptor de citocina diminuída em comparação com o correspondente citocina. No entanto, sob condições selecionadas ou em um ambiente biológico selecionado, os polipeptídeos quiméricos ativam seus receptores cognatos, muitas vezes com a mesma ou maior potência que a citocina de ocorrência natural correspondente. Conforme descrito neste documento, isso é tipicamente alcançado usando uma fração de bloqueio de citocina que bloqueia ou inibe a função de ativação do receptor da citocina, fragmento ativo ou muteína da mesma sob condições gerais, mas não sob condições selecionadas, tais como aquelas presentes no local desejado de atividade da citocina (por exemplo, um sítio inflamatório ou um tumor).

[00105] Os polipeptídeos quiméricos e ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos quiméricos podem ser feitos usando qualquer método adequado. Por exemplo, ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo quimérico podem ser feitos usando técnicas de DNA recombinante, química sintética ou combinações dessas técnicas e expressos em um sistema de expressão adequado, como em células CHO. Polipeptídeos quiméricos podem ser produzidos de forma semelhante, por exemplo, por expressão de um ácido nucleico adequado, usando técnicas químicas sintéticas ou semissintéticas e semelhantes. Em algumas modalidades, a fração de bloqueio pode ser anexada ao polipeptídeo de citocina por meio de conjugação mediada por sortase. "Sortases" são transpeptidases que modificam proteínas reconhecendo e clivando um sinal de classificação de terminal carboxila incorporado ou terminalmente ligado a uma proteína ou peptídeo alvo. Sortase A catalisa a clivagem do motivo LPXTG (SEQ ID No: 193) (onde X é qualquer aminoácido padrão) entre o resíduo Thr e Gly na proteína alvo, com ligação transitória do resíduo Thr ao resíduo Cys do local ativo na enzima, formando um intermediário enzima-tioacila. Para completar a transpeptidação e criar o conjugado peptídeo- monômero, uma biomolécula com um grupo nucleofílico N-terminal, tipicamente um motivo de oligoglicina, ataca o intermediário, deslocando a Sortase A e unindo as duas moléculas.

[00106] Para formar a proteína de fusão da fração de bloqueio de citocina, o polipeptídeo de citocina é primeiro marcado no terminal N com uma sequência de poliglicina ou, alternativamente, com no terminal C com um motivo LPXTG (SEQ ID NO: 193). A fração de bloqueio ou outro elemento tem respectivos peptídeos anexados que servem como sítios aceitadores para os polipeptídeos marcados. Para a conjugação com domínios que transportam um peptídeo aceitador LPXTG (SEQ ID NO: 193) ligado através de seu terminal N, o polipeptídeo será marcado com um trecho de poliglicina N-terminal. Para a conjugação com o domínio que transporta um peptídeo poliglicina ligado através do seu terminal C, o polipeptídeo será marcado no seu terminal C com uma sequência de reconhecimento de sortase LPXTG (SEQ ID NO: 193). Reconhecendo as sequências de poliglicina e LPXTG (SEQ ID NO: 193), a sortase formará uma ligação peptídica entre o polímero-peptídeo e os polipeptídeos marcados. A reação sortase cliva os resíduos de glicina como intermediários e ocorre em temperatura ambiente.

[00107] Uma variedade de mecanismos pode ser explorada para remover ou reduzir a inibição causada pela fração de bloqueio. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem incluir uma fração de citocina e uma fração de bloqueio, por exemplo, uma fração de bloqueio estérico, com um ligante clivável por protease compreendendo um sítio de clivagem de protease localizado entre a citocina e a fração de bloqueio de citocina ou dentro da fração de bloqueio de citocina. Quando o sítio de clivagem da protease é clivado, a fração de bloqueio pode se dissociar da citocina e a citocina pode então ativar o receptor de citocina. Uma fração de citocina também pode ser bloqueada por uma fração de bloqueio específica, como um anticorpo, que se liga a um epítopo encontrado na citocina relevante.

[00108] Qualquer ligante peptídico adequado pode ser usado. Por exemplo, o ligante peptídico pode compreender glicina-glicina, um motivo de reconhecimento de sortase ou um motivo de reconhecimento de sortase e uma sequência de peptídeos (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 195) ou (Gly3Ser)n, (SEQ ID NO.: 196) em que n é 1, 2, 3, 4 ou 5. Normalmente, o motivo de reconhecimento de sortase compreende uma sequência de peptídeos LPXTG (SEQ ID NO: 193), em que X é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, a ligação covalente é entre um resíduo de lisina reativo ligado ao terminal C do polipeptídeo de citocina e um ácido aspártico reativo ligado ao terminal N do bloqueador ou outro domínio. Em algumas modalidades, a ligação covalente é entre um resíduo de ácido aspártico reativo ligado ao terminal N do polipeptídeo de citocina e um resíduo de lisina reativo ligado ao terminal C de tal bloqueador ou outro domínio.

[00109] Por conseguinte, conforme descrito em detalhes neste documento, as frações de bloqueio de citocina usadas podem ser bloqueadores estéricos. Conforme usado neste documento, um "bloqueador estérico" refere- se a um polipeptídeo ou fração de polipeptídeo que pode ser covalentemente ligado a um polipeptídeo de citocina direta ou indiretamente através de outras frações, tais como ligantes peptídicos, por exemplo, na forma de um polipeptídeo quimérico (proteína de fusão), mas, do contrário, não se liga covalentemente ao polipeptídeo de citocina. Um bloqueador estérico pode se ligar de forma não covalente ao polipeptídeo de citocina, por exemplo, por ligação eletrostática, hidrofóbica, iônica ou de hidrogênio. Um bloqueador estérico normalmente inibe ou bloqueia a atividade da fração de citocina devido à sua proximidade com a fração de citocina e tamanho comparativo. A inibição estérica da fração de citocina pode ser removida separando espacialmente a fração de citocina do bloqueador estérico, tal como clivando enzimaticamente uma proteína de fusão que contém um bloqueador estérico e um polipeptídeo de citocina em um sítio entre o bloqueador estérico e o polipeptídeo de citocina.

[00110] Conforme descrito em mais detalhes neste documento, a função de bloqueio pode ser combinada com ou devido à presença de componentes funcionais adicionais na composição farmacêutica, como um domínio de direcionamento, um elemento de prolongamento da meia-vida sérica e polipeptídeos de ligação cliváveis por protease. Por exemplo, um polipeptídeo que prolonga a meia-vida sérica também pode ser um bloqueador estérico.

[00111] No interesse de apresentar uma divulgação concisa do escopo completo da invenção, aspectos da invenção são descritos em detalhes usando a citocina IL-2 como uma citocina exemplificativa. No entanto, a invenção e esta divulgação não estão limitadas a IL-2. Será claro para um versado na técnica que esta divulgação, incluindo os métodos, polipeptídeos e ácidos nucleicos divulgados, descreve e permite de forma adequada o uso de outras citocinas, fragmentos e muteínas, como IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 IL-23, IFNalfa, IFNbeta, IFNgama, TNFalfa, linfotoxina, TGF-beta1, TGFbeta2, TGFbeta3, GM- CSF, CXCL10, CCL19, CCL20, CCL21 e funcional fragmentos ou muteínas de qualquer um dos anteriores.

[00112] Vários elementos asseguram a entrega e a atividade de IL-2 preferencialmente no local da atividade de IL-2 desejada e limitam severamente a exposição sistêmica à interleucina por meio de uma estratégia de bloqueio e/ou direcionamento preferencialmente ligada a uma estratégia de prolongamento da meia-vida sérica. Nessa estratégia de prolongamento da meia-vida sérica, a versão bloqueada da interleucina circula por períodos prolongados (preferencialmente 1-2 ou mais semanas), mas a versão ativada tem a meia-vida sérica típica da interleucina.

[00113] Em comparação com uma versão prolongada de meia-vida sérica, a meia-vida sérica de IL-2 administrada por via intravenosa é de apenas ~10 minutos devido à distribuição no espaço extracelular do corpo total, que é grande, ~15 L em um adulto de tamanho médio. Posteriormente, a IL-2 é metabolizada pelos rins com meia-vida de ~2,5 horas. (Smith, K. "Interleukin 2 immunotherapy." Therapeutic Immunology 240 (2001)). Por outras medições, IL- 2 tem uma meia-vida plasmática muito curta de 85 minutos para administração intravenosa e 3,3 horas para administração subcutânea (Kirchner, GI, et al., 1998, Br J Clin Pharmacol. 46: 5-10). Em algumas modalidades desta invenção, o elemento de prolongamento da meia-vida está ligado à interleucina por meio de um ligante peptídico que é clivado no sítio de ação (por exemplo, por proteases específicas de inflamação ou tumor), liberando a atividade total da interleucina no sítio desejado e também separando-o do prolongamento da meia- vida da versão não clivada. Em tais modalidades, a interleucina totalmente ativa e livre teria propriedades farmacocinéticas (pK) muito diferentes - uma meia-vida de horas em vez de semanas. Além disso, a exposição à citocina ativa é limitada ao sítio da atividade desejada da citocina (por exemplo, um sítio inflamatório ou tumor) e a exposição sistêmica à citocina ativa e a toxicidade associada e os efeitos colaterais são reduzidos.

[00114] Outras citocinas previstas nesta invenção têm farmacologia semelhante (por exemplo, IL-15 conforme relatado por Blood 2011 117: 4787- 4795; doi: doi.org/10.1182/blood-2010-10-311456) à IL-2 e, consequentemente, os projetos desta invenção aborda as deficiências de usar esses agentes diretamente e fornece polipeptídeos quiméricos que podem ter meia-vida prolongada e/ou ser direcionados a um sítio de atividade desejada (por exemplo, um sítio de inflamação ou um tumor).

[00115] Se desejado, IL-2 pode ser projetada para ligar o complexo IL- 2R geralmente ou uma das três subunidades IL-2R especificamente com uma afinidade que difere daquela da IL-2 de tipo selvagem correspondente, por exemplo, para ativar seletivamente Tregs ou Teff. Por exemplo, os polipeptídeos da IL-2 que se diz terem maior afinidade para a forma trimérica do receptor da IL-2 em relação à forma beta/gama dimérica do receptor da IL-2 em comparação com a IL-2 de tipo selvagem podem ter uma sequência de aminoácidos que inclui um dos seguintes conjuntos de mutações em relação à SEQ ID NO: 1 (uma proteína IL-2 madura compreendendo os aminoácidos 21-153 de IL-2 humana com o Nº de Acesso Uniprot P60568-1): (a) K64R, V69A e Q74P; (b) V69A, Q74P e T101A; (c) V69A, Q74P e I128T; (d) N30D, V69A, Q74P e F103S; (e) K49E, V69A, A73V e K76E; (f) V69A, Q74P, T101A e T133N; (g) N30S, V69A, Q74P e 1128A; (h) V69A, Q74P, N88D e S99P; (i) N30S, V69A, Q74P e 1128T; (j) K9T, Q11R, K35R, V69A e Q74P; (k) A1T, M46L, K49R, E61D, V69A e H79R; (l) K48E, E68D, N71T, N90H, F103S e 1114V; (m) S4P, T10A, Q11R, V69A, Q74P, N88D e T133A; (n) E15K, N30S Y31H, K35R, K48E, V69A, Q74P e 192T; (o) N30S, E68D, V69A, N71A, Q74P, S75P, K76R e N90H; (p) N30S, Y31C, T37A, V69A, A73V, Q74P, H79R e I128T; (q) N26D, N29S, N30S, K54R, E67G, V69A, Q74P e I92T; (r) K8R, Q13R, N26D, N30T, K35R, T37R, V69A, Q74P e I92T; e (s) N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P, N88D e I89V. Esta abordagem também pode ser aplicada para preparar muteínas de outras citocinas, incluindo interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL- 23), interferons (IFNs, incluindo IFNalfa, IFNbeta e IFNgama), fatores de necrose tumoral (por exemplo, TNFalfa, linfotoxina), fatores de crescimento transformadores (por exemplo, TGFbeta1, TGFbeta2, TGFbeta3) e fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CS). Por exemplo, podem ser preparadas muteínas que possuem a afinidade de ligação desejada para um receptor cognato.

[00116] Como observado acima, qualquer um dos polipeptídeos mutantes de IL-2 divulgados neste documento pode incluir as sequências descritas; eles também podem ser limitados às sequências descritas e de outra forma idênticas à SEQ ID NO: 1. Além disso, qualquer um dos polipeptídeos mutantes de IL-2 divulgados neste documento pode incluir opcionalmente uma substituição do resíduo de cisteína na posição 125 por outro resíduo (por exemplo, serina) e/ou pode incluir opcionalmente uma deleção do resíduo de alanina na posição 1 de SEQ ID NO: 1.

[00117] Outra abordagem para melhorar o índice terapêutico de uma terapia baseada em IL-2 é otimizar a farmacocinética da molécula para ativar ao máximo as células Treg. Os primeiros estudos da ação de IL-2 demonstraram que a estimulação de IL-2 da proliferação de células T humanas in vitro exigiu um mínimo de 5-6 horas de exposição a concentrações eficazes de IL-2 (Cantrell, DA, et. Al., 1984, Science, 224: 1312-1316). Quando administrada a pacientes humanos, a IL-2 tem uma meia-vida plasmática muito curta de 85 minutos para administração intravenosa e 3,3 horas para administração subcutânea (Kirchner, GI, et al., 1998, Br J Clin Pharmacol. 46: 5-10). Devido à sua meia-vida curta, manter a IL-2 circulante no nível ou acima do necessário para estimular a proliferação de células T pela duração necessária exige altas doses que resultam em níveis de pico de IL-2 significativamente acima do EC50 para células Treg ou exigirá administração. Estes altos níveis de pico de IL-2 podem ativar os receptores IL2Rβγ e ter outros efeitos indesejados ou indesejados, por exemplo VLS, como observado acima. Um análogo de IL-2 ou uma proteína multifuncional com IL-2 ligada a um domínio que permite a ligação ao receptor FcRn, com uma meia-vida circulante mais longa do que IL-2, pode atingir uma concentração da droga alvo por um período de tempo especificado em uma dose mais baixa do que IL-2 e com níveis de pico mais baixos. Tal análogo de IL-2 irá, portanto, requerer doses mais baixas ou administração menos frequente do que IL-2 para estimular efetivamente as células Treg. A administração subcutânea menos frequente de uma droga de IL-2 também será mais tolerável para os pacientes. Um tratamento com essas características se traduzirá clinicamente em eficácia farmacológica melhorada, toxicidade reduzida e adesão melhorada do paciente à terapia. Alternativamente, a IL-2 ou muteínas de IL-2 (neste documento, "IL-2*") podem ser direcionados seletivamente para o sítio de ação pretendido (por exemplo, sítios de inflamação ou um tumor). Este direcionamento pode ser alcançado por uma de várias estratégias, incluindo a adição de domínios ao agente administrado que compreende bloqueadores da IL-2 (ou muteínas) que são clivados ou por domínios de direcionamento ou uma combinação dos dois.

[00118] Em algumas modalidades, os agonistas parciais de IL-2* podem ser adaptados para se ligarem com maior ou menor afinidade, dependendo do alvo desejado; por exemplo, uma IL-2* pode ser projetada para se ligar com afinidade aumentada a uma das subunidades do receptor e não às outras. Esses tipos de agonistas parciais, ao contrário dos agonistas completos ou antagonistas completos, oferecem a capacidade de ajustar as propriedades de sinalização a uma amplitude que elicia as propriedades funcionais desejadas, embora não atenda aos limites para propriedades indesejadas. Dadas as atividades diferenciais dos agonistas parciais, um repertório de variantes de IL- 2 pode ser projetado para exibir um grau ainda mais fino de atividades de sinalização distintas, variando de quase total a agonismo parcial a antagonismo completo.

[00119] Em algumas modalidades, a IL-2* alterou a afinidade para IL- 2Rα. Em algumas modalidades, a IL-2* tem uma afinidade maior para IL-2Rα do que a IL-2 de tipo selvagem. Em outras modalidades, a IL-2* alterou a afinidade para IL-2Rβ. Em uma modalidade, a IL-2* aumentou a afinidade de ligação para IL-2Rβ, por exemplo, o terminal N de IL-2Rβ, que elimina o requisito funcional para IL-2Rα. Em outra modalidade, é gerada uma IL-2* que tem afinidade de ligação aumentada para IL-2Rβ, mas que exibiu ligação diminuída a IL-2Rγ e, portanto, é heterodimerização e sinalização de IL-2Rβγ defeituosa.

[00120] As frações de bloqueio, descritas em mais detalhes abaixo, também podem ser usadas para favorecer a ligação ou ativação de um ou mais receptores. Em uma modalidade, as frações de bloqueio são adicionadas de modo que a ligação ou ativação de IL-2Rβγ seja bloqueada, mas a ligação ou ativação de IL-2Rα não seja alterada. Em outra modalidade, as frações de bloqueio são adicionadas de modo que a ligação ou ativação de IL-2Rα seja diminuída. Em outra modalidade, as frações de bloqueio são adicionadas de modo que a ligação e/ou ativação de todos os três receptores seja inibida. Este bloqueio pode ser aliviado pela remoção das frações de bloqueio em um ambiente particular, por exemplo, por clivagem proteolítica de um ligante que liga uma ou mais frações de bloqueio à citocina.

[00121] Uma abordagem semelhante pode ser aplicada para melhorar outras citocinas, particularmente para uso como agentes imunoestimulantes, por exemplo, para o tratamento de câncer. Por exemplo, neste aspecto, a farmacocinética e/ou farmacodinâmica da citocina (por exemplo, IL-2, IL-7, IL- 12, IL-15, IL-18, IL-21 IL-23, IFNalfa, IFNbeta e IFNgama, TNFalfa, linfotoxina, TGFbeta1, TGFbeta2, TGFbeta3 GM-CSF, CXCL10, CCL19, CCL20 e CCL21 podem ser adaptados para ativar ao máximo as células efetoras (por exemplo, células T de efeito, células NK) e/ou células promotoras da resposta imune citotóxica (por exemplo, induzir a maturação de células dendríticas) em um sítio de atividade desejada, como em um tumor, mas preferencialmente de forma não sistêmica.

[00122] Assim, são fornecidas neste documento composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um polipeptídeo de citocina, como interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23), interferons (IFNs, incluindo IFNalfa, IFNbeta e IFNgama), fatores de necrose tumoral (por exemplo, TNFalfa, linfotoxina), fatores de crescimento transformadores (por exemplo, TGFbeta1, TGFbeta2, TGFbeta3), quimiocinas (por exemplo, CXCL10, CCL19, CCL20, CCL21) e fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CS) ou um fragmento funcional ou muteína de qualquer um dos anteriores. O polipeptídeo normalmente também inclui pelo menos uma sequência de aminoácidos de ligante peptídico, em que a sequência de aminoácidos é, em certas modalidades, capaz de ser clivada por uma protease endógena. Em uma modalidade, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo HSSKLQ (SEQ ID NO: 25), GPLGVRG (SEQ ID NO: 197), IPVSLRSG (SEQ ID NO: 198), VPLSLYSG (SEQ ID NO. 199) ou SGESPAYYTA (SEQ ID NO. 200). Em outras modalidades, o polipeptídeo quimérico contém ainda uma fração de bloqueio, por exemplo, uma fração de polipeptídeo de bloqueio estérico, capaz de bloquear a atividade do polipeptídeo de interleucina. A fração de bloqueio, por exemplo, pode compreender um domínio de ligação de albumina de soro humano (HSA) ou um polietilenoglicol

(PEG) opcionalmente ramificado ou multi-ramificado. Alternativamente, a composição farmacêutica compreende um primeiro polipeptídeo de citocina ou um fragmento do mesmo e fração de bloqueio, por exemplo, uma fração de polipeptídeo de bloqueio estérico, em que a fração de bloqueio bloqueia a atividade do polipeptídeo de citocina no receptor de citocina, e em que a fração de bloqueio em certas modalidades compreende um domínio clivável por protease. Em algumas modalidades, o bloqueio e a redução da atividade da citocina são alcançados simplesmente anexando domínios adicionais com ligantes peptídicos muito curtos ao terminal N ou C do domínio de interleucina. Em tais modalidades, prevê-se que o bloqueio seja aliviado pela digestão da protease da fração de bloqueio ou do ligante peptídico curto que amarra o bloqueador à interleucina. Uma vez que o domínio é cortado ou liberado, ele não será mais capaz de bloquear a atividade das citocinas.

[00123] A composição farmacêutica, por exemplo, polipeptídeo quimérico pode compreender duas ou mais citocinas, que podem ser o mesmo polipeptídeo de citocina ou polipeptídeos de citocina diferentes. Por exemplo, os dois ou mais tipos diferentes de citocinas têm funções complementares. Em alguns exemplos, uma primeira citocina é IL-2 e uma segunda citocina é IL-12. Em algumas modalidades, cada um dos dois ou mais tipos diferentes de polipeptídeos de citocina tem atividades que modulam a atividade dos outros polipeptídeos de citocina. Em alguns exemplos de polipeptídeos quiméricos que contêm dois polipeptídeos de citocina, um primeiro polipeptídeo de citocina é ativador de células T e um segundo polipeptídeo de citocina é não ativador de células T. Em alguns exemplos de polipeptídeos quiméricos que contêm dois polipeptídeos de citocina, uma primeira citocina é um quimioatraente, por exemplo, CXCL10, e uma segunda citocina é um ativador de células imunes.

[00124] De preferência, os polipeptídeos de citocina (incluindo fragmentos funcionais) que estão incluídos nas proteínas de fusão divulgadas neste documento não são mutados ou modificados para alterar as propriedades da citocina de ocorrência natural, incluindo afinidade de ligação ao receptor e especificidade ou meia-vida sérica. No entanto, alterações na sequência de aminoácidos de citocinas de ocorrência natural (incluindo tipo selvagem) são aceitáveis para facilitar a clonagem e para atingir os níveis de expressão desejados, por exemplo. Fração de Bloqueio

[00125] A fração de bloqueio pode ser qualquer fração que iniba a capacidade da citocina de se ligar e/ou ativar seu receptor. A fração de bloqueio pode inibir a capacidade da citocina de se ligar e/ou ativar seu receptor, bloqueando estericamente e/ou por ligação não covalente à citocina. Exemplos de frações de bloqueio adequadas incluem as completes ou um fragmento de ligação à citocina ou muteína do receptor cognato da citocina. Anticorpos e fragmentos destas, incluindo um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um fragmento variável de cadeia única (scFv), anticorpo de domínio único, tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de nanobody tipo camelídeo (VHH), um dAb e similares, que se ligam à citocina também podem ser usados. Outros domínios de ligação de antígeno adequados que se ligam à citocina também podem ser usados, incluindo proteínas diferentes de imunoglobulinas que imitam a ligação e/ou estrutura do anticorpo, tais como anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz, monobodies, e domínios de ligação baseados em outras proteínas estruturadas modificadas, tais como estruturas de SpA, GroEL, fibronectina, lipocallina e CTLA4. Outros exemplos de polipeptídeos de bloqueio adequados incluem polipeptídeos que inibem estericamente ou bloqueiam a ligação da citocina ao seu receptor cognato. Vantajosamente, essas frações também podem funcionar como elementos de prolongamento da meia-vida. Por exemplo, um peptídeo que é modificado por conjugação com um polímero solúvel em água, tal como PEG, pode inibir estericamente ou prevenir a ligação da citocina ao seu receptor. Polipeptídeos, ou fragmentos dos mesmos, que têm meia-vida sérica longa também podem ser usados, tais como albumina sérica (albumina sérica humana), imunoglobulina Fc, transferrina e semelhantes, bem como fragmentos e muteínas de tais polipeptídeos. Os anticorpos e os domínios de ligação ao antígeno que se ligam a, por exemplo, uma proteína com uma meia-vida sérica longa, como HSA, imunoglobulina ou transferrina, ou a um receptor que é reciclado para a membrana plasmática, como FcRn ou receptor de transferrina, podem também inibem a citocina, particularmente quando ligada ao seu antígeno. Exemplos de tais polipeptídeos de ligação ao antígeno incluem um fragmento variável de cadeia única (scFv), anticorpo de domínio único, como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de nanobody do tipo camelídeo (VHH), um dAb e semelhantes. Outro domínio de ligação ao antígeno adequado que se liga à citocina também pode ser usado, incluindo proteínas não imunoglobulinas que mimetizam a ligação e/ou estrutura de anticorpos, tais como, anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz, monobodies e domínios de ligação com base em outras proteínas estruturadas manipuladas, como estruturas de SpA, GroEL, fibronectina, lipocalina e CTLA4.

[00126] Em exemplos ilustrativos, quando IL-2 é a citocina no polipeptídeo quimérico, a fração de bloqueio pode ser a de comprimento total ou um fragmento ou muteína da cadeia alfa do receptor de IL-2 (IL-2Rα) ou beta (IL-2Rβ) ou cadeia gama do receptor de IL-2 (IL-2Rγ), um anticorpo de domínio único anti-IL-2 (dAb) ou scFv, um Fab, um anticorpo anti-CD25 ou fragmento do mesmo e anti-HAS dAb ou scFv, e semelhantes. Aspectos adicionais da invenção

1. Uma proteína de fusão compreendendo uma fração de citocina que está operacionalmente ligada a uma fração de ligação, a fração de ligação compreendendo uma alça não CDR e um ligante peptídico clivável, em que a fração de ligação é capaz de mascarar a ligação da citocina ao seu receptor e/ou ativação do receptor pela citocina.

2. A proteína de fusão do aspecto 1, em que a fração de ligação é um peptídeo natural, um peptídeo sintético, uma proteína estruturada modificada ou uma proteína sérica em grupo manipulada.

3. A proteína de fusão do aspecto 1 ou 2, em que a proteína estruturada modificada compreende um sdAb, um scFv, um Fab, um VHH, um domínio de fibronectina tipo III, proteína estruturada do tipo imunoglobulina, DARPin, peptídeo de nó de cistina, lipocalina, proteína estruturada de feixe de três hélices, módulo de ligação à albumina relacionado à proteína G ou uma proteína estruturada de aptâmeros de DNA ou RNA.

4. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-2, em que a fração de ligação é capaz de se ligar a uma proteína sérica em grupo.

5. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-3, em que a alça não CDR é de um domínio variável, um domínio constante, um domínio de conjunto C1, um domínio de conjunto C2, um domínio I ou quaisquer combinações dos mesmos.

6. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-4, em que a fração de ligação compreende ainda regiões determinantes de complementaridade (CDRs).

7. A proteína de fusão do aspecto 5, em que a fração de ligação é capaz de se ligar à proteína sérica em grupo.

8. A proteína de fusão do aspecto 6, em que a proteína sérica em grupo é uma proteína que prolonga a meia-vida.

9. A proteína de fusão do aspecto 6 ou 7, em que a proteína sérica em grupo é albumina, transferrina, Fator XIII ou Fibrinogênio.

10. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos5-8, que a alça CDR fornece o sítio de ligação específico para a proteína sérica em grupo ou a cadeia leve de imunoglobulina, ou quaisquer combinações das mesmas.

11. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-9, em que o ligante peptídico clivável compreende um sítio de clivagem.

12. A proteína de fusão do aspecto 10, em que o sítio de clivagem é reconhecido por uma protease.

13. A proteína de fusão do aspecto 11, em que a fração de ligação está ligada à citocina.

14. A proteína de fusão do aspecto 11 ou 11, em que a fração de ligação está ligada covalentemente à citocina.

15. A proteína de fusão do aspecto 11, 11 ou 14, em que a fração de ligação é capaz de mascarar a ligação da citocina ao seu alvo por meio de interações intermoleculares específicas entre a fração de ligação e a citocina.

16. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 11-14, em que a alça não CDR fornece um sítio de ligação específico para a ligação da fração à citocina.

17. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 11-15, em que após a clivagem do ligante peptídico clivável, a fração de ligação é separada da citocina e a citocina se liga ao seu alvo.

18. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-16, em que a citocina se liga a um receptor de citocina.

19. A proteína de fusão do aspecto 17, em que o receptor de citocina compreende um receptor de citocina de tipo I, um receptor de IL de tipo I, um receptor de IL de tipo II, um receptor de quimiocina ou um receptor de superfamília de receptores de necrose tumoral.

20. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-18, em que o ligante peptídico clivável compreende um sítio de clivagem.

21. A proteína de fusão do aspecto 20, em que o sítio de clivagem é reconhecido por uma protease.

22. A proteína de fusão do aspecto 21, em que o sítio de clivagem da protease é reconhecido por uma serina protease, uma cisteína protease, uma aspartato protease, uma treonina protease, uma protease de ácido glutâmico, uma metaloproteinase, uma gelatinase ou uma asparagina peptídeo liase.

23. A proteína de fusão do aspecto 21, em que o sítio de clivagem da protease é reconhecido por uma Catepsina B, uma Catepsina C, uma Catepsina

D, uma Catepsina E, uma Catepsina K, uma Catepsina L, uma calicreína, um hK1, um hK10, um hK15, uma plasmina, uma colagenase, uma colagenase Tipo IV, uma estromelisina, um Fator Xa, uma protease do tipo quimiotripsina, uma protease do tipo tripsina, uma protease do tipo elastase, uma protease do tipo subtilisina, uma actinidina, uma bromelaína, uma calpaína, uma caspase, uma caspase-3, uma Mir1-CP, uma papaína, uma protease de HIV-1, uma protease de HSV, uma protease de CMV, uma quimosina, uma renina, uma pepsina, uma matriptase, uma legumaína, uma plasmepsina, uma nepentsina, uma metaloexopeptidase, uma metaloendopeptidase, uma metaloprotease de matriz (MMP), uma MMP1, uma MMP2, uma MMP3, uma MMP8, uma MMP9, uma MMP10, uma MMP11, uma MMP12, uma MMP13, uma MMP14, uma ADAM10, uma ADAM17, um ADAM12, um ativador de uroquinase plasminogênio (uPA), uma enteroquinase, um alvo específico da próstata (PSA, hK3), uma enzima de conversão de interleucina-1β, uma trombina, um FAP (FAP-α), uma dipeptidil peptidase, ou dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26), uma protease de serina transmembrana tipo II (TTSP), uma elastase de neutrófilos, uma catepsina G, uma proteinase 3, uma serina protease de neutrófilos 4, uma quimase de mastócitos, uma triptase de mastócitos, uma dipeptidil peptidase e uma dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26).

24. Uma proteína de ligação condicionalmente ativa compreendendo uma fração de ligação (M) que compreende uma alça não CDR, uma citocina e um ligante peptídico clivável (L), em que a alça não CDR é capaz de se ligar à citocina e em que a fração de ligação é capaz de inibir a ligação da citocina ao seu receptor e/ou inibir a ativação do receptor pela citocina.

25. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 24, em que a fração de ligação é capaz de se ligar a uma proteína que prolonga a meia-vida.

26. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 24 ou 25, em que a fração de ligação é um peptídeo natural, um peptídeo sintético, uma proteína estruturada modificada ou uma proteína sérica em grupo manipulada.

27. A proteína de fusão do aspecto 26, em que a proteína estruturada modificada compreende um sdAb, um scFv, um Fab, um VHH, um domínio de fibronectina tipo III, proteína estruturada do tipo imunoglobulina, DARPin, peptídeo de nó de cistina, lipocalina, proteína estruturada de feixe de três hélices, módulo de ligação à albumina relacionado à proteína G ou uma proteína estruturada de aptâmeros de DNA ou RNA.

28. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 24-27, em que a alça não CDR é de um domínio variável, um domínio constante, um domínio de conjunto C1, um domínio de conjunto C2, um domínio I ou quaisquer combinações dos mesmos.

29. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 24-28, em que a fração de ligação compreende ainda regiões determinantes de complementaridade (CDRs).

30. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 24-29, em que a fração de ligação compreende um sítio de ligação específico para uma proteína sérica em grupo.

31. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 30, em que a proteína sérica em grupo é albumina, transferrina, Fator XIII ou Fibrinogênio.

32. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 29-31, em que as CDRs fornecem o sítio de ligação específico para a proteína sérica em grupo ou a cadeia leve de imunoglobulina, ou quaisquer combinações das mesmas.

33. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 29-32, em que a fração de ligação é capaz de mascarar a ligação da citocina ao seu alvo por meio de interações intermoleculares específicas entre a fração de ligação e a citocina.

34. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 29-33, em que a alça não CDR fornece um sítio de ligação específico para a ligação da fração de ligação à citocina.

35. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 24-34, em que a citocina se liga a um receptor de citocina.

36. A proteína de fusão do aspecto 35, em que o receptor de citocina compreende um receptor de citocina de tipo I, um receptor de IL de tipo I, um receptor de IL de tipo II, um receptor de quimiocina ou um receptor de superfamília de receptores de necrose tumoral.

37. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 24-36, em que o ligante peptídico clivável compreende um sítio de clivagem.

38. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 37, em que o sítio de clivagem é reconhecido por uma protease.

39. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 38, em que o sítio de clivagem da protease é reconhecido por uma serina protease, uma cisteína protease, uma aspartato protease, uma treonina protease, uma protease de ácido glutâmico, uma metaloproteinase, uma gelatinase ou uma asparagina peptídeo liase.

40. A proteína de fusão do aspecto 38, em que o sítio de clivagem da protease é reconhecido por uma Catepsina B, uma Catepsina C, uma Catepsina D, uma Catepsina E, uma Catepsina K, uma Catepsina L, uma calicreína, um hK1, um hK10, um hK15, uma plasmina, uma colagenase, uma colagenase Tipo IV, uma estromelisina, um Fator Xa, uma protease do tipo quimiotripsina, uma protease do tipo tripsina, uma protease do tipo elastase, uma protease do tipo subtilisina, uma actinidina, uma bromelaína, uma calpaína, uma caspase, uma caspase-3, uma Mir1-CP, uma papaína, uma protease de HIV-1, uma protease de HSV, uma protease de CMV, uma quimosina, uma renina, uma pepsina, uma matriptase, uma legumaína, uma plasmepsina, uma nepentsina, uma metaloexopeptidase, uma metaloendopeptidase, uma metaloprotease de matriz (MMP), uma MMP1, uma MMP2, uma MMP3, uma MMP8, uma MMP9, uma MMP10, uma MMP11, uma MMP12, uma MMP13, uma MMP14, uma ADAM10, uma ADAM17, um ADAM12, um ativador de uroquinase plasminogênio (uPA), uma enteroquinase, um alvo específico da próstata (PSA, hK3), uma enzima de conversão de interleucina-1β, uma trombina, um FAP (FAP-α), uma dipeptidil peptidase, ou dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26), uma protease de serina transmembrana tipo II (TTSP), uma elastase de neutrófilos, uma catepsina G, uma proteinase 3, uma serina protease de neutrófilos 4, uma quimase de mastócitos, uma triptase de mastócitos, uma dipeptidil peptidase e uma dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26).

41. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 24, compreendendo ainda um domínio de prolongamento da meia-vida ligado à fração de ligação, em que o domínio de prolongamento da meia-vida fornece à proteína de ligação um interruptor de segurança e em que, após a clivagem do ligante peptídico, a proteína de ligação é ativada por separação da fração de ligação e o domínio de prolongamento da meia-vida da citocina, e a proteína de ligação é assim separada do interruptor de segurança.

42. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 41, em que a clivagem do ligante peptídico ocorre em um microambiente tumoral.

43. Uma proteína de ligação condicionalmente ativa, compreendendo uma fração de ligação que se liga a uma citocina por meio de uma alça não CDR dentro da fração de ligação, em que a fração de ligação está ainda ligada a um domínio de prolongamento da meia-vida e compreende um ligante peptídico clivável, em que a proteína de ligação tem uma meia-vida prolongada antes de sua ativação por clivagem do ligante peptídico, e em que, após a ativação, a fração de ligação e o domínio de prolongamento da meia-vida são separados da citocina, e em que a proteína de ligação, em seu estado ativado, não tem um meia-vida prolongada.

44. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 43, em que a clivagem do ligante peptídico ocorre em um microambiente tumoral. Elementos de prolongamento da meia-vida in vivo

[00127] Preferencialmente, os polipeptídeos quiméricos compreendem um elemento de prolongamento da meia-vida in vivo. O aumento da meia-vida in vivo de moléculas terapêuticas com meia-vida naturalmente curta permite um regime de dosagem mais aceitável e administrável sem sacrificar a eficácia. Conforme usado neste documento, um "elemento de prolongamento de meia-

vida" é uma parte do polipeptídeo quimérico que aumenta a meia-vida in vivo e melhora a pK, por exemplo, alterando seu tamanho (por exemplo, para fica acima do limite de filtração renal), forma, raio hidrodinâmico, carga ou parâmetros de absorção, biodistribuição, metabolismo e eliminação. Uma forma exemplificativa de melhorar a pK de um polipeptídeo é pela expressão de um elemento na cadeia polipeptídica que se liga a receptores que são reciclados para a membrana plasmática das células em vez de degradados nos lisossomas, como o receptor FcRn em células endoteliais e transferrina receptor. Três tipos de proteínas, por exemplo, IgGs, HSA (ou fragmentos) e transferrina humanas, persistem por muito mais tempo no soro humano do que seria previsto apenas por seu tamanho, que é uma função de sua capacidade de se ligar a receptores que são reciclados em vez do que degradados no lisossoma. Essas proteínas, ou fragmentos delas que retêm a ligação de FcRn, são rotineiramente ligadas a outros polipeptídeos para prolongar sua meia-vida sérica. Em uma modalidade, o elemento de prolongamento de meia-vida é um domínio de ligação de albumina de soro humano (HSA). A HSA (SEQ ID NO: 2) também pode ser diretamente ligada às composições farmacêuticas ou ligada por meio de um ligante peptídico curto. Fragmentos de HSA também podem ser usados. A HSA e seus fragmentos podem funcionar como uma fração de bloqueio e um elemento de prolongamento da meia-vida. Os fragmentos de IgGs e Fc humanos também podem realizar uma função semelhante.

[00128] O elemento de prolongamento da meia-vida sérica também pode ser um polipeptídeo de ligação ao antígeno que se liga a uma proteína com uma meia-vida sérica longa, como albumina sérica, transferrina e semelhantes. Exemplos desses polipeptídeos incluem anticorpos e seus fragmentos, incluindo um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio único, tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de nanobody tipo camelídeo (VHH), um dAb e similares. Outros domínios de ligação de antígeno adequados incluem proteínas diferentes de imunoglobulinas que imitam a ligação e/ou estrutura do anticorpo, tais como anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz, monobodies, e domínios de ligação baseados em outras proteínas estruturadas modificadas, tais como estruturas de SpA, GroEL, fibronectina, lipocallina e CTLA4. Outros exemplos de polipeptídeos de ligação ao antígeno incluem um ligante para um receptor desejado, uma fração de ligação ao ligante de um receptor, uma lectina e peptídeos que se ligam a ou se associam a um ou mais antígenos alvo.

[00129] Alguns elementos de prolongamento da meia-vida sérica preferenciais são polipeptídeos que compreendem regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e, opcionalmente, alças não CDR. Vantajosamente, tais elementos de prolongamento da meia-vida sérica podem prolongar a meia- vida sérica da citocina e também funcionar como inibidores da citocina (por exemplo, via bloqueio estérico, interação não covalente ou combinação dos mesmos) e/ou como domínios de direcionamento. Em alguns casos, os elementos de prolongamento da meia-vida sérica são domínios derivados de uma molécula de imunoglobulina (molécula de Ig) ou proteínas estruturadas modificadas que mimetizam a estrutura e/ou atividade de ligação de anticorpos. A Ig pode ser de qualquer classe ou subclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, etc). Uma cadeia polipeptídica de uma molécula de Ig dobra-se em uma série de fitas beta paralelas ligadas por alças. Na região variável, três das alças constituem as "regiões determinantes de complementaridade" (CDRs) que determinam a especificidade de ligação ao antígeno da molécula. Uma molécula de IgG compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto ou um fragmento de ligação ao antígeno das mesmas. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada neste documento como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é composta de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada neste documento como VL) e uma região constante de cadeia leve.

A região constante de cadeia leve é composta de um domínio, CL.

As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que são hipervariáveis em sequência e/ou estão envolvidas no reconhecimento de antígeno e/ou geralmente formam alças estruturalmente definidas, intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do amino-terminal para o carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em algumas modalidades desta divulgação, pelo menos algumas ou todas as sequências de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 e FR4 fazem parte da "alça não CDR" das frações de ligação descritas neste documento.

Conforme mostrado na Fig. 5, um domínio variável de uma molécula de imunoglobulina tem várias fitas beta que ficam dispostas em duas folhas.

Os domínios variáveis de ambas as cadeias de imunoglobulina leve e pesada contêm três alças hipervariáveis, ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Os três CDRs de um domínio V (CDR1, CDR2, CDR3) agrupam-se em uma extremidade do barril beta.

As CDRs são as alças que conectam as fitas beta B-C, C'-C" e F-G da dobra da imunoglobulina, enquanto as alças inferiores que conectam as fitas beta AB, CC', C" -D e E-F da dobra da imunoglobulina, e a alça superior que conecta as fitas D-E da dobra da imunoglobulina são as alças não CDR.

Em algumas modalidades desta divulgação, pelo menos alguns resíduos de aminoácidos de um domínio constante, CH1, CH2 ou CH3, fazem parte da "alça não CDR" das frações de ligação descritas neste documento.

As alças não CDR compreendem, em algumas modalidades, uma ou mais das alças AB, CD, EF e DE de um domínio de conjunto C1 de uma Ig ou uma molécula do tipo Ig; as alças AB, CC', EF, FG, BC e EC' de um domínio de conjunto C2 de uma Ig ou uma molécula do tipo Ig; as alças DE, BD, GF, A(A1A2)B e EF do domínio I (Intermediário) definido de uma Ig ou molécula do tipo Ig.

[00130] Dentro do domínio variável, acredita-se que as CDRs sejam responsáveis pelo reconhecimento e ligação do antígeno, enquanto os resíduos de FR são considerados uma estrutura para as CDRs. No entanto, em certos casos, alguns dos resíduos de FR desempenham um papel importante no reconhecimento e ligação do antígeno. Os resíduos da região estrutural que afetam a ligação de Ag são divididos em duas categorias. Os primeiros são resíduos de FR que contatam o antígeno, portanto, fazem parte do sítio de ligação, e alguns desses resíduos estão próximos em sequência às CDRs. Outros resíduos são aqueles que estão longe das CDRs na sequência, mas estão próximos a elas na estrutura 3-D da molécula, por exemplo, uma alça na cadeia pesada. O domínio de prolongamento da meia-vida sérica (por exemplo, um domínio que compreende CDRs) pode compreender pelo menos uma alça não CDR. Em algumas modalidades, uma alça não CDR fornece um sítio de ligação para ligação a uma citocina, proteína sérica em grupo ou outro antígeno alvo.

[00131] O elemento de prolongamento da meia-vida sérica, além de ou, em alternativa, conter CDRs, compreende uma alça não CDR. Em algumas modalidades, a alça não CDR é modificada para gerar um sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno alvo desejado, como uma proteína sérica em massa, como albumina, ou para a fração de citocina ou outro antígeno de direcionamento. É contemplado que várias técnicas podem ser usadas para modificar a alça não CDR, por exemplo, mutagênese dirigida ao sítio, mutagênese aleatória, inserção de pelo menos um aminoácido que é estranho à sequência de aminoácidos da alça não CDR, substituição de aminoácidos. Um peptídeo de antígeno é inserido em uma alça não CDR, em alguns exemplos. Em alguns exemplos, um peptídeo antigênico é substituído pela alça não CDR. A modificação, para gerar um sítio de ligação ao antígeno, ocorre, em alguns casos, em apenas uma alça não CDR. Em outros casos, mais de uma alça não CDR é modificada. Por exemplo, a modificação ocorre em qualquer uma das alças não CDR mostradas na Fig. 5, isto é, AB, CC', C" D, EF e D-E. Em alguns casos, a modificação ocorre na alça DE. Em outros casos, as modificações ocorrem em todos as quatro alças AB, CC', C" –D, E-F.

[00132] Em alguns exemplos, o elemento de prolongamento da meia- vida sérica tem especificidade de ligação dupla e contém CDRs que se ligam especificamente a proteínas séricas em grupo, como albumina sérica, e alças não CDR que se ligam e bloqueiam especificamente o domínio de citocina. Em outros exemplos, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica contém CDRs que se ligam especificamente a um antígeno alvo, como o domínio de citocina ou outro antígeno alvo, e alças não CDR que se ligam especificamente a uma proteína sérica em grupo, como a albumina sérica. Preferencialmente, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica inibe a ligação do domínio de citocina ao receptor de citocina cognato, por exemplo, via oclusão estérica, via interações intermoleculares específicas ou uma combinação de ambas.

[00133] Em algumas modalidades, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica se liga de forma não covalente diretamente à citocina e inibe sua atividade.

[00134] Em certos exemplos, a fração de ligação se liga a uma citocina por meio de uma ou mais dentre as alças AB, CC', C" D e E-F e se liga a uma proteína sérica em grupo, como albumina, por meio de uma ou mais dentre as alças BC, C'C" e FG. Em certos exemplos, a fração de ligação se liga a uma proteína sérica em grupo, tal como albumina, através de sua alça AB, CC', C" D ou EF e se liga a uma citocina por meio de sua alça BC, C'C" ou FG. Em certos exemplos, a fração de ligação se liga a uma proteína sérica em grupo, tal como albumina, por meio de sua alça AB, CC', C" D e EF e está ligada a uma citocina por meio de sua alça BC, C'C" e FG. Em certos exemplos, a fração de ligação se liga a uma proteína sérica em grupo, como a albumina, através de uma ou mais dentre as alças AB, CC', C" D e E-F e se liga a uma citocina, através de uma ou mais dentre as alças BC, C'C" e FG.

[00135] As frações de ligação são quaisquer tipos de polipeptídeos. Por exemplo, em certos casos, as frações de ligação são peptídeos naturais,

peptídeos sintéticos ou proteínas estruturadas de fibronectina ou proteínas séricas manipuladas. A proteína sérica em grupo compreende, por exemplo, albumina, fibrinogênio ou uma globulina. Em algumas modalidades, as frações de ligação são proteínas estruturadas modificadas. As proteínas estruturadas modificadas compreendem, por exemplo, sdAb, um scFv, um Fab, um VHH, um domínio de fibronectina tipo III, uma proteína estruturada do tipo imunoglobulina (como sugerido em Halaby et al., 1999. Prot Eng 12(7): 563-571), DARPin, peptídeo de nó de cistina, lipocalina, proteína estruturada de feixe de três hélices, módulo de ligação de albumina relacionado à proteína G ou proteína estruturada de aptâmeros de DNA ou RNA.

[00136] Em alguns casos, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica se liga ao domínio de citocina por meio de suas alças não CDR e o domínio de citocina é ainda conectado a um domínio de direcionamento conforme descrito neste documento. Em alguns casos, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica compreende um sítio de ligação para uma proteína sérica em grupo. Em algumas modalidades, as CDRs fornecem o sítio de ligação para a proteína sérica em grupo. A proteína sérica em grupo é, em alguns exemplos, uma globulina, albumina, transferrina, IgG1, IgG2, IgG4, IgG3, monômero de IgA, Fator XIII, Fibrinogênio, IgE ou IgM pentamérica. Em algumas modalidades, a CDR forma um sítio de ligação para uma cadeia leve de imunoglobulina, como uma cadeia leve livre de Igκ ou uma cadeia leve livre de Igλ.

[00137] Uma proteína condicionalmente ativa exemplificativa é mostrada na Fig. 6. No exemplo ilustrado, as alças não CDR em um domínio de ligação de albumina sérica (por exemplo, um dAb) podem formar um sítio de ligação para a citocina IL-2. Neste exemplo, o sítio de ligação para albumina sérica pode ser formado pelas CDRs do domínio de ligação de albumina sérica.

[00138] O elemento de prolongamento da meia-vida sérica pode ser qualquer tipo de domínio de ligação, incluindo, mas não se limitando a, domínios de um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, a fração de ligação é um fragmento variável de cadeia única (scFv), anticorpo de domínio único, como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável (VHH) de nanobody derivado de camelídeo. Em outras modalidades, as frações de ligação são domínios de ligação não-Ig, ou seja, miméticos de anticorpo, tais como anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz e monobodies.

[00139] Em outras modalidades, o elemento de prolongamento da meia- vida sérica pode ser um polímero solúvel em água ou um peptídeo que é conjugado a um polímero solúvel em água, como PEG. “PEG”, “polietilenoglicol” e “poli (etilenoglicol)”, conforme usados neste documento, são intercambiáveis e abrangem qualquer poli(óxido de etileno) não peptídico solúvel em água. O termo “PEG” também significa um polímero que contém uma maioria, ou seja, maior que 50%, subunidades de repetição —OCH2CH2—. Com relação a formas específicas, o PEG pode assumir qualquer número de uma variedade de pesos moleculares, bem como estruturas ou geometrias, como "ramificado", "linear", "bifurcado", "multifuncional" e semelhantes, a serem descritos em maiores detalhes abaixo. O PEG não está limitado a uma estrutura particular e pode ser linear (por exemplo, uma extremidade limitada, por exemplo, PEG alcoxi ou um PEG bifuncional), ramificado ou de multi-ramificado (por exemplo, PEG bifurcado ou PEG ligado a um núcleo de poliol), um arquitetura dendrítica (ou em forma de estrela), cada uma com ou sem uma ou mais ligações degradáveis. Além disso, a estrutura interna do PEG pode ser organizada em qualquer número de padrões de repetição diferentes e pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em homopolímero, copolímero alternado, copolímero aleatório, copolímero em bloco, tripolímero alternado, tripolímero aleatório e tripolímero em bloco. Os PEGs podem ser conjugados a polipeptídeos e peptídeos por meio de qualquer método adequado. Normalmente, um derivado de PEG reativo, tal como N- hidroxisuccinamidil éster PEG, é feito reagir com um peptídeo ou polipeptídeo que inclui aminoácidos com uma cadeia lateral que contém uma amina, sulfidrila, ácido carboxílico ou grupo funcional hidroxila, tal como cisteína, lisina, asparagina, glutamina, teonina, tirosina, serina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Domínios de direcionamento e retenção

[00140] Para certas aplicações, pode ser desejável maximizar a quantidade de tempo que o construto fica presente em sua localização desejada no corpo. Isto pode ser conseguido incluindo um domínio adicional no polipeptídeo quimérico (proteína de fusão) para influenciar seus movimentos dentro do corpo. Por exemplo, os ácidos nucleicos quiméricos podem codificar um domínio que direciona o polipeptídeo para um sítio no corpo, por exemplo, células tumorais ou um sítio de inflamação; este domínio é denominado um "domínio de direcionamento" e/ou codifica um domínio que retém o polipeptídeo em um sítio no corpo, por exemplo, células tumorais ou um sítio de inflamação; este domínio é denominado “domínio de retenção”. Em algumas modalidades, um domínio pode funcionar como um domínio de direcionamento e de retenção. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento e/ou domínio de retenção são específicos para um ambiente rico em protease. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento codificado e/ou domínio de retenção são específicos para células T reguladoras (Tregs), por exemplo, direcionando os receptores CCR4 ou CD39. Outros domínios de direcionamento e/ou retenção adequados compreendem aqueles que têm um ligante cognato que é superexpresso em tecidos inflamados, por exemplo, o receptor de IL-1 ou o receptor de IL-6. Em outras modalidades, os domínios de direcionamento e/ou retenção adequados compreendem aqueles que têm um ligante cognato que é superexpresso no tecido tumoral, por exemplo, Epcam, CEA ou mesotelina. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento está ligado à interleucina por meio de um ligante peptídico que é clivado no sítio de ação (por exemplo, por inflamação ou proteases específicas do câncer), liberando a atividade total da interleucina no sítio desejado. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento e/ou retenção está ligado à interleucina por meio de um ligante peptídico que não é clivado no sítio de ação (por exemplo, por inflamação ou proteases específicas do câncer), fazendo com que a citocina permaneça no sítio desejado.

[00141] Os antígenos escolhidos, em alguns casos, são expressos na superfície de uma célula ou tecido doente, por exemplo, um tumor ou uma célula cancerígena. Antígenos úteis para o direcionamento e retenção de tumores incluem, mas não estão limitados a EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, c-Met, FOLR1 e CEA. As composições farmacêuticas divulgadas neste documento também incluem proteínas que compreendem dois domínios de direcionamento e/ou retenção que se ligam a dois antígenos alvo diferentes conhecidos por serem expressos em uma célula ou tecido doente. Pares exemplares de domínios de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a EGFR/CEA, EpCAM/CEA e HER-2/HER-3.

[00142] Domínios de direcionamento e/ou de retenção adequados incluem domínios de ligação de antígeno, tais como anticorpos e seus fragmentos, incluindo um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio único, tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de nanobody tipo camelídeo (VHH), um dAb e similares. Outros domínios de ligação de antígeno adequados incluem proteínas diferentes de imunoglobulinas que imitam a ligação e/ou estrutura do anticorpo, tais como anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz, monobodies, e domínios de ligação baseados em outras proteínas estruturadas modificadas, tais como estruturas de SpA, GroEL, fibronectina, lipocallina e CTLA4. Outros exemplos de polipeptídeos de ligação ao antígeno incluem um ligante para um receptor desejado, uma fração de ligação ao ligante de um receptor, uma lectina e peptídeos que se ligam a ou se associam a um ou mais antígenos alvo.

[00143] Em algumas modalidades, os domínios de direcionamento e/ou retenção se ligam especificamente a uma molécula da superfície celular. Em algumas modalidades, os domínios de direcionamento e/ou retenção se ligam especificamente a um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam específica e independentemente a um antígeno tumoral selecionado a partir de pelo menos um dentre proteína de ativação de fibroblastos alfa (FAPa), glicoproteína de trofoblasto (5T4), transdutor de sinal de cálcio associado a tumor 2 (Trop2), Fibronectina EDB (EDB -FN), domínio EIIIB de fibronectina, CGS-2, EpCAM, EGFR, HER-2, HER- 3, cMet, CEA e FOLR1. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam específica e independentemente a dois antígenos diferentes, em que pelo menos um dos antígenos é um antígeno tumoral selecionado de EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, cMet, CEA e FOLR1.

[00144] O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode ser um antígeno tumoral expresso em uma célula tumoral. Os antígenos tumorais são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, c-Met, FOLR1, PSMA, CD38, BCMA e CEA. 5T4, AFP, B7-H3, Caderina- 6, CAIX, CD117, CD123, CD138, CD166, CD19, CD20, CD205, CD22, CD30, CD33, CD352, CD37, CD44, CD52, CD56, CD70, CD71, CD74, CD79b, DLL3, EphA2, FAP, FGFR2, FGFR3, GPC3, gpA33, FLT-3, gpNMB, HPV-16 E6, HPV- 16 E7, ITGA2, ITGA3, SLC39A6, MAGE, mesotelina, Muc1, Muc16, NaPi2b, Nectina 4, P-caderina, NY-ESO-1, PRLR, PSCA, PTK7, ROR1, SLC44A4, SLTRK5, SLTRK6, STEAP1, TIM1, Trop2, WT1.

[00145] O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode ser uma proteína de ponto de controle imunológico. Exemplos de proteínas de checkpoint imunológico incluem, mas não estão limitados a CD27, CD137, 2B4, TIGIT, CD155, ICOS, HVEM, CD40L, LIGHT, TIM-1, OX40, DNAM-1, PD-L1, PD1, PD- L2, CTLA -4, CD8, CD40, CEACAM1, CD48, CD70, A2AR, CD39, CD73, B7-H3, B7-H4, BTLA, IDO1, IDO2, TDO, KIR, LAG-3, TIM-3 ou VISTA.

[00146] O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode ser uma molécula de superfície celular, como uma proteína, lipídio ou polissacarídeo. Em algumas modalidades, um antígeno de direcionamento e/ou retenção está em uma célula tumoral, célula infectada por vírus, célula infectada por bactérias, glóbulo vermelho danificado, célula de placa arterial, inflamada ou célula de tecido fibrótico. O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode compreender um modulador de resposta imune. Exemplos de modulador de resposta imune incluem, mas não estão limitados a fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF), fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), interleucina 2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), GITRL, CD3 ou GITR.

[00147] O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode ser um receptor de citocina. Exemplos de receptores de citocina incluem, mas não estão limitados a receptores de citocina Tipo I, tais como receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptores IL Tipo I, receptor Epo, receptor LIF, receptor CNTF, receptor TPO; Receptores de citocinas do tipo II, tais como receptor de IFN-alfa (IFNAR1, IFNAR2), receptor de IFB-beta, receptor de IFN-gama (IFNGR1, IFNGR2), receptores de IL do tipo II; receptores de quimiocinas, tais como receptores de quimiocinas CC, receptores de quimiocinas CXC, receptores de quimiocinas CX3C, receptores de quimiocinas XC; receptores da superfamília de receptores de necrose tumoral, tais como TNFRSF5/CD40, TNFRSF8/CD30, TNFRSF7/CD27, TNFRSF1A/TNFR1/CD120a, TNFRSF1B/TNFR2/CD120b; Receptores TGF-beta, tais como receptor TGF-beta 1, receptor TGF-beta 2; Receptores da superfamília Ig, como os receptores IL-1, CSF-1R, PDGFR (PDGFRA, PDGFRB), SCFR. Ligantes peptídicos

[00148] Como afirmado acima, as composições farmacêuticas compreendem uma ou mais sequências de ligantes peptídicos. Uma sequência de ligantes peptídicos serve para fornecer flexibilidade entre polipeptídeos, de modo que, por exemplo, a fração de bloqueio seja capaz de inibir a atividade do polipeptídeo de citocina. A sequência de ligantes peptídicos pode estar localizada entre qualquer ou todos os polipeptídeos de citocina, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica e/ou a fração de bloqueio. Conforme descrito neste documento, pelo menos um dos ligantes peptídicos é clivável por protease e contém um (um ou mais) sítio de clivagem para uma (uma ou mais) protease desejada. Preferencialmente, a protease desejada é enriquecida ou expressa seletivamente no sítio desejado de atividade da citocina (por exemplo, o microambiente tumoral). Assim, a proteína de fusão é preferencialmente ou seletivamente clivada no sítio da atividade de citocina desejada.

[00149] Os ligantes peptídicos adequados podem ser de comprimentos diferentes, tais como de 1 aminoácido (por exemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos e podem ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 aminoácidos.

[00150] A orientação dos componentes da composição farmacêutica é em grande parte uma questão de escolha de projeto e é reconhecido que múltiplas orientações são possíveis e todas se destinam a ser abrangidas por esta divulgação. Por exemplo, uma fração de bloqueio pode estar localizada no terminal C ou no terminal N de um polipeptídeo de citocina.

[00151] Proteases conhecidas por estarem associadas a células ou tecidos doentes incluem, mas não estão limitadas a serina proteases, cisteína proteases, aspartato proteases, treonina proteases, ácido glutâmico proteases, metaloproteases, asparagina peptídeo liases, proteases séricas, catepsinas, Catepsina B, Catepsina C, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina K, Catepsina L, calicreínas, hKl, hK10, hK15, plasmina, colagenase, colagenase Tipo IV, estromelisina, Fator Xa, protease do tipo quimiotripsina, protease do tipo tripsina, protease do tipo elastase, protease do tipo subtilisina, actinidaína, bromelaína,

calpaína, caspases, caspase-3, Mirl-CP, papaína, protease de HIV-1, protease de HSV, protease de CMV, quimosina, renina, pepsina, matriptase, legumaína, plasmepsina, nepentesina, metalo-exopeptidases, metalo-endopeptidases, metaloproteases de matriz (MMP), MMP1, MMP2, MMP3, MMP8, MMP9, MMP13, MMP11, MMP14, ativador de uroquinase plasminogênio (uPA), enteroquinase, antígeno específico da próstata (PSA, hK3), enzima de conversão de interleucina-1β, trombina, FAP (FAP-a), dipeptidil peptidase, meprinas, granzimas e dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26). Proteases capazes de clivar sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácido nucleico quiméricas fornecidas neste documento podem, por exemplo, ser selecionadas do grupo que consiste em um antígeno específico da próstata (PSA), uma metaloproteinase de matriz (MMP), uma desintegrina A e uma metaloproteinase (ADAM), um ativador de plasminogênio, uma catepsina, uma caspase, uma protease de superfície de célula tumoral e uma elastase. A MMP pode ser, por exemplo, uma metaloproteinase de matriz 2 (MMP2) ou metaloproteinase de matriz 9 (MMP9).

[00152] Proteases úteis nos métodos divulgados neste documento são apresentadas na Tabela 1, e proteases exemplares e seus sítios de clivagem são apresentados na Tabela 1a: Tabela 1. Proteases relevantes para inflamação e câncer Protease Especificidade Outros Aspectos Secretado por células T killer: Granzima B (grB) Cliva após resíduos Tipo de serina protease; de Asp (asp-ase) fortemente implicado na indução de apoptose de células alvo dependente de perforina Granzima A (grA) semelhante à Tipo de serina protease; tripsina, cliva após resíduos básicos

Granzima H (grH) Especificidade do Tipo de serina protease; substrato Outras granzimas também são desconhecida secretadas por células T killer, mas nem todas estão presentes em humanos Caspase-8 Cliva após resíduos Tipo de cisteína protease; de Asp desempenha um papel essencial na expansão celular induzida por TCR - papel molecular exato incerto Tecido linfoide Cliva após resíduos Tipo de cisteína protease; associado à mucosa de arginina provavelmente atua como uma (MALT1) proteína estruturada e uma enzima proteoliticamente ativa na via de sinalização dependente de

CBM Triptase Alvos: angiotensina I, Tipo de serina protease fibrinogênio, pró- específica de mastócitos; uroquinase, semelhante à tripsina; resistente TGFβ; à inibição por inibidores da preferencialmente protease macromoleculares cliva proteínas após expressos em mamíferos devido resíduos de lisina ou a sua estrutura tetramérica, com arginina todos os sítios voltados para o poro central estreito; também associado à inflamação Associado à inflamação: Trombina Alvos: FGF-2, Tipo de serina protease; modula HB-EGF, a atividade de fatores de osteopontina, PDGF, crescimento vascular, VEGF quimiocinas e proteínas extracelulares; fortalece a proliferação induzida por VEGF; induz a migração celular; fator angiogênico; regula a hemostasia Quimase Exibem Tipo de serina protease especificidade específica de mastócitos semelhante à quimiotripsina, clivando proteínas após resíduos de aminoácidos aromáticos Carboxipeptidase A Cliva resíduos de Tipo de metaloproteinase (MC-CPA) aminoácidos da dependente de zinco extremidade C- terminal de peptídeos e proteínas Calicreínas Alvos: alto peso Tipo de serina protease; molecular modulam a resposta de quininogênio, pró- relaxamento; contribuem para a uroquinase resposta inflamatória; degradação de fibrina Elastase Alvos: E-caderina, Tipo de serina protease serina de GM-CSF, IL-1, IL-2, neutrófilos; degrada os IL-6, IL8, p38MAPK, componentes de ECM; regula a TNFα, VE-caderina resposta inflamatória; ativa a sinalização pró-apoptótica

Catepsina G Alvos: EGF, ENA-78, Tipo de serina protease; degrada IL-8, MCP-1, MMP-2, os componentes de ECM; MT1-MMP, quimioatrativo de leucócitos; PAI-1, RANTES, regula a resposta inflamatória; TGFβ, TNFα promove a apoptose PR-3 Alvos: ENA-78, IL-8, Tipo de serina protease; promove IL-18, JNK, p38MAPK, resposta inflamatória; ativa a TNFα sinalização pró-apoptótica Granzima M (grM) Cliva após Met e Tipo de serina protease; expresso outros resíduos apenas em células NK hidrofóbicos longos e não ramificados Calpaínas Clivam entre Arg e Família de cisteína proteases; Gly dependente de cálcio; a ativação está envolvida no processo de inúmeras doenças associadas à inflamação Tabela 1a: Proteases Exemplares e Sequências de Reconhecimento de Protease Protease Sequência do Domínio SEQ ID de Clivagem NO: MMP7 KRALGLPG 3 MMP7 (DE)8RPLALWRS(DR)8 4 MMP9 PR(S/T)(L/I)(S/T) 5 MMP9 LEATA 6 MMP11 GGAANLVRGG 7 MMP14 SGRIGFLRTA 8 MMP PLGLAG 9 MMP PLGLAX 10

MMP PLGC(me)AG 11 MMP ESPAYYTA 12 MMP RLQLKL 13 MMP RLQLKAC 14 MMP2, MMP9, MMP14 EP(Cit)G(Hof)YL 15 Ativador da plasminogênio SGRSA 16 uroquinase (uPA) Ativador da plasminogênio DAFK 17 uroquinase (uPA) Ativador da plasminogênio GGGRR 18 uroquinase (uPA) Enzima lisossômica GFLG 19 Enzima lisossômica ALAL 20 Enzima lisossômica FK 21 Catepsina B NLL 22 Catepsina D PIC(Et)FF 23 Catepsina K GGPRGLPG 24 Antígeno Específico da Próstata HSSKLQ 25 Antígeno Específico da Próstata HSSKLQL 26 Antígeno Específico da Próstata HSSKLQEDA 27 Protease de vírus Herpes LVLASSSFGY 28 Simplex Protease do HIV GVSQNYPIVG 29 Protease do CMV GVVQASCRLA 30 Trombina F(Pip)RS 31 Trombina DPRSFL 32 Trombina PPRSFL 33 Caspase-3 DEVD 34 Caspase-3 DEVDP 35

Caspase-3 KGSGDVEG 36 Enzima conversora de GWEHDG 37 interleucina 1β Enteroquinase EDDDDKA 38 FAP KQEQNPGST 39 Calicreína 2 GKAFRR 40 Plasmina DAFK 41 Plasmina DVLK 42 Plasmina DAFK 43 TOP ALLLALL 44

[00153] São fornecidas neste documento composições farmacêuticas que compreendem sequências polipeptídicas. Tal como acontece com todos os peptídeos, polipeptídeos e proteínas, incluindo seus fragmentos, entende-se que podem ocorrer modificações adicionais na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos quiméricos (variantes de sequências de aminoácidos) que não alteram a natureza ou função dos peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Essas modificações incluem substituições conservativas de aminoácidos e são discutidas em mais detalhes abaixo.

[00154] As composições fornecidas neste documento têm uma função desejada. As composições são constituídas por pelo menos um polipeptídeo de citocina, como IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFNa ou IFNg, ou uma quimiocina, como CXCL10, CCL19, CCL20, CCL21, uma fração de bloqueio, por exemplo, um polipeptídeo de bloqueio estérico e um elemento de prolongamento da meia-vida sérica opcional e um polipeptídeo de direcionamento opcional, com um ou mais ligantes peptídicos conectando cada polipeptídeo na composição. O primeiro polipeptídeo, por exemplo, uma muteína de IL-2, é fornecido para ser um agente ativo. A fração de bloqueio é fornecida para bloquear a atividade da interleucina. O polipeptídeo ligante, por exemplo, um polipeptídeo clivável por protease, é fornecido para ser clivado por uma protease que é especificamente expressa no alvo pretendido do agente ativo. Opcionalmente, a fração de bloqueio bloqueia a atividade do primeiro polipeptídeo através da ligação do polipeptídeo de interleucina. Em algumas modalidades, a fração de bloqueio, por exemplo, um peptídeo de bloqueio estérico, está ligada à interleucina por meio de um ligante peptídico clivável por protease que é clivado no sítio de ação (por exemplo, por proteases específicas de inflamação ou de tumores), liberando a atividade total da citocina no sítio desejado.

[00155] O sítio de clivagem de protease pode ser um sítio de clivagem de protease de ocorrência natural ou um sítio de clivagem de protease modificado artificialmente. O sítio de clivagem de protease modificado artificialmente pode ser clivado por mais de uma protease específica para o ambiente desejado no qual a clivagem ocorrerá, por exemplo, um tumor. O sítio de clivagem da protease pode ser clivável por pelo menos uma protease, pelo menos duas proteases, pelo menos três proteases ou pelo menos quatro proteases.

[00156] Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende glicina-glicina, um motivo de reconhecimento de sortase, ou um motivo de reconhecimento de sortase e uma sequência peptídica (Gly4Ser)n (SEQ ID NO.: 195) ou (Gly3Ser)n, (SEQ ID NO.: 196), em que n é 1, 2, 3, 4 ou 5. Em uma modalidade, o motivo de reconhecimento de sortase compreende uma sequência peptídica LPXTG (SEQ ID NO.: 193), onde X é um aminoácido. Em uma modalidade, a ligação covalente é entre um resíduo de lisina reativo ligado ao terminal C do polipeptídeo de citocina e um ácido aspártico reativo ligado ao terminal N da fração de bloqueio ou outra fração. Em uma modalidade, a ligação covalente é entre um resíduo de ácido aspártico reativo ligado ao terminal N do polipeptídeo de citocina e um resíduo de lisina reativo ligado ao terminal C da fração de bloqueio ou outra fração. Clivagem e indutibilidade

[00157] Conforme descrito neste documento, a atividade do polipeptídeo de citocina no contexto da proteína de fusão é atenuada e a clivagem pela protease no sítio de atividade desejado, como em um microambiente tumoral, libera uma forma da citocina a partir da proteína de fusão que é muito mais ativa como um agonista do receptor de citocina do que a proteína de fusão. Por exemplo, a atividade de ativação do receptor de citocina (agonista) do polipeptídeo de fusão pode ser de pelo menos cerca de 10X, pelo menos cerca de 50X, pelo menos cerca de 100X, pelo menos cerca de 250X, pelo menos cerca de 500X, ou pelo menos cerca de 1000x menor que a atividade de ativação do receptor de citocina do polipeptídeo de citocina como uma entidade molecular separada. O polipeptídeo de citocina que faz parte da proteína de fusão existe como uma entidade molecular separada quando contém um aminoácido que é substancialmente idêntico ao polipeptídeo de citocina e não inclui substancialmente aminoácidos adicionais e não está associado (por ligações covalentes ou não covalentes) a outras moléculas. Se necessário, um polipeptídeo de citocina como uma entidade molecular separada pode incluir algumas sequências de aminoácidos adicionais, como um marcador ou sequência curta para auxiliar na expressão e/ou purificação.

[00158] Em outros exemplos, a atividade de ativação do receptor de citocina (agonista) do polipeptídeo de fusão é pelo menos cerca de 10X, pelo menos cerca de 50X, pelo menos cerca de 100X, pelo menos cerca de 250X, pelo menos cerca de 500X, ou cerca de 1000x menor que a atividade de ativação do receptor de citocina do polipeptídeo que contém o polipeptídeo de citocina que é produzido pela clivagem do ligante peptídico clivável pela protease na proteína de fusão. Em outras palavras, a atividade de ativação do receptor de citocina (agonista) do polipeptídeo que contém o polipeptídeo de citocina que é produzido pela clivagem do ligante peptídico clivável por protease na proteína de fusão é de pelo menos cerca de 10X, pelo menos cerca de 50X, pelo menos cerca de 100X, pelo menos cerca de250X, pelo menos cerca de 500X, ou pelo menos cerca de 1000x maior que a atividade de ativação do receptor de citocina da proteína de fusão.

Substituições de polipeptídeo

[00159] Os polipeptídeos descritos neste documento podem incluir componentes (por exemplo, a citocina, a fração de bloqueio) que têm a mesma sequência de aminoácidos da proteína de ocorrência natural correspondente (por exemplo, IL-2, IL-15, HSA) ou podem ter uma sequência de aminoácidos que difere da proteína de ocorrência natural, desde que a função desejada seja mantida. Entende-se que uma maneira de definir quaisquer modificações e derivados conhecidos ou aqueles que possam surgir das proteínas divulgadas, e ácidos nucleicos que as codificam, é através da definição das variantes de sequência em termos de identidade para sequências de referência conhecidas específicas. São divulgados, especificamente, polipeptídeos e ácidos nucleicos que têm pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento de identidade com os polipeptídeos quiméricos fornecidos neste documento. Por exemplo, são fornecidos polipeptídeos ou ácidos nucleicos que têm pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento de identidade com a sequência de qualquer um dos ácidos nucleicos ou polipeptídeos descritos neste documento. Os versados na técnica compreendem facilmente como determinar a identidade de dois polipeptídeos ou dois ácidos nucleicos. Por exemplo, a identidade pode ser calculada após o alinhamento das duas sequências para que a identidade esteja em seu nível mais alto.

[00160] Outra maneira de calcular a identidade pode ser realizada por algoritmos publicados. O alinhamento ideal de sequências para a comparação pode ser realizado pelo algoritmo de identidade local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de identidade de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa pelo método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics

Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) ou por inspeção.

[00161] Os mesmos tipos de identidade podem ser obtidos para ácidos nucleicos, por exemplo, pelos algoritmos divulgados em Zuker, Science 244: 48- 52 (1989); Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706-7710 (1989); Jaeger et al., Methods Enzymol. 183: 281-306 (1989), que são incorporados neste documento por referência para pelo menos o material relacionado ao alinhamento de ácido nucleico. Entende-se que qualquer um dos métodos pode normalmente ser usado e que, em certos casos, os resultados desses vários métodos podem diferir, mas o versado na técnica entende que se a identidade for encontrada com pelo menos um desses métodos, as sequências seriam consideradas como tendo a identidade declarada, e ser divulgada neste documento.

[00162] As modificações de proteínas incluem modificações na sequência de aminoácidos. As modificações na sequência de aminoácidos podem surgir naturalmente como variações alélicas (por exemplo, devido ao polimorfismo genético), podem surgir devido à influência ambiental (por exemplo, por exposição à luz ultravioleta) ou podem ser produzidas por intervenção humana (por exemplo, por mutagênese de clonagem Sequências de DNA), tais como ponto induzido, deleção, inserção e mutantes de substituição. Essas modificações podem resultar em mudanças na sequência de aminoácidos, fornecer mutações silenciosas, modificar um sítio de restrição ou fornecer outras mutações específicas. As modificações da sequência de aminoácidos normalmente se encontram em uma ou mais das três classes: modificações substitucionais, de inserção ou deleção. As inserções incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila, bem como inserções intrassequenciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. As inserções normalmente serão inserções menores do que aquelas de fusões de terminal amino ou carboxila, por exemplo, na ordem de um a quatro resíduos. As deleções são caracterizadas pela remoção de um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de proteína. Normalmente, não mais do que cerca de 2 a 6 resíduos são deletados em qualquer sítio dentro da molécula de proteína.

As substituições de aminoácidos são normalmente de resíduos únicos, mas podem ocorrer em vários sítios diferentes ao mesmo tempo; as inserções serão normalmente da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos; e as deleções variarão de cerca de 1 a 30 resíduos.

Deleções ou inserções são feitas preferencialmente em pares adjacentes, isto é, uma deleção de 2 resíduos ou inserção de 2 resíduos.

Substituições, deleções, inserções ou qualquer combinação destas podem ser combinadas para chegar a um construto final.

As mutações não devem colocar a sequência fora do quadro de leitura e, preferencialmente, não criarão regiões complementares que poderiam produzir estrutura de mRNA secundária.

Modificações de substituição são aquelas em que pelo menos um resíduo foi removido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar.

Essas substituições geralmente são feitas de acordo com a Tabela 2 a seguir e são referidas como substituições conservativas.

Tabela 2.Substituições de aminoácidos exemplificativas Aminoácido Substituições exemplificativas

Ala Ser, Gly, Cys Arg Lys, Gln, Met, Ile Asn Gln, His, Glu, Asp Asp Glu, Asn, Gln Cys Ser, Met, Thr Gln Asn, Lys, Glu, Asp Glu Asp, Asn, Gln Gly Pro, Ala His Asn, Gln Ile Leu, Val, Met Leu Ile, Val, Met

Lys Arg, Gln, Met, Ile Met Leu, Ile, Val Phe Met, Leu, Tyr, Trp, His Ser Thr, Met, Cys Thr Ser, Met, Val Trp Tyr, Phe Tyr Trp, Phe, His Val Ile, Leu, Met

[00163] As modificações, incluindo as substituições de aminoácidos específicas, são feitas por métodos conhecidos. Por exemplo, as modificações são feitas por mutagênese específica do sítio de nucleotídeos no DNA que codifica o polipeptídeo, produzindo assim o DNA que codifica a modificação e, em seguida, expressando o DNA em cultura de células recombinantes. As técnicas para fazer mutações de substituição em sítios predeterminados no DNA com uma sequência conhecida são bem conhecidas, por exemplo, a mutagênese do primer M13 e a mutagênese por PCR.

[00164] As modificações podem ser selecionadas para otimizar a ligação. Por exemplo, as técnicas de maturação de afinidade podem ser usadas para alterar a ligação do scFv pela introdução de mutações aleatórias dentro das regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Essas mutações aleatórias podem ser introduzidas usando uma variedade de técnicas, incluindo radiação, mutagênicos químicos ou PCR propensa a erros. Múltiplas rodadas de mutação e seleção podem ser realizadas usando, por exemplo, exibição de fagos.

[00165] A divulgação também se refere aos ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos quiméricos descritos neste documento e ao uso de tais ácidos nucleicos para produzir os polipeptídeos quiméricos e para fins terapêuticos. Por exemplo, a invenção inclui moléculas de DNA e RNA (por exemplo, mRNA, RNA autorreplicante) que codificam um polipeptídeo quimérico e para o uso terapêutico de tais moléculas de DNA e RNA. Composições Exemplificativas

[00166] Proteínas de fusão exemplificativas da invenção combinam os elementos descritos acima em uma variedade de orientações. As orientações descritas nesta seção são exemplos e não devem ser consideradas limitantes.

[00167] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma citocina, uma fração de bloqueio e um elemento de prolongamento da meia-vida. Em algumas modalidades, a citocina é posicionada entre o elemento de prolongamento da meia-vida e a fração de bloqueio. Em algumas modalidades, a citocina é do terminal N para a fração de bloqueio e o elemento de prolongamento da meia-vida. Em algumas dessas modalidades, a citocina é proximal à fração de bloqueio; em algumas de tais modalidades, a citocina é proximal ao elemento de prolongamento da meia-vida. Pelo menos um ligante peptídico clivável por protease deve ser incluído em todas as modalidades, de modo que a citocina possa ser ativa após a clivagem. Em algumas modalidades, a citocina é do terminal C para a fração de bloqueio e o elemento de prolongamento da meia-vida. Elementos adicionais podem ser ligados uns aos outros por um ligante peptídico clivável, um ligante peptídico não clivável ou por fusão direta.

[00168] Em algumas modalidades, os domínios de bloqueio usados são capazes de prolongar a meia-vida e a citocina é posicionada entre dois desses domínios de bloqueio. Em algumas modalidades, a citocina é posicionada entre dois domínios de bloqueio, um dos quais é capaz de prolongar a meia-vida.

[00169] Em algumas modalidades, duas citocinas estão incluídas no mesmo construto. Em algumas modalidades, as citocinas são conectadas a dois domínios de bloqueio cada (três no total em uma molécula), com um domínio de bloqueio entre os dois domínios de citocina. Em algumas modalidades, um ou mais domínios de prolongamento da meia-vida adicionais podem ser incluídos para otimizar as propriedades farmacocinéticas. Em alguns casos, é benéfico incluir duas da mesma citocina para facilitar a dimerização. Um exemplo de citocina que funciona como dímero é o IFN.

[00170] Em algumas modalidades, três citocinas estão incluídas no mesmo construto. Em algumas modalidades, a terceira citocina pode funcionar para bloquear as outras duas no lugar de um domínio de bloqueio entre as duas citocinas.

[00171] Os elementos de prolongamento da meia-vida preferenciais para uso nas proteínas de fusão são albumina sérica humana (HSA), um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, scFV, dAb) que se liga à albumina sérica, uma IgG humana ou humanizada, ou um fragmento de qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades preferenciais, a fração de bloqueio é albumina sérica humana (HSA), ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga à albumina sérica, um anticorpo que se liga à citocina e evita a ativação da ligação ou ativação do receptor de citocina, outra citocina ou um fragmento de qualquer um dos anteriores. Em modalidades preferenciais compreendendo um domínio de direcionamento adicional, o domínio de direcionamento é um anticorpo que se liga a uma proteína da superfície celular que é enriquecida na superfície de células cancerosas, como EpCAM, FOLR1 e Fibronectina. Métodos de Tratamento e Composições Farmacêuticas

[00172] Além disso, são fornecidos métodos de tratamento de um sujeito com ou em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio, como doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária ou doença do enxerto contra o hospedeiro. Os métodos de administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão, conforme divulgado neste documento, que é tipicamente administrada como uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente selecionar um sujeito com ou em risco de desenvolver tal doença ou distúrbio. A composição farmacêutica compreende preferencialmente uma citocina bloqueada, fragmento ou muteína desta que é ativada em um sítio de inflamação ou um tumor. Em uma modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende um polipeptídeo de citocina, fragmento ou muteína deste e um elemento de prolongamento da meia-vida sérico. Em outra modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende um polipeptídeo de citocina, fragmento ou muteína deste e uma fração de bloqueio, por exemplo, um polipeptídeo de bloqueio estérico, em que o polipeptídeo de bloqueio estérico é capaz de bloquear estericamente a atividade do polipeptídeo de citocina, fragmento ou muteína deste. Em outra modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende um polipeptídeo de citocina, fragmento ou muteína deste, uma fração de bloqueio e um elemento de extensão de meia-vida sérico.

[00173] A inflamação é parte da resposta biológica complexa dos tecidos do corpo a estímulos prejudiciais, como patógenos, células danificadas ou irritantes, e é uma resposta protetora que envolve células imunes, vasos sanguíneos e mediadores moleculares. A função da inflamação é eliminar a causa inicial da lesão celular, limpar as células necróticas e os tecidos danificados pelo insulto original e o processo inflamatório e iniciar o reparo do tecido. A inflamação pode ocorrer por infecção, como sintoma ou doença, por exemplo, câncer, aterosclerose, alergias, miopatias, HIV, obesidade ou uma doença autoimune. Uma doença autoimune é uma condição crônica decorrente de uma resposta imune anormal a um autoantígeno. As doenças autoimunes que podem ser tratadas com os polipeptídeos divulgados neste documento incluem, mas não estão limitadas a lúpus, doença celíaca, diabetes mellitus tipo 1, doença de Graves, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, psoríase, artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistêmico.

[00174] A composição farmacêutica pode compreender uma ou mais sequência de ligante peptídico cliváveis por protease. A sequência de ligante peptídico serve para fornecer flexibilidade entre os polipeptídeos, de modo que cada polipeptídeo seja capaz de inibir a atividade do primeiro polipeptídeo. A sequência de ligante peptídico pode estar localizada entre qualquer ou todos os polipeptídeos de citocina, fragmento ou muteína deste, a fração de bloqueio e o elemento de extensão de meia-vida sérico. Opcionalmente, a composição compreende, duas, três, quatro ou cinco sequência de ligante peptídico. A sequência de ligante peptídico, duas, três ou quatro sequências de ligante peptídico podem ser as mesmas ou diferentes sequências de ligante peptídico. Em uma modalidade, a sequência de ligante peptídico compreende GGGGS (SEQ ID NO: 201), GSGSGS (SEQ ID NO: 202) ou G (SGGG)2SGGT (SEQ ID NO: 203). Em outra modalidade, o ligante peptídico compreende uma sequência clivável por protease selecionada do grupo consistindo em HSSKLQ (SEQ ID NO: 25), GPLGVRG (SEQ ID NO: 197), IPVSLRSG (SEQ ID NO: 198), VPLSLYSG (SEQ ID NO: 199) e SGESPAYYTA (SEQ ID NO: 200).

[00175] Em algumas modalidades, o ligante peptídico é clivado por uma protease selecionada do grupo consistindo em uma calicreína, trombina, quimase, carboxipeptidase A, catepsina G, uma elastase, PR-3, granzima M, uma calpaína, uma metaloproteinase de matriz (MMP), um ativador de plasminogênio, uma catepsina, uma caspase, uma triptase ou uma protease de superfície de célula tumoral.

[00176] Os ligantes peptídicos adequados podem ser de comprimentos diferentes, tais como de 1 aminoácido (por exemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos e podem ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 aminoácidos.

[00177] São fornecidos adicionalmente métodos de tratamento de um sujeito com ou em risco de desenvolver câncer. Os métodos compreendem administrar ao sujeito em necessidade desta uma quantidade eficaz de um polipeptídeo quimérico (uma proteína de fusão), conforme divulgado neste documento, que é tipicamente administrada como uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o método compreende ainda selecionar um sujeito com ou em risco de desenvolver câncer. A composição farmacêutica compreende preferencialmente uma citocina bloqueada, fragmento ou muteína desta que é ativada em um sítio de tumor. Preferencialmente, o tumor é um tumor sólido. O câncer pode ser, mas não limitado a, um câncer de cólon, um câncer de pulmão, um melanoma, um sarcoma, um carcinoma de células renais e um câncer de mama.

[00178] O método pode envolver adicionalmente a administração de um ou mais agentes adicionais para tratar o câncer, tais como agentes quimioterápicos (por exemplo, Adriamicina, Cerubidina, Bleomicina, Alkeran, Velban, Oncovin, Fluorouracila, Tiotepa, Metotrexato, Bisantreno, Noantrona, Tiguanina, Citaribina, Procarabizina), agentes imuno-oncológicos (por exemplo, anti-PD-L1, anti-CTLA4, anti-PD-1, anti-CD47, anti-GD2), terapias celulares (por exemplo, CAR-T, terapia de células T), vírus oncolíticos e semelhantes.

[00179] São fornecidas neste documento formulações farmacêuticas ou composições contendo os polipeptídeos quiméricos e um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições fornecidas neste documento são adequadas para administração in vitro ou in vivo. Por carreador farmaceuticamente aceitável entende-se um material que não é biologicamente, ou de outra forma, indesejável, isto é, o material é administrado a um paciente sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de um modo prejudicial com os outros componentes da formulação ou composição farmacêutica na qual está contido. O carreador é selecionado para minimizar a degradação do ingrediente ativo e minimizar os efeitos colaterais adversos no sujeito.

[00180] Os carreadores adequados e suas formulações são descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Edição, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005). Normalmente, uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é usada na formulação para tornar a formulação isotônica, embora a formulação possa ser hipertônica ou hipotônica se desejado. Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água estéril, solução salina, soluções tamponadas como solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é geralmente de cerca de 5 a cerca de 8 ou de cerca de 7 a 7,5. Outros carreadores incluem preparações de liberação sustentada, como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo os polipeptídeos imunogênicos. As matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, lipossomas ou micropartículas. Certos carreadores podem ser mais preferenciais dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração da composição a ser administrada. Os carreadores são aqueles adequados para a administração dos polipeptídeos quiméricos ou sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos quiméricos a humanos ou outros sujeitos.

[00181] As formulações são administradas de inúmeras maneiras, dependendo se um tratamento local ou sistêmico for desejado, e na área ser tratada. As composições são administradas por meio de qualquer uma das várias vias de administração, incluindo topicamente, oralmente, parentericamente, intravenosamente, intra-articularmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutaneamente, intracavidade, transdermicamente, intra-hepaticamente, intracranialmente, por nebulização/inalação, ou por instalação via broncoscopia. Em algumas modalidades, as composições são administradas localmente (não sistemicamente), incluindo intratumoralmente, intra-articularmente, intratecalmente, etc.

[00182] As preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietilenoglicol, óleos vegetais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etila. Os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, suspensões ou emulsões incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringe, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólitos (como os baseados em dextrose de Ringer) e semelhantes. Aditivos e outros conservantes estão opcionalmente presentes, como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes.

[00183] As formulações para a administração tópica incluem pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Carreadores farmacêuticos convencionais, aquosos, bases de pó ou oleosas, espessantes e semelhantes são opcionalmente necessários ou desejáveis.

[00184] As composições para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água ou meio não aquoso, cápsulas, sachês ou comprimidos. Espessantes, aromatizantes, diluentes, emulsionantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes são opcionalmente desejáveis.

[00185] Opcionalmente, os polipeptídeos quiméricos ou sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos quiméricos são administrados por um vetor. Existem várias composições e métodos que podem ser usados para transmitir as moléculas de ácido nucleico e/ou polipeptídeos às células, ou in vitro ou in vivo por meio de, por exemplo, vetores de expressão. Esses métodos e composições podem ser amplamente divididos em duas classes: sistemas de liberação baseados em vírus e sistemas de liberação com base não viral. Tais métodos são bem conhecidos na técnica e prontamente adaptáveis para uso com as composições e métodos descritos neste documento. Tais composições e métodos podem ser usados para transfectar ou transduzir células in vitro ou in vivo, por exemplo, para produzir linhagens celulares que expressam e, preferencialmente, segregam o polipeptídeo quimérico codificado ou para transmitir terapeuticamente ácidos nucleicos a um sujeito. Os componentes dos ácidos nucleicos quiméricos divulgados neste documento normalmente estão operacionalmente ligados na estrutura para codificar uma proteína de fusão.

[00186] Conforme usado neste documento, plasmídeos ou vetores virais são agentes que transportam os ácidos nucleicos divulgados para a célula sem degradação e incluem um promotor que produz a expressão da molécula de ácido nucleico e/ou polipeptídeo nas células nas quais é transmitido. Os vetores virais são, por exemplo, adenovírus, vírus adenoassociado, vírus do herpes, vírus da vacina, vírus da poliomielite, Sindbis e outros vírus de RNA, incluindo esses vírus com a estrutura do HIV. Também são preferenciais quaisquer famílias virais que compartilhem as propriedades desses vírus que os tornam adequados para uso como vetores. Os vetores retrovirais, em geral, são descritos por Coffin et al., Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997), que são incorporados neste documento por referência para os vetores e métodos de produzi-los. O construto de adenovírus deficientes para a replicação foi descrita (Berkner et al., J. Virol. 61: 1213-20 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2872-83 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virol. 57: 267-74 (1986); Davidson et al., J. Virol. 61: 1226-39 (1987); Zhang et al., BioTechniques 15: 868-72 (1993)). O benefício e o uso desses vírus como vetores é que eles são limitados na extensão em que podem se espalhar para outros tipos de células, uma vez que podem se replicar dentro de uma célula infectada inicial, mas são incapazes de formar novas partículas virais infecciosas. Os adenovírus recombinantes demonstraram alcançar alta eficiência após a liberação direta in vivo ao epitélio das vias aéreas, hepatócitos, endotélio vascular, parênquima do SNC e vários outros sítios de tecido. Outros sistemas úteis incluem, por exemplo, vetores de vírus vaccinia replicantes e restritos ao hospedeiro e não replicantes.

[00187] Os polipeptídeos e/ou moléculas de ácido nucleico fornecidos podem ser transmitidos por meio de partículas semelhantes a vírus. As partículas semelhantes a vírus (VLPs) consistem em proteínas virais derivadas das proteínas estruturais de um vírus. Os métodos para fazer e usar partículas semelhantes a vírus são descritos, por exemplo, em Garcea e Gissmann, Current Opinion in Biotechnology 15: 513-7 (2004).

[00188] Os polipeptídeos fornecidos podem ser transmitidos por corpos densos subvirais (DBs). Os DBs transportam proteínas para as células-alvo por fusão de membrana. Os métodos para fazer e usar DBs são descritos, por exemplo, Pepperl-Klindworth et al., Gene Therapy 10: 278-84 (2003).

[00189] Os polipeptídeos fornecidos podem ser transmitidos por agregados de tegumento. Os métodos para fazer e usar agregados de tegumento são descritos na Publicação Internacional N° WO 2006/110728.

[00190] Os métodos de liberação não baseados em vírus podem incluir vetores de expressão compreendendo moléculas de ácido nucleico e sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos, em que os ácidos nucleicos estão operacionalmente ligados a uma sequência de controle de expressão. As estruturas adequadas do vetor incluem, por exemplo, aquelas rotineiramente usadas na técnica, tais como plasmídeos, cromossomos artificiais, BACs, YACs ou PACs. Vários vetores e sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis em empresas como Novagen (Madison, Wis.), Clonetech (Pal Alto, Califórnia), Stratagene (La Jolla, Califórnia) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, Califórnia). Os vetores normalmente contêm uma ou mais regiões reguladoras. As regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências potenciadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteína, elementos induzíveis, sequências de ligação de proteína, regiões não traduzidas (UTRs) 5' e 3', sítios de início de transcrição, sequências de terminação, sequências de poliadenilação e íntrons. Esses vetores também podem ser usados para fazer os polipeptídeos quiméricos por expressão em uma célula hospedeira adequada, tal como células CHO.

[00191] Os promotores preferenciais que controlam a transcrição de vetores em células hospedeiras de mamífero podem ser obtidos a partir de várias fontes, por exemplo, os genomas de vírus, tais como polioma, vírus símio 40 (SV40), adenovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, mais preferencialmente, citomegalovírus (CMV), ou de promotores heterólogos de mamífero, por exemplo, promotor de β-actina ou promotor de EF1α, ou de promotores híbridos ou quiméricos (por exemplo, promotor de CMV fundido ao promotor de β-actina). Obviamente, os promotores da célula hospedeira ou espécies relacionadas também são úteis neste documento.

[00192] O intensificador geralmente se refere a uma sequência de DNA que funciona a uma distância fixa do sítio de partida da transcrição e pode ser 5' ou 3' para a unidade de transcrição. Além disso, os intensificadores podem estar dentro de um íntron, bem como dentro da própria sequência de codificação. Eles geralmente têm entre 10 e 300 pares de bases (bp) de comprimento e funcionam em cis. Os estimuladores geralmente funcionam para aumentar a transcrição de promotores próximos. Os intensificadores também podem conter elementos de resposta que medeiam a regulação da transcrição. Embora muitas sequências potenciadoras sejam conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, fetoproteína e insulina), tipicamente uma usará um potenciador de um vírus de célula eucariótica para expressão geral. Exemplos preferenciais são o potencializador SV40 no lado final da origem de replicação, o potencializador de promotor inicial do citomegalovírus, o potencializador de polioma no lado final da origem de replicação e potencializadores de adenovírus.

[00193] O promotor e/ou o intensificador podem ser indutíveis (por exemplo, regulado quimicamente ou fisicamente). Um promotor e/ou intensificador quimicamente regulado pode, por exemplo, ser regulado pela presença de álcool, tetraciclina, um esteroide ou um metal. Um promotor e/ou intensificador fisicamente regulado pode, por exemplo, ser regulado por fatores ambientais, como temperatura e luz. Opcionalmente, o promotor e/ou região intensificadora pode atuar como um promotor constitutivo e/ou intensificador para maximizar a expressão da região da unidade de transcrição a ser transcrita. Em certos vetores, o promotor e/ou a região intensificadora podem ser ativos de uma maneira específica do tipo de célula. Opcionalmente, em certos vetores, o promotor e/ou a região intensificadora podem ser ativos em todas as células eucarióticas, independentemente do tipo de célula. Os promotores preferenciais deste tipo são o promotor de CMV, o promotor de SV40, o promotor de β-actina, o promotor de EF1α e a repetição terminal longa retroviral (LTR).

[00194] Os vetores também podem incluir, por exemplo, origens de replicação e/ou marcadores. Um gene marcador pode conferir um fenótipo selecionável, por exemplo, resistência a antibióticos, em uma célula. O produto marcador é usado para determinar se o vetor foi transmitido à célula e, uma vez transmitido, é expresso. Exemplos de marcadores selecionáveis para células de mamíferos são di-hidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase, neomicina, análogo de neomicina G418, higromicina, puromicina e blasticidina. Quando esses marcadores selecionáveis são transferidos com sucesso para uma célula hospedeira de mamífero, a célula hospedeira de mamífero transformada pode sobreviver se colocada sob pressão seletiva. Exemplos de outros marcadores incluem, por exemplo, o gene lacZ de E. coli , proteína fluorescente verde (GFP) e luciferase. Além disso, um vetor de expressão pode incluir uma sequência com marca projetada para facilitar a manipulação ou detecção (por exemplo, purificação ou localização) do polipeptídeo expresso. Sequências de tag, como GFP, glutationa S-transferase (GST), poli-histidina, c-myc, hemaglutinina ou sequência de tag FLAG ™ (Kodak; New Haven, Conn.), são normalmente expressas como uma fusão com o polipeptídeo codificado. Essas marcações podem ser inseridas em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, incluindo nos terminais carboxila ou amino.

[00195] Conforme usados neste documento, os termos peptídeo, polipeptídeo ou proteína são usados de maneira ampla, significando dois ou mais aminoácidos ligados por uma ligação peptídica. Proteína, peptídeo e polipeptídeo também são usados neste documento de maneira intercambiável para se referir a sequências de aminoácidos. Deve-se reconhecer que o termo polipeptídeo não é usado neste documento para sugerir um tamanho ou quantidade específicos de aminoácidos que compreende a molécula e que um peptídeo da invenção pode conter até inúmeros resíduos de aminoácidos ou mais. Conforme usado ao longo do documento, sujeito pode ser um vertebrado, mais especificamente um mamífero (por exemplo, um humano, cavalo, gato, cachorro, vaca, porco, ovelha, cabra, camundongo, coelho, rato e porquinho-da- índia), aves, répteis, anfíbios, peixes e qualquer outro animal. O termo não denota uma idade ou sexo específico. Assim, sujeitos adultos e recém-nascidos, sejam do sexo masculino ou feminino, devem ser abrangidos. Conforme usado neste documento, paciente ou sujeito pode ser usado alternadamente e pode se referir a um sujeito com uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer). O termo paciente inclui sujeitos humanos e veterinários.

[00196] Um sujeito em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio pode ser geneticamente predisposto à doença ou distúrbio, por exemplo, ter um histórico familiar ou ter uma mutação em um gene que causa a doença ou distúrbio, ou mostrar sinais ou sintomas precoces da doença ou transtorno. Um sujeito atualmente com uma doença ou distúrbio tem um ou mais de um sintoma da doença ou distúrbio e pode ter sido diagnosticado com a doença ou distúrbio.

[00197] Os métodos e os agentes, conforme descritos neste documento, são úteis para o tratamento profilático e terapêutico. Para uso profilático, uma quantidade terapeuticamente eficaz dos polipeptídeos quiméricos ou sequências de ácido nucleico quiméricas que codificam os polipeptídeos quiméricos descritos neste documento são administrados a um sujeito antes do início (por exemplo, antes de sinais óbvios de câncer ou inflamação) ou durante o início precoce (por exemplo, após sinais e sintomas iniciais de câncer ou inflamação). A administração profilática pode ocorrer por vários dias a anos antes da manifestação dos sintomas de câncer ou inflamação. A administração profilática pode ser usada, por exemplo, no tratamento preventivo de sujeitos diagnosticados com uma predisposição genética ao câncer. O tratamento terapêutico envolve a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos polipeptídeos quiméricos ou sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos quiméricos descritos neste documento após o diagnóstico ou desenvolvimento de câncer ou inflamação (por exemplo, uma doença autoimune). O uso profilático também pode ser aplicado quando um paciente está sendo submetido a um tratamento, por exemplo, uma quimioterapia, na qual é esperada inflamação.

[00198] De acordo com os métodos ensinados neste documento, o sujeito é administrado com uma quantidade eficaz do agente (por exemplo, um polipeptídeo quimérico). Os termos quantidade eficaz e dosagem eficaz são usados indistintamente. O termo quantidade eficaz é definido como qualquer quantidade necessária para produzir uma resposta fisiológica desejada. Quantidades eficazes e horários para administrar o agente podem ser determinados empiricamente, e fazer tais determinações está dentro da habilidade na técnica. Os intervalos de dosagem para administração são aqueles grandes o suficiente para produzir o efeito desejado no qual um ou mais sintomas da doença ou distúrbio são afetados (por exemplo, reduzidos ou retardados). A dose não deve ser tão grande a ponto de causar efeitos colaterais adversos substanciais, como indesejáveis reações cruzadas, reações anafiláticas, e assim por diante. Geralmente, a dosagem irá variar com a idade, condição, sexo, tipo de doença, a extensão da doença ou distúrbio, via de administração ou se outros fármacos estão incluídos no regime e podem ser determinados por um versado no técnica. A dosagem pode ser ajustada pelo médico individual em caso de quaisquer contraindicações. As dosagens podem variar e podem ser administradas em uma ou mais doses diárias, por um ou vários dias. As orientações podem ser encontradas na literatura para as dosagens apropriadas para determinadas classes de produtos farmacêuticos.

[00199] Conforme usado neste documento, os termos tratamento, tratar ou tratar referem-se a um método de redução dos efeitos de uma doença ou condição ou sintoma da doença ou condição. Portanto, no método divulgado, o tratamento pode se referir a uma redução de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% na gravidade de uma doença estabelecida ou condição ou sintoma da doença ou condição. Por exemplo, um método para tratar uma doença é considerado um tratamento se houver uma redução de 10% em um ou mais sintomas da doença em um sujeito em comparação com um controle. Assim, a redução pode ser de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou qualquer percentual de redução entre 10% e 100% em comparação com os níveis nativos ou de controle. Entende-se que o tratamento não se refere necessariamente à cura ou ablação completa da doença, condição ou sintomas da doença ou condição.

[00200] Conforme usado neste documento, os termos prevenir, prevenir e prevenção de uma doença ou distúrbio referem-se a uma ação, por exemplo, a administração do polipeptídeo quimérico ou sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo quimérico, que ocorre antes ou em aproximadamente ao mesmo tempo, um sujeito começa a mostrar um ou mais sintomas da doença ou distúrbio, que inibe ou retarda o início ou a exacerbação de um ou mais sintomas da doença ou distúrbio. Conforme usado neste documento, as referências à diminuição, redução ou inibição incluem uma mudança de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um nível de controle. Esses termos podem incluir, mas não necessariamente incluem a eliminação completa.

[00201] Foram desenvolvidas variantes de IL-2 que são seletivas para IL2Rαβγ em relação a IL2Rβγ (Shanafelt, AB, et al., 2000, Nat Biotechnol.18: 1197-202; Cassell, DJ, et. Al., 2002, Curr Pharm Des., 8: 2171-83). Estas variantes têm substituições de aminoácidos que reduzem sua afinidade para IL2RB. Como IL-2 tem afinidade indetectável para IL2RG, essas variantes, consequentemente, têm afinidade reduzida para o complexo de receptor IL2Rβγ e capacidade reduzida de ativar células que expressam IL2Rβγ, mas retêm a capacidade de se ligar a IL2RA e a capacidade de ligar e ativar o complexo de receptor IL2Rαβγ.

[00202] Uma dessas variantes, IL2/N88R (Bay 50-4798), foi clinicamente testada como uma versão de baixa toxicidade de IL-2 como um estimulador do sistema imunológico, com base na hipótese de que células NK que expressam IL2Rβγ são os principais contribuintes para a toxicidade. Bay 50- 4798 demonstrou estimular seletivamente a proliferação de células T ativadas em relação às células NK e foi avaliado em ensaios clínicos de fase I/II em pacientes com câncer (Margolin, K., et. Al., 2007, Clin Cancer Res., 13: 3312-9) e pacientes com HIV (Davey, RT, et. Al., 2008, J Interferon Cytokine Res., 28: 89-100). Esses ensaios clínicos mostraram que o Bay 50-4798 era consideravelmente mais seguro e tolerável do que a aldesleucina, e também mostrou que aumentava os níveis de células T CD4+CD25+, uma população de células enriquecida em células Treg. Em seguida a esses ensaios, a pesquisa no campo estabeleceu mais completamente a identidade das células Treg e demonstrou que as células Treg expressam seletivamente IL2Rαβγ (revisado em Malek, TR, et al., 2010, Immunity, 33: 153-65).

[00203] Além disso, podem ser feitos mutantes que alteram seletivamente a afinidade para a cadeia de CD25 em relação ao Il-2 nativo.

[00204] IL-2 pode ser projetada para produzir mutantes que se ligam ao complexo IL-2R geralmente ou à subunidade IL-2Rα especificamente com uma afinidade que difere daquela da IL-2 do tipo selvagem correspondente ou de um mutante atualmente disponível (referido como C125S, como o resíduo de cisteína na posição 125 é substituído por um resíduo de serina).

[00205] Consequentemente, a presente invenção apresenta polipeptídeos de interleucina-2 mutante (IL-2 *) que incluem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à IL-2 do tipo selvagem (por exemplo, 85, 87, 90, 95, 97, 98, ou 99% idênticos) e que se ligam, em comparação com IL-2 WT, com maior ao receptor trimérico de IL-2 em relação ao receptor de IL-2 dimérico. Normalmente, as muteínas também se ligarão a uma subunidade α do receptor de IL-2 (IL-2Rα) com uma afinidade que é maior do que a afinidade com a qual a IL-2 do tipo selvagem se liga ao IL-2Rα. A sequência de aminoácidos dentro dos polipeptídeos mutantes de IL-2 pode variar de SEQ ID NO: 1 (número de acesso UniProtKB P60568) em virtude de conter (ou conter apenas) uma ou mais substituições de aminoácidos, que podem ser consideradas substituições conservativas ou não conservativas. Aminoácidos não naturais também podem ser incorporados. Alternativamente, ou além disso, a sequência de aminoácidos pode variar de SEQ ID NO: 1 (que pode ser considerada a sequência de "referência") em virtude de conter e adicionar e/ou deletar um ou mais resíduos de aminoácidos. Mais especificamente, a sequência de aminoácidos pode diferir daquela da SEQ ID NO: 1 em virtude de uma mutação em pelo menos uma das seguintes posições da SEQ ID NO: 1: 1, 4, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 26, 29, 30, 31, 35, 37, 46, 48, 49, 54, 61, 64, 67, 68, 69, 71, 73, 74, 75, 76, 79, 88, 89, 90, 92, 99, 101, 103, 114, 125, 128 ou 133 (ou combinações destas). Conforme observado, apenas uma dessas posições pode ser alterada, assim como duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou 11 ou mais (incluindo até todas) das posições.

Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode diferir da SEQ ID NO: 1 nas posições 69 e 74 e adicionalmente em uma ou mais das posições 30, 35 e 128. A sequência de aminoácidos também pode diferir de SEQ ID NO: 2 (conforme divulgado em US 7569215, incorporado neste documento por referência) em um dos seguintes conjuntos de posições: (a) posições 64, 69 e 74; (b) posições 69, 74 e 101; (c) posições 69, 74 e 128; (d) posições 30, 69, 74 e 103; (e) posições 49, 69, 73 e 76; (f) posições 69, 74, 101 e 133; (g) posições 30, 69, 74 e 128; (h) posições 69, 74, 88 e 99; (i) posições 30, 69, 74 e 128; (j) posições 9, 11, 35, 69 e 74; (k) posições 1, 46, 49, 61, 69 e 79; (1) posições 48, 68, 71, 90, 103 e 114; (m) posições 4, 10, 11, 69, 74, 88 e 133; (n) posições 15, 30, 31, 35, 48, 69, 74 e 92; (O) posições 30, 68, 69, 71, 74, 75, 76 e 90; (p) posições 30, 31, 37, 69, 73, 74, 79 e 128; (q) posições 26, 29, 30, 54, 67, 69, 74 e 92; (r) posições 8, 13, 26, 30, 35, 37, 69, 74 e 92; e (s) posições 29, 31, 35, 37, 48, 69, 71, 74, 88 e 89. Com exceção das mutações nessas posições, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo mutante de IL-2 pode ser idêntica à SEQ ID NO: 1. Com relação a substituições específicas, a sequência de aminoácidos pode diferir da SEQ ID NO: 1 em virtude de ter uma ou mais das seguintes mutações: A1T, S4P, K8R, K9T, T10A, Q11R, Q13R, E15K, N26D, N29S, N30S, N30D, N30T, Y31H, Y31C, K35R, T37A, T37R, M46L, K48E, K49R, K49E, K54R, E61D, K64R, E67G, E68D, V69A, N71T, N71A, N71R, A73V, Q74P, S75P, K76E, K76R, H79R, N88D, I89V, N90H, I92T, S99P, T101A, F103S, I114V, I128T, I128A, T133A ou T133N.

Nossa nomenclatura é consistente com a da literatura científica, onde o código de uma única letra do aminoácido no tipo selvagem ou sequência de referência é seguido por sua posição dentro da sequência e, em seguida, pelo código de uma única letra do aminoácido com o qual é substituído.

Portanto, A1T designa uma substituição do resíduo de alanina na posição 1 por treonina. Outros polipeptídeos mutantes dentro do escopo da invenção incluem aqueles que incluem um mutante de SEQ ID NO: 2 tendo substituições em V69 (por exemplo, A) e Q74 (por exemplo, P). Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode incluir um dos seguintes conjuntos de mutações em relação à SEQ ID NO: 2: (a) K64R, V69A e Q74P; (b) V69A, Q74P e T101A; (c) V69A, Q74P e I128T; (d) N30D, V69A, Q74P e F103S; (e) K49E, V69A, A73V e K76E; (f) V69A, Q74P, T101A e T133N; (g) N30S, V69A, Q74P e I128A; (h) V69A, Q74P, N88D e S99P; (i) N30S, V69A, Q74P e I128T; (j) K9T, Q11R, K35R, V69A e Q74P; (k) A1T, M46L, K49R, E61D, V69A e H79R; (l) K48E, E68D, N71T, N90H, F103S e I114V; (m) S4P, T10A, Q11R, V69A, Q74P, N88D e T133A; (n) E15K, N30S Y31H, K35R, K48E, V69A, Q74P e I92T; (o) N30S, E68D, V69A, N71A, Q74P, S75P, K76R e N90H; (p) N30S, Y31C, T37A, V69A, A73V, Q74P, H79R e I128T; (q) N26D, N29S, N30S, K54R, E67G, V69A, Q74P e I92T; (r) K8R, Q13R, N26D, N30T, K35R, T37R, V69A, Q74P e I92T; e (s) N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P, N88D e I89V. SEQ ID NO: 2 é divulgada em US 7569215, que é incorporada neste documento por referência como um exemplo de sequência polipeptídica de IL-2 que pode ser usada na invenção.

[00206] Conforme observado acima, qualquer um dos polipeptídeos mutantes de IL-2 divulgados neste documento pode incluir as sequências descritas; eles também podem ser limitados às sequências descritas e de outra forma idênticas à SEQ ID NO: 1. Além disso, qualquer um dos polipeptídeos mutantes de IL-2 descritos neste documento pode incluir opcionalmente uma substituição do resíduo de cisteína na posição 125 por outro resíduo (por exemplo, serina) e/ou pode incluir opcionalmente uma deleção do resíduo de alanina na posição 1 de SEQ ID NO: 1.

[00207] Os polipeptídeos mutantes de IL-2 divulgados neste documento podem se ligar à subunidade de IL-2Rα com um Kd de menos do que cerca de 28 nM (por exemplo, menos do que cerca de 25 nM; menos do que cerca de 5 nM; cerca de 1 nM; menos do que cerca de 500 pM; ou menos do que cerca de

100 pM). Mais especificamente, um polipeptídeo de IL-2 mutante pode ter uma constante de equilíbrio de afinidade inferior a 1,0 nM (por exemplo, cerca de 0,8, 0,6, 0,4 ou 0,2 nM). A afinidade também pode ser expressa como uma taxa relativa de dissociação de uma subunidade de IL-2Rα ou de um complexo receptor de IL-2 (por exemplo, um complexo expresso na superfície de uma célula ou de outra forma ligado à membrana). Por exemplo, os polipeptídeos mutantes de IL-2 podem se dissociar de, por exemplo, IL-2Rα, a uma taxa diminuída em relação a um polipeptídeo do tipo selvagem ou a um agente terapêutico baseado em IL-2, por exemplo, IL-2*. Alternativamente, a afinidade pode ser caracterizada como o tempo, ou tempo médio, em que um polipeptídeo IL-2* persiste, por exemplo, na superfície de uma célula que expressa uma IL- 2R. Por exemplo, um polipeptídeo IL-2* pode persistir no receptor por pelo menos cerca de 2, 5, 10, 50, 100 ou 250 vezes (ou mais).

[00208] São divulgados materiais, composições e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados em preparação para, ou são produtos dos métodos e composições divulgados. Estes e outros materiais são divulgados neste documento, e compreende-se que quando combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc. destes materiais são divulgados que, enquanto referência específica das várias combinações individuais e coletivas e permutação desses compostos não pode ser explicitamente divulgada, cada uma é especificamente contemplada e descrita neste documento. Por exemplo, se um método é divulgado e discutido e um certo número de modificações que podem ser feitas a uma série de moléculas, incluindo o método são discutidos, cada uma e todas as combinações e permutações do método, e as modificações que são possíveis são especificamente contempladas, a menos que especificamente indicado em contrário. Da mesma forma, qualquer subconjunto ou combinação destes também é especificamente contemplado e divulgado. Este conceito aplica-se a todos os aspectos desta divulgação, incluindo, mas não se limitando a, etapas nos métodos usando as composições divulgadas. Portanto, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser executadas, compreende-se que cada uma dessas etapas adicionais pode ser realizada com quaisquer etapas de método específicas ou combinação de etapas dos métodos divulgados, e que cada tal combinação ou subconjunto de combinações é especificamente contemplado e deve ser considerado divulgado.

[00209] As publicações citadas neste documento e os materiais citados são especificamente incorporados por referência, em sua totalidade, neste documento.

EXEMPLOS

[00210] A seguir encontram-se exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras modalidades podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida neste documento. Exemplo 1: Detecção de IL-2, IL-2 muteína, IL-2Rα e IL-2Rγ em Proteínas de Fusão por ELISA

[00211] A muteína de IL-2 é detectada com um anticorpo comercialmente disponível, por exemplo, o monoclonal anti-IL-2 (JES6-1A12) (BD Pharmingen; San Jose, CA). Um controle positivo é usado para mostrar se o anticorpo monoclonal reconhece a citocina ou muteína. Anticorpos contra IL- 2Rα e cadeia de IL-2Rγ também são usados. Os poços de uma placa de 96 poços são revestidos com um anticorpo (2,5 μg/ml) em PBS. Os poços são bloqueados com 5% de leite desnatado em PBS com 0,2% de Tween®20 (PBS- M-Tw) e as proteínas de fusão são adicionadas durante 1-2 horas a 37°C. Após a lavagem, um anticorpo marcado com anti-IL-2,, por exemplo, JES5H4 (BD Pharmingen) é adicionado e a ligação é detectada usando Strepavidin HRP (Southern Biotechnology Associates; Birmingham, Ala.). A placa ELISA é desenvolvida pela adição de 50 μl de O-fenilenodiamina (OPD) (Sigma-Aldrich) em 0,1 M de Citrato, pH 4,5 e 0,04% de H 2O2, interrompida pela adição de 50 μl/poço, 2N H2SO4 e a absorbância foi lida a 490 nm. Exemplo 2: Clivagem de Protease da Proteína de Fusão pela Protease MMP9

[00212] Um versado na técnica estaria familiarizado com métodos de configuração de ensaio de clivagem de proteína. 100ug de proteína em 1xPBS pH 7,4 foram clivados com 1 ug de MMP9 ativo (catálogo Sigma # SAE0078-50 ou catálogo Enzo BML-SE360) e incubados em temperatura ambiente durante até 16 horas. A proteína digerida é, em seguida, usada em ensaios funcionais ou armazenada a -80°C antes do teste. A extensão da clivagem foi monitorada por SDS PAGE usando métodos bem conhecidos na técnica. Conforme mostrado nas FIGs. 10, 13, 18a, 18b, 24b, 24c e 27a, uma clivagem total das proteínas de fusão pela protease MMP9 é observada. Exemplo 3: Ensaio de CTLL-2

[00213] As células CTLL2 (ATCC) foram semeadas em suspensão a uma concentração de 500.000 células/poço em meio de cultura com ou sem albumina sérica humana (HSA) 40mg/ml e estimuladas com uma série de diluições de hIL2 recombinante ou hIL2 ativável durante 72 horas a 37°C e 5% de CO2. A atividade de hIL2 ativável não clivada e clivada foi testada. A hIL2 ativável clivada foi gerada por incubação com MMP9 ativa. A atividade celular foi avaliada usando um ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência CellTiter-Glo (Promega). Os resultados são mostrados nas FIGs. 8, 9 e 25. Exemplo 4: Clivagem de protease do polipeptídeo quimérico IL-2/IL- 2Rα/IL-2Rγ resulta em maior acessibilidade a anticorpos e muteína de IL-2 biologicamente ativa

[00214] As proteínas de fusão da muteína de IL-2 são bioquimicamente caracterizadas antes e após a clivagem com uma protease, por exemplo, PSA. As análises de imunoblot mostrarão que as proteínas de fusão podem ser clivadas por PSA e que há um aumento na intensidade do produto de clivagem de baixo peso molecular previsto de aproximadamente 20 kDa reativo com um anticorpo anti-IL-2 após o tratamento das amostras com PSA. O grau de clivagem depende da quantidade de PSA, bem como do tempo de incubação. Curiosamente, quando a proteína de fusão é analisada antes e depois do tratamento com PSA por ELISA, verificou-se que a quantidade aparente de IL-2 aumenta após a clivagem do PSA. Nesta experiência, existe um aumento de aproximadamente 2 ou 4 vezes na quantidade aparente de IL-2 detectada usando este ELISA sanduíche dependendo do construto, sugerindo que a ligação do anticorpo é parcialmente impedida na proteína de fusão intacta. Alíquotas das mesmas amostras também são analisadas após o tratamento com PSA usando a linhagem celular CTLL-2 que requer IL-2 para crescimento e sobrevivência e a viabilidade das células pode ser verificada usando o ensaio MTT colorimétrico. Neste ensaio, quanto mais um sobrenadante puder ser diluído, mais IL-2 biologicamente ativa ele conterá, e há um aumento na quantidade de IL-2 biologicamente ativa após a clivagem de PSA. A quantidade de aumento da muteína de IL-2 irá sugerir que após a clivagem de PSA há um aumento no fragmento de clivagem de baixo peso molecular previsto de aproximadamente 20 kDa reativo com um anticorpo anti-IL-2, um aumento na acessibilidade do anticorpo e, o mais importante, um aumento na quantidade de muteína de IL-2 biologicamente ativa. Exemplo 5: Liberação In Vivo de uma Proteína de Fusão Ativada por Protease Resulta em Redução no Crescimento Tumoral

[00215] O polipeptídeo quimérico é examinado para determinar se poderia ter efeitos biológicos in vivo. Para esses experimentos, um sistema é usado no qual as células tumorais injetadas de forma intraperitoneal rápida e preferencialmente fixam-se e crescem inicialmente nas manchas leitosas, uma série de agregados imunes organizados encontrados no omento (Gerber et al., Am. J. Pathol. 169:1739-52 (2006)). Este sistema oferece uma maneira conveniente de examinar os efeitos do tratamento com proteína de fusão no crescimento tumoral, uma vez que as proteínas de fusão podem ser liberadas por via intraperitoneal várias vezes, e o crescimento tumoral pode ser analisado examinando as células omentais dissociadas. Para esses experimentos, a linhagem celular Colon 38, uma linhagem celular de tumor de crescimento rápido que expressa tanto MMP2 quanto MMP9 in vitro, pode ser usada. O tecido omental normalmente expressa uma quantidade relativamente pequena de MMP2 e MMP9, mas, quando o tumor da Colon 38 está presente no omento, os níveis de MMP aumentam. Usando este modelo de tumor, a capacidade das proteínas de fusão de muteína de IL-2 para afetar o crescimento tumoral é examinada. As células da Colon 38 são injetadas por via intraperitoneal, permite- se que se fixem e cresçam por 1 dia e, em seguida, são tratadas diariamente com proteína de fusão por via interaperitoneal. No dia 7, os animais são sacrificados e o omento é examinado quanto ao crescimento tumoral usando citometria de fluxo e por um ensaio de formação de colônia. Exemplo 6: Construção de um CD20 de Direcionamento de Proteína IL2 Ativável Exemplificativa Geração de um domínio de IL2 ativável

[00216] Um polipeptídeo de IL-2 capaz de se ligar a um polipeptídeo de CD20 presente em um tumor ou em uma célula tumoral é produzido como segue. É produzido um ácido nucleico que contém sequências de ácido nucleico: (1) codificando uma sequência de polipeptídeo IFNg e (2) um ou mais ligantes polipeptídicos. Os construtos de plasmídeos de interleucina ativável podem ter Flag, His ou outras tags de afinidade opcionais, e são eletroporados para HEK293 ou outras linhagens celulares de humano ou de mamífero adequadas e purificadas. Os ensaios de validação incluem ensaios de ativação de células T que usam células T responsivas à estimulação de IFNg na presença de uma protease. Geração de um domínio de ligação scFv CD20

[00217] A CD20 é uma das proteínas de superfície celular presentes nos linfócitos B. O antígeno CD20 é encontrado em linfócitos pré-B e B maduros normais e malignos, incluindo aqueles em mais de 90% dos linfomas não- Hodgkin (LNH) de células B. O antígeno está ausente nas células-tronco hematopoiéticas, nos linfócitos B ativados (células plasmáticas) e no tecido normal. Dessa forma, vários anticorpos principalmente de origem murina foram descritos: 1F5, 2B8/C2B8, 2H7 e 1H4.

[00218] Os anticorpos anti-CD20 humanos ou humanizados são, portanto, usados para gerar sequências de scFv para domínios de ligação a CD20 de uma proteína de interleucina ativável. Sequências de DNA que codificam domínios VL e VH humanos ou humanizados são obtidas, e os códons para os construtos são, opcionalmente, otimizados para expressão em células de Homo sapiens. A ordem em que os domínios VL e VH aparecem no scFv é variada (ou seja, orientação VL-VH ou VH-VL), e três cópias de "G4S" (SEQ ID NO.: 201) ou “G4S” (SEQ ID NO.: 201) subunidade (G4S)3 (SEQ ID NO.: 204) conectam os domínios variáveis para criar o domínio de scFv. Os construtos de plasmídeos de scFv anti-CD20 podem ter Flag, His ou outras tags de afinidade opcionais, e são eletroporados para HEK293 ou outras linhagens celulares de humano ou de mamífero adequadas e purificadas. Os ensaios de validação incluem análise de ligação por FACS, análise cinética usando Proteon e coloração de células que expressam CD20. Clonagem de construtos de expressão de DNA que codificam a proteína IL2 ativável

[00219] O construto de IL2 ativável com domínios de sítio de clivagem de protease é usado para construir uma proteína interleucina ativável em combinação com um domínio de scFv anti-CD20 e um elemento de extensão da meia-vida sérica (por exemplo, um peptídeo de ligação de HSA ou domínio VH), com os domínios organizados conforme mostrado na Figura 11. Para a expressão de uma proteína interleucina ativável em células CHO, as sequências de codificação de todos os domínios de proteína são clonadas em um sistema de vetor de expressão de mamífero. Em resumo, as sequências genéticas que codificam o domínio de interleucina ativável, o elemento de extensão da meia- vida sérica e o domínio de ligação de CD20 juntamente com os ligantes peptídicos L1 e L2 são sintetizadas e subclonadas separadamente. Os construtos resultantes são então ligados entre si na ordem do domínio de ligação de CD20 – L1 – IL2, subunidade 1 – L2 –, domínio de clivagem de protease – L3 – IL2, subunidade 2 – L4 – anti-CD20 scFv – L5 –, elemento de extensão de meia-vida sérica para produzir um construto final. Todos os construtos de expressão são projetados para conter sequências de codificação para um peptídeo sinal N-terminal e uma (6xHis)-tag de hexa-histidina do terminal C (SEQ ID NO.: 205) para facilitar a secreção e purificação de proteínas, respectivamente. Expressão de proteínas IL2 ativáveis em células CHO transfectadas de forma estável

[00220] Um sistema de expressão de células CHO (Flp-In®, Life Technologies), um derivado de células de ovário de Hamster Chinês CHO-K1 (ATCC, CCL-61) (Kao e Puck, Proc. Natl. Acad Sci USA 1968;60(4):1275-81), é usado. As células aderentes são subcultivadas de acordo com os protocolos de cultura celular padrão fornecidos pela Life Technologies.

[00221] Para adaptação ao crescimento em suspensão, as células são separadas dos frascos de cultura de tecidos e colocadas em meio sem soro. As células adaptadas à suspensão são criopreservadas em meio com 10% de DMSO.

[00222] As linhagens celulares de CHO recombinantes que expressam, de forma estável, proteínas interleucina ativáveis secretadas são geradas por transfecção de células adaptadas a suspensão. Durante a seleção com o antibiótico Higromicina B, as densidades celulares viáveis são medidas duas vezes por semana, e as células são centrifugadas e ressuspensas em meio de seleção novo a uma densidade máxima de 0,1x106 células viáveis/mL. Agrupamentos de células que expressam, de forma estável, proteínas interleucina ativáveis são recuperados após 2-3 semanas de seleção, ponto em que as células são transferidas para o meio de cultura padrão em frascos de agitação. A expressão de proteínas secretadas recombinantes é confirmada pela realização de eletroforese em gel de proteínas ou citometria de fluxo. Os agrupamentos de células estáveis são criopreservados em meio contendo DMSO.

[00223] As proteínas IL2 ativáveis são produzidas em culturas descontínuas alimentadas de 10 dias de linhagens celulares de CHO transfectadas de forma estável por secreção no sobrenadante da cultura celular. Os sobrenadantes da cultura celular são colhidos após 10 dias em viabilidades de cultura de, tipicamente, >75%. Amostras são coletadas das culturas de produção em dias alternados, e a densidade celular e a viabilidade são avaliadas. No dia da coleta, os sobrenadantes da cultura celular são limpos por centrifugação e filtração a vácuo antes de serem usados.

[00224] Os títulos de expressão de proteína e a integridade do produto em sobrenadantes de cultura celular são analisados por SDS-PAGE. Purificação de proteínas IL2 ativáveis

[00225] Proteínas IL2 ativáveis são purificadas a partir de sobrenadantes de cultura celular de CHO em um procedimento de duas etapas. Os construtos são submetidos a cromatografia de afinidade em uma primeira etapa, seguido por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) preparativa em Superdex 200 em uma segunda etapa. As amostras são trocadas por tampão e concentradas por ultrafiltração a uma concentração típica de >1 mg/mL. A pureza e a homogeneidade (tipicamente >90%) das amostras finais são avaliadas por SDS PAGE sob condições redutoras e não redutoras, o que é seguido por imunoblot usando um anticorpo anti-HSA ou anti-idiotipo, bem como por SEC analítica, respectivamente. As proteínas purificadas são armazenadas em alíquotas a - 80°C até o uso. Exemplo 7: Determinação da afinidade do antígeno por citometria de fluxo

[00226] As proteínas interleucina ativáveis do Exemplo 1 são testadas quanto às suas afinidades de ligação a células CD20 + humanas e células CD20+ de cynomolgus.

[00227] As células CD20+ são incubadas com 100 µL de diluições em série das proteínas interleucina ativáveis do Exemplo 1 e pelo menos uma protease. Após três lavagens com tampão FACS, as células são incubadas com 0,1 mL de anticorpo anti-idiotipo monoclonal de camundongo a 10 µg/mL no mesmo tampão durante 45 min em gelo. Após um segundo ciclo de lavagem, as células são incubadas com 0,1 mL de anticorpos IgG anti-camundongo de cabra conjugados com FITC a 15 µg/mL nas mesmas condições anteriores. Como um controle, as células são incubadas com a IgG anti-His seguida pelos anticorpos IgG de cabra anti-camundongo conjugados com FITC sem as proteínas IL2 ativáveis. As células foram então lavadas novamente e ressuspensas em 0,2 mL de tampão FACS contendo 2 µg/mL de iodeto de propídio (PI) para excluir células mortas. A fluorescência de 1x104 células vivas é medida usando um citômetro de fluxo Beckman-Coulter FC500 MPL usando o software MXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) ou um citômetro de fluxo Millipore Guava EasyCyte usando o software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemanha). As intensidades de fluorescência médias das amostras de células são calculadas usando software CXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) ou software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemanha). Depois de retirar os valores de intensidade de fluorescência das células coradas apenas com os reagentes secundários e terciários, os valores são então usados para o cálculo dos valores KD com a equação para ligação de um sítio (hipérbole) do GraphPad Prism (versão 6.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla Califórnia EUA).

[00228] A ligação e a reatividade cruzada de CD20 são avaliadas nas linhagens celulares tumorais CD20+ humanas. A razão de KD de reatividade cruzada é calculada usando os valores de KD determinados nas linhagens celulares de CHO que expressam antígenos de cynomolgus recombinantes ou antígenos de humanos recombinantes. Exemplo 8: Ensaio de Citotoxicidade

[00229] A proteína interleucina ativável do Exemplo 6 é avaliada in vitro na sua mediação da resposta imune a células-alvo CD20+.

[00230] As células CD20+ REC-1 marcadas com fluorescência (uma linhagem celular de linfoma de células do manto, ATCC CRL-3004) são incubadas com PBMC isoladas de doadores aleatórios ou células T CB15 (linhagem de células T padronizada) como células efetoras na presença da proteína IL2 ativável do Exemplo 6 e pelo menos uma protease. Após incubação por 4 h a 37 °C em uma incubadora umidificada, a liberação do corante fluorescente das células-alvo para o sobrenadante é determinada em um espectrofluorímetro. As células-alvo incubadas sem a proteína IL2 ativável do Exemplo 6 e células-alvo totalmente lisadas pela adição de saponina no final da incubação servem como controles negativos e positivos respectivamente.

[00231] Com base nas células-alvo vivas restantes medidas, a porcentagem de lise celular específica é calculada de acordo com a seguinte fórmula: [1-(número de alvos vivos(amostra)/número de alvos vivos(espontâneo))] x 100%. As curvas de resposta à dose sigmoidais e os valores de EC 50 são calculados por regressão não linear/ajuste logístico de 4 parâmetros usando o software GraphPad. Os valores de lise obtidos para uma determinada concentração de anticorpos são usados para calcular curvas de resposta à dose sigmoidais por análise de ajuste logístico de 4 parâmetros usando o software Prism. Exemplo 9: Farmacocinética de Proteínas interleucina ativáveis

[00232] A proteína interleucina ativável do Exemplo 5 é avaliada quanto à meia-vida de eliminação em estudos com animais.

[00233] A proteína IL2 ativável é administrada em macacos cynomolgus como uma injeção em bolus a 0,5 mg/kg na veia safena. Outro grupo de macacos cynomolgus recebe um construto de IL2 comparável em tamanho, mas sem um elemento de prolongamento da meia-vida sérica. Um terceiro e um quarto grupos recebem um construto de IL2 com elementos de extensão da meia-vida sérica e uma citocina com CD20 e elementos de extensão da meia-vida sérica respectivamente, e ambos comparáveis em tamanho à proteína interleucina ativável. Cada grupo de teste consiste em 5 macacos. As amostras de soro são colhidas em pontos de tempo indicados, diluídas em série, e a concentração das proteínas é determinada usando um ELISA de ligação a CD20.

[00234] A análise farmacocinética é realizada usando as concentrações plasmáticas do artigo de teste. Os dados de plasma médios do grupo para cada artigo de teste estão em conformidade com um perfil multiexponencial quando plotados em relação ao tempo pós-dosagem. Os dados são ajustados por um modelo de dois compartimentos padrão com entrada de bolus e constantes de taxa de primeira ordem para as fases de distribuição e eliminação. A equação geral para o melhor ajuste dos dados para administração i.v. é: c(t)=Ae −αt+Be−βt, onde c(t) é a concentração plasmática no tempo t, A e B se interceptam no eixo Y, e α e β são as constantes de taxa de primeira ordem aparentes para as fases de distribuição e eliminação respectivamente. A fase α é a fase inicial da depuração e reflete a distribuição da proteína em todo o fluido extracelular do animal, enquanto a segunda porção ou porção da fase β da curva de decaimento representa a depuração plasmática verdadeira. Os métodos para ajustar tais equações são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, A=D/V(α−k21)/(α−β), B=D/V(β−k21)/(α−β), e α e β (para α>β) são raízes da equação quadrática: r2+(k12+k21+k10)r+k21k10=0 usando parâmetros estimados de V=volume de distribuição, k10=taxa de eliminação, k12=taxa de transferência do compartimento 1 para o compartimento 2 e k21=taxa de transferência do compartimento 2 para o compartimento 1 e D=dose administrada.

[00235] Análise de dados: Gráficos de concentração versus perfis de tempo são feitos usando KaleidaGraph (KaleidaGraph™ V. 3.09 Copyright 1986-

1997. Synergy Software. Reading, Pa.). Os valores relatados como menos do que relatáveis (LTR) não são incluídos na análise de PK e não são representados graficamente. Os parâmetros farmacocinéticos são determinados por análise compartimental usando o software WinNonlin (WinNonlin® Professional V. 3.1 WinNonlin™ Copyright 1998-1999. Pharsight Corporation. Mountain View, Calif). Os parâmetros farmacocinéticos são calculados conforme descrito em Ritschel W A e Kearns G L, 1999, IN: Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 5ª edição, American Pharmaceutical Assoc., Washington,

DC

[00236] Espera-se que a proteína interleucina ativável do Exemplo 5 tenha parâmetros farmacocinéticos aprimorados, como um aumento na meia-

vida de eliminação em comparação com proteínas sem um elemento de extensão da meia-vida sérica. Exemplo 10: Modelo de Tumor de Xenoenxerto

[00237] A proteína IL2 ativável do Exemplo 6 é avaliada em um modelo de xenoenxerto.

[00238] Camundongos NOD/scid imunodeficientes fêmeas são irradiados subletalmente (2 Gy) e inoculados por via subcutânea com 4x10 6 células Ramos RA1 no flanco dorsal direito. Quando os tumores atingem 100 a 200 mm3, os animais são alocados em 3 grupos de tratamento. Os grupos 2 e 3 (8 animais cada) são injetados por via intraperitoneal com 1,5x10 7 células T humanas ativadas. Três dias depois, os animais do Grupo 3 são subsequentemente tratados com um total de 9 doses intravenosas de 50 µg de proteína interleucina ativável do Exemplo 6 (qdx9d). Os grupos 1 e 2 são tratados apenas com veículo. O peso corporal e o volume tumoral são determinados durante 30 dias.

[00239] Espera-se que os animais tratados com a proteína interleucina ativável do Exemplo 5 tenham um atraso estatisticamente significativo no crescimento tumoral em comparação com o respectivo grupo de controle tratado com veículo.

[00240] Embora as modalidades preferíveis da presente invenção tenham sido mostradas e descritas neste documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas somente a título de exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles versados na técnica, sem que haja afastamento da invenção. Deve-se entender que diversas alternativas às modalidades da invenção descritas neste documento podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos. Exemplo 11: Ensaio de Sobrevida de Células IFNg WEHI de

Camundongo

[00241] As células WEHI279 (ATCC) foram semeadas em suspensão a uma concentração de 25.000 células/poço em meio de cultura com ou sem 1,5% de albumina sérica humana (HSA) e estimuladas com uma série de diluições de mIFNg recombinante ou mIFNg induzível durante 72 horas a 37C e 5% de CO2. A atividade de mIFNg indutível não clivado e clivado foi testada. A mIFNg indutível clivada foi gerada por incubação com MMP9 ativa. A sobrevida celular foi avaliada usando um ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência CellTiter-Glo (Promega). Os valores de EC50 para moléculas de mIFNg indutíveis clivadas foram pelo menos 100x mais potentes do que as moléculas de mIFNg indutíveis não clivadas. Conforme mostrado na FIG. 16, foi observada maior indutibilidade em ensaios em que o meio de cultura continha albumina sérica humana. Exemplo 12: Ensaio de Célula Repórter IFNg B16 de Camundongo

[00242] Células B16-Blue IFNg (InvivoGen) foram semeadas a uma concentração de 75.000 células / poço em meio de cultura com ou sem 1,5% de albumina sérica humana (HSA) e estimuladas com uma série de diluição de mIFNg recombinante ou mIFNg induzível durante 24 horas a 37°C e 5% de CO2. A atividade de mIFNg indutível não clivado e clivado foi testada. A mIFNg indutível clivada foi gerada por incubação com MMP9 ativa. Os sobrenadantes foram coletados e a ativação de SEAP foi avaliada pela adição de QUANTI-Blue Reagent (InvivoGen), incubação a 37°C durante 2 horas e medição da absorbância a 620 nm. Os resultados são mostrados nas Figs. 17, 19, 22, 23 e

28. Este experimento foi repetido para proteínas de fusão IFNa usando células IFNa/b B16-Blue. Os valores de EC50 para moléculas de mIFNa indutíveis clivadas foram pelo menos 100x mais potentes do que as moléculas de mIFNa indutíveis não clivadas. Exemplo 13.Liberação In Vivo de uma Proteína de Fusão Ativada por Protease Resulta em Redução no Crescimento Tumoral

[00243] O polipeptídeo quimérico é examinado para determinar se poderia ter efeitos biológicos in vivo. Para esses experimentos, um sistema é usado no qual as células tumorais injetadas de forma intraperitoneal rápida e preferencialmente fixam-se e crescem inicialmente nas manchas leitosas, uma série de agregados imunes organizados encontrados no omento (Gerber et al., Am. J. Pathol. 169:1739-52 (2006)). Este sistema oferece uma maneira conveniente de examinar os efeitos do tratamento com proteína de fusão no crescimento tumoral, uma vez que as proteínas de fusão podem ser liberadas por via intraperitoneal várias vezes, e o crescimento tumoral pode ser analisado examinando as células omentais dissociadas. Para esses experimentos, a linhagem celular Colon 38, uma linhagem celular de tumor de crescimento rápido que expressa tanto MMP2 quanto MMP9 in vitro, pode ser usada. O tecido omental normalmente expressa uma quantidade relativamente pequena de MMP2 e MMP9, mas, quando o tumor da Colon 38 está presente no omento, os níveis de MMP aumentam. Usando este modelo de tumor, a capacidade das proteínas de fusão IFN para afetar o crescimento tumoral é examinada. As células da Colon 38 são injetadas por via intraperitoneal, permite-se que se fixem e cresçam por 1 dia e, em seguida, são tratadas diariamente com proteína de fusão por via interaperitoneal. No dia 7, os animais são sacrificados e o omento é examinado quanto ao crescimento tumoral usando citometria de fluxo e por um ensaio de formação de colônia. Exemplo 13b: O polipeptídeo quimérico foi examinado para determinar seus efeitos biológicos in vivo.

[00244] A linhagem celular MC38, uma linhagem celular de adenocarcinoma do cólon de crescimento rápido que expressa MMP9 in vitro, foi usada. Usando este modelo de tumor, a capacidade das proteínas de fusão IFN para afetar o crescimento tumoral foi examinada. As células MC38 foram injetadas por via subcutânea, permitidas crescer durante 10-14 dias e, em seguida, tratadas com proteína de fusão duas vezes por semana por via intraperitoneal por um total de quatro doses, nos níveis mostrados na FIG. 21. Como um comparador, mIFNγ do tipo selvagem foi administrada nos níveis de dose indicados, duas vezes ao dia durante 2 semanas em um cronograma de 5 dias sim/2 dias não (10 doses no total). O crescimento do tumor e o peso corporal foram monitorados aproximadamente duas vezes por semana durante duas semanas. Exemplo 14: Construção de um CD20 de Direcionamento de Proteína IFNg Exemplificativa Geração de um domínio de citocina ativável

[00245] Um polipeptídeo de IFNg capaz de se ligar a um polipeptídeo de CD20 presente em um tumor ou em uma célula tumoral é produzido como segue. É produzido um ácido nucleico que contém sequências de ácido nucleico: (1) codificando uma sequência de polipeptídeo IFNg e (2) um ou mais ligantes polipeptídicos. Os construtos de plasmídeos de IFNg ativável podem ter Flag, His ou outras tags de afinidade opcionais, e são eletroporados para HEK293 ou outras linhagens celulares de humano ou de mamífero adequadas e purificadas. Os ensaios de validação incluem ensaios de ativação de células T que usam células T responsivas à estimulação de IFNg na presença de uma protease. Geração de um domínio de ligação scFv CD20

[00246] A CD20 é uma das proteínas de superfície celular presentes nos linfócitos B. O antígeno CD20 é encontrado em linfócitos pré-B e B maduros normais e malignos, incluindo aqueles em mais de 90% dos linfomas não- Hodgkin (LNH) de células B. O antígeno está ausente nas células-tronco hematopoiéticas, nos linfócitos B ativados (células plasmáticas) e no tecido normal. Dessa forma, vários anticorpos principalmente de origem murina foram descritos: 1F5, 2B8/C2B8, 2H7 e 1H4.

[00247] Os anticorpos anti-CD20 humanos ou humanizados são, portanto, usados para gerar sequências de scFv para domínios de ligação a CD20 de uma proteína IFNg ativável. Sequências de DNA que codificam domínios VL e VH humanos ou humanizados são obtidas, e os códons para os construtos são, opcionalmente, otimizados para expressão em células de Homo sapiens. A ordem em que os domínios VL e VH aparecem no scFv é variada (ou seja, orientação VL-VH ou VH-VL), e três cópias de "G4S" (SEQ ID NO.: 201) ou “G4S” (SEQ ID NO.: 201) subunidade (G4S)3 (SEQ ID NO.: 204) conectam os domínios variáveis para criar o domínio de scFv. Os construtos de plasmídeos de scFv anti-CD20 podem ter Flag, His ou outras tags de afinidade opcionais, e são eletroporados para HEK293 ou outras linhagens celulares de humano ou de mamífero adequadas e purificadas. Os ensaios de validação incluem análise de ligação por FACS, análise cinética usando Proteon e coloração de células que expressam CD20. Clonagem de construtos de expressão de DNA que codificam a proteína IFNg ativável

[00248] O construto de IFNg ativável com domínios de sítio de clivagem de protease é usado para construir uma proteína iIFNg ativável em combinação com um domínio de scFv anti-CD20 e um elemento de extensão da meia-vida sérica (por exemplo, um peptídeo de ligação de HSA ou domínio VH), com os domínios organizados conforme mostrado na FIG. 14. Para a expressão de uma proteína IFNg ativável em células CHO, as sequências de codificação de todas e ahomogeneidade (normalmente >90%) das amostras finais foram avaliadas por SDS PAGE em condições redutoras e não redutoras, seguido por imunoblot usando um anticorpo anti-HSA ou anti-idiotipo, bem como por SEC analítica, respectivamente. As proteínas purificadas foram armazenadas em alíquotas a - 80ºC até o uso. Expressão de proteínas IFNg ativáveis em células CHO transfectadas de forma estável

[00249] Um sistema de expressão de células CHO (Flp-In®, Life Technologies), um derivado de células de ovário de Hamster Chinês CHO-K1 (ATCC, CCL-61) (Kao e Puck, Proc. Natl. Acad Sci USA 1968;60(4):1275-81), é usado. As células aderentes são subcultivadas de acordo com os protocolos de cultura celular padrão fornecidos pela Life Technologies.

[00250] Para adaptação ao crescimento em suspensão, as células são separadas dos frascos de cultura de tecidos e colocadas em meio sem soro. As células adaptadas à suspensão são criopreservadas em meio com 10% de DMSO.

[00251] As linhagens celulares de CHO recombinantes que expressam, de forma estável, proteínas IFNg ativáveis secretadas são geradas por transfecção de células adaptadas a suspensão. Durante a seleção com o antibiótico Higromicina B, as densidades celulares viáveis são medidas duas vezes por semana, e as células são centrifugadas e ressuspensas em meio de seleção fresco a uma densidade máxima de 0,1x10 6 células viáveis/mL. Agrupamentos de células que expressam, de forma estável, proteínas IFNg ativáveis são recuperados após 2-3 semanas de seleção, ponto em que as células são transferidas para o meio de cultura padrão em frascos de agitação. A expressão de proteínas secretadas recombinantes é confirmada pela realização de eletroforese em gel de proteínas ou citometria de fluxo. Os agrupamentos de células estáveis são criopreservados em meio contendo DMSO.

[00252] As proteínas IFNg ativáveis são produzidas em culturas descontínuas alimentadas de 10 dias de linhagens celulares de CHO transfectadas de forma estável por secreção no sobrenadante da cultura celular. Os sobrenadantes da cultura celular são colhidos após 10 dias em viabilidades de cultura de, tipicamente, >75%. Amostras são coletadas das culturas de produção em dias alternados, e a densidade celular e a viabilidade são avaliadas. No dia da coleta, os sobrenadantes da cultura celular são limpos por centrifugação e filtração a vácuo antes de serem usados.

[00253] Os títulos de expressão de proteína e a integridade do produto em sobrenadantes de cultura celular são analisados por SDS-PAGE. Purificação de proteínas IFNg ativáveis

[00254] Proteínas IFNg ativáveis são purificadas a partir de sobrenadantes de cultura celular de CHO em um procedimento de duas etapas. Os construtos são submetidos a cromatografia de afinidade em uma primeira etapa, seguido por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) preparativa em Superdex 200 em uma segunda etapa. As amostras são trocadas por tampão e concentradas por ultrafiltração a uma concentração típica de >1 mg/mL. A pureza e a homogeneidade (tipicamente >90%) das amostras finais são avaliadas por SDS PAGE sob condições redutoras e não redutoras, o que é seguido por imunoblot usando um anticorpo anti-HSA ou anti-idiotipo, bem como por SEC analítica, respectivamente. As proteínas purificadas são armazenadas em alíquotas a -80°C até o uso. Exemplo 15: Determinação da afinidade do antígeno por citometria de fluxo

[00255] As proteínas IFNg ativáveis do Exemplo 14 são testadas quanto às suas afinidades de ligação a células CD20 + humanas e células CD20+ de cynomolgus.

[00256] As células CD20+ são incubadas com 100 µL de diluições em série das proteínas IFNg ativáveis do Exemplo 14 e pelo menos uma protease. Após três lavagens com tampão FACS, as células são incubadas com 0,1 mL de anticorpo anti-idiotipo monoclonal de camundongo a 10 µg/mL no mesmo tampão durante 45 min em gelo. Após um segundo ciclo de lavagem, as células são incubadas com 0,1 mL de anticorpos IgG anti-camundongo de cabra conjugados com FITC a 15 µg/mL nas mesmas condições anteriores. Como um controle, as células são incubadas com a IgG anti-His seguida pelos anticorpos IgG de cabra anti-camundongo conjugados com FITC sem as proteínas IFNg ativáveis. As células foram então lavadas novamente e ressuspensas em 0,2 mL de tampão FACS contendo 2 µg/mL de iodeto de propídio (PI) para excluir células mortas. A fluorescência de 1x104 células vivas é medida usando um citômetro de fluxo Beckman-Coulter FC500 MPL usando o software MXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) ou um citômetro de fluxo Millipore Guava EasyCyte usando o software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemanha).

As intensidades de fluorescência médias das amostras de células são calculadas usando software CXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) ou software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemanha). Depois de retirar os valores de intensidade de fluorescência das células coradas apenas com os reagentes secundários e terciários, os valores são então usados para o cálculo dos valores KD com a equação para ligação de um sítio (hipérbole) do GraphPad Prism (versão 6.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla Califórnia EUA).

[00257] A ligação e a reatividade cruzada de CD20 são avaliadas nas linhagens celulares tumorais CD20+ humanas. A razão KD de reatividade cruzada é calculada usando os valores KD determinados nas linhagens celulares de CHO que expressam antígenos de cynomolgus recombinantes ou antígenos de humanos recombinantes. Exemplo 16: Ensaio de Citotoxicidade

[00258] A proteína IFNg ativável do Exemplo 14 é avaliada in vitro na sua mediação da resposta imune a células-alvo CD20+.

[00259] As células CD20+ REC-1 marcadas com fluorescência (uma linhagem celular de linfoma de células do manto, ATCC CRL-3004) são incubadas com PBMC isoladas de doadores aleatórios ou células T CB15 (linhagem de células T padronizada) como células efetoras na presença da proteína IFNg ativável do Exemplo 14 e pelo menos uma protease. Após incubação por 4 h a 37 °C em uma incubadora umidificada, a liberação do corante fluorescente das células-alvo para o sobrenadante é determinada em um espectrofluorímetro. As células-alvo incubadas sem a proteína IFNg ativável do Exemplo 14 e células-alvo totalmente lisadas pela adição de saponina no final da incubação servem como controles negativos e positivos respectivamente.

[00260] Com base nas células-alvo vivas restantes medidas, a porcentagem de lise celular específica é calculada de acordo com a seguinte fórmula: [1-(número de alvos vivos(amostra)/número de alvos vivos(espontâneo))] x 100%. As curvas de resposta à dose sigmoidais e os valores de EC 50 são calculados por regressão não linear/ajuste logístico de 4 parâmetros usando o software GraphPad. Os valores de lise obtidos para uma determinada concentração de anticorpos são usados para calcular curvas de resposta à dose sigmoidais por análise de ajuste logístico de 4 parâmetros usando o software Prism. Exemplo 17: Farmacocinética de proteínas IFNg ativáveis

[00261] A proteína IFNg ativável do Exemplo 14 é avaliada quanto à meia-vida de eliminação em estudos com animais.

[00262] A proteína IFNg ativável é administrada em macacos cynomolgus como uma injeção em bolus a 0,5 mg/kg na veia safena. Outro grupo de macacos cynomolgus recebe uma citocina comparável em tamanho, mas sem um elemento de prolongamento da meia-vida sérica. Um terceiro e um quarto grupos recebem uma citocina com elementos de prolongamento da meia- vida sérica e uma citocina com CD20 e elementos de prolongamento da meia- vida sérica respectivamente, e ambos comparáveis em tamanho à proteína IFNg ativável. Cada grupo de teste consiste em 5 macacos. As amostras de soro são colhidas em pontos de tempo indicados, diluídas em série, e a concentração das proteínas é determinada usando um ELISA de ligação a CD20.

[00263] A análise farmacocinética é realizada usando as concentrações plasmáticas do artigo de teste. Os dados de plasma médios do grupo para cada artigo de teste estão em conformidade com um perfil multiexponencial quando plotados em relação ao tempo pós-dosagem. Os dados são ajustados por um modelo de dois compartimentos padrão com entrada de bolus e constantes de taxa de primeira ordem para as fases de distribuição e eliminação. A equação geral para o melhor ajuste dos dados para administração i.v. é: c(t)=Ae −αt+Be−βt, onde c(t) é a concentração plasmática no tempo t, A e B se interceptam no eixo Y, e α e β são as constantes de taxa de primeira ordem aparentes para as fases de distribuição e eliminação respectivamente. A fase α é a fase inicial da depuração e reflete a distribuição da proteína em todo o fluido extracelular do animal, enquanto a segunda porção ou porção da fase β da curva de decaimento representa a depuração plasmática verdadeira. Os métodos para ajustar tais equações são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, A=D/V(α−k21)/(α−β), B=D/V(β−k21)/(α−β), e α e β (para α>β) são raízes da equação quadrática: r2+(k12+k21+k10)r+k21k10=0 usando parâmetros estimados de V=volume de distribuição, k10=taxa de eliminação, k12=taxa de transferência do compartimento 1 para o compartimento 2 e k21=taxa de transferência do compartimento 2 para o compartimento 1 e D=dose administrada.

[00264] Análise de dados: Gráficos de concentração versus perfis de tempo são feitos usando KaleidaGraph (KaleidaGraph™ V. 3.09 Copyright 1986-

1997. Synergy Software. Reading, Pa.). Os valores relatados como menos do que relatáveis (LTR) não são incluídos na análise de PK e não são representados graficamente. Os parâmetros farmacocinéticos são determinados por análise compartimental usando o software WinNonlin (WinNonlin® Professional V. 3.1 WinNonlin™ Copyright 1998-1999. Pharsight Corporation. (Mountain View, Calif). Os parâmetros farmacocinéticos são calculados conforme descrito em Ritschel W A e Kearns G L, 1999, IN: Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 5ª edição, American Pharmaceutical Assoc., Washington, DC

[00265] Espera-se que a proteína IFNg ativável do Exemplo 14 tenha parâmetros farmacocinéticos aprimorados, como um aumento na meia-vida de eliminação em comparação com proteínas sem um elemento de extensão da meia-vida sérica. Exemplo 18: Modelo de Tumor de Xenoenxerto

[00266] A proteína IFNg ativável do Exemplo 14 é avaliada em um modelo de xenoenxerto.

[00267] Camundongos NOD/scid imunodeficientes fêmeas são irradiados subletalmente (2 Gy) e inoculados por via subcutânea com 4x10 6 células Ramos RA1 no flanco dorsal direito. Quando os tumores atingem 100 a 200 mm3, os animais são alocados em 3 grupos de tratamento. Os grupos 2 e 3 (8 animais cada) são injetados por via intraperitoneal com 1,5x10 7 células T humanas ativadas. Três dias depois, os animais do Grupo 3 são subsequentemente tratados com um total de 9 doses intravenosas de 50 µg de proteína IFNg ativável do Exemplo 14 (qdx9d). Os grupos 1 e 2 são tratados apenas com veículo. O peso corporal e o volume tumoral são determinados durante 30 dias.

[00268] Espera-se que os animais tratados com a proteína IFNg ativável do Exemplo 5 tenham um atraso estatisticamente significativo no crescimento tumoral em comparação com o respectivo grupo de controle tratado com veículo.

[00269] Embora as modalidades preferíveis da presente invenção tenham sido mostradas e descritas neste documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas somente a título de exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles versados na técnica, sem que haja afastamento da invenção. Deve-se entender que diversas alternativas às modalidades da invenção descritas neste documento podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos. Exemplo 19: Ensaio HEK Blue

[00270] Células HEK-Blue IL12 (InvivoGen) foram semeadas em suspensão a uma concentração de 250.000 células/poço em meios de cultura com ou sem 40 mg/ml de albumina sérica humana (HSA) e estimuladas com uma série de diluições de hIL12 recombinante, IL12 quimérica (p35 de camundongo/p40 humano) ou hIL12 ativável por 24 horas a 37C e 5% de CO2. A atividade de hIL12 ativável não clivada e clivada foi testada. A hIL12 indutível clivada foi gerada por incubação com MMP9 ativa. A atividade da IL12 foi avaliada pela quantificação da atividade da Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP) usando o reagente QUANTI-Blue (InvivoGen), um ensaio com base colorimétrica. Os resultados são mostrados nas Figs. 11, 12, 15 e 26.

[00271] Células HEK-Blue IL2 (InvivoGen) foram semeadas em suspensão a uma concentração de 50.000 células/poço em meios de cultura com ou sem 15-40 mg/ml de albumina sérica humana (HSA) e estimuladas com uma série de diluições de hIL2 recombinante ou hIL2 ativável por 24 horas a 37C e 5% de CO2. A atividade de hIL2 ativável não clivada e clivada foi testada. A hIL2 indutível clivada foi gerada por incubação com MMP9 ativa. A atividade da IL12 foi avaliada pela quantificação da atividade da Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP) usando o reagente QUANTI-Blue (InvivoGen), um ensaio com base colorimétrica. Os resultados são mostrados na FIG. 24a-24d. Exemplo 20: Ensaio de blastos T de esplenócitos

[00272] Blastos T foram induzidos a partir de esplenócitos murinos com uma incubação de 6 dias com PHA e uma incubação de 24 horas com hIL12 recombinante. Os blastos T foram então semeados em suspensão a uma concentração de 200.000 células/poço em meios de cultura com ou sem albumina sérica humana (HSA) a 40 mg/ml e estimulados com uma série de diluições de hIL12 recombinante ou IL12 quimérica (p35 de camundongo/p40 humano) ou IL12 de camundongo por 72 horas a 37C e 5% de CO2. A atividade de IL12 não clivada e clivada foi testada. A hIL12 indutível clivada foi gerada por incubação com MMP9 ativa. A atividade de IL12 foi avaliada por quantificação a jusante da produção de IFN usando um mIFN alphaLISA. Exemplo 21: Liberação In Vivo de uma Proteína de Fusão Ativada por Protease Resulta em Redução no Crescimento Tumoral

[00273] O polipeptídeo quimérico é examinado para determinar se poderia ter efeitos biológicos in vivo. Para esses experimentos, um sistema é usado no qual as células tumorais injetadas de forma intraperitoneal rápida e preferencialmente fixam-se e crescem inicialmente nas manchas leitosas, uma série de agregados imunes organizados encontrados no omento (Gerber et al., Am. J. Pathol. 169:1739-52 (2006)). Este sistema oferece uma maneira conveniente de examinar os efeitos do tratamento com proteína de fusão no crescimento tumoral, uma vez que as proteínas de fusão podem ser liberadas por via intraperitoneal várias vezes, e o crescimento tumoral pode ser analisado examinando as células omentais dissociadas. Para esses experimentos, a linhagem celular Colon 38, uma linhagem celular de tumor de crescimento rápido que expressa tanto MMP2 quanto MMP9 in vitro, pode ser usada. O tecido omental normalmente expressa uma quantidade relativamente pequena de MMP2 e MMP9, mas, quando o tumor da Colon 38 está presente no omento, os níveis de MMP aumentam. Usando este modelo de tumor, a capacidade das proteínas de fusão de muteína de IL-2 para afetar o crescimento tumoral é examinada. As células da Colon 38 são injetadas por via intraperitoneal, permite- se que se fixem e cresçam por 1 dia e, em seguida, são tratadas diariamente com proteína de fusão por via interaperitoneal. No dia 7, os animais são sacrificados e o omento é examinado quanto ao crescimento tumoral usando citometria de fluxo e por um ensaio de formação de colônia. Exemplo 22: Construção de uma Proteína de Interleucina Ativável Direcionada a CD20 Exemplificativa Geração de um domínio de interleucina ativável

[00274] A sequência canônica da cadeia de IL-12p35 humana é a de Nº de Acesso Uniprot P29459. A sequência canônica da cadeia IL-12p40 humana é a de Nº de Acesso Uniprot P29460. IL-12p35 e IL-12p40 são clonadas em um construto de expressão. Um sítio de clivagem de protease é incluído entre os domínios de IL-12p35 e IL-12p40. Um polipeptídeo de IL-12 capaz de se ligar a um polipeptídeo de CD20 presente em um tumor ou em uma célula tumoral é produzido como segue. É produzido um ácido nucleico que contém sequências de ácidos nucleicos: (1) codificando-se uma sequência polipeptídica de IFNg e (2) um ou mais peptídeos de ligação polipeptídicos. Os construtos de plasmídeo de interleucina ativável podem ter Flag, His ou outras tags de afinidade opcionais e são eletroporados para HEK293 ou outras linhagens celulares humanas ou de mamíferos adequadas e purificadas. Os ensaios de validação incluem ensaios de ativação de células T que usam células T responsivas à estimulação de IL-12 na presença de uma protease.

Geração de um domínio de ligação scFv CD20

[00275] A CD20 é uma das proteínas de superfície celular presentes nos linfócitos B. O antígeno CD20 é encontrado em linfócitos pré-B e B maduros normais e malignos, incluindo aqueles em mais de 90% dos linfomas não- Hodgkin (LNH) de células B. O antígeno está ausente nas células-tronco hematopoiéticas, nos linfócitos B ativados (células plasmáticas) e no tecido normal. Dessa forma, vários anticorpos principalmente de origem murina foram descritos: 1F5, 2B8/C2B8, 2H7 e 1H4.

[00276] Os anticorpos anti-CD20 humanos ou humanizados são, portanto, usados para gerar sequências de scFv para domínios de ligação a CD20 de uma proteína de interleucina ativável. Sequências de DNA que codificam domínios VL e VH humanos ou humanizados são obtidas, e os códons para os construtos são, opcionalmente, otimizados para expressão em células de Homo sapiens. A ordem em que os domínios VL e VH aparecem no scFv é variada (ou seja, orientação VL-VH ou VH-VL), e três cópias de "G4S" (SEQ ID NO.: 201) ou “G4S” (SEQ ID NO.: 201) subunidade (G4S)3 (SEQ ID NO.: 204) conectam os domínios variáveis para criar o domínio de scFv. Os construtos de plasmídeos de scFv anti-CD20 podem ter Flag, His ou outras tags de afinidade opcionais, e são eletroporados para HEK293 ou outras linhagens celulares de humano ou de mamífero adequadas e purificadas. Os ensaios de validação incluem análise de ligação por FACS, análise cinética usando Proteon e coloração de células que expressam CD20. Clonagem de construtos de expressão de DNA que codificam a proteína interleucina ativável

[00277] O construto de interleucina ativável com domínios de sítio de clivagem de protease é usado para construir uma proteína interleucina ativável em combinação com um domínio de scFv anti-CD20 e um elemento de extensão da meia-vida sérica (por exemplo, um peptídeo de ligação de HSA ou domínio VH). Para a expressão de uma proteína interleucina ativável em células CHO, as sequências de codificação de todos os domínios de proteína são clonadas em um sistema de vetor de expressão de mamífero. Em resumo, as sequências genéticas que codificam o domínio de interleucina ativável, o elemento de extensão da meia-vida sérica e o domínio de ligação de CD20 juntamente com os ligantes peptídicos L1 e L2 são sintetizadas e subclonadas separadamente. Os construtos resultantes são então ligados entre si na ordem do domínio de ligação de CD20 – L1 – IL-12p35– L2 – domínio de clivagem de protease – L3 – IL-12p40 – L4 – scFv anti-CD20 – L5 – elemento de extensão da meia-vida sérica para produzir um construto final. Todos os construtos de expressão são projetados para conter sequências de codificação para um peptídeo sinal N- terminal e uma (6xHis)-tag de hexa-histidina C-terminal (SEQ ID NO.: 205) para facilitar a secreção e purificação de proteínas, respectivamente. Expressão de proteínas interleucina ativáveis em células CHO transfectadas de forma estável

[00278] Um sistema de expressão de células CHO (Flp-In®, Life Technologies), um derivado de células de ovário de Hamster Chinês CHO-K1 (ATCC, CCL-61) (Kao e Puck, Proc. Natl. Acad Sci USA 1968;60(4):1275-81), é usado. As células aderentes são subcultivadas de acordo com os protocolos de cultura celular padrão fornecidos pela Life Technologies.

[00279] Para adaptação ao crescimento em suspensão, as células são separadas dos frascos de cultura de tecidos e colocadas em meio sem soro. As células adaptadas à suspensão são criopreservadas em meio com 10% de DMSO.

[00280] As linhagens celulares de CHO recombinantes que expressam, de forma estável, proteínas interleucina ativáveis secretadas são geradas por transfecção de células adaptadas a suspensão. Durante a seleção com o antibiótico Higromicina B, as densidades celulares viáveis são medidas duas vezes por semana, e as células são centrifugadas e ressuspensas em meio de seleção fresco a uma densidade máxima de 0,1x10 6 células viáveis/mL. Agrupamentos de células que expressam, de forma estável, proteínas interleucina ativáveis são recuperados após 2-3 semanas de seleção, ponto em que as células são transferidas para o meio de cultura padrão em frascos de agitação. A expressão de proteínas secretadas recombinantes é confirmada pela realização de eletroforese em gel de proteínas ou citometria de fluxo. Os agrupamentos de células estáveis são criopreservados em meio contendo DMSO.

[00281] As proteínas interleucina ativáveis são produzidas em culturas descontínuas alimentadas de 10 dias de linhagens celulares de CHO transfectadas de forma estável por secreção no sobrenadante da cultura celular. Os sobrenadantes da cultura celular são colhidos após 10 dias em viabilidades de cultura de, tipicamente, >75%. Amostras são coletadas das culturas de produção em dias alternados, e a densidade celular e a viabilidade são avaliadas. No dia da coleta, os sobrenadantes da cultura celular são limpos por centrifugação e filtração a vácuo antes de serem usados.

[00282] Os títulos de expressão de proteína e a integridade do produto em sobrenadantes de cultura celular são analisados por SDS-PAGE. Purificação de proteínas interleucina ativáveis

[00283] Proteínas interleucina ativáveis são purificadas a partir de sobrenadantes de cultura celular de CHO em um procedimento de duas etapas. Os construtos são submetidos a cromatografia de afinidade em uma primeira etapa, seguido por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) preparativa em Superdex 200 em uma segunda etapa. As amostras são trocadas por tampão e concentradas por ultrafiltração a uma concentração típica de >1 mg/mL. A pureza e a homogeneidade (tipicamente >90%) das amostras finais são avaliadas por SDS PAGE sob condições redutoras e não redutoras, o que é seguido por imunoblot usando um anticorpo anti-HSA ou anti-idiotipo, bem como por SEC analítica, respectivamente. As proteínas purificadas são armazenadas em alíquotas a -80°C até o uso. Exemplo 23: Determinação da afinidade do antígeno por citometria de fluxo

[00284] As proteínas interleucina ativáveis do Exemplo 22 são testadas quanto às suas afinidades de ligação a células CD20 + humanas e células CD20+ de cynomolgus.

[00285] As células CD20+ são incubadas com 100 µL de diluições em série das proteínas interleucina ativáveis do Exemplo 22 e pelo menos uma protease. Após três lavagens com tampão FACS, as células são incubadas com 0,1 mL de anticorpo anti-idiotipo monoclonal de camundongo a 10 µg/mL no mesmo tampão durante 45 min em gelo. Após um segundo ciclo de lavagem, as células são incubadas com 0,1 mL de anticorpos IgG anti-camundongo de cabra conjugados com FITC a 15 µg/mL nas mesmas condições anteriores. Como um controle, as células são incubadas com a IgG anti-His seguida pelos anticorpos IgG de cabra anti-camundongo conjugados com FITC sem as proteínas interleucina ativáveis. As células foram então lavadas novamente e ressuspensas em 0,2 mL de tampão FACS contendo 2 µg/mL de iodeto de propídio (PI) para excluir células mortas. A fluorescência de 1x104 células vivas é medida usando um citômetro de fluxo Beckman-Coulter FC500 MPL usando o software MXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) ou um citômetro de fluxo Millipore Guava EasyCyte usando o software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemanha). As intensidades de fluorescência médias das amostras de células são calculadas usando software CXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) ou software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemanha). Depois de retirar os valores de intensidade de fluorescência das células coradas apenas com os reagentes secundários e terciários, os valores são então usados para o cálculo dos valores KD com a equação para ligação de um sítio (hipérbole) do GraphPad Prism (versão 6.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla Califórnia EUA).

[00286] A ligação e a reatividade cruzada de CD20 são avaliadas nas linhagens celulares tumorais CD20+ humanas. A razão KD de reatividade cruzada é calculada usando os valores KD determinados nas linhagens celulares de CHO que expressam antígenos de cynomolgus recombinantes ou antígenos de humanos recombinantes.

Exemplo 24: Ensaio de Citotoxicidade

[00287] A proteína interleucina ativável do Exemplo 22 é avaliada in vitro na sua mediação da resposta imune a células-alvo CD20+.

[00288] As células CD20+ REC-1 marcadas com fluorescência (uma linhagem celular de linfoma de células do manto, ATCC CRL-3004) são incubadas com PBMC isoladas de doadores aleatórios ou células T CB15 (linhagem de células T padronizada) como células efetoras na presença da proteína interleucina ativável do Exemplo 22 e pelo menos uma protease. Após incubação por 4 h a 37 °C em uma incubadora umidificada, a liberação do corante fluorescente das células-alvo para o sobrenadante é determinada em um espectrofluorímetro. As células-alvo incubadas sem a proteína interleucina ativável do Exemplo 22 e células-alvo totalmente lisadas pela adição de saponina no final da incubação servem como controles negativos e positivos respectivamente.

[00289] Com base nas células-alvo vivas restantes medidas, a porcentagem de lise celular específica é calculada de acordo com a seguinte fórmula: [1-(número de alvos vivos(amostra)/número de alvos vivos(espontâneo))] x 100%. As curvas de resposta à dose sigmoidais e os valores de EC 50 são calculados por regressão não linear/ajuste logístico de 4 parâmetros usando o software GraphPad. Os valores de lise obtidos para uma determinada concentração de anticorpos são usados para calcular curvas de resposta à dose sigmoidais por análise de ajuste logístico de 4 parâmetros usando o software Prism. Exemplo 25: Farmacocinética de Proteínas interleucina ativáveis

[00290] A proteína interleucina ativável do Exemplo 22 é avaliada quanto à meia-vida de eliminação em estudos com animais.

[00291] A proteína interleucina ativável é administrada em macacos cynomolgus como uma injeção em bolus a 0,5 mg/kg na veia safena. Outro grupo de macacos cynomolgus recebe uma citocina comparável em tamanho, mas sem um elemento de prolongamento da meia-vida sérica. Um terceiro e um quarto grupos recebem uma citocina com elementos de extensão da meia-vida sérica e uma citocina com CD20 e elementos de extensão da meia-vida sérica respectivamente, e ambos comparáveis em tamanho à proteína interleucina ativável. Cada grupo de teste consiste em 5 macacos. As amostras de soro são colhidas em pontos de tempo indicados, diluídas em série, e a concentração das proteínas é determinada usando um ELISA de ligação a CD20.

[00292] A análise farmacocinética é realizada usando as concentrações plasmáticas do artigo de teste. Os dados de plasma médios do grupo para cada artigo de teste estão em conformidade com um perfil multiexponencial quando plotados em relação ao tempo pós-dosagem. Os dados são ajustados por um modelo de dois compartimentos padrão com entrada de bolus e constantes de taxa de primeira ordem para as fases de distribuição e eliminação. A equação geral para o melhor ajuste dos dados para administração i.v. é: c(t)=Ae −αt+Be−βt, onde c(t) é a concentração plasmática no tempo t, A e B se interceptam no eixo Y, e α e β são as constantes de taxa de primeira ordem aparentes para as fases de distribuição e eliminação respectivamente. A fase α é a fase inicial da depuração e reflete a distribuição da proteína em todo o fluido extracelular do animal, enquanto a segunda porção ou porção da fase β da curva de decaimento representa a depuração plasmática verdadeira. Os métodos para ajustar tais equações são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, A=D/V(α−k21)/(α−β), B=D/V(β−k21)/(α−β), e α e β (para α>β) são raízes da equação quadrática: r2+(k12+k21+k10)r+k21k10=0 usando parâmetros estimados de V=volume de distribuição, k10=taxa de eliminação, k12=taxa de transferência do compartimento 1 para o compartimento 2 e k21=taxa de transferência do compartimento 2 para o compartimento 1 e D=dose administrada.

[00293] Análise de dados: Gráficos de concentração versus perfis de tempo são feitos usando KaleidaGraph (KaleidaGraph™ V. 3.09 Copyright 1986-

1997. Synergy Software. Reading, Pa.). Os valores relatados como menos do que relatáveis (LTR) não são incluídos na análise de PK e não são representados graficamente. Os parâmetros farmacocinéticos são determinados por análise compartimental usando o software WinNonlin (WinNonlin® Professional V. 3.1 WinNonlin™ Copyright 1998-1999. Pharsight Corporation. (Mountain View, Calif). Os parâmetros farmacocinéticos são calculados conforme descrito em Ritschel W A e Kearns G L, 1999, IN: Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 5ª edição, American Pharmaceutical Assoc., Washington, DC

[00294] Espera-se que a proteína interleucina ativável do Exemplo 22 tenha parâmetros farmacocinéticos aprimorados, como um aumento na meia- vida de eliminação em comparação com proteínas sem um elemento de extensão da meia-vida sérica. Exemplo 26: Modelo de Tumor de Xenoenxerto

[00295] A proteína interleucina ativável do Exemplo 22 é avaliada em um modelo de xenoenxerto.

[00296] Camundongos NOD/scid imunodeficientes fêmeas são irradiados subletalmente (2 Gy) e inoculados por via subcutânea com 4x10 6 células Ramos RA1 no flanco dorsal direito. Quando os tumores atingem 100 a 200 mm3, os animais são alocados em 3 grupos de tratamento. Os grupos 2 e 3 (8 animais cada) são injetados por via intraperitoneal com 1,5x10 7 células T humanas ativadas. Três dias depois, os animais do Grupo 3 são subsequentemente tratados com um total de 9 doses intravenosas de 50 µg de proteína interleucina ativável do Exemplo 5 (qdx9d). Os grupos 1 e 2 são tratados apenas com veículo. O peso corporal e o volume tumoral são determinados durante 30 dias.

[00297] Espera-se que os animais tratados com a proteína interleucina ativável do Exemplo 22 tenham um atraso estatisticamente significativo no crescimento tumoral em comparação com o respectivo grupo de controle tratado com veículo.

[00298] Embora as modalidades preferíveis da presente invenção tenham sido mostradas e descritas neste documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas somente a título de exemplo.

Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles versados na técnica, sem que haja afastamento da invenção.

Deve-se entender que diversas alternativas às modalidades da invenção descritas neste documento podem ser empregadas na prática da invenção.

Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos.

Exemplo 27: Experimentos de MC38 A linhagem celular MC38, uma linhagem celular de adenocarcinoma do cólon de crescimento rápido que expressa MMP9 in vitro, foi usada.

Usando este modelo de tumor, a capacidade das proteínas de fusão para afetar o crescimento tumoral foi examinada.

Exemplo 27a: MC38 IL-2POC Agentes e Tratamento:

Dose de Gr.

N Agente Via Cronograma formulação bissemanalmente 1# 10 Veículo - ip x3 bissemanalmente 2 7 ACP16 700µg/animal ip x3 bissemanalmente 3 7 ACP16 230µg/animal ip x3 7 bissemanalmente 4 ACP16 70µg/animal ip x3 - Grupo de # Controle

Exemplo 27b: MC38 IL-2 Agentes e Tratamento:

Dose de Gr.

N Agente Via Cronograma formulação

1# 12 Veículo - ip bissemanal x 2 2 8 ACP16 4,4 µg/animal ip bissemanal x 2 3 8 ACP16 17 µg/animal ip bissemanal x 2 4 8 ACP16 70 µg/animal ip bissemanal x 2 5 8 ACP16 232 µg/animal ip bissemanal x 2 6 8 ACP130 19 g/animal ip bissemanal x 2 7 8 ACP130 45 g/animal ip bissemanal x 2 8 8 ACP130 180 µg/animal ip bissemanal x 2 9 8 ACP130 600 µg/animal ip bissemanal x 1 12 8 ACP124 17 µg/animal ip bissemanal x 2 13 8 ACP124 70 µg/animal ip bissemanal x 2 14 8 ACP124 230 µg/animal ip bissemanal x 2 15 8 ACP124 700 µg/animal ip bissemanal x 2 duas vezes ao dia x 5, depois pausa de 2 dias, depois duas 16 8 IL-2-WTI 12 µg/animal ip vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias duas vezes ao dia x 5, depois pausa de 2 dias, depois duas 17 8 IL-2-WTI 36 µg/animal ip vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias - Grupo de # Controle

Procedimentos: Camundongos foram anestesiados com isoflurano para o implante de células para reduzir as ulcerações. 308 camundongos C57BL/6 fêmeas CR foram preparados com 5x105 células tumorais MC38 em 0% de Matrigel sc no flanco.

O Volume de Injeção Celular foi de 0,1 mL/camundongo.

A idade do camundongo na data de início era de 8 a 12 semanas.

As correspondências de pares foram realizadas quando os tumores atingiram um tamanho médio de 100 - 150 mm³ e o tratamento iniciou.

Os pesos corporais foram medidos no início e depois bissemanalmente até ao fim.

As medições do calibrador foram feitas bissemanalmente até o fim.

Quaisquer reações adversas foram notificadas imediatamente.

Qualquer animal individual com uma única observação de >30% de perda de peso corporal ou três medições consecutivas de >25% de perda de peso corporal foi sacrificado.

Qualquer grupo com uma perda de peso corporal média de >20% ou >10% de mortalidade interrompeu a dosagem; o grupo não foi sacrificado, e a recuperação é permitida.

Dentro de um grupo com >20% de perda de peso, os indivíduos que atingiram o critério de avaliação de perda de peso corporal individual foram sacrificados.

Se a perda de peso corporal relacionada a tratamento de grupo é recuperada até dentro de 10% dos pesos originais, a dosagem pode retomar a uma dose inferior ou a um cronograma de dosagem menos frequente.

Exceções ao não-tratamento de recuperação da % de peso corporal podem ser permitidas analisando-se caso-a-caso.

O ponto final foi a desaceleração do crescimento tumoral (TGD). Os animais foram monitorados individualmente.

O critério de avaliação do experimento foi um volume tumoral de 1500 mm 3 ou 45 dias, o que ocorrer primeiro.

Os respondedores foram acompanhados por mais tempo.

Quando o critério de avaliação foi atingido, os animais tiveram que ser sacrificados. • Os resultados são mostrados nas Fig. 31a-c e Fig. 32a-c.

As curvas de sobrevivência são mostradas na Fig 34a-d.

Exemplo 27c: MC38 IFNa e IL-12 Agentes e Tratamento:

Dose de Gr.

N Agente Via Cronograma formulação

1# 12 Veículo - ip bissemanalmente x 3 17,5 2 8 ACP11 ip bissemanalmente x 3 µg/animal 3 8 ACP11 175 µg/animal ip bissemanalmente x 3 4 8 ACP11 525 µg/animal ip bissemanalmente x 3 5 8 ACP31 33 µg/animal ip bissemanalmente x 3 6 8 ACP31 110 µg/animal ip bissemanalmente x 3 7 8 ACP31 330 µg/animal ip bissemanalmente x 3 duas vezes ao dia x 5, depois pausa de 2 dias, depois duas 8 8 ACP131 1 µg/animal ip vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias duas vezes ao dia x 5, depois pausa de 2 dias, depois duas 9 8 ACP131 10 µg/animal ip vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias duas vezes ao dia x 5, depois pausa de 2 dias, depois duas 10 8 ACP131 30 µg/animal ip vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias duas vezes ao dia x 5, depois mIFNa1- pausa de 2 dias, depois duas 11 8 1 µg/animal ip WTI vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias mIFNa1- duas vezes ao dia x 5, depois 12 8 10 µg/animal ip WTI pausa de 2 dias, depois duas vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias duas vezes ao dia x 5, depois IL-12- pausa de 2 dias, depois duas 13 8 2 µg/animal ip HM-WTI vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias duas vezes ao dia x 5, depois IL-12- pausa de 2 dias, depois duas 14 8 10 µg/animal ip HM-WTI vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias duas vezes ao dia x 5, depois pausa de 2 dias, depois duas 15 8 ACP131 5 µg/animal itu vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias - Grupo de # Controle

Procedimentos: Camundongos foram anestesiados com isoflurano para o implante de células para reduzir as ulcerações. 308 camundongos C57BL/6 fêmeas CR foram preparados com 5x105 células tumorais MC38 em 0% de Matrigel sc no flanco.

O Volume de Injeção Celular foi de 0,1 mL/camundongo.

A idade do camundongo na data de início era de 8 a 12 semanas.

As correspondências de pares foram realizadas quando os tumores atingiram um tamanho médio de 100 - 150 mm³ e o tratamento iniciou.

Os pesos corporais foram medidos no início e depois bissemanalmente até ao fim.

As medições do calibrador foram feitas bissemanalmente até o fim.

Quaisquer reações adversas foram notificadas imediatamente.

Qualquer animal individual com uma única observação de >30% de perda de peso corporal ou três medições consecutivas de >25% de perda de peso corporal foi sacrificado.

Qualquer grupo com uma perda de peso corporal média de >20% ou >10% de mortalidade interrompeu a dosagem; o grupo não foi sacrificado, e a recuperação é permitida.

Dentro de um grupo com >20% de perda de peso, os indivíduos que atingiram o critério de avaliação de perda de peso corporal individual foram sacrificados.

Se a perda de peso corporal relacionada a tratamento de grupo é recuperada até dentro de 10% dos pesos originais, a dosagem pode retomar a uma dose inferior ou a um cronograma de dosagem menos frequente.

Exceções ao não-tratamento de recuperação da % de peso corporal podem ser permitidas analisando-se caso-a-caso.

O ponto final foi a desaceleração do crescimento tumoral (TGD). Os animais foram monitorados individualmente.

O critério de avaliação do experimento foi um volume tumoral de 1500 mm 3 ou 45 dias, o que ocorrer primeiro.

Os respondedores foram acompanhados por mais tempo.

Quando o critério de avaliação foi atingido, os animais tiveram que ser sacrificados.

Os resultados são mostrados nas Figs. 29b, 29c e 30. Exemplo 27d: Tratamento com ACP16, ACP132 e ACP21 Os camundongos foram anestesiados com isoflurano para implante de células para reduzir as ulcerações.

Camundongos CR C57BL/6 fêmeas foram preparados com 5x105 células tumorais MC38 em 0% de Matrigel sc no flanco.

O Volume de Injeção Celular foi de 0,1 mL/camundongo.

A idade do camundongo na data de início era de 8 a 12 semanas.

As combinações de pares foram realizadas quando os tumores atingiram um tamanho médio de 100 - 150 mm³ e começaram o tratamento.

A ACP16 foi administrada com 17, 55, 70 ou 230 µg/animal; ACP132 foi administrada a 9, 28, 36 ou 119 µg/animal; ACP21 foi administrada a 13, 42, 54 ou 177 µg/animal.

Os pesos corporais foram medidos no início e depois bissemanalmente até o fim.

As medições do calibrador foram feitas bissemanalmente até o fim.

Quaisquer reações adversas foram notificadas imediatamente.

Qualquer animal individual com uma única observação de >30% de perda de peso corporal ou três medições consecutivas de >25% de perda de peso corporal foi sacrificado.

Qualquer grupo com uma perda de peso corporal média de >20% ou >10% de mortalidade interrompeu a dosagem; o grupo não foi sacrificado, e a recuperação é permitida.

Dentro de um grupo com >20% de perda de peso, os indivíduos que atingiram o critério de avaliação de perda de peso corporal individual foram sacrificados.

Se a perda de peso corporal relacionada a tratamento de grupo é recuperada até dentro de 10% dos pesos originais, a dosagem pode retomar a uma dose inferior ou a um cronograma de dosagem menos frequente.

Exceções ao não-tratamento de recuperação da % de peso corporal podem ser permitidas analisando-se caso- a-caso.

O ponto final foi a desaceleração do crescimento tumoral (TGD). Os animais foram monitorados individualmente.

O critério de avaliação do experimento foi um volume tumoral de 1500 mm 3 ou 45 dias, o que ocorrer primeiro.

Os respondedores foram acompanhados por mais tempo.

Quando o critério de avaliação foi atingido, os animais tiveram que ser sacrificados.

Os resultados são mostrados na Fig 35. Exemplo 27e: Reexposição a MC38 Camundongos curados (tratados com ACP16) do Exemplo 27b foram reexpostos com implantação de tumor para determinar se a memória anti-tumor foi estabelecida a partir dos tratamentos iniciais.

Agentes e Tratamento:

Dose de Gr.

N Agente Via Cronograma formulação

Sem 1# 33 - - - Tratamento 2 7 ACP16 70 µg/animal ip (ACP16 bissemanalmente x 2) 3 8 ACP16 232 µg/animal ip (ACP16 bissemanalmente x 2) (IL-2WTI duas vezes ao dia x 5, 5 5 IL-2-WTI 12 µg/animal ip depois pausa de 2 dias, depois duas vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias) (IL-2WTI duas vezes ao dia x 5, depois pausa de 2 dias, depois 6 7 IL-2-WTI 36 µg/animal ip duas vezes ao dia x 5 e depois pausa de 2 dias) - Grupo de # Controle

Procedimentos: Os camundongos foram anestesiados com isoflurano para implante de células para reduzir as ulcerações.

Esta parte do estudo começou no dia do implante (Dia 1). O Grupo 1 consistiu em 33 camundongos C57BL/6 fêmeas CR com 5x105 células tumorais MC38 em 0% de Matrigel por via subcutânea no flanco.

Os grupos 2-6 consistiram em 33 camundongos C57BL/6 fêmeas CR preparados com 5x105 células tumorais MC38 em 0% de Matrigel 0% sc no flanco esquerdo.

Os tumores do experimento com MC38 anterior (Exemplo 27b) foram implantados no flanco direito de cada animal.

O Volume de Injeção Velular foi de 0,1 mL/camundongo.

A idade dos camundongos de controle no início era de 14 a 17 semanas.

Estes camundongos foram pareados por idade com os camundongos do experimento com MC38 anterior (Exemplo 27b). Nenhuma dosagem de agente ativo ocorreu durante a reexposição.

Pesos corporais foram avaliados bissemanalmente até o final, assim como as medições do calibrador.

Quaisquer reações adversas ou morte foram relatadas imediatamente.

Qualquer animal individual com uma única observação de >30% de perda de peso corporal ou três medições consecutivas de >25% de perda de peso corporal foi sacrificado.

O ponto final foi a desaceleração do crescimento tumoral (TGD). Os animais foram monitorados individualmente.

O critério de avaliação do experimento foi um volume tumoral de 1000 mm 3 ou 45 dias, o que ocorrer primeiro. Os respondedores foram acompanhados por mais tempo, quando possível. Quando o critério de avaliação foi atingido, os animais tiveram que ser sacrificados. Os resultados são mostrados na Fig. 33 Exemplo 28.Proteínas de Fusão Condicionalmente Ativas Que Contêm Uma Fração Bloqueadora Que É Um Domínio de Ligação à Albumina Sérica

[00299] Este exemplo descreve a produção e a atividade de proteínas de fusão, de preferência citocinas, que possuem atividade induzível, ou seja, são inativas até serem induzidas, tipicamente por separação de uma fração de bloqueio da fração ativa após a clivagem de um ligante peptídico entre a fração de bloqueio e a fração ativa. As proteínas de fusão contêm um único domínio variável de anticorpo (um dAb) que se liga à albumina sérica por meio das alças de CDR e se liga a uma fração ativa (no caso, uma scFV anti-CD3) por meio de uma ou mais alças não CDR (por exemplo, a alça C). A fração de bloqueio de ligação à albumina sérica está operacionalmente ligada à fração ativa através de um ligante peptídico clivável por protease, e a fração ativa está operacionalmente ligada a um domínio de direcionamento (no caso, um dAb de receptor de fator de crescimento anti-epidérmico (EGFR) ou dAb anti-antígeno da membrana específica da próstata (PSMA)) através de um ligante peptídico que não é clivável por protease. Estas proteínas de fusão podem ser administradas como proteínas inativas que se são ativadas após a clivagem do ligante peptídico clivável por protease e subsequente liberação do domínio inibitório de ligação à albumina. A scFV anti-CD3 nas proteínas de fusão é um substituto para uma citocina desejada nas proteínas de fusão descritas nesta divulgação. Proteínas de fusão semelhantes que contêm uma citocina desejada (por exemplo, IL-2, IL-12, um interferon) ou fragmento funcional ou muteína desta, um domínio de direcionamento e um dAb de ligação à albumina que também se liga e inibe a citocina ou fragmento funcional ou muteína desta podem ser preparados usando os métodos descritos e exemplificados neste documento. O dAb anti-albumina sérica que se liga e inibe a atividade de uma citocina desejada ou fragmento funcional ou muteína desta pode fornecer mascaramento estérico da citocina (através da proximidade das citocinas à albumina sérica ligada) e mascaramento específico da citocina (através de ligação à citocina através do alça não CDR (por exemplo, o alça C)). O dAb anti-albumina sérica que se liga e inibe a atividade de uma citocina desejada ou fragmento funcional ou muteína desta pode ser obtida usando métodos adequados, tais como introdução de diversidade de sequência de aminoácidos nas alças não CDR (por exemplo, alça C) de um dAb de ligação anti-albumina sérica e triagem para ligação à citocina desejada. Quaisquer métodos adequados podem ser usados para a seleção, tais como exibição de fago. Por exemplo, um dab anti-albumina sérica exemplificativo que pode ser usado tem a sequência seguinte, e a sequência de aminoácidos na alça C (Sublinhada em Negrito) pode ser diversificada (por exemplo, randomizada), e os dAbs resultantes triados para ligação à albumina sérica via interação com CDR e à citocina via interação com alça não CDR. Se desejado, a sequência de aminoácidos de um peptídeo de ligação a citocina conhecido pode ser enxertada na alça C.

EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQGGGGGLD

GNEEPGGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPE DTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO.: 194) A. A ativação da protease de ProTriTAC leva a um aumento significativo da atividade in vitro

[00300] ProTriTAC purificado (pró-fármaco), ProTriTAC não clivável [pró-fármaco (não clivável)] e fragmento de fármaco ativo recombinante que imita o ProTriTAC ativado por protease (fármaco ativo) foram testados quanto à ligação a CD3 humano recombinante em um ensaio ELISA, ligação a células T primárias humanas purificadas em um ensaio de citometria de fluxo e potência funcional em um ensaio de citotoxicidade celular dependente de células T.

[00301] Para ELISA, proteínas ProTriTAC solúveis nas concentrações indicadas foram incubadas com CD3e humano recombinante imobilizado (R&D Systems) por 1 h em temperatura ambiente em PBS suplementado com 15 mg/ml de albumina sérica humana. As placas foram bloqueadas usando SuperBlock (Thermo Fisher), lavadas usando PBS com 0,05% de Tween-20 e detectadas usando um anticorpo monoclonal idiotipo anti-CD3 não competitivo 11D3 seguido por anticorpo secundário marcado com peroxidase e solução de substrato TMB-ELISA (Thermo Fisher).

[00302] Para citometria de fluxo, proteínas ProTriTAC solúveis nas concentrações indicadas foram incubadas com células T primárias humanas purificadas por 1 h a 4 °C na presença de PBS com 2% de soro fetal bovino e 15 mg/ml de albumina sérica humana. As placas foram lavadas com PBS com 2% de soro fetal bovino, detectadas usando o anticorpo monoclonal idiotipo anti-CD3 não competitivo marcado com AlexaFluor 647 11D3, e os dados foram analisados usando FlowJo 10 (FlowJo, LLC).

[00303] Para a potência funcional em ensaios de citotoxicidade celular dependente de células T, proteínas ProTriTAC solúveis nas concentrações indicadas foram incubadas com células T humanas em repouso purificadas (célula efetora) e com célula cancerígena HCT116 (célula-alvo) a uma razão efetor:célula-alvo de 10:1 durante 48 h a 37 °C. A linhagem da célula-alvo HCT116 foi transfectada de forma estável com um gene repórter de luciferase para permitir a medição de morte celular mediada por célula T específica por ONE-Glo (Promega). B. ProTriTAC exibe atividade potente, dependente de protease e anti- tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de roedor

[00304] O ProTriTAC foi avaliado quanto à sua atividade antitumoral in vivo em um tumor de xenoenxerto subcutâneo HCT116 misturado com células T humanas expandidas em camundongos NCG imunocomprometidos. Especificamente, 5x106 células HCT116 foram misturadas com 2,5x106 células T expandidas por camundongo no dia 0. As dosagens de ProTriTACs foram realizadas começando no dia seguinte com um cronograma q.d. x 10 via injeção intraperitoneal. As medições do volume tumoral foram determinadas usando medições de calibre e calculadas usando a fórmula V = (comprimento x largura x largura) / 2 nos tempos indicados. C. Expressão, purificação e estabilidade de moléculas triespecíficas de ProTriTAC exemplificativas Produção de Proteínas

[00305] As sequências que codificam moléculas de proteína de fusão induzíveis foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA 3.4 (Invitrogen) precedido por uma sequência líder e seguido por uma tag de Histidina 6x (SEQ ID NO: 205). As células Expi293F (Life Technologies A14527) foram mantidas em suspensão em Optimum Growth Flasks (Thomson) entre 0,2 a 8 x 1e6 células/ml em meios Expi 293. O DNA de plasmídeo purificado foi transfectado em células Expi293 de acordo com os protocolos do Expi293 Expression System Kit (Life Technologies, A14635) e mantido durante 4-6 dias após a transfecção. Alternativamente, as sequências que codificam as moléculas de proteína de fusão foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pDEF38 (CMC ICOS), transfectadas em células CHO-DG44 dhfr-, conjuntos estáveis foram gerados e foram cultivadas em meios de produção por até 12 dias antes da purificação. A quantidade de proteínas de fusão exemplificativas em meios condicionados foi quantificada usando um instrumento Octet RED 96 com pontas de Proteína A (ForteBio/Pall) usando uma proteína de fusão de controle para uma curva padrão. O meio condicionado de qualquer uma das células hospedeiras foi filtrado e parcialmente purificado por cromatografia de afinidade e dessalinização. As proteínas de fusão foram subsequentemente polidas por troca iônica e após agrupamento de frações formuladas em um tampão neutro contendo excipientes. A pureza final foi avaliada por SDS-PAGE e SEC analítica usando uma coluna Acquity BEH SEC 200 de 1,7µ 4,6 x 150 mm (Waters Corporation) resolvida em uma fase móvel aquosa/orgânica com excipientes em pH neutro em um sistema 1290 LC e picos integrados com Chemstation Software CDS (Agilent). As proteínas de fusão purificadas de células hospedeiras CHO são mostradas na SDS-PAGE descrita abaixo. Avaliação de Estabilidade

[00306] As proteínas de fusão purificadas em duas formulações foram subaliquotadas em tubos estéreis e tensionadas por cinco ciclos de congelamento-descongelamento, cada um compreendendo mais de 1 hora a - 80 °C e temperatura ambiente ou por incubação a 37 °C durante 1 semana. Amostras tensionadas foram avaliadas quanto à concentração e turbidez por espectrometria de UV usando placas de 96 poços transparentes de UV (Corning 3635) com um software SpectraMax M2 e SoftMaxPro (Molecular Devices), SDS-PAGE e SEC analítica e comparadas com a mesma análise de amostras não tensionadas de controle. Uma sobreposição de cromatogramas de SEC analítica de amostras de controle e tensionadas para uma única molécula de ProTriTAC exemplificativa purificada de células hospedeiras 293 é ilustrada abaixo.

[00307] Os resultados mostram que ProTriTACs foram produzidos com rendimentos comparáveis a TriTACs normais de agrupamentos estáveis de CHO; e que as proteínas eram estáveis após repetidos congelamentos- descongelamentos a 37 ° C durante 1 semana. D. Demonstração de mascaramento funcional e estabilidade de ProTriTAC in vivo em um estudo farmacocinético de macaco cynomolgus de três semanas

[00308] Dose única de ProTriTAC direcionado a PSMA (SEQ ID C1872), ProTriTAC não clivável (SEQ ID NO .: 187), TriTAC não mascarado/não clivável (SEQ IDNO: 190) e ProTriTAC ativado por protease que mimetiza o fármaco ativa (SEQ IDNO: 188) foi administrada em macacos cynomolgus a 0,1 mg/kg por meio de injeção intravenosa. As amostras de plasma foram coletadas nos pontos de tempo indicados. As concentrações de ProTriTAC foram determinadas usando ensaios de ligação de ligante com PSMA humano recombinante biotinilado (R&D systems) e 11D3 clonado anti-anticorpo idiotipo de CD3 marcado com enxofre em um ensaio MSD (Meso Scale Diagnostic, LLC). Os parâmetros farmacocinéticos foram estimados usando o software de farmacocinética Phoenix WinNonlin usando uma abordagem não compartimental consistente com a via de administração em bolus intravenosa.

[00309] Para calcular a taxa de conversão do pró-fármaco in vivo, a concentração do fármaco ativo em circulação foi estimada resolvendo o seguinte sistema de equações diferenciais, onde P é a concentração de pró-fármaco, A é a concentração de fármaco ativo, ka é a taxa de ativação de pró-fármaco na circulação, kc,P é a taxa de depuração do pró-fármaco e kc,A é a taxa de depuração do fármaco ativo. 𝑑𝑃 = −𝑘𝑐,𝑃 𝑃 𝑑𝑡 𝑑𝐴 = 𝑘𝑎 𝑃 − 𝑘𝑐,𝐴 𝐴 𝑑𝑡

[00310] As taxas de eliminação do pró-fármaco, do fármaco ativo e de um controle de pró-fármaco não clivável (kc,NCLV) foram determinadas empiricamente em macacos cynomolgus. Para estimar a taxa de ativação do pró-fármaco em circulação, presumimos que a diferença entre a taxa de depuração do pró-fármaco clivável e do pró-fármaco não clivável surgiu apenas da ativação não específica em circulação. Portanto, a taxa de conversão do pró- fármaco em fármaco ativo em circulação foi estimada subtraindo-se a taxa de depuração do pró-fármaco clivável do pró-fármaco não clivável.

𝑘𝑎 = 𝑘𝑐,𝑁𝐶𝐿𝑉 − 𝑘𝑐,𝑃

[00311] A concentração inicial do pró-fármaco em circulação foi determinada empiricamente, e a concentração inicial do fármaco ativo foi considerada como sendo zero. Resultados e Discussão

[00312] Os resultados do Exemplo 28 mostram que proteínas de fusão que contêm um polipeptídeo com atividade terapêutica desejada, como uma citocina ou fragmento funcional ou muteína desta ou scFV anti-CD3 podem ser preparadas em que a atividade terapêutica é mascarada por um domínio de mascaramento que se liga à albumina sérica e ao polipeptídeo ativo. O domínio de mascaramento está operacionalmente ligado ao domínio ativo por meio de um ligante peptídico clivável por protease. Os resultados mostram que este tipo de proteína de fusão pode ser administrado como uma proteína inativa que se torna ativada após a clivagem da protease no local desejado de atividade terapêutica, tal como em um tumor.

[00313] As sequências de aminoácidos das proteínas de fusão utilizadas no Exemplo 28 são fornecidas como SEQ ID NO: 183-190.

[00314] Os construtos da proteína de fusão de amostra são detalhados na Tabela 3. Na tabela 3, "L" é uma abreviatura de "ligante peptídico" e "lig. cliv." é uma abreviatura de “ligante peptídico clivável”. Outras abreviaturas: “mIFNg” indica interferon gama de camundongo (IFNg); “HAlbumina” indica albumina sérica humana (HSA); “MAlbumina” indica albumina sérica de camundongo. Tabela 3: TABELA DE PERMUTAÇÃO DE CONSTRUTO Nome do Construto Descrição do Construto ACP01 (anti-HSA)-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-camundongo ACP02 IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-camundongo IFNg-(lig. ACP03 cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-EpCAM)-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-camundongo ACP50 IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-EpCAM)-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. ACP51 cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante- ACP52 (anti-EpCAM)-6xHis ACP53 mAlbumina-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-mAlbumina-6xHis mAlbumina-(lig. cliv.)-mIFNg-Peptídeo Ligante-mIFNg-(lig. cliv.)- ACP54 mAlbumina-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-(lig.

ACP30 cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-(lig.

ACP55 cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis-C-tag (anti-FOLR1)-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig.

ACP56 cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante- ACP57 (anti-FOLR1)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)- ACP58 Peptídeo Ligante-(anti-EpCAM)-6xHis (anti-FOLR1)-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig.

ACP59 cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)- ACP60 Peptídeo Ligante-(anti-FOLR1)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-mIFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)- ACP61 Peptídeo Ligante-FN(CGS-2)-6xHis ACP63 anti-FN CGS-2 scFv (Vh/Vl)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-(lig.

ACP69 cliv.)-camundongo IFNg camundongo IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-camundongo ACP70 IFNg-(lig. cliv.)-(anti-HSA) camundongo IFNg-(lig. cliv.)-mAlbumina-(lig. cliv.)-camundongo ACP71 IFNg-(lig. cliv.)-mAlbumina mAlbumina-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-mAlbumina-(lig.

ACP72 cliv.)-camundongo IFNg mAlbumina-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-mAlbumina-(lig.

ACP73 cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-mAlbumina mAlbumina-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-5mer ligante peptídico-mAlbumina-5mer ligante peptídico-(lig. cliv.)-camundongo ACP74 IFNg-(lig. cliv.)-mAlbumina mAlbumina-(lig. cliv.)-camundongo IFNg-(lig. cliv.)-10mer ligante peptídico-mAlbumina-10mer ligante peptídico-(lig. cliv.)- ACP75 camundongo IFNg-(lig. cliv.)-mAlbumina (anti-HSA)-Peptídeo Ligante-camundongo_IFNg-Peptídeo Ligante- (anti-HSA)-Peptídeo Ligante-camundongo_IFNg-Peptídeo Ligante- ACP78 (anti-HSA)_(controle_não-clivável) Anti-HSA-(lig. cliv.)-camundongo-(lig. cliv.)-anti-HSA-(lig. cliv.)- ACP134 camundongo_IFNg-(lig. cliv.)-anti-HSA-L-anti-FOLR1 Anti-FOLR1-L-HSA-(lig. cliv.)-camundongo-(lig. cliv.)-HSA-(lig.

ACP135 cliv.)-camundongo_IFNg-(lig. cliv.)-HSA

ACP04 humano p40-murino p35-6xHis

ACP05 humano p40-humano p35-6xHis ACP34 camundongo p35- (lig. cliv.)-camundongo p40-6xHis ACP35 camundongo p35-GS-(lig. cliv.)-GS-camundongo p40-6xHis (anti-HSA)-(Lig.

Cliv.)-camundongo p40-camundongo p35-(Lig.

ACP36 Cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-EpCAM)-(anti-HSA)-(Lig.

Cliv.)-camundongo p40- ACP37 camundongo p35-(Lig.

Cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-EpCAM)-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIL12-(lig.

ACP79 cliv.)-(Anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIL12-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante- ACP80 (anti-EpCAM)-6xHis Bloqueador12-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)-humano p40-Peptídeo ACP06 Ligante-camundongo p35-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis ACP07 Bloqueador12-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)-humano p40-Peptídeo

Ligante-camundongo p35-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante- (anti-FOLR1)-6xHis (anti-FOLR1)-Peptídeo Ligante-Bloqueador12-Peptídeo Ligante- (lig. cliv.)-humano p40-Peptídeo Ligante-camundongo p35-(lig.

ACP08 cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-Peptídeo Ligante-Bloqueador12-Peptídeo Ligante-(lig.

ACP09 cliv.)-humano p40-Peptídeo Ligante-camundongo p35-6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-humano p40-L-camundongo p35-(lig. cliv.)- ACP10 Peptídeo Ligante-Bloqueador12-6xHis Humano_p40-Peptídeo Ligante-camundongo_p35- (lig. cliv.)- ACP11 Peptídeo Ligante-Bloqueador12-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-6xHis humano_p40-Peptídeo Ligante-camundongo_p35-Peptídeo ACP91 Ligante-Peptídeo Ligante-Bloqueador-Peptídeo Ligante-(anti- HSA)_(controle_não-clivável) ACP136 humano p40-L-camundongo p35-(lig. cliv.)-Bloqueador humano_p40-L-camundongo_p35- (lig. cliv.)-Bloqueador-L-(anti- ACP138 HSA)-L-FOLR1 Anti-FOLR1-L-humano_p40-L-camundongo_p35-(lig. cliv.)- ACP139 Bloqueador12-L-(anti-HSA) Anti-FOLR1-(lig. cliv.)-humano_p40-L-camundongo_p35-(lig. cliv.)- ACP140 Bloqueador12-L-(anti-HSA) ACP12 (anti-EpCAM)-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-bloqueador2-6xHis ACP13 (anti-EpCAM)-Bloqueador2-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-IL2-6xHis Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)-IL2- (lig. cliv.)-(anti-HSA)- ACP14 6xHis Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante-(lig.

ACP15 cliv.)- IL2 -6xHis IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)-Bloqueador2- ACP16 6xHis

(anti-EpCAM)-Peptídeo Ligante-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo ACP17 Ligante-(lig. cliv.)-Bloqueador2-6xHis (anti-EpCAM)-Peptídeo Ligante-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo ACP18 Ligante-vh(lig. cliv.)vl-6xHis IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(anti- ACP19 HSA)-Peptídeo Ligante-(anti-EpCAM) -6xHis ACP20 IL2-(lig. cliv.)-Bloqueador2-6xHis ACP21 IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-Bloqueador2-6xHis IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-bloqueador-(lig. cliv.)-(anti-HSA)- ACP22 Peptídeo Ligante-(anti-EpCAM)-6xHis (anti-FOLR1)-(lig. cliv.)-Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)- ACP23 (anti-HSA)-(lig. cliv.)- IL2-6xHis ACP24 (Bloqueador2)-(lig. cliv.)-(IL2)-6xHis ACP25 Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)-IL2-6xHis (anti-EpCAM)-Peptídeo Ligante-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo ACP26 Ligante-bloqueador(NARA1 Vh/Vl) (anti-EpCAM)-Peptídeo Ligante-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo ACP27 Ligante-bloqueador(NARA1 Vl/Vh) IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-Bloqueador2-(NARA1 Vh/Vl)- ACP28 Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante-(anti-EpCAM) IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-Bloqueador2-(NARA1 Vl/Vh)- ACP29 Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante-(anti-EpCAM) ACP38 IL2-(lig. cliv.)-bloqueador-(anti-HSA)-(anti-EpCAM)-6xHis (anti-EpCAM)-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-Bloqueador2-(lig.

ACP39 cliv.)-IL-2-6xHis ACP40 CD25ecd-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)-IL2-6xHis ACP41 IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-CD25ecd-6xHis (anti-HSA)-Peptídeo Ligante-CD25ecd-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)- ACP42 IL2-6xHis

IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-CD25ecd-Peptídeo Ligante-(anti- ACP43 HSA)-6xHis IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-CD25ecd-(lig. cliv.)-(anti-HSA)- ACP44 6xHis (anti-HSA)-(lig. cliv.)-Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)-IL2- ACP45 6xHis IL2-(lig. cliv.)-ligante peptídicoL-vh(lig. cliv.)vl-ligante peptídico-(anti- ACP46 HSA)-L-(anti-EpCAM)-6xHis (anti-EpCAM)-Peptídeo Ligante-IL2-(Peptídeo Ligante Clivável)- ACP47 (anti-HSA)-Peptídeo Ligante-Bloqueador2-6xHis ACP48 IL2-(lig. cliv.)-Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-6xHis IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(anti- ACP49 HSA)-6xHis (anti-HSA)-(16mer Lig.

Cliv.)-IL2-(16mer Lig.

Cliv.)-(anti-HSA)- ACP92 6XHis (anti-EpCAM)-(anti-HSA)-(anti-EpCAM)-Bloqueador2-(lig. cliv.)-IL2- ACP93 6xHis ACP94 (anti-EpCAM)-(anti-HSA)-Bloqueador2-(lig. cliv.)-IL2-6xHis ACP95 (anti-EpCAM)-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-IL2-6xHis ACP96 (anti-EpCAM)-(16mer lig. cliv.)-IL2-(16mer lig. cliv.)-(anti-HSA) ACP97 (anti-EpCAM)-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis ACP99 (anti-EpCAM)-Peptídeo Ligante-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis ACP100 (anti-EpCAM)-Peptídeo Ligante-IL2-6xHis ACP101 IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-EpCAM)-(lig. cliv.)-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante- ACP102 bloqueador-6xHis IL2-(lig. cliv.)-Peptídeo Ligante-Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(anti- ACP103 HSA)-Peptídeo Ligante-(antiI-FOLR1)-6xHis ACP104 (anti-FOLR1)-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante-

Bloqueador2-6xHis Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)- ACP105 Peptídeo Ligante-(anti-FOLR1)-6xHis (anti-FOLR1)-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-bloqueador- ACP106 Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)-IL2 -6xHis Bloqueador2-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-(lig. cliv.)-IL2-Peptídeo ACP107 Ligante-(anti-FOLR1)-6xHis (anti-EpCAM)-IL2-(Duplamente lig. cliv.)-(anti-HSA)-Peptídeo ACP108 Ligante-bloqueador-6xHis ACP117 anti-FN CGS-2 scFv (Vh/Vl)-6xHis ACP118 NARA1 Vh/Vl não-clivável ACP119 NARA1 Vh/Vl clivável ACP120 NARA1 Vh/Vl não-clivável ACP121 NARA1 Vl/Vh clivável IL2-Peptídeo Ligante-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante-Peptídeo ACP124 Ligante-bloqueador_(controle_não-clivável) ACP132 IL2-L-HSA ACP141 IL2-L-Albumina_humana ACP142 IL2-(lig. cliv.)-Albumina_humana ACP144 IL2-(lig. cliv.)-HSA-(ligante clivável)bloqueador-L-(anti-FOLR1) Anti-FOLR1-L-IL2-(lig. cliv.)-HSA-Peptídeo Ligante-(lig. cliv.)- ACP145 bloqueador2 Anti-FOLR1-(cleav. link)-IL2-(lig. cliv.)-HSA-Peptídeo Ligante-(lig.

ACP146 cliv.)-bloqueador2 ACP133 IL2-6x His IL2-(Peptídeo ligante clivável)-(anti-HSA)-Peptídeo Ligante-(lig.

ACP147 cliv.)-bloqueador2-L-(anti-EpCAM) (anti-EpCAM)-L-IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-L-(Peptídeo ligante cliv.)- ACP148 bloqueador2

(anti-EpCAM)-(lig. cliv.)-IL2-(Peptídeo ligante cliv)-(anti-HSA)-L- ACP149 (Peptídeo ligante cliv.)-bloqueador2 ACP31 (anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNa1-(lig. cliv.)-(anti-HSA) ACP32 (anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNa1(N+C trunc)-(lig. cliv.)-(anti-HSA) ACP33 (anti-HSA)-(lig. cliv.)-mIFNa1(C trunc)-(lig. cliv.)-(anti-HSA) ACP131 mIFNa1 ACP125 Anti-HSA-(lig. cliv.)-mIFNa1 ACP126 mIFNa1-(lig. cliv.)-(anti-HSA) Albumina_Camundongo-(Lig. cliv.)-mIFNa1-(cleav link)- ACP127 Albumina_camundongo ACP128 Albumina_Camundongo-(lig. cliv.)-mIFNa1 ACP129 mIFNa1-(lig. cliv.)-mAlb ACP150 (Anti-FOLR1)-L-(anti-HSA)-(Lig. cliv.)-mIFNa1-(Lig. cliv.)-(anti-HSA) Anti-FOLR1-L-(anti-HSA)-(Lig. cliv.)-mIFNa1-(Lig. cliv.)-(anti-HSA)- ACP151 L-(anti-FOLR1) ACP152 (anti-HSA)-L-mIFNa1-L-(anti-HSA)_(controle_não-clivável) ACP153 IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-ligante peptídico(lig. cliv.)-bloqueador2 ACP154 IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-ligante peptídico(lig. cliv.)-bloqueador2 ACP155 IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-ligante peptídico(lig. cliv.)-bloqueador2 ACP156 IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-ligante peptídico(lig. cliv.)-bloqueador2 ACP157 IL2-(lig. cliv.)-(anti-HSA)-ligante peptídico(lig. cliv.)-bloqueador2 Tabela de Sequência SEQ ID Nome Sequência NO. 1 IL-2 MYRMQLLSCI ALSLALVTNS APTSSSTKKT QLQLEHLLLD Humana LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE

EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIISTLT

2 Albumin MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE a séricaENFKALVLIA FAQYLQQCPF EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD humana ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP

ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ GLKCASLQKF GERAFKAWAV ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEK SHCIAEVEND EMPADLPSLA ADFVGSKDVC KNYAEAKDVF LGMFLYEYAR RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE FKPLVEEPQN LIKQNCELFE QLGEYKFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV SRNLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDCLSVF LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVNGRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEK ERQIKKQTALV ELVKHK PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET

CFAEEGKKLVAASQAALGL 45 ACP12 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQAPG (proteína KQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL de fusão KPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSggggsggggsggggs de IL2) aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist ltSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS

GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKG

RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGT LVTVSSggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA

ASGFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDY WGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSAS VGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTF

GGGTKVEIKHHHHHH 46 ACP13 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQAPG (proteína KQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL de fusão KPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSggggsggggsggggs de IL2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAP

GKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTN

VGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKggggsggggsgg ggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVR

QAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYL

QMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAG MKGLPGSaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatel khlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativefl nrwitfcqsiistltHHHHHH 47 ACP14 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAP (proteína GKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMN de fusão SLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSG de IL2) GGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTN

VGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKggggsggggsgg ggsggggsggggsggggsSGGPGPAGMKGLPGSaptssstkktqlqlehlll dlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrp rdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistltSGGPGPAGMK

GLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSW VRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTT LYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSHHHHH

H 48 ACP15 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAP (proteína GKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMN de fusão SLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSG de IL2) GGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTN

VGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKggggsggggsgg ggsggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF

TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF

TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV TVSSggggsggggsggggsSGGPGPAGMKGLPGSaptssstkktqlqle hllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfh lrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistltHHHHHH 49 ACP16 aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk (proteína pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist de fusão ltSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS de IL2) GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKG

RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGT LVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsggggsSGGPGPAGMKG

LPGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWV RQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQN VGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKHHHHH

H 50 ACP17 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQAPG (proteína KQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL de fusão KPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSggggsggggsggggs de IL2) aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist ltSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS

GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKG

RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGT LVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsggggsSGGPGPAGMKG

LPGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWV RQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQN VGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKHHHHH

H 51 ACP18 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQAPG (proteína KQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL de fusão KPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSggggsggggsggggs de IL2) aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist ltSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS

GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKG

RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGT LVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsggggsEVQLVESGGGLV

QPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDS

SSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSsggpgpagmkglpgsDIQMTQS

PSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIY SASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQY YTYPYTFGGGTKVEIKHHHHHH

52 ACP19 aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk (proteína pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist de fusão ltSGGPGPAGMKGLPGSggggsggggsggggsggggsggggsggggsE de IL2) VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAPG

KGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNV

GWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKggggsggggsggg gsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQ

APGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQ MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSggggsggggsgg ggsQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQ

APGKQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQM NSLKPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSHHHHHH** 53 ACP20 aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk (proteína pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist de fusão ltSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS de IL2) GFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRF

TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWG QGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGG

GTKVEIKHHHHHH 54 ACP21 aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk (proteína pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist de fusão ltSGGPGPAGMKGLPGSggggsggggsggggsggggsggggsggggsE de IL2) VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAPG

KGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNV GWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI

SSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKHHHHHH 55 ACP22 aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk (proteína pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist de fusãoltSGGPGPAGMKGLPGSggggsggggsggggsggggsggggsggggsE de IL2) VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAPG

KGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNV GWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKSGGPGPAGM KGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMS

WVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKT TLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSggggsg gggsggggsQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMS

WYRQAPGKQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNT VYLQMNSLKPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSHHHH

HH 56 ACP23 QVQLQESGGGLAQAGGSLSLSCAASGFTVSNSVMAWYRQT (proteína PGKQREFVAIINSVGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMN de fusão NLKPEDTAVYVCNRNFDRIYWGQGTQVTVSSSGGPGPAGMK de IL2) GLPGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAW

VRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQ

NVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKggggs ggggsggggsggggsggggsggggsSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVE

SGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLE WVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRP

EDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMKGLPGS aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist ltHHHHHH 57 ACP24 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAP (proteína GKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMN de fusão SLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSG de IL2) GGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTN

VGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLT

ISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKSGGPGPAGM KGLPGSaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkh lqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnr witfcqsiistltHHHHHH 58 ACP25 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAP (proteína GKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMN de fusão SLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSG de IL2) GGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTN

VGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKggggsggggsgg ggsggggsggggsggggsSGGPGPAGMKGLPGSaptssstkktqlqlehlll dlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrp rdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistltHHHHHH 59 ACP26 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQAPG (proteína KQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL de fusão KPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSggggsggggsggggs de IL2) aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist ltSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS

GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKG

RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGT LVTVSSggggsggggsggggsggggsQVQLQQSGAELVRPGTSVK

VSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYN

EKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARWRGD GYYAYFDVWGAGTTVTVSSggggsggggsggggsDIVLTQSPASL

AVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLI YAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQS

NEDPYTFGGGTKLEIKHHHHHHEPEA 60 ACP27 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQAPG (proteína KQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL de fusão KPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSggggsggggsggggs de IL2) aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist ltSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS

GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKG

RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGT LVTVSSggggsggggsggggsggggsDIVLTQSPASLAVSLGQRATI

SCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIP

ARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGG TKLEIKggggsggggsggggsQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKA

SGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARWRGDGYYAY

FDVWGAGTTVTVSSHHHHHHEPEA 61 ACP28 aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk (proteína pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist de fusão ltSGGPGPAGMKGLPGSggggsggggsggggsggggsggggsQVQLQ de IL2) QSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLE

WIGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTS DDSAVYFCARWRGDGYYAYFDVWGAGTTVTVSSggggsgggg sggggsDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMN

WYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHP VEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKggggsggggsggggs

EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP

GKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQM NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSggggsggggsggg gsQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQA

PGKQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMN

SLKPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSHHHHHHEPEA 62 ACP29 aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelk (proteína pleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist de fusão ltSGGPGPAGMKGLPGSggggsggggsggggsggggsggggsDIVLT de IL2) QSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQ

PPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATY YCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKggggsggggsggggsQVQLQQSG

AELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGV

INPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSA VYFCARWRGDGYYAYFDVWGAGTTVTVSSggggsggggsgggg sEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQA

PGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQ MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSggggsggggsgg ggsQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQ

APGKQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQM NSLKPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSHHHHHHEPE

A 63 IL2Ra 10 20 30 40 50

MDSYLLMWGL LTFIMVPGCQ AELCDDDPPE IPHATFKAMA

YKEGTMLNCE 60 70 80 90 100

CKRGFRRIKS GSLYMLCTGN SSHSSWDNQC QCTSSATRNT

TKQVTPQPEE 110 120 130 140 150

QKERKTTEMQ SPMQPVDQAS LPGHCREPPP WENEATERIY

HFVVGQMVYY 160 170 180 190 200

QCVQGYRALH RGPAESVCKM THGKTRWTQP QLICTGEMET

SQFPGEEKPQ 210 220 230 240 250

ASPEGRPESE TSCLVTTTDF QIQTEMAATM ETSIFTTEYQ

VAVAGCVFLL 260 270

ISVLLLSGLT WQRRQRKSRR TI 64 IL2Rb 10 20 30 40 50

MAAPALSWRL PLLILLLPLA TSWASAAVNG TSQFTCFYNS

RANISCVWSQ 60 70 80 90 100

DGALQDTSCQ VHAWPDRRRW NQTCELLPVS QASWACNLIL

GAPDSQKLTT 110 120 130 140 150

VDIVTLRVLC REGVRWRVMA IQDFKPFENL RLMAPISLQV

VHVETHRCNI 160 170 180 190 200

SWEISQASHY FERHLEFEAR TLSPGHTWEE APLLTLKQKQ EWICLETLTP DTQYEFQVRV KPLQGEFTTW SPWSQPLAFR TKPAALGKDT

IPWLGHLLVG 260 270 280 290 300

LSGAFGFIIL VYLLINCRNT GPWLKKVLKC NTPDPSKFFS

QLSSEHGGDV 310 320 330 340 350

QKWLSSPFPS SSFSPGGLAP EISPLEVLER DKVTQLLLQQ

DKVPEPASLS 360 370 380 390 400

SNHSLTSCFT NQGYFFFHLP DALEIEACQV YFTYDPYSEE

DPDEGVAGAP 410 420 430 440 450

TGSSPQPLQP LSGEDDAYCT FPSRDDLLLF SPSLLGGPSP

PSTAPGGSGA 460 470 480 490 500

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LVLREAGEEV 510 520 530 540 550

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V 65 IL2Rg 10 20 30 40 50

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) lkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadp yrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaHHHHHH 67 ACP05 iwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkef (proteína gdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcw de fusão wlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsacpaa de p40 eeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtw humana/ stphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewa p35 IL12 svpcsggggsggggsggggsrnlpvatpdpgmfpclhhsqnllravsnmlqkarqtl murina) efypctseeidheditkdktstveaclpleltknesclnsretsfitngsclasrktsfmmal clssiyedlkmyqvefktmnakllmdpkrqifldqnmlavidelmqalnfnsetvpqks sleepdfyktkiklcillhafriravtidrvmsylnasHHHHHH 68 ACP06 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSRSNIGSNTVKWYQQLP (proteína GTAPKLLIYYNDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDE de fusão ADYYCQSYDRYTHPALLFGTGTKVTVLggggsggggsggggsQVQ de p40 LVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGK humana/ GLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS p35 IL12 LRAEDTAVYYCKTHGSHDNWGQGTMVTVSSggggsggggsggg murina) gsggggsggggsggggsSGGPGPAGMKGLPGSiwelkkdvyvveldwyp dapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlsh sllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssd pqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklky enytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgks krekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcsggggsggggsg gggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktc lplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnh nhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtin rvmgylssaSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLR

LSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLY AESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLS

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LSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLY

AESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLS VSSQGTLVTVSSggggsggggsggggsQVQLQESGGGLAQAGGS

LSLSCAASGFTVSNSVMAWYRQTPGKQREFVAIINSVGSTNY ADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYVCNRNFDR

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RLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTL YAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSL

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KGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCKTHGSHDNWGQGTMVTVSSggggsggggsgg ggsggggsggggsggggsSGGPGPAGMKGLPGSiwelkkdvyvveldwy pdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevls hsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgss dpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklk yenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgk skrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcsggggsggggs ggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlkt clplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqn hnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvti nrvmgylssaHHHHHHEPEA 72 ACP10 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP (proteína GKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQM de fusão NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMK de p40 GLPGSiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgk humana/ tltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceakny p35 IL12 sgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqeds murina) acpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevswe ypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryysss wsewasvpcsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktarekl khysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlcl gsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppv geadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaSGGPGPAGMKGLPGSgg ggsggggsggggsggggsggggsggggsQSVLTQPPSVSGAPGQRVT

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SQGTLVTVSSHHHHHHEPEA 74 IL12 p40 humana (Nº de Acesso Uniprot P29460)

75 IL12 p35 de camund ongo (Nº de Acesso Uniprot P43431)

76 IL12Rb- 2

77 IL12Rb- 1

78 IL-12 p35 humana (Nº de Acesso Uniprot P29459)

79 IL-12 p40 de camund ongo (Nº de Acesso Uniprot P43432) 80 ACP01 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP (proteína GKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQM de fusão NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMK de IFNgGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlf de evlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqvqrqafnelirvvhq camund llpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGN ongo) SLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRD

TLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGG

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PGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVR QAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYL

QMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSHHHHHH 82 ACP03 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP (proteína GKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQM de fusão NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMK de IFNgGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlf de evlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqvqrqafnelirvvhq camund llpesslrkrkrsrcggggsggggsggggshgtviesleslnnyfnssgidveekslfldi ongo) wrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsi akfevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGS

EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP GKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQM

NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSHHHHHH 83 IFN-g humano (Nº de Acesso Uniprot P01579) 84 IFN-g de camund ongo (Nº de Acesso Uniprot P01580) 85 ACP30 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF (proteína TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF de fusão TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV de IFNgTVSSSGGPGPAGMKGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwr de nwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiak camund fevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSE ongo) VQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPG

KGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN

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LRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDT LYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGS

LSVSSQGTLVTVSSHHHHHH 86 ACP31 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP (proteína GKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQM de fusão NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMK de IFNa1 GLPGScdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrkdfgfpqekvdaqqikkaqaip de vlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlqgclmqqvgvqefpltqedall camund avrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssanvlgrlreekSGGPGPAG ongo) MKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGM

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HHHEPEA 87 ACP32 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP (proteína GKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQM de fusão NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMK de IFNa1 GLPGScdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrkdfgfpqekvdaqqikkaqaip de vlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlqgclmqqvgvqefpltqedall camund avrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssanvSGGPGPAGMKGLP ongo) GSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQ

APGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQ MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSHHHHHHEPE

A 88 IFNgR1 89 IFNgR2 90 ACP51 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQAPG Proteína KQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL de fusão KPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVTVSSggggsggggsggggs de IFGEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP de GKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQM camund NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMK ongo GLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlf evlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqvqrqafnelirvvhq llpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGN

SLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRD TLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGG

SLSVSSQGTLVTVSSHHHHHH 91 ACP52 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP Proteína GKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQM de fusão NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMK de IFGGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlf de evlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqvqrqafnelirvvhq camund llpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGN ongo SLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRD

TLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGG SLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGL VQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSIS

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GLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIDIMSWYRQAPGKQRELVARIT RGGTISYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYY

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SGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKG RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGT

LVTVSSHHHHHH 95 ACP55 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF Proteína TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF de fusão TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV de IFGTVSSSGGPGPAGMKGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwr de nwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiak camund fevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSE ongo VQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPG

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SLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMKG LPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlfe vlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqvqrqafnelirvvhqll pesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNS

LRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDT LYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGS

LSVSSQGTLVTVSSHHHHHH 96 ACP56 mdmrvpaqllgllllwlrgarcQVQLQESGGGLAQAGGSLSLSCAASG Proteína FTVSNSVMAWYRQTPGKQREFVAIINSVGSTNYADSVKGRFT de fusão ISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYVCNRNFDRIYWGQGTQ de IFGVTVSSggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAA de SGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVK camund GRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQG ongo TLVTVSSSGGPGPAGMKGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfl diwrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafm siakfevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPG

SEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQA PGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQ MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSHHHHHHEPE

A 97 ACP57 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF Proteína TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF de fusão TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV de IFGTVSSSGGPGPAGMKGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwr de nwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiak camund fevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSE ongo VQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPG

KGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSggggsggggsgggg sQVQLQESGGGLAQAGGSLSLSCAASGFTVSNSVMAWYRQT

PGKQREFVAIINSVGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMN

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AASGFTVSNSVMAWYRQTPGKQREFVAIINSVGSTNYADSVK GRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYVCNRNFDRIYWGQ

GTQVTVSSHHHHHHEPEA 101 ACP61 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF Proteína TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF de fusão TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV de IFGTVSSSGGPGPAGMKGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwr de nwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiak camund fevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGShg ongo tviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqais nnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkr srcSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAA

SGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVK

GRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQG TLVTVSSggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA

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GTKLTVLHHHHHHEPEA 103 ACP69 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF Proteína TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF de fusão TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV de IFGTVSSSGGPGPAGMKGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwr de nwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiak camund fevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSE ongo VQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPG

KGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN

SLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMKG LPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlfe vlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqvqrqafnelirvvhqll pesslrkrkrsrcHHHHHHEPEA 104 ACP70 mdmrvpaqllgllllwlrgarchgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgd Proteína mkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqv de fusão qrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVES de IFGGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEW de VSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPED camund TAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMKGLPGShgt ongo viesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqais nnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkr srcSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAA

SGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVK GRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQG

TLVTVSSHHHHHHEPEA 105 ACP71 mdmrvpaqllgllllwlrgarchgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgd Proteína mkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqv de fusão qrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSEAHKSEIA de IFGHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFA de KTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCT camund KQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTF ongo MGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKES

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LVTRCKDALAHHHHHHEPEA 106 ACP72 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFS Proteína QYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLF de fusão GDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSL de IFGPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPEL de LYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQ camund RMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDL ongo TKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCD

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KPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEA KDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEAN PPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAIL VRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVE DYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTV DETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKP

KATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRC KDALASGGPGPAGMKGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiw rnwqkdgdmkilqsqiisfylrlfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsia kfevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSE

AHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQ EVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGEL ADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFK ENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCA EADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAF KAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECA DDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHD TMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRH PDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLV EEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLV EAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKT PVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTF HSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFA

QFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALASGGPGPAGM KGLPGShgtviesleslnnyfnssgidveekslfldiwrnwqkdgdmkilqsqiisfylr lfevlkdnqaisnnisvieshlittffsnskakkdafmsiakfevnnpqvqrqafnelirvvh qllpesslrkrkrsrcSGGPGPAGMKGLPGSEAHKSEIAHRYNDLGE

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SGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVK GRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQG TLVTVSSSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGGSLR LSCAASGFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPD TVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWD ALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSAS

FRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTY PYTFGGGTKVEIKggggsggggsggggsggggsggggsggggsSGGP GPAGMKGLPGSaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfymp kkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadet ativeflnrwitfcqsiistltHHHHHH 150 ACP107 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF Proteína TFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTI de fusão SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQ de IL-2 GTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD

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AWYRQTPGKQREFVAIINSVGSTNYADSVKGRFTISRDNAKN TVYLQMNNLKPEDTAVYVCNRNFDRIYWGQGTQVTVSSHHH

HHH 151 ACP108 mdmrvpaqllgllllwlrgarcQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG Proteína RIFSIDIMSWYRQAPGKQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTIS de fusão RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVT de IL-2 VSSggggsggggsggggsaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltf kfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmce yadetativeflnrwitfcqsiistltSGGPGPAGMKGLPGSrgetgpaaPGSE

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VEIKHHHHHH 152 ACP117 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF Anti-FN TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF CGS-2 TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVGAFRPYRKHE scFv WGQGTLVTVSRggggsggggsggggsSSELTQDPAVSVALGQTV

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GGTKLEIKHHHHHHEPEA 154 ACP119 mdmrvpaqllgllllwlrgarcQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY NARA1 AFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKAT Vh/Vl LTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARWRGDGYYAYFDV clivável WGAGTTVTVSSSGGPGPAGMKGLPGSDIVLTQSPASLAVSL

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PYTFGGGTKLEIKHHHHHHEPEA 155 ACP120 mdmrvpaqllgllllwlrgarcDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQS NARA1 VDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGS Vl/Vh GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKg não- gggsggggsggggsQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFT clivável NYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTA

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YAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKA TLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARWRGDGYYAYFD

VWGAGTTVTVSSHHHHHHEPEA 157 ACP124 mdmrvpaqllgllllwlrgarcaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfk Proteína fympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmcey de fusão adetativeflnrwitfcqsiistltggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQP de IL-2 GNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSG

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SEQ ID NO: 205) 165 ACP147 mdmrvpaqllgllllwlrgarcaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfk Proteína fympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmcey de fusão adetativeflnrwitfcqsiistltSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGG de IL-2 LVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSI

SGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAV YYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggs ggggsSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS

CAASGFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTV RGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDAL DYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFR

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LVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSI

SGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAV YYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggs ggggsSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS

CAASGFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTV RGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDAL DYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFR YSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPY

TFGGGTKVEIKHHHHHHEPEA 167 ACP149 mdmrvpaqllgllllwlrgarcQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG Proteína RIFSIDIMSWYRQAPGKQRELVARITRGGTISYDDSVKGRFTIS de fusão RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCNALYGTDYWGKGTQVT de IL-2 VSSSGGPGPAGMKGLPGSaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkl trmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgset tfmceyadetativeflnrwitfcqsiistltSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVE

SGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLE

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SLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTY SPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSN WDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIY SASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQY

YTYPYTFGGGTKVEIKHHHHHHEPEA 168 ACP33 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF Proteína TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF de fusão TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV de IFNaTVSSSGGPGPAGMKGLPGScdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrkd de fgfpqekvdaqqikkaqaipvlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlqg camund clmqqvgvqefpltqedallavrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssanv ongo SGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS

GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKG RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGT

LVTVSSHHHHHHEPEA 169 ACP131 mdmrvpaqllgllllwlrgarccdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrkdfgfpqek IFNa devdaqqikkaqaipvlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlqgclmqqv camund gvqefpltqedallavrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssanvlgrlreek ongo HHHHHHEPEA 170 ACP125 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF Proteína TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF de fusão TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV de IFNaTVSSSGGPGPAGMKGLPGScdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrkd de fgfpqekvdaqqikkaqaipvlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlqg camund clmqqvgvqefpltqedallavrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssanv ongo lgrlreekHHHHHHEPEA 171 ACP126 mdmrvpaqllgllllwlrgarccdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrkdfgfpqek Proteína vdaqqikkaqaipvlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlqgclmqqv de fusão gvqefpltqedallavrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssanvlgrlreek de IFNaSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS de GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKG camund RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGT ongo LVTVSSHHHHHHEPEA 172 ACP127 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFS Proteína QYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLF de fusão GDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSL de IFNaPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPEL de LYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQ camund RMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDL ongo TKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCD

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EGPNLVTRCKDALAHHHHHHEPEA 173 ACP128 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFS Proteína QYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLF de fusão GDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSL de IFNaPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPEL de LYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQ camund RMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDL ongo TKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCD

KPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEA KDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEAN PPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAIL VRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVE DYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTV DETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKP

KATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRC KDALASGGPGPAGMKGLPGScdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrk dfgfpqekvdaqqikkaqaipvlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlq gclmqqvgvqefpltqedallavrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssan vlgrlreekHHHHHHEPEA 174 ACP129 mdmrvpaqllgllllwlrgarccdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrkdfgfpqek Proteína vdaqqikkaqaipvlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlqgclmqqv de fusão gvqefpltqedallavrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssanvlgrlreek de IFNaSGGPGPAGMKGLPGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAF de SQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTL camund FGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPS ongo LPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPE

LLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQ RMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDL TKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCD KPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEA KDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEAN PPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAIL VRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVE DYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTV DETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKP KATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRC

KDALAHHHHHHEPEA 175 ACP150 mdmrvpaqllgllllwlrgarcQVQLQESGGGLAQAGGSLSLSCAASG Proteína FTVSNSVMAWYRQTPGKQREFVAIINSVGSTNYADSVKGRFT de fusão ISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYVCNRNFDRIYWGQGTQ de IFNaVTVSSggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAA de SGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVK camund GRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQG ongo TLVTVSSSGGPGPAGMKGLPGScdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclk drkdfgfpqekvdaqqikkaqaipvlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqln dlqgclmqqvgvqefpltqedallavrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralss sanvlgrlreekSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNS

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LSVSSQGTLVTVSSHHHHHHEPEA 176 ACP151 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF Proteína TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF de fusão TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV de IFNaTVSSSGGPGPAGMKGLPGScdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrkd de fgfpqekvdaqqikkaqaipvlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlqg camund clmqqvgvqefpltqedallavrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssanv ongo lgrlreekSGGPGPAGMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLS

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WGQGTQVTVSSHHHHHHEPEA 177 ACP152 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGF Proteína TFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRF de fusão TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV de IFNaTVSSggggsggggsggggscdlpqthnlrnkraltllvqmrrlsplsclkdrkdfgfpq de ekvdaqqikkaqaipvlseltqqilniftskdssaawnttlldsfcndlhqqlndlqgclmq camund qvgvqefpltqedallavrkyfhritvylrekkhspcawevvraevwralsssanvlgrlre ongo ekggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFT

FSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVT

VSSHHHHHHEPEA 178 ACP153 mdmrvpaqllgllllwlrgarcaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfk (Conjuga fympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmcey do de IL-adetativeflnrwitfcqsiistltsggpGPAGLYAQpgsEVQLVESGGGLV 2) QPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISG

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TKVEIKHHHHHHEPEA 179 mdmrvpaqllgllllwlrgarcaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfk fympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmcey ACP154 adetativeflnrwitfcqsiistltsggpPGGPAGIGpgsEVQLVESGGGLVQ (Conjuga PGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGS do de IL-GRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYC 2) TIGGSLSVSSQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsgggg ssggpPGGPAGIGpgsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF

TFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQ GTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD RVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGG

TKVEIKHHHHHHEPEA 180 ACP155 mdmrvpaqllgllllwlrgarcaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfk (Conjuga fympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmcey do de IL-adetativeflnrwitfcqsiistltsggpALFKSSFPpgsEVQLVESGGGLVQ 2) PGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGS

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TKVEIKHHHHHHEPEA 181 ACP156 mdmrvpaqllgllllwlrgarcaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfk (Conjuga fympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmcey do de IL-adetativeflnrwitfcqsiistltsggpPLAQKLKSSpgsEVQLVESGGGLV 2) QPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISG

SGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYY CTIGGSLSVSSQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsggg gssggpPLAQKLKSSpgsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS

GFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWG QGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGG

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A 183 Pró- EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQG fármaco GGGGLDGNEEPGGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISR de DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSS

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184 Pró- EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQG fármaco GGGGLDGNEEPGGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISR não DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSS clivável GGGGSGGGGSGGVVGGGGTQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLT de CASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPA

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DSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWG QGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCA ASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVVAINWASGSTYYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGYQINSGN

YNFKDYEYDYWGQGTLVTVSSHHHHHH 186 Pró- EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQG fármaco GGGGLDGNEEPGGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISR de DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSS

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FSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGT KLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKL SCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYY ADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANF GNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGG LVQPGGSLTLSCAASRFMISEYHMHWVRQAPGKGLEWVSTI NPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVY

YCDSYGYRGQGTQVTVSSHHHHHH 187 Pró- EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQG fármaco GGGGLDGNEEPGGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISR não DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSS clivável GGGGSGGGGSGGVVGGGGTQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLT de CASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPA

PSMA RFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGG C1873 TKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLK

LSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATY YADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHAN FGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGG GLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYHMHWVRQAPGKGLEWVST INPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVY

YCDSYGYRGQGTQVTVSSHHHHHH 188 Fármaco VVGGGGTQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNY Ativo de PNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALT

PSMA LSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSGG C1875 GGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYA

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QVTVSSHHHHHH 189 GFP QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQA TriTAC PGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYL C646 QMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSSGGGGSG

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TKLTVLHHHHHH 190 TriTAC EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAP não GKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQM mascara NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGG do/não SGGVVGGGGTQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTS clivável GNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGK C1874 AALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGG

SGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTF NKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYW AYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL TLSCAASRFMISEYHMHWVRQAPGKGLEWVSTINPAGTTDYA ESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCDSYGYRG

QGTQVTVSSHHHHHH 191 Bloquea mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF dor 2 TFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTI

(Bloquea SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQ dor de GTTVTVSSggggsggggsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC IL2) KASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSG

SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIK

HHHHHH 192 Bloquea mdmrvpaqllgllllwlrgarcQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSRS dor 12 NIGSNTVKWYQQLPGTAPKLLIYYNDQRPSGVPDRFSGSKSG (bloquea TSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDRYTHPALLFGTGTKVTVLg dor de gggsggggsggggsQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS IL-12) SYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTIS

RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTHGSHDNWGQGTMV TVSSHHHHHH INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00315] Todas as divulgações de todas as publicações de patentes e não patentes citadas neste documento são, cada uma, incorporadas por referência em suas totalidades para todos os fins.

OUTRAS MODALIDADES

[00316] A divulgação exposta acima pode abranger múltiplas invenções distintas com utilidade independente. Embora cada uma destas invenções tenha sido divulgada na(s) sua(s) forma(s) preferida(s), as suas concretizações específicas como descritas e ilustradas aqui não devem ser consideradas num sentido limitativo, porque são possíveis numerosas variações. O assunto das invenções inclui todas as combinações e subcombinações novas e não óbvias dos vários elementos, características, funções e/ou propriedades descritas neste documento. As reivindicações a seguir destacam particularmente certas combinações e subcombinações consideradas como novas e não óbvias. As invenções incorporadas em outras combinações e subcombinações de recursos, funções, elementos e/ou propriedades podem ser reivindicadas neste pedido,

em pedidos que reivindicam prioridade desse pedido ou em pedidos relacionados.

Tais reivindicações, quer sejam voltadas para uma invenção diferente ou para a mesma invenção, e se de um escopo mais amplo, mais restrito, igual ou diferente em comparação com as reivindicações originais, também são consideradas como incluídas dentro do assunto das invenções da presente descrição.

Claims (69)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos cada um de: a) um polipeptídeo de citocina [A]; b) uma fração de bloqueio de citocina [D]; e c) um ligante polipeptídico clivável por protease [L]; em que o polipeptídeo de citocina e a fração de bloqueio de citocina estão operacionalmente ligados pelo ligante polipeptídico clivável por protease e o polipeptídeo de fusão tem atividade de ativação do receptor de citocina atenuada, em que a atividade de ativação do receptor de citocina do polipeptídeo de fusão é pelo menos cerca 10X menor que a atividade de ativação do receptor de citocina do polipeptídeo que contém o polipeptídeo de citocina que é produzido por clivagem do ligante clivável por protease.

2. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de citocina é selecionado do grupo que consiste em IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, TGFβ, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNF, TGFbeta, CXCL10, CCL19, CCL20, CCL21 e fragmentos ativos destes.

3. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de citocina é um polipeptídeo de citocina de meia-vida curta.

4. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do ligante clivável por protease compreende, independentemente, uma sequência que é capaz de ser clivada por uma protease selecionada do grupo que consiste em uma calicreína, trombina, quimase, carboxipeptidase A, catepsina G, catepsina L, uma elastase, PR-3, granzima M, uma calpaína, uma metaloproteinase de matriz (MMP), um ADAM, um FAP, uma catepsina L, um ativador de plasminogênio, uma catepsina, uma caspase, uma triptase e um protease de superfície de células tumorais.

5. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo clivável por protease compreende, independentemente, dois ou mais sítios de clivagem para a mesma protease, ou dois ou mais sítios de clivagem que são clivados por diferentes proteases ou pelo menos um dos polipeptídeos cliváveis por protease compreende um sítio de clivagem para duas ou mais proteases diferentes.

6. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de citocina também é um elemento de prolongamento da meia-vida.

7. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de citocina bloqueia estericamente a atividade agonista da citocina.

8. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de citocina é albumina sérica humana, uma proteína de ligação ao antígeno ou um polipeptídeo de ligação ao antígeno que se liga à albumina sérica humana ou a um fragmento desta.

9. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a citocina está livre para se dissociar da fração de bloqueio de citocina após o ligante de polipeptídeo clivável por protease ser clivado por uma protease.

10. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de citocina inibe o polipeptídeo de citocina de ativar seu receptor cognato.

11. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão se liga ao receptor cognato do polipeptídeo de citocina antes da clivagem do ligante clivável por protease.

12. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um elemento de prolongamento da meia-vida.

13. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de citocina se associa não covalentemente ao polipeptídeo de citocina, independentemente da ligação peptídica do ligante.

14. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a associação não covalente é dependente do pH.

15. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o elemento de prolongamento da meia-vida inibe estericamente ou bloqueia a ativação e/ou ligação do polipeptídeo de citocina ao seu receptor cognato.

16. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o elemento de prolongamento da meia-vida é albumina sérica humana, uma IgG humana, uma IgG humanizada, um scFv, um Fab, um sdAb ou um fragmento destes.

17. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de citocina compreende um domínio de ligação ao ligante, um anticorpo de domínio único ou scFv que se liga ao polipeptídeo de citocina, ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo selecionado entre um anticorpo de domínio único e um scFv que se liga a um receptor do polipeptídeo de citocina.

18. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a atividade de ativação do receptor de citocina é determinada usando um ensaio de ativação do receptor in vitro padrão e quantidades iguais em uma base molar do polipeptídeo de citocina e da proteína de fusão.

19. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a citocina perde contato com a fração de bloqueio de citocina e/ou elemento de prolongamento da meia- vida após a sequência clivável por protease ser clivada por uma protease.

20. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreendendo pelo menos cada um entre [A], [D] e [L], em qualquer uma das seguintes orientações: a) [A]-[L]-[D]; b) [D]-[L]-[A]; c) [D]-[L]-[A]-[L]-[D]-[L]-[A]; d) [A]-[L]-[D]-[L]-[A]-[L]-[D]; e) [D]-[L]-[A]-[L]-[D]; f) [D]-[L]-[A]-[L]-[A]-[L]-[D]; g) [D]-[L]-[A]-[L]-[D]-[L]-[A]-[L]-[D]; e h) [D]-[L]-[A]-[A]-[L]-[D].

21. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende dois peptídeos de citocina.

22. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, que tem a Fórmula: [A]-[L1]-[D]-[L2]-[A]-[L2]-[D] caracterizado pelo fato de que A é um polipeptídeo de citocina; L1 e L2 são, independentemente, ligantes polipeptídicos cliváveis por protease; D é uma fração de bloqueio de citocina opcionalmente capaz de prolongar a meia-vida sérica; e em que L1 é um substrato para uma primeira protease e em que L2 é um substrato para uma segunda protease.

23. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, caracterizado pelo fato de que o elemento de prolongamento da meia-vida é um elemento de prolongamento da meia-vida, dois elementos de prolongamento da meia-vida ou três elementos de prolongamento da meia-vida.

24. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende um ligante clivável por protease, dois ligantes cliváveis por protease, três ligantes cliváveis por protease, quatro ligantes cliváveis por protease, cinco ligantes cliváveis por protease, seis ligantes cliváveis por protease ou sete ligantes cliváveis por protease.

25. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um peptídeo de ligação ao antígeno específico de tumor.

26. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de ligação ao antígeno específico do tumor está operacionalmente ligado ao polipeptídeo de citocina por um ligante não clivável.

27. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de ligação ao antígeno específico do tumor está operacionalmente ligado ao polipeptídeo de citocina por um ligante clivável.

28. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de citocina tem uma meia-vida sérica comparável à citocina de ocorrência natural correspondente.

29. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a meia-vida sérica do polipeptídeo que contém o polipeptídeo de citocina que é produzido por clivagem da proteína de fusão é comparável à citocina de ocorrência natural correspondente.

30. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de citocina é uma muteína que tem uma meia-vida sérica curta e é rapidamente depurada após a clivagem do polipeptídeo de fusão.

31. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos cada um de: a) um polipeptídeo de interferon [A]; b) uma fração de bloqueio de interferon [D]; e c) um ligante polipeptídico clivável por protease [L]; e em que o polipeptídeo de interferon e a fração de bloqueio de interferon estão operacionalmente ligados pelo ligante polipeptídico clivável por protease e o polipeptídeo de fusão tem atividade de ativação do receptor de interferon atenuada, em que a atividade de ativação do receptor de interferon do polipeptídeo de fusão é pelo menos cerca 10X menor que a atividade de ativação do receptor de interferon do polipeptídeo de interferon que é produzido por clivagem do ligante clivável por protease.

32. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 31, que tem a Fórmula: [D]-[L1]-[A]-[L2]-[D]; caracterizado pelo fato de que A é um polipeptídeo de interferon alfa (IFN); L1 e L2 são, independentemente, um ligante polipeptídico clivável por protease; D é uma fração de bloqueio de IFN que também prolonga a meia-vida in vivo; e em que o polipeptídeo de interferon alfa e a fração de bloqueio de interferon alfa estão operacionalmente ligados pelo ligante polipeptídico clivável por protease, o polipeptídeo de fusão tem atividade de ativação do receptor de interferon alfa atenuada, em que a atividade de ativação do receptor de interferon alfa do polipeptídeo de fusão é pelo menos cerca 10X menor do que a atividade de ativação do receptor de interferon do polipeptídeo de interferon alfa que é produzido pela clivagem do ligante clivável por protease, e em que quando ocorre a clivagem de ambos os ligantes, a meia-vida in vivo do polipeptídeo de interferon alfa é substancialmente semelhante à do interferon alfa de ocorrência natural.

33. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 31, que tem a Fórmula: [D]-[L1]-[A]-[L2]-[D]-[L3]-[A]-[L4]-[D]; caracterizado pelo fato de que A é um polipeptídeo de interferon gama (IFN); L1, L2, L3 e L4 são, independentemente, ligantes polipeptídicos cliváveis por protease; D é uma fração de bloqueio de IFN capaz de prolongar a meia-vida sérica; e em que o polipeptídeo de interferon gama e a fração de bloqueio de interferon gama estão operacionalmente ligados pelo ligante polipeptídico clivável por protease, o polipeptídeo de fusão tem atividade de ativação do receptor de interferon gama atenuada, em que a atividade de ativação do receptor de interferon gama do polipeptídeo de fusão é pelo menos cerca 10X menor do que a atividade de ativação do receptor de interferon do polipeptídeo de interferon gama que é produzido pela clivagem do ligante clivável por protease, e em que quando ocorre a clivagem de ambos os ligantes, a meia-vida in vivo do polipeptídeo de interferon gama é substancialmente semelhante à do interferon gama de ocorrência natural.

34. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 33, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do ligante clivável por protease compreende uma sequência que é capaz de ser clivada por uma protease selecionada do grupo que consiste em uma calicreína, trombina, quimase, carboxipeptidase A, catepsina G, catepsina L, uma elastase, PR-3, granzima M, uma calpaína, uma metaloproteinase de matriz (MMP), um ADAM, um FAP, uma catepsina L, um ativador de plasminogênio, uma catepsina, uma caspase, uma triptase e um protease de superfície de células tumorais.

35. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que cada polipeptídeo clivável por protease compreende, independentemente, dois ou mais sítios de clivagem para a mesma protease, ou dois ou mais sítios de clivagem que são clivados por diferentes proteases ou pelo menos um dos polipeptídeos cliváveis por protease compreende um sítio de clivagem para duas ou mais proteases diferentes.

36. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o interferon é interferon alfa ou interferon gama.

37. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 31, que tem a Fórmula: [A]-[L1]-[D]-[L2]-[A]-[L2]-[D] caracterizado pelo fato de que A é um polipeptídeo de interferon; L1 e L2 são, independentemente, ligantes polipeptídicos cliváveis por protease; D é uma fração de bloqueio de interferon capaz de prolongar a meia-vida sérica; e em que L1 é um substrato para uma primeira protease e em que L2 é um substrato para uma segunda protease.

38. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 37, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de interferon também é um elemento de prolongamento da meia-vida.

39. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 37, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de interferon bloqueia estericamente a atividade agonista da citocina.

40. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de interferon é albumina sérica humana, ou um polipeptídeo de ligação ao antígeno que se liga à albumina sérica humana.

41. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 40, caracterizado pelo fato de que o interferon está livre para se dissociar da fração de bloqueio de interferon após o ligante polipeptídico clivável por protease ser clivado por uma protease.

42. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 41, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de interferon inibe o polipeptídeo de interferon de ativar seu receptor cognato.

43. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 42, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão se liga ao receptor cognato para o polipeptídeo de interferon antes da clivagem do ligante clivável por protease.

44. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 43, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um elemento de prolongamento da meia-vida.

45. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de interferon se associa não covalentemente ao polipeptídeo de interferon.

46. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 44, caracterizado pelo fato de que a associação não covalente é dependente de pH.

47. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o elemento de prolongamento da meia-vida inibe estericamente ou bloqueia a ativação e/ou ligação do polipeptídeo de interferon ao seu receptor cognato.

48. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o elemento de prolongamento da meia-vida é albumina sérica humana, uma IgG humana ou um fragmento desta.

49. Polipeptídeo de fusão, de acordo com as reivindicações 44 a 48, caracterizado pelo fato de que o elemento de prolongamento da meia-vida não se liga ao polipeptídeo de interferon.

50. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de interferon compreende um domínio de ligação ao ligante ou fragmento de um receptor cognato para o interferon, um anticorpo de domínio único ou scFv que se liga ao polipeptídeo de interferon, ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, anticorpo de domínio único, scFv) que se liga a um receptor de interferon.

51. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 50, caracterizado pelo fato de que a atividade de ativação do receptor do interferon cognato é determinada usando um ensaio de ativação do receptor in vitro padrão e quantidades iguais em uma base molar do polipeptídeo de fusão e do polipeptídeo de interferon.

52. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 51, caracterizado pelo fato de que o interferon está livre para se dissociar da fração de bloqueio do interferon e/ou elemento de prolongamento da meia-vida após a sequência clivável por protease ser clivada por uma protease.

53. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 52, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende pelo menos cada um de [A], [B] e [L], em qualquer uma das seguintes orientações: a) [A]-[L]-[D]; b) [D]-[L]-[A]; c) [D]-[L]-[A]-[L]-[D]-[L]-[A]; d) [A]-[L]-[D]-[L]-[A]-[L]-[D]; e) [D]-[L]-[A]-[L]-[D]; f) [D]-[L]-[A]-[L]-[A]-[L]-[D]; g) [D]-[L]-[A]-[L]-[D]-[L]-[A]-[L]-[D]; e h) [D]-[L]-[A]-[A]-[L]-[D].

54. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 53, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende dois peptídeos de citocina.

55. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que os dois polipeptídeos de citocina são dois peptídeos de citocina diferentes.

56. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que pelo menos um elemento de prolongamento da meia-vida é um elemento de prolongamento da meia-vida ou dois elementos de prolongamento da meia-vida.

57. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 56, caracterizado pelo fato de que compreende um ligante polipeptídico clivável por protease é um ligante clivável por protease, dois ligantes cliváveis por protease, três ligantes cliváveis por protease, quatro ligantes cliváveis por protease, cinco ligantes cliváveis por protease, seis ligantes cliváveis por protease ou sete ligantes cliváveis por protease.

58. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 57, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um peptídeo de ligação ao antígeno específico do tumor.

59. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de ligação ao antígeno específico do tumor está operacionalmente ligado ao polipeptídeo de interferon por um ligante não clivável.

60. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de ligação ao antígeno específico do tumor está operacionalmente ligado ao polipeptídeo de interferon por um ligante clivável.

61. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60.

62. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 61.

63. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, de acordo com a reivindicação 62, ou ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 61.

64. Método de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 63, em condições adequadas para expressão e coleta dos polipeptídeos desejados.

65. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende i) um polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, e ii) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

66. Método de tratamento de um tumor, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um sujeito em necessidade, de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60.

67. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizado pelo fato de que é para uso como medicamento.

68. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um tumor em um sujeito em necessidade.

69. Composição farmacêutica para o tratamento de um tumor em um sujeito em necessidade, caracterizada pelo fato de que compreende como ingrediente ativo um polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60.

= polipeptídeo de citocina (ou fragmento funcional ou muteína)

= fração de bloqueio, funciona opcionalmente

Petição 870210002936, de 11/01/2021, pág. 245/325 como extensor de meia- vida

= ligante peptídico

= Sítio de clivagem de protease

Receptor de citocina

Célula de expressão de receptor Célula de expressão de receptor 1/79

1 .A citocina é conectada à fração de bloqueio através de via do ligante peptídico clivável por 2. Em um ambiente inflamatório ou de tumor, a protease, dessa forma bloqueando sua protease cliva no sítio de clivagem de protease no capacidade de se ligar ao seu receptor. ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina para ligar o receptor