TW202334186A - 三聚體的可活化之細胞介素構築體及相關之組成物及方法 - Google Patents

三聚體的可活化之細胞介素構築體及相關之組成物及方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202334186A
TW202334186A TW111138606A TW111138606A TW202334186A TW 202334186 A TW202334186 A TW 202334186A TW 111138606 A TW111138606 A TW 111138606A TW 111138606 A TW111138606 A TW 111138606A TW 202334186 A TW202334186 A TW 202334186A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
amino acids
acc
monomer
construct
combination
Prior art date
Application number
TW111138606A
Other languages
English (en)
Inventor
埃爾萬 勒斯科蘭
阿曼達 寇勒
瑪登 培德航加
迪倫 丹尼爾
Original Assignee
美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司 filed Critical 美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司
Publication of TW202334186A publication Critical patent/TW202334186A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

本文中提供可活化之細胞介素構築體，其包含：第一單體構築體，其包含第一細胞介素蛋白質(CP1)、第一可切割之部份(CM1)、及第一空間遮蔽部份(SMM1)，其中該CM1係位在該CP1與該SMM1之間；第二單體構築體，其包含第二細胞介素蛋白質(CP2)、第二可切割之部份(CM2)、及第二空間遮蔽部份(SMM2)，其中該CM2係位在該CP2與該SMM2之間；及第三單體構築體，其包含第三細胞介素蛋白質(CP3)、第三可切割之部份(CM3)、及第三空間遮蔽部份(SMM3)，其中該CM3係位在該CP3與該SMM3之間，其中：該CP1、該CP2、及該CP3彼此結合，從而形成該第一、該第二、及該第三單體構築體之三聚體；及該SMM1、該SMM2、及該SMM3係球狀分子。

Description

三聚體的可活化之細胞介素構築體及相關之組成物及方法
本揭露關於生物技術領域，且更具體而言，關於可活化之細胞介素構築體。 相關申請案之交互參照本申請案主張2021年10月13日申請之美國臨時專利申請案第63/255,340號之權益。上述申請案之全部內容特此以引用方式全部併入本文中。 參考電子序列表電子序列表之內容(CYTX088.xml；大小：741,530位元；及創建日期：2022年10月3日)係以全文引用方式併入本文中。
細胞介素係由大多數有核細胞在回應於病毒感染及/或其他抗原性刺激物時所產生及分泌之天然存在的小蛋白質及醣蛋白質家族。LIGHT(淋巴毒素樣誘導性蛋白質(lymphotoxin-like inducible protein)，其與用於T細胞上疱疹病毒入侵之醣蛋白D競爭)係腫瘤壞死因子(TNF)配體超家族中之一種細胞介素，其表現於活化之T細胞、單核細胞、顆粒細胞及免疫樹狀細胞上。LIGHT亦稱為腫瘤壞死因子超家族成員14 (tumor necrosis factor superfamily member 14, TNFSF14)。LIGHT係同三聚體(homotrimer)且與二種已知細胞受體：疱疹病毒入侵介體(herpesvirus entry mediator, HVEM)及淋巴毒素β受體(lymphotoxin-beta receptor, LTbetaR)結合為三聚體。通過HVEM路徑及LT-β-受體(LT-beta-Receptor)之活化，LIGHT可活化T細胞並刺激趨化介素之產生，最終募集T細胞。其已顯示觸發各種腫瘤細胞之凋亡。(Rooney, IA, et. Al., J. Biol. Chem. 275(19):14307-15 (2000))。若在腫瘤微環境中表現，則LIGHT可在腫瘤微環境中募集並活化T細胞。因此，LIGHT已被認為係用於癌症之治療劑。然而，在周邊系統中，持續性LIGHT活化可能導致淋巴球活化、發炎、及組織破壞。顯著的副作用及脫靶毒性已使LIGHT作為治療劑之發展受到阻礙。 對於改進細胞介素療法對所欲目標之特異性及選擇性的需求及期望有著極大興趣。增加細胞介素治療劑對疾病部位之靶向性可降低基於全身性機制之毒性並導致更廣泛的治療效用。
本揭露提供三聚體的可活化之細胞介素構築體及其使用以及製造之方法。在一個態樣中，本揭露提供可活化之細胞介素構築體(activatable cytokine construct, ACC)，其包含：第一單體構築體，其包含第一細胞介素蛋白質(first cytokine protein, CP1)、第一可切割之部份(first cleavable moiety, CM1)、及第一空間遮蔽部份(first steric masking moiety, SMM1)，其中CM1係位在CP1與SMM1之間；第二單體構築體，其包含第二細胞介素蛋白質(CP2)、第二可切割之部份(CM2)、及第二空間遮蔽部份(SMM2)，其中CM2係位在CP2與SMM2之間；及第三單體構築體，其包含第三細胞介素蛋白質(CP3)、第三可切割之部份(CM3)、及第三空間遮蔽部份(SMM3)，其中CM3係位在CP3與SMM3之間，其中：CP1、CP2、及CP3彼此結合，從而形成第一、第二、及第三單體構築體之三聚體；及SMM1、SMM2、及SMM3係球狀分子。 在一些具體實施例中，CP1、CP2、及CP3係相同細胞介素。在一些具體實施例中，細胞介素係腫瘤壞死因子或腫瘤壞死因子超家族之成員。在一些具體實施例中，CP1、CP2及CP3係腫瘤壞死因子超家族成員14(TNFSF14亦稱為LIGHT)。在一些具體實施例中，CP1、CP2、及CP3之各者包含與SEQ ID NO: 54至少80%、90%、95%、或99%一致的序列。 在一些具體實施例中，SMM1、SMM2、及SMM3係相同的球狀分子。在一些具體實施例中，球狀分子係白蛋白。在一些具體實施例中，白蛋白係人類血清白蛋白。在一些具體實施例中，白蛋白包含與人類血清白蛋白至少80%、90%、95%、或99%一致的序列。 在一些具體實施例中，第一單體構築體包含至少一個連接子。在一些具體實施例中，該至少一個連接子包含設置在CP1與CM1之間的連接子L1、及/或在CM1與SMM1之間的連接子L2。在一些具體實施例中，第二單體構築體包含至少一個連接子。在一些具體實施例中，該至少一個連接子包含設置在CP2與CM2之間的連接子L3、及/或在CM2與SMM2之間的連接子L4。在一些具體實施例中，第三單體構築體包含至少一個連接子。在一些具體實施例中，該至少一個連接子包含設置在CP3與CM3之間的連接子L5、及/或在CM3與SMM3之間的連接子L6。 在一些具體實施例中，第一單體構築體進一步包含第一親和力遮蔽部份(AMM1)及視需要地位在AMM1與CP1之間的第四可切割之部份(CM4)，第二單體構築體進一步包含第二親和力遮蔽部份(AMM2)及視需要地位在AMM2與CP2之間的第五可切割之部份(CM5)，及第三單體構築體進一步包含第三親和力遮蔽部份(AMM3)及視需要地位在AMM3與CP3之間的第六可切割之部份(CM6)。在一些具體實施例中，AMM1、AMM2、及AMM3係相同的。在一些具體實施例中，AMM1、AMM2、及AMM3之各者包含SEQ ID NO: 61之序列。在一些具體實施例中，AMM1、AMM2、及AMM3之各者包含與SEQ ID NO: 61至少80%、90%、95%、或99%一致的序列。在一些具體實施例中，CM1、CM2、及CM3包含相同蛋白酶之受質。在一些具體實施例中，CM1、CM2、及CM3包含不同蛋白酶之受質。在一些具體實施例中，CM1、CM2、及CM3之各者包含與SEQ ID NO: 62或63至少95%一致的序列。在一些具體實施例中，CM4、CM5、及CM6包含相同蛋白酶之受質。在一些具體實施例中，CM4、CM5、及CM6包含不同蛋白酶之受質。在一些具體實施例中，CM4、CM5、及CM6之各者包含與SEQ ID NO: 62或63至少95%一致的序列。 在一些具體實施例中，(多種)蛋白酶係由個體之腫瘤所產生。在一些具體實施例中，(多種)蛋白酶係選自由下列所組成之群組：ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、BACE、腎活素(Renin)、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、凋亡蛋白酶1、凋亡蛋白酶2、凋亡蛋白酶3、凋亡蛋白酶4、凋亡蛋白酶5、凋亡蛋白酶6、凋亡蛋白酶7、凋亡蛋白酶8、凋亡蛋白酶9、凋亡蛋白酶10、凋亡蛋白酶14、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2、組織蛋白酶X/Z/P、克魯茲蛋白酶(Cruzipain)、天冬胺酸內肽酶(Legumain)、泛素特異性蛋白酶-2 (Otubain-2)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、安眠蛋白酶(Meprin)、腦啡肽酶(Neprilysin)、PSMA、BMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26、MMP-27、活化蛋白質C (activated protein C)、組織蛋白酶A、組織蛋白酶G、凝乳酶(Chymase)、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、彈性蛋白酶(Elastase)、顆粒酶B (Granzyme B)、胍基苯甲酸蛋白酶(Guanidinobenzoatase)、HtrA1、人類嗜中性球裂解酶、乳鐵蛋白、通道活化蛋白酶(marapsin)、NS3/4A、PACE4、纖維蛋白溶酶(Plasmin)、PSA、tPA、凝血酶(thrombin)、類胰蛋白酶(tryptase)、uPA、DESC1、DPP-4、FAP、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(Hepsin)、間質蛋白酶-2 (Matriptase-2)、MT-SP1/間質蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3、及TMPRSS4。 在一些具體實施例中，第一單體構築體進一步包含在AMM1與CM4之間的連接子L7及/或在CM4與CP1之間的連接子L8。在一些具體實施例中，第二單體構築體進一步包含在AMM2與CM5之間的連接子L9及/或在CM5與CP2之間的連接子L10。在一些具體實施例中，第三單體構築體進一步包含在AMM3與CM6之間的連接子L11及/或在CM6與CP3之間的連接子L12。在一些具體實施例中，連接子L1至L12之各者具有2至30個胺基酸之總長。在一些具體實施例中，連接子L1至L12之各者獨立地包含SEQ ID NO: 64至69、75至77、GGS、SGG、GSG、GS、或G中任一者之序列。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含CP1、CM1、及SMM1，第二單體構築體包含CP2、CM2、及SMM2，及第三單體構築體包含CP3、CM3、及SMM3。在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含SMM1、CM1、及CP1，第二單體構築體包含SMM2、CM2、及CP2，及第三單體構築體包含SMM3、CM3、及CP3。在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含AMM1、CM4、CP1、CM1、及SMM1，第二單體構築體包含AMM2、CM5、CP2、CM2、及SMM2，及第三單體構築體包含AMM3、CM6、CP3、CM3、及SMM3。在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含SMM1、AMM1、CM1、及CP1；第二單體構築體包含SMM2、AMM2、CM2、及CP2，及第三單體構築體包含SMM3、AMM3、CM3、及CP3。在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含AMM1、SMM1、CM1、及CP1；第二單體構築體包含AMM2、SMM2、CM2、及CP2，及第三單體構築體包含AMM3、SMM3、CM3、及CP3。在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含SMM1、CM1、CP1、CM4、及AMM1，第二單體構築體包含SMM2、CM2、CP2、CM5、及AMM2，及第三單體構築體包含SMM3、CM3、CP3、CM6、及AMM3。在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含CP1、CM1、AMM1、及SMM1；第二單體構築體包含CP2、CM2、AMM2、及SMM2；及第三單體構築體包含CP3、CM3、AMM3、及SMM3。在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含CP1、CM1、SMM1、及AMM1；第二單體構築體包含CP2、CM2、SMM2、及AMM2；及第三單體構築體包含CP3、CM3、SMM3、及AMM3。 在一些具體實施例中，在非活性狀態下，相較於CP1、CP2、CP3、或其三聚體中之至少一者的活性對照水平，ACC特徵在於具有降低之CP1、CP2、CP3、或其三聚體中之至少一者的活性水平。在一些具體實施例中，相較於不包含空間遮蔽部份或親和力阻遮蔽部份的CP1、CP2、及CP3之對照三聚體的活性，ACC特徵在於CP1、CP2、及CP3之三聚體的活性降低至少2倍、5倍、10倍、500倍、10 3倍、10 4倍、10 5倍、或10 6倍。在一些具體實施例中，活性係疱疹病毒入侵介體(HVEM)之活化。在一些具體實施例中，活性係淋巴毒素β受體之活化。在一些具體實施例中，活性係疱疹病毒入侵介體(HVEM)之活化及淋巴毒素β受體之活化。在一些具體實施例中，CP1、CP2、及CP3之對照三聚體由ACC之活化產生。 在一些具體實施例中，第一單體構築體、第二單體構築體、及第三單體構築體係一致的。在一些具體實施例中，ACC不包含任何促進形成除CP1、CP2、及CP3之外的三聚體的結構域。在一些具體實施例中，ACC不包含除CP1、CP2、及CP3之外的任何共價連接第一、第二、及第三單體構築體的結構域。在一些具體實施例中，ACC不包含卷曲螺旋結構域(coil-coiled domain)、Fc結構域、或除CP1、CP2、或CP3之外的能夠形成雙硫鍵的結構域。在一些具體實施例中，ACC不包含腫瘤導向分子(例如，ACC不包含辨識在癌細胞上發現之抗原的Fab或scFv)。在一些具體實施例中，CP1、CP2、及CP3係一致的且各包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列。在一些具體實施例中，第一單體構築體、第二單體構築體、及第三單體構築體係一致的且各單體包含：SEQ ID NO: 54之胺基酸序列；及AMM，其包含與SEQ ID NO: 61之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列；及SMM，其包含白蛋白。 在另一態樣中，本揭露提供可活化之細胞介素構築體(ACC)，其包含：第一單體構築體，其包含第一細胞介素蛋白質(CP1)、第一可切割之部份(CM1)、及第一親和力遮蔽部份(AMM1)，其中CM1係位在CP1與AMM1之間；第二單體構築體，其包含第二細胞介素蛋白質(CP2)、第二可切割之部份(CM2)、及第二親和力遮蔽部份(AMM2)，其中CM2係位在CP2與AMM2之間；及第三單體構築體，其包含第三細胞介素蛋白質(CP3)、第三可切割之部份(CM3)、及第三親和力遮蔽部份(AMM3)，其中CM3係位在CP3與AMM3之間，其中CP1、CP2、及CP3彼此結合，從而形成第一、第二、及第三單體構築體之三聚體。 在另一態樣中，本揭露提供組成物，其包含本文中之ACC。在一些具體實施例中，組成物係醫藥組成物。 在另一態樣中，本揭露提供容器、小瓶、注射器、注射筆、或套組，其包含至少一個劑量的本文中之組成物。 在另一態樣中，本揭露提供核酸，其編碼包含本文中之ACC之第一單體構築體、第二單體構築體、或第三單體構築體中之至少一者的多肽。在一個具體實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 9、11、13、25、31、41、43、45、或47中任一者之序列。 在另一態樣中，本揭露提供核酸組，其共同編碼包含本文中之ACC中之第一單體構築體、第二單體構築體、或第三單體構築體的多肽。 在另一態樣中，本揭露提供載體，其包含本文中之核酸或核酸組。 在另一態樣中，本揭露提供細胞，其表現本文中之核酸或載體。在一些態樣中，細胞係哺乳動物細胞。 在另一態樣中，本揭露提供治療有其需要之個體之方法，其包含向個體投予治療有效量的本文中之ACC或組成物。在一些具體實施例中，個體已經被確認或診斷為患有癌症。在一些具體實施例中，方法進一步包含投予免疫檢查點抑制劑。在一些具體實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。 在另一態樣中，本揭露提供產生ACC之方法，其包含：在足以產生ACC之條件下在液體培養基中培養如請求項61之細胞；及從該細胞或該液體培養基中回收ACC。在一些具體實施例中，方法進一步包含使用親和力層析法純化回收之ACC。在一些具體實施例中，方法進一步包含將回收之ACC調配成醫藥組成物。
本文中提供三聚體的可活化之細胞介素構築體(ACC)，其包括三個單體構築體之三聚體。單體構築體之各者包括細胞介素，該等細胞介素可彼此結合並形成三聚體(例如，同三聚體或異三聚體)。活化後，活性細胞介素產物仍呈三聚體的形式。 單體構築體之各者可進一步包含經由一或多個可切割之部份與細胞介素偶合之一或多個遮蔽部份。在一些具體實施例中，遮蔽部份可係空間遮蔽部份，其不結合至細胞介素，但在非活性狀態下，經由立體阻礙來降低、抑制、或干擾細胞介素與其結合配偶體(例如，配體或受體)之間的結合。在一些具體實施例中，遮蔽部份可係親和力遮蔽部份，其特異性結合至細胞介素並在非活性狀態下降低、抑制、或干擾細胞介素與其結合配偶體之間的結合。在一些具體實施例中，三聚體的ACC之各單體構築體包含空間遮蔽部份。在一些實施例中，各單體構築體可係雙遮蔽的且包括空間遮蔽部份及親和力遮蔽部份。在此類單體構築體中，空間遮蔽部份及親和力遮蔽部份可偶合至細胞介素之不同側，其中各遮蔽部份以其擁有的可切割之部份偶合至細胞介素。替代地，在單體構築體中空間遮蔽部份及親和力遮蔽部份可在細胞介素之相同側上。在此類情況下，該等遮蔽部份可經由一個可切割之部份(例如，位在細胞介素與較靠近細胞介素之遮蔽部份之間)與細胞介素偶合。 在活性狀態下(例如，當ACC暴露於切割該可切割之部份的蛋白酶時)，一或多個遮蔽部份可從細胞介素釋放，產出具有實質上恢復活性之細胞介素產物。在活性狀態下，細胞介素可為呈三聚體之形式。ACC可經設計成在暴露於患病組織後選擇性地活化，但在正常組織中則無。舉例而言，ACC可經設計具有一或多個被蛋白酶切割的可切割之部份(CM)。相對於健康組織，切割一或多個CM的(多種)蛋白酶可能在患病組織(例如，腫瘤組織)中過度表現。ACC可在(多個)CM之切割後活化，使得細胞介素可在患病組織中(例如，在腫瘤微環境中)發揮其活性，而該細胞介素活性在健康組織之背景下係減弱的。因此，相對於傳統細胞介素治療劑，本文中所提供之ACC可提供降低之毒性，使細胞介素之有效劑量更高、及/或增加細胞介素之治療範圍(therapeutic window)。因此，此等化合物有可能對基於細胞介素之療法賦予益處，且與某些基於細胞介素之療法相關聯之毒性可能較少。 本文中亦提供相關之中間物、組成物、套組、核酸、載體、及重組細胞、以及相關方法，其包括本文中所述之任何可活化之細胞介素構築體之使用方法及產生方法。本文中提供由本文中所述之方法中任一者所產生之ACC。本文中亦提供組成物，其包含本文中所述之ACC中任一者。本文中亦提供本文中所述之組成物中任一者之組成物，其中該組成物係醫藥組成物。本文中亦提供套組，其包含本文中所述之組成物中任一者之至少一個劑量。 [ 定義 ]除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與此發明所屬之技術領域中具有通常知識者所共同理解之相同含義。本文中描述用於本發明之方法及材料；亦可使用所屬技術領域中已知之其他合適的方法及材料。該等材料、方法、及實施例僅係說明性質，並不意欲為限制。本文中所提及之所有出版物、專利申請案、專利、序列、資料庫條目、及其他參考文獻均以全文引用方式併入本文中。倘若有衝突，將以本說明書(包括定義)為準。 從下列詳細描述及圖式中及從申請專利範圍中，本發明之其他特徵及優點將顯而易見。 術語「一(a/an)」係指該冠詞之語法對象之一或多個(即，至少一個)。舉例來說，「一細胞(a cell)」涵蓋一或多個細胞。 如本文中所使用，術語「約(about)」及「大約(approximately)」當用於修飾以數值或範圍指定之量時，表示該數值以及與所屬技術領域中具有通常知識者已知之該值的合理偏差。舉例而言，±20%、±10%、或±5%當適用時係在所敘述之值的預期含義內。 濃度、量、及其他數字數據可以範圍形式在本文中表述或呈現。應當理解，此種範圍形式僅為了方便及簡明而使用，因此應當被靈活地解釋為不僅包括明確敘述為範圍之限值的數值，而且亦包括在該範圍內涵蓋之所有個別的數值及子範圍，如同各數值及子範圍均被明確敘述。作為一例證，「約0.01至2.0」之數值應當被解釋為不僅包括明確敘述之約0.01至約2.0的值，而且亦包括在指定範圍內之個別的值及子範圍。因此，被包括在此數值範圍內者係個別的值(諸如0.5、0.7、及1.5)及子範圍(諸如0.5至1.7、0.7至1.5、及1.0至1.5等)。此外，無論範圍之寬度或所述之特徵，此種解釋應當適用。此外，應注意的是，所有的百分比係以重量計，除非另有說明。 在理解本揭露之範疇時，如本文中所使用之術語「包括(including)」或「包含(comprising)」及其衍生詞係意欲為開放式術語，該等術語詳細說明陳述之特徵、元件、組分、群組、整數、及/或步驟之存在，但不排除其他未陳述之特徵、元件、組分、群組、整數、及/或步驟之存在。前述亦適用於具有類似意義之詞語諸如術語「包括(including)」、「具有(having)」及其衍生詞。如本文中所使用之術語「由...所組成(consisting)」或其衍生詞係意欲為封閉式術語，該等術語詳細說明陳述之特徵、元件、組分、群組、整數、及/或步驟之存在，但排除其他未陳述之特徵、元件、組分、群組、整數、及/或步驟之存在。如本文中所使用之術語「基本上由....所組成(consisting essentially of)」係意欲為詳細說明陳述之特徵、元件、組分、群組、整數、及/或步驟之存在，以及不會實質性影響特徵、元件、組分、群組、整數、及/或步驟之基本及(多種)新穎特性的彼等存在。應理解，提及此等過渡術語中之任一者(即「包含」、「由...所組成」或「基本上由....所組成」)為置換成未特定使用之任何其他過渡術語提供直接支持。舉例而言，對於整個本揭露中所揭示之任何元件，將術語從「包含」修改為「基本上由....所組成」或「由...所組成」將由於此定義而得到直接支持。基於此定義，本文中所揭示或以引用之方式併入之任何元件可包括在所請求之發明中或從中排除。 如本文中所使用，為方便起見，可在共同列表中呈現複數個化合物、元件、或步驟。然而，此等列表應當被解讀為如同該列表中之各成員皆被個別識別為單獨且獨有的成員。因此，在沒有相反之指示下，此種列表中之個別成員不應僅基於其在共同群組中之呈現而被解讀為係相同列表之任何其他成員的現實上的等同物。 此外，可在一個特定具體實施例或態樣之上下文中或在本揭露之單獨段落或章節中討論某些分子、構築體、組成物、元件、部份、賦形劑、病症、病況、性質、步驟等。應理解，此僅為了方便及簡明，且任何此種揭露同樣地適用並意欲與在本揭露及申請專利範圍中任何地方發現之任何其他具體實施例或態樣組合，該等具體實施例或態樣都在申請日時形成本申請案及所請求之發明。舉例而言，關於構築體、組成物、或方法所描述之構築體、分子、方法、步驟、套組、或組成物之列表意欲並確實找出對關於本揭露之任何其他部分中所述之構築體、組成物、配方、及方法之具體實施例的直接支持，即使彼等方法步驟、活性劑、套組、或組成物未在該具體實施例或態樣之上下文或部分中重新列出。 除非另有指明，否則「編碼蛋白質之核酸序列」包括彼此之簡併版本及因此編碼該相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。 當在多肽一級胺基酸序列中提及第一結構域或序列相對於第二結構域或序列的位置時，術語「位於N端(N-terminally positioned)」意指第一結構域或序列係位在比第二結構域或序列更靠近多肽一級胺基酸序列之N端。在一些具體實施例中，在第一結構域或序列與第二結構域或序列之間可能存在額外序列及/或結構域。 當在多肽一級胺基酸序列中提及第一結構域或序列相對於第二結構域或序列的位置時，術語「位於C端(C-terminally positioned)」意指第一結構域或序列係位在比第二結構域或序列更靠近多肽一級胺基酸序列之C端。在一些具體實施例中，在第一結構域或序列與第二結構域或序列之間可能存在額外序列及/或結構域。 術語「外源性(exogenous)」係指從細胞、組織、或生物體之外部引入或起源的任何材料，亦即不是由被引入之相同細胞、組織、或生物體所產生或不是從被引入之相同細胞、組織、或生物體起源。 術語「轉導(transduced)」、「轉染(transfected)」、或「轉形(transformed)」係指將外源性核酸引入或轉移到細胞中之過程。「轉導」、「轉染」、或「轉形」細胞(例如，哺乳動物細胞)係已經用外源性核酸(例如，載體)轉導、轉染、或轉形的細胞，其包括編碼本文中所述之任何可活化之細胞介素構築體之外源性核酸。 術語「核酸(nucleic acid)」係指呈單股或雙股形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、或其組合。除非特別限制，否則該術語涵蓋含有具有與參考核苷酸類似結合性質的已知天然核苷酸之類似物的核酸。除非另有指示，否則特定的核酸序列亦隱含互補序列以及明確指示之序列。在本文中所述之任何核酸的一些具體實施例中，核酸係DNA。在本文中所述之任何核酸的一些具體實施例中，核酸係RNA。 可藉由所屬技術領域中已知之標準技術將修飾引入核苷酸序列中，諸如定點誘變及聚合酶連鎖反應(PCR)媒介之誘變。保守胺基酸取代係其中將胺基酸殘基用具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。具有類似側鏈之胺基酸殘基的家族已在所屬技術領域中有所定義。此等家族包括：具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸及麩胺酸)、具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、及組胺酸)、非極性胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、***酸、甲硫胺酸、及色胺酸)、未帶電極性胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸)、親水性胺基酸(例如，精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸、及蘇胺酸)、疏水性胺基酸(例如，丙胺酸、半胱胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、***酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸、及纈胺酸)。胺基酸之其他家族包括：脂肪族羥基胺基酸(例如，絲胺酸及蘇胺酸)、醯胺家族(例如，天冬醯胺酸及麩醯胺酸)、脂肪族家族(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸)、芳香族家族(例如，***酸、色胺酸、及酪胺酸)。 如本文中所使用，片語「特異性結合(specifically bind)」或「與...免疫反應(immunoreacts with)」意指蛋白質或蛋白質複合物與一或多個結合配偶體反應且不會與其他多肽反應，或與該(等)結合配偶體以低得多的親和力(例如，約或大於10 -6M)結合。 術語「治療(treatment)」係指改善病症之至少一種症狀。在一些具體實施例中，正在治療之病症係癌症且欲改善癌症之至少一種症狀。 可活化之細胞介素構築體在一個態樣中，本揭露提供包括三個單體構築體的可活化之細胞介素構築體(ACC)，該等三個單體構築體通過其等細胞介素組分形成三聚體。單體構築體之各者可包含細胞介素蛋白質(CP)、一或多個遮蔽部份(MM)、及位在MM與CP之間的一或多個可切割之部份(CM)。在一些具體實施例中，MM可係空間遮蔽部份(SMM)。在一些具體實施例中，MM可係親和力遮蔽部份(AMM)。在一些具體實施例中，MM可包括SMM及AMM兩者。在一些具體實施例中，ACC在形成三聚體的單體單元之間不包括任何共價鍵。在一些具體實施例中，ACC除細胞介素本身之外不包括促進三聚體之形成的任何結構域。在一些具體實施例中，ACC除細胞介素本身之外不包括加強三聚體之形成的任何結構域。舉例而言，在一些具體實施例中，ACC可不包含除CP1、CP2、及CP3之外的任何共價連接第一、第二、及第三單體構築體的結構域。在一些實施例中，ACC不包含卷曲螺旋結構域、Fc結構域、或除CP1、CP2、或CP3之外能夠橫跨不同單體形成雙硫鍵的結構域。 在活化後，CM可經切割且MM可從ACC釋放，導致活性細胞介素產物。該活性細胞介素產物可仍呈三聚體的形式(例如，其包含由三個CP所形成之三聚體)。 在特定具體實施例中，本文中提供可活化之細胞介素構築體(ACC)，其包括第一單體構築體、第二單體構築體、及第三單體構築體，其中： 第一單體構築體包含第一細胞介素蛋白質(CP1)、第一可切割之部份(CM1)、及第一空間遮蔽部份(SMM1)，其中CM1係位在CP1與SMM1之間； 第二單體構築體包含第二細胞介素蛋白質(CP2)、第二可切割之部份(CM2)、及第二空間遮蔽部份(SMM2)，其中CM2係位在CP2與SMM2之間；及 第三單體構築體包含第三細胞介素蛋白質(CP3)、第三可切割之部份(CM3)、及第三空間遮蔽部份(SMM3)，其中CM3係位在CP3與SMM3之間。 CP1、CP2、及CP3可彼此結合(例如，藉由共價或非共價結合)，從而形成第一、第二、及第三單體構築體之三聚體。在一些具體實施例中，SMM1、SMM2、及SMM3之各者係球狀分子。在一個實施例中，SMM1、SMM2、及SMM3係相同的球狀分子(例如，人類血清白蛋白)。在一些實施例中，CP1、CP2、及CP3係腫瘤壞死因子超家族成員14(TNFSF14亦稱為LIGHT)。 ACC可包含在本文中所述之兩個組分之間的連接子。在一些實施例中，第一單體構築體包含至少一個連接子，例如，設置在CP1與CM1之間的連接子L1、及/或在CM1與SMM1之間的連接子L2。在一些實施例中，第二單體構築體包含至少一個連接子，例如，設置在CP2與CM2之間的連接子L3、及/或在CM2與SMM2之間的連接子L4。在一些實施例中，第三單體構築體包含至少一個連接子，例如，設置在CP3與CM3之間的連接子L5、及/或在CM3與SMM3之間的連接子L6。 在一些具體實施例中，第一單體構築體可進一步包含第一親和力遮蔽部份(AMM1)及位在AMM1與CP1之間的第四可切割之部份(CM4)，第二單體構築體可進一步包含第二親和力遮蔽部份(AMM2)及位在AMM2與CP2之間的第五可切割之部份(CM5)，及第三單體構築體可進一步包含第三親和力遮蔽部份(AMM3)及位在AMM3與CP3之間的第六可切割之部份(CM6)。 在一些實施例中，第一單體構築體可進一步包含在AMM1與CM4之間的連接子L7及/或在CM4與CP1之間的連接子L8。在一些實施例中，第二單體構築體進一步包含在AMM2與CM5之間的連接子L9及/或在CM5與CP2之間的連接子L10。在一些實施例中，第三單體構築體可進一步包含在AMM3與CM6之間的連接子L11及/或在CM6與CP3之間的連接子L12。 在另一特定具體實施例中，本文中提供可活化之細胞介素構築體(ACC)，其包括第一單體構築體、第二單體構築體、及第三單體構築體，其中： 第一單體構築體，其包含第一細胞介素蛋白質(CP1)、第一可切割之部份(CM1)、及第一親和力遮蔽部份(AMM1)，其中CM1係位在CP1與AMM1之間； 第二單體構築體，其包含第二細胞介素蛋白質(CP2)、第二可切割之部份(CM2)、及第二親和力遮蔽部份(AMM2)，其中CM2係位在CP2與AMM2之間；及 第三單體構築體，其包含第三細胞介素蛋白質(CP3)、第三可切割之部份(CM3)、及第三親和力空間遮蔽部份(AMM3)，其中CM3係位在CP3與AMM3之間。 CP1、CP2、及CP3彼此結合，從而形成第一、第二、及第三單體構築體之三聚體。 ACC可進一步包含一或多個間隔物，該等間隔物係併入在成熟ACC之游離端處(例如在訊息肽與成熟ACC之N端之間)的胺基酸殘基或肽。在一些態樣中，間隔物(或「頭部(header)」)可含有麩醯胺酸(Q)殘基。在一些態樣中，間隔物中之殘基將胺肽酶(aminopeptidase)及/或外肽酶(exopeptidase)作用最小化，以阻止N端胺基酸之切割。說明性及非限制性間隔物胺基酸序列可包含任何下列例示性胺基酸序列或由其所組成：QGQSGS (SEQ ID NO: 76)；GQSGS (SEQ ID NO: 1)；QSGS (SEQ ID NO: 70)；SGS；GS；S；QGQSGQG (SEQ ID NO: 71)；GQSGQG (SEQ ID NO: 72)；QSGQG (SEQ ID NO: 73)；SGQG (SEQ ID NO: 74)；GQG；QG；G；QGQSGQ (SEQ ID NO: 80)；GQSGQ (SEQ ID NO: 136)；QSGQ (SEQ ID NO: 137)；QGQSG (SEQ ID NO: 138)；QGQS (SEQ ID NO: 139)；SGQ；GQ；及Q。在一些具體實施例中，可省略間隔物序列。 術語「可活化之(activatable)」當用於提及細胞介素構築體時，係指展現一或多種活性之第一水平的細胞介素構築體當在暴露於引起至少一個可切割部分之切割的條件中後導致生成的細胞介素構築體展現該一或多種活性之第二水平，其中該第二活性水平大於該第一活性水平。活性之非限制實施例包括本文中所述或所屬技術領域中已知之任何細胞介素(例如，TNF或TNF超家族成員)之例示性活性。 術語「遮蔽部份(masking moiety)」及「MM」在本文中可互換使用，係指降低或抑制細胞介素蛋白質之一或多種活性的胺基酸序列。在一些具體實施例中，MM可係空間遮蔽部份(SMM)，其不會特異性結合至CP，而是通過立體阻礙(steric hindrance)干擾CP與其結合配偶體的結合。舉例而言，SMM可定位在未切割之ACC中，使得ACC之三級或四級結構允許該SMM定位通過在SMM與CP之間及/或基於電荷之交互作用遮蔽CP，從而使SMM保留在原位用以干擾結合配偶體接近該CP。在一些具體實施例中，MM可係親和力遮蔽部份(AMM)，其與CP交互作用，因此降低、抑制、或干擾CP與其結合配偶體之間的交互作用。在一些具體實施例中，AMM可係肽遮蔽物(「PM」)。 在本文中可互換使用之術語「肽遮蔽物(peptide mask)」及「PM」係指降低或抑制細胞介素蛋白質之一或多種活性的少於50個胺基酸的胺基酸序列。PM可結合至細胞介素並限制細胞介素與其受體之交互作用。在一些具體實施例中，PM係不超過40個胺基酸長。在較佳具體實施例中，PM係不超過20個胺基酸長。在一些具體實施例中，PM係不超過19、18、17、16、或15個胺基酸長。 如本文中所使用，術語「遮蔽效率(masking efficiency)」係指未切割之ACC之活性(例如，EC50)除以對照細胞介素之活性，其中對照細胞介素可係該ACC之切割產物或用作該ACC之CP的細胞介素。具有使CP活性中之至少一者的水平降低之ACC具有大於10的遮蔽效率。在一些具體實施例中，本文中所述之ACC具有大於10、大於100、大於1000、或大於5000的遮蔽效率。用於測定遮蔽效率之說明性檢定包括於實施例1中所述者。 在本文中可互換使用之術語「可切割之部份(cleavable moiety)」及「CM」係指其胺基酸序列包含序列特異性蛋白酶之受質的肽。適用於本文中之ACC的可切割之部份包括所屬技術領域已知之任何蛋白酶受質。例示性可切割之部份在下文中更詳細地描述。 如本文中所使用，諸如細胞介素或空間遮蔽部份(例如，白蛋白諸如人類血清白蛋白)之多肽可係野生型多肽(例如，天然存在的多肽)或該野生型多肽之變體。變體可係由野生型多肽之一或多個胺基酸的取代、***、刪除及/或添加所修飾之多肽，前提是該變體保留該野生型多肽之基本功能或活性。在一些實施例中，與野生型多肽相比，變體可具有改變(增加或減少)之功能或活性。在一些態樣中，變體可係野生型多肽之功能片段。術語「功能片段(functional fragment)」意指多肽(例如，細胞介素)之序列可包括比全長多肽序列更少的胺基酸但有足夠的多肽鏈長度來賦予活性(例如，細胞介素活性)。 如本文中所使用，術語「連接子(linker)」係其胺基酸序列不是蛋白酶之受質的肽。連接子可包含連接ACC中之二個組分的一段胺基酸序列。例示性連接子在下文中更詳細地描述。 第一、第二、及第三單體構築體中之各者中的組分組織可以相同順序配置於各單體構築體中。在一些具體實施例中，第一、第二、及第三單體構築體中之各者中的組分組織可以不同順序配置於各單體構築體中。在一些實施例中，在各單體構築體中之對應組分(例如，CP1、CP2、及CP3；或SMM1、SMM2、及SMM3；CM1、CM2、及CM3；AMM1、AMM2、及AMM3；及CM4、CM5、CM6)就例如分子量、大小、胺基酸序列等方面而言可為相同。在一些實施例中，在各單體構築體中之對應組分(例如，CP1、CP2、及CP3；或SMM1、SMM2、及SMM3；CM1、CM2、及CM3；AMM1、AMM2、及AMM3；及CM4、CM5、CM6)就例如分子量、大小、胺基酸序列等方面而言可為不同。因此，三聚體的ACC可能具有對稱或不對稱的單體構築體組分。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向，第一單體構築體包含CP1、CM1、及SMM1，第二單體構築體包含CP2、CM2、及SMM2，及第三單體構築體包含CP3、CM3、及SMM3。此類ACC之實施例顯示於圖1A中。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向，第一單體構築體包含SMM1、CM1、及CP1，第二單體構築體包含SMM2、CM2、及CP2，及第三單體構築體包含SMM3、CM3、及CP3。此類ACC之實施例顯示於圖1B中。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向，第一單體構築體包含AMM1、CM1、及CP1，第二單體構築體包含AMM2、CM2、及CP2，及第三單體構築體包含AMM3、CM3、及CP3。此類ACC之實施例顯示於圖1C中。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向，第一單體構築體包含CP1、CM1、及AMM1，第二單體構築體包含CP2、CM2、及AMM2，及第三單體構築體包含CP3、CM3、及AMM3。此類ACC之實施例顯示於圖1D中。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向，第一單體構築體包含AMM1、CM4、CP1、CM1、及SMM1，第二單體構築體包含AMM2、CM5、CP2、CM2、及SMM2，及第三單體構築體包含AMM3、CM6、CP3、CM3、及SMM3。此類ACC之實施例顯示於圖1E中。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含SMM1、CM1、CP1、CM4、及AMM1，第二單體構築體包含SMM2、CM2、CP2、CM5、及AMM2，及第三單體構築體包含SMM3、CM3、CP3、CM6、及AMM3。此類ACC之實施例顯示於圖1F中。 在一些具體實施例中，AMM及SMM在單體構築體中可相對於CP位於相同側。AMM及SMM可在CP與較靠近CP之MM之間以CM與CP偶合。CM之切割可使AMM及SMM兩者從CP釋放，導致活性細胞介素產物。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向，第一單體構築體包含CP1、CM1、AMM1、及SMM1；第二單體構築體包含CP2、CM2、AMM2、及SMM2；及第三單體構築體包含CP3、CM3、AMM3、及SMM3。此類ACC之實施例顯示於圖1H中。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向，第一單體構築體包含CP1、CM1、SMM1、及AMM1；第一單體構築體包含CP2、CM2、SMM2、及AMM2；及第一單體構築體包含CP3、CM3、SMM3、及AMM3。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向：第一單體構築體包含SMM1、AMM1、CM1、及CP1；第二單體構築體包含SMM2、AMM2、CM2、及CP2，及第三單體構築體包含SMM3、AMM3、CM3、及CP3。此類ACC之實施例顯示於圖1G中。 在一些具體實施例中，沿N-端至C-端方向，第一單體構築體包含AMM1、SMM1、CM1、及CP1；第二單體構築體包含AMM2、SMM2、CM2、及CP2，及第三單體構築體包含AMM3、SMM3、CM3、及CP3。 在一些具體實施例中，相較於CP1、CP2、CP3、或其三聚體中之至少一者的活性對照水平，該ACC特徵在於CP1、CP2、CP3、或其三聚體中之至少一者的活性水平降低。在一些具體實施例中，對照水平可係重組CP1、CP2、CP3、或其三聚體(例如，市售之重組CP1、CP2、CP3、或其三聚體，重組野生型CP1、CP2、CP3、或其三聚體等)之活性水平。在一些具體實施例中，對照水平可係ACC之切割(活化)形式的活性水平。 在一些具體實施例中，CP1、CP2、CP3、或其三聚體對其結合配偶體(例如，同源受體)之結合親和力(K D)可使用表面電漿子共振來測定(例如，在25℃下於磷酸鹽緩衝鹽水中執行)。在某些具體實施例中，活性可係疱疹病毒入侵介體(HVEM)活化之水平(例如，如使用下文實施例章節中所述之基於HVEM細胞之檢定來評估)。在一些具體實施例中，當嚙合A375人類黑色素瘤細胞株之表面上的淋巴毒素β受體時，活性可係刺激產生IL-8的能力(例如，使用下文實施例章節中所述之基於淋巴毒素β受體細胞之檢定來評估)。在一些實施例中，相較於CP1、CP2、及CP3之對照三聚體，ACC在疱疹病毒入侵介體(HVEM)之活化中顯示降低之活性。 在一些實施例中，相較於CP1、CP2、及CP3之對照三聚體，ACC在淋巴毒素β受體之活化中顯示降低之活性。 在一些實施例中，相較於CP1、CP2、及CP3之對照三聚體，ACC在疱疹病毒入侵介體(HVEM)之活化及淋巴毒素β受體之活化中顯示降低之活性。在一些實施例中，CP1、CP2、及CP3之對照三聚體由ACC之活化產生。 在一些具體實施例中，相較於對照水平，ACC特徵在於CP1、CP2、CP3、或其三聚體中至少一者之活性降低至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、10 4倍、10 5倍、10 6倍、10 7倍、或10 8倍。 在一些具體實施例中，相較於對照水平，ACC特徵在於CP1、CP2、CP3、或其三聚體中至少一者之活性降低1至20倍、降低200至500倍、降低300至500倍、降低400至500倍、降低500至600倍、降低600至700倍、降低150至1000倍、降低100至1500倍、降低200至1500倍、降低300至1500倍、降低400至1500倍、降低500至1500倍、降低1000至1500倍、降低100至1000倍、降低200至1000倍、降低300至1000倍、降低400至1000倍、降低500至1000倍、降低100至500倍、降低20至50倍、降低30至50倍、降低40至50倍、降低100至400倍、降低200至400倍、或降低300至400倍、降低100至300倍、降低200至300倍、或降低100至200倍。 在一些具體實施例中，CP1、CP2、CP3、或其三聚體之活性的對照水平係在CM被(多種)蛋白酶切割後從ACC釋放之CP1、CP2、CP3、或其三聚體(「切割產物」)之活性。在一些具體實施例中，CP1、CP2、CP3、或其三聚體中之至少一者活性的對照水平係對應的野生型成熟細胞介素(例如，重組野生型成熟細胞介素)或其三聚體之活性。 在一些具體實施例中，ACC與蛋白酶之培育產出(多個)活化之細胞介素產物，其中該CP1、該CP2、該CP3、或其三聚體之活性大於完整ACC(未切割)之CP1、CP2、CP3、或其三聚體之一或多種活性。在一些具體實施例中，CP1、CP2、及CP3、或其三聚體之活性係比ACC之CP1、CP2、及CP3、或其三聚體之活性大至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、10 4倍、10 5倍、10 6倍、10 7倍、或10 8倍。在一些具體實施例中，CP1、CP2、及CP3、或其三聚體之活性比ACC之CP1、CP2、及CP3、或其三聚體之活性大1至20倍、大200至500倍、大300至500倍、大400至500倍、大500至600倍、大600至700倍、大150至1000倍、大100至1500倍、大200至1500倍、大300至1500倍、大400至1500倍、大500至1500倍、大1000至1500倍、大100至1000倍、大200至1000倍、大300至1000倍、大400至1000倍、大500至1000倍、大100至500倍、大20至50倍、大30至50倍、大40至50倍、大100至400倍、大200至400倍、或大300至400倍、大100至300倍、大200至300倍、或大100至200倍。 在一些具體實施例中，第一、第二、及/或第三單體構築體之各者可獨立地包含總共約150個胺基酸至約850個胺基酸、約150個胺基酸至約800個胺基酸、約150個胺基酸至約750個胺基酸、約150個胺基酸至約700個胺基酸、約150個胺基酸至約650個胺基酸、約150個胺基酸至約600個胺基酸、約150個胺基酸至約550個胺基酸、約150個胺基酸至約500個胺基酸、約150個胺基酸至約450個胺基酸、約150個胺基酸至約400個胺基酸、約150個胺基酸至約350個胺基酸、約150個胺基酸至約300個胺基酸、約150個胺基酸至約250個胺基酸、約150個胺基酸至約200個胺基酸、約200個胺基酸至約850個胺基酸、約200個胺基酸至約800個胺基酸、約200個胺基酸至約750個胺基酸、約200個胺基酸至約700個胺基酸、約200個胺基酸至約650個胺基酸、約200個胺基酸至約600個胺基酸、約200個胺基酸至約550個胺基酸、約200個胺基酸至約500個胺基酸、約200個胺基酸至約450個胺基酸、約200個胺基酸至約400個胺基酸、約200個胺基酸至約350個胺基酸、約200個胺基酸至約300個胺基酸、約200個胺基酸至約250個胺基酸、約250個胺基酸至約800個胺基酸、約250個胺基酸至約750個胺基酸、約250個胺基酸至約700個胺基酸、約250個胺基酸至約650個胺基酸、約250個胺基酸至約600個胺基酸、約250個胺基酸至約550個胺基酸、約250個胺基酸至約500個胺基酸、約250個胺基酸至約450個胺基酸、約250個胺基酸至約400個胺基酸、約250個胺基酸至約350個胺基酸、約250個胺基酸至約300個胺基酸、約300個胺基酸至約800個胺基酸、約300個胺基酸至約750個胺基酸、約300個胺基酸至約700個胺基酸、約300個胺基酸至約650個胺基酸、約300個胺基酸至約600個胺基酸、約300個胺基酸至約550個胺基酸、約300個胺基酸至約500個胺基酸、約300個胺基酸至約450個胺基酸、約300個胺基酸至約400個胺基酸、約300個胺基酸至約350個胺基酸、約350個胺基酸至約800個胺基酸、約350個胺基酸至約750個胺基酸、約350個胺基酸至約700個胺基酸、約350個胺基酸至約650個胺基酸、約350個胺基酸至約600個胺基酸、約350個胺基酸至約550個胺基酸、約350個胺基酸至約500個胺基酸、約350個胺基酸至約450個胺基酸、約350個胺基酸至約400個胺基酸、約400個胺基酸至約800個胺基酸、約400個胺基酸至約750個胺基酸、約400個胺基酸至約700個胺基酸、約400個胺基酸至約650個胺基酸、約400個胺基酸至約600個胺基酸、約400個胺基酸至約550個胺基酸、約400個胺基酸至約500個胺基酸、約400個胺基酸至約450個胺基酸、約450個胺基酸至約800個胺基酸、約450個胺基酸至約750個胺基酸、約450個胺基酸至約700個胺基酸、約450個胺基酸至約650個胺基酸、約450個胺基酸至約600個胺基酸、約450個胺基酸至約550個胺基酸、約450個胺基酸至約500個胺基酸、約500個胺基酸至約850個胺基酸、約500個胺基酸至約800個胺基酸、約500個胺基酸至約750個胺基酸、約500個胺基酸至約700個胺基酸、約500個胺基酸至約650個胺基酸、約500個胺基酸至約600個胺基酸、約500個胺基酸至約550個胺基酸、約550個胺基酸至約850個胺基酸、約550個胺基酸至約800個胺基酸、約550個胺基酸至約750個胺基酸、約550個胺基酸至約700個胺基酸、約550個胺基酸至約650個胺基酸、約550個胺基酸至約600個胺基酸、約600個胺基酸至約850個胺基酸、約600個胺基酸至約800個胺基酸、約600個胺基酸至約750個胺基酸、約600個胺基酸至約700個胺基酸、約600個胺基酸至約650個胺基酸、約650個胺基酸至約850個胺基酸、約650個胺基酸至約800個胺基酸、約650個胺基酸至約750個胺基酸、約650個胺基酸至約700個胺基酸、約700個胺基酸至約850個胺基酸、約700個胺基酸至約800個胺基酸、約700個胺基酸至約750個胺基酸、約750個胺基酸至約800個胺基酸、或約800個胺基酸至約850個胺基酸。 在一些具體實施例中，在ACC中之一或多個單體構築體可包含SEQ ID NO: 8、10、12、24、30、40、42、44、或46中任一者之序列。在一些具體實施例中，在ACC中之一或多個單體構築體中可包含與SEQ ID NO: 8、10、12、24、30、40、42、44、或46中任一者至少80%(例如，至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%、或100%)一致的序列。在一些具體實施例中，在ACC中之三個單體構築體中之各者係一致的，且包含與SEQ ID NO: 8、10、12、24、30、40、42、44、或46中任一者至少80%(例如，至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%、或100%)一致的序列。 在一些具體實施例中，在ACC中之一或多個單體構築體可由核酸所編碼，該核酸包含SEQ ID NO: 9、11、13、25、31、41、43、45、或47中任一者之序列。 在一些具體實施例中，在ACC中之一或多個單體構築體中可由核酸所編碼，該核酸包含與SEQ ID NO: 9、11、13、25、31、41、43、45、或47中任一者至少80%(例如，至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%、或100%)一致的序列。 在一些態樣中，本揭露提供核酸，其包含SEQ ID NO: 9、11、13、25、31、41、43、45、或47中任一者之序列。在一些態樣中，本揭露提供核酸，其包含與SEQ ID NO: 9、11、13、25、31、41、43、45、或47中任一者至少80%(例如，至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%、或100%)一致的序列。在一些態樣中，本揭露提供一或多種載體，其包含本文中所述之任何核酸。 在一些態樣中，在ACC中之一或多個單體構築體可包括此類序列，但也可沒有彼等序列之訊息序列。訊息序列沒有特別限制。訊息序列之一些實施例包括SEQ ID NO: 78。 遮蔽部份 (MM)本文中之ACC可含一或多個能夠干擾CP與其結合配偶體(例如，配體或受體)之結合的遮蔽部份(MM)。 MM可係如本文中所述之空間遮蔽部份(SMM)或親和力遮蔽部份(AMM)。MM可藉由CM及視需要地一或多個本文中所述之連接子偶合至CP。在一些具體實施例中，當ACC未活化時，MM阻止CP與目標結合；但當ACC活化時(當CM被蛋白酶切割時)，MM實質上不會或顯著地干擾CP與目標的結合。 在ACC中，干擾CP之目標結合的MM可偶合至該CP。替代地，干擾CP之目標結合的MM可偶合至不是該CP的ACC組分。舉例而言，MM可偶合至不同CP。在任一情況下，在可活化之結構的三級或四級結構中，MM可位於允許MM遮蔽CP的位置(例如，靠近要遮蔽之CP)。 在一些具體實施例中，MM可與CP交互作用，因此降低或抑制CP與其結合配偶體之間的交互作用。在一些具體實施例中，MM可包含CP之天然存在的結合配偶體的至少部分或完整的胺基酸序列。舉例而言，MM可係天然存在的結合配偶體的片段。該片段可保留與天然存在的結合配偶體不超過95%、90%、80%、75%、70%、60%、50%、40%、30%、25%、或20%同源的核酸或胺基酸序列。 在一些具體實施例中，MM可不特異性結合至CP，但仍通過非特異***互作用(諸如立體阻礙)干擾CP與其結合配偶體的結合。舉例而言，MM可位於ACC中，使得該ACC之三級或四級結構允許該MM通過基於電荷之交互作用遮蔽CP，從而將該MM保留在原位用以干擾結合配偶體接近該CP。 在一些具體實施例中，遮蔽部份(例如，空間遮蔽部份諸如白蛋白(例如，HSA))可使ACC穩定在非活化狀態下。 在一些實施例中，SMM可係一種肽，其大小、結構、構形、及/或在ACC中之位置阻止、抑制、或干擾CP與其結合配偶體之結合。在一些實施例中，SMM可係球狀蛋白質，例如，白蛋白諸如卵白蛋白、人類血清白蛋白(HSA)、及牛血清白蛋白(BSA)。在特定實施例中，SMM可係人類血清白蛋白，例如，SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，SMM可包含與SEQ ID NO: 56至少80%(例如，至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%、或100%)一致的序列。 在一些具體實施例中，AMM可係CP之同源肽。舉例而言，該MM可包含CP的表位、配體、或受體、或其片段的序列。在其中CP係TNFSF14之情況下，AMM可係TNFSF14之受體或其部分，例如，SEQ ID NO: 61。 如本文中所使用之術語「天然存在的(naturally occurring)」當應用於物體時係指物體可在自然界被發現的事實。舉例而言，存在於生物體(包括病毒)內、可從自然界來源中單離、且沒有被人在實驗室中或以其他方式刻意修飾之多肽或多核苷酸序列係天然存在的。 在一些具體實施例中，MM可包含不是天然存在的胺基酸序列或不含天然存在的結合配偶體或目標蛋白質之胺基酸序列。在某些具體實施例中，MM不是CP之天然結合配偶體。MM可係CP之經修飾之結合配偶體，其含有減少與CP結合之親和力及/或結合性的胺基酸變化。在一些具體實施例中，MM可不含或實質上沒有與CP之天然結合配偶體同源的核酸或胺基酸。在其他具體實施例中，MM與CP之天然結合配偶體不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或80%類似。 在一些具體實施例中，MM可具有之與CP結合之解離常數不超過CP與目標之解離常數。在一些具體實施例中，在切割狀態下，MM不可干擾CP或與CP競爭結合至目標。 MM之結構性質可根據諸如干擾蛋白質與目標結合所需之最小胺基酸序列、感興趣之目標蛋白質-蛋白質結合對、CP之大小、是否存在連接子等的因素來選擇。 在一些具體實施例中，MM可為偶合之CP所獨有。MM之實施例包括經特異性篩選以結合CP之結合結構域或其片段的MM(例如，親和力遮蔽物)。本文中提供用於篩選MM以獲得該CP所獨有且特異性及/或選擇性地結合結合配偶體/目標之結合結構域的MM之方法，並可包括蛋白質展示方法。 如本文中所使用，術語「遮蔽效率(masking efficiency)」係指在非活化狀態下ACC之活性(例如，EC 50)除以對照抗體之活性，其中對照抗體可係ACC之切割產物或可用作可活化之目標結合蛋白質之CP的抗體或其片段。具有降低之CP活性水平的ACC可具有大於10的遮蔽效率。在一些具體實施例中，本文中所述之可活化之目標結合蛋白質可具有大於10、100、1000、或5000的遮蔽效率。 在一些具體實施例中，MM可係約2至50個胺基酸長之多肽。舉例而言，MM可係2至40、2至30、2至20、2至10、5至15、10至20、15至25、20至30、25至35、30至40、35至45、40至50個胺基酸長。舉例而言，MM可係具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個胺基酸長之多肽。在一些實施例中，MM可係超過50個胺基酸長之多肽，例如，100、200、300、400、500、600、700、800個、或更多個胺基酸。 在一些具體實施例中，當在體外免疫吸附檢定(例如，描述於US20200308243A1中)中測量時，在CP之目標存在下，在具有CP及干擾MM之ACC的非活性狀態下，相較於不具有干擾MM之對應抗體(counterpart antibody)之結合，CP與目標沒有結合或實質上沒有結合，或CP與其目標之結合不超過0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、或50%達至少0.1、0.5、1、2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小時；或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天；或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個月。 在具有干擾MM之情況下，CP對目標或結合配偶體之結合親和力可係比在沒有干擾MM之情況下，CP對其結合配偶體之結合親和力低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍，或比當沒有干擾MM時CP對其結合配偶體之結合親和力低5至10、10至100、10至1,000、10至10,000、10至100,000、10至1,000,000、10至10,000,000、100至1,000、100至10,000、100至100,000、100至1,000,000、100至10,000,000、1,000至10,000、1,000至100,000、1,000至1,000,000、1000至10,000,000、10,000至100,000、10,000至1,000,000、10,000至10,000,000、100,000至1,000,000、或100,000至10,000,000倍之間。 MM對其遮蔽之CP的解離常數可大於CP對目標的解離常數。MM對所遮蔽之CP的解離常數可比CP對目標的解離常數大至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。相反地，MM對所遮蔽之CP的結合親和力可低於CP對目標的結合親和力。MM對CP的結合親和力可比CP對目標的結合親和力低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。 在一些具體實施例中，MM可含有遺傳編碼或非遺傳編碼之胺基酸。非遺傳編碼之胺基酸的實施例係但不限於D-胺基酸、β-胺基酸、及γ-胺基酸。在特定具體實施例中，MM含有不超過50%、40%、30%、20%、15%、10%、5%或1%的非遺傳編碼之胺基酸。 在一些具體實施例中，一旦從ACC釋放並呈游離狀態時，MM可具有生物活性或治療效應，諸如結合能力。舉例而言，游離肽可與相同或不同結合配偶體結合。在某些實施例中，游離MM可發揮治療效應，對本文中所揭示之組成物提供次要功能(secondary function)。在一些具體實施例中，一旦從ACC解偶合並呈游離狀態時，MM可有利地不展現生物活性。舉例而言，在MM呈游離狀態之一些具體實施例中並未誘發個體之免疫反應。 合適的MM可通過從具有可變的MM之候選可活化之目標結合蛋白質庫中的篩選程序來鑑別且/或進一步最佳化。舉例而言，可選擇CP及CM以提供所欲之酶/目標組合，且可藉由下述篩選程序來鑑別MM之胺基酸序列，以鑑別提供可活化之表型的MM。舉例而言，可在本文中所揭示之篩選方法中使用隨機肽庫(例如，包含2至40個胺基酸或更多個胺基酸的肽)來鑑別合適的MM。 在一些具體實施例中，可通過篩選程序來鑑別對於CP具有特異性結合親和力之MM，該篩選程序包括提供包含候選MM之肽支架庫(library of peptide scaffold)，其中各支架係由跨膜蛋白質及候選MM所構成。然後可將該庫與完整或一部分的蛋白質(諸如全長蛋白質、天然存在的蛋白質片段、或含有蛋白質之非天然存在的片段(亦能夠結合感興趣之結合配偶體))接觸，並鑑別具有可偵測出結合蛋白質之一或多種候選MM。篩選可藉由一或多輪的磁性活化分選(magnetic-activated sorting, MACS)或螢光活化分選(fluorescence-activated sorting, FACS)、以及測定MM對CP之結合親和力及隨後測定遮蔽效率來執行，例如，如於WO2009025846及US20200308243A1所述，其係以全文引用方式併入本文中。 細胞介素蛋白質ACC可採用可形成三聚體的任何各式各樣的細胞介素蛋白質。此類細胞介素蛋白質之實施例包括腫瘤壞死因子(TNF)配體之成員，諸如TNF之成員或TNF超家族成員。細胞介素之實施例包括腫瘤壞死因子超家族14(TNFSF14，亦稱為LIGHT)、腫瘤壞死因子TNF(例如，TNF-α、-β、或-C)、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF15、及TNFSF18。在一個實施例中，細胞介素蛋白質係LIGHT(亦稱為TNFSF14)。在一些實施例中，ACC包含不是TNF的細胞介素(例如，除TNF之外的TNF超家族之成員)。 在一些具體實施例中，細胞介素蛋白質可係成熟細胞介素蛋白質。術語「成熟細胞介素蛋白質(mature cytokine protein)」在本文中係指缺乏訊息序列的細胞介素蛋白質。訊息序列在本文中亦稱為「訊息肽」。成熟細胞介素蛋白質亦可缺乏(多個)胞內及/或跨膜結構域。細胞介素蛋白質(CP)可係成熟細胞介素蛋白質或具有訊息肽、胞內結構域、跨膜結構域、或其部分之細胞介素蛋白質。在一些具體實施例中，細胞介素蛋白質可包含訊息肽。在一些實施例中，本揭露之ACC可包括本文中所揭示之包括或缺乏本文中所述之訊息序列的序列。 舉例而言，此類蛋白質之序列包括本文中所例示者及可從ncbi.nlm.nih.gov/protein中獲得之額外序列。適用於本發明之ACC的截短變體包括保留細胞介素活性的任何N端或C端截短之細胞介素。在一些實施例中，截短變體可係N端及/或C端被截短1至約200個胺基酸、1至約150個胺基酸、1至約100個胺基酸、1至約95個胺基酸、1至約90個胺基酸、1至約85個胺基酸、1至約80個胺基酸、1至約75個胺基酸、1至約70個胺基酸、1至約65個胺基酸、1至約60個胺基酸、1至約55個胺基酸、1至約50個胺基酸、1至約45個胺基酸、1至約40個胺基酸、1至約35個胺基酸、1至約30個胺基酸、1至約25個胺基酸、1至約20個胺基酸、1至約15個胺基酸、1至約10個胺基酸、1至約8個胺基酸、1至約6個胺基酸、1至約4個胺基酸，該等截短變體保留細胞介素活性。在前述具體實施例之一些中，截短之CP係N端截短之CP。在其他具體實施例中，截短之CP係C端截短之CP。在某些具體實施例中，截短之CP係C端及N端截短之CP。在一些具體實施例中，CP經截短以移除天然存在的蛋白酶辨識序列(即移除可能易受蛋白酶切割影響的部位)。 在一些實施例中，CP1、CP2、及CP3之各者可獨立地包含在多個物種之間具有交叉反應性(cross-reactive)的細胞介素(例如，野生型細胞介素之突變體)。交叉反應性細胞介素可結合至不同物種之受體並活化對應的訊息傳導路徑。在一些實施例中，交叉反應性細胞介素係小鼠-人類交叉反應性，即可結合至人類及小鼠兩者之受體並活化(多個)對應的訊息傳導路徑。在一些實施例中，交叉反應性細胞介素係小鼠-人類交叉反應性TNFSF14。小鼠-人類交叉反應性TNFSF14可包含在人類TNFSF14蛋白質上之一或多個突變。在一個實施例中，小鼠-人類交叉反應性TNFSF14包含SEQ ID NO: 55之序列。額外交叉反應性細胞介素可藉由使用酵母表面展示(yeast surface display)(例如，描述於Tang et al. Cancer Cell. 2016 Mar 14; 29(3):285-296中，其係以全文引用方式併入)篩選細胞介素(例如，野生型細胞介素)之隨機錯誤誘變庫(random error mutagenesis library)來鑑別。 在一些具體實施例中，CP1、CP2、及CP3之各者可獨立地包含與SEQ ID NO: 54或55之細胞介素參考序列至少80%一致(例如，至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%一致)的胺基酸序列。 序列一致性之百分比係指當使用序列比對程式(例如，可在NCBI網站之網路上公開獲得之BLAST程式套件)比對時，在二或更多個肽序列之間的胺基酸序列一致性之水平。亦參見Altschul et al., J. Mol.Biol.215:403-10, 1990。 在一些具體實施例中，CP1、CP2、及/或CP3展現腫瘤壞死因子或腫瘤壞死因子超家族成員(例如，TNFSF14)之活性且包括與SEQ ID NO: 54或55之序列至少80%一致、至少82%一致、至少84%一致、至少86%一致、至少88%一致、至少90%一致、至少92%一致、至少94%一致、至少96%一致、至少98%一致、或至少99%一致、或100%一致的胺基酸序列。 所採用之細胞介素蛋白質序列中之胺基酸數量可取決於所採用之特定細胞介素蛋白質而有所變化。在一些具體實施例中，CP1、CP2、及/或CP3包括總共約10個胺基酸至約700個胺基酸、約10個胺基酸至約650個胺基酸、約10個胺基酸至約600個胺基酸、約10個胺基酸至約550個胺基酸、約10個胺基酸至約500個胺基酸、約10個胺基酸至約450個胺基酸、約10個胺基酸至約400個胺基酸、約10個胺基酸至約350個胺基酸、約10個胺基酸至約300個胺基酸、約10個胺基酸至約250個胺基酸、約10個胺基酸至約200個胺基酸、約10個胺基酸至約150個胺基酸、約10個胺基酸至約100個胺基酸、約10個胺基酸至約80個胺基酸、約10個胺基酸至約60個胺基酸、約10個胺基酸至約40個胺基酸、約10個胺基酸至約20個胺基酸、約20個胺基酸至約700個胺基酸、約20個胺基酸至約650個胺基酸、約20個胺基酸至約600個胺基酸、約20個胺基酸至約550個胺基酸、約20個胺基酸至約500個胺基酸、約20個胺基酸至約450個胺基酸、約20個胺基酸至約400個胺基酸、約20個胺基酸至約350個胺基酸、約20個胺基酸至約300個胺基酸、約20個胺基酸至約250個胺基酸、約20個胺基酸至約200個胺基酸、約20個胺基酸至約150個胺基酸、約20個胺基酸至約100個胺基酸、約20個胺基酸至約80個胺基酸、約20個胺基酸至約60個胺基酸、約20個胺基酸至約40個胺基酸、約40個胺基酸至約700個胺基酸、約40個胺基酸至約650個胺基酸、約40個胺基酸至約600個胺基酸、約40個胺基酸至約550個胺基酸、約40個胺基酸至約500個胺基酸、約40個胺基酸至約450個胺基酸、約40個胺基酸至約400個胺基酸、約40個胺基酸至約350個胺基酸、約40個胺基酸至約300個胺基酸、約40個胺基酸至約250個胺基酸、約40個胺基酸至約200個胺基酸、約40個胺基酸至約150個胺基酸、約40個胺基酸至約100個胺基酸、約40個胺基酸至約80個胺基酸、約40個胺基酸至約60個胺基酸、約60個胺基酸至約700個胺基酸、約60個胺基酸至約650個胺基酸、約60個胺基酸至約600個胺基酸、約60個胺基酸至約550個胺基酸、約60個胺基酸至約500個胺基酸、約60個胺基酸至約450個胺基酸、約60個胺基酸至約400個胺基酸、約60個胺基酸至約350個胺基酸、約60個胺基酸至約300個胺基酸、約60個胺基酸至約250個胺基酸、約60個胺基酸至約200個胺基酸、約60個胺基酸至約150個胺基酸、約60個胺基酸至約100個胺基酸、約60個胺基酸至約80個胺基酸、約80個胺基酸至約700個胺基酸、約80個胺基酸至約650個胺基酸、約80個胺基酸至約600個胺基酸、約80個胺基酸至約550個胺基酸、約80個胺基酸至約500個胺基酸、約80個胺基酸至約450個胺基酸、約80個胺基酸至約400個胺基酸、約80個胺基酸至約350個胺基酸、約80個胺基酸至約300個胺基酸、約80個胺基酸至約250個胺基酸、約80個胺基酸至約200個胺基酸、約80個胺基酸至約150個胺基酸、約80個胺基酸至約100個胺基酸、約100個胺基酸至約700個胺基酸、約100個胺基酸至約650個胺基酸、約100個胺基酸至約600個胺基酸、約100個胺基酸至約550個胺基酸、約100個胺基酸至約500個胺基酸、約100個胺基酸至約450個胺基酸、約100個胺基酸至約400個胺基酸、約100個胺基酸至約350個胺基酸、約100個胺基酸至約300個胺基酸、約100個胺基酸至約250個胺基酸、約100個胺基酸至約200個胺基酸、約100個胺基酸至約150個胺基酸、約150個胺基酸至約700個胺基酸、約150個胺基酸至約650個胺基酸、約150個胺基酸至約600個胺基酸、約150個胺基酸至約550個胺基酸、約150個胺基酸至約500個胺基酸、約150個胺基酸至約450個胺基酸、約150個胺基酸至約400個胺基酸、約150個胺基酸至約350個胺基酸、約150個胺基酸至約300個胺基酸、約150個胺基酸至約250個胺基酸、約150個胺基酸至約200個胺基酸、約200個胺基酸至約700個胺基酸、約200個胺基酸至約650個胺基酸、約200個胺基酸至約600個胺基酸、約200個胺基酸至約550個胺基酸、約200個胺基酸至約500個胺基酸、約200個胺基酸至約450個胺基酸、約200個胺基酸至約400個胺基酸、約200個胺基酸至約350個胺基酸、約200個胺基酸至約300個胺基酸、約200個胺基酸至約250個胺基酸、約250個胺基酸至約700個胺基酸、約250個胺基酸至約650個胺基酸、約250個胺基酸至約600個胺基酸、約250個胺基酸至約550個胺基酸、約250個胺基酸至約500個胺基酸、約250個胺基酸至約450個胺基酸、約250個胺基酸至約400個胺基酸、約250個胺基酸至約350個胺基酸、約250個胺基酸至約300個胺基酸、約300個胺基酸至約700個胺基酸、約300個胺基酸至約650個胺基酸、約300個胺基酸至約600個胺基酸、約300個胺基酸至約550個胺基酸、約300個胺基酸至約500個胺基酸、約300個胺基酸至約450個胺基酸、約300個胺基酸至約400個胺基酸、約300個胺基酸至約350個胺基酸、約350個胺基酸至約700個胺基酸、約350個胺基酸至約650個胺基酸、約350個胺基酸至約600個胺基酸、約350個胺基酸至約550個胺基酸、約350個胺基酸至約500個胺基酸、約350個胺基酸至約450個胺基酸、約350個胺基酸至約400個胺基酸、約400個胺基酸至約700個胺基酸、約400個胺基酸至約650個胺基酸、約400個胺基酸至約600個胺基酸、約400個胺基酸至約550個胺基酸、約400個胺基酸至約500個胺基酸、約400個胺基酸至約450個胺基酸、約450個胺基酸至約700個胺基酸、約450個胺基酸至約650個胺基酸、約450個胺基酸至約600個胺基酸、約450個胺基酸至約550個胺基酸、約450個胺基酸至約500個胺基酸、約500個胺基酸至約700個胺基酸、約500個胺基酸至約650個胺基酸、約500個胺基酸至約600個胺基酸、約500個胺基酸至約550個胺基酸、約550個胺基酸至約700個胺基酸、約550個胺基酸至約650個胺基酸、約550個胺基酸至約600個胺基酸、約600個胺基酸至約700個胺基酸、約600個胺基酸至約650個胺基酸、或約650個胺基酸至約700個胺基酸。在一些具體實施例中，CP1、CP2、及/或CP3係成熟野生型人類細胞介素蛋白質。 可切割之部份在一些態樣中，位在ACC中之CP與MM(例如，SMM及/或AMM)組分之間的係直接或間接(例如，經由連接子)的可切割之部份(CM)，其包含蛋白酶之受質。在一些具體實施例中，ACC中CM之各者可獨立地包含選自由下列所組成之群組的蛋白酶之受質：ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADEMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、BACE、腎活素、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、凋亡蛋白酶1、凋亡蛋白酶2、凋亡蛋白酶3、凋亡蛋白酶4、凋亡蛋白酶5、凋亡蛋白酶6、凋亡蛋白酶7、凋亡蛋白酶8、凋亡蛋白酶9、凋亡蛋白酶10、凋亡蛋白酶14、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶G、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2、組織蛋白酶X/Z/P、凝乳酶、克魯茲蛋白酶、DESC1、DPP-4、FAP、天冬胺酸內肽酶、泛素特異性蛋白酶-2、彈性蛋白酶、FVIIa、FiXA、FXa、FXIa、FXIIa、顆粒酶B、胍基苯甲酸蛋白酶、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶、HtrA1、人類嗜中性球彈性蛋白酶(human neutrophil elastase)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、乳鐵蛋白、通道活化蛋白酶、間質蛋白酶-2、安眠蛋白酶、MT-SP1/間質蛋白酶、腦啡肽酶、NS3/4A、PACE4、纖維蛋白溶酶、PSMA、PSA、BMP-1、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26、MMP27、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、tPA、凝血酶、類胰蛋白酶、及uPA。 在一些具體實施例中，切割本文中所述之任何CM的蛋白酶可係：ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、BACE、腎活素(Renin)、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、凋亡蛋白酶1、凋亡蛋白酶2、凋亡蛋白酶3、凋亡蛋白酶4、凋亡蛋白酶5、凋亡蛋白酶6、凋亡蛋白酶7、凋亡蛋白酶8、凋亡蛋白酶9、凋亡蛋白酶10、凋亡蛋白酶14、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2、組織蛋白酶X/Z/P、克魯茲蛋白酶(Cruzipain)、天冬胺酸內肽酶(Legumain)、泛素特異性蛋白酶-2 (Otubain-2)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、安眠蛋白酶(Meprin)、腦啡肽酶(Neprilysin)、PSMA、BMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26、MMP-27、活化蛋白質C (activated protein C)、組織蛋白酶A、組織蛋白酶G、凝乳酶(Chymase)、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、彈性蛋白酶(Elastase)、顆粒酶B (Granzyme B)、胍基苯甲酸蛋白酶(Guanidinobenzoatase)、HtrA1、人類嗜中性球裂解酶、乳鐵蛋白、通道活化蛋白酶(marapsin)、NS3/4A、PACE4、纖維蛋白溶酶(Plasmin)、PSA、tPA、凝血酶(thrombin)、類胰蛋白酶(tryptase)、uPA、DESC1、DPP-4、FAP、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(Hepsin)、間質蛋白酶-2 (Matriptase-2)、MT-SP1/間質蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3、或TMPRSS4。 在一些具體實施例中，蛋白酶係選自下列之群組：uPA、天冬胺酸內肽酶、MT-SP1、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-2、MMP-9、MMP-12、MMP-13、及MMP-14。 在一些具體實施例中，選擇CM與特定蛋白酶一起使用。蛋白酶可係由腫瘤細胞所產生(例如，腫瘤細胞可表現比健康組織更大量的該蛋白酶)。在一些具體實施例中，CM係至少一種選自下列之群組的蛋白酶之受質：ADAM 17、BMP-1、半胱胺酸蛋白酶諸如組織蛋白酶、HtrA1、天冬胺酸內肽酶、間質蛋白酶(MT-SP1)、基質金屬蛋白酶(MMP)、嗜中性球彈性蛋白酶、TMPRSS(諸如TMPRSS3或TMPRSS4)、凝血酶、及u型血漿蛋白原活化因子(uPA，亦稱為尿激酶)。 在一些具體實施例中，CM係至少一種基質金屬蛋白酶(MMP)之受質。MMP之實施例包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26、及MMP27。在一些具體實施例中，CM係MMP9、MMP14、MMP1、MMP3、MMP13、MMP17、MMP11、及MMP19之受質。在一些具體實施例中，CM係MMP7之受質。在一些具體實施例中，CM係MMP9之受質。在一些具體實施例中，CM係用於MMP14之受質。在一些具體實施例中，CM係二或更多種MMP之受質。在一些具體實施例中，CM至少係MMP9及MMP14之受質。在一些具體實施例中，CM包括用於相同MMP之二或更多種受質。在一些具體實施例中，CM包括至少二或更多種MMP9受質。在一些具體實施例中，CM包括至少二或更多種MMP14受質。 據報導具有已知受質之蛋白酶在許多癌症中之水平增加。參見例如La Roca et al., British J. Cancer90(7):1414-1421, 2004。適用於本文中所採用之CM組分的受質包括更普遍存在於癌細胞及組織中的受質。因此，在某些實施例中，在ACC中CM之各者可獨立地包含較普遍存在於與癌症相關聯之患病組織中的蛋白酶之受質。在一些具體實施例中，癌症係選自下列之群組：胃癌、乳癌、骨肉瘤、及食道癌。在一些具體實施例中，癌症係乳癌。在一些具體實施例中，癌症係HER2-陽性癌症。在一些具體實施例中，癌症係卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、毛細胞白血病(hairy cell leukemia)、慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)、濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、腎細胞癌(renal cell cancer, RCC)、黑色素瘤、神經母細胞瘤、基底細胞癌、皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma)、鼻咽腺癌(nasopharyngeal adenocarcinoma)、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、BCG-抗性非肌肉侵襲性膀胱癌(BCG-resistant non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)、子宮內膜癌、胰臟癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)、結腸直腸癌、食道癌、膽囊癌、神經膠質瘤(glioma)、頭頸癌、子宮癌、子宮頸癌、或睾丸癌等。在一些上述具體實施例中，CM組分包含在腫瘤組織中較普遍之(多種)蛋白酶的受質。 在一些具體實施例中，CM可係或包含由下表1中之任一個序列及SEQ ID NO: 62、63、及81的共有序列所涵蓋之序列。在一些具體實施例中，CM係與選自由SEQ ID No: 62、63、及81所組成之群組的序列至少95%、98%、或99%一致。 表1. 例示性CM序列 CM之實施例進一步包括前述胺基酸序列之截短變體，其保留對應蛋白酶之辨識部位。此等包括C端及/或N端截短變體，其包含前述胺基酸序列之至少3個連續胺基酸、或前述胺基酸序列之至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個胺基酸，該等截短變體保留蛋白酶之辨識部位。在某些具體實施例中，上述胺基酸序列之截短變體係對應於上述胺基酸序列中之任一者，但C端及/或N端被截短1至約10個胺基酸、1至約9個胺基酸、1至約8個胺基酸、1至約7個胺基酸、1至約6個胺基酸、1至約5個胺基酸、1至約4個胺基酸、或1至約3個胺基酸的胺基酸序列，且其：(1)具有至少三個胺基酸殘基；及(2)保留蛋白酶之辨識部位。在前述具體實施例之一些中，截短之CM係N端截短之CM。在一些具體實施例中，截短之CM係C端截短之CM。在一些具體實施例中，截短之CM係C端及N端截短之CM。 在一些具體實施例中，在ACC中CM之各者可獨立地包含總共約3個胺基酸至約25個胺基酸。在一些具體實施例中，在ACC中CM之各者可獨立地包含總共約3個胺基酸至約25個胺基酸、約3個胺基酸至約20個胺基酸、約3個胺基酸至約15個胺基酸、約3個胺基酸至約10個胺基酸、約3個胺基酸至約5個胺基酸、約5個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約20個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約5個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約10個胺基酸至約20個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約15個胺基酸至約25個胺基酸、約15個胺基酸至約20個胺基酸、或約20個胺基酸至約25個胺基酸。 在一些具體實施例中，ACC可包含多種CM，其包含不同蛋白酶之受質。在一些具體實施例中，ACC中之一些或全部CM包含不同蛋白酶之受質。在一些具體實施例中，CM包含相同蛋白酶之受質。 連接子單體構築體可包含在二個組分之間的一或多個連接子。在一些具體實施例中，第一單體可包括設置在CP1與CM1之間的連接子。在一些具體實施例中，CP1及CM1在第一單體中彼此直接鄰接。在一些具體實施例中，第一單體包含設置在CM1與SMM1之間的連接子。在一些具體實施例中，CM1及SMM1在第一單體中彼此直接鄰接。在一些具體實施例中，第一單體包含設置在CP1與CM4(該CM偶合CP1及AMM1)之間的連接子。在一些具體實施例中，CP1及CM4在第一單體中彼此直接鄰接。在一些具體實施例中，第一單體包含設置在CM4與AMM1之間的連接子。在一些具體實施例中，CM4及AMM1在第一單體中彼此直接鄰接。 在一些具體實施例中，第二單體可包括設置在CP2與CM2之間的連接子。在一些具體實施例中，CP2及CM2在第二單體中彼此直接鄰接。在一些具體實施例中，第二單體包含設置在CM2與SMM2之間的連接子。在一些具體實施例中，CM2及SMM2在第二單體中彼此直接鄰接。在一些具體實施例中，第二單體包含設置在CP2與CM5(該CM偶合CP2及AMM2)之間的連接子。在一些具體實施例中，CP2及CM5在第二單體中彼此直接鄰接。在一些具體實施例中，第二單體包含設置在CM5與AMM2之間的連接子。在一些具體實施例中，CM5及AMM2在第二單體中彼此直接鄰接。 在一些具體實施例中，第三單體可包括設置在CP3與CM3之間的連接子。在一些具體實施例中，CP3及CM3在第三單體中彼此直接鄰接。在一些具體實施例中，第三單體包含設置在CM3與SMM3之間的連接子。在一些具體實施例中，CM3及SMM3在第三單體中彼此鄰接。在一些具體實施例中，第三單體包含設置在CP3與CM6(該CM偶合CP3及AMM3)之間的連接子。在一些具體實施例中，CP3及CM6在第三單體中彼此直接鄰接。在一些具體實施例中，第三單體包含設置在CM6與AMM3之間的連接子。在一些具體實施例中，CM6及AMM3在第三單體中彼此直接鄰接。 在一些具體實施例中，可將一或多個連接子(例如，可撓性連接子)引入可活化之細胞介素構築體中，以在結構域之間、在部份之間、在部份與結構域之間的一或多個接合處，或在其中連接子將有所益處的任何其他接合處提供可撓性。在一些具體實施例中，當ACC作為構形約束之構築體(conformationally constrained construct)提供時，可***可撓性連接子以在未切割之可活化之細胞介素構築體中促進結構之形成及維持。本文中所述之任何連接子可提供所欲之可撓性，以促進抑制目標(例如，細胞介素之受體)之結合，或促進CM被蛋白酶之切割。在一些具體實施例中，被包括在ACC中之連接子係全部或部分可撓性的，使得連接子可包括可撓性連接子以及賦予較低可撓性結構的一或多個部分以提供所欲之ACC。一些連接子可包括半胱胺酸殘基，其可形成雙硫鍵並降低構築體之可撓性。連接子長度可藉由沿N端至C端方向計算從連接子與前一個組分之C端胺基酸相鄰的N端開始至連接子與下一個組分之N端胺基酸相鄰的C端的胺基酸數量來判定(即，連接子長度不包括前一個組分之C端胺基酸或下一個組分之N端胺基酸)。 在一些具體實施例中，連接子可包括總共約1個胺基酸至約25個胺基酸(例如，約1個胺基酸至約24個胺基酸、約1個胺基酸至約22個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約18個胺基酸、約1個胺基酸至約16個胺基酸、約1個胺基酸至約15個胺基酸、約1個胺基酸至約14個胺基酸、約1個胺基酸至約12個胺基酸、約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約8個胺基酸、約1個胺基酸至約6個胺基酸、約1個胺基酸至約5個胺基酸、約1個胺基酸至約4個胺基酸、約1個胺基酸至約3個胺基酸、約1個胺基酸至約2個胺基酸、約2個胺基酸至約25個胺基酸、約2個胺基酸至約24個胺基酸、約2個胺基酸至約22個胺基酸、約2個胺基酸至約20個胺基酸、約2個胺基酸至約18個胺基酸、約2個胺基酸至約16個胺基酸、約2個胺基酸至約15個胺基酸、約2個胺基酸至約14個胺基酸、約2個胺基酸至約12個胺基酸、約2個胺基酸至約10個胺基酸、約2個胺基酸至約8個胺基酸、約2個胺基酸至約6個胺基酸、約2個胺基酸至約5個胺基酸、約2個胺基酸至約4個胺基酸、約2個胺基酸至約3個胺基酸、約4個胺基酸至約25個胺基酸、約4個胺基酸至約24個胺基酸、約4個胺基酸至約22個胺基酸、約4個胺基酸至約20個胺基酸、約4個胺基酸至約18個胺基酸、約4個胺基酸至約16個胺基酸、約4個胺基酸至約15個胺基酸、約4個胺基酸至約14個胺基酸、約4個胺基酸至約12個胺基酸、約4個胺基酸至約10個胺基酸、約4個胺基酸至約8個胺基酸、約4個胺基酸至約6個胺基酸、約4個胺基酸至約5個胺基酸、約5個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約24個胺基酸、約5個胺基酸至約22個胺基酸、約5個胺基酸至約20個胺基酸、約5個胺基酸至約18個胺基酸、約5個胺基酸至約16個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約5個胺基酸至約14個胺基酸、約5個胺基酸至約12個胺基酸、約5個胺基酸至約10個胺基酸、約5個胺基酸至約8個胺基酸、約5個胺基酸至約6個胺基酸、約6個胺基酸至約25個胺基酸、約6個胺基酸至約24個胺基酸、約6個胺基酸至約22個胺基酸、約6個胺基酸至約20個胺基酸、約6個胺基酸至約18個胺基酸、約6個胺基酸至約16個胺基酸、約6個胺基酸至約15個胺基酸、約6個胺基酸至約14個胺基酸、約6個胺基酸至約12個胺基酸、約6個胺基酸至約10個胺基酸、約6個胺基酸至約8個胺基酸、約8個胺基酸至約25個胺基酸、約8個胺基酸至約24個胺基酸、約8個胺基酸至約22個胺基酸、約8個胺基酸至約20個胺基酸、約8個胺基酸至約18個胺基酸、約8個胺基酸至約16個胺基酸、約8個胺基酸至約15個胺基酸、約8個胺基酸至約14個胺基酸、約8個胺基酸至約12個胺基酸、約8個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約10個胺基酸至約24個胺基酸、約10個胺基酸至約22個胺基酸、約10個胺基酸至約20個胺基酸、約10個胺基酸至約18個胺基酸、約10個胺基酸至約16個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約10個胺基酸至約14個胺基酸、約10個胺基酸至約12個胺基酸、約12個胺基酸至約25個胺基酸、約12個胺基酸至約24個胺基酸、約12個胺基酸至約22個胺基酸、約12個胺基酸至約20個胺基酸、約12個胺基酸至約18個胺基酸、約12個胺基酸至約16個胺基酸、約12個胺基酸至約15個胺基酸、約12個胺基酸至約14個胺基酸、約14個胺基酸至約25個胺基酸、約14個胺基酸至約24個胺基酸、約14個胺基酸至約22個胺基酸、約14個胺基酸至約20個胺基酸、約14個胺基酸至約18個胺基酸、約14個胺基酸至約16個胺基酸、約14個胺基酸至約15個胺基酸、約15個胺基酸至約25個胺基酸、約15個胺基酸至約24個胺基酸、約15個胺基酸至約22個胺基酸、約15個胺基酸至約20個胺基酸、約15個胺基酸至約18個胺基酸、約15個胺基酸至約16個胺基酸、約16個胺基酸至約25個胺基酸、約16個胺基酸至約24個胺基酸、約16個胺基酸至約22個胺基酸、約16個胺基酸至約20個胺基酸、約16個胺基酸至約18個胺基酸、約18個胺基酸至約25個胺基酸、約18個胺基酸至約24個胺基酸、約18個胺基酸至約22個胺基酸、約18個胺基酸至約20個胺基酸、約20個胺基酸至約25個胺基酸、約20個胺基酸至約24個胺基酸、約20個胺基酸至約22個胺基酸、約22個胺基酸至約25個胺基酸、約22個胺基酸至約24個胺基酸、或約24個胺基酸至約25個胺基酸)。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，連接子包括總共約1個胺基酸、約2個胺基酸、約3個胺基酸、約4個胺基酸、約5個胺基酸、約6個胺基酸、約7個胺基酸、約8個胺基酸、約9個胺基酸、約10個胺基酸、約11個胺基酸、約12個胺基酸、約13個胺基酸、約14個胺基酸、約15個胺基酸、約16個胺基酸、約17個胺基酸、約18個胺基酸、約19個胺基酸、約20個胺基酸、約21個胺基酸、約22個胺基酸、約23個胺基酸、約24個胺基酸、或約25個胺基酸。 在一些具體實施例中，連接子可富含甘胺酸(Gly或G)殘基。在一些具體實施例中，連接子可富含絲胺酸(Ser或S)殘基。在一些具體實施例中，連接子可富含甘胺酸及絲胺酸殘基。在一些具體實施例中，連接子具有一或多個甘胺酸-絲胺酸殘基(GS)對(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個或更多個GS對)。在一些具體實施例中，連接子具有一或多個Gly-Gly-Gly-Ser (GGGS)序列(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個或更多個GGGS序列)。在一些具體實施例中，連接子具有一或多個Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS)序列(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個或更多個GGGGS序列)。在一些具體實施例中，連接子具有一或多個Gly-Gly-Ser-Gly (GGSG)序列(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個或更多個GGSG序列)。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，連接子包括下列中之任一者或一或多者的組合：(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 645)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 646)、(GGGS)n (SEQ ID NO: 647)、GGSG (SEQ ID NO: 648)、GGSGG (SEQ ID NO: 649)、GSGSG (SEQ ID NO: 650)、GSGGG (SEQ ID NO: 651)、GGGSG (SEQ ID NO: 652)、GSSSG (SEQ ID NO: 653)、GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 654)、GGGS (SEQ ID NO: 655)、GGGSGGGS (SEQ ID NO: 656)、GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 657)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 658)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 659)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 660)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 661)、GGGGS (SEQ ID NO: 662)、GS、GGGGSGS (SEQ ID NO: 663)、GGGGSGGGGSGGGGSGS (SEQ ID NO: 664)、GGSLDPKGGGGS (SEQ ID NO: 665)、PKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 666)、SKYGPPCPPCPAPEFLG (SEQ ID NO: 667)、GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO: 668)、GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 669)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 670)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 671)、及GSTSGSGKPGSSEGST (SEQ ID NO: 672)，其中n係1以上之整數。 連接子之非限制性實施例可包括與本文中所述之例示性連接子序列至少70%一致(例如，至少72%、至少74%、至少75%、至少76%、至少78%、至少80%、至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、100%一致)的序列。 在一些具體實施例中，ACC可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個連接子序列(例如，本文中所述或所屬技術領域中已知之任何例示性連接子序列的相同或不同的連接子序列)。在一些具體實施例中，連接子包含sulfo-SIAB、SMPB、及sulfo-SMPB，其中該連接子與一級胺氫硫基(sulfhydryl)反應。 額外例示性連接子序列列於下表2中： 表2. 例示性連接子序列 與劑共軛ACC可與一或多種劑共軛，例如，促進遞送至感興趣之細胞或組織的靶向部份、劑(例如，治療劑、抗腫瘤劑)、毒素、或其片段。 在一些具體實施例中，ACC可共軛至細胞毒性劑，包括但不限於毒素(例如，細菌、真菌、植物、或動物來源之酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素。在一些具體實施例中，可活化之細胞介素構築體可共軛至細胞毒性劑，包括但不限於毒素(例如，細菌、真菌、植物、或動物來源之酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素。 可共軛至本文中所述之任何ACC的非限制性例示性細胞毒性劑包括：海兔毒素(dolastatin)及其衍生物(例如，奧瑞他汀E (auristatin E)、AFP、單甲基奧瑞他汀D (monomethyl auristatin D, MMAD)、單甲基奧瑞他汀F (MMAF)、單甲基奧瑞他汀E (MMAE)、去甲基奧瑞他汀E (desmethyl auristatin E, DMAE)、奧瑞他汀F、去甲基奧瑞他汀F (DMAF)、海兔毒素16 (DmJ)、海兔毒素16 (Dpv))、奧瑞他汀衍生物(例如，奧瑞他汀酪胺(auristatin tyramine)、奧瑞他汀喹啉酮(auristatin quinolone))、類美坦素(maytansinoid)(例如，DM-1、DM-4)、類美坦素衍生物、雙聯黴素、α-瓢菌素(alpha-amanitin)、透他汀(turbostatin)、苯他汀(phenstatin)、羥苯他汀(hydroxyphenstatin)、海綿素5 (spongistatin 5)、海綿素7、哈利他汀1 (halistatin 1)、哈利他汀2、哈利他汀3、鹵代他汀(halocomstatin)、吡咯并苯并咪唑(pyrrolobenzimidazole, PBI)、環他汀6 (cibrostatin6)、多沙利坦(doxaliform)、西馬多汀類似物(cemadotin analogue) (CemCH2-SH)、假單胞菌毒素A (pseudomonas toxin A) (PES8)變體、假單胞菌毒素A (pseudomonase toxin A)(ZZ-PE38)變體、ZJ-101、蒽環(anthracycline)、阿黴素(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、苔蘚抑素(bryostatin)、喜樹鹼(camptothecin)、7-取代之喜樹鹼(7-substituted campothecin)、10, 11-二氟亞甲基二氧基喜樹鹼(difluoromethylenedioxycamptothecin)、考布他汀(combretastatin)、褐藻毒素(debromoaplysiatoxin)、KahaMide-F、盤皮海綿內酯(discodermolide)、及海鞘素(ecteinascidin)。 可共軛至本文中所述之任何ACC的非限制性例示性酶活性毒素包括：白喉毒素、外毒素(exotoxin) A鏈(來自綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素(ricin) A鏈、相思豆素(abrin) A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin) A鏈、α-帚曲毒蛋白(alpha-sarcin)、油桐( Aleuriies fordii)蛋白質、香石竹(dianfhin)蛋白質、美洲商陸( Phytoiaca Americana)蛋白質(例如，PAPI、PAPII、及PAP-8)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(geionin)、米托黴素(mitogeliin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、新黴素(neomycin)、及單端孢黴烯(trichothecene)。 可共軛至本文中所述之任何ACC的非限制性例示性抗腫瘤劑包括：阿德力黴素(adriamycin)、司比定(cerubidine)、博萊黴素(bleomycin)、愛克蘭(alkeran)、長春鹼(velban)、安可平(oncovin)、氟尿嘧啶、胺甲喋呤、沙奧特帕(thiotepa)、比生群(bisantrene)、諾肖林(novantrone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、丙卡巴肼(procarabizine)、及阿糖胞苷(cytarabine)。 可共軛至本文中所述之任何ACC的非限制性例示性抗病毒劑包括：阿昔洛韋(acyclovir)、vira A、及金剛烷胺(symmetrel)。 可共軛至本文中所述之任何ACC的非限制性例示性抗真菌劑包括：制黴菌素(nystatin)。 可共軛至本文中所述之任何ACC的非限制性例示性可共軛之偵測試劑包括：螢光素及其衍生物、異硫氰酸螢光素(FITC)。 可共軛至本文中所述之任何可活化之細胞介素構築體的非限制性例示性抗菌劑包括：胺基糖苷、鏈黴素、新黴素、康黴素(kanamycin)、丁胺卡那黴素(amikacin)、正大黴素(gentamicin)、及妥布黴素(tobramycin)。 可共軛至本文中所述之任何可活化之細胞介素構築體的非限制性例示性3β,16β,17α-三羥基膽甾-5-烯-22-酮16-O-(2-O-4-甲氧基苯甲醯基-β-D-木吡喃糖苷基)-(1--＞3)-(2-O-乙醯基-α-L-***吡喃糖苷) (OSW-1)包括：O6-苯甲基鳥嘌呤之s-硝基苯甲基氧基羰基衍生物、拓撲異構酶抑制劑、哈米特林(hemiasterlin)、三尖杉鹼酯(cephalotaxine)、高三尖杉酯鹼(homoharringtonine)、吡咯并苯并二吖呯二聚物(pyrrolobenzodiazepine dimer, PBD)、官能化吡咯并苯并二吖庚因駢(functionalized pyrrolobenzodiazepene)、卡奇黴素(calicheamicin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉烷(taxane)、及長春花生物鹼(vinca alkoid)。 可共軛至本文中所述之任何可活化之細胞介素構築體的非限制性例示性放射性製劑包括： 123I、 89Zr、 125I、 131I、 99mTc、 201T1、 62Cu、 18F、 68Ga, 13N、 15O、 38K、 82Rb、 111In、 133Xe、 11C、及 99mTc(鎝)。 可共軛至本文中所述之任何ACC的非限制性例示性重金屬包括：鋇、金、及鉑。 可共軛至本文中所述之任何ACC的非限制性例示性抗黴漿菌劑包括：泰樂菌(tylosine)、奇黴素(spectinomycin)、鏈黴素B、青黴素、胺苯磺醯胺、多黏桿菌素(polymyxin)、及氯黴素(chloramphenicol)。 所屬技術領域具有通常知識者將認可大量可能的部份可共軛至本文中所述之任何可活化之細胞介素構築體。共軛可包括將結合二個分子的任何化學反應，只要ACC及另一個部份皆保留其各自活性即可。共軛可包括許多化學機制，例如，共價結合、親和力結合、嵌入、配位結合、及複合作用。在一些具體實施例中，較佳的結合係共價結合。共價結合可藉由現有側鏈之直接縮合或藉由外部橋接分子之併入來達成。許多二價或多價連接劑可用於共軛本文中所述之任何可活化之細胞介素構築體。舉例而言，共軛可包括有機化合物，諸如硫酯、碳二亞胺、琥珀醯亞胺酯、戊二醛(glutaraldehyde)、重氮苯(diazobenzene)、及己二胺。在一些具體實施例中，可活化之細胞介素構築體可包括，或以其他方式引入一或多個非天然存在的胺基酸殘基以提供適用於共軛之部位。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，劑及/或共軛物係藉由雙硫鍵(例如半胱胺酸分子上之雙硫鍵)附接至(多個)細胞介素蛋白質。由於許多癌症自然釋放高水平的麩胱甘肽(一種還原劑)，存在於癌性組織微環境中之麩胱甘肽可還原雙硫鍵，隨後在遞送部位處釋放劑及/或共軛物。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，當共軛物在目標部位(例如，患病組織(例如，癌性組織))內在補體存在下結合至其目標時，將共軛物及/或劑附接至連接子的醯胺鍵或酯鍵被切割，導致該共軛物及/或該劑呈其活性形式之釋放。此等共軛物及/或劑當投予至個體時，將完成該共軛物及/或該劑在目標部位處(例如。患病組織(例如，癌性組織))之遞送及釋放。此等共軛物及/或劑對本文中所述之任何共軛物及/或劑之體內遞送特別有效。 在一些具體實施例中，連接子不被補體系統之酶切割。舉例而言，由於補體活化最終溶解目標細胞，所以共軛物及/或劑係在沒有補體活化之情況下釋放。在此類具體實施例中，共軛物及/或劑將被遞送至目標細胞(例如，激素、酶、皮質類固醇、神經傳導物、或基因)。此外，連接子受血清蛋白酶切割輕度影響，因此共軛物及/或劑在目標部位處將緩慢地釋放。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，共軛物及/或劑經設計使得該共軛物及/或劑被遞送至目標部位(例如，患病組織(例如，癌性組織))但該共軛物及/或劑不被釋放。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，共軛物及/或劑係直接或經由不可切割之連接子附接至細胞介素蛋白質。例示性不可切割之連接子包括胺基酸(例如，D-胺基酸)、肽、及其他有機化合物，其可經修飾以包括可隨後藉由本文中所述之方法附接至細胞介素中所用之官能基。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，ACC包括至少一個用於劑之共軛點。在一些具體實施例中，所有可能的共軛點皆可用於與劑的共軛。在一些具體實施例中，一或多個共軛點包括但不限於參與雙硫鍵之硫原子、參與鏈間雙硫鍵之硫原子、參與鏈間雙硫鍵之硫原子但不是參與鏈內雙硫鍵之硫原子、及/或半胱胺酸之硫原子或含有硫原子之其他胺基酸殘基。在此類情況下，殘基可天然存在於蛋白質構築體中或可使用方法(包括但不限於非天然存在的胺基酸之定點誘變、化學轉換、或錯誤併入)併入到蛋白質構築體中。 本揭露亦提供用於製備共軛用之ACC的方法及材料。在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，ACC經修飾以包括一或多個鏈間雙硫鍵。舉例而言，ACC中之雙硫鍵可在暴露於還原劑後經歷還原，該等還原劑諸如但不限於TCEP、DTT、或β-巰基乙醇。在一些情況下，雙硫鍵之還原僅係部分的。如本文中所使用，術語部分還原係指其中ACC與還原劑接觸且所有可能的共軛部位中之一部分經歷還原(例如，並非所有雙硫鍵均還原)的狀態。在一些具體實施例中，在與還原劑接觸後若少於99%，(例如，少於98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或少於5%)的所有可能的共軛部位被還原，則可活化之細胞介素構築體係部分地還原。在一些具體實施例中，將具有一或多個鏈間雙硫鍵之還原的ACC共軛至對游離硫醇基具有反應性的藥物。 本揭露亦提供用於將治療劑共軛至ACC上之特定位置的方法及材料。在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，ACC經修飾使得治療劑可在ACC上之特定位置處共軛至ACC。舉例而言，ACC可以促進共軛至ACC之方式部分地還原。在此類情況下，ACC之部分還原係以ACC中之共軛部位不會被還原之方式發生。在一些具體實施例中，ACC上之(多個)共軛部位經選擇以促使劑在蛋白質構築體上之特定位置處共軛。當用還原劑處理時，各種因素可能影響ACC之「還原水平」。例如但不限於，還原劑與ACC之比率、培育之時間、培育溫度、及/或還原反應溶液之pH可能需要最佳化以便用本文中所述之方法及材料達成ACC之部分還原。任何適當因素之組合(例如，還原劑與ACC之比率、與還原劑培育之時間及溫度、及/或還原劑之pH)皆可用於達成ACC之部分還原(例如，可能的共軛部位之一般還原或在特定共軛部位處之還原)。 還原劑與ACC之有效比率可係至少部分地以允許共軛至劑的方式還原ACC(例如，可能的共軛部位之一般還原或在特定共軛部位處之還原)的任何比率。在一些具體實施例中，還原劑與ACC之比率將在約20:1至1:1、約10:1至1:1、約9:1至1:1、約8:1至1:1、約7:1至1:1、約6:1至1:1、約5:1至1:1、約4:1至1:1、約3:1至1:1、約2:1至1:1、約20:1至1:1.5、約10:1至1:1.5、約9:1至1:1.5、約8:1至1:1.5、約7:1至1:1.5、約6:1至1:1.5、約5:1至1:1.5、約4:1至1:1.5、約3:1至1:1.5、約2:1至1:1.5、約1.5:1至1:1.5、或約 1:1至1:1.5之範圍內。在一些具體實施例中，比率係在約5:1至1:1之範圍內。在一些具體實施例中，比率係在約5:1至1.5:1之範圍內。在一些具體實施例中，比率係在約4:1至1:1之範圍內。在一些具體實施例中，比率係在約4:1至1.5:1之範圍內。在一些具體實施例中，比率係在約8:1至1:1範圍內。在一些具體實施例中，比率係在約2.5:1至1:1之範圍內。 用還原劑處理ACC之有效培育時間及溫度可係以允許將劑共軛至ACC之方式至少部分地還原ACC(例如，可能的共軛部位之一般還原或在特定共軛部位處之還原)的任何時間及溫度。在一些具體實施例中，處理ACC之培育時間及溫度將在37℃下約1小時至在37℃下約12小時之範圍內(或其中任何子範圍)。 用還原劑處理ACC之還原反應的有效pH可係以允許將劑共軛至ACC之方式至少部分地還原ACC(例如，可能的共軛部位之一般還原或在特定共軛部位處之還原)的任何pH。 當部分還原之ACC與含有硫醇基之劑接觸時，該劑可共軛至ACC中之鏈間硫醇基。劑可使用含硫醇基之試劑(例如，半胱胺酸或N-乙醯基半胱胺酸)以包括硫醇基之方式來修飾。舉例而言，ACC可以所欲之還原劑與ACC之比率與還原劑(例如，TEPC)在約37℃下培育約1小時後被部分地還原。還原劑與ACC之有效比率可係以允許共軛含硫醇基之劑的方式部分地還原位在ACC中之至少二個鏈間雙硫鍵(例如，可能的共軛部位之一般還原或在特定共軛部位處之還原)的任何比率。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，ACC係藉由還原劑以避免還原任何鏈內雙硫鍵之方式來還原。在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，ACC係藉由還原劑以避免還原任何鏈內雙硫鍵並還原至少一個鏈間雙硫鍵之方式來還原。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，ACC亦可包括共軛至ACC之劑。在一些具體實施例中，共軛之劑係治療劑。 在一些具體實施例中，劑(例如，共軛至可活化之細胞介素構築體的劑)係可偵測之部份，諸如例如標記或其他標誌物。舉例而言，劑係或包括放射性標記之胺基酸、可被標誌之親和素(avidin)(例如，含有螢光素標誌物或酶活性之鏈黴親和素，其可藉由光學或量熱方法偵測到)偵測之一或多個生物素基(biotinyl)部份、一或多種放射性同位素或放射性核素(radionuclide)、一或多種螢光標記、一或多種酶標記、及/或一或多種化學發光劑。在一些具體實施例中，可偵測之部份係藉由間隔物分子來附接。 在一些具體實施例中，劑(例如，共軛至可活化之細胞介素構築體的細胞毒性劑)係使用碳水化合物部份、氫硫基、胺基、或羧酸酯基連接至ACC。 在一些具體實施例中，劑(例如，共軛至可活化之細胞介素構築體的細胞毒性劑)係經由共軛部份共軛至ACC。共軛部份可包含本文中所述之(多種)連接子及(多種)CM，以及其他類型的分子。在一些具體實施例中，劑(例如，共軛至可活化之細胞介素構築體的細胞毒性劑)係共軛至ACC中之半胱胺酸或離胺酸。在一些具體實施例中，劑(例如，共軛至可活化之細胞介素構築體的細胞毒性劑)係共軛至ACC之另一個殘基，諸如本文中所揭示之彼等殘基。在一些具體實施例中，共軛部份係含硫醇基之共軛部份。 所屬技術領域具有通常知識者將認識到，各式各樣的可能的部份可偶合至本揭露之ACC。(參見例如「Conjugate Vaccines」, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)，其全部內容以引用方式併入本文中)。大致上，劑(例如，細胞毒性劑)與ACC之有效共軛可藉由將使劑結合至ACC同時亦允許劑及ACC保留功能性的任何化學反應來完成。 在一些具體實施例中，可使用各種雙官能蛋白質偶合劑以將劑共軛至ACC，該等雙官能蛋白質偶合劑包括但不限於N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇基)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(iminothiolane) (IT)、亞胺酯之雙官能衍生物(例如，二甲基己二亞胺酸酯HCL (dimethyl adipimidate HCL))、活性酯(例如，雙琥珀醯亞胺基辛二酸酯(disuccinimidyl suberate))、醛類(例如，戊二醛(glutareldehyde))、雙疊氮化合物(例如，雙-(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(例如，雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如，甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙活性氟化合物(例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)中所述製備。在一些具體實施例中，碳14標記之1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)螯合劑可用於將放射性核苷酸共軛至ACC。(參見例如，WO94/11026)。 共軛部份之實施例描述於文獻中。(參見例如，Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res.44:201-208 (1984)描述使用MBS (M-順丁烯二醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯))。亦參見美國專利第5,030,719號描述使用藉由寡肽連接子之方式偶合至ACC的鹵化乙醯基醯肼衍生物。在一些具體實施例中，合適的共軛部份包括：(i) EDC (1-乙基-3-(3-二甲基胺基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；(ii) SMPT (4-琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(Pierce Chem. Co., Cat. (21558G)；(iii) SPDP (琥珀醯亞胺基-6 [3-(2-吡啶基二硫基)丙醯胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co., Cat #21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP (磺基琥珀醯亞胺基6 [3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]己酸酯(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G)；及(v)共軛至EDC之磺基-NHS(N-羥基磺基-琥珀醯亞胺：Pierce Chem. Co., Cat. #24510)。額外共軛部份包括SMCC、磺基-SMCC、SPDB、或磺基-SPDB。 上述共軛部份含有具有不同屬性的組分，因此導致具有不同物理化學性質之共軛物。舉例而言，烷基羧酸酯之磺基-NHS酯比芳族羧酸酯之磺基-NHS酯更穩定。含有NHS-酯之共軛部份比磺基-NHS酯溶解度更低。此外，共軛部份SMPT含有立體阻礙(sterically-hindered)之雙硫鍵，且可形成具有增加之穩定性的共軛物。雙硫鍵聯通常比其他鍵聯更不穩定，因為雙硫鍵聯在體外被切割，導致可獲得較少的共軛物。特定而言，磺基-NHS可增強碳二亞胺偶合之穩定性。碳二亞胺偶合(諸如EDC)當與磺基-NHS搭配使用時形成比單獨的碳二亞胺偶合反應更耐水解的酯。 在任何ACC之一些具體實施例中，可使用被包括在ACC之胺基酸序列中之經修飾之胺基酸序列將劑共軛至ACC。藉由在ACC之胺基酸序列內之特定位置處***能夠共軛之胺基酸(conjugation-enabled amino acid)，蛋白構築體可經設計以控制共軛劑(例如，細胞毒性劑)之放置及/或劑量。舉例而言，ACC可經修飾以在第一單體、第二單體、及/或第三單體上之位置包括半胱胺酸胺基酸殘基，該半胱胺酸胺基酸殘基提供反應性硫醇基且不會負面地影響蛋白質摺疊及/或組裝，並且不會改變細胞介素與其結合配偶體之結合。在一些具體實施例中，ACC可經修飾以在ACC之胺基酸序列內包括一或多種非天然存在的胺基酸殘基以提供合適的共軛部位。在一些具體實施例中，ACC可經修飾以在ACC之胺基酸序列內包括可酶活化之肽序列。 核酸本文中提供核酸，其包括編碼本文中所述之任何ACC之第一單體構築體(或第一單體構築體之蛋白質部分)(例如，本文中所述之任何第一單體構築體)、第二單體構築體(或第二單體構築體之蛋白質部分)(例如，本文中所述之任何第二單體構築體)、及第三單體構築體(或第三單體構築體之蛋白質部分)(例如，本文中所述之任何第三單體構築體的序列。在一些具體實施例中，核酸組一起編碼第一單體構築體(或第一單體構築體之蛋白質部分)、第二單體構築體(或第二單體構築體之蛋白質部分)、及第三單體構築體(或第三單體構築體之蛋白質部分)。在一些具體實施例中，編碼第一單體構築體(或第一單體構築體之蛋白質部分)之核酸序列係與編碼第二單體構築體(或第二單體構築體之蛋白質部分)之核酸序列至少70%一致性(例如，至少72%一致、至少74%一致、至少76%一致、至少78%一致、至少80%一致、至少82%一致、至少84%一致、至少86%一致、至少88%一致、至少90%一致、至少92%一致、至少94%一致、至少96%一致、至少98%一致、至少99%一致、或100%一致)。在一些具體實施例中，編碼第一單體構築體(或第一單體構築體之蛋白質部分)之核酸序列係與編碼第三單體構築體(或第三單體構築體之蛋白質部分)之核酸序列至少70%一致性(例如，至少72%一致、至少74%一致、至少76%一致、至少78%一致、至少80%一致、至少82%一致、至少84 %一致、至少86%一致、至少88%一致、至少90%一致、至少92%一致、至少94%一致、至少96%一致、至少98%一致、至少99%一致、或100%一致)。在一些具體實施例中，編碼第二單體構築體(或第二單體構築體之蛋白質部分)之核酸序列係與編碼第三單體構築體(或第三單體構築體之蛋白質部分)之核酸序列至少70%一致性(例如，至少72%一致、至少74%一致、至少76%一致、至少78%一致、至少80%一致、至少82%一致、至少84 %一致、至少86%一致、至少88%一致、至少90%一致、至少92%一致、至少94%一致、至少96%一致、至少98%一致、至少99%一致、或100%一致)。 載體本文中提供載體及載體組，其包括本文中所述之任何核酸。所屬技術領域中具有通常知識者將能夠選擇合適的載體或載體組(例如，表現載體)來製造本文中所述之ACC，並使用載體或載體組以表現本文中所述之任何ACC。舉例而言，因為(多種)載體可能需要能夠整合到細胞之染色體中且/或在其中複製，所以在選擇載體或載體組時必需考慮到細胞。可用於產生ACC之例示性載體亦描述於下。 如本文中所使用，術語「載體(vector)」係指能夠在細胞(例如，本文中所述之任何細胞)中誘導表現重組蛋白質(例如，第一或第二單體)的多核苷酸。「載體」能夠將核酸及其片段遞送到宿主細胞中，且包括調控序列(例如，啟動子、增強子、聚(A)訊息)。可將外源性多核苷酸***到表現載體中以便進行表現。術語「載體(vector)」亦包括人工染色體、質體、反轉錄病毒、及桿狀病毒載體。 用於構築包括本文中所述之任何核酸及適用於轉形細胞(例如，哺乳動物細胞)的合適載體之方法係所屬技術領域中眾所週知的。參見例如，Sambrook et al., Eds. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 2 ndEd., Cold Spring Harbor Press, 1989及Ausubel et al., Eds.“Current Protocols in Molecular Biology,” Current Protocols, 1993。 載體之非限制性實施例包括質體、轉位子、黏質體、及病毒載體(例如，任何腺病毒載體(例如，pSV或pCMV載體)、腺相關之病毒(AAV)載體、慢病毒載體、及反轉錄病毒載體)、及任何Gateway®載體。載體可例如包括足夠進行表現之順式作用元件(cis-acting element)；進行表現之其他元件可由宿主哺乳動物細胞或於體外表現系統中供給。熟練的從業人員將能夠選擇用於製造本文中所述之任何ACC之合適的載體及哺乳動物細胞。 在本文中所述之任何ACC的一些具體實施例中，ACC可使用重組DNA技術並在真核或原核物種中表現之生物合成方式製造。 在一些具體實施例中，載體包括編碼本文中所述之任何ACC之第一單體及第二單體的核酸。在一些具體實施例中，載體係表現載體。 在一些具體實施例中，載體組一起包括一起編碼本文中所述之任何ACC之第一、第二、及第三單體構築體的核酸組。在一些具體實施例中，載體對係表現載體組。 細胞本文中亦提供宿主細胞，其包括本文中所述之任何載體或載體組，該(等)載體或載體組包括本文中所述之任何核酸。 本文中所述之任何ACC可由任何細胞(例如，哺乳動物細胞)所產生。在一些具體實施例中，宿主細胞係哺乳動物細胞(例如，人類細胞)、囓齒動物細胞(例如，小鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞、或豚鼠細胞)、或非人靈長類動物細胞。 將核酸及載體(例如，本文中所述之任何載體及任何載體組)引入到細胞中之方法係所屬技術領域中已知的。可用於將核酸引入到細胞中的非限制性實施例包括：脂質轉染、轉染、磷酸鈣轉染、陽離子型聚合物轉染、病毒轉導(例如，腺病毒轉導、慢病毒轉導)、奈米粒子轉染、及電穿孔。 在一些具體實施例中，引入步驟包括向細胞中引入載體(例如，本文中所述之任何載體或載體組)，其包括編碼構成本文中所述之任何ACC的單體的核酸。 在本文中所述之任何方法的一些實施例中，細胞可係真核細胞。如本文中所使用，術語「真核細胞(eukaryotic cell)」係指具有明顯、帶膜細胞核(membrane-bound nucleus)的細胞。此類細胞可包括，例如，哺乳動物(例如，囓齒動物、非人靈長類動物、或人類)、昆蟲、真菌、及植物細胞。在一些具體實施例中，真核細胞係酵母細胞，諸如啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)。在一些具體實施例中，真核細胞係高等真核細胞，諸如哺乳動物、家禽、植物、或昆蟲細胞。哺乳動物細胞之非限制性實施例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞及人類胎腎細胞(例如，HEK293細胞)。 在一些具體實施例中，細胞含有編碼本文中所述之ACC中任一者之第一單體及第二單體的核酸。在一些具體實施例中，細胞含有一起編碼本文中所述之任何ACC之第一單體及第二單體的核酸對。 產生可活化之細胞介素構築體之方法本文中提供產生本文中所述之任何ACC之方法，其包括：(a)在足以產生ACC之條件下於液體培養基中培養本文中所述之任何重組宿主細胞；及(b)從宿主細胞及/或液體培養基中回收ACC。 培養細胞之方法係所屬技術領域中眾所週知的。細胞可在利於細胞增殖、細胞分化及細胞生長之條件下在體外維持。舉例而言，細胞可藉由使細胞(例如，本文中所述之任何細胞)與包括足以支持細胞活力及生長的必需生長因子及補充劑的細胞培養基接觸來培養。 在本文中所述之任何方法的一些實施例中，方法進一步包括單離回收之細胞。單離方法之非限制性實施例包括：硫酸胺沉澱法、聚乙二醇沉澱法、粒徑排阻層析法、配體親和力層析法、離子交換層析法(例如，陰離子或陽離子)、及疏水***互作用層析法。 在本文中所述之任何方法的一些實施例中，方法進一步包括將單離之ACC調配成醫藥組成物。各種配方係所屬技術領域中已知並於本文中描述。本文中所述之任何單離之ACC可經調配用於任何投予途徑(例如，靜脈內、腫瘤內、皮下、皮內、口服(例如，吸入)、經皮(例如，外用、穿黏膜、或肌內)。 本文中亦提供由本文中所述之任何方法所產生之ACC。亦提供組成物(例如，醫藥組成物)，其包括由本文中所述之任何方法所產生之任何ACC。本文中亦提供套組，其包括本文中所述之任何組成物(例如，醫藥組成物)之至少一個劑量。 在一些具體實施例中，ACC可包含可用於ACC之純化、單離、及/或偵測的一或多種標籤。此類標籤包括親和力標籤，諸如His標籤(例如，6X-His(六組胺酸(hexahistidine))標籤)、FLAG標籤、c-Myc標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase, GST)標籤、麥芽糖-結合蛋白質(maltose-binding protein, MBP)標籤、鈣調素-結合蛋白質(calmodulin-binding protein, CBP)標籤、及基於鏈黴親和素/生物素之標籤。在此等追蹤下，ACC可使用(多種)標籤單離或純化。在一些實施例中，標籤可從ACC中移除。 在一些具體實施例中，產生過程中所使用之細胞可產生第一、第二、及第三單體構築體之蛋白質部分(例如，具有一或多種親和力標籤)。然後單體可以非共價方式締合形成三聚體。在其中三個單體係相同的情況下，細胞可產生單體構築體(例如，具有一或多種親和力標籤)。然後單體可以非共價方式締合形成同三聚體。 可純化在本文中之細胞中表現之ACC。可使用親和力管柱執行純化，例如，HSA-親和力管柱、或鏈黴親和素-親和力管柱、或與上述標籤相容的其他管柱。來自親和力管柱之樣本可藉由其他層析法技術來進一步純化，例如，粒徑排阻層析法(SEC)。純化之ACC可具有至少80%、90%、95%、或99%之純度。 治療之方法本文中提供治療個體之疾病(例如，癌症(例如，本文中所述之任何癌症))之方法，其包括向個體投予治療有效量的本文中所述之任何ACC、核酸、載體、包含該等ACC、核酸、及/或該等載體之組成物。 如本文中所使用，術語「個體(subject)」係指任何生物體諸如哺乳動物。在一些具體實施例中，個體係貓科動物(例如，貓)、犬科動物(例如，狗)、馬科動物(例如，馬)、兔、豬、囓齒動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠或豚鼠)、非人靈長類動物(例如，猿猴(例如，猴子(例如，狒狒、狨猿)、或猿類(例如，黑猩猩、大猩猩、紅毛猩猩、或長臂猿))、或人類。在一些具體實施例中，個體係人類。 在一些具體實施例中，個體先前已經被確認或診斷為患有疾病(例如，癌症(例如，本文中所述之任何癌症))。 如本文中所使用，術語「治療(treat)」包括降低個體(例如，本文中所述之任何個體)之疾病(例如，癌症(例如，本文中所述之任何癌症))之一或多種(例如，1、2、3、4、或5種)症狀或徵象之嚴重性、頻率或數量。在其中疾病係癌症之一些具體實施例中，治療導致在患有癌症之個體中降低癌症生長、抑制癌症進展、抑制癌症轉移、或降低癌症復發之風險。 在本文中所述之任何方法的一些實施例中，疾病係癌症。本文中亦提供治療有其需要之個體(例如，本文中所述或所屬技術領域中已知之任何例示性個體)之方法，其包括向個體投予治療有效量的本文中所述之任何ACC或本文中所述之任何組成物(例如，醫藥組成物)。 在此等方法之一些具體實施例中，個體已經被確認或診斷為患有癌症。癌症之非限制性實施例包括：實體腫瘤、血液腫瘤、肉瘤、骨肉瘤(osteosarcoma)、神經膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、B-細胞贅生瘤、多發性骨髓瘤、淋巴瘤(例如，B-細胞淋巴瘤、B-細胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin’s lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤)、白血病(例如，毛細胞白血病、慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞性白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL))、骨髓增生不良症候群(myelodysplastic syndromes, MDS)、卡波西氏肉瘤、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、胃癌、泌尿道上皮癌(urothelial carcinoma)、肺癌、腎細胞癌、胃及食道癌、胰臟癌、***癌、腦癌、結腸癌、骨癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巢癌、鼻咽腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀細胞頭頸癌(squamous cell head and neck carcinoma)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、及肝細胞癌。在一些具體實施例中，癌症係淋巴瘤。在一些具體實施例中，淋巴瘤係伯奇氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma0。在一些態樣中，個體已經被確認或診斷為患有家族性癌症症候群諸如利-弗梅尼症候群(Li Fraumeni syndrome)、家族性乳癌-卵巢癌(familial breast-ovarian cancer)(BRCA1或BRAC2突變)症候群等。所揭示之方法亦可用於治療非實體癌症。例示性實體腫瘤包括各種器官系統之惡性腫瘤(例如，肉瘤、腺癌、及癌)，諸如肺、***、淋巴、胃腸道(例如，結腸)、及泌尿生殖(例如，腎、泌尿道上皮、或睪丸腫瘤)道、咽喉、***、及卵巢之惡性腫瘤。例示性腺癌包括結腸直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺之非小細胞癌、及小腸癌。 由國家癌症研究所所描述之例示性癌症包括：急性淋巴母細胞性白血病，成人；急性淋巴母細胞性白血病，兒童；急性骨髓性白血病，成人；腎上腺皮質癌；腎上腺皮質癌，兒童；AIDS相關之淋巴瘤；AIDS相關之惡性腫瘤；肛門癌(Anal Cancer)；星狀細胞瘤，兒童小腦；星狀細胞瘤，兒童大腦；膽管癌，肝外；膀胱癌；膀胱癌，兒童；骨癌，骨肉瘤/惡性纖維性組織細胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma)；腦幹神經膠質瘤(Brain Stem Glioma)，兒童；腦腫瘤，成人；腦腫瘤，腦幹神經膠質瘤，兒童；腦腫瘤，小腦星狀細胞瘤，兒童；腦腫瘤，大腦星狀細胞瘤/惡性神經膠質瘤，兒童；腦腫瘤，室管膜瘤(Ependymoma)，兒童；腦腫瘤，神經管胚細胞瘤(medulloblastoma)，兒童；腦腫瘤，幕上原始神經外胚層腫瘤(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumor)，兒童；腦腫瘤，視覺路徑及下視丘神經膠質瘤(Visual Pathway and Hypothalamic Glioma)，兒童；腦腫瘤，兒童(其他)；乳癌；乳癌及懷孕；乳癌，兒童；乳癌，男性；支氣管腺瘤/類癌(Bronchial Adenomas/Carcinoid)，兒童；類癌腫瘤(Carcinoid Tumor)，兒童；類癌腫瘤，胃腸道；癌，腎上腺皮質(Adrenocortical)；癌，胰島細胞(Islet Cell)；原發性未知癌；中樞神經系統淋巴瘤，原發性；小腦星形細胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)，兒童；大腦星狀細胞瘤/惡性神經膠質瘤(Cerebral Astrocytoma/Malignant Glioma)，兒童；子宮頸癌；兒童癌症；慢性淋巴細胞性白血病；慢性骨髓性白血病(Chronic Myelogenous Leukemia)；慢性骨髓性增生病症；腱鞘透明細胞肉瘤(Clear Cell Sarcoma of Tendon Sheath)；結腸癌；結腸直腸癌，兒童；皮膚T細胞淋巴瘤；子宮內膜癌；室管膜瘤，兒童；上皮癌，卵巢；食道癌；食道癌，兒童；尤文氏家族腫瘤(Ewing's Family of Tumor)；顱外生殖細胞腫瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)，兒童；性腺外生殖細胞腫瘤(Extragonadal Germ Cell Tumor)；肝外膽管癌；眼癌，眼球內黑色素瘤(Intraocular Melanoma)；眼癌，視網膜母細胞瘤(Retinoblastoma)；膽囊癌(Gallbladder)；胃癌；胃癌，兒童；胃腸道類癌瘤(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)；生殖細胞腫瘤，顱外，兒童；生殖細胞腫瘤，性腺外；生殖細胞腫瘤，卵巢；妊娠滋養細胞腫瘤(Gestational Trophoblastic Tumor)；神經膠質瘤，兒童腦幹；神經膠質瘤，兒童視覺路徑及下視丘；毛細胞白血病；頭頸癌；肝細胞(肝)癌，成人(原發性)；肝細胞(肝)癌，兒童(原發性)；霍奇金氏淋巴瘤，成人；霍奇金氏淋巴瘤，兒童；懷孕期間之霍奇金氏淋巴瘤；下嚥癌(Hypopharyngeal Cancer)；下視丘及視覺路徑神經膠質瘤，兒童；眼球內黑色素瘤；胰島細胞癌(內分泌胰臟(Endocrine Pancreas))；卡波西肉瘤；腎癌；喉癌(Laryngeal Cancer)；喉癌，兒童；白血病，急性淋巴母細胞性，成人；白血病，急性淋巴母細胞性，兒童；白血病，急性骨髓性，成人；白血病，急性骨髓性，兒童；白血病，慢性淋巴細胞性；白血病，慢性骨髓性；白血病，毛細胞；唇及口腔癌(Lip and Oral Cavity Cancer)；肝癌，成人(原發性)；肝癌，兒童(原發性)；肺癌，非小細胞；肺癌，小細胞；淋巴母細胞性白血病，成人急性；淋巴母細胞性白血病，兒童急性；淋巴細胞性白血病，慢性；淋巴瘤，AIDS相關；淋巴瘤，中樞神經系統(原發性)；淋巴瘤，皮膚T細胞；淋巴瘤，霍奇金氏，成人；淋巴瘤，霍奇金氏，兒童；淋巴瘤，懷孕期間之霍奇金氏；淋巴瘤，非霍奇金氏，成人；淋巴瘤，非霍奇金氏，兒童；淋巴瘤，懷孕期間之非霍奇金氏；淋巴瘤，原發性中樞神經系統；巨球蛋白血症(Macroglobulinemia)，華氏(Waldenstrom)；男性乳癌；惡性間皮瘤(Malignant Mesothelioma)，成人；惡性間皮瘤，兒童；惡性胸腺瘤(Malignant Thymoma)；神經管胚細胞瘤，兒童；黑色素瘤；黑色素瘤，眼球內；默氏細胞癌(Merkel Cell Carcinoma)；間皮瘤(Mesothelioma)，惡性；具隱匿原發性之轉移性鱗狀頸癌(Metastatic Squamous Neck with Occult Primary)；多發性內分泌腫瘤症候群(Multiple Endocrine Neoplasia Syndrome)，兒童；多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤(Plasma Cell Neoplasm)；蕈狀肉芽腫(Mycosis Fungoides)；骨髓化生不良症候群(Myelodysplastic Syndrome)；骨髓性白血病，慢性；骨髓白血病，兒童急性；骨髓瘤，多發性；骨髓增生性病症，慢性；鼻腔及副鼻竇癌(Nasal Cavity and Paranasal Sinus)；鼻咽癌；鼻咽癌，兒童；神經胚細胞瘤；非霍奇金氏淋巴瘤，成人；非霍奇金氏淋巴瘤，兒童；懷孕期間之非霍奇金氏淋巴瘤；非小細胞肺癌；口腔癌，兒童；口腔及唇癌；口咽癌(Oropharyngeal Cancer)；骨之骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤(Osteosarcoma/Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone)；卵巢癌，兒童；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性度腫瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)；胰腺癌；胰腺癌，兒童；胰腺癌，胰島細胞；副鼻竇及鼻腔癌(Paranasal Sinus and Nasal Cavity Cancer)；副甲狀腺癌；陰莖癌；嗜鉻細胞瘤(Pheochromocytoma)；松果體及幕上原始神經外胚層腫瘤(Pineal and Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumor)，兒童；腦下垂體瘤腫(Pituitary Tumor)；漿細胞瘤/多發性骨髓瘤(Plasma Cell Neoplasm/Multiple Myeloma)；胸膜肺母細胞瘤(Pleuropulmonary Blastoma)；懷孕及乳癌；懷孕及霍奇金氏淋巴瘤；懷孕及非霍奇金氏淋巴瘤；原發性中樞神經系統淋巴瘤；原發性肝癌，成人；原發性肝癌，兒童；***癌；直腸癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌，兒童；腎盂及輸尿管(Renal Pelvis and Ureter)，移行細胞癌(Transitional Cell Cancer)；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)，兒童；唾液腺癌(Salivary Gland Cancer)；唾液腺癌，兒童；肉瘤，尤文氏家族腫瘤；肉瘤，卡波西氏(Kaposi's)；肉瘤；骨之肉瘤(骨肉瘤)及惡性纖維組織(Sarcoma (Osteosarcoma)/Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone)；肉瘤，橫紋肌肉瘤，兒童；肉瘤，軟組織，成人；肉瘤，軟組織，兒童；西紮利氏症候群(Sezary Syndrome)；皮膚癌；皮膚癌，兒童；皮膚癌(黑色素瘤)；皮膚癌，默氏細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤，成人；軟組織肉瘤，兒童；具隱匿性原發性之鱗狀頸癌，轉移性；胃(胃)癌；胃(胃)癌，兒童；幕上原始神經外胚層腫瘤，兒童；T細胞淋巴瘤，皮膚；睾丸癌；胸腺瘤，兒童；胸腺瘤，惡性；甲狀腺癌；甲狀腺癌，兒童；腎盂及輸尿管之移行細胞癌；滋養細胞腫瘤(Trophoblastic Tumor)，妊娠；原發部位不明癌，兒童；兒童之不尋常癌症；輸尿管及腎盂，移行細胞癌；尿道癌(Urethral Cancer)；子宮肉瘤(Uterine Sarcoma)；***癌(Vaginal Cancer)；視覺路徑和下視丘神經膠質瘤，兒童；陰門癌(Vulvar Cancer)；華氏巨球蛋白血症；及威爾姆斯腫瘤(Wilms' Tumor)。 進一步例示性癌性包括瀰漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)及被套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)。 亦可根據本文中所述之方法治療或預防前述癌症之轉移。 在一些具體實施例中，此等方法可導致個體之癌症之一或多種症狀的數量、嚴重性、或頻率降低(例如，相較於治療前個體之癌症之一或多種症狀的數量、嚴重性、或頻率)。 在一些具體實施例中，治療個體之疾病(例如，癌症)之方法可包含將本文中之(多種)ACC、(多種)核酸、(多種)載體與一或多種免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1及/或PD-L1)組合投予。免疫檢查點抑制劑可係針對PD-1或PD-L1之抗體，例如，下表3中者。 在本文中所述之任何方法的一些具體實施例中，方法進一步包括向個體投予額外治療劑(例如，表3中所列之治療劑中之一或多者)。 表 3. 額外治療劑
抗體商品名稱 ( 抗體名稱 ) 目標
Raptiva™(依法利珠單抗(efalizumab)) CD11a
Arzerra™(歐福杜單抗(ofatumumab)) CD20
Bexxar™(托西莫單抗(tositumomab)) CD20
Gazyva™(阿托珠單抗(obinutuzumab)) CD20
Ocrevus™(歐瑞珠單抗(ocrelizumab)) CD20
Rituxan™(利妥昔單抗(rituximab)) CD20
Zevalin™(休賽坦-替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)) CD20
Adcetris™(維多汀-貝倫妥單抗(brentuximab vedotin)) CD30
Myelotarg™(吉妥珠單抗(gemtuzumab)) CD33
Mylotarg™(奧唑米星-吉妥珠單抗(gemtuzumab ozogamicin)) CD33
(伐達妥昔單抗(vadastuximab)) CD33
(他立林-伐達妥昔單抗(vadastuximab talirine)) CD33
Campath™(阿侖單抗(alemtuzumab)) CD52
Lemtrada™(阿侖單抗(alemtuzumab)) CD52
Tactress™(塔托單抗(tamtuvetmab)) CD52
Soliris™(依庫珠單抗(eculizumab)) 補體C5
Ultomiris™(拉夫珠單抗(ravulizumab)) 補體C5
(奧侖達珠單抗(olendalizumab)) 補體C5
Yervoy TM(伊匹單抗(ipilimumab)) CTLA-4
(曲美木單抗(tremelimumab)) CTLA-4
Orencia™(阿巴西普(abatacept)) CTLA-4
Hu5c8 CD40L
(依拓珠單抗(letolizumab)) CD40L
 Rexomun™(鄂托默單抗(tumaxomab)) CD3/Her2
Erbitux™(西妥昔單抗(cetuximab)) EGFR
Portrazza™(耐昔妥珠單抗(necitumumab)) EGFR
Vectibix™(帕尼單抗(panitumumab)) EGFR
CH806 EGFR
(迪妥昔珠單抗(depatuxizumab)) EGFR
(瑪汀-迪妥昔珠單抗(depatuxizumab mafodotin)) EGFR
(弗妥昔單抗:莫多妥昔單抗(futuximab:modotuximab)) EGFR
ICR62(伊姆加土珠單抗(imgatuzumab)) EGFR
(拉普妥昔單抗(laprituximab)) EGFR
(羅妥昔珠單抗(losatuxizumab)) EGFR
(維多汀-羅妥昔珠單抗(losatuxizumab vedotin)) EGFR
mAb 528 EGFR
(馬妥珠單抗(matuzumab)) EGFR
(尼妥珠單抗(nimotuzumab)) EGFR
(托木妥昔單抗(tomuzotuximab)) EGFR
(紮魯姆單抗(zalutumumab)) EGFR
MDX-447 EGFR/CD64
(阿德木單抗(adecatumumab)) EpCAM
Panorex™(依決洛單抗(edrecolomab)) EpCAM
Vicinium™ EpCAM
Synagis™(帕利珠單抗(palivizumab)) RSV之F蛋白質
ReoPro™(阿昔單抗(abiciximab)) 醣蛋白受體IIb/IIIa
Herceptin™(曲妥珠單(trastuzumab)) Her2
Herceptin™ Hylecta(曲妥珠單；透明質酸酶(trastuzumab; Hyaluronidase)) Her2
(德盧替康-曲妥珠單抗(trastuzumab deruxtecan)) Her2
(維多汀-妥珠單抗(hertuzumab verdotin)) Her2
Kadcyla™(曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)) Her2
(馬妥昔單抗(margetuximab)) Her2
(替米妥珠單抗(timigutuzumab)) Her2
Xolair™(奧馬珠單抗(omalizumab)) IgE
(利格珠單抗(ligelizumab)) IgE
(非妥木單抗(figitumumab)) IGF1R
(替妥木單抗(teprotumumab)) IGF1R
Simulect™(巴厘昔單抗basiliximab)) IL2R
Zenapax™(達利珠單抗(daclizumab)) IL2R
Zinbryta™(達利珠單抗(daclizumab)) IL2R
Actemra™(托珠單抗(tocilizumab)) IL-6受體
Kevzara™(薩利魯單抗(sarilumab)) IL-6受體
(沃巴厘珠單抗(vobarilizumab)) IL-6受體
Stelara™(優特克單抗(ustekinumab)) IL-12/IL-23
Tysabri™(那他珠單抗(natalizumab)) 整合素α4
(阿布利尤單抗(abrilumab)) 整合素α4
   Jagged 1或Jagged 2
(法西單抗(fasinumab)) NGF
(弗拉奴單抗(fulranumab)) NGF
(他尼珠單抗(tanezumab)) NGF
   Notch，例如，Notch 1
匹地珠單抗(Pidilizumab) δ樣-1 (Delta like-1)(PD-1路徑抑制劑)
Opdivo®(納武單抗(nivolumab)) PD1
Keytruda®(派姆單抗(pembrolizumab)) PD1
Libtayo®(西米普利單抗(cemiplimab)) PD1
BGB-A317(替雷利珠單(tislelizumab)) PD1
PDR001(斯帕利珠單抗(spartalizumab)) PD1
JNJ-63723283(西曲利單抗(cetrelimab)) PD1
TSR042(多斯達利單抗dostarlimab)) PD1
AGEN2034(巴提利單抗(balstilimab)) PD1
JS001(特瑞普利單抗(toripalimab)) PD1
IOBI308(辛替單抗(sintilimab)) PD1
BCD100(普羅高單(prolgolimab)) PD1
CBT-501(傑諾珠單(genolimzumab)) PD1
ABBV181 布地格單抗(budigalimab) PD1
AK105 PD1
BI-754091 PD1
INCSHR-1210 PD1
MEDI0680 PD1
MGA012 PD1
SHR-1210 PD1
Imfinzi™ 德瓦魯單抗(durvalumab) PD-L1
Tecentriq® 阿特珠單抗(atezolizumab) PD-L1
Bavencio®(艾維路單抗(avelumab)) PD-L1
KN035(恩沃利單抗(envafolimab)) PD-L1
BMS936559 (MDX1105) PD-L1
BGBA 333 PD-L1
FAZ053 PD-L1
LY-3300054 PD-L1
SH-1316 PD-L1
AMP-224 PD-L2
(巴維昔單抗(bavituximab)) 磷脂醯絲胺酸
huJ591 PSMA
RAV12 RAAG12
Prolia™(地諾單抗(denosumab)) RANKL
GC1008(夫蘇木單抗(fresolimumab)) TGFβ
Cimzia™(聚乙二醇化賽妥珠單抗(Certolizumab Pegol)) TNFα
Remicade™(英利昔單抗(infliximab)) TNFα
Humira™(阿達木單抗(adalimumab)) TNFα
Simponi™ (戈利木單抗(golimumab)) TNFα
Enbrel™(依那西普(etanercept)) TNF-R
(馬帕木單抗(mapatumumab)) TRAIL-R1
Avastin™(貝伐單抗(bevacizumab)) VEGF
Lucentis™(蘭尼單抗(ranibizumab)) VEGF
(布羅珠單抗(brolucizumab)) VEGF
(伐努賽珠單抗(vanucizumab)) VEGF
組成物 / 套組本文中亦提供組成物(例如，醫藥組成物)，其包括本文中所述之任何ACC、核酸、及/或載體及一或多種(例如，1、2、3、4、或5種)醫藥上可接受之載劑(例如，本文中所述之任何醫藥上可接受之載劑)、稀釋劑、或賦形劑。 在一些具體實施例中，包括本文中所述之任何ACC、核酸、及/或載體的組成物(例如，醫藥組成物)可置於無菌小瓶或預先裝載之注射器中。 在一些具體實施例中，包括本文中所述之任何ACC的組成物(例如，醫藥組成物)可經調配用於不同的投予途徑(例如，靜脈內、皮下、肌內、腹膜內、或腫瘤內)。 在一些具體實施例中，本文中所述之任何醫藥組成物可包括一或多種緩衝劑(例如，中性緩衝生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS))、胺基酸(例如，甘胺酸)、一或多種碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖、或甘露醇)、一或多種抗氧化劑、一或多種螫合劑(例如，EDTA或麩胱甘肽)、一或多種防腐劑、及/或醫藥上可接受之載劑(例如，抑菌水、PBS、或生理食鹽水)。 如本文所使用，片語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」係指與醫藥投予相容之任何及所有溶劑、分散介質、膜衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑等。合適的載劑包括但不限於：水、生理食鹽水、林格氏溶液(ringer’s solution)、葡萄糖溶液、及約5%人類血清白蛋白。 在本文中所述之任何醫藥組成物的一些具體實施例中，本文中所述之任何ACC係與能防止從身體快速消除的載劑一起製備，例如，包括植入物及微膠囊遞送系統(microencapsulated delivery system)之持續釋放及控制釋放配方。可使用可生物分解性、生物相容性聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯(polyorthoester)、及聚乳酸。製備此等醫藥組成物及配方之方法對所屬技術領域中具有通常知識者而言係顯而易見的。 本文中亦提供套組，其包括本文中所述之任何ACC、包括本文中所述之任何ACC的任何組成物、或包括本文中所述之任何ACC的任何醫藥組成物。亦提供套組，其除本文中所述之ACC之外亦包括選自表3之一或多種第二治療劑。(多種)第二治療劑可以與ACC分開的劑量投予形式(dosage administration form)提供。替代地，(多種)第二治療劑可與ACC一起調配。 本文中所述之任何套組包括使用本文中所述之任何組成物(例如，醫藥組成物)及/或任何ACC的說明。在一些具體實施例中，套組可包括執行本文中所述之任何方法的說明。在一些具體實施例中，套組可包括本文中所述之任何組成物(例如，醫藥組成物)之至少一個劑量。在一些具體實施例中，套組可提供用於投予本文中所述之任何醫藥組成物的注射器。 [實施例] 本發明在下列實施例中進一步描述，該等實施例不會限制申請專利範圍中所述之本發明的範疇。 實施例 1 ：用不可切割之 HSA 空間遮蔽物 (steric mask) 工程改造之 LIGHT 細胞介素構築體之活性細胞介素構築體LIGHT-21linker_HSA_Myc_cMyc (ProC1184)係藉由重組方法來製備。此構築體之1 st、2 nd及3 rd單體構築體係一致的，且各具有圖2A中所示之胺基酸序列(SEQ ID NO: 102)。1 st、2 nd及3 rd單體構築體之各者從N端至C端包含來自小鼠IgGκ訊息序列的經修飾之訊息序列(SEQ ID NO: 78)、對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質(即，人類LIGHT之胞外結構域(ectodomain)，對應於SEQ ID NO: 79之殘基85至240)、具有SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的不可切割之連接子、人類血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO: 56)、具有SGG之不可切割之連接子、及具有SEQ ID NO: 59之Myc標籤序列。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 103之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，LIGHT-21linker_HSA_cMyc。使用HSA-親和力管柱(例如，POROS CaptureSelect HSA樹脂)，(若有需要)接著為粒徑排阻層析法(SEC)來純化表現之三聚體多肽，以獲得至少95%純度之三聚體蛋白質。檢定的最終細胞介素構築體不包括訊息序列。 細胞介素構築體LIGHT-10GS- Strep (Proc1188) 亦係藉由重組方法來製備。此CC之1 st、2 nd及3 rd單體構築體係一致的，且各係具有圖2A中所示之胺基酸序列(SEQ ID NO: 86)。1 st、2 nd及3 rd單體構築體之各者從N端至C端包含來自小鼠IgGκ訊息序列的經修飾之訊息序列(SEQ ID NO: 78)、對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質、具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的不可切割之連接子、及Strep標籤序列(SEQ ID NO: 60)。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 87之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，LIGHT-10GS-Strep。使用鏈黴親和素-親和力管柱(例如，鏈黴親和素瓊脂糖樹脂)，(若有需要)接著為粒徑排阻層析法(SEC)來純化表現之三聚體多肽，以獲得至少95%純度之三聚體蛋白質。檢定的最終細胞介素構築體不具有訊息序列。 LIGHT細胞介素之活性係使用基於HVEM細胞之檢定及基於淋巴毒素β受體細胞之檢定(A375 IL-8 ELISA)來評估，如下述。 各細胞介素構築體之活性係在體外使用表現螢火蟲螢光素酶基因之重組人類HVEM/NF-kB報導子Jurkat細胞株(BPS Biosciences #79310)來測試。將細胞在補充有10% HI FBS(熱去活化之胎牛血清)及1% Pen/Strep(青黴素-鏈黴素)之RPMI 1640培養基中培養。將LIGHT添加至此等細胞中使HVEM受體活化，並隨後發訊息給NF-kB轉錄因子以結合至誘導螢光素酶報導子基因轉錄所需之DNA元件。可使用ONE-Glo螢光素酶檢定系統(可商購自Promega)來定量螢光素酶報導子基因之表現。 LIGHT-反應性(LIGHT-responsive) Jurkat HVEM/NF-kB螢光素酶報導子細胞係於補充有10% HI FBS之RPMI 1640培養基(ThermoFisher Scientific，例如目錄號11875093)中以390,000個細胞/mL之濃度製備，並將90 μL等分試樣吸量到白色平底96孔盤之孔(35,000個細胞/孔)中。將測試之細胞介素於補充有10% HI FBS之RPMI 1640培養基中稀釋成450nM之起始濃度。製備雙份的四倍連續稀釋液，從其中取10 μL添加至各孔。將盤以250rpm振盪1至2分鐘，然後放置於37℃培育箱中4小時。在4小時培育後，將盤從培育箱中移出，並使其平衡至室溫。ONE-Glo螢光素酶試劑係藉由將ONE-Glo檢定緩衝劑之內容物轉移至凍乾之ONE-Glo檢定受質中並倒置直到該受質徹底溶解為止來製備。將15mL等分試樣的試劑儲存在-20℃下，並在檢定當天在無直接光下解凍至室溫。一旦試劑及盤平衡至室溫，將100 μL等分試樣的ONE-Glo螢光素酶試劑吸量到盤之各孔中。在遮擋直接光下將盤放置於250rpm之盤振盪器上1-2分鐘。在徹底混合之後，使用Tecan Infinite M Plex多模式盤讀取器來測量螢光素酶表現。使用GraphPad Prism軟體生成劑量反應曲線並藉由S形擬合(sigmoidal fit)非線性迴歸來獲得EC50值。 使用A375細胞(具有高淋巴毒素β受體(LTbR)表現之人類黑色素瘤細胞株)於體外測試各細胞介素構築體之活性。將細胞在補充有10% HI FBS及1% Pen/Strep之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)培養基中培養。將LIGHT添加至此等細胞中使LTbR活化，該LTbR調節各種發炎訊息，包括IL-8之分泌。可使用人類IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA套組(R&D Systems, Catalog # DY208)來測量由LTbR-活化之A375細胞的IL-8分泌。 A375細胞係於補充有10% HI FBS之DMEM培養基中以400,000個細胞/mL之濃度製備，並將100 μL等分試樣吸量到透明、平底96孔盤之孔(40,000個細胞/孔)中。將盤在37℃下培養3至5小時。在培育後，將測試之細胞介素於補充有10% HI FBS之DMEM培養基中稀釋成5nM或400nM之起始濃度。製備雙份的四倍連續稀釋液，從其中取100 μL添加至各孔。輕輕敲打盤以混合，然後放置於37℃培育箱中整夜。在同一天，將另一個透明、平底96孔盤用100 μL的IL-8捕捉抗體推薦稀釋液(提供於R&D Systems IL-8 ELISA套組中)塗佈。然後將盤蓋住並在室溫下培育整夜。第二天，藉由按照R&D IL-8 ELISA套組中提供之規程來分析IL-8之產生。一旦完成，使用分光光度計在450 nm下測量IL-8水平。使用GraphPad Prism軟體生成劑量反應曲線並藉由S形擬合非線性迴歸來獲得EC50值。 在圖相較於LIGHT構築體ProC1188(用短的不可切割之Strep標籤工程改造)，2A及2B中之數據顯示構築體ProC1184(在其C末端處用不可切割之HSA部份工程改造)之活性降低。此數據表明不可切割之HSA部份提供立體阻礙、阻斷LIGHT與其受體之嚙合、及下游訊息傳導之活化。從HVEM檢定結果及淋巴毒素β受體檢定計算出ProC1184及ProC1188之EC50值並分別提供於下表4及表5中。 表4. EC50 [nM]：HVEM報導子檢定 表5. EC50 [pM]：淋巴毒素β受體報導子檢定 上表4中之數據表明ProC1184極高的(例如，大於10 6倍(一百萬倍))遮蔽效率，其係藉由比較在HVEM報導子檢定中對照ProC1188三聚體之EC50與遮蔽之ProC1184之EC50計算出。 實施例 2 ：用可切割之親和力肽遮蔽物工程改造之 LIGHT 細胞介素構築體之活性細胞介素構築體ProC_mLm16_1490_LIGHT-10GS-Strep (ProC1192)係藉由重組方法來製備。此ACC之1 st、2 nd及3 rd單體構築體係一致的，且各係具有圖3A中所示之胺基酸序列(SEQ ID NO: 88)。1 st、2 nd及3 rd單體構築體之各者從N端至C端包含來自經修飾之小鼠IgGκ訊息序列的訊息序列(SEQ ID NO: 78)、頭部序列(SEQ ID NO: 76)、具有SEQ ID NO: 61之序列的親和力遮蔽肽、具有SEQ ID NO: 68之序列的連接子、具有SEQ ID NO: 62之序列的可切割之部份、具有GGS之序列的連接子、對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質(即，人類LIGHT之胞外結構域，對應於SEQ ID NO: 79之殘基85至240)、具有SEQ ID NO: 66之序列的不可切割之連接子、及Strep標籤序列(SEQ ID NO: 60)。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 89之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，ProC_mLm16_1490_LIGHT-10GS-Strep。測定的最終細胞介素構築體不具有訊息序列。 在圖3A及3B中之數據顯示，相較於用短的不可切割之Strep標籤工程改造的LIGHT構築體ProC1188，在其N末端處用可切割之親和力肽遮蔽物工程改造的ACC ProC1192之LIGHT活性降低。此數據表明可切割之親和力肽遮蔽物藉由阻斷LIGHT與其受體之嚙合、及下游訊息傳導之活化來提供有效遮蔽。 為切割親和力肽遮蔽物，將含LIGHT之ACC在37℃下用重組人類蛋白酶(諸如尿激酶型血漿蛋白原活化因子(urokinase-type plasminogen activator, uPA))處理整夜。從此等檢定(圖3A及圖3B)之結果表明將含LIGHT之ACC用蛋白酶處理可使活性恢復到與沒有用遮蔽部份(無親和力肽遮蔽物或HSA部份)工程改造之LIGHT細胞介素可相比的水平。 從HVEM檢定結果及淋巴毒素β受體檢定計算出ProC1192及ProC1188之EC50值並分別提供於下表6及表7中。 表6. EC50 [nM]：HVEM報導子檢定 表7. EC50 [pM]：淋巴毒素β受體報導子檢定 上表6中之數據表明ProC1192之遮蔽效率為大於20倍，其係藉由比較在HVEM報導子檢定中對照ProC1188三聚體或蛋白酶活化之ProC1192的EC50與遮蔽之ProC1184的EC50計算出。 實施例 3 ：用可切割之親和力肽遮蔽物及不可切割之 HSA 空間遮蔽部份工程改造之 LIGHT 細胞介素構築體之活性細胞介素構築體ProC_mLm-16_1490_LIGHT_21linker _HSA-cMyc (ProC1163)係藉由重組方法來製備。此CC之1 st、2 nd及3 rd單體構築體係一致的，且各係具有SEQ ID NO: 130所示之胺基酸序列的多肽。1 st、2 nd及3 rd單體構築體之各者從N端至C端包含來自經修飾之小鼠IgGκ訊息序列的訊息序列(SEQ ID NO: 78)、頭部序列(SEQ ID NO: 76)、具有SEQ ID NO: 61之序列的遮蔽肽、具有SEQ ID NO: 68之序列的連接子、具有SEQ ID NO: 62之序列的可切割之部份、具有GGS之序列的連接子、對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質(即，人類LIGHT之胞外結構域，對應於SEQ ID NO: 79之殘基85至240)、具有SEQ ID NO: 65之不可切割之連接子、人類血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO: 56)、具有SGG之序列的不可切割之連接子及Myc標籤序列(SEQ ID NO: 59)。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 131之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，ProC_mLm-16_1490_LIGHT-21linker_HSA_cMyc。使用HSA-親和力管柱(例如，POROS CaptureSelect HSA樹脂)，(若有需要)接著為粒徑排阻層析法(SEC)來純化表現之三聚體多肽，以獲得至少95%純度之三聚體蛋白質。檢定的最終細胞介素構築體不具有訊息序列。 在圖4A及4B中之數據顯示，相較於用不可切割之HSA部份工程改造的LIGHT構築體ProC1184，在其C末端處用不可切割之HSA部份及在其N末端處用可切割之親和力肽工程改造的ACC ProC1163之LIGHT活性降低。此數據表明不可切割之HSA部份及可切割之親和力肽可各自獨立地降低LIGHT活性。其亦表明可組合兩種方法以進一步降低LIGHT訊息傳導活性。圖4C類似地顯示相較於LIGHT構築體ProC1184(不可切割之HSA部份)，ACC ProC1163(除不可切割之HSA部份之外還具有肽遮蔽物)之LIGHT活性降低，並且uPa蛋白酶活化之ProC1163 ACC的LIGHT活性被恢復到與ProC1184構築體可相比的水平。ProC1184及ProC1163兩者展示之LIGHT活性皆低於對照ProC1188構築體(用短的不可切割之Strep標籤工程改造)之LIGHT活性。 實施例 4 ：用可切割之親和力肽遮蔽物及可切割之 HSA 空間遮蔽部份工程改造之 LIGHT 可活化之細胞介素構築體之活性細胞介素構築體ProC_LIGHT-1204DNI-HSA-His (ProC1491)係藉由重組方法來製備。此ACC之1 st、2 nd及3 rd單體構築體係一致的，且各係具有圖5A中所示之胺基酸序列(SEQ ID NO: 90)。1 st、2 nd及3 rd單體構築體之各者從N端至C端包含來自小鼠IgGκ訊息序列的經修飾之訊息序列(SEQ ID NO: 78)、對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質(即，人類LIGHT之胞外結構域，對應於SEQ ID NO: 79之殘基85至240)、具有SEQ ID NO: 64的連接子、具有SEQ ID NO: 63的可切割之部份、具有GS之序列的連接子、人類血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO: 56)、具有S之序列的連接子、及具有SEQ ID NO: 58的His標籤。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 91之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，ProC_LIGHT-1204DNI-HSA-His。檢定的最終細胞介素構築體不具有訊息序列。 細胞介素構築體ProC_mLm16-LIGHT-1204DNI-HSA-His (ProC1492)係藉由重組方法來製備。此ACC之1 st、2 nd及3 rd單體構築體係一致的，且各係具有圖5A中所示之胺基酸序列(SEQ ID NO: 92)。1 st、2 nd及3 rd單體構築體之各者從N端至C端包含來自小鼠IgGκ訊息序列的經修飾之訊息序列(SEQ ID NO: 78)、SEQ ID NO: 76的頭部序列、具有SEQ ID NO: 61之序列的遮蔽肽、具有SEQ ID NO: 68之序列的連接子、具有SEQ ID NO: 81之序列的可切割之部份、具有GGS之序列的連接子、對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質(即，人類LIGHT之胞外結構域，對應於SEQ ID NO: 79之殘基85至240)、具有SEQ ID NO: 64的連接子、具有SEQ ID NO: 63的可切割之部份、序列GS之連接子、人類血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO: 56)、具有序列S的連接子、及具有SEQ ID NO: 58之序列的His標籤。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 93之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，ProC_mLm16-LIGHT-1204DNI-HSA-His。檢定的最終細胞介素構築體不具有訊息序列。 圖5A中之數據顯示，在HVEM報導子檢定中，相較於在其C末端處僅含有可切割之HSA部份(單遮蔽)之LIGHT ProC1491之活性，在其N末端處含有可切割之肽遮蔽物及在其C末端含有可切割HSA部份(雙遮蔽)之LIGHT ProC1492之活性進一步降低。當被uPa蛋白酶活化後，ProC1491及ProC1492失去其遮蔽潛能並恢復了LIGHT細胞介素活性。 圖5B中之數據顯示在淋巴毒素β受體檢定(A375 IL-8 ELISA)中，相較於未遮蔽之LIGHT ProC1189，ProC1491及ProC1492兩者皆具有降低之活性。當被uPa蛋白酶活化後，ProC1491及ProC1492兩者恢復之活性類似於LIGHT ProC1189。 從HVEM檢定結果及淋巴毒素β受體檢定計算出ProC1491及ProC1492之EC50值並分別提供於下表8及表9中。 表8. EC50 [nM]：HVEM報導子檢定 表9. EC50 [pM]：淋巴毒素β受體報導子檢定 總而言之，此等數據指示HVEM及淋巴毒素β受體兩者路徑之LIGHT活化可藉由將可切割之肽親和力遮蔽物(親和力遮蔽部份)及可切割之HSA部份(空間遮蔽部份)之任一或組合添加至LIGHT蛋白質中來降低。當蛋白酶活化後，LIGHT恢復其全部訊息傳導潛能。 實施例 6. 額外細胞介素構築體之體外表徵額外可活化之細胞介素構築體亦藉由重組方法製備。此等ACC之1 st、2 nd及3 rd單體構築體係一致的。 在一些ACC中，HSA部份經工程改造在LIGHT之N末端,，而親和力肽遮蔽物經工程改造在LIGHT之C末端。 細胞介素構築體ProC_cMyc-HSA-21GS-1204DNI-LIGHT (ProC1497) (SEQ ID NO: 120)從N端至C端包含來自小鼠IgGκ訊息序列的經修飾之訊息序列(SEQ ID NO: 78)、具有GSG之序列的連接子、及具有SEQ ID NO: 59之序列的Myc標籤、具有G之序列的連接子、人類血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO: 56)、具有SEQ ID NO: 64的連接子、具有SEQ ID NO: 63的可切割之部份、具有GS的連接子、及對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質(即，人類LIGHT之胞外結構域，對應於SEQ ID NO: 79之殘基85至240)。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 121之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，ProC_cMyc-HSA-21GS-1204DNI-LIGHT。檢定的最終細胞介素構築體不具有訊息序列。 細胞介素構築體ProC_cMyc-HSA-21GS-1204DNI-LIGHT-mLm16 (ProC1498) (SEQ ID NO: 126)從N端至C端包含來自經修飾之小鼠IgGκ訊息序列的訊息序列(SEQ ID NO: 78)、具有GSG之序列的連接子、具有SEQ ID NO: 59的Myc標籤、具有G之序列的連接子、人類血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO: 56)、具有SEQ ID NO: 64的連接子、具有SEQ ID NO: 63的可切割之部份、具有GS的連接子、對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質(即，人類LIGHT之胞外結構域，對應於SEQ ID NO: 79之殘基85至240)、具有SEQ ID NO: 75的連接子、具有SEQ ID NO: 62的可切割之部份、具有SEQ ID NO: 68的連接子、及具有SEQ ID NO: 61之序列的遮蔽肽。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 127之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，ProC_cMyc-HSA-21GS-1204DNI- LIGHT-mLm16。檢定的最終細胞介素構築體不具有訊息序列。 在圖6A中所示之數據顯示，在HVEM報導子檢定中，相較於沒有遮蔽物之LIGHT ProC1189，在其N末端處用可切割之HSA部份工程改造的ACC ProC1497之活性、或在其N末端處用可切割之HSA部份及在其C末端處用可切割之親和力肽遮蔽物工程改造的ACC ProC1498之活性顯著降低。相較於ProC1497之活性，ProC1498之活性進一步降低。其亦表明可組合在LIGHT之C末端或N末端處添加肽親和力遮蔽物及HSA部份以進一步降低LIGHT訊息傳導路徑。當被uPa蛋白酶活化後，ProC1497及ProC1498兩者恢復之活性類似於LIGHT ProC1189。 從HVEM檢定結果計算出之ProC1497及ProC1498之EC50值提供於下表10中。 表10. EC50 [nM]：HVEM報導子檢定 上表10中之數據表明ProC1497之遮蔽效率為22倍(22X)，其係藉由比較在HVEM報導子檢定中完整ProC1497 ACC之EC50與uPa蛋白酶切割之(活化之)ProC1497 ACC之EC50計算出。表10中之數據表明ProC1498極高的(例如，大於10 6倍(一百萬倍))遮蔽效率，其係藉由比較在HVEM報導子檢定中完整ProC1498 ACC之EC50與uPa蛋白酶切割之(活化之)ProC1498 ACC之EC50計算出。遮蔽之ACC ProC1498之EC50值未檢出(n.d.)乃因在HVEM報導子檢定中所測試之濃度下未偵測到細胞介素活性。 在一些ACC中，HSA部份及親和力肽遮蔽物經工程改造在LIGHT之相同末端(N端或C端)上，使得可切割單一個可切割之部份(CM)即移除HSA部份及親和力肽遮蔽物兩者。 細胞介素構築體ProC_cMyc-HSA-mLm16-1490DNI-LIGHT (ProC1488) (SEQ ID NO: 124)從N端至C端包含來自經修飾之小鼠IgGκ訊息序列的訊息序列(SEQ ID NO: 78)、具有GSG之序列的連接子、具有SEQ ID NO: 59的Myc標籤、具有G之序列的連接子、人類血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO: 56)、具有SEQ ID NO: 67的連接子、具有序列(SEQ ID NO: 76)的頭部、具有SEQ ID NO: 61之序列的親和力遮蔽肽、具有SEQ ID NO: 68的連接子、具有SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的可切割之部份、具有GGS的連接子、及對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 125之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，ProC_ cMyc-HSA-mLm16-1490DNI-LIGHT。檢定的最終細胞介素構築體不具有訊息序列。 細胞介素構築體ProC_LIGHT-1490DNI-mLm16-HSA-cMyc (ProC1489)從N端至C端包含來自小鼠IgGκ訊息序列的經修飾之訊息序列(SEQ ID NO: 122)、對應於截短之人類LIGHT多肽(SEQ ID NO: 54)的成熟細胞介素蛋白質(即，人類LIGHT之胞外結構域，對應於SEQ ID NO: 79之殘基85至240)、具有SEQ ID NO: 75的連接子、具有SEQ ID NO: 62的可切割之部份、具有SEQ ID NO: 68的連接子、具有SEQ ID NO: 61的遮蔽肽、具有SEQ ID NO: 66的連接子、人類血清白蛋白(HSA)序列(SEQ ID NO: 56)、具有S之序列的連接子、具有SEQ ID NO: 59的Myc標籤。多肽係藉由將宿主細胞用具有SEQ ID NO: 123之序列的多核苷酸轉形，接著培養所得之重組宿主細胞來製備。將所得之表現多肽三聚化，產出細胞介素構築體，ProC_ LIGHT-1490DNI-mLm16-HSA-cMyc。檢定的最終細胞介素構築體不具有訊息序列。 在HVEM檢定中評估ACC ProC1488及ProC1489之活性。圖6B中之數據顯示當HSA部份及親和力肽遮蔽物經工程改造在LIGHT之相同末端(N端或C端)上時，LIGHT活性相較於未遮蔽之LIGHT ProC1189明顯降低。當被uPa蛋白酶活化後，ProC1488及ProC1489恢復之活性類似於LIGHT ProC1189。 從HVEM檢定結果計算出之ProC1488及ProC1489之EC50值提供於下表11中。 表11. EC50 [nM]：HVEM報導子檢定 遮蔽之ACC ProC1488及ProC1489之EC50值未檢出(n.d.)乃因在HVEM報導子檢定中所測試之濃度下未偵測到細胞介素活性。此表明LIGHT細胞介素之遮蔽十分有效。上表11中之數據表明ProC1488極高的(例如，大於10 6倍(一百萬倍))遮蔽效率，其係藉由比較在HVEM報導子檢定中完整ProC1488 ACC之EC50與uPa蛋白酶切割之(活化之)ProC1488 ACC之EC50計算出。表11中之數據表明大於10^6(一百萬倍)之ProC1489的極高的(例如，大於10 6倍(一百萬倍))遮蔽效率，其係藉由比較在HVEM報導子檢定中完整ProC1489 ACC之EC50與uPa蛋白酶切割之(活化之)ProC1489 ACC之EC50計算出。 實施例 7. 人類 - 小鼠交叉反應性 LIGHT ACC 之體外表徵Tang et al. (Cancer Cell. 2016 Mar 14; 29(3):285-296)先前已有報導在人類LIGHT (SEQ ID No: 55)中有4個點突變，其保留與人類HVEM及淋巴毒素β受體的結合但賦予與小鼠HVEM及淋巴毒素β受體的結合。 ACC ProC1486 (ProC_mhLIGHT_1204DNI_HSA-cMyc)及ProC1487 (ProC_mLm-16_mhLIGHT_1204DNI_HSA-cMyc)已分別經類似於ProC1491及ProC1492之方式工程改造，其中不同之處在於ProC1486及ProC1487含有對應於具有4個點突變之人類LIGHT之胞外結構域(Tang et al.)的成熟細胞介素蛋白質並將C端連接子(SGG)及cMyc標籤(SEQ ID NO: 59)替代存在於ProC1491及1492上之連接子及His標籤。ProC1491及1492含有對應於人類LIGHT之胞外結構域的未突變之成熟細胞介素蛋白質。 藉由流動式細胞測量術來評估ProC1486及ProC1487與小鼠及人類淋巴毒素β受體之結合。使用MC38細胞株來評估與小鼠受體的結合。使用A375細胞株來評估與人類受體的結合。用PE-共軛之抗人類CD258 (LIGHT)抗體[Biolegend目錄號318706殖株：T5-39]偵測ProC1486或ProC1487與小鼠或人類受體之嚙合。圖7A中之數據顯示ProC1486與ProC1487並未結合至A375或MC38。當用uPa蛋白酶處理後，ProC1486及ProC1487兩者皆恢復與人類及小鼠淋巴毒素β受體的結合。其表明用可切割之HSA部份及/或可切割之肽親和力遮蔽物工程改造的人/小鼠LIGHT ACC具有降低之與小鼠或人類淋巴毒素β受體的結合或不與其結合。當蛋白酶活化後，結合恢復。 ACC ProC1486及ProC1487之活性如前述係在HVEM報導子檢定及A375-IL8報導子檢定中評估。 圖7B及圖7C中之數據顯示，ProC1486及ProC1487之活性在HVEM檢定中幾乎消滅而在淋巴毒素β受體檢定中降低。在淋巴毒素β受體檢定中，相較於僅用HSA部份工程改造之ProC1486，用肽親和力遮蔽物及HSA部份兩者工程改造之ProC1487之活性進一步降低。此數據表明，用於降低人類LIGHT活性之相同肽親和力遮蔽物及HSA部份可用於降低人類-小鼠交叉反應性LIGHT ACC之活性。在用uPa蛋白酶活化後，ProC1486及ProC1487之活性皆顯著增加。 ACC ProC2076 (ProC_cMyc-HSA-mLm16-1490-mhLIGHT)已經類似於ProC1488之方式工程改造，其中不同之處在於ProC2076含有對應於具有4個點突變之人類LIGHT之胞外結構域的成熟細胞介素蛋白質(Tang et al., Cancer Cell. 2016 Mar 14; 29(3):285-296)。 在小鼠HVEM報導子檢定中評估ACC ProC1486、ProC1487及ProC2076之活性。小鼠HVEM報導子細胞株係藉由用小鼠HVEM質體(Origene, #MC212911)轉染NF-kB luc-報導子HEK-293 (BPS Bioscience, #60650)來生成。細胞係使用Lipofectamine™ 2000轉染試劑(ThermoFisher, # 11668019)來轉染。使用0.8mg/mL Geneticin (ThermoFisher, #10131035)來選擇表現小鼠HVEM之細胞。 細胞係在補充有10% HI FBS(熱去活化之胎牛血清)1% Pen/Strep(青黴素-鏈黴素)、非必需胺基酸(ThermoFisher, #11140050)、丙酮酸鈉(ThermoFisher, #J61840.18)、50ug/mL濕黴素B (hygromycin B) (Thermofisher, #10687010)及0.8mg/mL建那黴素(geneticin) (ThermoFisher, #10131035)之MEM培養基中培養。將人類-小鼠交叉反應性LIGHT添加至此等細胞中使小鼠HVEM受體活化，並隨後發訊息給NF-kB轉錄因子以結合至誘導螢光素酶報導子基因轉錄所需之DNA元件。使用ONE-Glo螢光素酶檢定系統(可商購自Promega)來定量螢光素酶報導子基因之表現。 LIGHT-反應性Jurkat HVEM/NF-kB螢光素酶報導子細胞係於補充有10% HI FBS之DMEM培養基(ThermoFisher Scientific，例如目錄號10564011)中以每孔20,000個細胞接種於白色平底96孔盤中。在整夜培育之後，將培養基吸出。將測試之細胞介素於補充有10% HI FBS之DMEM培養基中稀釋成25nM之起始濃度。製備雙份的五倍連續稀釋液，從其中取100 μL添加至各孔。將盤以250rpm振盪1至2分鐘，然後放置於37℃培育箱中4小時。在5小時培育後，將盤從培育箱中移出，並使其平衡至室溫。ONE-Glo螢光素酶試劑係藉由將ONE-Glo檢定緩衝劑之內容物轉移至凍乾之ONE-Glo檢定受質中並倒置直到該受質徹底溶解為止來製備。將15mL等分試樣的試劑儲存在-20℃下，並在檢定當天在無直接光下解凍至室溫。一旦試劑及盤平衡至室溫，將100 μL等分試樣的ONE-Glo螢光素酶試劑吸量到盤之各孔中。在遮擋直接光下將盤放置於250rpm之盤振盪器上1至2分鐘。在徹底混合之後，使用Tecan Infinite M Plex多模式盤讀取器來測量螢光素酶表現。使用GraphPad Prism軟體生成劑量反應曲線並藉由S形擬合非線性迴歸來獲得EC50值。 圖8A及圖8B中之數據顯示在HVEM檢定中，ProC1486、ProC1487及ProC2076之活性顯著降低。相較於在其N末端用可切割之HSA部份及親和力肽遮蔽物工程改造之ProC2076，在其C末端用可切割之HSA部份工程改造之ProC2076的活性(圖8A)、在其C末端用可切割之HSA部份及在其N末端用可切割之親和力肽遮蔽物工程改造之ProC1487的活性(圖8B)進一步降低。在用uPa蛋白酶活化後，ProC1486，ProC1487及ProC2076之活性皆顯著增加(圖8A及圖8B)。 實施例 8. 人類 LIGHT ACC 於 HT-29 異種移植小鼠中之體內表徵在HT-29異種移植模型中評估在LIGHT之C末端用可切割之HSA結構域工程改造之人類LIGHT ACC ProC1491、及在LIGHT之C末端用His標籤工程改造之人類LIGHT ProC1189的抗腫瘤體內活性。在HT29及WiDr結腸癌模型中，由其配體淋巴毒素-α/β、LIGHT或促效mAb所誘導之LTβR活化在體內及體外皆觸發IFNg依賴性腫瘤生長抑制(Lukashev et al, Cancer Research, 2006)。 為評估ProC1491及ProC1189之體內抗腫瘤活性，在第0天，在7至8週雌性nu/nu小鼠之側腹中SC注射於100 µL無血清RPMI中之2x10 6個HT29-Luc2腫瘤細胞。當腫瘤達到~60至100 mm 3時，小鼠以1mg/kg之劑量接受各測試物之腹膜內注射。每個動物在第1天、第5天、第8天、第12天、第15天、第19天及第22天接受一劑量的測試物。在研究期間每週兩次記錄體重及腫瘤測量值。小鼠實驗係根據IACUC規程AP303(使用評估抗腫瘤活性之皮下小鼠腫瘤模型及IACUC指引G01：腫瘤模型之管理)來進行。 百分比腫瘤生長抑制(%TGI)係用以下公式計算：TGI (%) = [1 - (處理組之RTV)/(對照組之RTV)]×100 (%)，RTV= (測量當天之腫瘤體積)/(第0天之腫瘤體積)。 圖9中之數據顯示，在HT-29異種移植小鼠模型中，在LIGHT之C末端處用可切割之HSA結構域工程改造之人類LIGHT ACC ProC1491在促進腫瘤生長抑制方面比在LIGHT之C末端處用His標籤工程改造之人類LIGHT ProC1189更有效。相對百分比TGI示於表12中。此表明人類LIGHT ACC ProC1491在誘導腫瘤局限化之抗腫瘤活性方面比人類LIGHT ProC1189更有效。 表12. 在HT-29異種移植小鼠模型中之百分比腫瘤生長抑制： 實施例 9. 人類 - 小鼠交叉反應性 LIGHT ACC 於 MC38 同基因小鼠中之體內表徵使用MC38結腸腺癌同基因小鼠模型來評估人類-小鼠交叉反應性LIGHT ACC ProC1486、ProC1487及ProC2076之抗腫瘤活性。 小鼠實驗係根據IACUC規程AP303(使用評估抗腫瘤活性之皮下小鼠腫瘤模型及IACUC指引G01：腫瘤模型之管理)來進行。 將七至九週齡雌性C57BL/6小鼠植入於無血清培養基中之MC38腫瘤細胞。將LIGHT ACC以單一劑或與小鼠抗PD-1抗體(殖株RPMI1-14；BioXCell，目錄號BP0146)組合之方式給動物腹膜內給藥，並在研究期間每週兩次記錄腫瘤測量值。百分比腫瘤生長抑制(%TGI)係用以下公式計算：TGI (%) = [1 - (處理組之RTV)/(對照組之RTV)]×100 (%)，RTV= (測量當天之腫瘤體積)/(第0天之腫瘤體積)。 在一些實驗中，收集腫瘤及脾臟以評估LIGHT ACC活性之藥效學(pharmacodymanic, PD)生物標誌物。腫瘤樣本係根據Miltenyi腫瘤解離套組(Miltenyi, Cat #130-096-730)加工。脾臟係使用注射器推桿機械式加工，並用ACK裂解緩衝液(ThermoFisher, cat #A1049201)處理以移除紅血球細胞。免疫細胞係藉由流動式細胞測量術使用Attune NxT流式細胞儀(ThermoFisher)來分析。使用Prism軟體繪製流動式細胞測量術數據並分析。 圖10A及圖10B中之數據顯示ProC1486及ProC1487在MC38同基因小鼠模型中具有單一劑抗腫瘤活性(single agent antitumor activity)。當與抗PD-1組合給藥時，ProC1486及ProC1487之抗腫瘤活性進一步增強。ProC2076具有最小的單一劑活性(圖10B)。在MC38同基因小鼠模型中，其抗腫瘤活性亦與抗PD-1抗體組合而增加(圖10B)。 圖11A至圖11B中之數據顯示在MC38同基因小鼠模型中於開始處理後第6天，將ProC1487以單一劑或與抗PD-1抗體組合之方式給藥能夠增加腫瘤微環境中CD8+ T細胞之水平(圖11A)以及藉由CD8+ T細胞促進的Th1細胞介素(IFNγ、TNFα)之產生(圖11B)。ProC1487在脾臟中沒有活性或活性有限，表明ProC1487之活性僅侷限在腫瘤中。在一些情況下，在Prism軟體中使用統計學t-測試(statistical t-test)來分析數據。在圖11A及圖11B中，用星號表示測試顯著性。 表 12. 實施例序列 其他實施例應當理解的是，雖然本發明已搭配其實施方式加以描述，但前述旨在說明而非限制本發明之範疇，本發明之範疇係由隨附申請專利範圍之範疇所定義。其他態樣、優點、及修改仍在下列申請專利範圍之範疇內。
[ 圖 1A]至[ 圖 1H]顯示根據本揭露之一些具體實施例的例示性可活化之細胞介素構築體。圖1A及圖1B繪示採用人類血清白蛋白(HSA)作為空間遮蔽部份的例示性細胞介素構築體。圖1C至圖1D繪示採用肽遮蔽部份的例示性細胞介素構築體。圖1E至圖1H繪示採用空間遮蔽部份及肽遮蔽部份兩者的例示性細胞介素構築體。圖1E及圖1F繪示具有偶合至細胞介素組分之不同側的空間遮蔽部份及親和力遮蔽部份的例示性細胞介素構築體。圖1G及圖1H繪示具有偶合至細胞介素組分之相同側的空間遮蔽部份及親和力遮蔽部份的例示性細胞介素構築體。 [ 圖 2A] 至[ 圖 2B]顯示將HSA空間遮蔽部份添加至LIGHT中降低LIGHT在疱疹病毒入侵介體(HVEM)報導子檢定及基於淋巴毒素β受體細胞之檢定(A375 IL-8 ELISA)兩者中之訊息傳導。 [ 圖 3A] 至[ 圖 3B]顯示將可切割之肽遮蔽物添加至LIGHT中降低LIGHT在HVEM報導子檢定及A375 IL-8 ELISA兩者中之訊息傳導。 [ 圖 4A] 至[ 圖 4C]顯示將可切割之肽遮蔽物添加至LIGHT-HSA之N端中進一步降低LIGHT在HVEM報導子檢定及A375 IL-8 ELISA兩者中之訊息傳導。 [ 圖 5A] 至[ 圖 5B]顯示在HVEM報導子檢定及A375 IL-8 ELISA中，單遮蔽及雙遮蔽之LIGHT可活化之細胞介素構築體之體外活性。 [ 圖 6A]及[圖 6B]顯示額外ACC之體外活性。 [ 圖 7A] 至[ 圖 7D]顯示小鼠-人類交叉反應性LIGHT可活化之細胞介素構築體之體外活性。 [ 圖 8A] 及[ 圖 8B]顯示由HVEM檢定所測定之ProC1486、ProC1487及ProC2076之活性。 [ 圖 9]顯示在LIGHT之C末端處用可切割之HSA結構域工程改造之人類LIGHT ACC ProC1491及在LIGHT之C末端處用His標籤工程改造之人類LIGHT ProC1189之腫瘤生長抑制曲線。 [ 圖 10A] 至[ 圖 10B]顯示在MC38同基因小鼠模型中ProC1486及ProC1487之抗腫瘤活性。 [ 圖 11A] 至[ 圖 11B]中之數據顯示在MC38同基因小鼠模型中於開始處理後第6天，將ProC1487以單一劑或與抗PD-1抗體組合之方式給藥能夠增加腫瘤微環境中CD8+ T細胞之水平(圖11A)以及藉由CD8+ T細胞促進的Th1細胞介素(IFNγ、TNFα)之產生(圖11B)。
TW202334186A_111138606_SEQL.xml

Claims (68)

  1. 一種可活化之細胞介素構築體(ACC)，其包含： 第一單體構築體，其包含第一細胞介素蛋白質(CP1)、第一可切割之部份(CM1)、及第一空間遮蔽部份(SMM1)，其中該CM1係位在該CP1與該SMM1之間； 第二單體構築體，其包含第二細胞介素蛋白質(CP2)、第二可切割之部份(CM2)、及第二空間遮蔽部份(SMM2)，其中該CM2係位在該CP2與該SMM2之間；及 第三單體構築體，其包含第三細胞介素蛋白質(CP3)、第三可切割之部份(CM3)、及第三空間遮蔽部份(SMM3)，其中該CM3係位在該CP3與該SMM3之間， 其中： 該CP1、該CP2、及該CP3彼此結合，從而形成該第一、該第二、及該第三單體構築體之三聚體；及 該SMM1、該SMM2、及該SMM3係球狀分子。
  2. 如請求項1之ACC，其中該CP1、該CP2、及該CP3係相同的細胞介素。
  3. 如請求項2之ACC，其中該細胞介素係腫瘤壞死因子或腫瘤壞死因子超家族之成員。
  4. 如請求項2之ACC，其中該CP1、該CP2及該CP3係腫瘤壞死因子超家族成員14 (TNFSF14)。
  5. 如請求項2之ACC，其中該CP1、該CP2、及該CP3之各者包含與SEQ ID NO: 54至少80%、90%、95%、或99%一致的序列。
  6. 如請求項1至5中任一項或組合之ACC，其中該SMM1、該SMM2、及該SMM3係相同的球狀分子。
  7. 如請求項6之ACC，其中該球狀分子係白蛋白。
  8. 如請求項7之ACC，其中該白蛋白係人類血清白蛋白。
  9. 如請求項7之ACC，其中該白蛋白包含與人類血清白蛋白至少80%、90%、95%、或99%一致的序列。
  10. 如請求項1至9中任一項或組合之ACC，其中該第一單體構築體包含至少一個連接子。
  11. 如請求項10之ACC，其中該至少一個連接子包含設置在該CP1與該CM1之間的連接子L1、及/或在該CM1與該SMM1之間的連接子L2。
  12. 如請求項1至11中任一項或組合之ACC，其中該第二單體構築體包含至少一個連接子。
  13. 如請求項12之ACC，其中該至少一個連接子包含設置在該CP2與該CM2之間的連接子L3、及/或在該CM2與該SMM2之間的連接子L4。
  14. 如請求項1至13中任一項或組合之ACC，其中該第三單體構築體包含至少一個連接子。
  15. 如請求項14之ACC，其中該至少一個連接子包含設置在該CP3與該CM3之間的連接子L5、及/或在該CM3與該SMM3之間的連接子L6。
  16. 如請求項1至15中任一項或組合之ACC，其中： 該第一單體構築體進一步包含第一親和力遮蔽部份(AMM1)及視需要地位在該AMM1與該CP1之間的第四可切割之部份(CM4)， 該第二單體構築體進一步包含第二親和力遮蔽部份(AMM2)及視需要地位在該AMM2與該CP2之間的第五可切割之部份(CM5)，及 該第三單體構築體進一步包含第三親和力遮蔽部份(AMM3)及視需要地位在該AMM3與該CP3之間的第六可切割之部份(CM6)。
  17. 如請求項16之ACC，其中該AMM1、該AMM2、及該AMM3係相同的。
  18. 如請求項16之ACC，其中該AMM1、該AMM2、及該AMM3之各者包含SEQ ID NO: 61之序列。
  19. 如請求項16之ACC，其中該AMM1、該AMM2、及該AMM3之各者包含與SEQ ID NO: 61至少80%、90%、95%、或99%一致的序列。
  20. 如請求項1至19中任一項或組合之ACC，其中該CM1、該CM2、及該CM3包含相同的蛋白酶之受質。
  21. 如請求項1至19中任一項或組合之ACC，其中該CM1、該CM2、及該CM3包含不同蛋白酶之受質。
  22. 如請求項1至19中任一項或組合之ACC，其中該CM1、該CM2、及該CM3之各者包含與SEQ ID NO: 62或63至少95%一致的序列。
  23. 如請求項16至22中任一項或組合之ACC，其中該CM4、該CM5、及該CM6包含相同的蛋白酶之受質。
  24. 如請求項16至22中任一項或組合之ACC，其中該CM4、該CM5、及該CM6包含不同蛋白酶之受質。
  25. 如請求項16至22中任一項或組合之ACC，其中該CM4、該CM5、及該CM6之各者包含與SEQ ID NO: 62或63至少95%一致的序列。
  26. 如請求項20至25中任一項或組合之ACC，其中該(等)蛋白酶係由個體中之腫瘤所產生。
  27. 如請求項20至25中任一項或組合之ACC，其中該(等)蛋白酶係選自由下列所組成之群組：ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、BACE、腎活素(Renin)、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、凋亡蛋白酶1、凋亡蛋白酶2、凋亡蛋白酶3、凋亡蛋白酶4、凋亡蛋白酶5、凋亡蛋白酶6、凋亡蛋白酶7、凋亡蛋白酶8、凋亡蛋白酶9、凋亡蛋白酶10、凋亡蛋白酶14、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2、組織蛋白酶X/Z/P、克魯茲蛋白酶(Cruzipain)、天冬醯胺內肽酶(Legumain)、泛素特異性蛋白酶-2 (Otubain-2)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、安眠蛋白酶(Meprin)、腦啡肽酶(Neprilysin)、PSMA、BMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26、MMP-27、活化蛋白質C (activated protein C)、組織蛋白酶A、組織蛋白酶G、凝乳酶(Chymase)、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、彈性蛋白酶(Elastase)、顆粒酶B (Granzyme B)、胍基苯甲酸蛋白酶(Guanidinobenzoatase)、HtrA1、人類嗜中性球裂解酶、乳鐵蛋白、通道活化蛋白酶(marapsin)、NS3/4A、PACE4、纖維蛋白溶酶(Plasmin)、PSA、tPA、凝血酶(thrombin)、類胰蛋白酶(tryptase)、uPA、DESC1、DPP-4、FAP、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(Hepsin)、間質蛋白酶-2 (Matriptase-2)、MT-SP1/間質蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3、及TMPRSS4。
  28. 如請求項16至27中任一項或組合之ACC，其中該第一單體構築體進一步包含在該AMM1與該CM4之間的連接子L7及/或在該CM4與該CP1之間的連接子L8。
  29. 如請求項16至28中任一項或組合之ACC，其中該第二單體構築體進一步包含在該AMM2與該CM5之間的連接子L9及/或在該CM5與該CP2之間的連接子L10。
  30. 如請求項16至29中任一項或組合之ACC，其中該第三單體構築體進一步包含在該AMM3與該CM6之間的連接子L11及/或在該CM6與該CP3之間的連接子L12。
  31. 如請求項11至30中之一項或任何組合之ACC，其中該等連接子L1至L12之各者具有2至30個胺基酸之總長。
  32. 如請求項11至31中之一項或任何組合之ACC，其中該等連接子L1至L12之各者獨立地包含SEQ ID NO: 64至69、75至77、GGS、SGG、GSG、GS、或G中任一者之序列。
  33. 如請求項1至32中之一項或任何組合之ACC，其中沿N-端至C-端方向： 該第一單體構築體包含該CP1、該CM1、及該SMM1， 該第二單體構築體包含該CP2、該CM2、及該SMM2，及 該第三單體構築體包含該CP3、該CM3、及該SMM3。
  34. 如請求項1至32中之一項或任何組合之ACC，其中沿N-端至C-端方向： 該第一單體構築體包含該SMM1、該CM1、及該CP1， 該第二單體構築體包含該SMM2、該CM2、及該CP2，及 該第三單體構築體包含該SMM3、該CM3、及該CP3。
  35. 如請求項16至34中之一項或任何組合之ACC，其中沿N-端至C-端方向： 該第一單體構築體包含該AMM1、該CM4、該CP1、該CM1、及該SMM1， 該第二單體構築體包含該AMM2、該CM5、該CP2、該CM2、及該SMM2，及 該第三單體構築體包含該AMM3、該CM6、該CP3、該CM3、及該SMM3。
  36. 如請求項16至34中之一項或任何組合之ACC，其中沿N-端至C-端方向： 該第一單體構築體包含該SMM1、該AMM1、該CM1、及該CP1； 該第二單體構築體包含該SMM2、該AMM2、該CM2、及該CP2，及 該第三單體構築體包含該SMM3、該AMM3、該CM3、及該CP3。
  37. 如請求項16至34中之一項或任何組合之ACC，其中沿N-端至C-端方向： 該第一單體構築體包含，該AMM1、該SMM1、該CM1、及該CP1； 該第二單體構築體包含該AMM2、該SMM2、該CM2、及該CP2，及 該第三單體構築體包含該AMM3、該SMM3、該CM3、及該CP3。
  38. 如請求項16至34中之一項或任何組合之ACC，其中沿N-端至C-端方向： 該第一單體構築體包含該SMM1、該CM1、該CP1、該CM4、及AMM1， 該第二單體構築體包含該SMM2、該CM2、該CP2、該CM5、及AMM2，及 該第三單體構築體包含該SMM3、該CM3、該CP3、該CM6、及該AMM3。
  39. 如請求項16至34中之一項或任何組合之ACC，其中沿N-端至C-端方向： 該第一單體構築體包含該CP1、該CM1、該AMM1、及該SMM1； 該第二單體構築體包含該CP2、該CM2、該AMM2、及該SMM2；及 該第三單體構築體包含該CP3、該CM3、該AMM3、及該SMM3。
  40. 如請求項16至34中之一項或任何組合之ACC，其中沿N-端至C-端方向： 該第一單體構築體包含該CP1、該CM1、該SMM1、及該AMM1； 該第一單體構築體包含該CP2、該CM2、該SMM2、及該AMM2；及 該第一單體構築體包含該CP3、該CM3、該SMM3、及該AMM3。
  41. 如請求項1至40中之一項或任何組合之ACC，其中在非活性狀態下，相較於對照水平之該CP1、該CP2、該CP3、或其三聚體中之至少一者的活性，該ACC特徵在於具有降低水平之該CP1、該CP2、該CP3、或其三聚體中之至少一者的該活性。
  42. 如請求項41之ACC，其中相較於不包含空間遮蔽部份或親和力阻遮蔽部份的CP1、CP2、及CP3之對照三聚體的該活性，該ACC特徵在於CP1、CP2、及CP3之該三聚體的該活性降低至少2倍、5倍、10倍、500倍、10 3倍、10 4倍、10 5倍、或10 6倍。
  43. 如請求項41或42之ACC，其中該活性係疱疹病毒入侵介體(HVEM)之活化。
  44. 如請求項41或42之ACC，其中該活性係淋巴毒素β受體之活化。
  45. 如請求項41或42之ACC，其中該活性係疱疹病毒入侵介體(HVEM)之活化及淋巴毒素β受體之活化。
  46. 如請求項41至45中任一項或組合之ACC，其中CP1、CP2、及CP3之該對照三聚體係由該ACC之活化產生。
  47. 一種可活化之細胞介素構築體(ACC)，其包含： 第一單體構築體，其包含第一細胞介素蛋白質(CP1)、第一可切割之部份(CM1)、及第一親和力遮蔽部份(AMM1)，其中該CM1係位在該CP1與該AMM1之間； 第二單體構築體，其包含第二細胞介素蛋白質(CP2)、第二可切割之部份(CM2)、及第二親和力遮蔽部份(AMM2)，其中該CM2係位在該CP2與該AMM2之間；及 第三單體構築體，其包含第三細胞介素蛋白質(CP3)、第三可切割之部份(CM3)、及第三親和力空間遮蔽部份(AMM3)，其中該CM3係位在該CP3與該AMM3之間， 其中該CP1、該CP2、及該CP3彼此結合，從而形成該第一、該第二、及該第三單體構築體之三聚體。
  48. 一種如請求項1至47中任一項或組合之ACC，其中該第一單體構築體、該第二單體構築體、及該第三單體構築體係一致的。
  49. 一種如請求項1至48中任一項或組合之ACC，其中該ACC不包含任何促進形成除CP1、CP2、及CP3之外的三聚體的結構域。
  50. 如請求項49之ACC，其中該ACC不包含除該CP1、該CP2、及該CP3之外的任何共價連接該第一、該第二、及該第三單體構築體的結構域。
  51. 如請求項49之ACC，其中該ACC不包含卷曲螺旋結構域(coil-coiled domain)、Fc結構域、或除該CP1、該CP2、或該CP3之外的能夠形成雙硫鍵的結構域。
  52. 如請求項1至51中任一項或組合之ACC，其中該CP1、CP2、及CP3係一致的且各包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列。
  53. 如請求項46之ACC，其中該第一單體構築體、該第二單體構築體、及第三單體構築體係一致的且各單體包含： a. SEQ ID NO: 54之胺基酸序列；及 b. AMM，其包含與SEQ ID NO: 61之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列；及 c. SMM，其包含白蛋白。
  54. 一種組成物，其包含如請求項1至53中任一項或組合之ACC。
  55. 如請求項48之組成物，其中該組成物係醫藥組成物。
  56. 一種容器、小瓶、注射器、注射筆、或套組，其包含至少一個劑量的如請求項54或55之組成物。
  57. 一種編碼多肽之核酸，該多肽包含如請求項1至53中任一項或組合之ACC之該第一單體構築體、該第二單體構築體、或該第三單體構築體中之至少一者。
  58. 如請求項57之核酸，其包含下列中任一者之序列：SEQ ID NO: 9、11、13、25、31、41、43、45、或47。
  59. 一種核酸組，其共同編碼包含如請求項1至53中任一項或組合之ACC中之該第一單體構築體、該第二單體構築體、及該第三單體構築體的多肽。
  60. 一種載體，其包含如請求項57至59中任一項之核酸或核酸組。
  61. 一種細胞，其包含如請求項57至59中任一項之核酸或如請求項60之載體。
  62. 一種治療有其需要之個體之方法，其包含向該個體投予治療有效量的如請求項1至53中任一項或組合之ACC或如請求項54或55之組成物。
  63. 如請求項62之方法，其中該個體已經被確認或診斷為患有癌症。
  64. 如請求項62或63之方法，其進一步包含投予免疫檢查點抑制劑。
  65. 如請求項64之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。
  66. 一種產生ACC之方法，其包含： 在足以產生該ACC之條件下在液體培養基中培養如請求項61之細胞；及 從該細胞或該液體培養基中回收該ACC。
  67. 如請求項66之方法，其進一步包含使用親和力層析法純化該回收之ACC。
  68. 如請求項66或67之方法，其進一步包含將該回收之ACC調配成醫藥組成物。
TW111138606A 2021-10-13 2022-10-12 三聚體的可活化之細胞介素構築體及相關之組成物及方法 TW202334186A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163255340P 2021-10-13 2021-10-13
US63/255,340 2021-10-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202334186A true TW202334186A (zh) 2023-09-01

Family

ID=84362661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111138606A TW202334186A (zh) 2021-10-13 2022-10-12 三聚體的可活化之細胞介素構築體及相關之組成物及方法

Country Status (3)

Country Link
AR (1) AR127343A1 (zh)
TW (1) TW202334186A (zh)
WO (1) WO2023064791A1 (zh)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988001513A1 (en) 1986-08-28 1988-03-10 Teijin Limited Cytocidal antibody complex and process for its preparation
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US20090304719A1 (en) 2007-08-22 2009-12-10 Patrick Daugherty Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
BRPI1011384A2 (pt) 2009-02-23 2016-03-15 Cytomx Therapeutics Inc pro-proteinas e seus metodos de uso
JP2021515599A (ja) * 2018-03-09 2021-06-24 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッドＡｓｋＧｅｎｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ． 新規のサイトカインプロドラッグ
ES2955511T3 (es) * 2018-05-14 2023-12-04 Werewolf Therapeutics Inc Polipéptidos de interleucina 2 activables y métodos de uso de los mismos
JP2021524756A (ja) * 2018-05-14 2021-09-16 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能なサイトカインポリペプチド及びその使用方法
JP2023503258A (ja) * 2019-11-14 2023-01-27 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能サイトカインポリペプチド及びその使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
AR127343A1 (es) 2024-01-31
WO2023064791A1 (en) 2023-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11365233B2 (en) Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
US11028126B2 (en) Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
US10894821B2 (en) Activatable antibodies having non-binding steric moieties and methods of using the same
AU2016225810C1 (en) Modified Antibody Compositions, Methods of Making and Using Thereof
US10053504B2 (en) SPARC binding ScFvs
US20210025877A1 (en) Methods of qualitatively and/or quantitatively analyzing properties of activatable antibodies and uses thereof
CN105188749B (zh) 抗ntb‑a抗体及相关组合物和方法
US20240124546A1 (en) Masked activatable cytokine constructs and related compositions and method
TW202334186A (zh) 三聚體的可活化之細胞介素構築體及相關之組成物及方法
TW202334185A (zh) 可經活化之細胞介素構築體和組合方法
WO2023192973A1 (en) Activatable multispecific molecules and methods of use thereof
TW202334187A (zh) 可活化細胞激素構築體及相關組成物與方法
WO2024030858A1 (en) Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2023183923A1 (en) Activatable dual-anchored masked molecules and methods of use thereof
WO2024030843A1 (en) Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030847A1 (en) Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030845A1 (en) Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030850A1 (en) Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2023192606A2 (en) Cd3-binding proteins and methods of use thereof
CN117624361A (zh) 抗meEGFR抗体、其抗原结合片段及其用途
TW202411256A (zh) 抗meEGFR抗體、其抗原結合片段及其用途
CN117157313A (zh) 经掩蔽的可活化细胞因子构建体以及相关组合物和方法