BR112020023118A2 - Polipeptídeos de interleucina 12 ativáveis e métodos de uso destes - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEOS DE INTERLEUCINA 12 ATIVÁVEIS E MÉTODOS DE USO DESTES. A divulgação apresenta proteínas de fusão que são variantes condicionalmente ativas de uma citocina de interesse. Em um aspecto, os polipeptídeos de comprimento total da invenção têm atividade de ativação do receptor de citocina reduzida ou mínima, embora contenham um polipeptídeo de citocina funcional. Após a ativação, por exemplo, por clivagem, de um ligante que se une a uma fração de bloqueio, por exemplo, um polipeptídeo de bloqueio estérico, em sequência à citocina ativa, a citocina pode ligar seu receptor e efetuar a sinalização.

Description

“POLIPEPTÍDEOS DE INTERLEUCINA 12 ATIVÁVEIS E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS”

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 62/671,225, depositado em 14 de maio de 2018, Pedido Provisório dos US No. 62/756,504, depositado em 6 de novembro de 2018 e Pedido Provisório US No. 62/756,515, depositado em 6 de novembro de 2018. Os ensinamentos completos dos pedidos acima são incorporados neste documento por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 14 de maio de 2019, é denominada 105365-0022_SL.txt e tem um tamanho de 232.520 bytes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] O desenvolvimento de células linfoides imunocompetentes maduras a partir de precursores menos comprometidos, suas subsequentes respostas imunes dirigidas por antígenos e a supressão dessas e respostas autorreativas indesejadas são altamente dependentes e reguladas por citocinas (incluindo interleucina-2 [IL-2], IL- 4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21) que utilizam receptores na família da cadeia γ comum (γc) (Rochman et al., 2009) e membros da família, incluindo IL-12, 18 e 23. A IL-2 é essencial para o desenvolvimento tímico de células Treg e regula criticamente vários aspectos importantes de células Treg periféricas maduras e células T convencionais ativadas por antígeno. Por causa de sua potente atividade de fator de crescimento de células T in vitro, IL-2 foi extensivamente estudada em parte porque esta atividade ofereceu um meio potencial para aumentar diretamente a imunidade, por exemplo, em pacientes com câncer e AIDS-HIV, ou um alvo para antagonizar respostas indesejadas, por exemplo, rejeição de transplante e doenças autoimunes. Embora estudos in vitro com IL-2 forneçam uma forte justificativa para esses estudos, a função de

IL-2 in vivo é claramente muito mais complexa, conforme ilustrado pela primeira vez em camundongos deficientes em IL-2, onde uma síndrome autoimune letal rápida, não falta imunidade, foi observada (Sadlack et al., 1993, 1995). Observações semelhantes foram feitas posteriormente quando os genes que codificam IL-2Rα (Il2ra) e IL-2Rβ (Il2rb) sofreram ablação individual (Suzuki et al., 1995; Willerford et al., 1995).

[004] A presente invenção refere-se a citocinas condicionalmente ativas e/ou direcionadas para uso no tratamento de câncer e outras doenças dependentes de regulação imune positiva ou negativa. Por exemplo, a atividade antitumoral de algumas citocinas é bem conhecida e descrita e algumas citocinas já foram utilizadas terapeuticamente em humanos. Citocinas, como interleucina-2 (IL-2) e interferon α (IFNα), mostraram atividade antitumoral positiva em pacientes com diferentes tipos de tumores, como carcinoma metastático renal, leucemia de células pilosas, sarcoma de Kaposi, melanoma, mieloma múltiplo e o gostar. Outras citocinas como IFNβ, o Fator de Necrose Tumoral (TNF) α, TNFβ, IL-1, 4, 6, 12, 15 e os CSFs têm mostrado certa atividade antitumoral sobre alguns tipos de tumores e, portanto, são objeto de estudos adicionais.

SUMÁRIO

[005] São fornecidas neste documento proteínas terapêuticas, ácidos nucleicos que codificam as proteínas e composições e métodos de uso das proteínas e ácidos nucleicos para o tratamento de uma doença ou distúrbio, como doença proliferativa, doença tumoral, doença inflamatória, distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, doença do enxerto contra o hospedeiro e semelhantes.

[006] A invenção apresenta proteínas de fusão que são variantes condicionalmente ativas de IL-12. Em um aspecto, os polipeptídeos de comprimento total da invenção têm atividade de ativação do receptor de IL-12 reduzida ou mínima, embora contenham um polipeptídeo de IL-12 funcional. Após a ativação, por exemplo, por clivagem de um ligante peptídico que se junta a uma fração de bloqueio, por exemplo, um polipeptídeo bloqueador estérico, em sequência para a citocina ativa, a IL-12 ou um fragmento funcional ou muteína desta, pode ligar-se ao seu receptor e efetuar a sinalização.

Se desejado, os polipeptídeos de comprimento total podem incluir uma fração de polipeptídeo de bloqueio que também fornece propriedades vantajosas adicionais.

Por exemplo, o polipeptídeo de comprimento total pode conter uma fração de polipeptídeo de bloqueio que também prolonga a meia-vida sérica e/ou direciona o polipeptídeo de comprimento total para um sítio desejado de atividade de citocina.

Alternativamente, os polipeptídeos de fusão de comprimento total podem conter um elemento de prolongamento da meia-vida sérica e/ou domínio de direcionamento que são distintos da fração de polipeptídeo de bloqueio.

Preferencialmente, a proteína de fusão contém pelo menos um elemento ou domínio capaz de prolongar a meia-vida circulante in vivo.

Preferencialmente, este elemento é removido enzimaticamente na localização corporal desejada (por exemplo, clivagem de protease no microambiente tumoral), restaurando as propriedades farmacocinéticas para a molécula de carga útil (por exemplo, IL2 ou IFNa) substancialmente semelhante à molécula de carga útil de ocorrência natural.

As proteínas de fusão são direcionadas a uma célula ou tecido desejado.

Conforme descrito neste documento, o direcionamento é realizado por meio da ação de uma fração de polipeptídeo de bloqueio que também se liga a um alvo desejado, ou através de um domínio de direcionamento.

O domínio que reconhece um antígeno alvo em um alvo preferido (por exemplo, um antígeno específico de tumor) pode ser anexado à citocina por meio de um ligante peptídico clivável ou não clivável.

Se ligado por um ligante peptídico não clivável, o domínio de direcionamento pode auxiliar ainda mais na retenção da citocina no tumor e pode ser considerado um domínio de retenção.

O domínio de direcionamento não precisa necessariamente estar diretamente ligado à molécula de carga útil e pode ser ligado diretamente a outro elemento da proteína de fusão.

Isso é especialmente verdadeiro se o domínio de direcionamento for anexado por meio de um ligante peptídico clivável.

[007] Em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo de fusão compreendendo um polipeptídeo de IL-12, ou fragmento funcional ou muteína do mesmo, e uma fração de bloqueio, por exemplo, um domínio de bloqueio estérico. A fração de bloqueio é fundida ao polipeptídeo de IL-12, diretamente ou através de um ligante peptídico, e pode ser separada do polipeptídeo de IL-12 por clivagem (por exemplo, clivagem mediada por protease) do polipeptídeo de fusão no ou próximo ao sítio de fusão ou ligante peptídico ou na fração de bloqueio. Por exemplo, quando o polipeptídeo de IL-12 é fundido a uma fração de bloqueio através de um ligante peptídico que contém um sítio de clivagem de protease, o polipeptídeo de IL-12 é liberado da fração de bloqueio e pode ligar seu receptor, mediante clivagem mediada por protease do ligante peptídico. O ligante peptídico é projetado para ser clivado no sítio da atividade de citocina desejada, por exemplo, no microambiente tumoral, evitando a atividade de citocina fora do alvo e reduzindo a toxicidade geral da terapia com citocina.

[008] A fração de bloqueio também pode funcionar como um elemento de prolongamento da meia-vida sérica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende ainda um elemento de prolongamento da meia-vida sérica separado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende ainda um domínio de direcionamento. Em várias modalidades, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica é um polipeptídeo solúvel em água, como polietilenoglicol (PEG) opcionalmente ramificado ou multi-ramificado, albumina sérica humana de comprimento total (HSA) ou um fragmento que preserva a ligação a FcRn, um Fc fragmento, ou um nanobody que se liga a FcRn diretamente ou a albumina de soro humano.

[009] Além dos elementos de prolongamento da meia-vida sérica, as composições farmacêuticas descritas neste documento preferencialmente compreendem pelo menos um ou mais domínios de direcionamento que se ligam a um ou mais antígenos alvo ou uma ou mais regiões em um único antígeno alvo. É contemplado neste documento que um construto polipeptídico da invenção é clivado, por exemplo, em um microambiente específico da doença ou no sangue de um sujeito no sítio de clivagem da protease e que o(s) domínio(s) de direcionamento se ligarão a um antígeno alvo em uma célula-alvo. Pelo menos um antígeno alvo está envolvido e/ou associado a uma doença, distúrbio ou condição. Antígenos alvo exemplificativos incluem aqueles associados a uma doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, uma doença do enxerto contra o hospedeiro ou uma doença do hospedeiro contra o enxerto.

[010] Em algumas modalidades, um antígeno alvo é uma molécula de superfície celular, como uma proteína, lipídio ou polissacarídeo. Em algumas modalidades, um antígeno alvo é um em uma célula tumoral, célula infectada por vírus, célula infectada por bactérias, glóbulo vermelho danificado, célula de placa arterial ou célula de tecido fibrótico.

[011] Os antígenos alvo, em alguns casos, são expressos na superfície de uma célula ou tecido doente, por exemplo, um tumor ou uma célula cancerosa. Os antígenos alvo para tumores incluem, mas não estão limitados a proteína alfa de ativação de fibroblastos (FAPa), glicoproteína de trofoblasto (5T4), transdutor de sinal de cálcio associado a tumor 2 (Trop2), Fibronectina EDB (EDB-FN), domínio de fibronectina EIIIB, CGS-2, EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, c-Met, FOLR1 e CEA. As composições farmacêuticas divulgadas neste documento também incluem proteínas que compreendem dois domínios de ligação ao antígeno que se ligam a dois antígenos alvo diferentes conhecidos por serem expressos em uma célula ou tecido doente. Pares exemplares de domínios de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a EGFR/CEA, EpCAM/CEA e HER-2/HER-3.

[012] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento compreendem independentemente um scFv, um domínio VH, um domínio VL, um domínio não-Ig ou um ligante que se liga especificamente ao antígeno alvo. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam especificamente a uma molécula de superfície celular. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam especificamente a um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam específica e independentemente a um antígeno tumoral selecionado a partir de pelo menos um de EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, cMet, CEA e FOLR1. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam específica e independentemente a dois antígenos diferentes, em que pelo menos um dos antígenos é um antígeno tumoral selecionado de EpCAM, EGFR, HER- 2, HER-3, cMet, CEA e FOLR1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de direcionamento serve como um domínio de retenção e é anexado à citocina por meio de um ligante peptídico não clivável.

[013] Conforme descrito neste documento, a fração de bloqueio de citocina pode se ligar à citocina e, assim, bloquear a ativação do receptor cognato da citocina.

[014] Esta divulgação também está relacionada a ácidos nucleicos, por exemplo, DNA, RNA, mRNA, que codificam as proteínas condicionalmente ativas aqui descritas, bem como vetores e células hospedeiras que contêm tais ácidos nucleicos.

[015] Esta divulgação também se refere a composições farmacêuticas que contêm uma proteína condicionalmente ativa, ácido nucleico que codifica a proteína condicionalmente ativa e vetores e células hospedeiras que contêm tais ácidos nucleicos. Normalmente, a composição farmacêutica contém um ou mais carreadores e/ou excipientes fisiologicamente aceitáveis.

[016] A divulgação também se refere a métodos terapêuticos que incluem a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de uma proteína condicionalmente ativa, ácido nucleico que codifica a proteína condicionalmente ativa, vetor ou células hospedeiras que contêm tal ácido nucleico e composições farmacêuticas de qualquer um dos anteriores. Normalmente, o sujeito tem, ou está em risco de desenvolver, uma doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral,

uma reação alérgica, uma reação parasitária, uma doença do enxerto contra o hospedeiro ou doença do hospedeiro contra o enxerto.

[017] A divulgação também se refere ao uso de uma proteína condicionalmente ativa, ácido nucleico que codifica a proteína condicionalmente ativa, vetor ou células hospedeiras que contêm tal ácido nucleico e composições farmacêuticas de qualquer um dos anteriores, para o tratamento de um sujeito em necessidade. Normalmente, o sujeito tem, ou está em risco de desenvolver, uma doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, uma doença do enxerto contra o hospedeiro ou doença do hospedeiro contra o enxerto.

[018] A divulgação também se refere ao uso de uma proteína condicionalmente ativa, ácido nucleico que codifica a proteína condicionalmente ativa, vetor ou células hospedeiras que contêm esse ácido nucleico para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença, como uma doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, uma doença do enxerto contra o hospedeiro ou uma doença do hospedeiro contra o enxerto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[019] A FIG. 1a é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que inclui uma fração de bloqueio. A fração de bloqueio pode opcionalmente funcionar como um domínio de prolongamento da meia-vida sérica. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de um ligante peptídico clivável por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, o desenho mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral uma protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor.

[020] A FIG. 1b é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease em que a HSA (fração de bloqueio) está diretamente ligada à citocina ou quimiocina de interesse, com um sítio de clivagem de protease entre a HSA e a citocina ou quimiocina de interesse. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de um ligante peptídico clivável por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, a protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor.

[021] A FIG. 1c é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease em que mais de uma HSA (fração de bloqueio) está diretamente ligada à molécula de interesse. Se desejado, um ou mais dos HSA podem ser ligados à citocina ou quimiocina através de um ligante peptídico, tal como um ligante peptídico que contém um sítio de clivagem de protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de um ligante peptídico clivável por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, a protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor. A citocina agora tem propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa (por exemplo, tem meia-vida curta).

[022] A FIG. 1d é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende mais de uma citocina, do mesmo tipo ou de tipos diferentes, com cada uma das quais estando ligada a um domínio de ligação através de um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de um ligante peptídico clivável por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, o desenho mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral uma protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor.

[023] A FIG. 2 é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende um polipeptídeo de citocina ou quimiocina, uma fração de bloqueio e um domínio de prolongamento da meia-vida sérica conectados por pelo menos um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio por meio de ligantes peptídicos cliváveis por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. Também está ligado a um elemento de prolongamento da meia-vida separado, que prolonga a meia-vida sérica. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, uma protease cliva em um sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando assim o elemento de prolongamento da meia-vida sérica e a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor. A citocina agora tem propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa (por exemplo, tem meia-vida curta).

[024] A FIG. 3 é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende um polipeptídeo de citocina ou quimiocina, uma fração de bloqueio e um domínio de direcionamento conectados por pelo menos um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada a uma fração de bloqueio e um domínio de direcionamento por meio de um ligante peptídico clivável por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, o desenho mostra que em um microambiente inflamatório ou tumoral uma protease cliva no sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando o domínio de direcionamento e a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor.

[025] A FIG. 4a é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende um polipeptídeo de citocina ou quimiocina, uma fração de bloqueio, um domínio de direcionamento e um domínio de prolongamento da meia-vida sérica conectados por pelo menos um ligante peptídico clivável por protease, em que o polipeptídeo de citocina e o domínio de direcionamento são conectados por um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que a está conectado ao domínio de direcionamento, fração de bloqueio e elemento de prolongamento da meia-vida por meio de peptídeo(s) de ligação clivável(is) por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, a protease cliva em um sítio de clivagem de protease no peptídeo(s) de ligação, liberando o elemento de prolongamento da meia-vida, o domínio de direcionamento e a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao seu receptor. A citocina agora tem propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa (por exemplo, tem meia-vida curta).

[026] A FIG. 4b é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende um polipeptídeo de citocina ou quimiocina, uma fração de bloqueio, um domínio de direcionamento e um domínio de prolongamento da meia-vida sérica conectados por pelo menos um ligante peptídico clivável por protease. À esquerda da seta, a figura mostra que uma citocina está conectada ao domínio de direcionamento, uma fração de bloqueio e um elemento de prolongamento da meia-vida por meio de peptídeo(s) de ligação clivável(is) por protease, bloqueando assim sua capacidade de se ligar ao seu receptor. À direita da seta, a figura mostra que em um ambiente inflamatório ou tumoral, a protease cliva em um sítio de clivagem de protease no peptídeo(s) de ligação, liberando o elemento de prolongamento da meia-vida e a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao receptor. A fração de direcionamento permanece ligada, mantendo a citocina no microambiente tumoral. A citocina agora tem propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa (por exemplo, tem meia-vida curta).

[027] A FIG. 5 é um esquema que ilustra a estrutura de um domínio variável de uma molécula de imunoglobulina. Os domínios variáveis de ambas as cadeias de imunoglobulina leve e pesada contêm três alças hipervariáveis, ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Os três CDRs de um domínio V (CDR1, CDR2, CDR3) agrupam-se em uma extremidade do barril beta. As CDRs são as alças que conectam as fitas beta B-C, C'-C" e F-G da dobra da imunoglobulina, enquanto as alças inferiores que conectam as fitas beta AB, CC', C" -D e E-F da dobra da imunoglobulina, e a alça superior que conecta as fitas D-E da dobra da imunoglobulina são as alças não CDR.

[028] A FIG. 6 é um esquema que ilustra uma citocina ou quimiocina ativada por protease que compreende uma citocina ou polipeptídeo de quimiocina, uma fração de bloqueio que é um domínio de ligação de albumina sérica (por exemplo, um dAb) e um ligante peptídico clivável por protease. No exemplo ilustrado, as alças não CDR em um domínio de ligação de albumina sérica (por exemplo, um sdAb) podem formar um sítio de ligação para a citocina IL-12. Neste exemplo, o sítio de ligação para albumina sérica pode ser formado pelas CDRs do domínio de ligação de albumina sérica.

[029] A FIG. 7 é um gráfico que retrata os resultados de um ensaio com repórter de IL-12 HEK-Blue realizados em proteínas de fusão de IL12 p40 humana/p35 murina antes e após a clivagem pela protease. A análise foi realizada com base na quantificação da atividade da Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP) usando o reagente QUANTI-Blue® (InvivoGen). Os resultados confirmam que as proteínas de fusão da proteína IL12 estão ativas.

[030] As FIGs. 8a-8f mostra uma série de gráficos que retratam os resultados do ensaio com HEK-blue de quatro proteína de fusão de IL-12, antes e após a clivagem por MMP9. A análise foi realizada com base na quantificação da atividade da Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP) usando o reagente QUANTI- Blue (InvivoGen). Os dados mostram maior atividade na IL12 clivada do que na proteína de fusão completa. Os construtos testados foram ACP06 (Fig 8a), ACP07 (Fig 8c), ACP08 (Fig 8b), ACP09 (Fig 8d), ACP10 (Fig 8e), ACP11 (Fig 8f).

[031] A FIG. 9 mostra os resultados de um ensaio de clivagem de proteína. A proteína de fusão ACP11 foi corrida em um gel de SDS-PAGE na forma clivada e não clivada. Como pode ser visto no gel, a clivagem foi completa.

[032] A FIG. 10 é um esquema que representa um exemplo não limitativo de uma proteína de citocina induzível, em que o construto é ativado após a clivagem por protease de um ligante peptídico ligado entre duas subunidades da citocina.

[033] As FIGs. 11a-11d são gráficos que retratam os resultados de um ensaio com HEK-Blue realizado em proteínas de fusão de IL12 p40 humana/p35 murina antes e após a clivagem pela protease. O ensaio foi realizado. Os resultados confirmam que as proteínas de fusão da proteína IL12 estão ativas. Cada ensaio de proliferação foi realizado com HSA ou sem HSA. A FIG. 12 são dois gráficos que mostram a atividade de proteínas de fusão de IFNγ (ACP51 e ACP52) clivadas por protease MMP9 em comparação com a atividade de proteínas de fusão não clivadas usando ensaio de células repórter B16. Cada proteína de fusão compreende um aglutinante anti-HSA e um domínio de direcionamento de tumor.

[034] A FIG. 13 é uma série de gráficos que mostram que polipeptídeos de IL- 12 clivados são ativos em um ensaio com repórter HEKBlue. O painel superior esquerdo mostra que a IL-12 murina está ativa neste ensaio (controle positivo). O painel inferior esquerdo e o painel inferior direito mostram a atividade dos não cortados (quadrados) e cortados (triângulos), respectivamente. Os valores de EC50 para cada um são mostrados no encarte da tabela, painel superior direito.

[035] A FIG. 14 mostra o volume do tumor ao longo do tempo em camundongos tratados com 17,5μg ACP11 (quadrados), 175μg ACP11 (triângulos), 525μg ACP11 (círculos) e como controles 2μg ACP04 (linha tracejada, triângulos) e 10 μg ACP04 (linha tracejada, losangos). O veículo sozinho é indicado por grandes círculos abertos. Os dados mostram que o volume do tumor diminui ao longo do tempo de uma maneira dependente da dose em camundongos tratados com ACP11 e ACP04 (uma proteína de fusão p40 IL12 humana/p35 murina).

[036] A FIG. 15 é uma série de diagramas de espaguete que mostram o volume tumoral ao longo do tempo em um modelo de tumor de xenoenxerto de camundongo em camundongos tratados apenas com o veículo (superior esquerdo), 2μg ACP04 (superior médio), 10μg ACP04 (superior direito), 17,5μg ACP11 (inferior esquerdo), 175μg ACP11 (inferior médio), e 525μg ACP11 (inferior direito). Cada linha representa um único camundongo.

[037] As FIGs. 16-21 ilustram as propriedades de polipeptídeos de TriTac, que servem como proteínas de fusão cliváveis por protease exemplares.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[038] São divulgados neste documento métodos e composições para projetar e usar construtos que compreendem IL-12 induzível. A IL-12 é um potente agonista imunológico, o que a leva a ser considerada um agente terapêutico promissor para a oncologia. No entanto, a IL-12 e outras citocinas provaram ter uma janela terapêutica muito estreita. As citocinas, tais como a IL-12, têm meia-vida sérica curta e também são consideradas altamente potentes. Consequentemente, a administração terapêutica de citocinas produziu efeitos sistêmicos indesejáveis e toxicidades. Estes foram exacerbados pela necessidade de administrar grandes quantidades de citocina para atingir os níveis desejados de citocina no sítio pretendido de ação da citocina (por exemplo, um tumor). Infelizmente, devido à biologia das citocinas e à incapacidade de direcionar e controlar efetivamente sua atividade, as citocinas não alcançaram as vantagens clínicas esperadas no tratamento de tumores.

[039] São divulgadas neste documento proteínas de fusão que superam a toxicidade e os problemas de meia-vida curta que limitaram severamente o uso clínico da IL-12 em oncologia. As proteínas de fusão contêm polipeptídeos de IL- 12 que possuem atividade agonista do receptor. Mas, no contexto da proteína de fusão, a atividade agonista do receptor de IL-12 é atenuada e a meia-vida circulante é prolongada. As proteínas de fusão incluem sítios de clivagem de protease, que são clivados por proteases que estão associadas a um sítio desejado de atividade de IL-12 (por exemplo, um tumor) e são tipicamente enriquecidos ou seletivamente presentes no sítio de atividade desejada. Assim, as proteínas de fusão são preferencialmente (ou seletivamente) e eficientemente clivadas no sítio de atividade desejado para limitar a atividade da citocina substancialmente ao sítio de atividade desejado, tal como o microambiente tumoral. A clivagem de protease no sítio de atividade desejado, tal como em um microambiente tumoral, libera uma forma da IL-12 a partir da proteína de fusão que é muito mais ativa como um agonista do receptor de IL-12 do que a proteína de fusão (tipicamente pelo menos cerca de 100X mais ativa do que o proteína de fusão). A forma da IL-12 que é liberada após a clivagem da proteína de fusão normalmente tem uma meia-vida curta, que muitas vezes é substancialmente semelhante à meia-vida da IL-12 de ocorrência natural, restringindo ainda mais a atividade da IL-12 ao microambiente tumoral. Mesmo que a meia-vida da proteína de fusão seja prolongada, a toxicidade é dramaticamente reduzida ou eliminada porque a proteína de fusão circulante é atenuada e a citocina ativa é direcionada ao microambiente tumoral. As proteínas de fusão descritas neste documento, pela primeira vez, permitem a administração de uma dose terapêutica eficaz de uma citocina para tratar tumores com a atividade da citocina substancialmente limitada ao microambiente tumoral e reduz drasticamente ou elimina efeitos sistêmicos indesejados e toxicidade do citocina.

[040] A menos que definido de outro modo, todos os termos da técnica, notações e outros termos científicos ou terminologia utilizados neste documento são destinados a ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica aos quais pertence esta invenção. Em alguns casos, termos com significados comumente compreendidos são definidos neste documento para clareza e/ou para referência pronta, e a inclusão de tais definições neste documento não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença sobre o que é geralmente entendido na técnica. As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados aqui são geralmente bem compreendidos e comumente empregados usando metodologias convencionais por aqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, as metodologias de clonagem molecular amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4ª ed. (2012) Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Conforme apropriado, os procedimentos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis no mercado geralmente são realizados de acordo com os protocolos e condições definidos pelo fabricante, a menos que indicado de outra forma.

[041] "Citocina" é um termo bem conhecido da técnica que se refere a qualquer uma de uma classe de proteínas imunorreguladoras (como interleucina ou interferon) que são secretadas por células, especialmente do sistema imunológico e que são moduladores do sistema imunológico. Os polipeptídeos de citocina que podem ser usados nas proteínas de fusão aqui divulgadas incluem, mas não estão limitados a fatores de crescimento de transformação, tais como TGF-α e TGF-β (por exemplo, TGFbeta1, TGFbeta2, TGFbeta3); interferons, tais como interferon-α, interferon-β, interferon-γ, interferon-kappa e interferon-ômega; interleucinas, como IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21 e IL- 25; fatores de necrose tumoral, como fator de necrose tumoral alfa e linfotoxina; quimiocinas (por exemplo, quimiocina de motivo C-X-C 10 (CXCL10), CCL19, CCL20, CCL21) e fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CS), bem como fragmentos de tais polipeptídeos que ativam os receptores cognatos para a citocina (ou seja, fragmentos funcionais dos anteriores)."Quimiocina" é um termo da técnica que se refere a qualquer um de uma família de pequenas citocinas com a capacidade de induzir quimiotaxia dirigida em células responsivas próximas.

[042] As citocinas são bem conhecidas por terem meia-vida sérica curta, que frequentemente é de apenas alguns minutos. Mesmo as formas de citocinas que têm sequências de aminoácidos alteradas com a intenção de prolongar a meia- vida sérica, mas retêm a atividade do agonista do receptor, normalmente também têm meia-vida sérica curta. Conforme usado neste documento, uma "citocina de meia-vida curta" refere-se a uma citocina que tem uma meia-vida substancialmente breve circulando no soro de um sujeito, como uma meia-vida sérica que é inferior a 10, inferior a 15, menos de 30, menos de 60, menos de

90, menos de 120, menos de 240 ou menos de 480 minutos. Conforme usado neste documento, uma citocina de meia-vida curta inclui citocinas que não foram modificadas em sua sequência para atingir uma meia-vida mais longa do que o normal no corpo de um sujeito e polipeptídeos que têm sequências de aminoácidos alteradas destinadas a prolongar a meia-vida sérica vida ainda retém a atividade agonista do receptor. Este último caso não se destina a incluir a adição de domínios de proteínas heterólogas, como um elemento de prolongamento da meia-vida genuíno, como albumina sérica. Normalmente, um polipeptídeo de citocina com meia-vida curta, tal como um polipeptídeo de IL-12, tem uma meia-vida que é comparável à IL-12 de ocorrência natural, por exemplo, dentro de 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes ou 2 vezes da IL-12 de ocorrência natural.

[043] "Sortases" são transpeptidases que modificam proteínas reconhecendo e clivando um sinal de classificação de terminal carboxila incorporado ou terminalmente ligado a uma proteína ou peptídeo alvo. A Sortase A catalisa a clivagem do motivo LPXTG (SEQ ID NO: 80) (onde X é qualquer aminoácido padrão) entre o resíduo Thr e Gly na proteína alvo, com ligação transitória do resíduo Thr ao resíduo Cys do sítio ativo na enzima, formando um intermediário enzima-tioacila. Para completar a transpeptidação e criar o conjugado peptídeo- monômero, uma biomolécula com um grupo nucleofílico N-terminal, tipicamente um motivo de oligoglicina, ataca o intermediário, deslocando a Sortase A e unindo as duas moléculas.

[044] Conforme usado neste documento, o termo "bloqueador estérico" refere- se a um polipeptídeo ou fração de polipeptídeo que pode ser covalentemente ligado a um polipeptídeo de citocina direta ou indiretamente através de outras frações, tais como ligantes, por exemplo, na forma de um polipeptídeo quimérico (proteína de fusão), mas de outra forma não se liga covalentemente ao polipeptídeo de citocina. Um bloqueador estérico pode se ligar de forma não covalente ao polipeptídeo de citocina, por exemplo, por ligação eletrostática, hidrofóbica, iônica ou de hidrogênio. Um bloqueador estérico normalmente inibe ou bloqueia a atividade da fração de citocina devido à sua proximidade com a fração de citocina e tamanho comparativo.

[045] Conforme usado e descrito neste documento, um "elemento de prolongamento da meia-vida" é uma parte do polipeptídeo quimérico que aumenta a meia-vida sérica e melhora a pK, por exemplo, alterando seu tamanho (por exemplo, para ficar acima do limite de filtração renal), forma, raio hidrodinâmico, carga ou parâmetros de absorção, biodistribuição, metabolismo e eliminação.

[046] Conforme usado neste documento, os termos "ativável", "ativar", "induzir" e "indutível" referem-se à capacidade de uma proteína, ou seja, uma citocina, que faz parte de uma proteína de fusão, de se ligar ao seu receptor e efetuar a atividade sobre clivagem de elementos adicionais da proteína de fusão.

[047] Conforme usado neste documento, "plasmídeos" ou "vetores virais" são agentes que transportam os ácidos nucleicos divulgados para a célula sem degradação e incluem um promotor que produz a expressão da molécula de ácido nucleico e/ou polipeptídeo nas células nas quais é distribuído.

[048] Conforme usado neste documento, os termos "peptídeo", "polipeptídeo" ou "proteína" são usados de maneira ampla, significando dois ou mais aminoácidos ligados por uma ligação peptídica. Proteína, peptídeo e polipeptídeo também são usados neste documento de maneira intercambiável para se referir a sequências de aminoácidos. Deve-se reconhecer que o termo polipeptídeo não é usado neste documento para sugerir um tamanho ou quantidade específicos de aminoácidos que compreende a molécula e que um peptídeo da invenção pode conter até inúmeros resíduos de aminoácidos ou mais.

[049] Conforme usado ao longo do documento, "sujeito" pode ser um vertebrado, mais especificamente um mamífero (por exemplo, um humano, cavalo, gato, cachorro, vaca, porco, ovelha, cabra, camundongo, coelho, rato e porquinho-da-índia), aves, répteis, anfíbios, peixes e qualquer outro animal. O termo não denota uma idade ou sexo específico. Assim, sujeitos adultos e recém-nascidos, sejam do sexo masculino ou feminino, devem ser abrangidos.

[050] Conforme usado neste documento, "paciente" ou "sujeito" pode ser usado alternadamente e pode se referir a um sujeito com uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer). O termo paciente inclui sujeitos humanos e veterinários.

[051] Conforme usado neste documento, os termos "tratamento", "tratar" ou "tratar" referem-se a um método de redução dos efeitos de uma doença ou condição ou sintoma da doença ou condição. Assim, no método divulgado, o tratamento pode se referir a pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou redução substancialmente completa na gravidade de uma doença ou condição estabelecida ou sintoma da doença ou condição. Por exemplo, um método para tratar uma doença é considerado um tratamento se houver uma redução de 10% em um ou mais sintomas da doença em um sujeito em comparação com um controle. Assim, a redução pode ser de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou qualquer percentual de redução entre 10% e 100% em comparação com os níveis nativos ou de controle. Entende-se que o tratamento não se refere necessariamente à cura ou ablação completa da doença, condição ou sintomas da doença ou condição.

[052] Conforme usado neste documento, os termos "prevenir", "prevenir" e "prevenção" de uma doença ou distúrbio referem-se a uma ação, por exemplo, a administração do polipeptídeo quimérico ou sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo quimérico, que ocorre antes ou em aproximadamente ao mesmo tempo, um sujeito começa a mostrar um ou mais sintomas da doença ou distúrbio, que inibe ou retarda o início ou a exacerbação de um ou mais sintomas da doença ou distúrbio.

[053] Conforme usado neste documento, as referências a "diminuir", "reduzir" ou "inibir" incluem uma mudança de pelo menos cerca de 10%, de pelo menos cerca de 20%, de pelo menos cerca de 30%, de pelo menos cerca de 40%, de pelo menos cerca de 50%, de pelo menos cerca de 60%, de pelo menos cerca de 70%, de pelo menos cerca de 80%, de pelo menos cerca de 90% ou mais em comparação com um nível de controle adequado. Esses termos podem incluir, mas não necessariamente incluem a eliminação completa de uma função ou propriedade, como a atividade agonista.

[054] Um "agonista do receptor de citocina atenuado" é um agonista do receptor de citocina que diminuiu a atividade agonista do receptor em comparação com o agonista de ocorrência natural do receptor de citocina. Um agonista de citocina atenuado pode ter pelo menos cerca de 10X, pelo menos cerca de 50X, pelo menos cerca de 100X, pelo menos cerca de 250X, pelo menos cerca de 500X, pelo menos cerca de 1000X ou menos atividade agonista em comparação com o agonista de ocorrência natural do receptor. Quando uma proteína de fusão que contém um polipeptídeo de citocina, conforme descrito neste documento, é descrita como "atenuada" ou tendo "atividade atenuada", significa que a proteína de fusão é um agonista do receptor de citocina atenuado.

[055] Uma "proteína de fusão intacta" é uma proteína de fusão na qual nenhum domínio foi removido, por exemplo, por clivagem de protease. Um domínio pode ser removível por clivagem de protease ou outra atividade enzimática, mas quando a proteína de fusão está "intacta", isso não ocorreu.

[056] Conforme usado neste documento, "fração" se refere a uma fração de uma molécula que tem uma função distinta dentro dessa molécula, e essa função pode ser realizada por essa fração no contexto de outra molécula. Uma fração pode ser uma entidade química com uma função particular ou uma fração de uma molécula biológica com uma função particular. Por exemplo, uma "fração de bloqueio" dentro de uma proteína de fusão é uma fração da proteína de fusão que é capaz de bloquear a atividade de algum ou de todo o polipeptídeo de fusão. Este pode ser um domínio de proteína, como albumina sérica.

[057] Em geral, o uso terapêutico de citocinas é fortemente limitado por sua toxicidade sistêmica. O TNF, por exemplo, foi originalmente descoberto por sua capacidade de induzir a necrose hemorrágica de alguns tumores e por seu efeito citotóxico in vitro em diferentes linhagens tumorais, mas posteriormente demonstrou possuir forte atividade pró-inflamatória, que pode, no caso de condições de superprodução, afetar perigosamente o corpo humano. Como a toxicidade sistêmica é um problema fundamental com o uso de quantidades farmacologicamente ativas de citocinas em humanos, novos derivados e estratégias terapêuticas estão agora em avaliação, com o objetivo de reduzir os efeitos tóxicos dessa classe de efetores biológicos mantendo sua eficácia terapêutica.

[058] A interleucina-12 (IL-12) é um heterodímero ligado por dissulfeto de duas subunidades codificadas separadamente (p35 e p40), que estão ligadas covalentemente para dar origem à chamada molécula heterodimérica bioativa (p70) (Lieschke et al., 1997; Jana et al., 2014). Além de formar heterodímeros (IL-12 e IL-23), a subunidade p40 também é segregada como um monômero (p40) e um homodímero (p40 2). É conhecido na técnica que a síntese do heterodímero como uma única cadeia com um ligante conectando o p35 à subunidade p40 preserva a atividade biológica completa do heterodímero. A IL- 12 desempenha um papel crítico na resposta inflamatória inicial à infecção e na geração de células Th1, que favorecem a imunidade mediada por células. Foi descoberto que a superprodução de IL-12 pode ser perigosa para o hospedeiro porque está envolvida na patogênese de uma série de doenças inflamatórias autoimunes (por exemplo, MS, artrite, diabetes tipo 1).

[059] O receptor de IL-12 (IL-12R) é um complexo heterodimérico que consiste nas cadeias IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2 expressas na superfície de células T ativadas e células natural killer (Trinchieri et al., 2003). A cadeia IL-12Rβ1 se liga à subunidade IL-12p40, enquanto IL-12p35 em associação com IL-12Rβ2 confere uma capacidade de sinalização intracelular (Benson et al., 2011). A transdução de sinal através do IL-12R induz a fosforilação da Janus quinase (Jak2) e da tirosina quinase (Tyk2), que fosforilam e ativam o transdutor de sinal e ativador da transcrição (STAT) 1, STAT3, STAT4 e STAT5. Os efeitos celulares específicos da IL-12 são devidos principalmente à ativação de STAT4. IL-12 induz e células T e natural killer a produzirem citocinas, em particular interferon

(IFN)γ, que medeiam muitas das atividades pró-inflamatórias de IL-12, incluindo diferenciação de células T CD4+ em direção ao fenótipo Th1 (Montepaone et al., 2014).

[060] A IL-12 é uma citocina pleiotrópica, cujas ações criam uma interconexão entre a imunidade inata e adaptativa. A IL-12 foi descrita pela primeira vez como um fator secretado por linhas de células B transformadas por EBV induzidas por PMA. Com base em suas ações, a IL-12 foi designada como fator de maturação de linfócitos citotóxicos e fator estimulante de células natural killer. Devido à ligação entre a imunidade inata e adaptativa e ao estímulo potente da produção de IFNγ, uma citocina que coordena os mecanismos naturais de defesa anticâncer, a IL-12 parecia a candidata ideal para a imunoterapia tumoral em humanos. No entanto, os efeitos colaterais graves associados à administração sistêmica de IL-12 em investigações clínicas e o índice terapêutico muito estreito dessa citocina diminuíram acentuadamente o entusiasmo pelo uso desta citocina em pacientes com câncer (Lasek et. Al., 2014). Abordagens para terapia com IL- 12 em que a distribuição da citocina é direcionada ao tumor, o que pode diminuir alguns dos problemas anteriores com terapia com IL-12, estão atualmente em ensaios clínicos para câncer.

[061] A presente invenção é projetada para abordar as deficiências da terapia direta com IL-12 e terapia usando outras citocinas, por exemplo, usando frações de bloqueio de citocinas, por exemplo, polipeptídeos de bloqueio estérico, polipeptídeos de prolongamento da meia-vida do soro, polipeptídeos de direcionamento, polipeptídeos de ligação, incluindo ligantes peptídicos cliváveis por protease, e combinações dos mesmos. Citocinas, incluindo interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 IL-23), interferons (IFNs, incluindo IFNalfa, IFNbeta e IFNgama), fatores de necrose tumoral (por exemplo, TNFalfa, linfotoxina), fatores de crescimento de transformação (por exemplo, TGFbeta1, TGFbeta2, TGFbeta3), quimiocinas (motivo C-X-C quimiocina 10 (CXCL10), CCL19, CCL20, CCL21) e fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CS) são altamente potentes quando administrados a pacientes.

Conforme usado neste documento, "quimiocina" significa uma família de pequenas citocinas com a capacidade de induzir quimiotaxia dirigida em células responsivas próximas. As citocinas podem fornecer terapia poderosa, mas são acompanhadas por efeitos indesejáveis que são difíceis de controlar clinicamente e que limitaram o uso clínico de citocinas. Esta divulgação se refere a novas formas de citocinas que podem ser usadas em pacientes com efeitos indesejados reduzidos ou eliminados. Em particular, esta divulgação se refere a composições farmacêuticas, incluindo polipeptídeos quiméricos (proteínas de fusão), ácidos nucleicos que codificam proteínas de fusão e formulações farmacêuticas das anteriores que contêm citocinas ou fragmentos ativos ou muteínas de citocinas que têm atividade de ativação de receptor de citocina diminuída em comparação com o correspondente citocina. No entanto, sob condições selecionadas ou em um ambiente biológico selecionado, os polipeptídeos quiméricos ativam seus receptores cognatos, muitas vezes com a mesma ou maior potência que a citocina de ocorrência natural correspondente. Conforme descrito neste documento, isso é tipicamente alcançado usando uma fração de bloqueio de citocina que bloqueia ou inibe a função de ativação do receptor da citocina, fragmento ativo ou muteína da mesma sob condições gerais, mas não sob condições selecionadas, tais como aquelas presentes no local desejado de atividade da citocina (por exemplo, um sítio inflamatório ou um tumor).

[062] Os polipeptídeos quiméricos e ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos quiméricos podem ser feitos usando qualquer método adequado. Por exemplo, ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo quimérico podem ser feitos usando técnicas de DNA recombinante, química sintética ou combinações dessas técnicas e expressos em um sistema de expressão adequado, como em células CHO. Polipeptídeos quiméricos podem ser produzidos de forma semelhante, por exemplo, por expressão de um ácido nucleico adequado, usando técnicas químicas sintéticas ou semissintéticas e semelhantes. Em algumas modalidades, a fração de bloqueio pode ser anexada ao polipeptídeo de citocina por meio de conjugação mediada por sortase. "Sortases" são transpeptidases que modificam proteínas reconhecendo e clivando um sinal de classificação de terminal carboxila incorporado ou terminalmente ligado a uma proteína ou peptídeo alvo. Sortase A catalisa a clivagem do motivo LPXTG (SEQ ID NO: 80) (onde X é qualquer aminoácido padrão) entre o resíduo Thr e Gly na proteína alvo, com ligação transitória do resíduo Thr ao resíduo Cys do local ativo na enzima, formando um intermediário enzima-tioacila. Para completar a transpeptidação e criar o conjugado peptídeo- monômero, uma biomolécula com um grupo nucleofílico N-terminal, tipicamente um motivo de oligoglicina, ataca o intermediário, deslocando a Sortase A e unindo as duas moléculas.

[063] Para formar a proteína de fusão da fração de bloqueio de citocina, o polipeptídeo de citocina é primeiro marcado no terminal N com uma sequência de poliglicina ou, alternativamente, com no terminal C com um motivo LPXTG (SEQ ID NO: 80). A fração de bloqueio ou outro elemento tem respectivos peptídeos anexados que servem como sítios aceitadores para os polipeptídeos marcados. Para a conjugação com domínios que transportam um peptídeo aceitador LPXTG (SEQ ID NO: 80) ligado através de seu terminal N, o polipeptídeo será marcado com um trecho de poliglicina N-terminal. Para a conjugação com o domínio que transporta um peptídeo poliglicina ligado através do seu terminal C, o polipeptídeo será marcado no seu terminal C com uma sequência de reconhecimento de sortase LPXTG (SEQ ID NO: 80). Reconhecendo as sequências de poliglicina e LPXTG (SEQ ID NO: 80), a sortase formará uma ligação peptídica entre o polímero-peptídeo e os polipeptídeos marcados. A reação sortase cliva os resíduos de glicina como intermediários e ocorre em temperatura ambiente.

[064] Uma variedade de mecanismos pode ser explorada para remover ou reduzir a inibição causada pela fração de bloqueio. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem incluir um polipeptídeo de IL-12 e uma fração de bloqueio, por exemplo, uma fração de bloqueio estérico, com um ligante clivável por protease compreendendo um sítio de clivagem de protease localizado entre o polipeptídeo de IL-12 e a fração de bloqueio de citocina ou dentro da fração de bloqueio de citocina. Quando o sítio de clivagem da protease é clivado, a fração de bloqueio pode se dissociar da citocina e a citocina pode então ativar o receptor de citocina.

[065] Qualquer ligante peptídico adequado pode ser usado. Por exemplo, o ligante peptídico pode compreender glicina-glicina, um motivo de reconhecimento de sortase ou um motivo de reconhecimento de sortase e uma sequência de peptídeos (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 81) ou (Gly3Ser)n, (SEQ ID NO: 82) em que n é 1, 2, 3, 4 ou 5. Normalmente, o motivo de reconhecimento de sortase compreende uma sequência de peptídeos LPXTG (SEQ ID NO: 80), em que X é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, a ligação covalente é entre um resíduo de lisina reativo ligado ao terminal C do polipeptídeo de citocina e um ácido aspártico reativo ligado ao terminal N do bloqueador ou outro domínio. Em algumas modalidades, a ligação covalente é entre um resíduo de ácido aspártico reativo ligado ao terminal N do polipeptídeo de citocina e um resíduo de lisina reativo ligado ao terminal C de tal bloqueador ou outro domínio.

[066] Por conseguinte, conforme descrito em detalhes neste documento, as frações de bloqueio de citocina (frações de bloqueio de IL-12) usadas podem ser bloqueadores estéricos. Conforme usado neste documento, um "bloqueador estérico" refere-se a um polipeptídeo ou fração de polipeptídeo que pode ser covalentemente ligado a um polipeptídeo de citocina direta ou indiretamente através de outras frações, tais como ligantes peptídicos, por exemplo, na forma de um polipeptídeo quimérico (proteína de fusão), mas, do contrário, não se liga covalentemente ao polipeptídeo de citocina. Um bloqueador estérico pode se ligar de forma não covalente ao polipeptídeo de citocina, por exemplo, por ligação eletrostática, hidrofóbica, iônica ou de hidrogênio. Um bloqueador estérico normalmente inibe ou bloqueia a atividade da fração de citocina devido à sua proximidade com a fração de citocina e tamanho comparativo. A inibição estérica da fração de citocina pode ser removida separando espacialmente a fração de citocina do bloqueador estérico, tal como clivando enzimaticamente uma proteína de fusão que contém um bloqueador estérico e um polipeptídeo de citocina em um sítio entre o bloqueador estérico e o polipeptídeo de citocina.

[067] Conforme descrito em mais detalhes neste documento, a função de bloqueio pode ser combinada com ou devido à presença de componentes funcionais adicionais na composição farmacêutica, como um domínio de direcionamento, um elemento de prolongamento da meia-vida sérica e polipeptídeos de ligação cliváveis por protease. Por exemplo, um polipeptídeo que prolonga a meia-vida sérica também pode ser um bloqueador estérico.

[068] Vários elementos asseguram a entrega e a atividade de IL-12 preferencialmente no local da atividade de IL-12 desejada e limitam severamente a exposição sistêmica à interleucina por meio de uma estratégia de bloqueio e/ou direcionamento preferencialmente ligada a uma estratégia de prolongamento da meia-vida sérica. Nessa estratégia de prolongamento da meia-vida sérica, a versão bloqueada da interleucina circula por períodos prolongados (preferencialmente 1-2 ou mais semanas), mas a versão ativada tem a meia-vida sérica típica da interleucina.

[069] Em algumas modalidades desta invenção, o elemento de prolongamento da meia-vida está ligado à interleucina por meio de um ligante peptídico que é clivado no sítio de ação (por exemplo, por proteases específicas de inflamação ou tumor), liberando a atividade total da interleucina no sítio desejado e também separando-o do prolongamento da meia-vida da versão não clivada. Em tais modalidades, a interleucina totalmente ativa e livre teria propriedades farmacocinéticas (pK) muito diferentes - uma meia-vida de horas em vez de semanas. Além disso, a exposição à citocina ativa é limitada ao sítio da atividade desejada da citocina (por exemplo, um sítio inflamatório ou tumor) e a exposição sistêmica à citocina ativa e a toxicidade associada e os efeitos colaterais são reduzidos.

[070] As frações de bloqueio, descritas em mais detalhes abaixo, também podem ser usadas para favorecer a ligação ou ativação de um ou mais receptores. Este bloqueio pode ser aliviado pela remoção das frações de bloqueio em um ambiente particular, por exemplo, por clivagem proteolítica de um ligante que liga uma ou mais frações de bloqueio à citocina.

[071] Em outro aspecto, uma abordagem semelhante pode ser aplicada para melhorar outras citocinas, particularmente para uso como agentes imunoestimulantes, por exemplo, para o tratamento de câncer. Por exemplo, neste aspecto, a farmacocinética e/ou farmacodinâmica da citocina (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 IL-23, IFNalfa, IFNbeta e IFNgama, TNFalfa, linfotoxina, TGFbeta1, TGFbeta2, TGFbeta3 GM-CSF, CXCL10, CCL19, CCL20 e CCL21 podem ser adaptados para ativar ao máximo as células efetoras (por exemplo, células T de efeito, células NK) e/ou células promotoras da resposta imune citotóxica (por exemplo, induzir a maturação de células dendríticas) em um sítio de atividade desejada, como em um tumor, mas preferencialmente de forma não sistêmica.

[072] Assim, são fornecidas neste documento composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um polipeptídeo de citocina, como interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23), interferons (IFNs, incluindo IFNalfa, IFNbeta e IFNgama), fatores de necrose tumoral (por exemplo, TNFalfa, linfotoxina), fatores de crescimento transformadores (por exemplo, TGFbeta1, TGFbeta2, TGFbeta3), quimiocinas (por exemplo, CXCL10, CCL19, CCL20, CCL21) e fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CS) ou um fragmento funcional ou muteína de qualquer um dos anteriores. O polipeptídeo normalmente também inclui pelo menos uma sequência de aminoácidos de ligante peptídico, em que a sequência de aminoácidos é, em certas modalidades, capaz de ser clivada por uma protease endógena. Em uma modalidade, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo HSSKLQ (SEQ ID NO: 24), GPLGVRG (SEQ ID NO: 83), IPVSLRSG (SEQ ID NO: 84), VPLSLYSG (SEQ ID NO: 85) ou SGESPAYYTA (SEQ ID NO: 86). Em outras modalidades, o polipeptídeo quimérico contém ainda uma fração de bloqueio, por exemplo, uma fração de polipeptídeo de bloqueio estérico, capaz de bloquear a atividade do polipeptídeo de interleucina. A fração de bloqueio, por exemplo, pode compreender um domínio de ligação de albumina de soro humano (HSA) ou um polietilenoglicol (PEG) opcionalmente ramificado ou multi-ramificado. Alternativamente, a composição farmacêutica compreende um primeiro polipeptídeo de citocina ou um fragmento do mesmo e fração de bloqueio, por exemplo, uma fração de polipeptídeo de bloqueio estérico, em que a fração de bloqueio bloqueia a atividade do polipeptídeo de citocina no receptor de citocina, e em que a fração de bloqueio em certas modalidades compreende um domínio clivável por protease. Em algumas modalidades, o bloqueio e a redução da atividade da citocina são alcançados simplesmente anexando domínios adicionais com ligantes peptídicos muito curtos ao terminal N ou C do domínio de interleucina. Em tais modalidades, prevê-se que o bloqueio seja aliviado pela digestão da protease da fração de bloqueio ou do ligante peptídico curto que amarra o bloqueador à interleucina. Uma vez que o domínio é cortado ou liberado, ele não será mais capaz de bloquear a atividade das citocinas.

[073] A composição farmacêutica, por exemplo, polipeptídeo quimérico pode compreender duas ou mais citocinas, que podem ser o mesmo polipeptídeo de citocina ou polipeptídeos de citocina diferentes. Por exemplo, os dois ou mais tipos diferentes de citocinas têm funções complementares. Em alguns exemplos, uma primeira citocina é IL-12 e uma segunda citocina é IL-2. Em algumas modalidades, cada um dos dois ou mais tipos diferentes de polipeptídeos de citocina tem atividades que modulam a atividade dos outros polipeptídeos de citocina. Em alguns exemplos de polipeptídeos quiméricos que contêm dois polipeptídeos de citocina, um primeiro polipeptídeo de citocina é ativador de células T e um segundo polipeptídeo de citocina é não ativador de células T. Em alguns exemplos de polipeptídeos quiméricos que contêm dois polipeptídeos de citocina, uma primeira citocina é um quimioatraente, por exemplo, CXCL10, e uma segunda citocina é um ativador de células imunes.

[074] De preferência, os polipeptídeos de IL-12 (incluindo fragmentos funcionais) que estão incluídos nas proteínas de fusão divulgadas neste documento não são mutados ou modificados para alterar as propriedades da citocina de ocorrência natural, incluindo afinidade de ligação ao receptor e especificidade ou meia-vida sérica. No entanto, alterações na sequência de aminoácidos de citocinas de ocorrência natural (incluindo tipo selvagem) são aceitáveis para facilitar a clonagem e para atingir os níveis de expressão desejados, por exemplo. Fração de Bloqueio

[075] A fração de bloqueio pode ser qualquer fração que iniba a capacidade da citocina de se ligar e/ou ativar seu receptor. A fração de bloqueio pode inibir a capacidade da citocina de se ligar e/ou ativar seu receptor, bloqueando estericamente e/ou por ligação não covalente à citocina. Exemplos de frações de bloqueio adequadas incluem as completes ou um fragmento de ligação à citocina ou muteína do receptor cognato da citocina. Anticorpos e fragmentos destas, incluindo um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um fragmento variável de cadeia única (scFv), anticorpo de domínio único, tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de nanobody tipo camelídeo (VHH), um dAb e similares, que se ligam à citocina também podem ser usados. Outros domínios de ligação de antígeno adequados que se ligam à citocina também podem ser usados, incluindo proteínas diferentes de imunoglobulinas que imitam a ligação e/ou estrutura do anticorpo, tais como anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz, monobodies, e domínios de ligação baseados em outras proteínas estruturadas modificadas, tais como estruturas de SpA, GroEL, fibronectina, lipocallina e CTLA4. Outros exemplos de polipeptídeos de bloqueio adequados incluem polipeptídeos que inibem estericamente ou bloqueiam a ligação da citocina ao seu receptor cognato. Vantajosamente, essas frações também podem funcionar como elementos de prolongamento da meia-vida. Por exemplo, um peptídeo que é modificado por conjugação com um polímero solúvel em água, tal como PEG, pode inibir estericamente ou prevenir a ligação da citocina ao seu receptor. Polipeptídeos, ou fragmentos dos mesmos, que têm meia-vida sérica longa também podem ser usados, tais como albumina sérica (albumina sérica humana), imunoglobulina Fc, transferrina e semelhantes, bem como fragmentos e muteínas de tais polipeptídeos. Os anticorpos e os domínios de ligação ao antígeno que se ligam a, por exemplo, uma proteína com uma meia-vida sérica longa, como HSA, imunoglobulina ou transferrina, ou a um receptor que é reciclado para a membrana plasmática, como FcRn ou receptor de transferrina, podem também inibem a citocina, particularmente quando ligada ao seu antígeno. Exemplos de tais polipeptídeos de ligação ao antígeno incluem um fragmento variável de cadeia única (scFv), anticorpo de domínio único, como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de nanobody do tipo camelídeo (VHH), um dAb e semelhantes. Outro domínio de ligação ao antígeno adequado que se liga à citocina também pode ser usado, incluindo proteínas não imunoglobulinas que mimetizam a ligação e/ou estrutura de anticorpos, tais como, anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz, monobodies e domínios de ligação com base em outras proteínas estruturadas manipuladas, como estruturas de SpA, GroEL, fibronectina, lipocalina e CTLA4.

[076] Em exemplos ilustrativos, quando IL-12 é a citocina no polipeptídeo quimérico, a fração de bloqueio pode ser a de comprimento total ou um fragmento ou muteína da primeira moécula do receptor de IL-12 (IL-12Rβ1) ou beta (IL-12Rβ2), um anticorpo de domínio único anti-IL-2 (dAb) ou scFv, um anticorpo anti- IL-12Rβ1 ou fragmento do mesmo, um anticorpo anti-IL-12Rβ2 ou fragmento do mesmo e anti-HSA dAb ou scFv, e semelhantes. Aspectos adicionais da invenção

1. Uma proteína de fusão compreendendo uma fração de citocina que está operacionalmente ligada a uma fração de ligação, a fração de ligação compreendendo uma alça não CDR e um ligante peptídico clivável, em que a fração de ligação é capaz de mascarar a ligação da citocina ao seu receptor e/ou ativação do receptor pela citocina.

2. A proteína de fusão do aspecto 1, em que a fração de ligação é um peptídeo natural, um peptídeo sintético, uma proteína estruturada modificada ou uma proteína sérica em grupo manipulada.

3. A proteína de fusão do aspecto 1 ou 2, em que a proteína estruturada modificada compreende um sdAb, um scFv, um Fab, um VHH, um domínio de fibronectina tipo III, proteína estruturada do tipo imunoglobulina, DARPin, peptídeo de nó de cistina, lipocalina, proteína estruturada de feixe de três hélices, módulo de ligação à albumina relacionado à proteína G ou uma proteína estruturada de aptâmeros de DNA ou RNA.

4. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-2, em que a fração de ligação é capaz de se ligar a uma proteína sérica em grupo.

5. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-3, em que a alça não CDR é de um domínio variável, um domínio constante, um domínio de conjunto C1, um domínio de conjunto C2, um domínio I ou quaisquer combinações dos mesmos.

6. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-4, em que a fração de ligação compreende ainda regiões determinantes de complementaridade (CDRs).

7. A proteína de fusão do aspecto 5, em que a fração de ligação é capaz de se ligar à proteína sérica em grupo.

8. A proteína de fusão do aspecto 6, em que a proteína sérica em grupo é uma proteína que prolonga a meia-vida.

9. A proteína de fusão do aspecto 6 ou 7, em que a proteína sérica em grupo é albumina, transferrina, Fator XIII ou Fibrinogênio.

10. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos5-8, que a alça CDR fornece o sítio de ligação específico para a proteína sérica em grupo ou a cadeia leve de imunoglobulina, ou quaisquer combinações das mesmas.

11. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-9, em que o ligante peptídico clivável compreende um sítio de clivagem.

12. A proteína de fusão do aspecto 10, em que o sítio de clivagem é reconhecido por uma protease.

13. A proteína de fusão do aspecto 11, em que a fração de ligação está ligada à citocina.

14. A proteína de fusão do aspecto 11 ou 11, em que a fração de ligação está ligada covalentemente à citocina.

15. A proteína de fusão do aspecto 11, 11 ou 14, em que a fração de ligação é capaz de mascarar a ligação da citocina ao seu alvo por meio de interações intermoleculares específicas entre a fração de ligação e a citocina.

16. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 11-14, em que a alça não CDR fornece um sítio de ligação específico para a ligação da fração à citocina.

17. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 11-15, em que após a clivagem do ligante peptídico clivável, a fração de ligação é separada da citocina e a citocina se liga ao seu alvo.

18. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-16, em que a citocina se liga a um receptor de citocina.

19. A proteína de fusão do aspecto 17, em que o receptor de citocina compreende um receptor de citocina de tipo I, um receptor de IL de tipo I, um receptor de IL de tipo II, um receptor de quimiocina ou um receptor de superfamília de receptores de necrose tumoral.

20. A proteína de fusão de qualquer um dos aspectos 1-18, em que o ligante peptídico clivável compreende um sítio de clivagem.

21. A proteína de fusão do aspecto 20, em que o sítio de clivagem é reconhecido por uma protease.

22. A proteína de fusão do aspecto 21, em que o sítio de clivagem da protease é reconhecido por uma serina protease, uma cisteína protease, uma aspartato protease, uma treonina protease, uma protease de ácido glutâmico, uma metaloproteinase, uma gelatinase ou uma asparagina peptídeo liase.

23. A proteína de fusão do aspecto 21, em que o sítio de clivagem da protease é reconhecido por uma Catepsina B, uma Catepsina C, uma Catepsina D, uma Catepsina E, uma Catepsina K, uma Catepsina L, uma calicreína, um hK1, um hK10, um hK15, uma plasmina, uma colagenase, uma colagenase Tipo IV, uma estromelisina, um Fator Xa, uma protease do tipo quimiotripsina, uma protease do tipo tripsina, uma protease do tipo elastase, uma protease do tipo subtilisina, uma actinidina, uma bromelaína, uma calpaína, uma caspase, uma caspase-3, uma Mir1-CP, uma papaína, uma protease de HIV-1, uma protease de HSV, uma protease de CMV, uma quimosina, uma renina, uma pepsina, uma matriptase, uma legumaína, uma plasmepsina, uma nepentsina, uma metaloexopeptidase, uma metaloendopeptidase, uma metaloprotease de matriz (MMP), uma MMP1, uma MMP2, uma MMP3, uma MMP8, uma MMP9, uma MMP10, uma MMP11, uma MMP12, uma MMP13, uma MMP14, uma ADAM10, uma ADAM17, um ADAM12, um ativador de uroquinase plasminogênio (uPA), uma enteroquinase, um alvo específico da próstata (PSA, hK3), uma enzima de conversão de interleucina-1β, uma trombina, um FAP (FAP-α), uma dipeptidil peptidase, ou dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26), uma protease de serina transmembrana tipo II (TTSP), uma elastase de neutrófilos, uma catepsina G, uma proteinase 3, uma serina protease de neutrófilos 4, uma quimase de mastócitos, uma triptase de mastócitos, uma dipeptidil peptidase e uma dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26).

24. Uma proteína de ligação condicionalmente ativa compreendendo uma fração de ligação (M) que compreende uma alça não CDR, uma citocina e um ligante peptídico clivável (L), em que a alça não CDR é capaz de se ligar à citocina e em que a fração de ligação é capaz de inibir a ligação da citocina ao seu receptor e/ou inibir a ativação do receptor pela citocina.

25. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 24, em que a fração de ligação é capaz de se ligar a uma proteína que prolonga a meia-vida.

26. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 24 ou 25, em que a fração de ligação é um peptídeo natural, um peptídeo sintético, uma proteína estruturada modificada ou uma proteína sérica em grupo manipulada.

27. A proteína de fusão do aspecto 26, em que a proteína estruturada modificada compreende um sdAb, um scFv, um Fab, um VHH, um domínio de fibronectina tipo III, proteína estruturada do tipo imunoglobulina, DARPin, peptídeo de nó de cistina, lipocalina, proteína estruturada de feixe de três hélices, módulo de ligação à albumina relacionado à proteína G ou uma proteína estruturada de aptâmeros de DNA ou RNA.

28. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 24-27, em que a alça não CDR é de um domínio variável, um domínio constante, um domínio de conjunto C1, um domínio de conjunto C2, um domínio I ou quaisquer combinações dos mesmos.

29. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 24-28, em que a fração de ligação compreende ainda regiões determinantes de complementaridade (CDRs).

30. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 24-29, em que a fração de ligação compreende um sítio de ligação específico para uma proteína sérica em grupo.

31. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 30, em que a proteína sérica em grupo é albumina, transferrina, Fator XIII ou Fibrinogênio.

32. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 29-31, em que as CDRs fornecem o sítio de ligação específico para a proteína sérica em grupo ou a cadeia leve de imunoglobulina, ou quaisquer combinações das mesmas.

33. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 29-32, em que a fração de ligação é capaz de mascarar a ligação da citocina ao seu alvo por meio de interações intermoleculares específicas entre a fração de ligação e a citocina.

34. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 29-33, em que a alça não CDR fornece um sítio de ligação específico para a ligação da fração de ligação à citocina.

35. A proteína de ligação condicionalmente ativa de qualquer um dos aspectos 24-34, em que a citocina se liga a um receptor de citocina.

36. A proteína de fusão do aspecto 35, em que o receptor de citocina compreende um receptor de citocina de tipo I, um receptor de IL de tipo I, um receptor de IL de tipo II, um receptor de quimiocina ou um receptor de superfamília de receptores de necrose tumoral.

37. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 24-36, em que o ligante peptídico clivável compreende um sítio de clivagem.

38. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 37, em que o sítio de clivagem é reconhecido por uma protease.

39. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 38, em que o sítio de clivagem da protease é reconhecido por uma serina protease, uma cisteína protease, uma aspartato protease, uma treonina protease, uma protease de ácido glutâmico, uma metaloproteinase, uma gelatinase ou uma asparagina peptídeo liase.

40. A proteína de fusão do aspecto 38, em que o sítio de clivagem da protease é reconhecido por uma Catepsina B, uma Catepsina C, uma Catepsina D, uma Catepsina E, uma Catepsina K, uma Catepsina L, uma calicreína, um hK1, um hK10, um hK15, uma plasmina, uma colagenase, uma colagenase Tipo IV, uma estromelisina, um Fator Xa, uma protease do tipo quimiotripsina, uma protease do tipo tripsina, uma protease do tipo elastase, uma protease do tipo subtilisina, uma actinidina, uma bromelaína, uma calpaína, uma caspase, uma caspase-3, uma Mir1-CP, uma papaína, uma protease de HIV-1, uma protease de HSV, uma protease de CMV, uma quimosina, uma renina, uma pepsina, uma matriptase, uma legumaína, uma plasmepsina, uma nepentsina, uma metaloexopeptidase, uma metaloendopeptidase, uma metaloprotease de matriz (MMP), uma MMP1, uma MMP2, uma MMP3, uma MMP8, uma MMP9, uma MMP10, uma MMP11, uma MMP12, uma MMP13, uma MMP14, uma ADAM10, uma ADAM17, um ADAM12, um ativador de uroquinase plasminogênio (uPA), uma enteroquinase,

um alvo específico da próstata (PSA, hK3), uma enzima de conversão de interleucina-1β, uma trombina, um FAP (FAP-α), uma dipeptidil peptidase, ou dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26), uma protease de serina transmembrana tipo II (TTSP), uma elastase de neutrófilos, uma catepsina G, uma proteinase 3, uma serina protease de neutrófilos 4, uma quimase de mastócitos, uma triptase de mastócitos, uma dipeptidil peptidase e uma dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26).

41. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 24, compreendendo ainda um domínio de prolongamento da meia-vida ligado à fração de ligação, em que o domínio de prolongamento da meia-vida fornece à proteína de ligação um interruptor de segurança e em que, após a clivagem do ligante peptídico, a proteína de ligação é ativada por separação da fração de ligação e o domínio de prolongamento da meia-vida da citocina, e a proteína de ligação é assim separada do interruptor de segurança.

42. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 41, em que a clivagem do ligante peptídico ocorre em um microambiente tumoral.

43. Uma proteína de ligação condicionalmente ativa, compreendendo uma fração de ligação que se liga a uma citocina por meio de uma alça não CDR dentro da fração de ligação, em que a fração de ligação está ainda ligada a um domínio de prolongamento da meia-vida e compreende um ligante peptídico clivável, em que a proteína de ligação tem uma meia-vida prolongada antes de sua ativação por clivagem do ligante peptídico, e em que, após a ativação, a fração de ligação e o domínio de prolongamento da meia-vida são separados da citocina, e em que a proteína de ligação, em seu estado ativado, não tem um meia-vida prolongada.

44. A proteína de ligação condicionalmente ativa do aspecto 43, em que a clivagem do ligante peptídico ocorre em um microambiente tumoral. Elementos de prolongamento da meia-vida in vivo

[077] Preferencialmente, os polipeptídeos quiméricos compreendem um elemento de prolongamento da meia-vida in vivo. O aumento da meia-vida in vivo de moléculas terapêuticas com meia-vida naturalmente curta permite um regime de dosagem mais aceitável e administrável sem sacrificar a eficácia. Conforme usado neste documento, um "elemento de prolongamento de meia- vida" é uma parte do polipeptídeo quimérico que aumenta a meia-vida in vivo e melhora a pK, por exemplo, alterando seu tamanho (por exemplo, para fica acima do limite de filtração renal), forma, raio hidrodinâmico, carga ou parâmetros de absorção, biodistribuição, metabolismo e eliminação. Uma forma exemplificativa de melhorar a pK de um polipeptídeo é pela expressão de um elemento na cadeia polipeptídica que se liga a receptores que são reciclados para a membrana plasmática das células em vez de degradados nos lisossomas, como o receptor FcRn em células endoteliais e transferrina receptor. Três tipos de proteínas, por exemplo, IgGs, HSA (ou fragmentos) e transferrina humanas, persistem por muito mais tempo no soro humano do que seria previsto apenas por seu tamanho, que é uma função de sua capacidade de se ligar a receptores que são reciclados em vez do que degradados no lisossoma. Essas proteínas, ou fragmentos delas que retêm a ligação de FcRn, são rotineiramente ligadas a outros polipeptídeos para prolongar sua meia-vida sérica. Em uma modalidade, o elemento de prolongamento de meia-vida é um domínio de ligação de albumina de soro humano (HSA). A HSA (SEQ ID NO: 1) também pode ser diretamente ligada às composições farmacêuticas ou ligada por meio de um ligante peptídico curto. Fragmentos de HSA também podem ser usados. A HSA e seus fragmentos podem funcionar como uma fração de bloqueio e um elemento de prolongamento da meia-vida. As IgGs humanas também podem realizar uma função semelhante.

[078] O elemento de prolongamento da meia-vida sérica também pode ser um polipeptídeo de ligação ao antígeno que se liga a uma proteína com uma meia- vida sérica longa, como albumina sérica, transferrina e semelhantes. Exemplos desses polipeptídeos incluem anticorpos e seus fragmentos, incluindo um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio único, tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de nanobody tipo camelídeo (VHH), um dAb e similares. Outros domínios de ligação de antígeno adequados incluem proteínas diferentes de imunoglobulinas que imitam a ligação e/ou estrutura do anticorpo, tais como anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz, monobodies, e domínios de ligação baseados em outras proteínas estruturadas modificadas, tais como estruturas de SpA, GroEL, fibronectina, lipocallina e CTLA4. Outros exemplos de polipeptídeos de ligação ao antígeno incluem um ligante para um receptor desejado, uma fração de ligação ao ligante de um receptor, uma lectina e peptídeos que se ligam a ou se associam a um ou mais antígenos alvo.

[079] Alguns elementos de prolongamento da meia-vida sérica preferenciais são polipeptídeos que compreendem regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e, opcionalmente, alças não CDR. Vantajosamente, tais elementos de prolongamento da meia-vida sérica podem prolongar a meia- vida sérica da citocina e também funcionar como inibidores da citocina (por exemplo, via bloqueio estérico, interação não covalente ou combinação dos mesmos) e/ou como domínios de direcionamento. Em alguns casos, os elementos de prolongamento da meia-vida sérica são domínios derivados de uma molécula de imunoglobulina (molécula de Ig) ou proteínas estruturadas modificadas que mimetizam a estrutura e/ou atividade de ligação de anticorpos. A Ig pode ser de qualquer classe ou subclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, etc). Uma cadeia polipeptídica de uma molécula de Ig dobra-se em uma série de fitas beta paralelas ligadas por alças. Na região variável, três das alças constituem as "regiões determinantes de complementaridade" (CDRs) que determinam a especificidade de ligação ao antígeno da molécula. Uma molécula de IgG compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto ou um fragmento de ligação ao antígeno das mesmas. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada neste documento como VH) e uma região constante de cadeia pesada.

A região constante da cadeia pesada é composta de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada neste documento como VL) e uma região constante de cadeia leve.

A região constante de cadeia leve é composta de um domínio, CL.

As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que são hipervariáveis em sequência e/ou estão envolvidas no reconhecimento de antígeno e/ou geralmente formam alças estruturalmente definidas, intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do amino-terminal para o carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em algumas modalidades desta divulgação, pelo menos algumas ou todas as sequências de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 e FR4 fazem parte da "alça não CDR" das frações de ligação descritas neste documento.

Conforme mostrado na Fig. 5, um domínio variável de uma molécula de imunoglobulina tem várias fitas beta que ficam dispostas em duas folhas.

Os domínios variáveis de ambas as cadeias de imunoglobulina leve e pesada contêm três alças hipervariáveis, ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Os três CDRs de um domínio V (CDR1, CDR2, CDR3) agrupam-se em uma extremidade do barril beta.

As CDRs são as alças que conectam as fitas beta B-C, C'-C" e F-G da dobra da imunoglobulina, enquanto as alças inferiores que conectam as fitas beta AB, CC', C" -D e E-F da dobra da imunoglobulina, e a alça superior que conecta as fitas D-E da dobra da imunoglobulina são as alças não CDR.

Em algumas modalidades desta divulgação, pelo menos alguns resíduos de aminoácidos de um domínio constante, CH1, CH2 ou CH3, fazem parte da "alça não CDR" das frações de ligação descritas neste documento.

As alças não CDR compreendem, em algumas modalidades, uma ou mais das alças AB, CD, EF e DE de um domínio de conjunto C1 de uma Ig ou uma molécula do tipo Ig; as alças AB, CC', EF, FG,

BC e EC' de um domínio de conjunto C2 de uma Ig ou uma molécula do tipo Ig; as alças DE, BD, GF, A(A1A2)B e EF do domínio I (Intermediário) definido de uma Ig ou molécula do tipo Ig.

[080] Dentro do domínio variável, acredita-se que as CDRs sejam responsáveis pelo reconhecimento e ligação do antígeno, enquanto os resíduos de FR são considerados uma estrutura para as CDRs. No entanto, em certos casos, alguns dos resíduos de FR desempenham um papel importante no reconhecimento e ligação do antígeno. Os resíduos da região estrutural que afetam a ligação de Ag são divididos em duas categorias. Os primeiros são resíduos de FR que contatam o antígeno, portanto, fazem parte do sítio de ligação, e alguns desses resíduos estão próximos em sequência às CDRs. Outros resíduos são aqueles que estão longe das CDRs na sequência, mas estão próximos a elas na estrutura 3-D da molécula, por exemplo, uma alça na cadeia pesada. O domínio de prolongamento da meia-vida sérica (por exemplo, um domínio que compreende CDRs) pode compreender pelo menos uma alça não CDR. Em algumas modalidades, uma alça não CDR fornece um sítio de ligação para ligação a uma citocina, proteína sérica em grupo ou outro antígeno alvo.

[081] O elemento de prolongamento da meia-vida sérica, além de ou, em alternativa, conter CDRs, compreende uma alça não CDR. Em algumas modalidades, a alça não CDR é modificada para gerar um sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno alvo desejado, como uma proteína sérica em massa, como albumina, ou para a fração de citocina ou outro antígeno de direcionamento. É contemplado que várias técnicas podem ser usadas para modificar a alça não CDR, por exemplo, mutagênese dirigida ao sítio, mutagênese aleatória, inserção de pelo menos um aminoácido que é estranho à sequência de aminoácidos da alça não CDR, substituição de aminoácidos. Um peptídeo de antígeno é inserido em uma alça não CDR, em alguns exemplos. Em alguns exemplos, um peptídeo antigênico é substituído pela alça não CDR. A modificação, para gerar um sítio de ligação ao antígeno, ocorre, em alguns casos, em apenas uma alça não CDR. Em outros casos, mais de uma alça não

CDR é modificada. Por exemplo, a modificação ocorre em qualquer uma das alças não CDR mostradas na Fig. 5, isto é, AB, CC', C" D, EF e D-E. Em alguns casos, a modificação ocorre na alça DE. Em outros casos, as modificações ocorrem em todos as quatro alças AB, CC', C" –D, E-F.

[082] Em alguns exemplos, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica tem especificidade de ligação dupla e contém CDRs que se ligam especificamente a proteínas séricas em grupo, como albumina sérica, e alças não CDR que se ligam e bloqueiam especificamente o domínio de citocina. Em outros exemplos, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica contém CDRs que se ligam especificamente a um antígeno alvo, como o domínio de citocina ou outro antígeno alvo, e alças não CDR que se ligam especificamente a uma proteína sérica em grupo, como a albumina sérica. Preferencialmente, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica inibe a ligação do domínio de citocina ao receptor de citocina cognato, por exemplo, via oclusão estérica, via interações intermoleculares específicas ou uma combinação de ambas.

[083] Em algumas modalidades, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica se liga de forma não covalente diretamente à citocina e inibe sua atividade.

[084] Em certos exemplos, a fração de ligação se liga a uma citocina por meio de uma ou mais dentre as alças AB, CC', C" D e E-F e se liga a uma proteína sérica em grupo, como albumina, por meio de uma ou mais dentre as alças BC, C'C" e FG. Em certos exemplos, a fração de ligação se liga a uma proteína sérica em grupo, tal como albumina, através de sua alça AB, CC', C" D ou EF e se liga a uma citocina por meio de sua alça BC, C'C" ou FG. Em certos exemplos, a fração de ligação se liga a uma proteína sérica em grupo, tal como albumina, por meio de sua alça AB, CC', C" D e EF e está ligada a uma citocina por meio de sua alça BC, C'C" e FG. Em certos exemplos, a fração de ligação se liga a uma proteína sérica em grupo, como a albumina, através de uma ou mais dentre as alças AB, CC', C" D e E-F e se liga a uma citocina, através de uma ou mais dentre as alças BC, C'C" e FG.

[085] As frações de ligação são quaisquer tipos de polipeptídeos. Por exemplo,

em certos casos, as frações de ligação são peptídeos naturais, peptídeos sintéticos ou proteínas estruturadas de fibronectina ou proteínas séricas manipuladas. A proteína sérica em grupo compreende, por exemplo, albumina, fibrinogênio ou uma globulina. Em algumas modalidades, as frações de ligação são proteínas estruturadas modificadas. As proteínas estruturadas modificadas compreendem, por exemplo, sdAb, um scFv, um Fab, um VHH, um domínio de fibronectina tipo III, uma proteína estruturada do tipo imunoglobulina (como sugerido em Halaby et al., 1999. Prot Eng 12(7): 563-571), DARPin, peptídeo de nó de cistina, lipocalina, proteína estruturada de feixe de três hélices, módulo de ligação de albumina relacionado à proteína G ou proteína estruturada de aptâmeros de DNA ou RNA.

[086] Em alguns casos, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica se liga ao domínio de citocina por meio de suas alças não CDR e o domínio de citocina é ainda conectado a um domínio de direcionamento conforme descrito neste documento. Em alguns casos, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica compreende um sítio de ligação para uma proteína sérica em grupo. Em algumas modalidades, as CDRs fornecem o sítio de ligação para a proteína sérica em grupo. A proteína sérica em grupo é, em alguns exemplos, uma globulina, albumina, transferrina, IgG1, IgG2, IgG4, IgG3, monômero de IgA, Fator XIII, Fibrinogênio, IgE ou IgM pentamérica. Em algumas modalidades, a CDR forma um sítio de ligação para uma cadeia leve de imunoglobulina, como uma cadeia leve livre de Igκ ou uma cadeia leve livre de Igλ.

[087] Uma proteína condicionalmente ativa exemplificativa é mostrada na Fig.

6. No exemplo ilustrado, as alças não CDR em um domínio de ligação de albumina sérica (por exemplo, um dAb) podem formar um sítio de ligação para a citocina IL-12. Neste exemplo, o sítio de ligação para albumina sérica pode ser formado pelas CDRs do domínio de ligação de albumina sérica.

[088] O elemento de prolongamento da meia-vida sérica pode ser qualquer tipo de domínio de ligação, incluindo, mas não se limitando a, domínios de um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, a fração de ligação é um fragmento variável de cadeia única (scFv), anticorpo de domínio único, como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável (VHH) de nanobody derivado de camelídeo. Em outras modalidades, as frações de ligação são domínios de ligação não-Ig, ou seja, miméticos de anticorpo, tais como anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz e monobodies.

[089] Em outras modalidades, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica pode ser um polímero solúvel em água ou um peptídeo que é conjugado a um polímero solúvel em água, como PEG. “PEG”, “polietilenoglicol” e “poli (etilenoglicol)”, conforme usados neste documento, são intercambiáveis e abrangem qualquer poli(óxido de etileno) não peptídico solúvel em água. O termo “PEG” também significa um polímero que contém uma maioria, ou seja, maior que 50%, subunidades de repetição —OCH2CH2—. Com relação a formas específicas, o PEG pode assumir qualquer número de uma variedade de pesos moleculares, bem como estruturas ou geometrias, como "ramificado", "linear", "bifurcado", "multifuncional" e semelhantes, a serem descritos em maiores detalhes abaixo. O PEG não está limitado a uma estrutura particular e pode ser linear (por exemplo, uma extremidade limitada, por exemplo, PEG alcoxi ou um PEG bifuncional), ramificado ou de multi-ramificado (por exemplo, PEG bifurcado ou PEG ligado a um núcleo de poliol), um arquitetura dendrítica (ou em forma de estrela), cada uma com ou sem uma ou mais ligações degradáveis. Além disso, a estrutura interna do PEG pode ser organizada em qualquer número de padrões de repetição diferentes e pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em homopolímero, copolímero alternado, copolímero aleatório, copolímero em bloco, tripolímero alternado, tripolímero aleatório e tripolímero em bloco. Os PEGs podem ser conjugados a polipeptídeos e peptídeos por meio de qualquer método adequado. Normalmente, um derivado de PEG reativo, tal como N- hidroxisuccinamidil éster PEG, é feito reagir com um peptídeo ou polipeptídeo que inclui aminoácidos com uma cadeia lateral que contém uma amina, sulfidrila, ácido carboxílico ou grupo funcional hidroxila, tal como cisteína, lisina, asparagina, glutamina, teonina, tirosina, serina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Domínios de direcionamento e retenção

[090] Para certas aplicações, pode ser desejável maximizar a quantidade de tempo que o construto fica presente em sua localização desejada no corpo. Isto pode ser conseguido incluindo um domínio adicional no polipeptídeo quimérico (proteína de fusão) para influenciar seus movimentos dentro do corpo. Por exemplo, os ácidos nucleicos quiméricos podem codificar um domínio que direciona o polipeptídeo para um sítio no corpo, por exemplo, células tumorais ou um sítio de inflamação; este domínio é denominado um "domínio de direcionamento" e/ou codifica um domínio que retém o polipeptídeo em um sítio no corpo, por exemplo, células tumorais ou um sítio de inflamação; este domínio é denominado “domínio de retenção”. Em algumas modalidades, um domínio pode funcionar como um domínio de direcionamento e de retenção. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento e/ou domínio de retenção são específicos para um ambiente rico em protease. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento codificado e/ou domínio de retenção são específicos para células T reguladoras (Tregs), por exemplo, direcionando os receptores CCR4 ou CD39. Outros domínios de direcionamento e/ou retenção adequados compreendem aqueles que têm um ligante cognato que é superexpresso em tecidos inflamados, por exemplo, o receptor de IL-1 ou o receptor de IL-6. Em outras modalidades, os domínios de direcionamento e/ou retenção adequados compreendem aqueles que têm um ligante cognato que é superexpresso no tecido tumoral, por exemplo, Epcam, CEA ou mesotelina. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento está ligado à interleucina por meio de um ligante peptídico que é clivado no sítio de ação (por exemplo, por inflamação ou proteases específicas do câncer), liberando a atividade total da interleucina no sítio desejado. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento e/ou retenção está ligado à interleucina por meio de um ligante peptídico que não é clivado no sítio de ação (por exemplo, por inflamação ou proteases específicas do câncer), fazendo com que a citocina permaneça no sítio desejado.

[091] Os antígenos escolhidos, em alguns casos, são expressos na superfície de uma célula ou tecido doente, por exemplo, um tumor ou uma célula cancerígena. Antígenos úteis para o direcionamento e retenção de tumores incluem, mas não estão limitados a proteína alfa de ativação de fibroblastos (FAPa), glicoproteína de trofoblastos (5T4), transdutor de sinal de cálcio associado a tumor 2 (Trop2), fibronectina EDB (EDB-FN), FOLR1, domínio de fibronectina EIIIB, EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, c-Met, FOLR1 e CEA. As composições farmacêuticas divulgadas neste documento também incluem proteínas que compreendem dois domínios de direcionamento e/ou retenção que se ligam a dois antígenos alvo diferentes conhecidos por serem expressos em uma célula ou tecido doente. Pares exemplares de domínios de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a EGFR/CEA, EpCAM/CEA e HER- 2/HER-3.

[092] Domínios de direcionamento e/ou de retenção adequados incluem domínios de ligação de antígeno, tais como anticorpos e seus fragmentos, incluindo um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio único, tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de nanobody tipo camelídeo (VHH), um dAb e similares. Outros domínios de ligação de antígeno adequados incluem proteínas diferentes de imunoglobulinas que imitam a ligação e/ou estrutura do anticorpo, tais como anticalinas, afilinas, moléculas de affibody, affimers, afitinas, alphabodies, avimers, DARPins, fynomers, peptídeos de domínio kunitz, monobodies, e domínios de ligação baseados em outras proteínas estruturadas modificadas, tais como estruturas de SpA, GroEL, fibronectina, lipocallina e CTLA4. Outros exemplos de polipeptídeos de ligação ao antígeno incluem um ligante para um receptor desejado, uma fração de ligação ao ligante de um receptor, uma lectina e peptídeos que se ligam a ou se associam a um ou mais antígenos alvo.

[093] Em algumas modalidades, os domínios de direcionamento e/ou retenção se ligam especificamente a uma molécula da superfície celular. Em algumas modalidades, os domínios de direcionamento e/ou retenção se ligam especificamente a um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam específica e independentemente a um antígeno tumoral selecionado a partir de pelo menos um dentre proteína de ativação de fibroblastos alfa (FAPa), glicoproteína de trofoblasto (5T4), transdutor de sinal de cálcio associado a tumor 2 (Trop2), Fibronectina EDB (EDB -FN), FOLR1, domínio de fibronectina EIIIB, EpCAM, EGFR, HER-2, HER- 3, cMet, CEA e FOLR1. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de direcionamento se ligam específica e independentemente a dois antígenos diferentes, em que pelo menos um dos antígenos é um antígeno tumoral selecionado dentre proteína alfa de ativação de fibroblastos (FAPa), glicoproteína de trofoblastos (5T4), transdutor de sinal de cálcio associado a tumor 2 (Trop2), fibronectina EDB (EDB-FN), FOLR1, domínio de fibronectina EIIIB, EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, cMet, CEA e FOLR1.

[094] O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode ser um antígeno tumoral expresso em uma célula tumoral. Os antígenos tumorais são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, proteína alfa de ativação de fibroblastos (FAPa), glicoproteína de trofoblastos (5T4), transdutor de sinal de cálcio associado a tumor 2 (Trop2), fibronectina EDB (EDB-FN), FOLR1, domínio de fibronectina EIIIB, EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, c-Met, FOLR1, PSMA, CD38, BCMA e CEA. 5T4, AFP, B7-H3, Caderina-6, CAIX, CD117, CD123, CD138, CD166, CD19, CD20, CD205, CD22, CD30, CD33, CD352, CD37, CD44, CD52, CD56, CD70, CD71, CD74, CD79b, DLL3, EphA2, FAP, FGFR2, FGFR3, GPC3, gpA33, FLT-3, gpNMB, HPV-16 E6, HPV-16 E7, ITGA2, ITGA3, SLC39A6, MAGE, mesotelina, Muc1, Muc16, NaPi2b, Nectina 4, P-caderina, NY-

ESO-1, PRLR, PSCA, PTK7, ROR1, SLC44A4, SLTRK5, SLTRK6, STEAP1, TIM1, Trop2, WT1.

[095] O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode ser uma proteína de ponto de controle imunológico. Exemplos de proteínas de checkpoint imunológico incluem, mas não estão limitados a CD27, CD137, 2B4, TIGIT, CD155, ICOS, HVEM, CD40L, LIGHT, TIM-1, OX40, DNAM-1, PD-L1, PD1, PD- L2, CTLA -4, CD8, CD40, CEACAM1, CD48, CD70, A2AR, CD39, CD73, B7-H3, B7-H4, BTLA, IDO1, IDO2, TDO, KIR, LAG-3, TIM-3 ou VISTA.

[096] O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode ser uma molécula de superfície celular, como uma proteína, lipídio ou polissacarídeo. Em algumas modalidades, um antígeno de direcionamento e/ou retenção está em uma célula tumoral, célula infectada por vírus, célula infectada por bactérias, glóbulo vermelho danificado, célula de placa arterial, inflamada ou célula de tecido fibrótico. O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode compreender um modulador de resposta imune. Exemplos de modulador de resposta imune incluem, mas não estão limitados a fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF), fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), interleucina 2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), GITRL, CD3 ou GITR.

[097] O antígeno de direcionamento e/ou retenção pode ser um receptor de citocina. Exemplos de receptores de citocina incluem, mas não estão limitados a receptores de citocina Tipo I, tais como receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptores IL Tipo I, receptor Epo, receptor LIF, receptor CNTF, receptor TPO; Receptores de citocinas do tipo II, tais como receptor de IFN-alfa (IFNAR1, IFNAR2), receptor de IFB-beta, receptor de IFN-gama (IFNGR1, IFNGR2), receptores de IL do tipo II; receptores de quimiocinas, tais como receptores de quimiocinas CC, receptores de quimiocinas CXC, receptores de quimiocinas CX3C, receptores de quimiocinas XC; receptores da superfamília de receptores de necrose tumoral, tais como TNFRSF5/CD40, TNFRSF8/CD30,

TNFRSF7/CD27, TNFRSF1A/TNFR1/CD120a, TNFRSF1B/TNFR2/CD120b; Receptores TGF-beta, tais como receptor TGF-beta 1, receptor TGF-beta 2; Receptores da superfamília Ig, como os receptores IL-1, CSF-1R, PDGFR (PDGFRA, PDGFRB), SCFR. Ligantes peptídicos

[098] Como afirmado acima, as composições farmacêuticas compreendem uma ou mais sequências de ligantes peptídicos. Uma sequência de ligantes peptídicos serve para fornecer flexibilidade entre polipeptídeos, de modo que, por exemplo, a fração de bloqueio seja capaz de inibir a atividade do polipeptídeo de citocina. A sequência de ligantes peptídicos pode estar localizada entre qualquer ou todos os polipeptídeos de citocina, o elemento de prolongamento da meia-vida sérica e/ou a fração de bloqueio. Conforme descrito neste documento, pelo menos um dos ligantes peptídicos é clivável por protease e contém um (um ou mais) sítio de clivagem para uma (uma ou mais) protease desejada. Preferencialmente, a protease desejada é enriquecida ou expressa seletivamente no sítio desejado de atividade da citocina (por exemplo, o microambiente tumoral). Assim, a proteína de fusão é preferencialmente ou seletivamente clivada no sítio da atividade de citocina desejada.

[099] A orientação dos componentes da composição farmacêutica é em grande parte uma questão de escolha de projeto e é reconhecido que múltiplas orientações são possíveis e todas se destinam a ser abrangidas por esta divulgação. Por exemplo, uma fração de bloqueio pode estar localizada no terminal C ou no terminal N de um polipeptídeo de citocina.

[100] Proteases conhecidas por estarem associadas a células ou tecidos doentes incluem, mas não estão limitadas a serina proteases, cisteína proteases, aspartato proteases, treonina proteases, ácido glutâmico proteases, metaloproteases, asparagina peptídeo liases, proteases séricas, catepsinas, Catepsina B, Catepsina C, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina K, Catepsina L, calicreínas, hKl, hK10, hK15, plasmina, colagenase, colagenase Tipo IV, estromelisina, Fator Xa, protease do tipo quimiotripsina, protease do tipo tripsina,

protease do tipo elastase, protease do tipo subtilisina, actinidaína, bromelaína, calpaína, caspases, caspase-3, Mirl-CP, papaína, protease de HIV-1, protease de HSV, protease de CMV, quimosina, renina, pepsina, matriptase, legumaína, plasmepsina, nepentesina, metalo-exopeptidases, metalo-endopeptidases, metaloproteases de matriz (MMP), MMP1, MMP2, MMP3, MMP8, MMP9, MMP13, MMP11, MMP14, ativador de uroquinase plasminogênio (uPA), enteroquinase, antígeno específico da próstata (PSA, hK3), enzima de conversão de interleucina-1β, trombina, FAP (FAP-a), dipeptidil peptidase, meprinas, granzimas e dipeptidil peptidase IV (DPPIV/CD26). Proteases capazes de clivar sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácido nucleico quiméricas fornecidas neste documento podem, por exemplo, ser selecionadas do grupo que consiste em um antígeno específico da próstata (PSA), uma metaloproteinase de matriz (MMP), uma desintegrina A e uma metaloproteinase (ADAM), um ativador de plasminogênio, uma catepsina, uma caspase, uma protease de superfície de célula tumoral e uma elastase. A MMP pode ser, por exemplo, uma metaloproteinase de matriz 2 (MMP2) ou metaloproteinase de matriz 9 (MMP9).

[101] Proteases úteis nos métodos divulgados neste documento são apresentadas na Tabela 1, e proteases exemplares e seus sítios de clivagem são apresentados na Tabela 1a: Tabela 1. Proteases relevantes para inflamação e câncer Protease Especificidade Outros Aspectos Secretado por células T killer: Granzima B (grB) Cliva após resíduos Tipo de serina protease; de Asp (asp-ase) fortemente implicado na indução de apoptose de células alvo dependente de perforina Granzima A (grA) semelhante à Tipo de serina protease; tripsina, cliva após resíduos básicos Granzima H (grH) Especificidade do Tipo de serina protease; substrato Outras granzimas também são desconhecida secretadas por células T killer, mas nem todas estão presentes em humanos Caspase-8 Cliva após resíduos Tipo de cisteína protease; de Asp desempenha um papel essencial na expansão celular induzida por TCR - papel molecular exato incerto Tecido linfoide Cliva após resíduos Tipo de cisteína protease; associado à mucosa de arginina provavelmente atua como uma (MALT1) proteína estruturada e uma enzima proteoliticamente ativa na via de sinalização dependente de CBM Triptase Alvos: angiotensina I, Tipo de serina protease fibrinogênio, pró- específica de mastócitos; uroquinase, semelhante à tripsina; resistente TGFβ; à inibição por inibidores da preferencialmente protease macromoleculares cliva proteínas após expressos em mamíferos devido resíduos de lisina ou a sua estrutura tetramérica, com arginina todos os sítios voltados para o poro central estreito; também associado à inflamação Associado à inflamação: Trombina Alvos: FGF-2, Tipo de serina protease; modula

HB-EGF, a atividade de fatores de osteopontina, PDGF, crescimento vascular, VEGF quimiocinas e proteínas extracelulares; fortalece a proliferação induzida por VEGF; induz a migração celular; fator angiogênico; regula a hemostasia Quimase Exibem Tipo de serina protease especificidade específica de mastócitos semelhante à quimiotripsina, clivando proteínas após resíduos de aminoácidos aromáticos Carboxipeptidase A Cliva resíduos de Tipo de metaloproteinase (MC-CPA) aminoácidos da dependente de zinco extremidade C- terminal de peptídeos e proteínas Calicreínas Alvos: alto peso Tipo de serina protease; molecular modulam a resposta de quininogênio, pró- relaxamento; contribuem para a uroquinase resposta inflamatória; degradação de fibrina Elastase Alvos: E-caderina, Tipo de serina protease serina GM-CSF, IL-1, IL-2, de neutrófilos; degrada os IL-6, IL8, p38MAPK, componentes de ECM; regula a

TNFα, VE-caderina resposta inflamatória; ativa a sinalização pró-apoptótica Catepsina G Alvos: EGF, ENA-78, Tipo de serina protease; degrada IL-8, MCP-1, MMP-2, os componentes de ECM; MT1-MMP, quimioatrativo de leucócitos; PAI-1, RANTES, regula a resposta inflamatória; TGFβ, TNFα promove a apoptose PR-3 Alvos: ENA-78, IL-8, Tipo de serina protease; IL-18, JNK, p38MAPK, promove resposta inflamatória; TNFα ativa a sinalização pró- apoptótica Granzima M (grM) Cliva após Met e Tipo de serina protease; outros resíduos expresso apenas em células NK hidrofóbicos longos e não ramificados Calpaínas Clivam entre Arg e Família de cisteína proteases; Gly dependente de cálcio; a ativação está envolvida no processo de inúmeras doenças associadas à inflamação Tabela 1a: Proteases Exemplares e Sequências de Reconhecimento de Protease Protease Sequência do Domínio SEQ ID de Clivagem NO: MMP7 KRALGLPG 2 MMP7 (DE)8RPLALWRS(DR)8 3 MMP9 PR(S/T)(L/I)(S/T) 4 MMP9 LEATA 5 MMP11 GGAANLVRGG 6

MMP14 SGRIGFLRTA 7 MMP PLGLAG 8 MMP PLGLAX 9 MMP PLGC(me)AG 10 MMP ESPAYYTA 11 MMP RLQLKL 12 MMP RLQLKAC 13 MMP2, MMP9, MMP14 EP(Cit)G(Hof)YL 14 Ativador da plasminogênio SGRSA 15 uroquinase (uPA) Ativador da plasminogênio DAFK 16 uroquinase (uPA) Ativador da plasminogênio GGGRR 17 uroquinase (uPA) Enzima lisossômica GFLG 18 Enzima lisossômica ALAL 19 Enzima lisossômica FK 20 Catepsina B NLL 21 Catepsina D PIC(Et)FF 22 Catepsina K GGPRGLPG 23 Antígeno Específico da HSSKLQ 24 Próstata Antígeno Específico da HSSKLQL 25 Próstata Antígeno Específico da HSSKLQEDA 26 Próstata Protease de vírus Herpes LVLASSSFGY 27 Simplex Protease do HIV GVSQNYPIVG 28

Protease do CMV GVVQASCRLA 29 Trombina F(Pip)RS 30 Trombina DPRSFL 31 Trombina PPRSFL 32 Caspase-3 DEVD 33 Caspase-3 DEVDP 34 Caspase-3 KGSGDVEG 35 Enzima conversora de GWEHDG 36 interleucina 1β Enteroquinase EDDDDKA 37 FAP KQEQNPGST 38 Calicreína 2 GKAFRR 39 Plasmina DAFK 40 Plasmina DVLK 41 Plasmina DAFK 42 TOP ALLLALL 43

[102] São fornecidas neste documento composições farmacêuticas que compreendem sequências polipeptídicas. Tal como acontece com todos os peptídeos, polipeptídeos e proteínas, incluindo seus fragmentos, entende-se que podem ocorrer modificações adicionais na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos quiméricos (variantes de sequências de aminoácidos) que não alteram a natureza ou função dos peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Essas modificações incluem substituições conservativas de aminoácidos e são discutidas em mais detalhes abaixo.

[103] As composições fornecidas neste documento têm uma função desejada. As composições são constituídas por pelo menos uma IL-12, um polipeptídeo de citocina, uma fração de bloqueio, por exemplo, um polipeptídeo de bloqueio estérico e um elemento de prolongamento da meia-vida sérica opcional e um polipeptídeo de direcionamento opcional, com um ou mais ligantes peptídicos conectando cada polipeptídeo na composição. O primeiro polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo de IL-12, é fornecido para ser um agente ativo. A fração de bloqueio é fornecida para bloquear a atividade da interleucina. O polipeptídeo ligante, por exemplo, um polipeptídeo clivável por protease, é fornecido para ser clivado por uma protease que é especificamente expressa no alvo pretendido do agente ativo. Opcionalmente, a fração de bloqueio bloqueia a atividade do primeiro polipeptídeo através da ligação do polipeptídeo de interleucina. Em algumas modalidades, a fração de bloqueio, por exemplo, um peptídeo de bloqueio estérico, está ligada à interleucina por meio de um ligante peptídico clivável por protease que é clivado no sítio de ação (por exemplo, por proteases específicas de inflamação), liberando a atividade total da citocina no sítio desejado.

[104] O sítio de clivagem de protease pode ser um sítio de clivagem de protease de ocorrência natural ou um sítio de clivagem de protease modificado artificialmente. O sítio de clivagem de protease modificado artificialmente pode ser clivado por mais de uma protease específica para o ambiente desejado no qual a clivagem ocorrerá, por exemplo, um tumor. O sítio de clivagem da protease pode ser clivável por pelo menos uma protease, pelo menos duas proteases, pelo menos três proteases ou pelo menos quatro proteases.

[105] Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende glicina-glicina, um motivo de reconhecimento de sortase, ou um motivo de reconhecimento de sortase e uma sequência peptídica (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 81) ou (Gly3Ser)n, (SEQ ID NO.: 82), em que n é 1, 2, 3, 4 ou 5. Em uma modalidade, o motivo de reconhecimento de sortase compreende uma sequência peptídica LPXTG (SEQ ID NO: 80), onde X é um aminoácido. Em uma modalidade, a ligação covalente é entre um resíduo de lisina reativo ligado ao terminal C do polipeptídeo de citocina e um ácido aspártico reativo ligado ao terminal N da fração de bloqueio ou outra fração. Em uma modalidade, a ligação covalente é entre um resíduo de ácido aspártico reativo ligado ao terminal N do polipeptídeo de citocina e um resíduo de lisina reativo ligado ao terminal C da fração de bloqueio ou outra fração. Clivagem e indutibilidade

[106] Conforme descrito neste documento, a atividade do polipeptídeo de citocina no contexto da proteína de fusão é atenuada e a clivagem pela protease no sítio de atividade desejado, como em um microambiente tumoral, libera uma forma da citocina a partir da proteína de fusão que é muito mais ativa como um agonista do receptor de citocina do que a proteína de fusão. Por exemplo, a atividade de ativação do receptor de citocina (agonista) do polipeptídeo de fusão pode ser de pelo menos cerca de 10X, pelo menos cerca de 50X, pelo menos cerca de 100X, pelo menos cerca de 250X, pelo menos cerca de 500X, ou pelo menos cerca de 1000x menor que a atividade de ativação do receptor de citocina do polipeptídeo de citocina como uma entidade molecular separada. O polipeptídeo de citocina que faz parte da proteína de fusão existe como uma entidade molecular separada quando contém um aminoácido que é substancialmente idêntico ao polipeptídeo de citocina e não inclui substancialmente aminoácidos adicionais e não está associado (por ligações covalentes ou não covalentes) a outras moléculas. Se necessário, um polipeptídeo de citocina como uma entidade molecular separada pode incluir algumas sequências de aminoácidos adicionais, como um marcador ou sequência curta para auxiliar na expressão e/ou purificação.

[107] Em outros exemplos, a atividade de ativação do receptor de citocina (agonista) do polipeptídeo de fusão é pelo menos cerca de 10X, pelo menos cerca de 50X, pelo menos cerca de 100X, pelo menos cerca de 250X, pelo menos cerca de 500X, ou cerca de 1000x menor que a atividade de ativação do receptor de citocina do polipeptídeo que contém o polipeptídeo de citocina que é produzido pela clivagem do ligante peptídico clivável pela protease na proteína de fusão. Em outras palavras, a atividade de ativação do receptor de citocina (agonista) do polipeptídeo que contém o polipeptídeo de citocina que é produzido pela clivagem do ligante peptídico clivável por protease na proteína de fusão é de pelo menos cerca de 10X, pelo menos cerca de 50X, pelo menos cerca de 100X, pelo menos cerca de250X, pelo menos cerca de 500X, ou pelo menos cerca de 1000x maior que a atividade de ativação do receptor de citocina da proteína de fusão. Substituições de polipeptídeo

[108] Os polipeptídeos descritos neste documento podem incluir componentes (por exemplo, a citocina, a fração de bloqueio) que têm a mesma sequência de aminoácidos da proteína de ocorrência natural correspondente (por exemplo, IL- 2, IL-15, HSA) ou podem ter uma sequência de aminoácidos que difere da proteína de ocorrência natural, desde que a função desejada seja mantida. Entende-se que uma maneira de definir quaisquer modificações e derivados conhecidos ou aqueles que possam surgir das proteínas divulgadas, e ácidos nucleicos que as codificam, é através da definição das variantes de sequência em termos de identidade para sequências de referência conhecidas específicas. São divulgados, especificamente, polipeptídeos e ácidos nucleicos que têm pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento de identidade com os polipeptídeos quiméricos fornecidos neste documento. Por exemplo, são fornecidos polipeptídeos ou ácidos nucleicos que têm pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento de identidade com a sequência de qualquer um dos ácidos nucleicos ou polipeptídeos descritos neste documento. Os versados na técnica compreendem facilmente como determinar a identidade de dois polipeptídeos ou dois ácidos nucleicos. Por exemplo, a identidade pode ser calculada após o alinhamento das duas sequências para que a identidade esteja em seu nível mais alto.

[109] Outra maneira de calcular a identidade pode ser realizada por algoritmos publicados. O alinhamento ideal de sequências para a comparação pode ser realizado pelo algoritmo de identidade local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de identidade de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa pelo método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) ou por inspeção.

[110] Os mesmos tipos de identidade podem ser obtidos para ácidos nucleicos, por exemplo, pelos algoritmos divulgados em Zuker, Science 244: 48-52 (1989); Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706-7710 (1989); Jaeger et al., Methods Enzymol. 183: 281-306 (1989), que são incorporados neste documento por referência para pelo menos o material relacionado ao alinhamento de ácido nucleico. Entende-se que qualquer um dos métodos pode normalmente ser usado e que, em certos casos, os resultados desses vários métodos podem diferir, mas o versado na técnica entende que se a identidade for encontrada com pelo menos um desses métodos, as sequências seriam consideradas como tendo a identidade declarada, e ser divulgada neste documento.

[111] As modificações de proteínas incluem modificações na sequência de aminoácidos. As modificações na sequência de aminoácidos podem surgir naturalmente como variações alélicas (por exemplo, devido ao polimorfismo genético), podem surgir devido à influência ambiental (por exemplo, por exposição à luz ultravioleta) ou podem ser produzidas por intervenção humana (por exemplo, por mutagênese de clonagem Sequências de DNA), tais como ponto induzido, deleção, inserção e mutantes de substituição. Essas modificações podem resultar em mudanças na sequência de aminoácidos, fornecer mutações silenciosas, modificar um sítio de restrição ou fornecer outras mutações específicas. As modificações da sequência de aminoácidos normalmente se encontram em uma ou mais das três classes: modificações substitucionais, de inserção ou deleção. As inserções incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila, bem como inserções intrassequenciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. As inserções normalmente serão inserções menores do que aquelas de fusões de terminal amino ou carboxila, por exemplo,

na ordem de um a quatro resíduos.

As deleções são caracterizadas pela remoção de um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de proteína.

Normalmente, não mais do que cerca de 2 a 6 resíduos são deletados em qualquer sítio dentro da molécula de proteína.

As substituições de aminoácidos são normalmente de resíduos únicos, mas podem ocorrer em vários sítios diferentes ao mesmo tempo; as inserções serão normalmente da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos; e as deleções variarão de cerca de 1 a 30 resíduos.

Deleções ou inserções são feitas preferencialmente em pares adjacentes, isto é, uma deleção de 2 resíduos ou inserção de 2 resíduos.

Substituições, deleções, inserções ou qualquer combinação destas podem ser combinadas para chegar a um construto final.

As mutações não devem colocar a sequência fora do quadro de leitura e, preferencialmente, não criarão regiões complementares que poderiam produzir estrutura de mRNA secundária.

Modificações de substituição são aquelas em que pelo menos um resíduo foi removido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar.

Essas substituições geralmente são feitas de acordo com a Tabela 2 a seguir e são referidas como substituições conservativas.

Tabela 2. Substituições de aminoácidos exemplificativas Aminoácido Substituições exemplificativas

Ala Ser, Gly, Cys Arg Lys, Gln, Met, Ile Asn Gln, His, Glu, Asp Asp Glu, Asn, Gln Cys Ser, Met, Thr Gln Asn, Lys, Glu, Asp Glu Asp, Asn, Gln Gly Pro, Ala

His Asn, Gln Ile Leu, Val, Met Leu Ile, Val, Met Lys Arg, Gln, Met, Ile Met Leu, Ile, Val Phe Met, Leu, Tyr, Trp, His Ser Thr, Met, Cys Thr Ser, Met, Val Trp Tyr, Phe Tyr Trp, Phe, His Val Ile, Leu, Met

[112] As modificações, incluindo as substituições de aminoácidos específicas, são feitas por métodos conhecidos. Por exemplo, as modificações são feitas por mutagênese específica do sítio de nucleotídeos no DNA que codifica o polipeptídeo, produzindo assim o DNA que codifica a modificação e, em seguida, expressando o DNA em cultura de células recombinantes. As técnicas para fazer mutações de substituição em sítios predeterminados no DNA com uma sequência conhecida são bem conhecidas, por exemplo, a mutagênese do primer M13 e a mutagênese por PCR.

[113] As modificações podem ser selecionadas para otimizar a ligação. Por exemplo, as técnicas de maturação de afinidade podem ser usadas para alterar a ligação do scFv pela introdução de mutações aleatórias dentro das regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Essas mutações aleatórias podem ser introduzidas usando uma variedade de técnicas, incluindo radiação, mutagênicos químicos ou PCR propensa a erros. Múltiplas rodadas de mutação e seleção podem ser realizadas usando, por exemplo, exibição de fagos.

[114] A divulgação também se refere aos ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos quiméricos descritos neste documento e ao uso de tais ácidos nucleicos para produzir os polipeptídeos quiméricos e para fins terapêuticos. Por exemplo, a invenção inclui moléculas de DNA e RNA (por exemplo, mRNA, RNA autorreplicante) que codificam um polipeptídeo quimérico e para o uso terapêutico de tais moléculas de DNA e RNA. Composições Exemplificativas

[115] Proteínas de fusão exemplificativas da invenção combinam os elementos descritos acima em uma variedade de orientações. As orientações descritas nesta seção são exemplos e não devem ser consideradas limitantes.

[116] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo de IL-12, uma fração de bloqueio e um elemento de prolongamento da meia-vida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-12 é posicionado entre o elemento de prolongamento da meia-vida e a fração de bloqueio. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-12 é do terminal N para a fração de bloqueio e o elemento de prolongamento da meia-vida. Em algumas dessas modalidades, o polipeptídeo de IL-12 é proximal à fração de bloqueio; em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo de IL-12 é proximal ao elemento de prolongamento da meia-vida. Pelo menos um ligante peptídico clivável por protease deve ser incluído em todas as modalidades, de modo que o polipeptídeo de IL-12 possa ser ativo após a clivagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-12 é do terminal C para a fração de bloqueio e o elemento de prolongamento da meia-vida. Elementos adicionais podem ser ligados uns aos outros por um ligante peptídico clivável, um ligante peptídico não clivável ou por fusão direta.

[117] Em algumas modalidades, os domínios de bloqueio usados são capazes de prolongar a meia-vida e o polipeptídeo de IL-12 é posicionado entre dois desses domínios de bloqueio. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-12 é posicionado entre dois domínios de bloqueio, um dos quais é capaz de prolongar a meia-vida.

[118] Em algumas modalidades, duas citocinas estão incluídas no mesmo construto. Em algumas modalidades, as citocinas são conectadas a dois domínios de bloqueio cada (três no total em uma molécula), com um domínio de bloqueio entre os dois domínios de citocina. Em algumas modalidades, um ou mais domínios de prolongamento da meia-vida adicionais podem ser incluídos para otimizar as propriedades farmacocinéticas.

[119] Em algumas modalidades, três citocinas estão incluídas no mesmo construto. Em algumas modalidades, a terceira citocina pode funcionar para bloquear as outras duas no lugar de um domínio de bloqueio entre as duas citocinas.

[120] Os elementos de prolongamento da meia-vida preferenciais para uso nas proteínas de fusão são albumina sérica humana (HSA), um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, scFV, dAb) que se liga à albumina sérica, uma IgG humana ou humanizada, ou um fragmento de qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades preferenciais, a fração de bloqueio é albumina sérica humana (HSA), ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga à albumina sérica, um anticorpo que se liga à citocina e evita a ativação da ligação ou ativação do receptor de citocina, outra citocina ou um fragmento de qualquer um dos anteriores. Em modalidades preferenciais compreendendo um domínio de direcionamento adicional, o domínio de direcionamento é um anticorpo que se liga a uma proteína da superfície celular que é enriquecida na superfície de células cancerosas, como EpCAM, FOLR1 e Fibronectina. Métodos de Tratamento e Composições Farmacêuticas

[121] Além disso, são fornecidos métodos de tratamento de um sujeito com ou em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio, como doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária ou doença do enxerto contra o hospedeiro. Os métodos de administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão, conforme divulgado neste documento, que é tipicamente administrada como uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente selecionar um sujeito com ou em risco de desenvolver tal doença ou distúrbio. A composição farmacêutica compreende preferencialmente um polipeptídeo de IL-12 bloqueado, fragmento ou muteína deste que é ativada em um sítio de inflamação. Em uma modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende um polipeptídeo de IL-12, fragmento ou muteína deste e um elemento de prolongamento da meia-vida sérico. Em outra modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende um polipeptídeo de IL-12, fragmento ou muteína deste e uma fração de bloqueio, por exemplo, um polipeptídeo de bloqueio estérico, em que o polipeptídeo de bloqueio estérico é capaz de bloquear estericamente a atividade do polipeptídeo de IL-12, fragmento ou muteína deste. Em outra modalidade, o polipeptídeo quimérico compreende um polipeptídeo de IL-12, fragmento ou muteína deste, uma fração de bloqueio e um elemento de extensão de meia-vida sérico.

[122] A inflamação é parte da resposta biológica complexa dos tecidos do corpo a estímulos prejudiciais, como patógenos, células danificadas ou irritantes, e é uma resposta protetora que envolve células imunes, vasos sanguíneos e mediadores moleculares. A função da inflamação é eliminar a causa inicial da lesão celular, limpar as células necróticas e os tecidos danificados pelo insulto original e o processo inflamatório e iniciar o reparo do tecido. A inflamação pode ocorrer por infecção, como sintoma ou doença, por exemplo, câncer, aterosclerose, alergias, miopatias, HIV, obesidade ou uma doença autoimune. Uma doença autoimune é uma condição crônica decorrente de uma resposta imune anormal a um autoantígeno. As doenças autoimunes que podem ser tratadas com os polipeptídeos divulgados neste documento incluem, mas não estão limitadas a lúpus, doença celíaca, diabetes mellitus tipo 1, doença de Graves, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, psoríase, artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistêmico.

[123] A composição farmacêutica pode compreender uma ou mais sequência de ligante peptídico cliváveis por protease. A sequência de ligante peptídico serve para fornecer flexibilidade entre os polipeptídeos, de modo que cada polipeptídeo seja capaz de inibir a atividade do primeiro polipeptídeo. A sequência de ligante peptídico pode estar localizada entre qualquer ou todos os polipeptídeos de citocina, fragmento ou muteína deste, a fração de bloqueio e o elemento de extensão de meia-vida sérico. Opcionalmente, a composição compreende, duas, três, quatro ou cinco sequência de ligante peptídico. A sequência de ligante peptídico, duas, três ou quatro sequências de ligante peptídico podem ser as mesmas ou diferentes sequências de ligante peptídico. Em uma modalidade, a sequência de ligante peptídico compreende GGGGS (SEQ ID NO: 87), GSGSGS (SEQ ID NO: 88) ou G (SGGG)2SGGT (SEQ ID NO: 89). Em outra modalidade, o ligante peptídico compreende uma sequência clivável por protease selecionada do grupo consistindo em HSSKLQ (SEQ ID NO: 24), GPLGVRG (SEQ ID NO: 83), IPVSLRSG (SEQ ID NO: 84), VPLSLYSG (SEQ ID NO: 85) e SGESPAYYTA (SEQ ID NO: 86).

[124] Os ligantes peptídicos adequados podem ser de comprimentos diferentes, tais como de 1 aminoácido (por exemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos e podem ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 aminoácidos.

[125] Em algumas modalidades, o ligante peptídico é clivado por uma protease selecionada do grupo consistindo em uma calicreína, trombina, quimase, carboxipeptidase A, catepsina G, uma elastase, PR-3, granzima M, uma calpaína, uma metaloproteinase de matriz (MMP), um ativador de plasminogênio, uma catepsina, uma caspase, uma triptase ou uma protease de superfície de célula tumoral.

[126] São fornecidos adicionalmente métodos de tratamento de um sujeito com ou em risco de desenvolver câncer. Os métodos compreendem administrar ao sujeito em necessidade desta uma quantidade eficaz de um polipeptídeo quimérico (uma proteína de fusão), conforme divulgado neste documento, que é tipicamente administrada como uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o método compreende ainda selecionar um sujeito com ou em risco de desenvolver câncer. A composição farmacêutica compreende preferencialmente uma citocina bloqueada, fragmento ou muteína desta que é ativada em um sítio de tumor. Preferencialmente, o tumor é um tumor sólido. O câncer pode ser um câncer de cólon, um câncer de pulmão, um melanoma, um sarcoma, um carcinoma de células renais, um câncer de mama...

[127] O método pode envolver adicionalmente a administração de um ou mais agentes adicionais para tratar o câncer, tais como agentes quimioterápicos (por exemplo, Adriamicina, Cerubidina, Bleomicina, Alkeran, Velban, Oncovin, Fluorouracila, Tiotepa, Metotrexato, Bisantreno, Noantrona, Tiguanina, Citaribina, Procarabizina), agentes imuno-oncológicos (por exemplo, anti-PD-L1, anti-CTLA4, anti-PD-1, anti-CD47, anti-GD2), terapias celulares (por exemplo, CAR-T, terapia de células T), vírus oncolíticos e semelhantes.

[128] São fornecidas neste documento formulações farmacêuticas ou composições contendo os polipeptídeos quiméricos e um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições fornecidas neste documento são adequadas para administração in vitro ou in vivo. Por carreador farmaceuticamente aceitável entende-se um material que não é biologicamente, ou de outra forma, indesejável, isto é, o material é administrado a um paciente sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de um modo prejudicial com os outros componentes da formulação ou composição farmacêutica na qual está contido. O carreador é selecionado para minimizar a degradação do ingrediente ativo e minimizar os efeitos colaterais adversos no sujeito.

[129] Os carreadores adequados e suas formulações são descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Edição, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005). Normalmente, uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é usada na formulação para tornar a formulação isotônica, embora a formulação possa ser hipertônica ou hipotônica se desejado. Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água estéril, solução salina, soluções tamponadas como solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é geralmente de cerca de 5 a cerca de 8 ou de cerca de 7 a 7,5. Outros carreadores incluem preparações de liberação sustentada, como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo os polipeptídeos imunogênicos. As matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, lipossomas ou micropartículas. Certos carreadores podem ser mais preferenciais dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração da composição a ser administrada. Os carreadores são aqueles adequados para a administração dos polipeptídeos quiméricos ou sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos quiméricos a humanos ou outros sujeitos.

[130] As formulações são administradas de inúmeras maneiras, dependendo se um tratamento local ou sistêmico for desejado, e na área ser tratada. As composições são administradas por meio de qualquer uma das várias vias de administração, incluindo topicamente, oralmente, parentericamente, intravenosamente, intra-articularmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutaneamente, intracavidade, transdermicamente, intra-hepaticamente, intracranialmente, por nebulização/inalação, ou por instalação via broncoscopia. Em algumas modalidades, as composições são administradas localmente (não sistemicamente), incluindo intratumoralmente, intra-articularmente, intratecalmente, etc.

[131] As preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietilenoglicol, óleos vegetais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etila. Os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, suspensões ou emulsões incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringe, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólitos (como os baseados em dextrose de Ringer) e semelhantes. Aditivos e outros conservantes estão opcionalmente presentes, como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes.

[132] As formulações para a administração tópica incluem pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Carreadores farmacêuticos convencionais, aquosos, bases de pó ou oleosas, espessantes e semelhantes são opcionalmente necessários ou desejáveis.

[133] As composições para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água ou meio não aquoso, cápsulas, sachês ou comprimidos. Espessantes, aromatizantes, diluentes, emulsionantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes são opcionalmente desejáveis.

[134] Opcionalmente, os polipeptídeos quiméricos ou sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos quiméricos são administrados por um vetor. Existem várias composições e métodos que podem ser usados para transmitir as moléculas de ácido nucleico e/ou polipeptídeos às células, ou in vitro ou in vivo por meio de, por exemplo, vetores de expressão. Esses métodos e composições podem ser amplamente divididos em duas classes: sistemas de liberação baseados em vírus e sistemas de liberação com base não viral. Tais métodos são bem conhecidos na técnica e prontamente adaptáveis para uso com as composições e métodos descritos neste documento. Tais composições e métodos podem ser usados para transfectar ou transduzir células in vitro ou in vivo, por exemplo, para produzir linhagens celulares que expressam e, preferencialmente, segregam o polipeptídeo quimérico codificado ou para transmitir terapeuticamente ácidos nucleicos a um sujeito. Os componentes dos ácidos nucleicos quiméricos divulgados neste documento normalmente estão operacionalmente ligados na estrutura para codificar uma proteína de fusão.

[135] Conforme usado neste documento, plasmídeos ou vetores virais são agentes que transportam os ácidos nucleicos divulgados para a célula sem degradação e incluem um promotor que produz a expressão da molécula de ácido nucleico e/ou polipeptídeo nas células nas quais é transmitido. Os vetores virais são, por exemplo, adenovírus, vírus adenoassociado, vírus do herpes, vírus da vacina, vírus da poliomielite, Sindbis e outros vírus de RNA, incluindo esses vírus com a estrutura do HIV. Também são preferenciais quaisquer famílias virais que compartilhem as propriedades desses vírus que os tornam adequados para uso como vetores. Os vetores retrovirais, em geral, são descritos por Coffin et al., Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997), que são incorporados neste documento por referência para os vetores e métodos de produzi-los. O construto de adenovírus deficientes para a replicação foi descrita (Berkner et al., J. Virol. 61: 1213-20 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2872-83 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virol. 57: 267-74 (1986); Davidson et al., J. Virol. 61: 1226-39 (1987); Zhang et al., BioTechniques 15: 868-72 (1993)). O benefício e o uso desses vírus como vetores é que eles são limitados na extensão em que podem se espalhar para outros tipos de células, uma vez que podem se replicar dentro de uma célula infectada inicial, mas são incapazes de formar novas partículas virais infecciosas. Os adenovírus recombinantes demonstraram alcançar alta eficiência após a liberação direta in vivo ao epitélio das vias aéreas, hepatócitos, endotélio vascular, parênquima do SNC e vários outros sítios de tecido. Outros sistemas úteis incluem, por exemplo, vetores de vírus vaccinia replicantes e restritos ao hospedeiro e não replicantes.

[136] Os polipeptídeos e/ou moléculas de ácido nucleico fornecidos podem ser transmitidos por meio de partículas semelhantes a vírus. As partículas semelhantes a vírus (VLPs) consistem em proteínas virais derivadas das proteínas estruturais de um vírus. Os métodos para fazer e usar partículas semelhantes a vírus são descritos, por exemplo, em Garcea e Gissmann, Current Opinion in Biotechnology 15: 513-7 (2004).

[137] Os polipeptídeos fornecidos podem ser transmitidos por corpos densos subvirais (DBs). Os DBs transportam proteínas para as células-alvo por fusão de membrana. Os métodos para fazer e usar DBs são descritos, por exemplo, Pepperl-Klindworth et al., Gene Therapy 10: 278-84 (2003).

[138] Os polipeptídeos fornecidos podem ser transmitidos por agregados de tegumento. Os métodos para fazer e usar agregados de tegumento são descritos na Publicação Internacional N° WO 2006/110728.

[139] Os métodos de liberação não baseados em vírus podem incluir vetores de expressão compreendendo moléculas de ácido nucleico e sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos, em que os ácidos nucleicos estão operacionalmente ligados a uma sequência de controle de expressão. As estruturas adequadas do vetor incluem, por exemplo, aquelas rotineiramente usadas na técnica, tais como plasmídeos, cromossomos artificiais, BACs, YACs ou PACs. Vários vetores e sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis em empresas como Novagen (Madison, Wis.), Clonetech (Pal Alto, Califórnia), Stratagene (La Jolla, Califórnia) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, Califórnia). Os vetores normalmente contêm uma ou mais regiões reguladoras. As regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências potenciadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteína, elementos induzíveis, sequências de ligação de proteína, regiões não traduzidas (UTRs) 5' e 3', sítios de início de transcrição, sequências de terminação, sequências de poliadenilação e íntrons. Esses vetores também podem ser usados para fazer os polipeptídeos quiméricos por expressão em uma célula hospedeira adequada, tal como células CHO.

[140] Os promotores preferenciais que controlam a transcrição de vetores em células hospedeiras de mamífero podem ser obtidos a partir de várias fontes, por exemplo, os genomas de vírus, tais como polioma, vírus símio 40 (SV40), adenovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, mais preferencialmente, citomegalovírus (CMV), ou de promotores heterólogos de mamífero, por exemplo, promotor de β-actina ou promotor de EF1α, ou de promotores híbridos ou quiméricos (por exemplo, promotor de CMV fundido ao promotor de β-actina). Obviamente, os promotores da célula hospedeira ou espécies relacionadas também são úteis neste documento.

[141] O intensificador geralmente se refere a uma sequência de DNA que funciona a uma distância fixa do sítio de partida da transcrição e pode ser 5' ou

3' para a unidade de transcrição. Além disso, os intensificadores podem estar dentro de um íntron, bem como dentro da própria sequência de codificação. Eles geralmente têm entre 10 e 300 pares de bases (bp) de comprimento e funcionam em cis. Os estimuladores geralmente funcionam para aumentar a transcrição de promotores próximos. Os intensificadores também podem conter elementos de resposta que medeiam a regulação da transcrição. Embora muitas sequências potenciadoras sejam conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, fetoproteína e insulina), tipicamente uma usará um potenciador de um vírus de célula eucariótica para expressão geral. Exemplos preferenciais são o potencializador SV40 no lado final da origem de replicação, o potencializador de promotor inicial do citomegalovírus, o potencializador de polioma no lado final da origem de replicação e potencializadores de adenovírus.

[142] O promotor e/ou o intensificador podem ser indutíveis (por exemplo, regulado quimicamente ou fisicamente). Um promotor e/ou intensificador quimicamente regulado pode, por exemplo, ser regulado pela presença de álcool, tetraciclina, um esteroide ou um metal. Um promotor e/ou intensificador fisicamente regulado pode, por exemplo, ser regulado por fatores ambientais, como temperatura e luz. Opcionalmente, o promotor e/ou região intensificadora pode atuar como um promotor constitutivo e/ou intensificador para maximizar a expressão da região da unidade de transcrição a ser transcrita. Em certos vetores, o promotor e/ou a região intensificadora podem ser ativos de uma maneira específica do tipo de célula. Opcionalmente, em certos vetores, o promotor e/ou a região intensificadora podem ser ativos em todas as células eucarióticas, independentemente do tipo de célula. Os promotores preferenciais deste tipo são o promotor de CMV, o promotor de SV40, o promotor de β-actina, o promotor de EF1α e a repetição terminal longa retroviral (LTR).

[143] Os vetores também podem incluir, por exemplo, origens de replicação e/ou marcadores. Um gene marcador pode conferir um fenótipo selecionável, por exemplo, resistência a antibióticos, em uma célula. O produto marcador é usado para determinar se o vetor foi transmitido à célula e, uma vez transmitido, é expresso. Exemplos de marcadores selecionáveis para células de mamíferos são di-hidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase, neomicina, análogo de neomicina G418, higromicina, puromicina e blasticidina. Quando esses marcadores selecionáveis são transferidos com sucesso para uma célula hospedeira de mamífero, a célula hospedeira de mamífero transformada pode sobreviver se colocada sob pressão seletiva. Exemplos de outros marcadores incluem, por exemplo, o gene lacZ de E. coli , proteína fluorescente verde (GFP) e luciferase. Além disso, um vetor de expressão pode incluir uma sequência com marca projetada para facilitar a manipulação ou detecção (por exemplo, purificação ou localização) do polipeptídeo expresso. Sequências de tag, como GFP, glutationa S-transferase (GST), poli-histidina, c-myc, hemaglutinina ou sequência de tag FLAG ™ (Kodak; New Haven, Conn.), são normalmente expressas como uma fusão com o polipeptídeo codificado. Essas marcações podem ser inseridas em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, incluindo nos terminais carboxila ou amino.

[144] Conforme usados neste documento, os termos peptídeo, polipeptídeo ou proteína são usados de maneira ampla, significando dois ou mais aminoácidos ligados por uma ligação peptídica. Proteína, peptídeo e polipeptídeo também são usados neste documento de maneira intercambiável para se referir a sequências de aminoácidos. Deve-se reconhecer que o termo polipeptídeo não é usado neste documento para sugerir um tamanho ou quantidade específicos de aminoácidos que compreende a molécula e que um peptídeo da invenção pode conter até inúmeros resíduos de aminoácidos ou mais. Conforme usado ao longo do documento, sujeito pode ser um vertebrado, mais especificamente um mamífero (por exemplo, um humano, cavalo, gato, cachorro, vaca, porco, ovelha, cabra, camundongo, coelho, rato e porquinho-da-índia), aves, répteis, anfíbios, peixes e qualquer outro animal. O termo não denota uma idade ou sexo específico. Assim, sujeitos adultos e recém-nascidos, sejam do sexo masculino ou feminino, devem ser abrangidos. Conforme usado neste documento, paciente ou sujeito pode ser usado alternadamente e pode se referir a um sujeito com uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer). O termo paciente inclui sujeitos humanos e veterinários.

[145] Um sujeito em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio pode ser geneticamente predisposto à doença ou distúrbio, por exemplo, ter um histórico familiar ou ter uma mutação em um gene que causa a doença ou distúrbio, ou mostrar sinais ou sintomas precoces da doença ou transtorno. Um sujeito atualmente com uma doença ou distúrbio tem um ou mais de um sintoma da doença ou distúrbio e pode ter sido diagnosticado com a doença ou distúrbio.

[146] Os métodos e os agentes, conforme descritos neste documento, são úteis para o tratamento profilático e terapêutico. Para uso profilático, uma quantidade terapeuticamente eficaz dos polipeptídeos quiméricos ou sequências de ácido nucleico quiméricas que codificam os polipeptídeos quiméricos descritos neste documento são administrados a um sujeito antes do início (por exemplo, antes de sinais óbvios de câncer ou inflamação) ou durante o início precoce (por exemplo, após sinais e sintomas iniciais de câncer ou inflamação). A administração profilática pode ocorrer por vários dias a anos antes da manifestação dos sintomas de câncer ou inflamação. A administração profilática pode ser usada, por exemplo, no tratamento preventivo de sujeitos diagnosticados com uma predisposição genética ao câncer. O tratamento terapêutico envolve a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos polipeptídeos quiméricos ou sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos quiméricos descritos neste documento após o diagnóstico ou desenvolvimento de câncer ou inflamação (por exemplo, uma doença autoimune). O uso profilático também pode ser aplicado quando um paciente está sendo submetido a um tratamento, por exemplo, uma quimioterapia, na qual é esperada inflamação.

[147] De acordo com os métodos ensinados neste documento, o sujeito é administrado com uma quantidade eficaz do agente (por exemplo, um polipeptídeo quimérico). Os termos quantidade eficaz e dosagem eficaz são usados indistintamente. O termo quantidade eficaz é definido como qualquer quantidade necessária para produzir uma resposta fisiológica desejada. Quantidades eficazes e horários para administrar o agente podem ser determinados empiricamente, e fazer tais determinações está dentro da habilidade na técnica. Os intervalos de dosagem para administração são aqueles grandes o suficiente para produzir o efeito desejado no qual um ou mais sintomas da doença ou distúrbio são afetados (por exemplo, reduzidos ou retardados). A dose não deve ser tão grande a ponto de causar efeitos colaterais adversos substanciais, como indesejáveis reações cruzadas, reações anafiláticas, e assim por diante. Geralmente, a dosagem irá variar com a idade, condição, sexo, tipo de doença, a extensão da doença ou distúrbio, via de administração ou se outros fármacos estão incluídos no regime e podem ser determinados por um versado na técnica. A dosagem pode ser ajustada pelo médico individual em caso de quaisquer contraindicações. As dosagens podem variar e podem ser administradas em uma ou mais doses diárias, por um ou vários dias. As orientações podem ser encontradas na literatura para as dosagens apropriadas para determinadas classes de produtos farmacêuticos.

[148] Conforme usado neste documento, os termos tratamento, tratar ou tratar referem-se a um método de redução dos efeitos de uma doença ou condição ou sintoma da doença ou condição. Portanto, no método divulgado, o tratamento pode se referir a uma redução de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% na gravidade de uma doença estabelecida ou condição ou sintoma da doença ou condição. Por exemplo, um método para tratar uma doença é considerado um tratamento se houver uma redução de 10% em um ou mais sintomas da doença em um sujeito em comparação com um controle. Assim, a redução pode ser de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou qualquer percentual de redução entre 10% e 100% em comparação com os níveis nativos ou de controle. Entende-se que o tratamento não se refere necessariamente à cura ou ablação completa da doença, condição ou sintomas da doença ou condição.

[149] Conforme usado neste documento, os termos prevenir, prevenir e prevenção de uma doença ou distúrbio referem-se a uma ação, por exemplo, a administração do polipeptídeo quimérico ou sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo quimérico, que ocorre antes ou em aproximadamente ao mesmo tempo, um sujeito começa a mostrar um ou mais sintomas da doença ou distúrbio, que inibe ou retarda o início ou a exacerbação de um ou mais sintomas da doença ou distúrbio. Conforme usado neste documento, as referências à diminuição, redução ou inibição incluem uma mudança de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um nível de controle. Esses termos podem incluir, mas não necessariamente incluem a eliminação completa.

[150] São divulgados materiais, composições e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados em preparação para, ou são produtos dos métodos e composições divulgados. Estes e outros materiais são divulgados neste documento, e compreende-se que quando combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc. destes materiais são divulgados que, enquanto referência específica das várias combinações individuais e coletivas e permutação desses compostos não pode ser explicitamente divulgada, cada uma é especificamente contemplada e descrita neste documento. Por exemplo, se um método é divulgado e discutido e um certo número de modificações que podem ser feitas a uma série de moléculas, incluindo o método são discutidos, cada uma e todas as combinações e permutações do método, e as modificações que são possíveis são especificamente contempladas, a menos que especificamente indicado em contrário. Da mesma forma, qualquer subconjunto ou combinação destes também é especificamente contemplado e divulgado. Este conceito aplica-se a todos os aspectos desta divulgação, incluindo, mas não se limitando a, etapas nos métodos usando as composições divulgadas. Portanto, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser executadas, compreende-se que cada uma dessas etapas adicionais pode ser realizada com quaisquer etapas de método específicas ou combinação de etapas dos métodos divulgados, e que cada tal combinação ou subconjunto de combinações é especificamente contemplado e deve ser considerado divulgado.

[151] As publicações citadas neste documento e os materiais citados são especificamente incorporados por referência, em sua totalidade, neste documento.

EXEMPLOS

[152] A seguir encontram-se exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras modalidades podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida neste documento. Exemplo 1: Clivagem de Protease da Proteína de Fusão pela Protease MMP9

[153] Um versado na técnica estaria familiarizado com métodos de configuração de ensaio de clivagem de proteína. 100ug de proteína em 1xPBS pH 7,4 foram clivados com 1 ug de MMP9 ativo (catálogo Sigma # SAE0078-50 ou catálogo Enzo BML-SE360) e incubados em temperatura ambiente durante até 16 horas. A proteína digerida é, em seguida, usada em ensaios funcionais ou armazenada a -80°C antes do teste. A extensão da clivagem foi monitorada por SDS PAGE usando métodos bem conhecidos na técnica. FIG. 9. Exemplo 2: Ensaio de HEK Blue

[154] As células HEK Blue IL12 (InvivoGen) foram semeadas em suspensão a uma concentração de 250.000 células/poço em meio de cultura com ou sem albumina sérica humana (HSA) 40mg/ml e estimuladas com uma série de diluições de hIL12 recombinante, IL12 quimérica (p35 de camundongo/p40 humana) ou hIL12 ativável durante 24 horas a 37°C e 5% de CO2. A atividade de hIL12 ativável não clivada e clivada foi testada. A hIL12 induzível clivada foi gerada por incubação com MMP9 ativa. A atividade da IL12 foi avaliada por quantificação da atividade da Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP) usando o reagente QUANTI-Blue (InvivioGen), um ensaio baseado em colorimetria. FIGs. 7, 8, 11 e 13.

Exemplo 3: Ensaio com Blastos T de Esplenócitos

[155] Os blastos T foram induzidos a partir de esplenócitos com uma incubação de 6 dias com PHA e uma incubação de 24 horas com hIL12 recombinante. Os blastos T foram então semeados em suspensão numa concentração de 200.000 células/poço em meio de cultura com ou sem 40 mg/ml de albumina sérica humana (HSA) e estimuladas com uma série de diluições de hIL12 recombinante ou IL12 quimérica (p35 de camundongo/p40 humana) ou IL12 de camundongo por 72 horas a 37°C e CO2 a 5%. As atividades da IL12 clivada e não clivada foram testadas. A hIL12 induzível clivada foi gerada por incubação com MMP9 ativa. A atividade da IL12 foi avaliada por quantificação decrescente da produção de IFNγ usando um mIFNγ alphaLISA. Exemplo 4: Liberação In Vivo de uma Proteína de Fusão Ativada por Protease Resulta em Redução no Crescimento Tumoral

[156] O polipeptídeo quimérico é examinado para determinar se poderia ter efeitos biológicos in vivo. Para esses experimentos, um sistema é usado no qual as células tumorais injetadas de forma intraperitoneal rápida e preferencialmente fixam-se e crescem inicialmente nas manchas leitosas, uma série de agregados imunes organizados encontrados no omento (Gerber et al., Am. J. Pathol. 169:1739-52 (2006)). Este sistema oferece uma maneira conveniente de examinar os efeitos do tratamento com proteína de fusão no crescimento tumoral, uma vez que as proteínas de fusão podem ser liberadas por via intraperitoneal várias vezes, e o crescimento tumoral pode ser analisado examinando as células omentais dissociadas. Para esses experimentos, a linhagem celular Colon 38, uma linhagem celular de tumor de crescimento rápido que expressa tanto MMP2 quanto MMP9 in vitro, pode ser usada. O tecido omental normalmente expressa uma quantidade relativamente pequena de MMP2 e MMP9, mas, quando o tumor da Colon 38 está presente no omento, os níveis de MMP aumentam. Usando este modelo de tumor, a capacidade das proteínas de fusão de muteína de IL-2 para afetar o crescimento tumoral é examinada. As células da Colon 38 são injetadas por via intraperitoneal, permite-

se que se fixem e cresçam por 1 dia e, em seguida, são tratadas diariamente com proteína de fusão por via interaperitoneal. No dia 7, os animais são sacrificados e o omento é examinado quanto ao crescimento tumoral usando citometria de fluxo e por um ensaio de formação de colônia. Exemplo 5: Construção de uma Proteína de Interleucina Ativável Direcionada a CD20 Exemplificativa Geração de um domínio de interleucina ativável

[157] A sequência canônica da cadeia de IL-12p35 humana é a de Nº de Acesso Uniprot P29459. A sequência canônica da cadeia IL-12p40 humana é a de Nº de Acesso Uniprot P29460. IL-12p35 e IL-12p40 são clonadas em um construto de expressão. Um sítio de clivagem de protease é incluído entre os domínios de IL- 12p35 e IL-12p40. Um polipeptídeo de IL-12 capaz de se ligar a um polipeptídeo de CD20 presente em um tumor ou em uma célula tumoral é produzido como segue. É produzido um ácido nucleico que contém sequências de ácidos nucleicos: (1) codificando-se uma sequência polipeptídica de IFNg e (2) um ou mais peptídeos de ligação polipeptídicos. Os construtos de plasmídeo de interleucina ativável podem ter Flag, His ou outras tags de afinidade opcionais e são eletroporados para HEK293 ou outras linhagens celulares humanas ou de mamíferos adequadas e purificadas. Os ensaios de validação incluem ensaios de ativação de células T que usam células T responsivas à estimulação de IL-12 na presença de uma protease. FIG. 10. Geração de um domínio de ligação scFv CD20

[158] A CD20 é uma das proteínas de superfície celular presentes nos linfócitos B. O antígeno CD20 é encontrado em linfócitos pré-B e B maduros normais e malignos, incluindo aqueles em mais de 90% dos linfomas não-Hodgkin (LNH) de células B. O antígeno está ausente nas células-tronco hematopoiéticas, nos linfócitos B ativados (células plasmáticas) e no tecido normal. Dessa forma, vários anticorpos principalmente de origem murina foram descritos: 1F5, 2B8/C2B8, 2H7 e 1H4.

[159] Os anticorpos anti-CD20 humanos ou humanizados são, portanto, usados para gerar sequências de scFv para domínios de ligação a CD20 de uma proteína de interleucina ativável. Sequências de DNA que codificam domínios VL e VH humanos ou humanizados são obtidas, e os códons para os construtos são, opcionalmente, otimizados para expressão em células de Homo sapiens. A ordem em que os domínios VL e VH aparecem no scFv é variada (ou seja, orientação VL-VH ou VH-VL), e três cópias de "G4S" (SEQ ID NO: 87) ou “G4S” (SEQ ID NO: 87) subunidade (G4S)3 (SEQ ID NO: 90) conectam os domínios variáveis para criar o domínio de scFv. Os construtos de plasmídeos de scFv anti-CD20 podem ter Flag, His ou outras tags de afinidade opcionais, e são eletroporados para HEK293 ou outras linhagens celulares de humano ou de mamífero adequadas e purificadas. Os ensaios de validação incluem análise de ligação por FACS, análise cinética usando Proteon e coloração de células que expressam CD20. Clonagem de construtos de expressão de DNA que codificam a proteína interleucina ativável

[160] O construto de interleucina ativável com domínios de sítio de clivagem de protease é usado para construir uma proteína interleucina ativável em combinação com um domínio de scFv anti-CD20 e um elemento de extensão da meia-vida sérica (por exemplo, um peptídeo de ligação de HSA ou domínio VH), conforme mostrado na Fig. 10. Para a expressão de uma proteína interleucina ativável em células CHO, as sequências de codificação de todos os domínios de proteína são clonadas em um sistema de vetor de expressão de mamífero. Em resumo, as sequências genéticas que codificam o domínio de interleucina ativável, o elemento de extensão da meia-vida sérica e o domínio de ligação de CD20 juntamente com os ligantes peptídicos L1 e L2 são sintetizadas e subclonadas separadamente. Os construtos resultantes são então ligados entre si na ordem do domínio de ligação de CD20 – L1 – IL-12p35– L2 – domínio de clivagem de protease – L3 – IL-12p40 – L4 – scFv anti-CD20 – L5 – elemento de extensão da meia-vida sérica para produzir um construto final. Todos os construtos de expressão são projetados para conter sequências de codificação para um peptídeo sinal N-terminal e uma (6xHis)-tag de hexa-histidina C-terminal (SEQ ID NO: 91) para facilitar a secreção e purificação de proteínas, respectivamente. Expressão de proteínas interleucina ativáveis em células CHO transfectadas de forma estável

[161] Um sistema de expressão de células CHO (Flp-In®, Life Technologies), um derivado de células de ovário de Hamster Chinês CHO-K1 (ATCC, CCL-61) (Kao e Puck, Proc. Natl. Acad Sci USA 1968;60(4):1275-81), é usado. As células aderentes são subcultivadas de acordo com os protocolos de cultura celular padrão fornecidos pela Life Technologies.

[162] Para adaptação ao crescimento em suspensão, as células são separadas dos frascos de cultura de tecidos e colocadas em meio sem soro. As células adaptadas à suspensão são criopreservadas em meio com 10% de DMSO.

[163] As linhagens celulares de CHO recombinantes que expressam, de forma estável, proteínas interleucina ativáveis secretadas são geradas por transfecção de células adaptadas a suspensão. Durante a seleção com o antibiótico Higromicina B, as densidades celulares viáveis são medidas duas vezes por semana, e as células são centrifugadas e ressuspensas em meio de seleção fresco a uma densidade máxima de 0,1x106 células viáveis/mL. Agrupamentos de células que expressam, de forma estável, proteínas interleucina ativáveis são recuperados após 2-3 semanas de seleção, ponto em que as células são transferidas para o meio de cultura padrão em frascos de agitação. A expressão de proteínas secretadas recombinantes é confirmada pela realização de eletroforese em gel de proteínas ou citometria de fluxo. Os agrupamentos de células estáveis são criopreservados em meio contendo DMSO.

[164] As proteínas interleucina ativáveis são produzidas em culturas descontínuas alimentadas de 10 dias de linhagens celulares de CHO transfectadas de forma estável por secreção no sobrenadante da cultura celular. Os sobrenadantes da cultura celular são colhidos após 10 dias em viabilidades de cultura de, tipicamente, >75%. Amostras são coletadas das culturas de produção em dias alternados, e a densidade celular e a viabilidade são avaliadas. No dia da coleta, os sobrenadantes da cultura celular são limpos por centrifugação e filtração a vácuo antes de serem usados.

[165] Os títulos de expressão de proteína e a integridade do produto em sobrenadantes de cultura celular são analisados por SDS-PAGE. Purificação de proteínas interleucina ativáveis

[166] Proteínas interleucina ativáveis são purificadas a partir de sobrenadantes de cultura celular de CHO em um procedimento de duas etapas. Os construtos são submetidos a cromatografia de afinidade em uma primeira etapa, seguido por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) preparativa em Superdex 200 em uma segunda etapa. As amostras são trocadas por tampão e concentradas por ultrafiltração a uma concentração típica de >1 mg/mL. A pureza e a homogeneidade (tipicamente >90%) das amostras finais são avaliadas por SDS PAGE sob condições redutoras e não redutoras, o que é seguido por imunoblot usando um anticorpo anti-HSA ou anti-idiotipo, bem como por SEC analítica, respectivamente. As proteínas purificadas são armazenadas em alíquotas a - 80°C até o uso. Exemplo 6: Determinação da afinidade do antígeno por citometria de fluxo

[167] As proteínas interleucina ativáveis dos exemplos anteriores são testadas quanto às suas afinidades de ligação a células CD20 + humanas e células CD20+ de cynomolgus.

[168] As células CD20+ são incubadas com 100 µL de diluições em série das proteínas interleucina ativáveis dos exemplos anteriores e pelo menos uma protease. Após três lavagens com tampão FACS, as células são incubadas com 0,1 mL de anticorpo anti-idiotipo monoclonal de camundongo a 10 µg/mL no mesmo tampão durante 45 min em gelo. Após um segundo ciclo de lavagem, as células são incubadas com 0,1 mL de anticorpos IgG anti-camundongo de cabra conjugados com FITC a 15 µg/mL nas mesmas condições anteriores. Como um controle, as células são incubadas com a IgG anti-His seguida pelos anticorpos IgG de cabra anti-camundongo conjugados com FITC sem as proteínas interleucina ativáveis. As células foram então lavadas novamente e ressuspensas em 0,2 mL de tampão FACS contendo 2 µg/mL de iodeto de propídio (PI) para excluir células mortas. A fluorescência de 1x104 células vivas é medida usando um citômetro de fluxo Beckman-Coulter FC500 MPL usando o software MXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) ou um citômetro de fluxo Millipore Guava EasyCyte usando o software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemanha). As intensidades de fluorescência médias das amostras de células são calculadas usando software CXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) ou software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemanha). Depois de retirar os valores de intensidade de fluorescência das células coradas apenas com os reagentes secundários e terciários, os valores são então usados para o cálculo dos valores KD com a equação para ligação de um sítio (hipérbole) do GraphPad Prism (versão 6.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla Califórnia EUA).

[169] A ligação e a reatividade cruzada de CD20 são avaliadas nas linhagens celulares tumorais CD20+ humanas. A razão KD de reatividade cruzada é calculada usando os valores KD determinados nas linhagens celulares de CHO que expressam antígenos de cynomolgus recombinantes ou antígenos de humanos recombinantes. Exemplo 7: Ensaio de Citotoxicidade

[170] A proteína interleucina ativável dos exemplos anteriores é avaliada in vitro na sua mediação da resposta imune a células-alvo CD20+.

[171] As células CD20+ REC-1 marcadas com fluorescência (uma linhagem celular de linfoma de células do manto, ATCC CRL-3004) são incubadas com PBMC isoladas de doadores aleatórios ou células T CB15 (linhagem de células T padronizada) como células efetoras na presença da proteína interleucina ativável dos exemplos anteriores e pelo menos uma protease. Após incubação por 4 h a 37 °C em uma incubadora umidificada, a liberação do corante fluorescente das células-alvo para o sobrenadante é determinada em um espectrofluorímetro. As células-alvo incubadas sem a proteína interleucina ativável dos exemplos anteriores e células-alvo totalmente lisadas pela adição de saponina no final da incubação servem como controles negativos e positivos respectivamente.

[172] Com base nas células-alvo vivas restantes medidas, a porcentagem de lise celular específica é calculada de acordo com a seguinte fórmula: [1-(número de alvos vivos(amostra)/número de alvos vivos(espontâneo))] x 100%. As curvas de resposta à dose sigmoidais e os valores de EC 50 são calculados por regressão não linear/ajuste logístico de 4 parâmetros usando o software GraphPad. Os valores de lise obtidos para uma determinada concentração de anticorpos são usados para calcular curvas de resposta à dose sigmoidais por análise de ajuste logístico de 4 parâmetros usando o software Prism. Exemplo 8: Farmacocinética de Proteínas interleucina ativáveis

[173] A proteína interleucina ativável dos exemplos anteriores é avaliada quanto à meia-vida de eliminação em estudos com animais.

[174] A proteína interleucina ativável é administrada em macacos cynomolgus como uma injeção em bolus a 0,5 mg/kg na veia safena. Outro grupo de macacos cynomolgus recebe uma citocina comparável em tamanho, mas sem um elemento de prolongamento da meia-vida sérica. Um terceiro e um quarto grupos recebem uma citocina com elementos de extensão da meia-vida sérica e uma citocina com CD20 e elementos de extensão da meia-vida sérica respectivamente, e ambos comparáveis em tamanho à proteína interleucina ativável. Cada grupo de teste consiste em 5 macacos. As amostras de soro são colhidas em pontos de tempo indicados, diluídas em série, e a concentração das proteínas é determinada usando um ELISA de ligação a CD20.

[175] A análise farmacocinética é realizada usando as concentrações plasmáticas do artigo de teste. Os dados de plasma médios do grupo para cada artigo de teste estão em conformidade com um perfil multiexponencial quando plotados em relação ao tempo pós-dosagem. Os dados são ajustados por um modelo de dois compartimentos padrão com entrada de bolus e constantes de taxa de primeira ordem para as fases de distribuição e eliminação. A equação geral para o melhor ajuste dos dados para administração i.v. é: c(t)=Ae−αt+Be−βt, onde c(t) é a concentração plasmática no tempo t, A e B se interceptam no eixo Y, e α e β são as constantes de taxa de primeira ordem aparentes para as fases de distribuição e eliminação respectivamente. A fase α é a fase inicial da depuração e reflete a distribuição da proteína em todo o fluido extracelular do animal, enquanto a segunda porção ou porção da fase β da curva de decaimento representa a depuração plasmática verdadeira. Os métodos para ajustar tais equações são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, A=D/V(α−k21)/(α−β), B=D/V(β−k21)/(α−β), e α e β (para α>β) são raízes da equação quadrática: r2+(k12+k21+k10)r+k21k10=0 usando parâmetros estimados de V=volume de distribuição, k10=taxa de eliminação, k12=taxa de transferência do compartimento 1 para o compartimento 2 e k21=taxa de transferência do compartimento 2 para o compartimento 1 e D=dose administrada.

[176] Análise de dados: Gráficos de concentração versus perfis de tempo são feitos usando KaleidaGraph (KaleidaGraph™ V. 3.09 Copyright 1986-1997. Synergy Software. Reading, Pa.). Os valores relatados como menos do que relatáveis (LTR) não são incluídos na análise de PK e não são representados graficamente. Os parâmetros farmacocinéticos são determinados por análise compartimental usando o software WinNonlin (WinNonlin® Professional V. 3.1 WinNonlin™ Copyright 1998-1999. Pharsight Corporation. (Mountain View, Calif). Os parâmetros farmacocinéticos são calculados conforme descrito em Ritschel W A e Kearns G L, 1999, IN: Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 5ª edição, American Pharmaceutical Assoc., Washington, DC

[177] Espera-se que a proteína interleucina ativável dos exemplos anteriores tenha parâmetros farmacocinéticos aprimorados, como um aumento na meia- vida de eliminação em comparação com proteínas sem um elemento de extensão da meia-vida sérica. Exemplo 9: Modelo de Tumor de Xenoenxerto

[178] A proteína interleucina ativável dos exemplos anteriores é avaliada em um modelo de xenoenxerto.

[179] Camundongos NOD/scid imunodeficientes fêmeas são irradiados subletalmente (2 Gy) e inoculados por via subcutânea com 4x10 6 células Ramos RA1 no flanco dorsal direito. Quando os tumores atingem 100 a 200 mm3, os animais são alocados em 3 grupos de tratamento. Os grupos 2 e 3 (8 animais cada) são injetados por via intraperitoneal com 1,5x10 7 células T humanas ativadas. Três dias depois, os animais do Grupo 3 são subsequentemente tratados com um total de 9 doses intravenosas de 50 µg de proteína interleucina ativável dos exemplos anteriores (qdx9d). Os grupos 1 e 2 são tratados apenas com veículo. O peso corporal e o volume tumoral são determinados durante 30 dias.

[180] Espera-se que os animais tratados com a proteína interleucina ativável dos exemplos anteriores tenham um atraso estatisticamente significativo no crescimento tumoral em comparação com o respectivo grupo de controle tratado com veículo.

[181] Embora as modalidades preferíveis da presente invenção tenham sido mostradas e descritas neste documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas somente a título de exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles versados na técnica, sem que haja afastamento da invenção. Deve-se entender que diversas alternativas às modalidades da invenção descritas neste documento podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos. Exemplo 10: Experimentos de MC38 A linhagem celular MC38, uma linhagem celular de adenocarcinoma do cólon de crescimento rápido que expressa MMP9 in vitro, foi usada. Usando este modelo de tumor, a capacidade das proteínas de fusão para afetar o crescimento tumoral foi examinada.

Exemplo 10a: MC38 IFNa e IL-12 Agentes e Tratamento:

Dose de Gr.

N Agente Via Cronograma formulação bissemanalmente x 1# 12 Veículo - ip 3 17,5 bissemanalmente x 2 8 ACP11 ip µg/animal 3 175 bissemanalmente x 3 8 ACP11 ip µg/animal 3 8 525 bissemanalmente x 4 ACP11 ip µg/animal 3 8 bissemanalmente x 5, em seguida IL-12- pausa de 2 dias, em 13 2 µg/animal ip HM-WTI seguida bid x 5, em seguida pausa de 2 dias 8 bissemanalmente x 5, em seguida IL-12- 10 pausa de 2 dias, em 14 ip HM-WTI µg/animal seguida bid x 5, em seguida pausa de 2 dias - Grupo de # Controle

Procedimentos: Camundongos foram anestesiados com isoflurano para o implante de células para reduzir as ulcerações. Camundongos C57BL/6 fêmeas CR foram preparados com 5x105 células tumorais MC38 em 0% de Matrigel sc no flanco. O Volume de Injeção Celular foi de 0,1 mL/camundongo. A idade do camundongo na data de início era de 8 a 12 semanas. As correspondências de pares foram realizadas quando os tumores atingiram um tamanho médio de 100 - 150 mm³ e o tratamento iniciou. Os pesos corporais foram medidos no início e depois bissemanalmente até ao fim. As medições do calibrador foram feitas bissemanalmente até o fim. Quaisquer reações adversas foram notificadas imediatamente. Qualquer animal individual com uma única observação de >30% de perda de peso corporal ou três medições consecutivas de >25% de perda de peso corporal foi sacrificado. Qualquer grupo com uma perda de peso corporal média de >20% ou >10% de mortalidade interrompeu a dosagem; o grupo não foi sacrificado, e a recuperação é permitida. Dentro de um grupo com >20% de perda de peso, os indivíduos que atingiram o critério de avaliação de perda de peso corporal individual foram sacrificados. Se a perda de peso corporal relacionada a tratamento de grupo é recuperada até dentro de 10% dos pesos originais, a dosagem pode retomar a uma dose inferior ou a um cronograma de dosagem menos frequente. Exceções ao não-tratamento de recuperação da % de peso corporal podem ser permitidas analisando-se caso-a-caso. O ponto final foi a desaceleração do crescimento tumoral (TGD). Os animais foram monitorados individualmente. O critério de avaliação do experimento foi um volume tumoral de 1500 mm 3 ou 45 dias, o que ocorrer primeiro. Os respondedores foram acompanhados por mais tempo. Quando o critério de avaliação foi atingido, os animais tiveram que ser sacrificados.

Exemplo 11: Proteínas de Fusão Condicionalmente Ativas Que Contêm Uma Fração de Bloqueio que é um Domínio de Ligação à Albumina Sérica

[182] Este exemplo descreve a produção e a atividade de proteínas de fusão, de preferência citocinas, que possuem atividade induzível, ou seja, são inativas até serem induzidas, tipicamente por separação de uma fração de bloqueio da fração ativa após a clivagem de um ligante peptídico entre a fração de bloqueio e a fração ativa.

As proteínas de fusão contêm um único domínio variável de anticorpo (um dAb) que se liga à albumina sérica por meio das alças de CDR e se liga a uma fração ativa (no caso, uma scFV anti-CD3) por meio de uma ou mais alças não CDR (por exemplo, a alça C). A fração de bloqueio de ligação à albumina sérica está operacionalmente ligada à fração ativa através de um ligante peptídico clivável por protease, e a fração ativa está operacionalmente ligada a um domínio de direcionamento (no caso, um dAb de receptor de fator de crescimento anti-epidérmico (EGFR) ou dAb anti-antígeno da membrana específica da próstata (PSMA)) através de um ligante peptídico que não é clivável por protease.

Estas proteínas de fusão podem ser administradas como proteínas inativas que se são ativadas após a clivagem do ligante peptídico clivável por protease e subsequente liberação do domínio inibitório de ligação à albumina.

A scFV anti-CD3 nas proteínas de fusão é um substituto para uma citocina desejada nas proteínas de fusão descritas nesta divulgação.

Proteínas de fusão semelhantes que contêm uma citocina desejada (por exemplo, IL-2, IL- 12, um interferon) ou fragmento funcional ou muteína desta, um domínio de direcionamento e um dAb de ligação à albumina que também se liga e inibe a citocina ou fragmento funcional ou muteína desta podem ser preparados usando os métodos descritos e exemplificados neste documento.

O dAb anti-albumina sérica que se liga e inibe a atividade de uma citocina desejada ou fragmento funcional ou muteína desta pode fornecer mascaramento estérico da citocina (através da proximidade das citocinas à albumina sérica ligada) e mascaramento específico da citocina (através de ligação à citocina através do alça não CDR (por exemplo, o alça C)). O dAb anti-albumina sérica que se liga e inibe a atividade de uma citocina desejada ou fragmento funcional ou muteína desta pode ser obtida usando métodos adequados, tais como introdução de diversidade de sequência de aminoácidos nas alças não CDR (por exemplo, alça C) de um dAb de ligação anti-albumina sérica e triagem para ligação à citocina desejada.

Quaisquer métodos adequados podem ser usados para a seleção, tais como exibição de fago. Por exemplo, um dab anti-albumina sérica exemplificativo que pode ser usado tem a sequência seguinte, e a sequência de aminoácidos na alça C (Sublinhada em Negrito) pode ser diversificada (por exemplo, randomizada), e os dAbs resultantes triados para ligação à albumina sérica via interação com CDR e à citocina via interação com alça não CDR. Se desejado, a sequência de aminoácidos de um peptídeo de ligação a citocina conhecido pode ser enxertada na alça C.

EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQGGGGGLDGNEE

PGGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVY YCTIGGSLSVSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 92) A. A ativação da protease de ProTriTAC leva a um aumento significativo da atividade in vitro

[183] ProTriTAC purificado (pró-fármaco), ProTriTAC não clivável [pró-fármaco (não clivável)] e fragmento de fármaco ativo recombinante que imita o ProTriTAC ativado por protease (fármaco ativo) foram testados quanto à ligação a CD3 humano recombinante em um ensaio ELISA, ligação a células T primárias humanas purificadas em um ensaio de citometria de fluxo e potência funcional em um ensaio de citotoxicidade celular dependente de células T.

[184] Para ELISA, proteínas ProTriTAC solúveis nas concentrações indicadas foram incubadas com CD3e humano recombinante imobilizado (R&D Systems) por 1 h em temperatura ambiente em PBS suplementado com 15 mg/ml de albumina sérica humana. As placas foram bloqueadas usando SuperBlock (Thermo Fisher), lavadas usando PBS com 0,05% de Tween-20 e detectadas usando um anticorpo monoclonal idiotipo anti-CD3 não competitivo 11D3 seguido por anticorpo secundário marcado com peroxidase e solução de substrato TMB-ELISA (Thermo Fisher).

[185] Para citometria de fluxo, proteínas ProTriTAC solúveis nas concentrações indicadas foram incubadas com células T primárias humanas purificadas por 1 h a 4 °C na presença de PBS com 2% de soro fetal bovino e 15 mg/ml de albumina sérica humana. As placas foram lavadas com PBS com 2% de soro fetal bovino,

detectadas usando o anticorpo monoclonal idiotipo anti-CD3 não competitivo marcado com AlexaFluor 647 11D3, e os dados foram analisados usando FlowJo 10 (FlowJo, LLC).

[186] Para a potência funcional em ensaios de citotoxicidade celular dependente de células T, proteínas ProTriTAC solúveis nas concentrações indicadas foram incubadas com células T humanas em repouso purificadas (célula efetora) e com célula cancerígena HCT116 (célula-alvo) a uma razão efetor:célula-alvo de 10:1 durante 48 h a 37 °C. A linhagem da célula-alvo HCT116 foi transfectada de forma estável com um gene repórter de luciferase para permitir a medição de morte celular mediada por célula T específica por ONE-Glo (Promega). B. ProTriTAC exibe atividade potente, dependente de protease e anti-tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de roedor

[187] O ProTriTAC foi avaliado quanto à sua atividade antitumoral in vivo em um tumor de xenoenxerto subcutâneo HCT116 misturado com células T humanas expandidas em camundongos NCG imunocomprometidos. Especificamente, 5x106 células HCT116 foram misturadas com 2,5x106 células T expandidas por camundongo no dia 0. As dosagens de ProTriTACs foram realizadas começando no dia seguinte com um cronograma q.d. x 10 via injeção intraperitoneal. As medições do volume tumoral foram determinadas usando medições de calibre e calculadas usando a fórmula V = (comprimento x largura x largura) / 2 nos tempos indicados. C. Expressão, purificação e estabilidade de moléculas triespecíficas de ProTriTAC exemplificativas Produção de Proteínas

[188] As sequências que codificam moléculas de proteína de fusão induzíveis foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA 3.4 (Invitrogen) precedido por uma sequência líder e seguido por uma tag de Histidina 6x (SEQ ID NO: 91). As células Expi293F (Life Technologies A14527) foram mantidas em suspensão em Optimum Growth Flasks (Thomson) entre 0,2 a 8 x 1e6 células/ml em meios Expi 293. O DNA de plasmídeo purificado foi transfectado em células Expi293 de acordo com os protocolos do Expi293 Expression System Kit (Life Technologies, A14635) e mantido durante 4-6 dias após a transfecção. Alternativamente, as sequências que codificam as moléculas de proteína de fusão foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pDEF38 (CMC ICOS), transfectadas em células CHO-DG44 dhfr-, conjuntos estáveis foram gerados e foram cultivadas em meios de produção por até 12 dias antes da purificação. A quantidade de proteínas de fusão exemplificativas em meios condicionados foi quantificada usando um instrumento Octet RED 96 com pontas de Proteína A (ForteBio/Pall) usando uma proteína de fusão de controle para uma curva padrão. O meio condicionado de qualquer uma das células hospedeiras foi filtrado e parcialmente purificado por cromatografia de afinidade e dessalinização. As proteínas de fusão foram subsequentemente polidas por troca iônica e após agrupamento de frações formuladas em um tampão neutro contendo excipientes. A pureza final foi avaliada por SDS-PAGE e SEC analítica usando uma coluna Acquity BEH SEC 200 de 1,7µ 4,6 x 150 mm (Waters Corporation) resolvida em uma fase móvel aquosa/orgânica com excipientes em pH neutro em um sistema 1290 LC e picos integrados com Chemstation Software CDS (Agilent). As proteínas de fusão purificadas de células hospedeiras CHO são mostradas na SDS-PAGE descrita abaixo. Avaliação de Estabilidade

[189] As proteínas de fusão purificadas em duas formulações foram subaliquotadas em tubos estéreis e tensionadas por cinco ciclos de congelamento-descongelamento, cada um compreendendo mais de 1 hora a - 80 °C e temperatura ambiente ou por incubação a 37 °C durante 1 semana. Amostras tensionadas foram avaliadas quanto à concentração e turbidez por espectrometria de UV usando placas de 96 poços transparentes de UV (Corning 3635) com um software SpectraMax M2 e SoftMaxPro (Molecular Devices), SDS- PAGE e SEC analítica e comparadas com a mesma análise de amostras não tensionadas de controle. Uma sobreposição de cromatogramas de SEC analítica de amostras de controle e tensionadas para uma única molécula de ProTriTAC exemplificativa purificada de células hospedeiras 293 é ilustrada abaixo.

[190] Os resultados mostram que ProTriTACs foram produzidos com rendimentos comparáveis a TriTACs normais de agrupamentos estáveis de CHO; e que as proteínas eram estáveis após repetidos congelamentos- descongelamentos a 37 ° C durante 1 semana. D. Demonstração de mascaramento funcional e estabilidade de ProTriTAC in vivo em um estudo farmacocinético de macaco cynomolgus de três semanas

[191] Dose única de ProTriTAC direcionado a PSMA (SEQ ID NO: 74), ProTriTAC não clivável (SEQ ID NO: 75), TriTAC não mascarado/não clivável (SEQ ID NO: 78) e ProTriTAC ativado por protease que mimetiza o fármaco ativa (SEQ ID NO: 76) foi administrada em macacos cynomolgus a 0,1 mg/kg por meio de injeção intravenosa. As amostras de plasma foram coletadas nos pontos de tempo indicados. As concentrações de ProTriTAC foram determinadas usando ensaios de ligação de ligante com PSMA humano recombinante biotinilado (R&D systems) e 11D3 clonado anti-anticorpo idiotipo de CD3 marcado com enxofre em um ensaio MSD (Meso Scale Diagnostic, LLC). Os parâmetros farmacocinéticos foram estimados usando o software de farmacocinética Phoenix WinNonlin usando uma abordagem não compartimental consistente com a via de administração em bolus intravenosa.

[192] Para calcular a taxa de conversão do pró-fármaco in vivo, a concentração do fármaco ativo em circulação foi estimada resolvendo o seguinte sistema de equações diferenciais, onde P é a concentração de pró-fármaco, A é a concentração de fármaco ativo, ka é a taxa de ativação de pró-fármaco na circulação, kc,P é a taxa de depuração do pró-fármaco e kc,A é a taxa de depuração do fármaco ativo. 𝑑𝑃 = −𝑘𝑐,𝑃 𝑃 𝑑𝑡 𝑑𝐴 = 𝑘𝑎 𝑃 − 𝑘𝑐,𝐴 𝐴 𝑑𝑡

[193] As taxas de eliminação do pró-fármaco, do fármaco ativo e de um controle de pró-fármaco não clivável (kc,NCLV) foram determinadas empiricamente em macacos cynomolgus. Para estimar a taxa de ativação do pró-fármaco em circulação, presumimos que a diferença entre a taxa de depuração do pró- fármaco clivável e do pró-fármaco não clivável surgiu apenas da ativação não específica em circulação. Portanto, a taxa de conversão do pró-fármaco em fármaco ativo em circulação foi estimada subtraindo-se a taxa de depuração do pró-fármaco clivável do pró-fármaco não clivável. 𝑘𝑎 = 𝑘𝑐,𝑁𝐶𝐿𝑉 − 𝑘𝑐,𝑃

[194] A concentração inicial do pró-fármaco em circulação foi determinada empiricamente, e a concentração inicial do fármaco ativo foi considerada como sendo zero. Resultados e Discussão

[195] Os resultados do Exemplo 11 mostram que proteínas de fusão que contêm um polipeptídeo com atividade terapêutica desejada, como uma citocina ou fragmento funcional ou muteína desta ou scFV anti-CD3 podem ser preparadas em que a atividade terapêutica é mascarada por um domínio de mascaramento que se liga à albumina sérica e ao polipeptídeo ativo. O domínio de mascaramento está operacionalmente ligado ao domínio ativo por meio de um ligante peptídico clivável por protease. Os resultados mostram que este tipo de proteína de fusão pode ser administrado como uma proteína inativa que se torna ativada após a clivagem da protease no local desejado de atividade terapêutica, tal como em um tumor.

[196] As sequências de aminoácidos das proteínas de fusão utilizadas no Exemplo 11 são fornecidas como SEQ ID NOs: 71-78.

[197] Os construtos da proteína de fusão de amostra são detalhados na Tabela

3. Na tabela 3, "L" é uma abreviatura de "ligante peptídico" e "lig. cliv." é uma abreviatura de “ligante peptídico clivável”. Outras abreviaturas: “mIFNg” indica interferon gama de camundongo (IFNg); “HAlbumina” indica albumina sérica humana (HSA); “MAlbumina” indica albumina sérica de camundongo.

Tabela 3: TABELA DE PERMUTAÇÃO DE CONSTRUTO Nome do Descrição do Construto Construto ACP63 anti-FN CGS-2 scFv (Vh/Vl)-6xHis ACP04 p40 humana-p35 murina-6xHis ACP05 p40 humana-p35 humana-6xHis p35 de camundongo-(ligante peptídico cliv.)-p40 de camundongo- ACP34 6xHis p35 de camundongo-GS-(ligante peptídico cliv.)-GS-p40 de ACP35 camundongo-6xHis (anti-HSA)-(ligante peptídico cliv.)-p40 de camundongo-p35 de ACP36 camundongo-(ligante peptídico cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-EpCAM)-(anti-HSA)-(ligante peptídico cliv.)-p40 de camundongo-p35 de camundongo-(ligante peptídico cliv.)-(anti- ACP37 HSA)-6xHis (anti-EpCAM)-Ligante peptídico-(anti-HSA)-(ligante peptídico ACP79 cliv.r)-mIL12-(ligante peptídico cliv.)-(Anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-(ligante peptídico cliv.)-mIL12-(ligante peptídico cliv.)- ACP80 (anti-HSA)-Ligante peptídico-(anti-EpCAM)-6xHis Bloqueador12-Ligante peptídico-(ligante peptídico cliv.)-p40 humana-Ligante peptídico-p35 de camundongo-( ligante peptídico ACP06 cliv.)-(anti-HSA)-6xHis Bloqueador12-Ligante peptídico-( ligante peptídico cliv.)-p40 humana-Ligante peptídico-p35 de camundongo-(ligante peptídico ACP07 cliv.)-(anti-HSA)-Ligante peptídico-(anti-FOLR1)-6xHis

(anti-FOLR1)-Ligante peptídico-Bloqueador12-Ligante peptídico- (ligante peptídico cliv.)-p40 humana-Ligante peptídico-p35 de ACP08 camundongo-(ligante peptídico cliv.)-(anti-HSA)-6xHis (anti-HSA)-Ligante peptídico-Bloqueador12-Ligante peptídico- (ligante peptídico cliv.)-p40 humana-Ligante peptídico-p35 de ACP09 camundongo-6xHis (anti-HSA)-(ligante peptídico cliv.)-p40 humana-L-p35 de camundongo-(ligante peptídico cliv.)-Ligante peptídico- ACP10 Bloqueador12-6xHis hp40-Ligante peptídico-mp35-(ligante peptídico cliv.)-Ligante ACP11 peptídico-Bloqueador12-Ligante peptídico-(anti-HSA)-6xHis p40 humana-Ligante peptídico-p35 de camundongo-Ligante peptídico-Ligante peptídico-Bloqueador-Ligante peptídico-(anti- ACP91 HSA)_(controle não clivável) ACP136 p40 humana-L-p35 de camundongo-XL-Bloqueador p40 humana-L-p35 de camundongo-XL-Bloqueador-L-HSA-L- ACP138 FOLR1 FOLR1-L-p40 humana-L-p35 de camundongo-XL-Bloqueador-L- ACP139 HSA FOLR1-(ligante peptídico cliv.)-p40 humana-L-p35 de ACP140 camundongo-XL-Bloqueador-L-HSA ACP117 anti-FN CGS-2 scFv (Vh/Vl)-6xHis Tabela de Sequência SE Nome Sequência

Q ID NO .

1 Albumin MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE a sérica VAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF EDHVKLVNEV humana TEFAKTCVAD ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE

MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ GLKCASLQKF GERAFKAWAV ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEK SHCIAEVEND EMPADLPSLA ADFVGSKDVC KNYAEAKDVF LGMFLYEYAR RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE FKPLVEEPQN LIKQNCELFE QLGEYKFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV SRNLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDCLSVF LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVNGRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLS EKERQIKKQTALV ELVKHK PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET

CFAEEGKKLVAASQAALGL 44 ACP04 iwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqv (proteín kefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysg a de rftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqeds fusão acpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevs de IL12 weypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdry de p40 yssswsewasvpcsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddm humana vktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclpp /p35 qktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqsln murina) hngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaHHHHHH

45 ACP05 iwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqv (proteín kefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysg a de rftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqeds fusão acpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevs de IL12 weypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdry de p40 yssswsewasvpcsggggsggggsggggsrnlpvatpdpgmfpclhhsqnllr humana avsnmlqkarqtlefypctseeidheditkdktstveaclpleltknesclnsretsfitn /p35 gsclasrktsfmmalclssiyedlkmyqvefktmnakllmdpkrqifldqnmlavid murina) elmqalnfnsetvpqkssleepdfyktkiklcillhafriravtidrvmsylnasHHHH

HH 46 ACP06 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSRSNIGSNTVKWYQQL (proteín PGTAPKLLIYYNDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQA a de EDEADYYCQSYDRYTHPALLFGTGTKVTVLggggsggggsggg fusão gsQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWV de IL12 RQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKN de p40 TLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTHGSHDNWGQGTMVTVSSg humana gggsggggsggggsggggsggggsggggsSGGPGPAGMKGLPGSi /p35 welkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvk murina) efgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgr ftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqeds acpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevs weypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdry yssswsewasvpcsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddm vktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclpp qktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqsln hngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaSGGPGPA

GMKGLPGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKF GMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTV

SSHHHHHHEPEA 47 ACP07 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSRSNIGSNTVKWYQQL (proteín PGTAPKLLIYYNDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQA a de EDEADYYCQSYDRYTHPALLFGTGTKVTVLggggsggggsggg fusão gsQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWV de IL12 RQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKN de p40 TLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTHGSHDNWGQGTMVTVSSg humana gggsggggsggggsggggsggggsggggsSGGPGPAGMKGLPGSi /p35 welkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvk murina) efgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgr ftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqeds acpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevs weypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdry yssswsewasvpcsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddm vktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclpp qktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqsln hngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaSGGPGPA

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QGTQVTVSSHHHHHHEPEA 48 ACP08 QVQLQESGGGLAQAGGSLSLSCAASGFTVSNSVMAWYRQ (proteín TPGKQREFVAIINSVGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYL a de QMNNLKPEDTAVYVCNRNFDRIYWGQGTQVTVSSggggsgg fusão ggsggggsQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSRSNIGSNTV de IL12 KWYQQLPGTAPKLLIYYNDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASL de p40 AITGLQAEDEADYYCQSYDRYTHPALLFGTGTKVTVLggggs humana ggggsggggsQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSY /p35 GMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTIS murina) RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTHGSHDNWGQGTM VTVSSggggsggggsggggsggggsggggsggggsSGGPGPAGMK GLPGSiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgs gktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrce aknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysv ecqedsacpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplkn srqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasis vraqdryyssswsewasvpcsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnll kttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttr gsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaide lmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaSGG

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HHHEPEA 50 ACP10 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQ (proteín APGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLY a de LQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSSGGPG fusão PAGMKGLPGSiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtld de IL12 qssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqke de p40 pknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgd humana nkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppk /p35 nlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatv murina) icrknasisvraqdryyssswsewasvpcsggggsggggsggggsrvipvsgpa rclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknescl atretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildk gmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgy lssaSGGPGPAGMKGLPGSggggsggggsggggsggggsggggsgg ggsQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSRSNIGSNTVKWYQ

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52 IL12 p40 humana (Uniprot Nº de Acesso P29460)

53 IL12 p35 de camund ongo (Uniprot Nº de Acesso P43431)

54 IL12Rb- 2

55 IL12Rb- 1

56 IL-12 p35 humana (Uniprot Nº de Acesso P29459)

57 IL-12 p40 de camund ongo (Uniprot Nº de Acesso P43432) 58 ACP63 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS Anti-FN GFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSV CGS-2 KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVGAFR scFv PYRKHEWGQGTLVTVSRggggsggggsggggsSSELTQDPAV

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60 ACP35 mdmrvpaqllgllllwlrgarcrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysct Proteína aedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiy de edlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvg fusão eadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaggggsggggsggggsSGGP de IL-12 GPAGMKGLPGSggggsggggsggggsmwelekdvyvvevdwtpdapg de etvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshshlllh camund kkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfnikssssspdsra ongo vtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnkyeny stsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqrkkek mketeegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacvpcrvr sHHHHHH 61 ACP36 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS Proteína GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESV de KGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVS fusão SQGTLVTVSSSGGPGPAGMKGLPGSmwelekdvyvvevdwtpd de IL-12 apgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshs de hlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfniksssssp camund dsravtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnk ongo yenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqr kkekmketeegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacv pcrvrsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhy sctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclg siyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkpp vgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaSGGPGPAGMKGLPG

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62 ACP37 mdmrvpaqllgllllwlrgarcQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAAS Proteína GRIFSIDIMSWYRQAPGKQRELVARITRGGTISYDDSVKGR de FTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCNALYGTDYWGK fusão GTQVTVSSggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRL de IL-12 SCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTL de YAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGG camund SLSVSSQGTLVTVSSSGGPGPAGMKGLPGSmwelekdvyvve ongo vdwtpdapgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkg getlshshlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfnik ssssspdsravtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielale arqqnkyenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfs lkffvriqrkkekmketeegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscs kwacvpcrvrsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktar eklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktsl mmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhng etlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaSGGPGPAGM

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HHHHHH 64 ACP80 mdmrvpaqllgllllwlrgarcEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS Proteína GFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESV de KGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVS fusão SQGTLVTVSSSGGPGPAGMKGLPGSmwelekdvyvvevdwtpd de IL-12 apgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshs de hlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfniksssssp camund dsravtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnk ongo yenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqr kkekmketeegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacv pcrvrsggggsggggsggggsrvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhy sctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclg siyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkpp vgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssaSGGPGPAGMKGLPG

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SSHHHHHH 65 ACP91 mdmrvpaqllgllllwlrgarciwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeed Proteína gitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdil de kdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsa fusão ervrgdnkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiik de IL-12 pdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvft quiméric dktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcsggggsggggsggggsrvi a pvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplel hknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhn hqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvti nrvmgylssaggggsggggsggggsggggsggggsggggsggggsggggs ggggsQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSRSNIGSNTVKW

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71 EGFR EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQ (G8) GGGGGLDGNEEPGGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTI Pró- SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV droga TVSSGGGGKPLGLQARVVGGGGTQTVVTQEPSLTVSPGG C1486 TVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFL

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GLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKT EDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASGRTFSSYAM GWFRQAPGKEREFVVAINWASGSTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGYQINSGNYNFKDYEY DYWGQGTLVTVSSHHHHHH

73 EGFR VVGGGGTQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGN (G8) YPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKA Droga ALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGG ativa GSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASG C1300 FTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQV

KDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGN SYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGL VQPGGSLTLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVVAI NWASGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAAGYQINSGNYNFKDYEYDYWGQGTLVTVSSHHH

HHH 74 PSMA EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQ Pró- GGGGGLDGNEEPGGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTI droga SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV C1872 TVSSGGGGKPLGLQARVVGGGGTQTVVTQEPSLTVSPGG

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HHH 75 PSMA EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQ Pró- GGGGGLDGNEEPGGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTI droga SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLV não TVSSGGGGSGGGGSGGVVGGGGTQTVVTQEPSLTVSPG clivável GTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKF C1873 LVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYS

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SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTHGSH DNWGQGTMVTVSSHHHHHH INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[198] Todas as divulgações de todas as publicações de patentes e não patentes citadas neste documento são, cada uma, incorporadas por referência em suas totalidades para todos os fins.

OUTRAS MODALIDADES

[199] A divulgação exposta acima pode abranger múltiplas invenções distintas com utilidade independente.

Embora cada uma destas invenções tenha sido divulgada na(s) sua(s) forma(s) preferida(s), as suas concretizações específicas como descritas e ilustradas aqui não devem ser consideradas num sentido limitativo, porque são possíveis numerosas variações.

O assunto das invenções inclui todas as combinações e subcombinações novas e não óbvias dos vários elementos, características, funções e/ou propriedades descritas neste documento.

As reivindicações a seguir destacam particularmente certas combinações e subcombinações consideradas como novas e não óbvias.

As invenções incorporadas em outras combinações e subcombinações de recursos, funções, elementos e/ou propriedades podem ser reivindicadas neste pedido, em pedidos que reivindicam prioridade desse pedido ou em pedidos relacionados.

Tais reivindicações, quer sejam voltadas para uma invenção diferente ou para a mesma invenção, e se de um escopo mais amplo, mais restrito, igual ou diferente em comparação com as reivindicações originais, também são consideradas como incluídas dentro do assunto das invenções da presente descrição.

Claims (43)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo de fusão da fórmula: [A]-[L1]-[D] ou [A]-[L1]-[D]-[L2]-[B] or [B]-[L1]-[A]-[L1]-[D] caracterizado pelo fato de que A é um polipeptídeo de interleucina 12 (IL-12); B é um elemento de prolongamento da meia-vida; L1 e L2 são, independentemente, um ligante polipeptídico, em que L1 é um ligante polipeptídico clivável por protease e L2 é um ligante polipeptídico que é opcionalmente clivável por protease; D é uma fração de bloqueio de IL-12; e o polipeptídeo de fusão é um agonista do receptor de IL-12 atenuado, mas após (i) clivagem do ligante polipeptídico clivável por protease L1, ou (ii) clivagem de ambos L1 e L2 quando L2 é um ligante polipeptídico clivável por protease, o fragmento contendo polipeptídeo de IL-12 do polipeptídeo de fusão que é produzido é um agonista do receptor de IL-12 de potência e meia-vida comparáveis às do polipeptídeo de IL-12 de ocorrência natural.

2. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos cada um de: a) um polipeptídeo de interleucina 12 (IL-12) [A]; b) uma fração de bloqueio de IL-12 [D]; e c) um ligante polipeptídico clivável por protease [L]; e em que o polipeptídeo de IL-12 e a fração de bloqueio de IL-12 estão operacionalmente ligados pelo ligante polipeptídico clivável por protease e o polipeptídeo de fusão atenuou a ativação do receptor de IL-12, em que a atividade de ativação do receptor de IL-12 do polipeptídeo de fusão é pelo menos cerca 10X menor que a atividade de ativação do receptor de IL-12 do polipeptídeo que contém o polipeptídeo de IL-12 que é produzido por clivagem do ligante polipeptídico clivável por protease.

3. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que [A] é o terminal N do polipeptídeo de fusão.

4. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que [A] tem a fórmula: [A1]-[L3]-[A2] ou [A2]-[L3]-[A1], em que A1 é um polipeptídeo da subunidade p40 de IL-12; A2 é um polipeptídeo da subunidade p35 de IL-12; e L3 é um ligante polipeptídico que é opcionalmente clivável por protease.

5. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que [A] tem a fórmula [A1]-[L3]-[A2] e L3 não é clivável por protease.

6. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a atividade do agonista do fragmento contendo polipeptídeo de IL-12 do polipeptídeo clivado aumenta em pelo menos 10X em comparação com a atividade do agonista do polipeptídeo de fusão não clivado.

7. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a atividade do agonista é avaliada usando um ensaio de células repórter HEK Blue.

8. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que cada polipeptídeo do ligante clivável por protease compreende, independentemente, uma sequência que é capaz de ser clivada por uma protease selecionada do grupo que consiste em uma calicreína, trombina, quimase, carboxipeptidase A, catepsina G, catepsina L, uma elastase, PR-3, granzima M, uma calpaína, uma metaloproteinase de matriz (MMP), uma proteína de ativação de fibroblastos, uma metaloproteinase ADAM, um ativador de plasminogênio, uma catepsina, uma caspase, uma triptase e uma protease de superfície de células tumorais.

9. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que cada polipeptídeo clivável por protease compreende, independentemente, dois ou mais sítios de clivagem para a mesma protease, ou dois ou mais sítios de clivagem que são clivados por diferentes proteases ou pelo menos um dos polipeptídeos cliváveis por protease compreende um sítio de clivagem para duas ou mais proteases diferentes.

10. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de IL-12 inibe a ativação do receptor de IL-12 pelo polipeptídeo de fusão.

11. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de IL-12 se liga não covalentemente ao polipeptídeo de IL-12.

12. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de IL-12 se liga ao polipeptídeo de subunidade p40 de IL-12.

13. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de IL-12 se liga à subunidade p35 de IL-12.

14. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de IL-12 se liga a p70 de IL-12.

15. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de IL-12 compreende um domínio de ligação ao ligante ou fragmento de um receptor cognato para IL-12, um anticorpo de domínio único, Fab ou scFv que se liga ao polipeptídeo de IL-12 ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo selecionado entre um anticorpo de domínio único, um Fab e um scFv que se liga a um receptor de IL-12.

16. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de IL-12 também é um elemento de prolongamento da meia-vida.

17. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 ou 16, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de IL-12 bloqueia estericamente a atividade do agonista de IL-12.

18. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a fração de bloqueio de IL-12 é albumina sérica humana ou um polipeptídeo de ligação ao antígeno que recruta albumina sérica humana.

19. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a IL-12 está livre para se dissociar da fração de bloqueio da IL-12 após o ligante polipeptídico clivável por protease ser clivado por uma protease.

20. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão se liga ao receptor de IL-12.

21. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um elemento de prolongamento da meia-vida.

22. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o elemento de prolongamento da meia-vida é albumina sérica humana ou um polipeptídeo de ligação ao antígeno que se liga à albumina sérica humana.

23. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o elemento de prolongamento da meia-vida é Fc de imunoglobulina.

24. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a associação não covalente é dependente do pH.

25. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a ativação do receptor de IL-12 é determinada usando um ensaio de ativação do receptor in vitro padrão e quantidades iguais em uma base molar do polipeptídeo de IL-12 e do polipeptídeo de fusão.

26. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 25, caracterizado pelo fato de que IL-12 está livre para se dissociar da fração de bloqueio de IL-12 e/ou do elemento de prolongamento da meia-vida após a sequência clivável por protease ser clivada por uma protease.

27. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um elemento de prolongamento da meia-vida [B] e que tem a fórmula [B]-[L1]-[A]-[L2]-[D] em que L1 e L2 são, independentemente, um ligante polipeptídico, em que L1 é um ligante polipeptídico clivável por protease e L2 é um ligante polipeptídico que é opcionalmente clivável por protease.

28. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que L2 é um ligante clivável por protease.

29. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou de 3 a 28, caracterizado pelo fato de que L1 é um substrato para uma primeira protease e L2 é um substrato para uma segunda protease.

30. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 29, caracterizado pelo fato que compreende ainda um peptídeo de ligação ao antígeno tumoral específico.

31. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de ligação ao antígeno tumoral específico está ligado ao polipeptídeo de IL-12 por um ligante não clivável.

32. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de ligação ao antígeno tumoral específico está ligado ao polipeptídeo de IL-12, ao elemento de prolongamento da meia-vida ou à fração de bloqueio de IL-12 por um ligante clivável.

33. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ligante entre os domínios de IL-12.

34. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 32, caracterizado pelo fato de que a meia-vida sérica do fragmento contendo o polipeptídeo de IL-12 que é produzido pela clivagem por protease do ligante polipeptídico clivável por protease é comparável à meia-vida de IL-12 de ocorrência natural.

35. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 34.

36. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 35.

37. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, de acordo com a reivindicação 36.

38. Método de preparação de uma composição farmacêutica caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 37, em condições adequadas para expressão e coleta dos polipeptídeos desejados.

39. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende i) uma quantidade eficaz do polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 34 e ii) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

40. Método para tratamento de um tumor caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um sujeito em necessidade, de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 34.

41. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 34, caracterizado pelo fato de que é para uso como medicamento.

42. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 34, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um tumor em um sujeito em necessidade.

43. Composição farmacêutica para tratamento de um tumor em um sujeito em necessidade caracterizada pelo fato de que compreende como ingrediente ativo um polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 34.

= polipeptídeo de citocina Protease (ou fragmento funcional seletiva de tumor ou muteína)

= fração de bloqueio,

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 121/148 opcionalmente funciona como um extensor de meia-vida

= ligante peptídico = sítio de clivagem de protease

Receptor de Citocina 1/27

Célula de expressão de receptor Célula de expressão de receptor

1 .A citocina é conectada à fração de bloqueio através 2. Em um ambiente inflamatório ou de tumor, a de via do ligante peptídico clivável por protease, dessa protease cliva no sítio de clivagem de protease no forma bloqueando sua capacidade de se ligar ao seu ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e receptor. permitindo que a citocina para ligar o receptor

HSA diretamente ligado

= polipeptídeo de citocina (ou fragmento funcional

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 122/148 ou muteína) Protease seletiva de = fração de bloqueio, tumor funciona opcionalmente como extensor de meia- vida = ligante peptídico

= sítio de clivagem de protease 2/27

Receptor de Citocina

Célula de expressão de receptor Célula de expressão de receptor

1 .A citocina é conectada à fração de bloqueio através 2. Em um ambiente inflamatório ou de tumor, a de via do ligante peptídeo clivável por protease, dessa protease cliva no sítio de clivagem de protease no forma bloqueando sua capacidade de se ligar ao seu ligante peptídico, liberando a fração de bloqueio e receptor. permitindo que a citocina para ligar o receptor

Múltiplos HSA diretamente ligados = polipeptídeo de citocina (ou fragmento funcional ou muteína)

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 123/148 Protease = fração de bloqueio, seletiva de funciona opcionalmente tumor como extensor de meia- vida = ligante peptídico = sítio de clivagem de protease

Receptor de Citocina 3/27

Célula de expressão de receptor Célula de expressão de receptor

1 .A citocina é conectada à fração de bloqueio através de 2. Um ambiente inflamatório ou de tumor, a protease cliva no sítio ou .A ligante via1do é conectada citocinapeptídico à fração clivável de bloqueio por protease, através dessa ligante peptídico de clivagem de protease, liberando a fração de de via do ligante peptídeo clivável por protease, forma bloqueando sua capacidade de se ligar ao seu dessa bloqueio e permitindo que a citocina se ligue ao receptor.

A citocina forma bloqueando sua capacidade de se ligar ao seu receptor. agora tem propriedades PK semelhantes comparadas à citocina nativa receptor. (por exemplo, meia-vida curta).

Citocinas Múltiplas = polipeptídeo de citocina (ou fragmento funcional ou

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 124/148 Protease muteína) seletiva de = fração de bloqueio, tumor opcionalmente funciona como um extensor de meia- vida = ligante peptídico = sítio de clivagem de Receptor protease de Citocina 4/27

Célula de expressão de receptor Célula de expressão de receptor

1 .A citocina é conectada à fração de bloqueio através 2. Em um ambiente inflamatório ou de tumor, a protease cliva de via do ligante peptídico clivável por protease, dessa no sítio ou ligante peptídico de clivagem de protease, forma bloqueando sua capacidade de se ligar ao seu liberando a fração de bloqueio e permitindo que a citocina se receptor. ligue ao receptor.

= polipeptídeo de citocina (ou fragmento funcional ou muteína) Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 125/148 Protease seletiva de = fração de bloqueio tumor = elemento de extensão de meia-vida = ligante peptídico = sítio de clivagem de protease Receptor de Citocina 5/27 Célula de expressão de receptor Célula de expressão de receptor

1.A citocina é conectada à fração de bloqueio através do 2.Em um ambiente inflamatório ou de tumor, a protease cliva no (s) ligante (s) peptídico (s) clivável (eis) por protease, sítio de clivagem de protease no ligante peptídico, liberando o assim bloqueando sua capacidade de se ligar ao seu elemento de extensão de meia-vida e fração de bloqueio e receptor. Ela também está ligada a um elemento de permitindo que a citocina se ligue ao receptor. A citocina agora tem extensão de meia-vida separado, que estende a meia-vida propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa no soro. (por exemplo (meia-vida curta)

= polipeptídeo de citocina (ou fragmento funcional Protease ou muteína) Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 126/148 seletiva de = domínio de direcionamento tumor = fração de bloqueio, opcionalmente funciona como extensor de meia-vida = ligante peptídico = sítio de clivagem de protease Receptor de Citocina 6/27 Célula de expressão de receptor Célula de expressão de receptor

1.A citocina é conectada à fração de bloqueio e 2.Em um ambiente inflamatório ou de tumor, a ao domínio de direcionamento através do protease cliva no sítio de clivagem de protease no ligante peptídico clivável por protease, assim ligante peptídico, liberando o domínio de bloqueando sua capacidade de se ligar ao seu direcionamento e fração de bloqueio e permitindo receptor. que a citocina se ligue ao receptor.

= polipeptídeo de citocina (ou fragmento funcional ou muteína) = fração de bloqueio, Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 127/148 Protease opcionalmente funciona seletiva de como extensor de meia-vida tumor = domínio de direcionamento = elemento de extensão de meia-vida = ligante peptídico = sítio de clivagem de protease 7/27 Receptor de Citocina Célula de expressão de receptor Célula de expressão de receptor

1.A citocina é conectada ao domínio de 2.Em um ambiente inflamatório ou de tumor, a protease cliva direcionamento, fração de bloqueio e ao no sítio de clivagem de protease no (s) ligante (s) peptídico (s), liberando o elemento de extensão de meia-vida, domínio elemento de extensão de meia-vida através do de direcionamento, fração de bloqueio e permitindo que a (s) ligante (s) peptídico (s) clivável (eis) por citocina se ligue ao receptor. A citocina agora tem protease, assim bloqueando sua capacidade de propriedade PK semelhantes em comparação com a citocina se ligar ao seu receptor. nativa (por exemplo, meia-vida curta).

= polipeptídeo de citocina (ou fragmento funcional ou muteína) = fração de bloqueio, Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 128/148 opcionalmente funciona Protease como extensor de meia-vida seletiva de = domínio de tumor direcionamento = elemento de extensão de meia-vida = ligante peptídico = sítio de clivagem de protease 8/27 Receptor de Citocina Célula de expressão de receptor Célula de expressão de receptor

1.A citocina é conectada ao domínio de 2.Em um ambiente inflamatório ou de tumor, a protease cliva no sítio direcionamento, fração de bloqueio e ao de clivagem de protease no (s) ligante (s) peptídico (s), liberando o elemento de extensão de meia-vida através do elemento de extensão de meia-vida e fração de bloqueio e permitindo (s) ligante (s) peptídico (s) clivável (eis) por que a citocina se ligue ao receptor. A porção de direcionamento protease, assim bloqueando sua capacidade de permanece ligada, mantendo a citocina no microambiente tumoral. A se ligar ao seu receptor. citocina agora tem propriedades pK semelhantes em comparação com a citocina nativa (por exemplo, meia -vida curta).

Alça DE

Alça AB

Alça C’’D

Alça CC’ Alça EF

ACP34 cortada ACP35 cortada

ACP07 clivada

ACP09 clivada ACP06 clivada

ACP08 clivada

ACP11 clivada ACP10 clivada não cortada cortada

Fusão intacta

Bloqueador-L-HSA

Precursores inativos Ligante clivável

Alvo Alvo

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 135/148 ou

Alvo Alvo

Clivagem por MMP-9 no microambiente tumoral IL-12 visada, ativa

Alvo

Alvo 15/27

Retenção de IL-12 ativada no tumor por ligação ao alvo

Alvo

Alvo

Alvo Alvo

ACP36 não cortada ACP36 cortada ACP37 cortada

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 136/148 16/27

ACP36 cortada ACP37 não cortada ACP37 cortada

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 137/148 ACP52 não cortada ACP51 não cortada ACP52 cortada ACP51 cortada 17/27

ACP51 não cortada MMP9 pré-ativada por ACP51 ACP52 não cortada MMP9 pré-ativada por ACP52

ACP11 não cortada

Inducina

ACP11 não cortada

ACP91 não cortada

Inducina

ACP91 não cortada

Veículo IP

Dias após o início da dosagem

Volume tumoral (mm3)

Veículo

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 141/148 Volume tumoral (mm3) Volume tumoral (mm3) Volume tumoral (mm3) Dias após o início da dosagem Dias após o início da dosagem Dias após o início da dosagem 21/27

Volume tumoral (mm3) Volume tumoral (mm3)

Volume tumoral (mm3) Dias após o início da dosagem Dias após o início da dosagem Dias após o início da dosagem

ProTriTACs São Ativáveis por Proteases Associadas ao Tumor

ProTnTAC sozinho

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 142/148 Ligante peptídico clivável por protease

(Pró-droga)

(Droga ativa) 22/27

Gel SDS-PAGE

Biblioteca proprietária do ligantes peptídicos de substrato com diferentes clivabilidades manipuladas

Atividade Diferencial suportada por Diversos Ensaios In Vitro 250X Diferencial em Ligação de CD3 (ELISA)

Droga Ativa Pró Droga Pró Droga (não clivável) Razão de mascaramento Ligação de CD3

Droga Ativa Pró Droga Pró Droga (não clivável) Concentração

>1000X Diferencial em Ligação de Célula T Humana Primária (FACS)

Droga Ativa Pró Droga (não clivável) Ligação de célula T humana

Pró Droga Razão de mascaramento

Droga Ativa Pró Droga Pró Droga (não clivável) Concentração

550X Diferencial em Atividade de Eliminação de Células T (TDCC)

Droga Ativa Pró Droga Viabilidade celular

Pró Droga (não clivável) Razão de mascaramento

Droga Ativa Pró Droga Concentração Pró Droga (não clivável) Plug-and-Play: mascaramento demonstrado com >20 ligantes peptídicos para 5 alvos diferentes

Atividade Anti-Tumor Potente, Dependente de Protease em Modelo de Xenoenxerto Colorretal de HCT116 em camundongos NCG

Petição 870210002816, de 08/01/2021, pág. 144/148 EGFR ProTriTAC (não clivável, 0,03 mg/kg)

Volume do Tumor, 24/27

Dia, implantação pós tumor

ProTriTAC ativada não detectável em circulação Dose Final Consistente com ativação intratumoral de ProTriTAC

Filtração Análise SDS-PAFE de Três ProTriTACs Purificadas Não Reduzida Reduzida Proteína A Dessalinizar Troca Iônica SEC Analítica +/- Agrupamento Fração de SDS-

PAGE Dessalinizar (Formulação)

SEC Analítica de uma ProTriTAC Após Diferentes Condições de Estresse

Condição % Principal

Estudo PK de Dose Única para Investigar Mascaramento Funcional e Estabilidade de ProTriTAC em Macaco Cynomolgus Controle #1 Controle #2 ProTriTAC Não mascarado Mascarado Mascarado Ativada Não clivável Não clivável Clivável

Alvo Concentração plasmática (nM)

Controle #1 (não mascarado, não clivável)

Controle #2 (mascarado, não clivável)

mascaramento melhora ProTriTAC ativada t1/2 e exposição ProTriTAC Ativada (CT) depuração rápida 2 animais por grupo, cada em 0,1 mg/kg

Tempo (h)

Artigo de teste t1/2 terminal (hr) AUC, 0-último Depuração

Controle #1 (não mascarado, não clivável)

Controle #2 (mascarado, não clivável)

ProTriTAC ativada (CT)

Proteção Dupla Contra Atividade No Alvo, Fora do Tumor Ligação de células T periféricas limitada (conforme demostrado por PK melhorada a partir do mascaramento) Depuração rápida de droga ativa em circulação Pró-droga Droga Ativa Concentração plasmática (nM)

Conversão in vivo não ProTriTAC (empírico) mediada por tumor

(calculada) Droga Ativa (calculada)

(empírico) (empírico) Depuração Depuração Tempo (h)

Ligante peptídico de substrato suficientemente estável em circulação: 50% de conversão a cada 194 h Droga ativa não acumula em circulação: abaixo de 0,5% de pró-droga todo o tempo