BR112014013122A2 - mutante de gdf-5 para indução de formação de cartilagem - Google Patents

Abstract

mutante de gdf-5 para indução de formação de cartilagem. a presente invenção é direcionada a proteínas relacionadas à gdf-5 que possuem uma capacidade aprimorada de indução da formação de cartilagem e uma capacidade reduzida de indução da formação de osso. as novas proteínas são particularmente úteis no tratamento de defeitos da cartilagem, em que a formação de tecido ósseo é indesejável.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MUTANTE DE GDF-5 PARA INDUÇÃO DE FORMAÇÃO DE CARTILAGEM". Descrição

[001] A presente invenção é direcionada a proteínas relacionadas a GDF-5 que possuem uma capacidade aprimorada de induzir a formação de cartilagem e uma capacidade reduzida de induzir a formação de osso. As novas proteínas são particularmente úteis no tratamento de defeitos da cartilagem, em que a formação de tecido ósseo é indesejável.

[002] As juntas sinoviais são essenciais para a função biomecânica do esqueleto. Uma função irregular que é observada nas doenças artríticas resulta diretamente em uma perda grave de qualidade de vida. Portanto, a biologia das juntas tem estado em foco de pesquisa extensiva durante anos levando a um entendimento da anatomia e da histologia das juntas bem como as propriedades biomecânicas e as funções de cartilagem articular e outros componentes na função e na manutenção das juntas.

[003] GDF-5 (Hótten e outros 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652) é um morfogene que se mostrou promover a proliferação, a diferenciação celular e/ou a formação de tecidos em vários tecidos. A proteína é também conhecida como proteína morfogênica MP52, proteína morfogenética óssea-14 (BMP-14) ou proteína morfogenética derivada de cartilagem-1 (CDMP-1). A GDF-5 exibe atividade condrogênica e mutações congênitas da GDF-5 causam defeitos nas articulações dos dedos, dos punhos e dos tornozelos em camundongos e seres humanos (Storm e outros, 1994; Thomas e outros, 1997). A expressão de GDF-5 é mais estraordinariamente limitada às regiões onde as juntas se desenvolverão e é um dos marcadores mais precoces da formação de juntas (Storm e Kingsley, 1999). A sinalização do receptor de BMP é necessária para a manutenção pós-natal da cartilagem articular (Rountree, 2004, PLoS Biol. 2004 Novembro, 2(11)).

[004] GDF-5 é intimamente relacionada a GDF-6 e GDF-7. Estas três proteínas formam um subgrupo distinto da superfamília TGF-R, exibindo assim propriedades biológicas comparáveis e um alto grau extraordinário de identidade de sequências de aminoácidos (ver, isto é, Wolfman e outros 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330). Todos os membros da família são inicialmente sintetizados na forma de proteínas precursoras maiores que subsequentemente sofrem clicagem proteolítica em um agrupamento de resíduos básicos de aproximadamente de 110 a 140 aminoácidos partindo do terminal C, liberando assim as partes da proteína madura do terminal C partindo do pró-domínio N-terminal. Os polipeptidecos maduros são estruturalmente — relacionados e contêm um domínio bioativo conservado que compreende seis ou sete resíduos de cisteína canônicos que é responsável pelo motivo "nó de cistina" tridimensional característico destas proteínas. As proteínas relacionadas a GDF-5 nativas são moléculas homodiméricas e atuam principalmente através da interação com complexos receptores específicos que são compostos de quinases de receptor de serina/treonina do tipo | e do tipo Il. As quinases de receptor subsequentemente ativam proteínas Smad, que então propagam os sinais para dentro do núcleo para regular a expressão do gene alvo.

[005] Foi demonstrado repetidamente que membros do subgrupo GDF-5/-6/-7 são primariamente importantes indutores e reguladores de osso e cartilagem (Cheng e outros 2003, J. Bone & Joint Surg. 85A, 1544-1552; Settle e outros 2003, Developm. Biol. 254, 116-130). GDF- e proteínas relacionadas se ligam a e oligomerizam dois tipos de receptores de serina-treonina quinase ligados à membrana denominados tipos | e Il. Após a ligação do ligante, estes complexos transduzem sinais através da fosforilação de membros da família SMAD de fatores de transcrição, que após a ativação entram no núcleo e regulam a transcrição de genes capazes de resposta (Massague, 1996). Experimentos recentes implicaram dois receptores do tipo | diferentes na configuração do esqueleto, BMPR-IA e BMPR- IB. Ambos os receptores são expressos em padrões dinâmicos durante o desenvolvimento normal. Em várias estruturas dos membros, por exemplo, nas interzonas das juntas e no pericôndrio, é observada uma expressão sobreposta de BMPR-IA e BMPR-IB (Mishina e outros, 1995; Zou e outros, 1997; Baur e outros, 2000). Em relação aos padrões de expressão de BMPR-IA e BMPR-IB, a transdução de sinal de GDF-5 deve ser realizada através da interação tanto com BMPR-IA quanto com BMPR-IB (Chang e outros, 1994; Zou e outros, 1997). Mutações nulas no gene bmpr-1b produzem camundongos viáveis com defeitos na formação de ossos e juntas que se assemelham bastante com aqueles observados em camundongos que não possuem GDF-5 (Storm e Kingsley, 1996; Yi e outros, 2000), enquanto que camundongos bmpr-la/ são conhecidos por morrerem precocemente na embriogênese (Mishina e outros, 1995). Entretanto, um nocaute condicional de BMPR-IA sob o controle de um controlador de GDF-5-Cre contorna a letalidade embrionária e produz camundongos viáveis com juntas formadas normalmente. Porém, após o nascimento, a cartilagem articular dentro das juntas se gasta em um processo similar à osteoartrite, que ressalta a importância deste receptor na homeostase e no reparo da cartilagem (Rountree e outros, 2004).

[006] A atividade das proteínas do tipo selvagem da família de proteínas relacionadas à GDF-5 geralmente resulta na formação de cartilagem e osso. Entretanto, há condições médicas diferentes, em que uma formação de cartilagem é desejável, entretanto, a formação de tecido ósseo é indesejada. Por exemplo, é evidente que no caso de defeitos nas juntas, a formação de cartilagem é desejável enquanto que a ossificação deve ser evitada.

[007] Portanto, o objetivo da presente invenção é utilizar especificamente o efeito de indução da formação de cartilagem de proteínas relacionadas à GDF-5 e desligar o efeito indutor de formação de osso. Surpreendentemente, foi descoberto que é possível fornecer variantes de proteínas relacionadas à GDF-5 que possuem uma capacidade aprimorada de induzir a formação de cartilagem e a capacidade reduzida de indução da formação de osso. Isto pode ser conseguido através da modificação das proteínas relacionadas à GDF- de forma que estas possuam uma maior afinidade pelo BMPR-IB e/ou uma afinidade reduzida pelo BMPR-IA.

[008] A GDF-5 do tipo selvagem se liga ao BMPR-IB in vitro com uma afinidade aproximadamente 40 até 120 vezes mais alta (KW — 8- 27 pM) quando comparado com BMPR-IA (Kf — 1-1,1 nM). Foi observado que através da modificação da afinidade de ligação de proteínas relacionadas à GDF-5 de forma que a afinidade por BMPR- IB seja aumentada enquanto que a afinidade por BMPR-IA é reduzida, a formação de cartilagem é facilitada enquanto que a formação de osso é reduzida. Isto pode ser conseguido através de substituições específicas de um ou mais resíduos de aminoácidos em relação a um sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA na sequência de aminoácidos de uma proteína relacionada à GDF-5.

[009] A afinidade de ligação de proteínas relacionadas à GDF-5 que possuem substituições específicas é comparada com a afinidade de ligação da proteína relacionada à GDF-5 humana do tipo selvagem, em particular GDF-5 humana do tipo selvagem.

[0010] Com a finalidade de evitar equívocos e ambiguidades,

alguns termos utilizados frequentemente aqui são definidos e exemplificados como a seguir:

[0011] O termo "domínio do nó de cistina" como é utilizado aqui significa a região de aminoácidos rica em cisteína bem conhecida e conservada que está presente nas partes maduras das proteínas da superfamília de T]GF-beta tal como, isto é, GDF-5 humana e forma uma estrutura proteica tridimensional conhecida como nó de cistina. Neste domínio a localização respectiva dos resíduos de cisteína em relação a cada outro é importante e é permitido apenas que varie ligeiramente com a finalidade de não perder a atividade biológica. Foi demonstrado que o domínio do nó de cistina sozinho é suficiente para a função biológica de proteína (Schreuder e outros (2005), Biochem Biophys Res Commun. 329, 1076-86). Sequências consenso para domínios nó de cistina são bem conhecidas no estado da arte. De acordo com a definição feita aqui o domínio do nó de cistina de uma proteína começa com o primeiro resíduo de cisteína que participa no nó de cistina da respectiva proteína e termina com o resíduo que segue a última cisteína que participa no nó de cistina da respectiva proteína. Por exemplo, o domínio do nó de cistina da proteína precursora de GDF-5 humana (SEQ ID %&Nº. 2) consiste dos aminoácidos 400 a 501 (ver também a Figura 1).

[0012] O termo "proteína relacionada à GDF-5" como é utilizado aqui significa qualquer proteína que ocorre naturalmente ou criada artificialmente que é muito intimamente relacionada ao fator de crescimento/diferenciação 5 humano (hGDF-5). Uma característica comum de todas as proteínas relacionadas à GFD-5 é a ocorrência de um domínio do nó de cistina com uma identidade de aminoácidos de pelo menos 60% em relação ao domínio do nó de cistina de 102 aa da GDF-5 humana (aminoácidos 400 a 501 da SEQ ID fNº. 2), que é suficiente para a função biológica da proteína. O termo "proteínas relacionadas à GDF-5" inclui proteínas que pertencem ao grupo das proteínas GDF-5, GDF-6 e GDF-7 de espécies de vertebrados ou de mamíferos bem como variantes recombinantes das mesmas contanto que estas proteínas exibam a porcentagem de identidade mencionada anteriormente em relação ao domínio do nó de cistina da GDF-5 humana. O valor limitante de 60% é bem adequado para separar os membros do grupo de proteínas GDF-5/-6/-7 bem como variantes dos mesmos de proteínas adicionais tais como GDFs mais distantemente relacionadas e BMPs. Uma comparação dos domínios dos nós de cistina de 102 aa da GDF-5 humana, da GDF-6 humana e da GDF-7 humana (ver a Figura 2) revela o alto grau de identidade de aminoácidos entre estas proteínas. A GDF-6 humana compartilha 87 (85%) e a GDF-7 humana compartilha 83 (81%) resíduos idênticos com o domínio do nó de cistina da GDF-5 humana. Os respectivos domínios das moléculas de GDF-5/-6/-7 de outras espécies de vertebrados e de mamíferos que foram identificadas até agora também exibem porcentagens de identidade muito altas de pelo menos 75% (entre 79% e 99%), quando comparados com o da GDF-5 humana. Em contraste, GDFs e BMPs que não pertencem ao subgrupo de GDF-5/-6/-7 exibem valores de identidade muito mais baixos abaixo de 60%.

[0013] A determinação das posições de aminoácidos correspondentes em sequências de aminoácidos relacionadas bem como o cálculo das porcentagens de identidade podem ser facilmente realizados com o auxílio de algoritmos de alinhamento bem conhecidos e opcionalmente programas de computador que utilizam estes algoritmos. Por exemplo, as identidades de aminoácidos neste pedido de patente (isto é, a Figura 2) foram calculadas através do alinhamento das sequências com o programa freeware ClustalX (Versão 1.81) com parâmetros pré-estabelecidos e da contagem subsequente de resíduos idênticos manualmente. Os ajustes pré- estabelecidos para o alinhamento em pares (de acurácia diminuída) são: parâmetro de abertura do espaço: 10,00; parâmetro de extensão do espaço 0,10; Matriz de peso da proteína: Gonnet 250. O programa ClustalX é descrito em detalhes em Thompson,J.D., Gibson,T.J., Plewniak,F., Jeanmougin,F. e Higgins,D.G. (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24:4876-4882. ClustalX é uma interface do Windows para o programa de alinhamento de sequências múltiplas ClustalW e está, isto é, disponível em várias fontes, isto é, através de ftp anônimo de ftp-igbmc.u-strasbg.fr, ftp.embl-heidelberg.de, ftp.ebi.ac.uk ou via download da página da web a seguir: http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/. O programa e o algoritmo ClustalW também são descritos em detalhes em Thompson, J.D., Higgins, D.G. e Gibson, T.J. (1994): CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680. As proteínas relacionadas à GDF-5 especialmente preferidas exibem identidades de aminoácidos de pelo menos 70%, 80%, 90% ou 95% em relação ao domínio nó de cistina de 102 aa da GDF-5 humana.

[0014] Exemplos não limitantes para proteínas relacionadas à GDF-5 de vertebrados e mamíferos são precursores e proteínas maduras da GDF-5 humana (divulgados como MP52 na WO95/04819 e como GDF-5 humana em Hôtten e outros 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652), GDF-5/MP52 humana recombinante (rh) (WO96/33215), MP52 Arg (WOS97/06254); HMW humana MP52s (WOS97/04095), CDMP-1 (WO96/14335), GDF-5 de camundongo (Mus musculus) (US 5.801.014), GDF-5 de coelho (Oryctolagus cuniculus) (Sanyal e outros 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210), GDF-5 de frango

(Gallus gallus) (No. de acesso do NCBI NP 989669), GDF-5 do sapo com garras africano (Xenopus laevis) (No. de acesso do NCBI AAT99303), GDF-5. monomérica (WO 01/11041 e WO 99/61611), GDF-6/BMP-13 humana (US 5.658.882), GDF-6 de camundongo (Nº. de acesso do NCBI NP 038554), GDF-6/CDMP-2 (WO96/14335), GDF-7/BMP-12 humana (US 5.658.882), GDF-7 de camundongo (fNº. de acesso do NCBI AAP97721), GDF-7/CDMP-3 (WOS96/143335). São também cobertas pela invenção as proteínas relacionadas à GDF-5 que possuem mutações adicionais tais como substituições, adições e deleções, contanto que estas mutações adicionais não anulem completamente a atividade biológica das proteínas.

[0015] A presente invenção se baseia na descoberta dos inventores de que é possível através de modificações específicas na região da sequência de aminoácidos de uma proteína relacionada à GDF-5 que está envolvida na ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA modificar a proteína de tal maneira que a mesma possua uma capacidade aprimorada de indução da formação de cartilagem e uma capacidade reduzida de indução da formação de osso.

[0016] Foi descoberto que as proteínas que possuem uma maior afinidade por BMPR-IB e/ou proteínas que possuem uma afinidade reduzida por BMPR-IA são mais capazes de induzir a formação de cartilagem enquanto que a formação de osso é reduzida. Estas propriedades são especialmente marcantes nas proteínas que exibem tanto uma maior afinidade por BMPR-IB quanto uma afinidade reduzida por BMPR-IA.

[0017] As proteínas relacionadas à GDF-5 da presente invenção podem ser obtidas através de modificação química ou tecnologia de engenharia genética com proteínas recombinantes sendo preferidas. As proteínas podem ser obtidas através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido relacionado a um sítio de ligação ao BMPR-

IB e/ou ao BMPR-IA na sequência de aminoácidos de uma proteína relacionada à GDF-5. Em particular, uma substituição de um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos relacionados a um sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou um sítio de ligação ao BMPR-IA na sequência de aminoácidos de uma proteína relacionada à GDF-5 é preferida.

[0018] A modificação acima pode ser introduzida em quaisquer proteínas relacionadas à GDF-5 conhecidas como definido anteriormente. Em relação ao aspecto de um uso terapêutico da proteína, é preferido derivar a proteína partindo de uma proteína relacionada à GDF-5 humana, por exemplo, partindo de uma proteína relacionada à GDF-5 humana do tipo selvagem tal como GDF-5, GDF- 6 ou GDF-7. Entretanto, as proteínas da invenção também podem ser derivadas de proteínas relacionadas à GDF-5 que possuem mutações adicionais tais como substituições, adições ou deleções contanto que estas mutações adicionais não anulem completamente a atividade biológica das proteínas.

[0019] As proteínas relacionadas à GDF-5 que são definidas aqui compreendem um domínio do nó de cistina com uma identidade de aminoácidos de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 95% em relação ao domínio do nó de cistina de 102 aa da GDF-5 humana.

[0020] As proteínas relacionadas à GDF-5 da presente invenção preferencialmente compreendem uma substituição de um ou mais aminoácidos comparadas com a do tipo selvagem na região que está envolvida na ligação ao BMPR-IB e/ou na região que está envolvida na ligação ao BMPR-IA. As regiões de proteínas relacionadas à GDF-5 que estão envolvidas na ligação ao BMPR-IA e/ou ao BMPR-IB são bem conhecidas na arte ou podem ser facilmente determinadas utilizando métodos que estão dentro do conhecimento comum.

[0021] Em referência à sequência de aminoácidos de comprimento completo da GDF-5 do tipo selvagem, é particularmente preferido substituir um ou mais dos aminoácidos a seguir (código de uma letra) por qualquer aminoácido diferente:

[0022] R 399;

[0023] qualquer um de F 409 até W 417, preferencialmente M 412, G 413, W 414 e/ou W 417;

[0024] qualquer um de E 434 até M 456, preferencialmente F 435, P 436, L 437, R438, S 439, H 440, P 443, N 445, V 448, | 449, L 452, M 453, S 455 e/ou M 456;

[0025] S 475;

[0026] | 476;

[0027] F 478;

[0028] qualquer um de K 488 até M 493, preferencialmente K 488, Y 490 e/ou D 492.

[0029] Preferencialmente, o aminoácido R 399 é substituído por V, L,I,M,F,Y, W, EouD.

[0030] Preferencialmente, o aminoácido M 412 é substituído por V, L,1,F,Y,W, H, KouR.

[0031] Preferencialmente, o aminoácido W 414 é substituído por RK,F,Y,H,EouD.

[0032] Preferencialmente, o aminoácido W 417 é substituído por R,K,F,Y, H, EouD.

[0033] Preferencialmente, o aminoácido F 435 é substituído por V, LI, M,P, Y, W, H, KouR.

[0034] Preferencialmente, o aminoácido P 436 é substituído por V, L,I,M,F, You W.

[0035] Preferencialmente, o aminoácido L 437 é substituído por D ou E.

[0036] Preferencialmente, o aminoácido R 438 é substituído por K,

D, HA, NM, E, Q, S, T, You W.

[0037] Preferencialmente, o aminoácido S 439 é substituído por K, D, E, HH, R M, T, N, Q, You W.

[0038] Preferencialmente, o aminoácido H 440 é substituído por V, IM,F,Y,W, EouD.

[0039] Preferencialmente, o aminoácido P 443 é substituído por V, LI, M,F,Y,W,AousS.

[0040] Preferencialmente, o aminoácido N 445 é substituído por D, Q,H,F,L,RKM,S,Y ou W.

[0041] Preferencialmente, o aminoácido V 448 é substituído por F, L,I, M,P, You W.

[0042] Preferencialmente, o aminoácido | 449 é substituído por F, L, V,M, P, You W.

[0043] Preferencialmente, o aminoácido L 452 é substituído por F, | V,M,P, Y ou W.

[0044] Preferencialmente, o aminoácido M 456 é substituído por F, I1L,P,Y,W,S,T,N,Q,KouD.

[0045] Preferencialmente, o aminoácido S 475 é substituído por M, T, N, Q, You W.

[0046] Preferencialmente, o aminoácido K 488 é substituído por R, M, S, T, N, Q, You W.

[0047] Preferencialmente, o aminoácido Y 490 é substituído por E, H, KR, Q,F, T, M, S, N, Qou W.

[0048] Preferencialmente, o aminoácido D 492 é substituído por G, E, MS, T, N, Q, Y, W, H, KouR.

[0049] Preferencialmente, o aminoácido | 476 é substituído por G, A, V, L, M, F, You W.

[0050] Preferencialmente, o aminoácido F 478 é substituído por G, A,V,L,1, You W.

[0051] As posições correspondentes na sequência de aminoácidos de proteínas relacionadas à GDF-5 diferentes podem ser facilmente derivadas da informação acima em relação à GDF-5 do tipo selvagem.

[0052] De acordo com uma primeira modalidade, pelo menos um aminoácido hidrofóbico no sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR- IA de uma proteína relacionada à GDF-5 é substituído por um aminoácido hidrofílico ou polar. Os exemplos de resíduos de aminoácidos hidrofílicos ou polares são ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, histidina, serina e treonina.

[0053] De acordo com uma segunda modalidade, pelo menos um aminoácido hidrofílico ou polar no sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA de uma proteína relacionada à GDF-5 é substituído por um aminoácido hidrofóbico. Os exemplos de aminoácidos hidrofóbicos são alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.

[0054] De acordo com outra modalidade preferida, a proteína da presente invenção compreende uma substituição conservativa de pelo menos um aminoácido no sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR- IA de uma proteína relacionada à GDF-5. Isto significa que a natureza do aminoácido que estava originalmente presente é mantida. Consequentemente, um aminoácido hidrofílico ou polar é substituído por outro aminoácido hidrofílico ou polar ou um aminoácido hidrofóbico é substituído por outro aminoácido hidrofóbico.

[0055] Preferencialmente, a substituição conservativa é selecionada de tal maneira que um aminoácido é trocado por outro aminoácido que possui uma demanda espacial diferente. De acordo com este aspecto da invenção, um aminoácido hidrofóbico pode ser substituído por um aminoácido hidrofóbico menor ou maior ou um aminoácido hidrofílico ou polar pode ser substituído por um aminoácido hidrofílico ou polar menor ou maior.

[0056] As substituições de aminoácidos nas proteínas relacionadas à GDF-5 podem ser divididas em 4 grupos através da natureza do aminoácido:

[0057] Resíduos de aminoácidos básicos (R, K, H), substituídos por

[0058] hidrofóbicos (V, L, , M, P, E, Y, W)

[0059] ácidos (E, D)

[0060] resíduos de aminoácidos básicos que não são idênticos a |. (R, K, H)

[0061] d) polares (S, T, N, Q).

[0062] Resíduos de aminoácidos ácidos (D), substituídos por

[0063] hidrofóbicos (M, Y, W, G)

[0064] ácidos (E)

[0065] básicos (R, K, H)

[0066] d) polares (S, T. N, Q).

[0067] Resíduos de aminoácidos hidrofóbicos (M, V, LL | P, F, Y, W, A), substituídos por

[0068] resíduos de aminoácidos hidrofóbicos que não são idênticos a Ill. (M, V, L | P,F, Y, W,G, A)

[0069] ácidos (E, D)

[0070] básicos (R, K, H)

[0071] polares (S, T, N, Q)

[0072] d) pequenos (A).

[0073] IV. Resíduos de aminoácidos polares (S, T, N), substituídos por

[0074] hidrofóbicos (M, V, L, 1, P, E, Y, W)

[0075] ácidos (E, D)

[0076] básicos (R, K, H)

[0077] d) resíduos de aminoácidos polares que não são idênticos a IV. (S, TN, Q).

[0078] Em uma modalidade preferida, a proteína relacionada à

GDF-5 da presente invenção compreende uma sequência que se combina com uma das sequências de aminoácidos a seguir: a) ZOX X2KXaLHVX.ZZZZZZZZZX7IAPLXs8Y EAXsHOX1oGX11CZZZZZ2Z2227222272Z27Z ZZZZXiaPX1aXisX16PX17X18CCVPX19X20L X21 PIZIL X22X23DX24aX25NNVVYZZZZZZVVEX? 7CGCR ou b) ZCOXK2KX3L HVXaFXsXZZZDDZX;IAPLXgY EAX9HCOX1oGX11CXK,2ZZZZ ZZLEZTZHAZZOTZZNZZX1 3P XX 1aX15X16PX1 7X 8 CCVPX 9X20LX21PIZIL Xa2X23DX24X25NNVVYZX2.sZZZMVVEX;;CGCR

[0079] e em que

[0080] cada X representa qualquer aminoácido,

[0081] cada Z representa qualquer aminoácido.

[0082] Estas sequências genéricas foram compiladas de uma comparação dos domínios do nó de cistina de sequências de GDF-5, GDF-6 e GDF-7 de vertebrados. As posições que não são conservadas nas proteínas alinhadas são representadas por um X nas sequências genéricas. As posições que são mutadas de acordo com a presente invenção são representadas por um Z.

[0083] Em uma modalidade mais preferida, a proteína relacionada à GDF-5 da invenção compreende uma sequência que se combina com uma das sequências genéricas de aminoácidos mencionadas anteriormente e em que

[0084] XxX, representa asparagina (N) ou serina (S)

[0085] X> representa arginina (R) ou lisina (K)

[0086] X; representa alanina (A), glutamina (Q), prolina (P) ou serina (S)

[0087] Xs representa arginina (R) ou lisina (K)

[0088] Xs representa ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E)

[0089] X; representa leucina (L) ou metionina (M)

[0090] X; representa isoleucina (|) ou valina (V)

[0091] X; representa ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E)

[0092] Xs representa histidina (H), fenilalanina (F) ou tirosina )

[0093] Xw representa ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E)

[0094] X, representa leucina (L)1 metionina (M) ou valina (V)

[0095] X,2 representa ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E)

[0096] X'13 representa alanina (A), asparagina (N) ou ácido aspártico (D)

[0097] Xu representa arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), glicina (G) ou serina (S)

[0098] X:5 representa alanina (A), asparagina (N), serina (S) ou treonina (T) Xi6 representa alanina (A), metionina (M) ou treonina (T)

[0099] X17 representa alanina (A) ou prolina (P)

[00100] Xi; representa serina (S) ou treonina (T)

[00101] X6, representa alanina (A), serina (S) ou treonina (T)

[00102] X» representa arginina (R) ou lisina (K)

[00103] X», representa serina (S) ou treonina (T)

[00104] X,» representa fenilalanina (F) ou tirosina (Y)

[00105] Xx; representa isoleucina (|) ou treonina (T)

[00106] X., representa alanina (A) ou serina (S)

[00107] Xx representa alanina (A) ou glicina (G)

[00108] Xxs representa ácido glutâmico (E) ou glutamina (Q)

[00109] X, representa alanina (A), glutamina (Q), serina (S) ou treonina (T) e

[00110] cada Zrepresenta qualquer aminoácido.

[00111] Em uma modalidade particular, a proteína relacionada à GDF-5 da invenção é derivada da GDF-5 do tipo selvagem. De acordo com este aspecto particular, a proteína relacionada à GDF-5 compreende uma sequência que se combina com uma das sequências genéricas de aminoácidos a seguir a)

[00112] ZCSRKALHVNZZZZZZZZZ|IAPLEYEAFHCEGLOZZZZ27277Z27Z7ZZ1Z

ZZZZZZDPESTPPTCCVPTRLSPIZILFIDSANNVVYZZZZZZVVESCGCR b)

[00113] ZCSRKALHVNFKDZZZDDZIIAPLEYEAFHCEGLCEZZZZZZ| EZTZHAZZ QTZZNZZDPESTPPTCCVPTRLSPIZILFIDSANNVVYZOZZZMVVESCGCR,

[00114] em que cada Z representa qualquer aminoácido.

[00115] Um exemplo para uma proteína que é descrita anteriormente é um variante da GDF-5 humana, em que o resíduo de triptofano na posição 414 é trocado por arginina (W414R). Em referência à sequência de GDF-5 madura (SEQ ID fNº4), isto corresponde a uma substituição na posição 33. Surpreendentemente, foi descoberto que este variante de proteína possui uma afinidade consideravelmente reduzida pelo BMPR-IA. Em contraste, a afinidade pelo BMPR-IB quase não é afetada. São também preferidos outros variantes de proteínas relacionadas à GDF-5 que compreendem substituições de aminoácidos diferentes de W414R.

[00116] Um exemplo para os ditos variantes de proteínas relacionadas à GDF-5 é um variante da GDF-5 humana, em que o resíduo de isoleucina na posição 449 é trocado por valina (I449V). Em referência à sequência de GDF-5 madura (SEQ ID fNº. 4), isto corresponde a uma substituição na posição 68. O dito variante de proteína possui afinidade reduzida pelo BMPP-IA e uma maior afinidade pelo BMPR-IB.

[00117] Um exemplo adicional de variante de proteínas relacionadas à GDF-5 compreende a substituição de aminoácido R399E. Em referência à sequência de GDF-5 madura (SEQ ID *Nº. 4), isto corresponde a uma substituição na posição 18. O dito variante de proteína possui uma afinidade reduzida pelo BMPR-IA.

[00118] Ainda um exemplo adicional de variante da GDF-5 humana é o variante, em que o resíduo de serina na posição 439 é trocado por ácido glutâmico (S439E). Em referência à sequência de GDF-5 madura (SEQ ID fNº. 4), isto corresponde a uma substituição na posição 58. O dito variante de proteína possui ainda uma afinidade reduzida pelo BMPR-IA.

[00119] Outro exemplo de variante da GDF-5 humana é o variante, em que o resíduo de arginina na posição 399 é trocado por metionina (R399M). Em referência à sequência de GDF-5 madura (SEQ ID tNº. 4), isto corresponde a uma substituição na posição 18. O dito variante de proteína possui uma afinidade consideravelmente maior pelo BMPR-IB.

[00120] Preferencialmente, as proteínas relacionadas à GDF-5 da presente invenção estão presentes na forma de proteínas "isoladas", Isto significa que a proteina da presente invenção está substancialmente separada das outras proteínas e moléculas peptídicas que estão presentes na fonte natural da proteína isolada (por exemplo, outros polipeptídeos da proteína da fonte natural). Por exemplo, um peptídeo expresso recombinante é considerado isolado. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína relacionada à GDF-5 é uma proteína recombinante. Ainda, um peptídeo é também considerado isolado, se este tiver sido alterado através de intervenção humana ou expresso por um organismo que não é sua fonte natural. Além disso, uma proteína "isolada" está livre de parte do outro material celular com o qual está naturalmente associada ou meio de cultura de células, quando produzida através de técnicas recombinantes ou precursores químicos ou outros reagentes químicos quando quimicamente sintetizada. São especificamente excluídas da definição de proteína "isolada", as misturas ou as composições não purificadas.

[00121] De acordo com outra modalidade, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica uma proteína da presente invenção. O ácido nucleico possui uma sequência tal que uma substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos relacionados a um sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA da respectiva proteína relacionada à GDF-5 do tipo selvagem é conseguida. Os tripletos de bases que codificam estes aminoácidos e a degeneração do código genético são geralmente conhecidos. O ácido nucleico pode ser uma sequência de DNA e/ou uma sequência de RNA contanto que a proteína de acordo com a invenção possa ser obtida partindo deste ácido nucleico após a expressão em um sistema adequado. O ácido nucleico da invenção pode ser completamente ou parcialmente sintético. Os ácidos nucleicos compreendem sequências de polinucleotídeos = de filamento simples e/ou de filamento completamente ou parcialmente duplo. O ácido nucleico pode ser produzido através da inclusão de preparações genômicas, preparações de cDNA, síntese in vitro, PCR, RT-PCR e/ou transcrição in vitro ou in vivo.

[00122] São particularmente preferidos os ácidos nucleicos "isolados", que estão substancialmente separados das moléculas de ácidos nucleicos que estão presentes na fonte natural do ácido nucleico (por exemplo, sequências que codificam outros polipeptídeos). Preferencialmente, um ácido nucleico "isolado" está livre de pelo menos parte das sequências que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é sequências localizadas nas extremidades a 5' e a 3' do ácido nucleico) em seu replicão que ocorre naturalmente. Por exemplo, um ácido nucleico clonado é considerado isolado. Um ácido nucleico é também considerado isolado, se este tiver sido alterado por intervenção humana ou colocado em um lócus ou uma localização que não é seu lado natural ou se este for introduzido dentro de uma célula. Além disso, um ácido nucleico isolado pode ser livre de parte de outro material celular com o qual este está naturalmente associado ou meio de cultura quando produzido através de técnicas recombinantes ou precursores químicos ou outros reagentes químicos quando sintetizado quimicamente.

[00123] De uma maneira preferida, os ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados através de síntese de um gene total ou através de mutagênese direcionada ao sítio do ácido nucleico que codifica proteínas relacionadas à GDF-5 do tipo selvagem ou modificadas. Os métodos incluem ligação direcionada ao molde, PCR recursiva, mutagênese de cassete, mutagênese direcionada ao sítio ou outras técnicas que são bem conhecidas na arte podem ser utilizadas.

[00124] Os ácidos nucleicos da presente invenção podem compreender ainda sequências de ácidos nucleicos adicionais que podem adicionar funções adicionais ao ácido nucleico isolado da invenção. Por exemplo, tais sequências de ácidos nucleicos adicionais podem compreender sequências de ácidos nucleicos que permitem a expressão apropriada de uma proteína da invenção e podem abranger sequências promotoras, sequências reguladoras, sinais de término, origens de replicação e similares. O perito está bem informado sobre tais sequências de ácidos nucleicos funcionais e sobre como dispô-las de forma a chegar em uma molécula de ácido nucleico com as propriedades desejadas.

[00125] Vetores de expressão são um assunto de objetivo adicional da presente invenção, em que o ácido nucleico é inserido dentro de um sistema de vetor adequado, o sistema de vetor sendo selecionado de acordo com a expressão desejada da proteína. O sistema de vetor pode ser um sistema de vetor eucariótico, mas preferencialmente é um sistema de vetor procariótico com o qual as proteínas podem ser produzidas de uma maneira particularmente fácil e pura. Um vetor de expressão adequado é, por exemplo, mostrado na WO 96/33215. O vetor de expressão também pode ser um vetor viral que pode ser utilizado, por exemplo, em abordagens de terapia gênica.

[00126] Células hospedeiras e organismos transgênicos são também um assunto de objetivo da presente invenção. As células hospedeiras e os organismos transgênicos são caracterizados pelo fato de que contêm um ácido nucleico ou um vetor de expressão de acordo com a invenção e que são capazes de utilizar a informação presente nos ácidos nucleicos e no vetor de expressão, respectivamente para a expressão das proteínas de acordo com a invenção. Assim, a presente invenção refere-se a organismos ou células transgênicas transformadas ou transfectadas de forma transitória ou estável com pelo menos um ácido nucleico ou pelo menos um vetor que codifica uma proteína da invenção ou a uma progênie de tais organismos ou células transgênicas. Além disso, a presente invenção refere-se a células, culturas de células, tecidos e/ou partes de organismos transgênicos da invenção. É entendido que para a finalidade da presente invenção o termo "organismo transgênico" não somente abrange o organismo no qual o ácido nucleico da invenção foi introduzido de forma transitória ou estável, mas também se refere à progênie de tais organismos independentemente da distância de geração, contanto que estes organismos ainda compreendam o ácido nucleico da invenção e expressem a proteína da invenção.

[00127] —Preferencialmente, o organismo ou a célula transgênica é de origem procariótica ou eucariótica. Preferencialmente, o organismo transgênico é um micro-organismo. Os micro-organismos preferidos são bactérias, leveduras, algas ou fungos. As células hospedeiras adequadas são preferencialmente células procarióticas, em particular cepas de E.coli. As células hospedeiras particularmente úteis são defendants de E.coli W3110 como é mostrado, por exemplo, na WO 96/33215. Em uma modalidade preferida, as células hospedeiras, preferencialmente de origem humana, também podem ser úteis para um transplante em pacientes que necessitam das mesmas.

[00128] A preparação de um organismo transformado ou de uma célula transformada requer a introdução do DNA apropriado dentro do organismo ou da célula hospedeira apropriada. Um grande número de métodos está disponível para este processo que é referido como transformação. Assim, com a finalidade de exemplo, o DNA pode ser introduzido diretamente por microinjeção ou por bombardeio com micropartículas ou nanopartículas revestidas com DNA. A célula também pode ser quimicamente tornada permeável, por exemplo, utilizando polietileno glicol, de forma que o DNA possa entrar na célula através de difusão. O DNA também pode ser transformado através de fusão de protoplastos com outras unidades contendo DNA tais como minicélulas, células, lisossomos ou lipossomos. Outro método adequado para a introdução do DNA é a eletroporação em que as células são reversivelmente tornadas permeáveis por um impulso elétrico.

[00129] Outro assunto de objetivo da presente invenção é um método para a produção de uma proteína que possui uma capacidade aprimorada de indução da formação de cartilagem e uma capacidade reduzida de indução da formação de osso, que compreende as etapas de:

[00130] escolha aleatória de pelo menos uma posição de aminoácido em uma região de uma proteína relacionada à GDF-5 que está relacionada a um sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA com a finalidade de obter variantes de proteína,

[00131] análise dos variantes de proteína obtidos em (i) em relação a sua afinidade ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA,

[00132] (iii) seleção de tais variantes de proteína que fornecem uma maior afinidade pelo BMPR-IB e/ou uma afinidade reduzida pelo BMPR-IA.

[00133] As regiõêes de uma proteína relacionada à GDF-5 envolvidas na ligação ao BMPR-IA ou ao BMPR-IB são conhecidas na arte. Na etapa (i) pelo menos uma posição de aminoácido em uma ou ambas destas regiões é escolhida aleatoriamente. É preferido escolher aleatoriamente pelo menos duas, trêê ou mais posições de aminoácidos. Os aminoácidos presentes na sequência de uma proteína relacionada à GDF-5 do tipo selvagem são substituídos por outros “aminoácidos através de modificações químicas ou preferencialmente através da tecnologia de engenharia genética. Os métodos para a produção dos variantes de proteína escolhidos aleatoriamente da etapa (i) abrangem a síntese de novo das proteínas e/ou a expressão das proteínas partindo de um ácido nucleico que codifica as mesmas. De uma maneira preferida particular, os variantes de proteína da etapa (i) são preparados através da expressão utilizando os respectivos ácidos nucleicos.

[00134] Preferencialmente, os variantes de proteína são obtidos para todos os outros aminoácidos possíveis na posição relevante. Entretanto, é também possível realizar apenas uma substituição específica de um ou mais aminoácidos contra outros aminoácidos. Por exemplo, aminoácidos hidrofílicos podem ser substituídos por aminoácidos hidrofóbicos. Alternativamente, aminoácidos hidrofóbicos podem ser substituídos por aminoácidos hidrofílicos. Uma substituição conservativa, em que a natureza hidrofílica ou hidrofóbica é mantida, também é possível. Através da substituição, preferencialmente uma troca por um aminoácido que possui outra demanda espacial é realizada.

[00135] O grande número de variantes de proteína obtido na etapa (i) é então analisado em relação a sua afinidade ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA. Isto pode ser realizado de uma maneira que é conhecida e usual no campo técnico. Os métodos para a avaliação das interações proteína-receptor são prática comum.

[00136] Na etapa (ili), aqueles variantes de proteína que fornecem uma maior afinidade por BMPR-IB e/ou uma afinidade reduzida por BMPR-IA são selecionados. Foi descoberto de forma surpreendente que estas proteínas particulares possuem uma capacidade aprimorada de indução da formação de cartilagem e uma capacidade reduzida de indução da formação de osso.

[00137] Outro assunto de objetivo da presente invenção está relacionado a anticorpos contra as proteínas relacionadas à GDF-5 da invenção. Estes anticorpos são específicos para as proteínas relacionadas à GDF-5 recombinantes reivindicadas. Preferencialmente, estes são específicos para as regiões de proteínas relacionadas à GDF-5 que contêm uma ou mais das substituições de aminoácidos descritas aqui. Preferencialmente, os anticorpos são específicos para uma região de uma proteína recombinante derivada de uma proteína relacionada à GDF-5 que está relacionada a um sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA. Estes anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser gerados através da utilização de tais fragmentos das proteínas da invenção que são descritos anteriormente como agentes imunogênicos para gerar anticorpos através de métodos conhecidos. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser de quaisquer isotipos. Também são compreendidos fragmentos de anticorpo tais como fragmentos Fab ou fragmentos Fab7.. Os anticorpos também podem ser anticorpos humanizados ou anticorpos genéricos etc.

[00138] Os anticorpos da presente invenção são, inter alia,

adequados como uma ferramenta analítica. Estes podem ser utilizados para a investigação da absorção e da distribuição de uma proteína de acordo com a invenção no corpo. Além disso, os anticorpos anteriores são adequados para estudar a cinética de liberação.

[00139] Um assunto de objetivo adicional do presente pedido de patente é uma composição farmacêutica que compreende a proteína relacionada à GDF-5 recombinante ou um ácido nucleico ou um vetor ou uma célula hospedeira de acordo com a invenção. Em princípio, quaisquer composições farmacêuticas que já tenham sido publicadas no contexto com as proteínas relacionadas à GDF-5 são adequadas. Um vetor de expressão ou uma célula hospedeira pode ser considerada como sendo vantajosas como substâncias ativas em uma composição farmacêutica. Ainda, combinações de uma proteína de acordo com a invenção com outras proteínas podem ser utilizadas em composições farmacêuticas preferidas. Evidentemente, a invenção compreende “ainda composições farmacêuticas que contêm substâncias adicionais como, por exemplo, aditivos ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis. A formulação pode incluir antioxidantes, preservantes, agentes de coloração, aromatizantes e emulsificantes, agentes de suspensão, solventes, recheios, agentes de volume, tampões, veículos de fornecimento, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Por exemplo, um carreador ou um veículo adequado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou uma solução salina misturada com uma proteína carreadora adequada tal como albumina do soro. Um antioxidante preferido para a preparação da composição da presente invenção é o ácido ascórbico.

[00140] O solvente ou o diluente da composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso e pode conter outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis que são capazes de modificar e/ou de manter um pH, osmolaridade, viscosidade, limpidez, escala,

esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou odor da formulação. Similarmente outros componentes podem ser incluídos na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção com a finalidade de modificar e/ou de manter a taxa de liberação da substância farmaceuticamente eficiente. Tais componentes de modificação são substâncias geralmente empregadas na arte com a finalidade de formular dosagens para administração parenteral na forma de dose unitária ou multi-doses.

[00141] A composição farmacêutica finalmente formulada preparada de acordo com a presente invenção pode ser armazenada em frascos esterilizados na forma de uma solução, uma suspensão, um gel, uma emulsão, um sólido ou um pó desidratado ou liofilizado. Estas formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta para uso ou em uma forma, por exemplo, no caso de um pó liofilizado, que requer reconstituição antes da administração. As formulações farmacêuticas adequadas anteriores e adicionais são conhecidas na arte e são descritas, por exemplo, em Gus Remington's Pharmaceutical Sciences (18º Ed., Mack Publishing Co., Eastern, Pa., 1990, 1435-1712). Tais formulações podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de eliminação in vivo do componente farmaceuticamente eficiente.

[00142] Outras formas de administração eficientes compreendem formulações de liberação lenta parenterais, isto é, retardada, vapores para inalação ou formulações oralmente ativas. Por exemplo, uma formulação de liberação lenta pode compreender proteínas ligadas a ou incorporadas dentro de preparações particuladas de compostos poliméricos (tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico etc.) ou lipossomos.

[00143] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção também pode ser formulada para administração parenteral,

por exemplo, por infusão ou injeção e também pode incluir formulações de liberação lenta ou de circulação sustentada. Tais composições terapêuticas administradas de forma parenteral estão tipicamente na forma de soluções aquosas parenteralmente aceitáveis isentas de agentes pirogênicos que compreendem o(s) componente(s) farmaceuticamente eficiente(s) em um carreador e/ou um diluente farmaceuticamente aceitável.

[00144] A composição farmacêutica pode compreender um material de matriz, por exemplo, em casos em que a regeneração da cartilagem é pretendida. É vantajoso para a proteína, o ácido nucleico, o vetor de expressão ou a célula hospedeira quando é aplicada dentro e/ou sobre um material de matriz biocompatível. O material de matriz como é utilizado aqui significa um carreador ou uma matriz que atua como um suporte para o recrutamento, para a ligação, para a proliferação e para a diferenciação das células e/ou como um dispositivo de fornecimento e armazenamento potencial para as proteínas relacionadas à GDF-5 recombinantes da invenção. Em contraste às matrizes sólidas, os carreadores consistem de materiais amorfos que não possuem superfícies definidas e que não possuem um formato específico, isto é, alquil celulose, plurônicos, gelatinas, polietileno glicóis, dextrinas, óleos vegetais, açúcares e outras substâncias líquidas e viscosas.

[00145] Os exemplos de materiais de matriz são, por exemplo, descritos na WO 98/21972. Estes materiais de matriz são igualmente adequados para as proteínas de acordo com a invenção. O material de matriz pode ser transplantado dentro do paciente, por exemplo, cirurgicamente, em que a proteína ou o DNA que codifica a proteína pode ser lentamente liberado partindo do material de matriz e então ser eficiente durante um período de tempo longo. Todos os tipos de materiais de matriz são úteis de acordo com a presente invenção contanto que estes sejam compatíveis e selecionados para a área pretendida ou indicação de uso. O material de matriz pode ser um material natural, um material natural modificado bem como um material sintético. Todas as matrizes já conhecidas para proteínas morfogenéticas são abrangidas. A matriz extracelular compreende, por exemplo, vários colágenos como, por exemplo, dos tipos |, Il, V, IX, X, XI e XIll, proteoglicanas e glicosamina glicanas adicionais como, por exemplo, sulfatos de condroitina, biglicanas, decorinas e/ou ácido hialurônico ou proteínas não colagenosas como, por exemplo, osteopontina, laminina, fibronectina, vitronectina e proteína de matriz de cartilagem. Todos os materiais naturais mencionados também podem ser utilizados em formas modificadas artificialmente. Para uma lista não limitante de carreadores e matrizes úteis (ver também Kirker- Head, 2000, Advanced Drug Delivery 43, 65-92).

[00146] Um assunto de objetivo adicional da presente invenção está relacionado às formulações lipossomais que compreendem a proteína relacionada à GDF-5 recombinante de acordo com a invenção. Os lipossomos utilizados nas ditas formulações são comumente conhecidos pelo perito na arte. Em particular, formulações lipossomais preferidas são divulgadas na WO 2008/049588. Formulações lipossomais mais preferidas são descritas nas páginas 9 até 13 da WO 2008/049588.

[00147] Além disso, as proteínas relacionadas à GDF-5 da invenção podem ser administradas em combinação com outras substâncias farmaceuticamente ativas. As ditas substâncias farmaceuticamente ativas podem ser, por exemplo, analgésicos tais como analgésicos eficientes localmente ou outras substâncias que possuem um efeito positivo sobre doenças, em que a formação de cartilagem é desejada, como inibidores de proteases. Estes são apenas exemplos de aditivos possíveis e um perito na arte pode facilmente adicionar outros excipientes que estão em uso nas preparações farmacêuticas ou que são geralmente considerados como seguros.

[00148] Devido a sua capacidade aprimorada de indução da formação de cartilagem, as proteínas relacionadas à GDF-5 recombinantes da presente invenção são particularmente adequadas para uso no tratamento de doenças, em que a formação de cartilagem é desejada, mas a formação de osso é indesejável. Assim outro aspecto da presente invenção é o uso das presentes proteínas, ácidos nucleicos, vetores ou células hospedeiras no tratamento destas doenças. Em particular, as presentes proteínas, ácidos nucleicos, vetores ou células hospedeiras são para uso no tratamento de defeitos da cartilagem ou para o tratamento de ruptura traumática ou descolamento de cartilagem,

[00149] em particular defeitos da cartilagem relacionados à idade, por exemplo, devido ao desgaste, à osteoartrite, à artrite reumatoide, a ferimentos relacionados a esportes,

[00150] doenças que podem afetar a cartilagem como condrodistrofias, doenças caracterizadas pela perturbação do crescimento e da ossificação subsequente da cartilagem, acondroplasia, costocondrite, formação de hérnia do disco espinhal e reparo do disco espinhal, policondrite reincidente,

[00151] reparo de defeitos da cartilagem associados com tumores, benignos ou malignos, como condroma ou condrossarcoma.

[00152] Outra modalidade da presente invenção é um método para o tratamento de doenças, em que a formação de cartilagem é desejada, mas a formação de osso é indesejável que compreende a etapa de administração de uma proteína, um ácido nucleico, um vetor ou uma célula hospedeira de acordo com a invenção a um paciente que necessita de tal tratamento.

[00153] Como é utilizado aqui, o termo "tratamento" refere-se à reversão, ao alívio ou à inibição do progresso de uma doença, um distúrbio ou um estado de saúde ou um ou mais sintomas de tal doença, distúrbio ou estado de saúde ao qual tal termo se aplica. Como é utilizado aqui, tratamento também pode se referir ao decréscimo da probabilidade ou da incidência da ocorrência de uma doença, um distúrbio ou um estado de saúde em um mamífero quando comparado a uma população de controle não tratada ou quando comparado ao mesmo mamífero antes do tratamento. Por exemplo, como é utilizado aqui, tratamento pode se referir à prevenção de uma doença, um distúrbio ou um estado de saúde e pode incluir o retardo ou a prevenção do início de uma doença, um distúrbio ou um estado de saúde ou o retardo ou a prevenção dos sintomas associados a uma doença, um distúrbio ou um estado de saúde. Como é utilizado aqui, tratamento também pode se referir à redução da gravidade de uma doença, um distúrbio ou um estado de saúde ou sintomas associados a tal doença, distúrbio ou estado de saúde antes da aflição de um mamífero com a doença, o distúrbio ou o estado de saúde. Tal prevenção ou redução da gravidade de uma doença, um distúrbio ou um estado de saúde antes da aflição refere- se à administração da composição da presente invenção que é descrita aqui a um indivíduo que não está no momento da administração afligido com a doença, o distúrbio ou o estado de saúde. Como é utilizado aqui, tratamento também pode se referir à prevenção da recorrência de uma doença, um distúrbio ou um estado de saúde ou de um ou mais sintomas associados a tal doença, distúrbio ou estado de saúde.

[00154] É pretendido que os Exemplos a seguir junto com as Figuras e os protocolos de sequências ilustrem adicionalmente a invenção.

[00155] ASEQID Nº. 1 mostra a sequência de DNA e a SEQ ID

ANº. 2 mostra a sequência de proteína do precursor da GDF-5 humana.

[00156] ASEQID Nº. 3 mostra a sequência de DNA e a SEQ ID HNº. 4 mostra a sequência de proteína da GDF-5 monomérica madura humana. Figuras

[00157] A Figura 1 mostra características adicionais da proteína precursora de GDF-5 humana de acordo com a SEQ ID ftNº .2:

[00158] aa001-381 pré-pró-domínio (letras em negrito)

[00159] —aa001-027 peptídeo sinal (em negrito e sublinhados)

[00160] aa382-501 parte da proteína madura

[00161] aa400-501 domínio nó de cistina (sublinhados)

[00162] A Figura 2 mostra uma comparação dos domínios nó de cistina de 102 aa da GDF-5 humana (SEQ ID &Nº.2), da GDF-6 humana (sequência 26 da Pat. dos U.S. &Nº. 5.658.882) e da GDF-7 humana (sequência 2 da Pat. dos %U.S. Nº. 5.658.882). Os resíduos de aminoácidos que são idênticos em todas as três moléculas são destacados por margens.

[00163] A Figura3 mostra os resultados de um ensaio de fosfatase alcalina (ALP) com o mutante de GDF-5 humana recombinante WA414R (que é descrito no exemplo 2).

[00164] A Figura 4 mostra os resultados de um ensaio de fosfatase alcalina (ALP) com o mutante de GDF-5 humana recombinante 1449V (que é descrito no exemplo 3).

[00165] A Figura 5 mostra os resultados de um ensaio de fosfatase alcalina (ALP) com o mutante de GDF-5 humana recombinante R399E (que é descrito no exemplo 3).

[00166] A Figura6 mostra os resultados de um ensaio de fosfatase alcalina (ALP) com o mutante de GDF-5 humana recombinante S439E (que é descrito no exemplo 3).

[00167] A Figura7 mostra os resultados de um ensaio de fosfatase alcalina (ALP) com o mutante de GDF-5 humana recombinante R399M (que é descrito no exemplo 3).

[00168] A Figura8 mostra os resultados de um ensaio de fosfatase alcalina (ALP) com o mutante de GDF-5 humana recombinante WA414R (que é descrito no exemplo 3). Exemplo 1: Criação, expressão e purificação de proteínas relacionadas à GDF

[00169] Os DNAs que codificam as partes maduras das proteínas GDF-5 humana, GDF-6 humana e GDF-7 humana foram isolados partindo de células osteoprogenitoras ROB-C26 humanas (Yamaguchi e outros 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225) através da técnica de RT-PCR e foram subsequentemente ligados dentro de vetores plasmideais procarióticos. Com a finalidade de identificar resíduos de aminoácidos funcionalmente importantes nas partes maduras de GDF- 5, -6 e -7, várias mutações isoladas foram introduzidas dentro destas sequências através de mutagênese direcionada ao sítio. Todas as mutações individuais foram criadas através da utilização do kit de mutagênese direcionada ao sítio kit QuickChangeTM com a PfuTurboTm DNA polimerase e a DPN | endonuclease da Stratagene de acordo com o manual de instrução do fabricante.

[00170] Utilizando a cepa bacteriana W3110BP transformada com os plasmídeos e induzida com IPTG, as proteínas foram expressas em corpos de inclusão. Estes corpos de inclusão foram isolados utilizando um tampão de homogeneização (25 mM de Tris HCl pH 7.3, 10 mM de EDTA NaOH pH 8, 8 M de Ureia) e tampão de lavagem (1 M de Ureia, mM de Tris HCI, pH 8,3, 10 MM de EDTA NaOH pH 8,0) de acordo com procedimentos padronizados. Uma purificação adicional foi realizada sobre uma coluna de fase inversa Aquapore Octyl (Applied Biosys, (CV = 7,8 mL) 100x10, 20u, &Nº. 186470) com um gradiente de 100% de Eluente A (0,1% de TFA, HO para HPLC) até 100% de Eluente B (0,1% de TFA, 90% de CH;3N, HO para HPLC) em 104 minutos (vazão: 3 mL/min). Após um controle de western, as frações contendo a proteína mutante foram agrupadas e liofilizadas.

[00171] As proteínas mutantes foram dissolvidas em tampão de dissolução (6 M de Guanidina HCl, 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 3 mM de DTT, pH = 8,0), a concentração de proteína foi ajustada exatamente para 2,6 mg/mL e o pH foi ajustado entre 8 e 9. Após uma incubação de 2 h à temperatura ambiente, o tampão de redobramento (1 M de NaCl, 50 mM de Tris, 5 MM de EDTA, 1 mM de GSSG, 2 mM de GSH, 33 mM de Chaps, pH = 9,5) foi adicionado sob agitação suave para atingir uma concentração final de 0,16 mg/mL.

[00172] A solução foi então incubada durante 48 ha 22T e o redobramento foi interrompido alterando o pH para 3-4 através da adição de HCl a 18%. Após a centrifugação, o monômero não redobrado foi separado da forma dimérica através da realização de uma segunda RP-HPLC sob as mesmas condições. As frações contendo a proteína dimerizada foram agrupadas, liofiizadas e armazenadas a -70T. Exemplo 2: Medida da atividade biológica de variantes de proteínas relacionadas à GDF diferentes in vitro através de ensaio de ALP

[00173] 2,0x10º células de C2C12-lb (uma linhagem de células que superexpressa estavelmente o receptor BMPR-IB) e células de C2C12 foram incubadas durante 3-4 dias em 20 mL de meio de cultura de células (alpha-MEM, Penicilina/Estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 10% de FCS) a 37 T, 5% de CO >, saturado com H,O. As células foram subsequentemente lavadas com PBS (solução salina tamponada com fosfato), tratadas com tripsina e ressuspensas em meio de cultura até uma densidade de 3x10º células/mL. 150 uL foram transferidos para cada poço de uma placa de cultura de 96 poços e incubados durante

24 h a 37, 5% de CO >, saturados com H,O. Após a lavagem com meio os poços foram preenchidos com 120 ul de meio de cultura novo. 40 ul de diluições diferentes de proteína mutante ou do tipo selvagem (dissolvida em 10 mM de HCI e diluída pelo menos 250 vezes em meio) foram adicionados, seguidos por outra etapa de incubação durante 72 h a 37 T, 5% de CO >, saturados com H7O. Após a lavagem com PBS, 150 uL de solução de lise (0,2% de Nonidet P40, 0,2 g de MgCl; x 6H,O, ajustada para 1000 mL com água) foram adicionados, seguidos por uma incubação de 15-18 h a 37 CT, 5% de CO2, saturados com H,O. 50 |l de cada poço foram subsequentemente transferidos para uma nova placa de 96 poços. 50 ul de solução de substrato (tampão de substrato de dietanolamina concentrado 2,5x + 148g/L de PNPP (p-nitrofenil-fosfato de sódio)) foram então adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante 4 min a 37 T, 5% de CO >, saturados com H,O. A reação de ALP foi interrompida depois disso com 100 ul de 30g/L de NaOH e finalmente a densidade óptica foi medida com uma leitora de microplacas automática em 405 nm sob consideração da subtração do valor do branco.

[00174] Como um exemplo, os resultados (valores médios de 2 experimentos independentes) em relação ao mutante de hGDF-5 WA414R para células C2C12-lb são mostrados na Figura 3. Cinco concentrações de proteína diferentes (14 ng/mL, 44,5 ng/mL, 133,2 ng/mL, 400 ng/ml e 1200 ng/mL) foram utilizadas neste ensaio. À proteína mutante W414R exibe atividade biológica nas células em que o receptor BMPR-IB (células C2C12-lb) é superexpresso, indicando que o sítio de ligação ao BMPR-IB de W414R é ativo funcional. À proteína do tipo selvagem (rhGDF-5) serviu como um controle no sistema de ensaio.

[00175] Resultados adicionais da atividade biológica de mutantes de hGDF-5 adicionais para as linhagens de células C2C12 e C2C12-Ib são mostrados na tabela 1.

Exemplo 3: Medida da atividade biológica de variantes de proteínas relacionadas à GDF diferentes in vitro através de ensaio de ALP

[00176] 5x10º células de células ATDC-5 e 5x10º células para MCHT1/26 foram incubadas durante 3-4 dias em 20 mL de meio de cultura de células (alpbha-MEM, 2 mM de L-glutamina, 10% de FCS, para MCHT1/26; DMEM/F12 (1:1), 5% de FCS) a 37ºC, 5% de CO;,, saturado com H,O. As células foram subsequentemente lavadas com PBS (solução salina tamponada com fosfato), tratadas com tripsina e ressuspensas em meio de cultura até uma densidade de 3x10º células/mL. 150 uL foram transferidos para cada poço de uma placa de cultura de 96 poços e incubados durante 24 h a 37ºC, 5% de CO,, saturados com H,O. Após a lavagem com meio os poços foram preenchidos com 120 uL de meio de cultura novo para MCHT1/26 e 120 ul de meio de ensaio para ATDC-5 (DMEM/F12 (1:1), 0,5% de FCS) mais 40 uL de diluições diferentes de proteína mutante ou do tipo selvagem (dissolvida em 10 mM de HCl e diluída pelo menos 250 vezes em meio) foram adicionados, seguidos por outra etapa de incubação durante 72 h a 37 T, 5% de CO >, saturados com H,O. Após a lavagem com PBS, 150 uL de solução de lise (solução de lise para MCHT1/26: 0,2% de Nonidet P40, 1 mM de MgCl>; solução de lise para ATDC-5: 100 mM de Na-Glicina, 1% de Nonidet P40, 1 mM de MgCl2) foram adicionados, seguidos por uma incubação de 1 h para ATDC-5 e 15 — 18 h para MCHT1/26 a 37C, 5% de CO >, saturados com H,O. 50 ul de cada poço foram subsequentemente transferidos para uma nova placa de 96 poços. 50 ul de solução de substrato (tampão de substrato de dietanolamina concentrado 2,5x + 148g/L de PNPP (p-nitrofenil-fosfato de sódio)) foram então adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante mais 60 min a 37“C, 5% de

CO,, saturados com H,O. A reação de ALP foi interrompida depois disso com 100 ul de 30g/L de NaOH e finalmente a densidade óptica foi medida com uma leitora de microplacas automática em 405 nm sob consideração da subtração do valor do branco.

[00177] Os exemplos de resultados (valores médios de 2 experimentos independentes) em relação aos mutantes de hGDF-5 I1449V, R399E, S439E, R399M, W414R são mostrados nas Figuras 4- 8, respectivamente. Cinco concentrações de proteína diferentes (14,8 ng/mL, 44,5 ng/ml, 133,2 ng/mL, 400 ng/mL, 1200 ng/mL) foram utilizadas neste ensaio. Comparadas com a GDF-5 do tipo selvagem as proteínas mutantes exibem uma atividade biológica mais alta sobre as células ATDC-5 comparadas com as células MCHT1/26 neste sistema de ensaio. Exemplo 4: Medida de afinidade com Biacore de proteínas relacionadas à GDF-5

[00178] Um sistema BiacoreT100 (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, GB) foi utilizado para todos os experimentos de biossensor. Aproximadamente 200 unidades de ressonância (UR) dos ectodomínios do receptor de proteína de fusão com Fc de BMPR-IB, BMPR-IA ou BMPR-II foram imobilizadas nos chips biossensores CM5 com proteína G. Os sensorgramas de interação foram registrados a uma vazão de 60 ulL/min a 30º em 10 mM de HEPES (pH 7,4), 300 mM de NaCl, 34 mM de EDTA, 0,005% de Tween 20. Os experimentos foram realizados em duplicata utilizando concentrações de ligante de 0,05 até 100 nM. Todas as afinidades de ligação aparentes foram obtidas utilizando BlAevaluation v. 2.2.4 (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, GB). As afinidades para a interação do receptor do tipo | ligante foram derivadas através do ajuste dos dados de cinética a um modelo de ligação de Langmuir de 1:1 (KD (kin)). Devido à cinética de ligação muito rápida (excedendo 106 M-1 s-1

(para kon) e 10-2 s-1 (para koff)) as afinidades de ligação aparentes para a interação ligante:BMPR-IIl foram determinadas partindo da dependência da dose de ligação em equilíbrio (KD (egq)).

[00179] Os resultados das medidas de afinidade com Biacore para variantes da GDF-5 humana diferentes são mostrados na tabela 1.

vil o o E = - nm /&8 sc = o So E Cc 28 ps - Bo 1238 > = 88 [ES5SL = oo lo = [ato [52 lo | 7 2 o 20 — = leo 15 | [8 [5 | [É 5 |oí < ES diz = sos = É o E je so 3 & = E õ m o o õ o " Hs E 8 oo s = a à E Sã E $$ à o 8 : S É < = 2 . ls E 3 288 - to |& |& [&E SE SE 5] o % 6 oq ': a 9/88 5 Fe Bkae E o gg: z NE e [O 6 [6 MN NO INTO o ke os Ss ss o E "o o o << x BS ce S o GS 285 zZ 2 SE É o Ss 2 3 E o 2 — 76 o o 8 É 2 o "o q = =|= Es 2 o n= |é E/E BIÉ o = 8 z” a alo falo o o & 7 = ui o on o a t LS: ele eek ko u s <C y RN =| |£ o ã É = a o E/S Es E EEE O o 2 2 = 2º 9 NS S/S 8 SO 6 lo o O = 8 Z to oi [= 8 [88 518 2 2) 9 = o É & 8 E n < + SS ese EEREIS O o C Ts clE e E = Ss 9 Z SE o o o v + wo [Elm |E E o ce o vv o = 2 O Bi 2 SN e silos e 2 a n - o TIRSS So E E o o 5 = a hai + 3 + + + + Fi Erlo QN o s ++ + E + EF ge | tt FI FFIRIFIEO E õ O +? S fo E =P DB S E Ce E cs o + Sw W o Ss o o O = &% 328 < o < No es | Fita le la l+/4/82 & BSS o | + 3 |* +|*|t/*jS Ss o “S<t3Oo 2º m enção o Ez ExõoE ao o s.E = Ss o on 2.2 = + + + Fho) TVULHÇGEE = + + = + X >= = O = x + + (=) Silo o o o Oo o Mm SME! + = Rg oO ÇoZ+to = TT 2EUTÇ+o 3 o 3Zo0ci o E nO o E +'E v E o o le cor & S&S) Euw>EeLEkew XK 3 É oTOoQ! à os) E&EEESsSBSBE, E E vo Ao8Z| elo EETES T = = 2 o 88| Fix EI =EBXSOE.A STE To+rc

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína relacionada à GDF-5, que possui uma capacidade aprimorada de indução da formação de cartilagem e uma capacidade reduzida de indução da formação de osso, em que a proteína possui uma maior afinidade pelo receptor BMP IB (BMPR-IB) e/ou uma afinidade reduzida pelo receptor BMP IA (BMPR-IA).

2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína é obtida através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido que está relacionado a um sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA na sequência de aminoácidos de uma proteína relacionada à GDF-5, preferencialmente através da tecnologia de engenharia genética.

3. Proteína de acordo com a reivindicação 2, em que a proteína é derivada de uma proteína relacionada à GDF-5 humana do tipo selvagem, em particular da GDF-5, GDF-6 ou GDF-7 humana.

4. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a3, em que pelo menos um aminoácido hidrofóbico no sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA de uma proteína relacionada à GDF-5 é substituído por um aminoácido hidrofílico ou polar.

5. Proteína de acordo com a reivindicação 4, em que o resíduo de aminoácido hidrofílico ou o resíduo de aminoácido polar é selecionado do grupo que consiste de ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, histidina, serina e treonina.

6. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, em que pelo menos um aminoácido hidrofílico ou polar no sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA de proteína relacionada à GDF-5 é substituído por um aminoácido hidrofóbico.

7. Proteína de acordo com a reivindicação 6, em que o resíduo de aminoácido hidrofóbico é selecionado do grupo que consiste de alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina,

prolina, triptofano, tirosina, valina.

8. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que compreende uma substituição conservativa de pelo menos um aminoácido no sítio de ligação ao BMPR-IB e/ou ao BMPR-IA de uma proteína relacionada à GDF-5, em particular em que um aminoácido hidrofóbico é substituído por um aminoácido hidrofóbico menor ou maior ou em que um aminoácido hidrofílico ou polar é substituído por um aminoácido hidrofílico ou polar menor ou maior.

9. Ácido nucleico que codifica uma proteína como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou o ácido nucleico como definido na reivindicação 9, para uso no tratamento de doenças, em que a formação de cartilagem é desejada, mas a formação de osso é indesejável.

11. Proteína ou ácido nucleico para o uso como definido na reivindicação 10, para uso no tratamento de defeitos da cartilagem ou para o tratamento de ruptura traumática ou descolamento de cartilagem, em defeitos da cartilagem relacionados à idade particulares, por exemplo, devidos ao desgaste, à osteoartrite, à artrite reumatoide, aos ferimentos relacionados a esportes, doenças que podem afetar a cartilagem como condrodistrofias, doenças caracterizadas pela perturbação do crescimento e da ossifcação subsequente da cartilagem, acondroplasia, costocondrite, formação de hérnia do disco espinhal e reparo do disco espinhal, policondrite reincidente, reparo de defeitos da cartilagem associados com tumores, benignos ou malignos, como condroma ou condrossarcoma.

12. Composição farmacêutica que compreende uma proteína como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, um ácido nucleico como definido na reivindicação 9, um vetor que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 9 ou uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 9 como o agente ativo, opcionalmente em combinação com aditivos ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

13. Processo para a produção de uma proteína relacionada à GDF-5 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, que compreende as etapas de: (1) escolha aleatória de pelo menos uma posição de aminoácido em uma região de uma proteína relacionada à GDF-5 em relação a um sítio de ligação ao receptor BMP |B e/ou ao receptor BMP IA, com a finalidade de obter variantes de proteína, (ii) análise dos variantes de proteína obtidos em (i) em relação a sua afinidade ao receptor BMP IB e/ou ao receptor BMP IA, (ii), seleção daqueles variantes de proteína que fornecem uma maior afinidade pelo receptor BMP IB (BMPR-IB) e/ou uma afinidade reduzida pelo receptor BMP IA (BMPR-IA).

14. Anticorpo contra uma proteína como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.