KR101639269B1 - 알칼라인 포스파타아제 어세이를 개선하기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ALP 어세이를 개선하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 ATDC5 세포의 동결 조건을 특정화시킴으로써, ATDC5 세포를 동결하여 보관하는 기간에 상관없이 해동한 후에는 장기간의 배양 과정을 필요로 하지 않고 즉시 ALP 어세이에 사용할 수 있는 방법을 제공한다. 이에 따라, ALP 어세이를 수행함으로써 BMP 단백질의 조골세포 분화 활성을 보다 신속하고 용이하게 측정하는 것이 본 발명에 의해 가능하다.

Description

알칼라인 포스파타아제 어세이를 개선하기 위한 방법{METHOD FOR IMPROVING ALKALINE PHOSPHATASE ASSAY}
본 발명은 ALP 어세이(Alkaline phosphatase assay: 알칼라인 포스파타아제 어세이)를 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 ATDC5 세포의 동결 조건을 특정화시킴으로써, ATDC5 세포를 동결하여 보관하는 기간에 상관없이 해동한 후에는 장기간의 배양 과정을 필요로 하지 않고 즉시 ALP 어세이에 사용할 수 있는 방법을 제공한다. 이에 따라, ALP 어세이를 수행함으로써 BMP 단백질의 조골세포 분화 활성을 보다 신속하고 용이하게 측정하는 것이 본 발명에 의해 가능하다.
BMP(Bone Morphogenetic Protein, 골형성 단백질)는 골형성 세포와 같은 유형의 세포의 성장 및 분화를 조절한다고 보고되어 있으며, 여기에는 BMP2, BMP3, BMP3b, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9, BMP10, BMP11, BMP12, BMP13, BMP14, BMP15 등이 포함된다. 특히, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7 및 BMP8은 시험관내 및 생체내 이소성 부위에서 골 형성을 단독으로 유도할 수 있는 성장 및 분화 인자이다.
이와 같이 BMP 단백질은 골 질환 등의 치료를 위해 다방면에서 사용되고 있다. 이를 위해, 당업계에서는 시판되는 BMP 단백질을 구입하여 이를 연골제제와 같은 2차 제품에 사용하는 것에 그치지 않고, 자체적으로 형질전환 기법 등을 이용하여 생물학적 활성(예컨대, 배아세포 또는 줄기세포를 조골세포로 분화시키는 활성)이 더 우수한 BMP 재조합 단백질을 생산해내고 있다.
이때, 새롭게 생산한 BMP 재조합 단백질이 생물학적 활성을 정상적으로 나타내는지 확인하는 것이 필요하다. 만일 자체적으로 생산한 BMP 재조합 단백질이 정상적인 생물학적 활성을 나타내지 못한다면, 이와 같은 BMP 재조합 단백질은 적합하게 사용할 수 없게 된다.
따라서, BMP 단백질의 생물학적 활성을 미리 시험관내(in vitro)에서 확인하는 것이 필요하며, 이때 널리 이용되는 검정법 중의 하나가 ALP 어세이(Alkaline phosphatase assay: 알칼라인 포스파타아제 어세이)다.
상기 ALP 어세이의 원리는, BMP 단백질을 배아 세포 또는 줄기 세포에 처리할 경우 조골세포 분화의 지표인 ALP(Alkaline phosphatase: 염기성인산분해효소)의 활성이 증가한다는 것이다. ALP는 기질과 반응하여 색깔을 나타내고 단위 unit/ml를 이용하여 정량적으로 나타낼 수 있는데, 이러한 ALP 값에 의해 BMP 재조합 단백질의 생물학적 활성 유무 및 정도를 간접적으로 확인할 수 있게 되는 것이다.
상기 ALP 어세이에서 BMP 단백질의 활성을 측정하기 위해 BMP 단백질로 처리되는 세포의 종류에는 주로 ATDC5 세포, MCHT 1/26 세포 등이 사용된다.
상기 ALP 어세이를 수행할 때 ATDC5 세포를 여러 세대 계대배양하면서 필요할 때마다 사용하는 방법이 있다. 그러나, 이 경우에는 계대배양하는 중에 ATDC5 세포가 마이코플라스마, 바이러스 등에 노출되어 감염될 가능성이 높다는 문제점이 있으며, 특히 계대배양된 ATDC5 세포들은 세대를 거듭할수록 서로간에 그 성장 속도, 성질 등이 점차 달라져 ALP 어세이의 실험결과의 균일성을 저해하는 변수가 된다.
이러한 이유들로 인해, 상기 ALP 어세이를 수행할 때 ATDC5 세포를 계대배양하면서 사용하는 방법보다는 일정량의 세포를 대량 생산한 후 동결보존하고 필요할 때마다 해동하여 사용하는 방법이 더 선호된다.
ATDC5 세포와 같은 부착 세포를 동결할 때에는, 세포를 배양하는데 사용하던 배지에 7.5%~10% DMSO(dimethyl sulfoxide: 디메틸 설폭시드)를 첨가하여 동결 스톡 용액(freezing stock solution)을 제조하고, 이 동결 스톡 용액과 함께 세포를 보관용 튜브 또는 바이알에 첨가한 후, -70℃의 Deepfreezer와 액체 질소통에서 보관하는 것이 통상적이다.
그러나, 상기와 같은 동결 스톡 용액은 기본적으로 세포의 장기간 보관을 목적으로 하는 것이기 때문에, ATDC5 세포를 해동시킨 후 ALP 어세이를 수행하는 것이 종국적인 목적인 경우에는 여러 문제점이 야기된다.
예를 들어, 세포를 동결하고 해동하는 과정에서 종종 손상되는 세포가 많기 때문에 이 세포들을 해동한 후에는 회복시키는 안정화 과정을 거쳐야 하는데, 세포가 정상적인 지수증식기(log phase)에 도달하기까지 짧게는 3~4일이 소요되고 길게는 한 달 이상이 소요된다. 이와 같이 해동한 후에 세포를 안정화시키는 기간이 오래 걸리는 경우, 세포를 동결하지 않고 계대배양하여 사용하는 방법과 마찬가지로 세포가 각종 오염에 노출될 가능성이 높아지게 된다. 또한, 동결된 세포를 보관하던 중에 ALP 어세이에 사용하기 위하여 각각 다른 시점에서 세포를 해동하였을 때, 이러한 세포들은 지수증식기(log phase)에 도달하는 시간에 있어서 편차가 크게 발생하게 되며, 결국 세포의 성장 속도, 단백질의 발현 능력, 조골세포와 같은 특정 세포로 분화되는 능력 등이 서로 다르기 때문에 ALP 어세이의 결과에 유의적인 오차를 유발하고 신뢰도를 현저하게 떨어뜨린다. 실험결과에 대한 큰 편차와 신뢰도의 저하는 당업자로 하여금 반복 실험을 더 많이 수행해야 하는 하는 문제점도 가져온다.
뿐만 아니라, 튜브 또는 바이알 내에서 동결 스톡 용액과 함께 동결 저장되고 있던 세포(공개특허공보 제10-2014-0100969호)는 해동한 후에 ALP 어세이를 수행하고자 하는 웰-플레이트상에 분주하여야 하는데, 이 과정은 세포를 해동 이후에 또다시 손상시키게 되며, 해동된 세포들이 플레이트의 바닥에 잘 부착되어 성장하는지 여부도 확인하여야 한다.
따라서, 동결 보관하고 있던 ATDC5 세포를 ALP 어세이에 사용하기 위하여 해동하였을 때, 세포를 튜브 또는 바이알에서 웰-플레이트로 옮기는 과정 및/또는 세포를 장기간에 걸쳐 안정화시키는 과정 등을 거치지 않을 수 있다면, ALP 어세이의 정확도 및 신뢰도를 유의적으로 높일 수 있게 되고 결국 BMP 단백질의 활성을 보다 정확하고 간편하게 측정할 수 있게 될 것이다.
공개특허공보 제10-2014-0100969호 (2014.08.18)
본 발명자들은 상기에서 살펴본 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 다양한 측면에서 실험들을 해온 결과, 동결 보관된 ATDC5 세포를 해동한 후 바로 ALP 어세이에 사용할 수 있는지 여부는 놀랍게도 ATDC5 세포를 동결할 때 이용되는 동결 스톡 용액(freezing stock solution)의 조성에 의존한다는 것을 새롭게 발견하게 되었다.
본 발명에 따른 방법은 BMP 단백질의 조골세포 분화 활성을 측정하기 위하여 종래에 알려져 있는 ALP 어세이를 수행하는 방법을 개선하기 위한 것으로서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) 10% DMSO, 20% FBS 및 70% DMEM F-12 배지로 구성된 동결 스톡 용액으로 ATDC5 세포를 동결시키고, ALP 어세이를 수행하기 전까지 보관하는 단계;
b) 상기 ATDC5 세포를 해동시키는 단계; 및
c) 상기 해동시킨 ATDC5 세포에 BMP 단백질을 첨가하여 ALP 어세이를 수행하는 단계.
바람직한 일구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 포함한다:
a-0) ATDC5 세포를 5% FBS가 첨가된 DMEM F-12 배지에서 배양하는 단계;
a) 10% DMSO, 20% FBS 및 70% DMEM F-12 배지로 구성된 동결 스톡 용액으로 ATDC5 세포를 동결시키고, ALP 어세이를 수행하기 전까지 보관하는 단계;
b) 상기 ATDC5 세포를 해동시키는 단계; 및
c) 상기 해동시킨 ATDC5 세포에 BMP 단백질을 첨가하여 ALP 어세이를 수행하는 단계.
바람직한 일구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 포함한다:
a-0) ATDC5 세포를 5% FBS가 첨가된 DMEM F-12 배지에서 배양하는 단계;
a) 10% DMSO, 20% FBS 및 70% DMEM F-12 배지로 구성된 동결 스톡 용액으로 ATDC5 세포를 동결시키고, ALP 어세이를 수행하기 전까지 보관하는 단계;
b) 상기 ATDC5 세포를 해동시키는 단계;
c-0) 해동된 ATDC5 세포를 2% FBS가 첨가된 DMEM F-12 배지에서 배양하는 단계; 및
c) 상기 해동시킨 ATDC5 세포에 BMP 단백질을 첨가하여 ALP 어세이를 수행하는 단계.
상기 a) 단계에서 동결한 ATDC5 세포를 보관하는 기간은 원하는 기간만큼 수행될 수 있다. 예를 들어 1일 내지 8주 동안 또는 그 이상으로 보관하는 것이 가능하다.
상기 c-0) 단계에서 해동된 ATDC5 세포를 배양하는 기간은 가능한한 짧은 기간내에 수행되는 것이 바람직하다. 특히, 1일 내지 2일 동안 수행되는 것이 바람직하다.
상기 a-0), a), b), c-0) 및 c) 단계 모두에서 ATDC5 세포는 멀티-웰 플레이트에 포함되어 있는 것을 특징으로 한다. 즉, a-0) 단계에서 ATDC5 세포는 멀티-웰 플레이트에 포함된 상태로 배양되고, a) 단계에서 ATDC5 세포는 멀티-웰 플레이트에 포함된 상태로 동결 및 보관되고, b) 단계에서 ATDC5 세포는 멀티-웰 플레이트에 포함된 상태로 해동되고, c-0) 단계에서 ATDC5 세포는 멀티-웰 플레이트에 포함된 상태로 배양되고, c) 단계에서 ATDC5 세포는 멀티-웰 플레이트에 포함된 상태로 BMP 단백질이 첨가되어 ALP 어세이가 수행된다.
상기 멀티-웰 플레이트는 6-웰, 12-웰, 24-웰, 48-웰 또는 96-웰 플레이트일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 멀티-웰 플레이트가 24-웰 플레이트인 경우 ATDC5 세포는 웰 당 5x104개 내지 7x104개 세포수의 농도로 분주될 수 있다.
상기 BMP 단백질은 BMP2 단백질인 것이 바람직하다.
NB324K 인간 신장 세포, HaCaT 인간 케라티노사이트 세포, RH18 인간 근육 세포 등을 동결시키는 방식을 ATDC5 세포에 대해서도 마찬가지로 적용할 경우, ATDC5 세포를 동결시키고 장기간 보관하는 데에는 문제가 없다.
그러나, ATDC5 세포를 해동한 후 빠른 시간 내에 BMP 단백질의 활성을 측정하는 ALP 어세이에 사용하고자 하는 경우에는 종래의 동결 조건은 적합하지 않다.
예를 들어, 동결하여 보관하기에 편리하여 통상적으로 이용되는 튜브 또는 바이알은 ATDC5 세포를 해동한 후에 웰-플레이트상에 정확한 세포수로 분주해야 하는 절차상의 번거로움이 존재한다. 또한, 세포는 동결 및 해동 과정에서 종종 손상되는데, 튜브 또는 바이알로부터 웰-플레이트로 세포를 옮기는 과정은 세포를 또다시 손상시키게 된다.
더욱이, ATDC5 세포를 해동하고 웰-플레이트상에 분주한 후에도, 플레이트의 바닥에 세포가 잘 부착될 수 있도록 그리고 정상적인 지수증식기(log phase)까지 잘 성장할 수 있도록 해야 하며, 이 과정에는 3~4일부터 한 달 이상에 이르기까지 소요되고, 그 소요되는 정확한 기간은 예측하기가 어렵다. 이와 같이 ATDC5 세포를 배양하여 지수증식기(log phase)에 도달하는 기간이 길어지게 되면, 세포군마다 세포의 성장 속도, 조골세포와 같은 특정 세포로 분화되는 능력 등에 있어서 편차가 많이 발생하게 된다. 결국, ATDC5 세포들을 사용하여 ALP 어세이를 수행할 때 실험결과에 오차가 많이 발생하게 되고, 실험결과의 신뢰도를 높이기 위해서는 더 많은 반복 실험이 필요하게 된다.
반면, 본 발명의 방법에 따르면, 세포의 성장 속도, 분화 능력 등이 균질한 상태의 ATDC5 세포를 대량으로 배양한 후에, 향후에 ALP 어세이를 수행하고자 하는 웰-플레이트상에 ATDC5 세포를 미리 분주하고 동결하게 된다. 그리고, 새롭게 제작한 BMP 재조합 단백질의 생물학적 활성을 측정해야 하는 시점에서, ATDC5 세포가 포함된 웰-플레이트를 해동하여 ALP 어세이에 사용하게 된다.
따라서, 본 발명은 ALP 어세이를 수행하기 위해 ATDC5 세포를 해동시키고 배양시킬 때 튜브 또는 바이알에서 웰-플레이트로 옮기는 과정이 불필요하므로, 종래에 이 과정에서 소요되던 시간과 노력을 감소시킬 수 있고, 특히 세포가 손상되는 과정을 생략할 수 있다는 점에서 매우 유리하다.
또한, 상기 동결된 웰-플레이트에는 성질이 균질한 상태의 ATDC5 세포들이 보관되어 있기 때문에, 예를 들어 2주 후에 해동시켜 사용하는 ATDC5 세포와 4주 후에 해동시켜 사용하는 ATDC5 세포는 성장 속도, 분화 능력 등이 거의 동일하므로, ALP 어세이의 실험결과에 영향을 미치는 변수를 유의적으로 줄일 수 있게 된다. 이는 ALP 어세이를 수행할 필요가 있는 시점에서 언제든지 동결 보관 중인 ATDC5 세포를 해동시켜 사용하는 것이 가능하다는 것을 의미한다.
특히, 후술하는 실시예에서 실험을 통해 입증된 바와 같이, ATDC5 세포를 동결시킬 때 본 발명에 따른 동결 스톡 용액의 조성을 사용하게 되면, ATDC5 세포를 동결시키지 않은 상태에서 ALP 어세이를 수행한 결과와 거의 동일한 정도로 ALP 어세이의 실험결과를 얻을 수 있다. 그 이유는, ATDC5 세포를 해동시킨 후 배양하여 지수증식기(log phase)에 도달하는 기간이 매우 짧아서, 동결하기 전의 ATDC5 세포들과 비교하였을 때 성장 속도, 분화 능력 등의 성질이 거의 차이나지 않기 때문인 것으로 여겨진다. 이는 ATDC5 세포를 동결하여 보관하더라도 동결하지 않은 것과 마찬가지로 BMP 단백질의 활성을 높은 신뢰도와 정확도로 측정할 수 있다는 것을 의미한다.
또한, ATDC5 세포가 마이코플라스마, 바이러스 등에 노출되어 감염될 가능성을 최소화시킬 수 있다.
도 1은 DMEM F-12 배지와 RPMI1640 배지에서 ATDC5 세포의 성장 및 증식 상태를 1일째, 2일째, 3일째에 관찰한 현미경 사진이다. 여러 개의 웰 사진 중에서 대표적인 사진을 도시하였다.
도 2는 DMEM F-12 배지와 RPMI1640 배지에서 ATDC5 세포를 동결하기 전과 해동 후 2일째에 관찰한 현미경 사진이다. 여러 개의 웰 사진 중에서 대표적인 사진을 도시하였다.
도 3a 및 3b는 DMSO, FBS의 조성을 다양하게 변형시킨 동결 스톡 용액으로 ATDC5 세포를 동결하였을 때, 동결하기 전과 해동 후 1일째에 관찰한 현미경 사진이다. 여러 개의 웰 사진 중에서 대표적인 사진을 도시하였다.
도 4는 24-웰 플레이트를 기준으로 ATDC5 세포의 웰 당 파종 수에 따라 동결하기 전과 해동 후 1일째, 2일째에 관찰한 현미경 사진이다. 여러 개의 웰 사진 중에서 대표적인 사진을 도시하였다.
도 5는 본 발명에 따라 동결하여 각각 2주, 4주, 8주 동안 보관하던 ATDC5 세포를 해동한 후 2일째에 관찰한 현미경 사진이다. 여러 개의 웰 사진 중에서 대표적인 사진을 도시하였다.
도 6은 동결 및 해동 과정을 거치지 않은 상태의 ATDC5 세포를 이용하여, 본 출원인이 형질전환을 통해 직접 제작한 rhBMP2 재조합 단백질과 R&D사에서 시판하는 BMP2 단백질에 대해 ALP 어세이를 수행하여 얻은 실험결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따라 각각 2주, 4주 동안 동결하고 해동시킨 ATDC5 세포를 이용하여, 본 출원인이 형질전환을 통해 직접 제작한 rhBMP2 재조합 단백질에 대해 ALP 어세이를 수행하여 얻은 실험결과를 그래프로 나타낸 것이다. 비교를 위해, 동결 및 해동 과정을 거치지 않은 상태의 ATDC5 세포를 이용한 ALP 어세이 실험결과(도 6)도 함께 도시하였다.
본 발명에 대해서는 하기의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 설명될 것이나, 이는 본 발명의 권리범위를 제한하려는 것이 아니다. 또한, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 취지를 해하지 않는 범위 내에서 본 발명에 대해 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있을 것이다.
1. 실험 재료의 준비
본 발명의 실험에서 사용된 재료들은 다음과 같다.
i. ATDC5 세포: RIKEN사, Cat#RCB0565, 마우스 배아 상피세포
ii. rhBMP2 (recombinant human Bone Morphogenetic Protein 2):
(1) 셀루메드(본 출원인)가 형질전환 기법을 통해 직접 제작함, CHO 세포에서 발현시켜 수득한 것임, Lot#R2521502
(2) R&D사에서 시판되는 것을 구입함, CHO 세포에서 발현시켜 수득한 것임, Cat#355-BM/CF, Lot#MSA361302A
iii. DMEM F-12 배지: GIBCO사, Cat#11330-032, Lot#1669948
DMEM F-12 배지는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium) 및 Nutirent Mixture Ham's F-12가 1:1로 혼합된 액상 배지로서, GIBCO사에서 시판되는 것을 구입하여 사용하였다.
iv. RPMI1640 배지: GIBCO사, Cat#22400-089, Lot#1677035
v. FBS (Fetal Bovine Serum: 소태아혈청): INVITROGEN사, Cat#10091-148, Lot#8185628
vi. Alkaline Phosphatase: SIGMA사, Cat#A2356, Lot#SLBK7196V
vii. Alkaline Phosphatase yellow (pNPP): SIGMA사, Cat#P7998
2. 세포 배양 및 동결 스톡 용액(freezing stock solution)에 사용되는 기본 배지의 선별
a. 세포의 배양 및 성장
ATDC5 세포에 대해 DMEM F-12 배지와 RPMI1640 배지를 사용하여 세포가 정상적으로 배양되고 증식하는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 상기 RPMI1640 배지는 NB324K 인간 신장 세포, HaCaT 인간 케라티노사이트 세포, RH18 인간 근육 세포 등을 동결하여 장기간 보관하기 위해 종래에 사용되고 있는 배지이다. 하기에서 배지 또는 동결 용액의 조성을 나타내기 위하여 %를 사용할 때 이는 부피를 기준으로 한다.
본 실험에서 사용한 배지의 구체적인 조성은 하기 표 1에 나타내었다.
실험군 배지
1 DMEM F-12 배지 + 5% FBS
2 RPMI1640 배지 + 9% FBS
3 RPMI1640 배지 + 5% FBS
6-웰 플레이트에 ATDC5 세포를 1.5x105 세포/웰의 농도로 분주한 후, 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다.
DMEM F-12 배지와 RPMI1640 배지 각각에서 배양된 ATDC5 세포를 배양 1일째, 2일째, 3일째에 관찰한 현미경 사진을 도 1에 도시하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, DMEM F-12 배지에서 배양된 ATDC5 세포는 배양 초기(1일째, 2일째)에 그 성장 및 증식 속도가 매우 빠르다는 것이 관찰되었으며, 배양한지 3일 내에 정상적인 지수증식기(log phase) 상태에 도달함을 확인할 수 있었다.
반면, RPMI1640 배지에서 배양된 ATDC5 세포는 배양 초기(1일째, 2일째)에 현저하게 느린 속도로 성장 및 증식하는 것이 관찰되었으며, 이와 같은 현상은 FBS의 비율과는 무관하게 마찬가지로 나타났다. 특히, 배양 3일째에 현미경으로 관찰하였을 때, 생존하여 증식된 ATDC5 세포들은 플레이트의 바닥에 잘 부착되어 자라지 못하고 대부분 바닥에서 분리되어 떠다니는 모습이 확인되었다.
b. 세포의 동결 및 해동
ATDC5 세포의 배양 및 성장을 관찰한 앞선 실험에 이어서, DMEM F-12 배지와 RPMI1640 배지를 각각 사용하여 ATDC5 세포를 동결하고 해동하는 실험을 추가로 수행하였다.
본 실험에서 사용한 세포 배양 배지, 동결 스톡 용액(freezing stock solution), 해동 용액은 하기 표 2에 나타내었다.
실험군 세포 배양 배지 동결 스톡 용액 해동 용액
1 DMEM F-12 배지
+ 5% FBS		 10% DMSO, 20% FBS,
70% DMEM F-12 배지		 DMEM F-12 배지
+ 2% FBS
2 RPMI1640 배지
+ 9% FBS		 10% DMSO, 20% FBS,
70% RPMI1640 배지		 RPMI1640 배지
+ 2% FBS
96-웰 플레이트에 ATDC5 세포를 3.3x105 세포/ml의 농도로 웰 당 25μl 씩 분주하였다(8,250개 세포/웰). 이어서, 5% FBS가 첨가된 DMEM F-12 배지와 9% FBS가 첨가된 RPMI1640 배지에서 각각 ATDC5 세포를 1일 동안 배양하였다.
상기 표 2에 기재되어 있는 동결 스톡 용액(freezing stock solution)을 제작하여, 실험군 1 및 2에서 배양된 ATDC5 세포를 -70℃에서 동결하였다.
-70℃에서 3일 동안 동결 보관된 ATDC5 세포를 해동하여, 2% FBS가 각각 보충된 DMEM F-12 배지와 RPMI1640 배지에서 배양하였다. ATDC5 세포가 웰-플레이트의 바닥면에 잘 부착되고 성장 및 증식하는지 여부를 현미경으로 관찰하였으며, 해동 후 2일째의 현미경 사진을 도 2에 도시하였다.
도 2에서 보는 바와 같이, RPMI1640 배지를 포함하는 동결 스톡 용액을 사용한 실험군 2에서, ATDC5 세포는 동결하기 전에도 증식된 생존 세포수가 적었으나 해동 후에는 대부분의 세포가 사멸하여 생존해있는 세포를 찾아보기가 어려웠다.
반면, DMEM F-12 배지를 포함하는 동결 스톡 용액을 사용한 실험군 1에서, ATDC5 세포는 동결하기 전에도 증식된 생존 세포수가 많았으나 해동 후에는 오히려 생존 세포수가 더 증가하였다.
c. 소결
RPMI1640 배지는 NB324K 인간 신장 세포, HaCaT 인간 케라티노사이트 세포, RH18 인간 근육 세포 등을 동결시키는 기본 배지로서 사용될 수 있다.
그러나, BMP 단백질의 생물학적 활성을 측정하려는 목적으로 ALP 어세이를 수행하기 위하여 ATDC5 세포를 사용할 경우, ATDC5 세포를 동결시키는 기본 배지로서 RPMI1640 배지는 상기 실험에서 확인된 바와 같이 적합하지 않았다.
하기에서는, ATDC5 세포를 가장 최적으로 동결하는데 사용되는 동결 스톡 용액(freezing stock solution)의 조성을 찾기 위하여, DMEM F-12 배지를 기본 배지로 설정하되 DMSO 및 FBS의 비율을 달리하고 웰 당 세포 파종수를 달리하여 실험결과를 비교하였다.
3. 세포를 동결하기 위한 동결 스톡 용액(freezing stock solution)의 조성
ATDC5 세포를 가장 최적으로 동결 및 해동시킬 수 있는 조건을 찾기 위하여, DMEM F-12 배지를 기본 배지로 설정하고 동결 스톡 용액을 구성하는 DMSO 및 FBS를 다양한 조성비로 변형시켜 실험을 설계하였다.
본 실험에서 사용한 동결 스톡 용액(freezing stock solution)의 조성은 하기 표 3에 나타내었다.
실험군 DMSO FBS DMEM F-12 배지
1 10% 20% 70%
2 8% 20% 72%
3 10% 15% 75%
4 8% 15% 77%
5 10% 10% 80%
6 8% 10% 82%
5% FBS가 포함된 DMEM F-12 배지를 96-웰 플레이트에 175μl씩 넣어주고, ATDC5 세포를 3.3x105 세포/ml의 농도로 웰 당 25μl 씩 분주하였다(8,250개 세포/웰). 그 후, 1일 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 다음날, ATDC5 세포가 플레이트의 밑면에 잘 부착되었는지 확인한 후, PBS로 한 번 세척하였다.
이어서, 상기 표 3에 기재되어 있는 다양한 DMSO, FBS의 조성으로 동결 스톡 용액을 제조하고, 각 웰에 150μl씩 충진하였다. 이때, 튜브 또는 바이알처럼 통상적으로 세포를 동결 보관하는데 사용되는 용기로 세포를 옮기지 않고, 플레이트 상태 그대로 -70℃ Deepfreezer에 보관함으로써 ATDC5 세포를 동결하였다.
동결을 시작하고 4주 동안 보관한 후에, ATDC5 세포가 함유된 웰-플레이트를 해동하였다. 해동한 후 PBS로 세척하고, 2% FBS가 함유된 DMEM F-12 배지를 웰에 200μl씩 첨가하여 ATDC5 세포를 배양하였다. 해동 후 1일째, 2일째에 세포가 잘 성장하고 플레이트의 밑면에 부착되어 있는지 여부를 관찰하였으며, 도 3a 및 3b에 해동 후 1일째 관찰한 현미경 사진을 도시하였다.
도 3a 및 3b에서 보는 바와 같이, 10% DMSO, 20% FBS 및 70% DMEM F-12 배지로 구성된 동결 스톡 용액(%는 부피비율임)으로 ATDC5 세포를 동결한 실험군 1은 해동 후 1일째 배양된 세포수가 동결하기 전보다 오히려 더 많았으며, 세포의 상태 역시 플레이트의 바닥에 잘 부착된 상태로 잘 성장하고 있는 것이 관찰되었다.
반면, DMSO와 FBS의 조성비가 다른 동결 스톡 용액으로 ATDC5 세포를 동결한 실험군 2 내지 6의 경우, 세포수 및 증식 정도의 차이는 있었으나 ATDC5 세포가 해동된 후 1일 동안이라는 짧은 기간내에 안정화된 지수증식기(log phase) 상태에 도달하지 못하였다. 특히, 해동 후 1일째에 ATDC5 세포가 증식하였더라도, 플레이트의 바닥에 잘 부착되지 못하고 분리되어 떠다니는 모습이 관찰되었는데, 이러한 현상은 ATDC5 세포가 ALP 어세이에 사용될 때 실험결과에 오차를 많이 발생시키는 주된 요인 중 하나이다.
4. ALP 어세이를 수행하는데 적합한 세포수
동결 보관된 ATDC5 세포를 해동하여 바로 ALP 어세이를 수행할 때, 가장 적합한 세포수를 찾기 위한 실험을 수행하였다.
이 실험은 ATDC5 세포를 해동한 시점과 ALP 어세이를 수행할 수 있기에 적합한 시점 사이의 기간을 최대한 짧게 만들 수 있는 조건을 찾기 위한 것이다. ATDC5 세포를 해동한 후 ALP 어세이를 빠르게 수행할수록, 확인하고자 하는 BMP 재조합 단백질의 생물학적 활성을 더 신속하게 측정할 수 있는 것은 물론이고, ATDC5 세포를 보다 균질한 상태에서 ALP 어세이를 수행하게 되므로 그 정확도 및 신뢰도를 증가시킬 수 있다.
우선 ATDC5 세포를 24-웰 플레이트에 5x104 세포/웰, 6x104 세포/웰, 7x104 세포/웰의 3개 농도로 각각 분주하였다. 37℃에서 1일 동안 배양한 후, PBS로 세척하였다.
앞선 실험에서 확인된 바에 따라 10% DMSO, 20% FBS 및 70% DMEM F-12 배지로 구성된 동결 스톡 용액을 제조하고, 이 동결 스톡 용액과 함께 ATDC5 세포가 포함된 24-웰 플레이트를 -70℃ Deepfreezer에서 동결하였다. 그로부터 1일 후, ATDC5 세포를 해동하여 PBS로 세척하고, 2% FBS가 포함된 DMEM F-12 배지로 교환해주었다.
ATDC5 세포의 파종 수에 따른 동결하기 전과 해동 후 1일째, 2일째의 세포 상태를 관찰한 현미경 사진을 도 4에 도시하였다.
도 4에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 10% DMSO, 20% FBS 및 70% DMEM F-12 배지로 구성된 동결 스톡 용액으로 ATDC5 세포를 동결하였을 때, ATDC5 세포의 증식 및 성장 상태는 5x104 세포/웰, 6x104 세포/웰, 7x104 세포/웰의 3개 농도에서 유의적인 차이를 보이지는 않았다. 다만, 웰 당 세포수가 90% 이상으로 너무 많아서 웰이 세포로 (과)포화된 경우에는 후속 절차인 ALP 어세이의 결과에 오류가 발생할 가능성이 있다는 점, 웰 당 분주되는 세포수가 7x104 세포/웰보다 더 적은 5x104 세포/웰의 경우에도 ALP 어세이를 수행하는데 적합하다는 점을 고려하여, 후술하는 ALP 어세이에서는 5x104 세포/웰의 세포 농도를 적용하여 실험을 수행하였다.
5. ALP 어세이
지금까지 수행된 실험들은 ATDC5 세포가 동결 및 해동 과정을 거친 후에도 가능한한 짧은 시간내에 잘 성장하고 증식되어 지수증식기(log phase) 상태에 도달하는지 여부를 확인하기 위한 것이다.
본 발명의 궁극적인 목적은 ALP 어세이를 수행하여 BMP 단백질이 생물학적 활성을 갖고 있는지 그리고 생물학적 활성의 정도가 얼마인지 측정하기 위한 것이므로, 본 실험에서는 전술한 실험에서 입증된 특정 조성의 동결 스톡 용액과 웰 당 파종 세포 수를 적용하여, ALP 어세이를 수행하였다. 구체적인 실험 내용 및 결과는 다음과 같다.
a. ATDC5 세포의 배양 및 동결
5% FBS가 포함된 DMEM F-12 배지에 ATDC5 세포를 5x104 세포/ml의 농도로 24-웰 플레이트에 웰 당 1ml씩 분주하고 1일 동안 배양하였다.
ATDC5 세포가 안정화되어 지수증식기(log phase) 상태에 도달한 것을 확인한 후, 10% DMSO, 20% FBS 및 70% DMEM F-12 배지로 구성된 동결 스톡 용액으로 배지를 교환하였다. 이어서, -70℃의 Deepfreezer에서 ATDC5 세포를 각각 2주, 4주, 8주 동안 보관하였다.
b. ATDC5 세포의 해동
ALP 어세이를 수행하기 위해, 각각 2주, 4주, 8주 동안 동결 보관하고 있던 ATDC5 세포를 해동시켰다. 해동할 때는 최대한 신속하게 (바람직하게는, 30분 이내에) ATDC5 세포가 손상되지 않도록 녹인 후, PBS로 한 번 세척해주었다. 그 후, 2% FBS가 포함된 DMEM F-12 배지로 교환하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 기아(starvation) 과정을 수행하였다. 이와 같이 수행되는 기아(starvation) 과정은, ALP 어세이를 진행하기에 앞서 FBS에 의해 간접적으로 영향받는 것을 최대한 배제하려는 목적과 함께, BMP 단백질을 세포에 처리하였을 때 조골세포로 분화되는 능력을 보다 선명하게 확인하려는 목적을 위해 포함되었다.
해동한 후 2일째의 ATDC5 세포 상태를 관찰한 현미경 사진을 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 해동한 후 2일째에 ATDC5 세포는 동결 보관한 기간이 2주, 4주, 8주인지 여부에 관계없이 정상적으로 성장하고 증식하여 지수증식기(log phase)에 도달하였다. 특히, ATDC5 세포는 플레이트의 바닥면에 잘 부착되어 있는 것이 관찰되었다.
이에 따라, 본 발명에 따른 방법에 의해 동결되어 보관되고 있던 ATDC5 세포는 해동한 후에 즉시 BMP2 단백질의 활성을 측정하기 위한 ALP 어세이에 사용할 수 있는 상태에 있다는 것을 확인할 수 있다.
c. 분화 활성을 측정하고자 하는 BMP 단백질 시료의 준비
본 출원인은 BMP2 유전자를 CHO DG44 세포에 형질전환시켜 BMP2 단백질을 과발현하는 CHO 세포주를 제작하였다. 이와 같이 제작된 CHO 세포주로부터 rhBMP2 재조합 단백질을 발현시킨 후, 이를 일련의 정제 과정을 통해 수득하였다.
상기 수득된 rhBMP2 재조합 단백질이 조골세포 분화 활성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여 ALP 어세이를 수행하였다.
d. ALP 어세이
본 출원인이 직접 생산한 rhBMP2 재조합 단백질과 비교하기 위하여, 시중에서 판매되고 있는 BMP2 단백질(R&D사제)을 구입하여 양성 대조군으로서 사용하였다.
첫번째 실험으로서, 동결 및 해동 과정을 거치지 않은 상태의 ATDC5 세포를 이용하여, 본 출원인의 rhBMP2 재조합 단백질과 R&D사의 BMP2 단백질에 대해 ALP 어세이를 수행하였다.
BMP2 단백질을 1 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.25 μg/ml, 0.125 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.03 μg/ml의 농도가 되도록 2% FBS가 함유된 DMEM F-12 배지로 순차 희석하였다. 그 후, 해동 2일째의 ATDC5 세포가 함유되어 있는 24-웰 플레이트에 BMP2 단백질이 희석된 배지를 웰 당 1ml씩 첨가하였다. BMP2 단백질을 ATDC5 세포에 처리한 후 2일이 경과하면 PBS로 1회 세척하고, 0.9% NaCl 버퍼로 1회 추가 세척하고, 융해(lysis) 버퍼(0.9% NaCl +1% NP40) 200μl를 웰에 각각 처리하였다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 12000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 펠릿(pellet)은 버리고, 상등액만 새로운 튜브에 옮겨놓았다. 이와 같이 세포를 융해하여 획득한 상등액을 96-웰 플레이트의 웰마다 20μl씩 넣고, 이어서 pNPP를 웰 당 100μl씩 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 색의 변화를 관찰하였으며, Perkinelmer사의 ELISA reader 장치를 사용하여 405nM의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 실험 결과는 도 6에 나타내었다. 본 출원인의 rhBMP2 재조합 단백질은 R&D사의 BMP2 단백질과 거의 유사한 ALP 활성 경향을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 특히 BMP2 단백질이 고농도로 처리될 때에는 오히려 본 출원인의 rhBMP2 재조합 단백질이 더 좋은 ALP 활성을 나타내었다. 이는 본 출원인의 rhBMP2 재조합 단백질이 시중에서 판매되는 BMP2 단백질에 비해 조골세포 분화 활성이 더 우수하다는 것을 입증한다.
두번째 실험으로서, 2주 동안 동결 보관하다가 해동시킨 ATDC5 세포와 4주 동안 동결 보관하다가 해동시킨 ATDC5 세포를 이용하여, 본 출원인의 rhBMP2 재조합 단백질에 대해 ALP 어세이를 수행하였다.
그 실험 결과는 도 7에 나타내었으며, 동결 및 해동 과정을 거치지 않은 상태의 ATDC5 세포를 이용한 도 6의 실험결과를 비교하기 위하여 도 7에 함께 도시하였다.
2주 동안 동결 보관하다가 해동시킨 ATDC5 세포를 사용한 경우의 ALP 활성과 4주 동안 동결 보관하다가 해동시킨 ATDC5 세포를 사용한 경우의 ALP 활성은 거의 동일하였다. 또한, 동결 보관을 한 기간과는 무관하게, 본 발명에 따라 동결 보관시킨 ATDC5 세포를 사용하여 얻은 ALP 활성과 동결시키지 않은 ATDC5 세포를 사용하여 얻은 ALP 활성이 매우 유사한 형태의 그래프로 표시됨을 확인할 수 있다.
이와 같은 결과가 얻어진 이유는, 동결 보관 중인 ATDC5 세포를 해동한 후 이를 ALP 어세이에 사용하기 위해 안정화하는데 걸리는 시간이 2일 이내로 매우 짧아서 ATDC5 세포들간에 조골 세포로 분화되는 능력이 거의 차이나지 않기 때문인 것으로 여겨진다.
따라서, 본 발명에 따라 ATDC5 세포를 동결 보관할 경우, ATDC5 세포를 동결하지 않은 경우와 마찬가지로 ALP 어세이에 사용할 수 있다. 이는 동결 보관 기간이 오래 지속된다고 하더라도 적용된다.
e. 소결
상기 실험 결과들에 따르면, 본 발명에 따른 특이적 조성의 동결 스톡 용액(freezing stock solution)을 이용하여 ATDC5 세포를 동결한 경우, ALP 어세이를 수행하기 직전에 ATDC5 세포를 해동시켜 바로 사용할 수 있다.
따라서, 새롭게 제작한 재조합 BMP 단백질이 조골세포 분화 활성을 정상적으로 나타내는지 쉽고 빠르게 확인하는 것이 가능하다. 또한, 시판되는 BMP 단백질을 구입한 경우 이를 이용하여 연골제제 등의 2차 제품을 대량 생산하기에 앞서, 시판되는 BMP 단백질이 실제로 조골세포 분화 활성을 원하는 정도로 나타내는지 여부를 빠르게 확인할 수 있다.
뿐만 아니라, ATDC5 세포를 동결하여 보관하는 기간이 장기간으로 길어진다고 하더라도, ALP 어세이의 실험결과를 균일하게 얻을 수 있다.

Claims (8)

  1. BMP 단백질의 조골세포 분화 활성을 측정하기 위하여 ALP 어세이를 수행하는 방법에 있어서,
    a) 10% DMSO, 20% FBS 및 70% DMEM F-12 배지로 구성된 동결 스톡 용액(freezing stock solution)으로 ATDC5 세포를 동결시키고, ALP 어세이를 수행하기 전까지 보관하는 단계;
    b) 상기 ATDC5 세포를 해동시키는 단계; 및
    c) 상기 해동시킨 ATDC5 세포에 BMP 단백질을 첨가하여 ALP 어세이를 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계 이전에, ATDC5 세포를 5% FBS가 첨가된 DMEM F-12 배지에서 배양하는 a-0) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계 이전에, 해동된 ATDC5 세포를 2% FBS가 첨가된 DMEM F-12 배지에서 배양하는 c-0) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 c-0) 단계의 배양은 1일 내지 2일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계에서 ATDC5 세포를 보관하는 기간은 1일 내지 8주 동안인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 a), b) 및 c) 단계 모두에서 ATDC5 세포는 멀티-웰 플레이트에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 a-0) 단계에서 ATDC5 세포는 멀티-웰 플레이트에서 배양되고, 상기 멀티-웰 플레이트가 24-웰 플레이트인 경우 ATDC5 세포는 5x104 내지 7x104 세포수/ml의 농도로 분주되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 BMP 단백질은 BMP2 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
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