CN104039820A - 用于诱导软骨形成的gdf-5突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及GDF-5相关蛋白,其具有改善的诱导软骨形成的能力和降低的诱导骨形成的能力。该新型蛋白在治疗软骨缺损中是特别有用的,其中骨组织的形成是不希望的。
Description
描述
本发明涉及GDF-5相关蛋白,其具有改善的诱导软骨形成的能力和降低的诱导骨形成的能力。该新型蛋白在治疗软骨缺损中是特别有用的,其中骨组织的形成是不希望的。
滑膜关节对于骨骼的生物力学功能是必不可少的。如在关节炎疾病中观察到的异常功能直接导致生活质量的严重降低。因此,关节生物学数年来一直集中在广泛的研究中,使我们理解关节解剖学和组织学以及关节软骨和其他成分在关节功能和维护中的生物力学性质和作用。
GDF-5(等人1994,Biochem.Biophys Res.Commun.204,646-652)是已显示在多种组织中促进细胞增殖、分化和/或组织形成的形态发生素。蛋白也称为形态发生蛋白MP52、骨形态发生蛋白-14(BMP-14)或软骨源性形态发生蛋白-1(CDMP-1)。GDF-5显示软骨形成活性并且先天GDF-5突变导致小鼠和人的手指或足趾(digit)、腕和踝关节缺陷(Storm等人,1994;Thomas等人,1997)。GDF-5的表达最显著地限制在关节将发育的区域,并且是关节形成的最早期的标志之一(Storm和Kingsley,1999)。需要BMP受体信号以对关节软骨进行出生后维护(Rountree,2004,PLoS Biol.2004November,2(11))。
GDF-5与GDF-6和GDF-7密切相关。这三种蛋白形成TGF-β超家族的独特亚组,从而显示相当的生物学特性和超高度的氨基酸序列一致性(参见Wolfman等人1997,J.Clin.Invest.100,321-330)。所有家族成员最初作为更大的前体蛋白合成,该前体蛋白随后在距离C末端约110-140个氨基酸的一组碱性残基处经历蛋白水解切割,从而将C末端成熟蛋白部分从N末端前结构域(prodomain)释放。成熟多肽在结构上相关并且含有包含六个或七个标准(canonical)半胱氨酸残基的保守的生物活性结构域,所述结构域导致这些蛋白的性质上三维的“胱氨酸结”模体。天然GDF-5相关蛋白是同型二聚体分子并主要通过与特异受体复合物的相互作用而起作用的,所述受体复合物由I型和II型丝氨酸/苏氨酸受体激酶组成。受体激酶随后活化Smad蛋白,其随后将信号传播到细胞核中以调节靶基因表达。
已经反复地证明GDF-5/-6/-7亚组的成员首先是骨和软骨的重要的诱导物和调节物(Cheng等人.2003,J.Bone&Joint Surg.85A,1544-1552;Settle等人.2003,Developm.Biol.254,116-130)。GDF-5和相关蛋白结合到两种类型的膜结合丝氨酸-苏氨酸激酶受体(称为I型和II型)并使其寡聚化。在配体结合时,这些复合物通过磷酸化转录因子的SMAD家族的成员来转导信号,所述转录因子的SMAD家族的成员在活化时进入细胞核并调节应答基因的转录(Massague,1996)。最近的实验在骨型、BMPR-IA和BMPR-IB中涉及两种不同的I型受体。两种受体在正常的发育过程中均以动态模式表达。在数种肢体结构中,例如,在关节间带和软骨膜中,观察到BMPR-IA和BMPR-IB的重叠表达(Mishina等人,1995;Zou等人,1997;Baur等人,2000)。对于BMPR-IA和BMPR-IB表达模式,GDF-5信号转导应通过与BMPR-IA和BMPR-IB两者的相互作用来实现(Chang等人,1994;Zou等人,1997)。在bmpr-1b基因中的无效突变产生在骨和关节形成中有缺陷的存活小鼠,所述缺陷非常接近在缺失GDF-5的小鼠中见到的那些(Storm和Kingsley,1996;Yi等人,2000),而已知bmpr-la/小鼠在胚胎形成的早期死亡(Mishina等人,1995)。然而,在GDF-5-Cre驱动子控制下的BMPR-IA的条件敲除避开了胚胎死亡并产生了具有正常形成的关节的存活小鼠。但是在出生后,关节内的关节软骨在与骨关节炎类似的过程中磨损,这指出了该受体在软骨稳态和修复中的重要性(Rountree等人,2004)。
GDF-5相关蛋白家族的野生型蛋白的活性通常导致软骨和骨的形成。然而,存在不同的医学病症,其中希望软骨形成,然而,不希望骨组织形成。例如,明显的是,在关节缺陷的情况下,希望软骨形成而应避免骨化。
因此,本发明的目的是特异性地使用GDF-5相关蛋白的诱导软骨形成的作用并关闭骨形成的诱导作用。令人惊讶地,发现可能提供GDF-5相关蛋白的变体,其具有改善的诱导软骨形成的能力和降低的诱导骨形成的能力。这可以通过修饰GDF-5相关蛋白实现,使得所述GDF-5相关蛋白具有对BMPR-IB的升高的亲和力和/或对BMPR-IA的降低的亲和力。
野生型GDF-5在体外结合BMPR-IB,其亲和力与BMPR-IA(KD~1-1.1nM)相比高40至120倍(KD~8-27pM)。发现通过修饰GDF-5相关蛋白的结合亲和力使得对BMPR-IB的亲和力升高而对BMPR-IA的亲和力降低时,软骨形成被促进而骨形成降低。这可以通过特异性替换与GDF-5相关蛋白的氨基酸序列中的BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点相关的一个或多个氨基酸残基来实现。
将具有特异性替换的GDF-5相关蛋白的结合亲和力与人野生型GDF-5相关蛋白的结合亲和力进行比较,特别是与人野生型GDF-5的结合亲和力进行比较。
为了避免误解和歧义,本文中一些常用的术语定义并例示如下:
如本文使用的术语“胱氨酸结结构域”是指熟知的且保守的富半胱氨酸氨基酸区域,该区域存在于TGF-β超家族蛋白如人GDF-5的成熟部分中,并形成称为胱氨酸结的三维蛋白结构。在该结构域中,半胱氨酸残基与彼此的相应位置是重要的,并仅允许轻微变化以便于不失去生物活性。已证实单独的胱氨酸结结构域对于蛋白的生物功能是足够的(Schreuder等人.(2005),Biochem Biophys Res Commun.329,1076-86)。胱氨酸结结构域的共有序列在本领域中是熟知的。根据本文限定的定义,蛋白的胱氨酸结结构域以参与相应蛋白的胱氨酸结的第一个半胱氨酸残基开始,并且以接着参与相应蛋白的胱氨酸结的最后的半胱氨酸的残基结束。例如,人GDF-5前体蛋白(SEQ IDNO:2)的胱氨酸结结构域由氨基酸400-501组成(还参见图1)。
如本文使用的术语“GDF-5相关蛋白”是指任何天然存在的或人工创建的蛋白,其非常紧密地与人生长/分化因子5(hGDF-5)相关。所有GFD-5相关蛋白的共同特征是出现的胱氨酸结结构域与人GDF-5的102个氨基酸的胱氨酸结结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸400-501)具有至少60%的氨基酸一致性,这对于蛋白的生物功能是足够的。术语“GDF-5相关蛋白”包括属于来自脊椎动物或哺乳动物物种的GDF-5、GDF-6和GDF-7蛋白组以及其重组变体的蛋白,只要这些蛋白显示上述的与人GDF-5的胱氨酸结结构域的一致性百分比。60%的限值充分适于从另外的蛋白如更远相关的GDF和BMP中分离蛋白的GDF-5/-6/-7组的成员以及其变体。对人GDF-5、人GDF-6和人GDF-7的102个氨基酸的胱氨酸结结构域的比较(见图2)显示了这些蛋白之间的高度的氨基酸一致性。人GDF-6与人GDF-5的胱氨酸结结构域共享87个(85%)相同残基,且人GDF-7与人GDF-5的胱氨酸结结构域共享83个(81%)相同残基。目前已确定的来自其他脊椎动物和哺乳动物物种的GDF-5/-6/-7分子的相应结构域与人GDF-5相比时也显示至少75%(79%至99%)的非常高的一致性百分比。相反地,不属于GDF-5/-6/-7亚组的GDF和BMP显示60%以下的低得多的一致性。
在相关氨基酸序列中的相应氨基酸位置的确定以及一致性百分比的计算可以借助熟知的比对算法和任选地使用这些算法的计算机程序而容易地进行。例如,在该专利申请中的氨基酸一致性(即,图2)已经使用具有缺省参数的免费程序ClustalX(1.81版)通过比对序列进行计算,并手工进行随后的相同残基计数。双序列比对(缓慢-精确)的缺省设置为:空位开放参数:10.00;空位延伸参数0.10;蛋白权重矩阵:Gonnet250。ClustalX程序在Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Plewniak.F.,Jeanmougin.F.和Higgins.D.G.(1997):The ClustalX windows interface:flexible strategies for multiple sequencealignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Research24:4876-4882中详细描述。ClustalX是ClustalW多序列比对程序的视窗界面并且可得自各种来源,即通过来自ftp-igbmc.u-strasbg.fr、ftp.embl-heidelberg.de、ftp.ebi.ac.uk的匿名ftp或通过从以下网页下载:http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/。ClustalW程序和算法也在Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.(1994):CLUSTALW:improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting,positions-specific gap penalties andweight matrix choice.Nucleic Acids Research22:4673-4680中详细描述。尤其优选的GDF-5相关蛋白显示与人GDF-5的102个氨基酸的胱氨酸结结构域有至少70%、80%、90%或95%的氨基酸一致性。
脊椎动物和哺乳动物GDF-5相关蛋白的非限定性实例是人GDF-5的前体和成熟蛋白(在WO95/04819公开为MP52并且在Hotten等人.1994,Biochem.Biophys Res.Commun.204,646-652中公开为人GDF-5)、重组人(rh)GDF-5/MP52(W096/33215)、MP52Arg(WO97/06254);HMW人MP52(WO97/04095)、CDMP-1(WO96/14335)、小鼠(小家鼠(Mus musculus))GDF-5(US5,801,014)、兔(家兔(Oryctolagus cuniculus))GDF-5(Sanyal等人2000,Mol Biotechnol.16,203-210)、鸡(原鸡(Gallus gallus))GDF-5(NCBI登录号NP_989669)、非洲爪蟾(非洲爪蟾(Xenopus laevis))GDF-5(NCBI登录号AAT99303)、单体GDF-5(WO01/11041和WO99/61611)、人GDF-6/BMP-13(US5,658,882)、小鼠GDF-6(NCBI登录号NP_038554)、GDF-6/CDMP-2(WO96/14335)、人GDF-7/BMP-12(US5,658,882)、小鼠GDF-7(NCBI登录号AAP97721)、GDF-7/CDMP-3(WO96/143335)。本发明涵盖的还有具有另外的突变的GDF-5相关蛋白,所述突变如替换、添加和缺失,只要这些另外的突变不完全破坏生物蛋白活性。
本发明基于发明人的发现:可能通过涉及结合于BMPR-IB和/或BMPR-IA的GDF-5相关蛋白的氨基酸序列的区域中的特异性修饰来以这样的方式改变蛋白,使其具有诱导软骨形成的改进的能力和诱导骨形成的降低的能力。
已发现对BMPR-IB具有升高的亲和力的蛋白和/或对BMPR-IA具有降低的亲和力的蛋白更能够用于诱导软骨形成,同时降低骨形成。这些特性在显示对BMPR-IB的升高的亲和力和对BMPR-IA的降低的亲和力两者的蛋白中是尤其明显的。
本发明的GDF-5相关蛋白可以通过化学修饰或基因工程技术来获得,优选重组蛋白。蛋白可以通过替换GDF-5相关蛋白的氨基酸序列中的、涉及BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点的至少一个氨基酸残基来获得。特别地,优选替换与GDF-5相关蛋白的氨基酸序列中的BMPR-IB结合位点和/或BMPR-IA结合位点相关的一个、两个、三个或更多个氨基酸残基。
以上修饰可以引入任意已知的如上定义的GDF-5相关蛋白中。对于蛋白的治疗用途方面,优选由人GDF-5相关蛋白衍生蛋白,例如由人野生型GDF-5相关蛋白如GDF-5、GDF-6或GDF-7衍生蛋白。然而,本发明的蛋白还可以由具有另外的突变的GDF-5相关蛋白衍生,所述突变如替换、添加或删除,只要这些另外的突变不完全破坏生物蛋白活性。
如本文所定义的GDF-5相关蛋白包括与人GDF-5的102个氨基酸的胱氨酸结结构域具有至少60%,优选地至少75%,更优选地至少80%,更优选地至少90%和最优选地至少95%的氨基酸一致性的胱氨酸结结构域。
本发明的GDF-5相关蛋白与野生型相比,在涉及结合到BMPR-IB的区域和/或涉及结合到BMPR-IA的区域中优选地包括一个或多个氨基酸替换。涉及结合到BMPR-IA和/或BMPR-IB的GDF-5相关蛋白的区域在本领域是熟知的或可以使用在公知常识内的方法容易地确定。
参照GDF-5野生型的全长氨基酸序列,特别优选地将一个或多个以下氨基酸(单字母码)替换为任意不同的氨基酸:
R399;
F409至W417中的任一个,优选地M412、G413、W414和/或W417;
E434至M456中的任一个,优选地F435、P436、L437、R438、S439、H440、P443、N445、V448、I449、L452、M453、S455和/或M456;
S475;
I476;
F478;
K488至M493中的任一个,优选地K488、Y490和/或D492。
优选地,将氨基酸R399替换为V、L、I、M、F、Y、W、E或D。
优选地,将氨基酸M412替换为V、L、I、F、Y、W、H、K或R。
优选地,将氨基酸W414替换为R、K、F、Y、H、E或D。
优选地,将氨基酸W417替换为R、K、F、Y、H、E或D。
优选地,将氨基酸F435替换为V、L、I、M、P、Y、W、H、K或R。
优选地,将氨基酸P436替换为V、L、I、M、F、Y或W。
优选地,将氨基酸L437替换为D或E。
优选地,将氨基酸R438替换为K、D、H、N、M、E、Q、S、T、Y或W。
优选地,将氨基酸S439替换为K、D、E、H、R、M、T、N、Q、Y或W。
优选地,将氨基酸H440替换为V、I、M、F、Y、W、E或D。
优选地,将氨基酸P443替换为V、L、I、M、F、Y、W、A或S。
优选地,将氨基酸N445替换为D、Q、H、F、L、R、K、M、S、Y或W。
优选地,将氨基酸V448替换为F、L、I、M、P、Y或W。
优选地,将氨基酸I449替换为F、L、V、M、P、Y或W。
优选地,将氨基酸L452替换为F、I、V、M、P、Y或W。
优选地,将氨基酸M456替换为F、I、L、P、Y、W、S、T、N、Q、K或D。
优选地,将氨基酸S475替换为M、T、N、Q、Y或W。
优选地,将氨基酸K488替换为R、M、S、T、N、Q、Y或W。
优选地,将氨基酸Y490替换为E、H、K、R、Q、F、T、M、S、N、Q或W。
优选地,将氨基酸D492替换为G、E、M、S、T、N、Q、Y、W、H、K或R。
优选地,将氨基酸I476替换为G、A、V、L、M、F、Y或W。
优选地,将氨基酸F478替换为G、A、V、L、I、Y或W。
不同GDF-5相关蛋白的氨基酸序列中的相应位置可以容易地从关于野生型GDF-5的以上信息得到。
根据第一个实施方案,GDF-5相关蛋白的BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点中的至少一个疏水性氨基酸被亲水性或极性氨基酸替换。亲水性或极性氨基酸残基的实例为天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
根据第二个实施方案,GDF-5相关蛋白的BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点中的至少一个亲水性或极性氨基酸被疏水性氨基酸替换。疏水性氨基酸的实例为丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
根据另一个优选的实施方案,本发明的蛋白包括GDF-5相关蛋白的BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点中的至少一个氨基酸的保守替换。这意味着最初存在的氨基酸的性质被保留。因此,将一种亲水性或极性氨基酸替换为另一种亲水性或极性氨基酸或将一种疏水性氨基酸替换为另一种疏水性氨基酸。
优选地,以这样的方式选择保守替换,以使一种氨基酸被具有不同的空间要求的另一种氨基酸交换。根据本发明的该方面,疏水性氨基酸可以替换为更小的或更大的疏水性氨基酸或亲水性或极性氨基酸可以替换为更小的或更大的亲水性或极性氨基酸。
GDF-5相关蛋白中的氨基酸替换可以根据氨基酸性质分为4组:
I.碱性氨基酸残基(R、K、H),替换为
a)疏水性(V、L、I、M、P、F、Y、W)
b)酸性(E、D)
c)与I不同的碱性氨基酸残基(R、K、H)
d)极性(S、T、N、Q)。
II.酸性氨基酸残基(D),替换为
a)疏水性(M、Y、W、G)
b)酸性(E)
c)碱性(R、K、H)
d)极性(S、T、N、Q)
III.疏水性氨基酸残基(M、V、L、I、P、F、Y、W、A),替换为
a)与III不同的疏水性氨基酸残基(M、V、L、I、P、F、Y、W、G、A)
b)酸性(E、D)
c)碱性(R、K、H)
d)极性(S、T、N、Q)
d)小的(A)。
IV.极性氨基酸残基(S、T、N),替换为
a)疏水性(M、V、L、I、P、F、Y、W)
b)酸性(E、D)
c)碱性(R、K、H)
d)与IV不同的极性氨基酸残基(S、T、N、Q)
在优选的实施方案中,本发明的GDF-5相关蛋白包括与以下氨基酸序列之一匹配的序列:
a)
ZCX1X2KX3LHVX4ZZZZZZZZZX7IAPLX8YEAX9HCX10GX11CZZZZZZZZZZZZZ
ZZZZZZZZZZX13PX14X15X16PX17X18CCVPX19X20LX21PIZILX22X23DX24X25NNW
YZZZZZZWEX27CGCR或
b)
ZCX1X2KX3LHVX4FX5X6ZZZDDZX7IAPLX8YEAX9HCX10GX11CX12ZZZZZZLEZ
TZHAZZQTZZNZZX13PX14X15X16PX17X18CCVPX19X20LX21PIZILX22X23DX24X25N
NVVYZX26ZZZMWEX27CGCR
并且其中
每个X表示任意氨基酸,
每个Z表示任意氨基酸。
这些通用序列由脊椎动物GDF-5、GDF-6和GDF-7序列的胱氨酸结结构域比较进行编译。在经比对的蛋白中不保守的位置在通用序列中表示为X。根据本发明突变的位置表示为Z。
在一个更优选的实施方案中,本发明的GDF-5相关蛋白包括与上述通用氨基酸序列之一匹配的序列,并且其中
X1表示天冬酰胺(N)或丝氨酸(s)
X2表示精氨酸(R)或赖氨酸(K)
X3表示丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、脯氨酸(P)或丝氨酸(S)
X4表示精氨酸(R)或赖氨酸(K)
X5表示天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)
X6表示亮氨酸(L)或蛋氨酸(M)
X7表示异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)
X8表示天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)
X9表示组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)
X10表示天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)
X11表示亮氨酸(L)1蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)
X12表示天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)
X13表示丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)
X14表示精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)或丝氨酸(S)
X15表示丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)
X16表示丙氨酸(A)、蛋氨酸(M)或苏氨酸(T)
X17表示丙氨酸(A)或脯氨酸(P)
X18表示丝氨酸(S)或苏氨酸(T)
X19表示丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)
X20表示精氨酸(R)或赖氨酸(K)
X21表示丝氨酸(S)或苏氨酸(T)
X22表示苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)
X23表示异亮氨酸(I)或苏氨酸(T)
X24表示丙氨酸(A)或丝氨酸(S)
X25表示丙氨酸(A)或甘氨酸(G)
X26表示谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)
X27表示丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)并且
每个Z表示任意氨基酸。
在一个具体实施方案中,本发明的GDF-5相关蛋白衍生自野生型GDF-5。根据该具体方面,GDF-5相关蛋白包括与以下通用氨基酸序列之一匹配的序列
a)
ZCSRKALHVNZZZZZZZZZIIAPLEYEAFHCEGLCZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ
ZZZZDPESTPPTCCVPTRLSPIZILFIDSANNVVYZZZZZZWESCGCR
b)
ZCSRKALHVNFKDZZZDDZIIAPLEYEAFHCEGLCEZZZZZZLEZTZHAZZQT
ZZNZZDPESTPPTCCVPTRLSPIZILFIDSANNWYZQZZZMWESCGCR,
其中每个Z表示任意氨基酸。
如上所述的蛋白的实例是人GDF-5的变体,借以将位于第414位的色氨酸残基与精氨酸交换(W414R)。参照GDF-5(SEQ ID NO:4)的成熟序列,这相当于在第33位的替换。令人惊讶地,发现该蛋白变体具有对BMPR-IA的大大降低的亲和力。相反地,对BMPR-IB的亲和力几乎未受影响。还优选的是包含与W414R不同的氨基酸替换的GDF-5相关蛋白的其他变体。
所述GDF-5相关蛋白的变体的实例是人GDF-5的变体,借以将位于第449位的异亮氨酸残基与缬氨酸交换(I449V)。参照GDF-5(SEQ ID NO:4)的成熟序列,这相当于在第68位的替换。所述蛋白变体具有对BMPR-IA降低的亲和力和对BMPR-IB升高的亲和力。
另外的示例性的GDF-5相关蛋白的变体包括氨基酸替换R399E。参照GDF-5(SEQ ID NO:4)的成熟序列,这相当于在第18位的替换。所述蛋白变体具有对BMPR-IA降低的亲和力。
再另外的示例性的人GDF-5的变体为变体,借以将位于第439位的丝氨酸残基交换为谷氨酸(S439E)。参照GDF-5(SEQ ID NO:4)的成熟序列,这相当于在第58位的替换。所述蛋白变体也具有对BMPR-IA降低的亲和力。
另一个示例性的人GDF-5的变体为变体,借以将位于第399位的精氨酸残基交换为蛋氨酸(R399M)。参照GDF-5(SEQ ID NO:4)的成熟序列,这相当于在第18位的替换。所述蛋白变体具有对BMPR-IB大大升高的亲和力。
优选地,本发明的GDF-5相关蛋白作为“分离的”蛋白存在。这意味着本发明的蛋白基本上与存在于分离的蛋白的天然来源(例如,天然来源的蛋白的其他多肽)中的其他蛋白和肽分子分离。例如,认为重组表达的肽是分离的。根据本发明的优选的实施方案,GDF-5相关蛋白为重组蛋白。另外,如果肽已经通过人工介入改变或由不是其天然来源的有机体表达,也认为肽是分离的。此外,当通过重组技术制备时,“分离的”蛋白不含其天然相关的一些其他细胞物质或细胞培养介质,或当化学合成时,其不含化学前体或其他化学品。未纯化的混合物或组合物特别地不包括在“分离的”蛋白的定义中。
根据另一个实施方案,本发明涉及编码本发明的蛋白的核酸。核酸具有这样的序列,使得实现与相应的野生型GDF-5相关蛋白的BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点有关的一个或多个氨基酸残基的替换。编码这些氨基酸的碱基三联体和遗传密码的简并性(degeneracy)是通常已知的。核酸可以是DNA序列和/或RNA序列,只要根据本发明的蛋白在适合的***中表达时可以由该核酸获得。本发明的核酸可以是全合成或部分合成的。核酸包括单链的和/或全部或部分双链的多核苷酸序列。核酸可以通过任意手段制备,包括基因组制备、cDNA制备、体外合成、PCR、RT-PCR和/或体外或体内转录。
特别优选的是“分离的”核酸,其基本上与存在于核酸的天然来源中的核酸分子(例如,编码其他多肽的序列)分离。优选地,“分离的”核酸不含在其天然存在的复制子中的至少一些天然地位于核酸侧翼的序列(即,位于核酸的5'和3'末端的序列)。例如,认为克隆的核酸是分离的。如果核酸已经通过人工介入改变或放置在不是其天然侧的座位或位置或如果其被引入细胞中时,也认为核酸是分离的。此外,当通过重组技术制备时,分离的核酸可以不含其天然相关的一些其他细胞物质或培养介质,或当化学合成时,其不含化学前体或其他化学品。
在优选的方式中,本发明的核酸可以通过全基因合成或通过编码野生型或修饰的GDF-5相关蛋白的核酸的定点突变(side-directed mutagenesis)来制备。可以利用的方法包括模板定向连接、循环PCR、盒式突变、定点突变或本领域熟知的其他技术。
本发明的核酸可以包括另外的核酸序列,所述另外的核酸序列可以将另外的功能添加到本发明的分离的核酸。例如,这样的另外的核酸序列可以包括允许本发明的蛋白适当表达的核酸序列,并且可以包括启动子序列、调节序列、终止信号、复制起点等。技术人员充分意识到这样的功能性核酸序列并意识到如何对其进行排列以得到具有希望的特性的核酸分子。
表达载体是本发明的另外的主题,其中核酸***到适合的载体***中,所述载体***根据希望的蛋白表达进行选择。载体***可以是真核载体***但是优选地为原核载体***,借助所述载体***可以以特别容易和单纯的方式制备蛋白。适合的表达载体例如显示在WO96/33215中。表达载体还可以是病毒载体,所述病毒载体可以用于例如基因治疗方法中。
宿主细胞和转基因生物体也是本发明的主题。宿主细胞和转基因生物体的特征在于其含有根据本发明的核酸或表达载体,并且其能够使用存在于核酸和存在于表达载体中的信息,所述信息分别用于表达根据本发明的蛋白。因此,本发明涉及转基因生物体或细胞,所述转基因生物体或细胞短暂地或稳定地转化或转染有编码本发明的蛋白的至少一种核酸或至少一种载体,或本发明涉及这样的转基因生物体或细胞的后代。此外,本发明涉及本发明的细胞、细胞培养物、组织和/或转基因生物体的部分。应理解出于本发明的目的,术语“转基因生物体”不仅包括短暂地或稳定地引入的本发明的核酸的生物体,而且还指这样的生物体的后代,不论代距如何,只要这些生物体仍然包括本发明的核酸并表达本发明的蛋白。
优选地,转基因生物体或细胞具有原核或真核来源。优选地,转基因生物体为微生物。优选的微生物为细菌、酵母、藻类或真菌。适合的宿主细胞优选地为原核细胞,特别是大肠杆菌(E.coli)菌株。特别有用的宿主细胞是大肠杆菌W3110的防御体(defendant),例如在WO96/33215所显示的。在优选的实施方案中,宿主细胞,尤其是人源的宿主细胞,对于移植到需要其的患者中也可以是有用的。
转化的生物体或转化的细胞的制备需要将合适的DNA引入合适的宿主生物体或细胞中。多种方法可以用于该过程,所述过程称为转化。因此,以举例的方式,DNA可以通过微注射或通过使用DNA包被的微颗粒或纳米颗粒轰击来直接引入。细胞还可以化学透化,例如使用聚乙二醇进行化学透化,以使DNA可以通过扩散进入细胞。DNA还可以通过与其他含有DNA的单元进行原生质体融合来转化,所述其他含有DNA的单元如微细胞、细胞、溶酶体或脂质体。另一种用于引入DNA的适合的方法是电穿孔,其中细胞通过电脉冲可逆地透化。
本发明的另一个主题是用于制备蛋白的方法,所述蛋白具有改进的诱导软骨形成的能力和降低的诱导骨形成的能力,所述方法包括以下步骤:
(i)随机化涉及BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点的、GDF-5相关蛋白区域中的至少一个氨基酸位置,以获得蛋白变体,
(ii)在(i)中获得的蛋白变体就其对BMPR-IB和/或BMPR-IA的亲和力进行分析,
(iii)选择提供对BMPR-IB的增强的亲和力和/或对BMPR-IA的降低的亲和力的那些蛋白变体。
涉及与BMPR-IA或BMPR-IB结合的GDF-5相关蛋白的区域在本领域是已知的。在步骤(i)中,在一个或两个这些区域中的至少一个氨基酸位置被随机化。优选地随机化至少两个、三个或多个氨基酸位置。存在于GDF-5相关蛋白的野生型序列中的氨基酸通过化学修饰或优选地通过基因工程技术被其他氨基酸替换。用于制备步骤(i)的随机化的蛋白变体的方法包括蛋白的合成性从头合成和/或由编码其的核酸表达该蛋白。在特别优选的方式中,步骤(i)的蛋白变体通过使用相应的核酸表达来制备。
优选地,针对在相关位置的所有其他可能的氨基酸获得蛋白变体。然而,还可能的是仅具体地将一个或多个氨基酸替换为其他氨基酸。例如,亲水性氨基酸可以替换为疏水性氨基酸。供选择地,疏水性氨基酸可以替换为亲水性氨基酸。其中保留了亲水性或疏水性特性的保守替换也是可能的。通过替换,优选地实现具有另一种空间要求的氨基酸的交换。
随后,在步骤(i)中获得的多个蛋白变体就其对BMPR-IB和/或对BMPR-IA的亲和力进行分析。这可以以本技术领域中已知且常见的方式实现。用于评估蛋白-受体相互作用的方法是习惯做法。
在步骤(iii)中,选择那些提供对BMPR-IB升高的亲和力和/或对BMPR-IA降低的亲和力的蛋白变体。出人意料地发现这些具体蛋白具有改善的诱导软骨形成的能力和降低的诱导骨形成的能力。
本发明的另一个主题涉及针对本发明的GDF-5相关蛋白的抗体。这些抗体对于要求保护的重组GDF-5相关蛋白具有特异性。优选地,所述抗体对于含有一个或多个本文所述的氨基酸替换的GDF-5相关蛋白的区域具有特异性。优选地,所述抗体对源自与BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点相关的GDF-5相关蛋白的重组蛋白的区域具有特异性。根据本发明的这些抗体可以通过使用通过已知方法生成抗体的如上所述的本发明的那些蛋白片段作为免疫原生成。抗体可以是单克隆的或多克隆的并且其可以是任何同种型。还包括抗体片段如Fab片段或Fab2片段。抗体也可以是人源化抗体或基因工程抗体等。
本发明的抗体尤其是适合用作分析工具。所述抗体可以用于研究根据本发明的蛋白在体内的吸收和分布。此外,以上抗体适用于研究释放动力学。
本申请的另外的主题是包含根据本发明的重组GDF-5相关蛋白或核酸或载体或宿主细胞的药物组合物。原则上,任何具有GDF-5相关蛋白的、已公布的药物组合物是适合的。可以认为表达载体或宿主细胞在药物组合物中作为活性物质是有利的。根据本发明的蛋白与其他蛋白的组合物也可以用于优选的药物组合物中。当然,本发明还包括含有另外的物质的药物组合物,所述另外的物质如药理学上可接受的添加剂或载体。制剂可以包括抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲剂、递送溶媒、赋形剂和/或药物佐剂。例如,适合的载体或溶媒可以是注射用水、生理盐溶液或与适合的载体蛋白如血清白蛋白混合的盐溶液。用于制备本发明的组合物的优选的抗氧化剂为抗坏血酸。
药物组合物的溶剂或稀释剂可以是水性或非水性的,并且可以包含其他药学上可接受的赋形剂,所述赋形剂能够改变和/或保持制剂的pH、渗透性、粘度、澄清度、比例(scale)、无菌度、稳定性、溶出率或气味。类似地,其他组分可以包括在本发明的药物组合物中以改变和/或保持药学上有效的物质的释放速率。这样的改变组分是本领域通常采用的物质,以配制以单位剂量形式或多剂量形式的用于肠胃外给药的剂量。
根据本发明制备的最终配制的药物组合物可以以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干的粉末的形式储存在无菌的小瓶中。这些制剂可以以随时可用的形式或以需要在给药前复溶的形式(例如,在冻干粉末的情况下)储存。以上和另外的适合的药物制剂在本领域是已知的,并描述于例如Gus Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed.,Mack Publishing Co.,Eastern,Pa.,1990,1435-1712)中。这样的制剂可以影响药学上有效组分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
其他有效的给药形式包括肠胃外缓释(即延迟)制剂、吸入雾或口服活性制剂。例如,缓释制剂可以包括结合于或加入到聚合物(如聚乳酸、聚乙醇酸等)或脂质体的微粒制剂的蛋白。
根据本发明的药物组合物还可以配制成用于肠胃外给药,例如通过输注或注射,并且还可以包括缓释或持续循环制剂。这样的肠胃外给药的治疗组合物通常为无致热原的肠胃外可接受的水溶液的形式,其包含在药学上可接受的载体和/或稀释剂中的药学上有效的组分(或多种组分)。
药物组合物可以包含基质材料,例如在意在使软骨再生的情况中。当施加在生物相容的基质材料中和/或基质材料上时,对于蛋白、核酸、表达载体或宿主细胞是有利的。如本文使用的基质材料是指充当细胞募集、附着、增殖和分化的骨架和/或充当本发明的重组GDF-5相关蛋白的潜在递送和储存装置的载体或基质。与固体基质相反,载体由不具有限定的表面且缺乏具体形状的无定型材料组成,即,烷基纤维素、普朗尼克、明胶、聚乙二醇、糊精、植物油、糖和其他液体和粘性物质。
示例性的基质材料例如描述于WO98/21972中。这些基质材料同样地适用于根据本发明的蛋白。基质材料可以例如用手术方法移植到患者体内,其中蛋白或编码所述蛋白的DNA可以缓慢地从基质材料中释放并随后在较长的一段时间内有效。根据本发明的所有类型的基质材料是有用的,只要其是生物相容的并且选择用于预期的使用区域或适应症。基质材料可以是天然材料、经修饰的天然材料以及合成材料。包括所有已知的用于形态发生蛋白的基质。细胞外基质包括例如多种胶原,例如I、II、V、IX、X、XI和XIII型;另外的蛋白聚糖和葡萄糖胺聚糖,例如硫酸软骨素、双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和/或透明质酸;或非胶原蛋白,例如骨桥蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和软骨基质蛋白。所有提及的天然材料也可以以人工修饰的形式使用。对于有用的载体和基质的非限定性实例,进一步参见Kirker-Head,2000,Advanced Drug Delivery43,65-92。
本发明的另外的主题涉及包含根据本发明的重组GDF-5相关蛋白的脂质体制剂。用于所述制剂中的脂质体对于本领域技术人员是公知的。特别地,优选的脂质体制剂公开于WO2008/049588。更优选的脂质体制剂描述于WO2008/049588的第9至13页。
此外,本发明的GDF-5相关蛋白可以与其他药学活性物质组合给药。所述药学活性物质可以是例如,止痛药,如局部有效的止痛药;或对其中希望软骨形成的疾病具有正效应的其他物质,如蛋白酶抑制剂。这些仅为可能的添加剂的实例,本领域技术工作者可以容易地加入用于药物制剂或通常认为安全的其他赋形剂。
由于其改进的诱导软骨形成的能力,本发明的重组GDF-5相关蛋白特别适用于疾病的治疗,其中希望软骨形成但不希望骨形成。因此,本发明的另一个方面是本发明的蛋白、核酸、载体或宿主细胞在治疗这些疾病中的用途。特别地,本发明的蛋白、核酸、载体或宿主细胞用于治疗软骨缺损或用于治疗软骨的创伤性破裂或脱落,特别是年龄相关性软骨缺损,例如由于磨损、骨关节炎、类风湿性关节炎、运动相关损伤引起的年龄相关性软骨缺损;可以影响软骨的疾病,如软骨营养不良;特征在于干扰软骨的生长和随后的骨化的疾病;软骨发育不全;肋软骨炎;椎间盘突出和椎间盘修复;复发性多软骨炎;与良性或恶性肿瘤相关的软骨缺损修复,所述肿瘤如软骨瘤或软骨肉瘤。
本发明的另一个实施方案是用于治疗疾病的方法,其中希望软骨形成但不希望骨形成,所述方法包括给予需要这样的治疗的患者根据本发明的蛋白、核酸、载体或宿主细胞的步骤。
如本文所使用,术语“治疗”是指逆转、减轻或抑制疾病、障碍或病症或该术语适用的这样的疾病、障碍或病症的一种或多种症状的进展。如本文所使用,治疗还可以指与未经治疗的对照群体相比或与治疗前的相同哺乳动物相比,降低哺乳动物的疾病、障碍或病症的发生的可能性或发病率。例如,如本文所使用,治疗可以指预防疾病、障碍或病症,并且可以包括延迟或预防疾病、障碍或病症的发作,或延迟或预防与疾病、障碍或病症相关的症状。如本文所使用,治疗还可以指在哺乳动物患上疾病、障碍或病症之前降低疾病、障碍或病症或与这样的疾病、障碍或病症相关的症状的严重程度。在患病之前的这样的预防或降低疾病、障碍或病症的严重程度涉及给予受试者如本文所述的本发明的组合物,所述受试者不是在给予时患上所述疾病、障碍或病症的。如本文所使用,治疗还可以指预防疾病、障碍或病症或与这样的疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状的复发。
以下实施例与附图和序列方案一起意在进一步说明本发明。
SEQ ID NO:1显示人GDF-5前体的DNA序列,而SEQ ID NO:2显示人GDF-5前体的蛋白序列。
SEQ ID NO:3显示人成熟单体GDF-5的DNA序列,而SEQ ID NO:4显示人成熟单体GDF-5的蛋白序列。
附图
图1显示根据SEQ ID NO:2的人GDF-5前体蛋白的另外的特征:
氨基酸001-381前原结构域(pre-prodomain)(黑体字母)
氨基酸001-027信号肽(黑体和下划线)
氨基酸382-501成熟蛋白部分
氨基酸400-501胱氨酸结结构域(下划线)
图2显示了人GDF-5(SEQ ID NO:2)、人GDF-6(来自第5,658,882号美国专利的序列)和人GDF-7(来自第5,658,882号美国专利的序列2)的102个氨基酸的胱氨酸结结构域的比较。在所有三个分子中均相同的氨基酸残基通过边框突出显示。
图3显示使用重组人GDF-5突变体W414R的碱性磷酸酶分析(ALP)的结果(如实施例2中所述)。
图4显示重组人GDF-5突变体I449V的碱性磷酸酶分析(ALP)的结果(如实施例3中所述)。
图5显示重组人GDF-5突变体R399E的碱性磷酸酶分析(ALP)的结果(如实施例3中所述)。
图6显示重组人GDF-5突变体S439E的碱性磷酸酶分析(ALP)的结果(如实施例3中所述)。
图7显示重组人GDF-5突变体R399M的碱性磷酸酶分析(ALP)的结果(如实施例3中所述)。
图8显示重组人GDF-5突变体W414R的碱性磷酸酶分析(ALP)的结果(如实施例3中所述)。
实施例1:GDF相关蛋白的产生、表达和纯化
通过RT-PCR技术将编码人GDF-5、人GDF-6和人GDF-7蛋白的成熟部分的DNA从人ROB-C26骨先质细胞中分离(Yamaguchi等人.1991,Calcif.Tissue Int.49,221-225)并随后连接于原核质粒载体中。为了确定GDF-5、-6和-7的成熟部分的功能上重要的氨基酸残基,通过定点突变将各种单一突变引入这些序列中。
通过根据制造商的使用说明书,使用QuickChangeTM定点突变试剂盒产生所有单个突变,其中PfuTurboTm DNA聚合酶和DPN1核酸内切酶来自Stratagene。
使用经质粒转化并经IPTG诱导的细菌菌株W3110BP,在内含体中表达蛋白。根据标准程序,使用匀浆缓冲液(25mM Tris HCI pH7.3,10mM EDTANaOH pH8,8M Urea)和洗涤缓冲液(1M尿素,20mM Tris HCI,pH8.3,10mM EDTA NaOH pH8.0)分离这些内含体。在反相柱Aquapore Octyl(AppliedBiosys,(CV=7,8ml)100x10,20μ,No186470)上,在104分钟内(流速:3ml/min),使用梯度为从100%的洗脱剂A(0.1%TFA,HPLC H2O)到100%的洗脱剂B(0.1%TFA,90%CH3N,HPLC H2O)进行进一步纯化。蛋白质印迹(western blot)对照后,汇集并冻干含有突变蛋白的馏分。
将突变蛋白溶于溶解缓冲液(6M盐酸胍,50m M Tris,150mM NaCl,3mM DTT,pH=8.0)中,将蛋白浓度精确调节到2.6mg/ml并将pH调节到8至9。在室温下孵育2小时后,在温和搅拌下加入复性(refolding)缓冲液(1M NaCl,50mM Tris,5mM EDTA,1mM GSSG,2mM GSH,33mM Chaps,pH=9.5)以达到0.16mg/ml的终浓度。
随后将溶液在22℃下孵育48h并通过加入18%HCl将pH改变为3-4来终止复性。离心后,通过在相同条件下进行第二次RP-HPLC将未复性的单体与二聚体形式分离。汇集含有二聚化蛋白的馏分,冻干并在-70℃下储存。
实施例2:通过ALP分析在体外测量GDF相关蛋白的不同变体的生物
活性
2.0x105个C2C12-lb细胞(稳定过表达BMPR-IB受体的细胞系)和C2C12细胞在37℃、5%CO2、H2O-饱和下在20ml细胞培养基(α-MEM,青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,10%FCS)中孵育3-4天。随后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤细胞,胰蛋白酶处理并重悬于培养基中,达到3x104个细胞/ml的密度。将150μl转移到96孔培养板的每个孔中并在37℃、5%CO2、H2O-饱和下孵育24h。使用培养基洗涤后,将孔充满120μl新培养基。加入40μl不同稀释度的突变蛋白或野生型蛋白(溶于10mM HCl并用培养基稀释至少250倍),接着在37℃、5%CO2、H2O-饱和下进行另一个孵育步骤72h。使用PBS洗涤后,加入150μl裂解液(0.2%Nonidet P40,0.2g MgCl2x6H2O,使用水调节至1000ml),接着在37℃、5%CO2、H2O-饱和下孵育15-18h。之后,将每个孔的50μl转移到新的96孔板。然后将50μl的底物溶液(2.5x浓缩的二乙醇胺底物缓冲液+148g/l PNPP(对硝基苯基磷酸钠))加到每个孔中,并在37℃、5%CO2、H2O-饱和下孵育板4min。后来使用100μl的30g/l NaOH终止ALP反应,并最终在考虑到空白值扣除的情况下使用自动酶标仪在405nm测量光密度。
作为实例,关于C2C12-lb细胞的hGDF-5突变体W414R的结果(2个独立实验的平均值)显示在图3中。五种不同的蛋白浓度(14ng/mL、44.5ng/mL、133.2ng/mL、400ng/mL和1200ng/mL)用于该分析中。突变蛋白W414R在过表达BMPR-IB受体的细胞中(C2C12-lb细胞)显示生物活性,表明W414R的BMPR-IB结合位点是功能活性的。野生型蛋白(rhGDF-5)在分析***中充当对照。
细胞系C2C12和C2C12-lb的另外的hGDF-5突变体的生物活性的另外的结果显示于表1中。
实施例3:通过ALP分析在体外测量GDF相关蛋白的不同变体的生物
活性
5x105个ATDC-5细胞和5x105个MCHT1/26细胞在37℃、5%CO2、H2O-饱和下在20ml细胞培养基(α-MEM,2mM L-谷氨酰胺,10%FCS,对于MCHT1/26;DMEM/F12(1:1),5%FCS)中孵育3-4天。随后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤细胞,胰蛋白酶处理并重悬于培养基中,达到3x104个细胞/ml的密度。将150μl转移到96孔培养板的每个孔中并在37℃、5%CO2、H2O-饱和下孵育24h。使用培养基洗涤后,对于MCHT1/26,将孔充满120μl新培养基,对于ATDC-5充满120μl分析培养基(DMEM/F12(1:1),0.5%FCS)。加入40μl不同稀释度的突变蛋白或野生型蛋白(溶于10mM HCl并用培养基稀释至少250倍),接着在37℃、5%CO2、H2O-饱和下进行另一个孵育步骤72h。使用PBS洗涤后,加入150μl裂解液(MCHT1/26裂解液:0.2%Nonidet P40,1mM MgCI2;ATDC-5裂解液:100mM甘氨酸钠,1%Nonidet P40,1mM MgCl2),接着在37℃、5%CO2、H2O-饱和下对ATDC-5孵育1h并且对MCHT1/26孵育15-18h。随后将每个孔的50μl转移到新的96孔板。然后将50μl的底物溶液(2.5x浓缩的二乙醇胺底物缓冲液+148g/lPNPP(对硝基苯基磷酸钠))加到每个孔中,并在37℃、5%CO2、H2O-饱和下再孵育板60min。后来使用100μl的30g/l NaOH终止ALP反应,并最终在考虑到空白值扣除的情况下使用自动酶标仪在405nm测量光密度。
关于hGDF-5突变体I449V、R399E、S439E、R399M、W414R的示例性结果(2个独立实验的平均值)分别显示在图4-8中。五种不同的蛋白浓度(14.8ng/ml、44.5ng/ml、133.2ng/ml、400ng/ml、1200ng/ml)用于该分析中。
与野生型GDF-5相比,突变蛋白在该分析***中显示对ATDC-5细胞比对MCHT1/26细胞具有更高的生物活性。
实施例4:GDF-5相关蛋白的Biacore亲和力测量
BiacoreT100***(Biacore,GE Healthcare,Chalfont St.Giles,GB)用于所有生物传感器实验。将BMPR-IB、BMPR-IA或BMPR-II的Fc-融合蛋白受体胞外域的约200个共振单位(RU)固定化到蛋白G CM5生物传感器芯片上。在30℃下,在10mM HEPES(pH7.4)、300mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005%吐温20中以60μl/min的流速记录相互作用传感图。使用0.05至100nM的配体浓度一式两份地进行实验。使用BIAevaluation v.2.2.4(Biacore,GEHealthcare,Chalfont St.Giles,GB)获得所有明显结合亲和力。通过将动力学数据拟合成1:1Langmuir结合模型(KD(kin))中推导出配体I型受体相互作用的亲和力。由于结合动力学过快(超过106M-1s-1(对于kon)和10-2s-1(对于koff)),对配体:BMPR-11相互作用的明显结合亲和力由平衡结合的剂量依赖性(KD(eq))确定。
对于人GDF-5的不同变体的Biacore亲和力测量的结果显示于表1中。
*=关于GDF-5野生型的亲和力测量1的结果,对BMPR-IA的亲和力:1nM,时BMPR-IB的亲和力:8pM
**=关于GDF-5野生型的亲和力测量2的结果,对BMPR-IA的亲和力:1.1nM,对BMPR-IB的亲和力:27pM
0=无ALP活性
+至+++++=ALP活性,数字+代表ALP活性的强度
n.d:未测定
Claims (14)
1.一种GDF-5相关蛋白,其具有改善的诱导软骨形成的能力和降低的诱导骨形成的能力,其中所述蛋白具有对BMP受体IB(BMPR-IB)增加的亲和力和/或对BMP受体IA(BMPR-IA)降低的亲和力。
2.根据权利要求1所述的蛋白,其中所述蛋白通过替换GDF-5相关蛋白的氨基酸序列中的、涉及BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点的至少一个氨基酸残基来获得,优选地通过基因工程技术获得。
3.根据权利要求2所述的蛋白,其中所述蛋白源自人野生型GDF-5相关蛋白,特别是源自人GDF-5、GDF-6或GDF-7。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白,其中将GDF-5相关蛋白的BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点中的至少一个疏水性氨基酸替换为亲水性或极性氨基酸。
5.根据权利要求4所述的蛋白,其中所述亲水性氨基酸残基或极性氨基酸残基选自:天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白,其中将GDF-5相关蛋白的BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点中的至少一个亲水性或极性氨基酸替换为疏水性氨基酸。
7.根据权利要求6所述的蛋白,其中所述疏水性氨基酸残基选自:丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白,其包括GDF-5相关蛋白的BMPR-IB和/或BMPR-IA结合位点中的至少一个氨基酸的保守替换,
特别地,其中疏水性氨基酸被更小的或更大的疏水性氨基酸替换,或其中亲水性或极性氨基酸被更小的或更大的亲水性或极性氨基酸替换。
9.一种核酸,其编码根据权利要求1至8中任一项所述的蛋白。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的蛋白或根据权利要求9所述的核酸在疾病治疗中的用途,其中希望软骨形成而不希望骨形成。
11.用于根据权利要求10所述的用途的蛋白或核酸,其用于治疗软骨缺损或用于治疗软骨的创伤性破裂或脱落,特别是年龄相关性软骨缺损,例如由于磨损、骨关节炎、类风湿性关节炎、运动相关损伤引起的年龄相关性软骨缺损;可以影响软骨的疾病,如软骨营养不良;特征在于干扰软骨的生长和随后的骨化的疾病;软骨发育不全;肋软骨炎;椎间盘突出和椎间盘修复;复发性多软骨炎;与良性或恶性肿瘤相关的软骨缺损修复,所述肿瘤如软骨瘤或软骨肉瘤。
12.一种药物组合物,其包含:根据权利要求1至8中任一项所述的蛋白、根据权利要求9所述的核酸、包含权利要求9所述的核酸的载体或包含权利要求9所述的核酸作为活性剂的宿主细胞,任选地所述蛋白、核酸、载体或宿主细胞与药学上可接受的添加剂或载体组合。
13.用于制备根据权利要求1至8中任一项所述的GDF-5相关蛋白的方法,其包括以下步骤:
(i)使与BMP受体IB和/或BMP受体IA结合位点相关的GDF-5相关蛋白的区域中的至少一个氨基酸位置随机化,以获得蛋白变体,
(ii)对在(i)中获得的蛋白变体就其对BMP受体IB和/或BMP受体5IA的亲和力进行分析,
(iii)选择提供对BMP受体IB(BMPR-IB)的增强的亲和力和/或对BMP受体IA(BMPR-IA)的降低的亲和力的那些蛋白变体。
14.一种抗体,其针对根据权利要求1至8中任一项所述的蛋白。
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