ES2630853T3

ES2630853T3 - Mutante de GDF-5 para inducir la formación de cartílago

Info

Publication number: ES2630853T3
Application number: ES12795011.1T
Authority: ES
Inventors: Frank PLÖGER; Florian Wagner
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2017-08-24
Anticipated expiration: 2032-12-05
Also published as: CN104039820B; EA201491119A1; RS58253B1; SI2788374T1; HRP20190160T8; WO2013083649A1; CA2856458C; MX2014006465A; EP2788374A1; ES2708675T3; DK3168230T3; EP2788374B1; PL3168230T3; HUE042191T2; KR20140100969A; EP3168230A1; EP3168230B1; TR201901263T4; US9718867B2; JP2015504649A

Abstract

Proteína variante de GDF-5 humano maduro representada por los aminoácidos 382 - 501 de SEQ ID Nº: 2 y que comprende una sustitución de aminoácido, seleccionada del grupo que consiste en R399E, W417F y W417R.

Description

Mutante de GDF-5 para inducir la formación de cartílago

La presente invención se dirige a proteínas relacionadas con GDF-5 que tienen una capacidad mejorada para inducir la formación de cartílago y una capacidad reducida para inducir la formación de hueso. Las nuevas proteínas son particularmente útiles en el tratamiento de defectos del cartílago, en los que la formación de hueso no es deseable.

Las articulaciones sinoviales son esenciales para la función biomecánica del esqueleto. Una función incorrecta como la observada en enfermedades artríticas da como resultado directamente una pérdida grave de calidad de vida. Por lo tanto, la biología de las articulaciones ha estado en el foco de una investigación intensiva durante años que ha conducido a una comprensión de la anatomía y la histología de las articulaciones así como las propiedades biomecánicas y los papeles del cartílago y otros componentes en la función y el mantenimiento de las articulaciones.

GDF-5 (Hötten y cols. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652) es un morfogén que se ha observado que promueve la proliferación celular, la diferenciación y/o la formación tisular en varios tejidos. La proteína también se conoce como proteína morfogénica MP52, proteína morfogenética ósea-14 (BMP-14) o proteína morfogenética derivada del cartílago-1 (CDMP-1). GDF-5 muestra actividad condrogénica y las mutaciones congénitas de GDF-5 provocan defectos en articulaciones de los dedos, las muñecas y los tobillos en ratones y seres humanos (Storm y cols., 1994; Thomas y cols., 1997). La expresión de GDF-5 está sorprendentemente limitada a regiones en las que se desarrollarán articulaciones y es uno de los marcadores iniciales de la formación de articulaciones (Storm y Kingsley, 1999). Se requiere la señalización del receptor de BMP para el mantenimiento posnatal del cartílago articular (Rountree, 2004, PLoS Biol. noviembre de 2004, 2(11))

El GDF-5 está estrechamente relacionado con GDF-6 y GDF-7. Estas tres proteínas forman un subgrupo distinto de la superfamilia TGF-ß, presentando así propiedades biológicas comparables y un grado extraordinariamente alto de identidad de secuencia de aminoácidos (véase, por ejemplo, Wolfman y cols. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330). Todos los miembros de la familia son sintetizados inicialmente como proteínas precursoras mayores que posteriormente sufren escisión proteolítica en una acumulación de residuos básicos de aproximadamente 110-140 aminoácidos desde el extremo C, liberando así las partes de proteína madura C-terminales del prodominio Nterminal. Los polipéptidos maduros están estructuralmente relacionados y contienen un dominio bioactivo conservado que comprende seis o siete residuos de cisteína canónicos que es responsable del motivo de “nudo de cistina” tridimensional característico de estas proteínas. Las proteínas relacionadas con GDF-5 naturales son moléculas homodímeras y actúan principalmente a través de la interacción con complejos receptores específicos que están compuestos por serina/treonina cinasas receptoras tipo I y tipo II. Posteriormente, las cinasas receptoras activan proteínas Smad, que a continuación propagan las señales hacia el núcleo para regular la expresión génica diana.

Se ha demostrado repetidamente que miembros del subgrupo GDF-5/-6/-7 son inductores y reguladores primordialmente importantes del hueso y el cartílago (Cheng y cols. 2003, J. Bone & Joint Surg. 85A, 1544-1552; Settle y cols. 2003, Developm. Biol. 254, 116-130). GDF-5 y las proteínas relacionadas se unen a y oligomerizan dos tipos de receptores de serina-treonina cinasa unidos a la membrana denominados tipo I y II. Durante la unión a ligandos, estos complejos transducen señales mediante miembros fosforilantes de la familia SMAD de factores de transcripción, que al activarse entran en el núcleo y regulan la transcripción de genes sensibles (Massague, 1996). Experimentos recientes han implicado a dos receptores de tipo I diferentes en el modelado esquelético, BMPR-IA y BMPR-IB. Ambos receptores se expresan en patrones dinámicos durante el desarrollo normal. En varias estructuras límbicas, por ejemplo, en interzonas articulares y el pericondrio, se observa una expresión solapada de BMPR-IA y BMPR-IB (Mishina y cols., 1995; Zou y cols, 1997; Baur y cols, 2000). Con respecto a los patrones de expresión de BMPR-IA y BMPR-IB, la transducción de señales de GDF-5 debe ser efectuada por la interacción tanto con BMPR-IA como con BMPR-IB (Chang y cols., 1994; Zou y cols., 1997). Las mutaciones completas en el gen bmpr-1 b producen ratones viables con defectos en la formación de huesos y articulaciones que se asemejan mucho a los observados en ratones que carecen de GDF-5 (Storm y Kingsley, 1996; Yi y cols, 2000), mientras que se sabe que los ratones bmpr-Ia/ mueren tempranamente en la embriogénesis (Mishina y cols, 1995). Sin embargo, una inactivación condicional de BMPR-IA bajo el control de un conductor GDF-5-Cre sortea la letalidad embrionaria y produce ratones viables que formaban normalmente articulaciones. Pero, después del nacimiento, el cartílago articular dentro de las articulaciones se desgasta en un proceso reminiscente de la osteoartritis, que apunta a la importancia de este receptor en la homeostasis y la reparación del cartílago (Rountree y cols., 2004).

La actividad de las proteínas silvestres de la familia de proteínas relacionadas con GDF-5 generalmente da como resultado la formación de cartílago y hueso. Sin embargo, existen diferentes afecciones médicas en las que es deseable una formación de cartílago, sin embargo, la formación de tejido óseo no se desea. Por ejemplo, es evidente que en caso de defectos articulares, la formación de cartílago es deseable mientras que se debe evitar la osificación.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es usar específicamente el efecto de inducción de formación de cartílago de proteínas relacionadas con GDF-5 y cortar el efecto inductor de la formación de hueso. Este objetivo se

resolvió al proporcionar proteínas variantes de GDF-5 humano maduro como las representadas por los aminoácidos 382 a 501 de SEQ ID Nº: 2 que comprende una sustitución de aminoácido seleccionada de R399E, W417F y W417R. Sorprendentemente, se encontró que es posible proporcionar variantes de proteínas relacionadas con GDF5 que tengan una capacidad mejorada para inducir la formación de cartílago y una capacidad reducida para inducir la formación de hueso. Esto se puede conseguir al modificar proteínas relacionadas con GDF-5 de modo que tengan una afinidad incrementada para el BMPR-IB y/o una afinidad reducida para el BMPR-IA.

GDF-5 silvestre se une a BMPR-IB in vitro con aproximadamente de 40 a 120 veces más afinidad (KD � 8-27 pM) en comparación con BMPR-IA (KD � 1-1,1 nM). Se encontró que al modificar la afinidad de unión de proteínas relacionadas con GDF-5 de modo que la afinidad para BMPR-IB se incremente mientras se reduce la afinidad para BMPR-IA, se facilita la formación de cartílago mientras se reduce la formación de hueso. Esto se puede conseguir mediante sustituciones específicas de uno o más residuos de aminoácido con relación a un sitio de unión a BMPR-IB y/o BMPR-IA en la secuencia de aminoácidos de una proteína relacionada con GDF-5.

La afinidad de unión de proteínas relacionadas con GDF-5 que tienen sustituciones específicas se compara con la afinidad de unión de un proteína relacionada con GDF-5 silvestre humana, en particular GDF-5 silvestre humano.

A fin de evitar malentendidos y ambigüedades, algunos términos usados frecuentemente en la presente se definen y ejemplifican como sigue:

El termino "dominio de nudo de cistina", según se usa en la presente, significa la región de aminoácidos rica en cisteína bien conocida y conservada que está presente en las partes maduras de proteínas de las superfamilia de TGF-ß tales como, p. ej., GDF-5 humano y forma una estructura proteínica tridimensional conocida como nudo de cistina. En este dominio, la localización respectiva de los residuos de cisteína entre sí es importante y solo se deja variar ligeramente a fin de no perder la actividad biológica. Se ha demostrado que el dominio de nudo de cistina es suficiente para la función biológica de la proteína (Schreuder y cols. (2005), Biochem Biophys Res Commun. 329, 1076-86). Secuencias de consenso para dominios de nudo de cistina son muy conocidas en el estado de la especialidad. Según la definición definida en la presente, el dominio de nudo de cistina de una proteína empieza con el primer residuo de cisteína que participa en el nudo de cistina de la proteína respectiva y termina con el residuo que sigue a la última cisteína que participa en el nudo de cistina de la proteína respectiva. Por ejemplo, el dominio de nudo de cistina de la proteína precursora de GDF-5 humano (SEQ ID Nº: 2) consiste en los aminoácidos 400-501 (véase también la FIG. 1).

El término "proteína relacionada con GDF-5" según se usa en la presente significa cualquier proteína presente en la naturaleza o creada artificialmente que esté muy estrechamente relacionada con el factor de crecimiento/diferenciación 5 humano (hGDF-5). Una característica común de todas las proteínas relacionadas con GDF-5 es la presencia de un dominio de nudo de cistina con una identidad de aminoácidos de al menos 60% con el dominio de nudo de cistina de 102 aa de GDF-5 humano (aminoácidos 400-501 of SEQ ID Nº: 2), que es suficiente para la función biológica de la proteína. El término "proteínas relacionadas con GDF-5" incluye proteínas pertenecientes al grupo de proteínas de GDF-5, GDF-6 y GDF-7 procedentes de especies de vertebrados o mamíferos así como variantes recombinantes de las mismas con tal de que estas proteínas muestren el porcentaje de identidad susodicho con el dominio de nudo de cistina de GDF-5 humano. El valor limitativo de 60% es muy adecuado para separar miembros del grupo GDF-5/-6/-7 de proteínas así como variantes de los mismos de proteínas adicionales tales como GDF y BMP relacionados más distantemente. Una comparación de los dominio de nudo de cistina de 102 aa de GDF-5 humano, GDF-6 humano y GDF-7 humano (véase la FIG. 2) revela el ato grado de identidad de aminoácidos entre estas proteínas. El GDF-6 humano comparte 87 (85%) y el GDF-7 humano comparte 83 (81%) residuos idénticos con el dominio de nudo de cistina de GDF-5 humano. Los dominios respectivos de moléculas de GDF-5/-6/-7 procedentes de otras especies de vertebrados y mamíferos que se han identificado hasta ahora también muestran porcentajes de identidad muy altos de al menos 75% (entre 79% y 99%), en comparación con GDF-5 humano. En contraste, los GDF y BMP que no pertenecen al subgrupo GDF-5/-6/-7 presentan valores de identidad muy inferiores por debajo de 60%.

La determinación de posiciones de aminoácidos correspondientes en secuencias de aminoácidos relacionadas así como el cálculo de los porcentajes de identidad se pueden realizar fácilmente con la ayuda de algoritmos de alineamiento estándar y opcionalmente programas informáticos que usan estos algoritmos. Por ejemplo, las identidades de aminoácidos en esta solicitud de patente (es decir, la FIG. 2) se han calculado al alinear secuencias con el programa gratuito ClustalX (Versión 1.81) con parámetros por defecto y el recuento posterior de residuos idénticos a mano. Los ajustes por defecto para el alineamiento por pares (baja exactitud) son: parámetro de apertura de huecos: 10,00; parámetro de extensión de huecos 0,10; Matriz de peso de proteínas: Gonnet 250. El programa ClustalX se describe con detalle en Thompson, J. D., Gibson, T.J., Plewniak. F., Jeanmougin.F. y Higgins.D.G. (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24:4876-4882. ClustalX es una interfaz de Windows para el programa de alineamiento de múltiples secuencias ClustalW y esta disponible, p. ej., de diversas fuentes, es decir mediante un ftp anónimo de ftp-igbmc.u-strasbg.fr, ftp.embl-heidelberg.de, ftp.ebi.ac.uk o a través de descarga desde la siguiente página de Internet: http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/. El programa y el algoritmo ClustalW también se describen con

detalle en Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994): CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680. Proteínas relacionadas con GDF-5 especialmente preferidas presentan identidades de aminoácidos de al menos 70%, 80%, 90% o 95% con el dominio de nudo de cistina de 102 aa de GDF-5 humano.

Ejemplos no limitativos para proteínas relacionadas con GDF-5 de vertebrado y mamífero son precursores y proteínas maduras de GDF-5 humano (divulgado como MP52 en el documento WO95/04819 y como GDF-5 humano en Hotten y cols. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652), GDF-5/MP52 humanos recombinantes (rh) (documento WO96/33215), MP52 Arg (documento WO97/06254); MP52 humanas de HMW (WO97/04095), CDMP-1 (documento WO96/14335), GDF-5 de ratón (Mus musculus) (documento US 5.801.014), GDF-5 de conejo (Oryctolagus cuniculus) (Sanyal y cols. 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210), GDF-5 de pollo (Gallus gallus) (nº de registro del NCBI NP_989669), GDF-5 de rana africana de uñas (Xenopus laevis) (nº de registro del NCBI AAT99303), GDF-5 monómero (documentos WO 01/1 1041 y WO 99/6161 1), GDF-6/BMP-13 humanos (documento US 5.658.882), GDF-6 de ratón (nº de registro del NCNP_038554), GDF-6/CDMP-2 (WO96/14335), GDF-7/BMP-12 humanos (documento US 5.658.882), GDF-7 de ratón (nº de registro del NC AAP97721), GDF-7/CDMP-3 (documento WO96/143335). También se cubren por la invención proteínas relacionadas con GDF-5 que tienen mutaciones adicionales tales como sustituciones, adiciones y supresiones, con tal de que estas mutaciones adicionales no eliminen completamente la actividad biológica de la proteína.

La presente invención se basa en el hallazgo de los inventores de que es posible mediante modificaciones específicas en la región de la secuencia de aminoácidos de una proteína relacionada con GDF-5 que está implicada en la unión a BMPR-IB y/o BMPR-IA cambiar la proteína de tal modo que tenga una capacidad mejorada para inducir la formación de cartílago y una capacidad reducida para inducir la formación de hueso.

Se encontró que las proteínas que tienen una afinidad incrementada para BMPR-IB y/o proteínas que tienen una afinidad reducida para BMPR-IA son más capaces de inducir la formación de cartílago mientras que se reduce la formación de hueso. Estas propiedades son especialmente pronunciadas en proteínas que muestran tanto una afinidad incrementada para BMPR-IB como una afinidad reducida para BMPR-IA.

Las proteínas relacionadas con GDF-5 de la presente invención se pueden obtener mediante modificación química o tecnología de manipulación genética, prefiriéndose las proteínas recombinantes. Las proteínas se pueden obtener al reemplazar al menos un residuo de aminoácido con relación a un sitio de unión a BMPR-IB y/o BMPR-IA en la secuencia de aminoácidos de una proteína relacionada con GDF-5.

Una proteína de la invención es una variante de GDF-5 humano, por la que el residuo de triptófano en la posición 414 se intercambia con arginina (W414R). En referencia a la secuencia madura de GDF-5 (para el GDF-5 monómero maduro mostrado en SEQ ID Nº: 4), esto corresponde a una sustitución en la posición 33. Sorprendentemente, se encontró que esta variante proteínica tiene una afinidad considerablemente reducida para el BMPR-IA. En contraste, la afinidad para el BMPR-IB está casi inalterada.

Una proteína variante de la invención adicional comprende la sustitución de aminoácidos R399E. En referencia a la secuencia madura de GDF-5 (para el GDF-5 monómero maduro mostrado en SEQ ID Nº: 4), esto corresponde a una sustitución en la posición 18. Dicha variante proteínica tiene una afinidad reducida para el BMPR-IA.

Preferiblemente, las proteínas relacionadas con GDF-5 de la presente invención están presentes como proteínas "aisladas". Esto significa que la proteína de la presente invención está sustancialmente separada de otras proteínas y moléculas peptídicas que están presentes en la fuente natural de la proteína aislada (p. ej. otros polipéptidos de la proteína de la fuente natural). Por ejemplo, un péptido expresado recombinante se considera aislado. Según una realización preferida de la invención, la proteína variante es una proteína recombinante. Además, un péptido también se considera aislado si se ha alterado mediante intervención humana o ha sido expresado por un organismo que no es su fuente natural. Por otra parte, una proteína "aislada" está libre de algo del otro material celular con el que está asociado naturalmente cuando se sintetiza químicamente. Se excluyen específicamente de la definición de proteína "aislada" las mezclas o composiciones no purificadas.

Según otra realización, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención. El ácido nucleico tiene una secuencia tal que se alcance una sustitución de ciertos residuos con relación a un sitio de unión a BMPR-IB y/o BMPR-IA de la respectiva proteína relacionada con GDF-5 silvestre. Se conocen generalmente los tripletes de bases que codifican estos aminoácidos y la degeneración del código genético. El ácido nucleico puede ser una secuencia de ADN y/o una secuencia de ARN con tal de que la proteína según la invención se pueda obtener a partir de este ácido nucleico durante la expresión en un sistema adecuado. El ácido nucleico de la invención puede ser totalmente o parcialmente sintético. Los ácidos nucleicos comprenden secuencias polinucleotídicas de una sola hebra y/o totalmente o parcialmente de doble hebra. El ácido nucleico se puede producir mediante cualquier medio adecuado incluyendo preparaciones genómicas, preparaciones de ADNc, síntesis in vitro, PCR, RT-PCR y/o transcripción in vitro o in vivo.

Se prefieren particularmente ácidos nucleicos "aislados", que están sustancialmente separados de moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (p. ej. secuencias que codifican otros polipéptidos). Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de al menos algunas de las secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias situadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en su replicón presente en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. Un ácido nucleico también se considera aislado si ha sido alterado mediante intervención humana o se ha situado en un locus

o localización que no es su lado natural o si se introduce en una célula. Por otra parte, un ácido nucleico aislado puede estar libre de algo del otro material celular con el que está asociado naturalmente o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

De un modo preferido, los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar mediante una síntesis génica total o mediante mutagénesis dirigida al sitio del ácido nucleico que codifica proteínas relacionadas con GDF-5 silvestres o modificadas. Los métodos incluyen ligación dirigida por plantilla, PGR recursiva, mutagénesis con casetes, mutagénesis dirigida al sitio o se pueden utilizar otras técnicas que son muy conocidas en la especialidad.

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender secuencias de ácido nucleico adicionales que pueden añadir funciones adicionales al ácido nucleico aislado de la invención. Por ejemplo, tales secuencias de ácido nucleico adicionales pueden comprender secuencias de ácido nucleico que permiten la expresión apropiada de una proteína de la invención y pueden abarcar secuencias promotoras, secuencias reguladoras, señales de detención, orígenes de replicación y similares. El experto está totalmente al tanto de tales secuencias de ácido nucleico funcionales y de cómo disponerlas en orden para llegar a una molécula de ácido nucleico con las propiedades deseadas.

También se divulgan vectores de expresión en los que el ácido nucleico está insertado en un sistema vectorial adecuado, seleccionándose el sistema vectorial según la expresión deseada de la proteína. El sistema vectorial puede ser un sistema vectorial eucariótico sino que preferiblemente es un sistema vectorial procariótico con el que las proteínas se puede producir de un modo particularmente fácil y puro. Un vector de expresión adecuado se muestra, por ejemplo, en el documento WO 96/33215. El vector de expresión también puede ser un vector viral que se puede usar, por ejemplo, en enfoques de terapia génica.

También se divulgan células hospedadoras y organismos transgénicos. Las células hospedadoras y los organismos transgénicos se caracterizan por que contienen un ácido nucleico o un vector de expresión según la invención y por que son capaces de usar la información presente en los ácidos nucleicos y en el vector de expresión, respectivamente, para la expresión de las proteínas según la invención. Así, la presente divulgación se refiere a organismos o células transgénicos transformados o transfectados transitoriamente o establemente con al menos un ácido nucleico o al menos un vector que codifica una proteína de la invención o a una progenie de tales organismos

o células transgénicos. Por otra parte, la presente divulgación se refiere a células, cultivos celulares, tejidos y/o partes de organismos transgénicos. Se entiende que para el propósito de la presente divulgación el término "organismo transgénico" no solo abarca el organismo en el que el ácido nucleico de la invención se ha introducido transitoriamente o establemente sino que también se refiere a la progenie de tales organismos independientemente de la distancia generacional, con tal de que estos organismos todavía comprendan el ácido nucleico de la invención y expresen la proteína de la invención.

Preferiblemente, el organismo o la célula transgénica es de origen procariótico o eucariótico. Preferiblemente, el organismo transgénico es un microorganismo. Microorganismos preferidos son bacterias, levaduras, algas u hongos. Células hospedadoras adecuadas son preferiblemente células procarióticas, en particular cepas de E. coli. Células hospedadoras particularmente útiles son descendentes de E. coli W31 10 como los mostrados por ejemplo en el documento WO 96/33215. En una realización preferida, las células hospedadoras, preferiblemente de origen humano, también pueden ser útiles para un trasplante a pacientes que los necesiten.

La preparación de un organismo transformado o de una célula transformada requiere introducir el ADN apropiado en el organismo o célula hospedador apropiado. Esta disponible una multitud de métodos para este procedimiento que se denomina transformación. Así, a modo de ejemplo, el ADN se puede introducir directamente mediante microinyección o mediante bombardeo de micropartículas o nanopartículas revestidas con ADN. La célula también se puede permeabilizar químicamente, por ejemplo usando polietilenglicol, de modo que el ADN pueda entrar en la célula a través de difusión. El ADN también se puede transformar a través de fusión de protoplastos con otras unidades que contienen ADN tales como minicélulas, células, lisosomas o liposomas. Otro método adecuado para introducir ADN es la electroporación en la que las células se permeabilizan reversiblemente mediante un impulso eléctrico.

También se analiza en la presente un método para producir una proteína que tiene una capacidad mejorada para inducir la formación de cartílago y una capacidad reducida para inducir la formación de hueso, que comprende las etapas de:

(i): aleatorizar al menos una posición de aminoácido en una región de una proteína relacionada con GDF-5 con relación a un sitio de unión a BMPR-IB y/o BMPR-IA a fin de obtener variantes proteínicas,

(ii): analizar las variantes proteínicas obtenidas en (i) con respecto a su afinidad para el BMPR-IB y/o el BMPR-IA,

(iii) seleccionar las variantes proteínicas que proporcionan una afinidad incrementada para el BMPR-IB y/o una afinidad reducida para el BMPR-IA.

Las regiones de una proteína relacionada con GDF-5 implicada en la unión a BMPR-IA o BMPR-IB se conocen en la especialidad. En la etapa (i) al menos una posición de aminoácido en uno o ambas de estas regiones se aleatoriza. Se prefiere aleatorizar al menos dos, tres o más posiciones de aminoácido. Los aminoácidos presentes en la secuencia silvestre de una proteína relacionada con GDF-5 se reemplazan por otros aminoácidos mediante modificaciones químicas o preferiblemente mediante tecnología de manipulación genética. Métodos para producir las variantes proteínicas aleatorizadas de la etapa (i) abarcan la síntesis de novo sintética de las proteínas y/o la expresión de las proteínas a partir de un ácido nucleico que codifica las mismas. De un modo preferido particular, las variantes proteínicas de la etapa (i) se preparan mediante expresión usando los respectivos ácidos nucleicos.

Preferiblemente, se obtienen variantes proteínicas para todos los otros aminoácidos posibles en la posición pertinente. Sin embargo, también es posible llevar a cabo una sustitución específica de uno o más aminoácidos por otros aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos hidrófilos se pueden reemplazar por aminoácidos hidrófobos. Alternativamente, los aminoácidos hidrófobos se pueden reemplazar por aminoácidos hidrófilos. También es posible una sustitución conservativa, en la que se mantiene el carácter hidrófilo o hidrófobo. Mediante la sustitución, preferiblemente se lleva a cabo un intercambio por un aminoácido que tiene otra demanda estérica.

La pluralidad de variantes proteínicas obtenida en la etapa (i) se analiza a continuación con respecto a su afinidad para BMPR-IB y/o para BMPR-IA. Esto se puede efectuar de un modo que es conocido y habitual en el campo técnico. Métodos para evaluar interacciones proteína-receptor son una práctica común.

En la etapa (iii), se seleccionan las variantes proteínicas que proporcionan una afinidad incrementada para BMPR-IB y/o una afinidad reducida para BMPR-IA. Sorprendentemente, se encontró que estas proteínas particulares tienen una capacidad mejorada para inducir la formación de cartílago y una capacidad reducida para inducir la formación de hueso.

Se divulgan además anticuerpos contra las proteínas relacionadas con GDF-5 descritas. Estos anticuerpos son específicos para las proteínas relacionadas con GDF-5 recombinantes reivindicadas. Preferiblemente, son específicos para las regiones de proteínas relacionadas con GDF-5 que contienen una o más de las sustituciones de aminoácidos descritas en la presente. Preferiblemente, los anticuerpos son específicos para una región de una proteína recombinante derivada de una proteína relacionada con GDF-5 con relación a un sitio de unión a BMPR-IB y/o BMPR-IA. Estos anticuerpos se pueden generar al usar los fragmentos de las proteínas que se describen anteriormente como inmunógenos para generar anticuerpos mediante métodos conocidos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser cualesquiera isotipos. También se divulgan fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab o fragmentos Fab2. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos humanizados o anticuerpos genéricos, etc.

Los anticuerpos son, entre otras cosas, adecuados como una herramienta analítica. Se pueden usar para investigar la absorción y la distribución de una proteína según la invención en el cuerpo. Por otra parte, los anticuerpos anteriores son adecuados para estudiar la cinética de liberación.

Una materia adicional de la presente solicitud es una composición farmacéutica que comprende la proteína relacionada con GDF-5 recombinante o un ácido nucleico o un vector o una célula hospedadora según la invención. En principio, son adecuadas cualesquiera composiciones farmacéuticas que ya se hayan publicado en contexto con proteínas relacionadas con GDF-5. Un vector de expresión o una célula hospedadora se pueden considerar ventajosos como sustancias activas en una composición farmacéutica. También se pueden usar combinaciones de una proteína según la invención con otras proteínas en composiciones farmacéuticas preferidas. Por supuesto, la invención también comprende composiciones farmacéuticas que contienen sustancias adicionales como, p. ej., aditivos o portadores farmacológicamente aceptables. La formulación puede incluir antioxidantes, conservantes, agentes colorantes, saborizantes y emulsionantes, agentes de suspensión, disolventes, cargas, agentes de aumento de volumen, tampones, vehículos de aporte, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Por ejemplo, un portador o vehículo adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o una solución salina mezclada con una proteína portadora adecuada tal como albúmina sérica. Un antioxidante preferido para la preparación de la composición de la presente invención es el ácido ascórbico.

El disolvente o diluyente de la composición farmacéutica puede ser bien acuoso o bien no acuoso y puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables que son capaces de modificar y/o mantener un pH, una osmolaridad, una viscosidad, una transparencia, una escala, una esterilidad, una estabilidad, una velocidad de

disolución o un olor de la formulación. De forma similar, se pueden incluir otros componentes en la composición farmacéutica según la presente invención a fin de modificar y/o mantener la velocidad de liberación de la sustancia farmacéuticamente eficaz. Tales componentes modificadores son sustancias empleadas habitualmente en la especialidad a fin de formular dosificaciones para administración parenteral en forma bien unitaria o bien de múltiples dosis.

La composición farmacéutica finalmente formulada preparada según la presente invención se puede almacenar en viales estériles en la forma de una solución, una suspensión, un gel, una emulsión, un polvo sólido o deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones se pueden almacenar bien en una forma lista para usar o bien en una forma, p. ej. en el caso de un polvo liofilizado, que requiera reconstitución antes de la administración. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas anteriores y otras se conocen en la especialidad y se describen, por ejemplo, en Gus Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª Ed., Mack Publishing Co., Eastern, Pa., 1990, 1435-1712). Tales formulaciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de depuración in vivo del componente farmacéuticamente eficaz.

Otras formas de administración eficaces comprenden formulaciones parenterales de liberación lenta, es decir retardadas, nebulizaciones inhaladas o formulaciones oralmente activas. Por ejemplo, una formulación de liberación lenta puede comprender proteínas unidas a o incorporadas en preparaciones en partículas de compuestos poliméricos (tales como poli(ácido láctico, poli(ácido glicólico), etc.) o liposomas.

La composición farmacéutica según la presente invención también se puede formular para administración parenteral,

p. ej., mediante infusión o inyección, y también puede incluir formulaciones de liberación lenta o circulación sostenida. Tales composiciones terapéuticas administradas parenteralmente típicamente están en la forma de soluciones acuosas parenteralmente aceptables libres de pirógenos que comprenden el componente o los componentes farmacéuticamente eficaces en un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica puede comprender un material de matriz, p. ej. en casos en los que se pretende la regeneración de cartílago. Es ventajoso para la proteína, el ácido nucleico, el vector de expresión o la célula hospedadora que se apliquen en y/o sobre un material de matriz biocompatible. Material de matriz, según se usa en la presente, significa un portador o una matriz que actúa como un andamiaje para la incorporación, la ligazón, la proliferación y la diferenciación celulares y/o como un dispositivo potencial de aporte y almacenamiento para las proteínas relacionadas con GDF-5 recombinantes de la invención. En contraste con las matrices sólidas, los portadores consisten en materiales amorfos que no tienen superficies definidas y que carecen de una conformación específica, es decir alquilcelulosa, pluronics, gelatinas, polietilenglicoles, dextrinas, aceites vegetales, azúcares y otras sustancias líquidas y viscosas.

Materiales de matriz ejemplares se describen, por ejemplo, en el documento WO 98/21972. Estos materiales de matriz son igualmente adecuados para las proteínas según la invención. El material de matriz puede ser trasplantado al paciente, p. ej. quirúrgicamente, en donde la proteína o el ADN que codifica la proteína puede ser liberado lentamente desde el material de matriz y a continuación ser eficaz a lo largo de un período prolongado. Todos los tipos de materiales de matriz son útiles según la presente invención con tal de que sean biocompatibles y se seleccionen para la zona o indicación de uso. El material de matriz puede ser un material natural, un material natural modificado así como un material sintético. Se abarcan todas las matrices ya conocidas para proteínas morfogenéticas. La matriz extracelular comprende por ejemplo diversos colágenos como por ejemplo los tipos I, II, V, IX, X, XI y XIII, proteoglicanos y glicosaminoglicanos adicionales como, por ejemplo, sulfatos de condroitina, biglicanos, decorinas y/o ácido hialurónico o proteínas no colagenosas como, p. ej., osteopontina, laminina, fibronectina, vitronectina y proteína de matriz del cartílago. Todos los materiales naturales mencionados también se pueden usar en formas modificadas artificialmente. Para una lista no limitativa de portadores y matrices útiles, véase además Kirker-Head, 2000, Advanced Drug Delivery 43, 65-92).

Una posibilidad adicional se refiere a formulaciones liposómicas que comprenden la proteína relacionada con GDF-5 recombinante según la invención. Los liposomas usados en dichas formulaciones son conocidos comúnmente para el experto en la especialidad. En particular, formulaciones liposómicas preferidas se divulgan en el documento WO 2008/049588. Formulaciones liposómicas más preferidas se describen en las páginas 9 a 13 del documento WO 2008/049588.

Por otra parte, las proteínas variantes de GDF-5 de la invención se pueden administrar en combinación con otras sustancias farmacéuticamente activas. Dichas sustancias farmacéuticamente activas pueden ser, por ejemplo, analgésicos tales como analgésicos localmente eficaces u otras sustancias que tienen un efecto positivo sobre enfermedades, en las que se desea la formación de cartílago, como inhibidores de proteasas. Estos son solo ejemplos de posibles aditivos, y un trabajador experto en la especialidad puede añadir fácilmente otros excipientes que se usan en preparaciones farmacéuticas o que generalmente se consideran seguros.

Debido a su capacidad mejorada para inducir la formación de cartílago, las proteínas variantes de GDF-5 recombinantes la presente invención son particularmente adecuadas para el uso en el tratamiento de enfermedades, en las que se desea la formación de cartílago pero la formación de hueso no es deseable. Así, otro aspecto de la

presente invención es el uso de las proteínas, los ácidos nucleicos, los vectores o las células hospedadoras presentes en el tratamiento de estas enfermedades. En particular, las proteínas, los ácidos nucleicos, los vectores o las células hospedadoras presentes se usan en el tratamiento de defectos del cartílago o para el tratamiento de la rotura o la separación traumática del cartílago, en particular defectos del cartílago relacionados con la edad, por ejemplo debidos a desgaste, osteoartritis, artritis reumatoide, lesiones relacionadas con el deporte, enfermedades que pueden afectar al cartílago como condrodistrofias, enfermedades caracterizadas por una perturbación del crecimiento y la posterior osificación del cartílago, acondroplasia, costocondritis, hernia discal y reparación discal, policondritis recidivante, reparación de defectos del cartílago asociados con tumores, bien benignos o bien malignos, como condroma o condrosarcoma.

Otro aspecto es un método para el tratamiento de enfermedades, en las que se desea la formación de cartílago pero no se desea la formación de hueso, que comprende la etapa de administrar una proteína, un ácido nucleico, un vector o una célula hospedadora según la invención a un paciente que necesite tal tratamiento.

Según se usa en la presente, el término "tratar" se refiere a invertir, aliviar, o inhibir el avance de una enfermedad, un trastorno o una afección o uno o más síntomas de tal enfermedad, trastorno o afección a la que se aplica tal término. Según se usa en la presente, tratar también se puede referir a disminuir la probabilidad o incidencia de la presencia de una enfermedad, un trastorno o una afección en un mamífero en comparación con una población de control no tratada o en comparación con el mismo mamífero antes del tratamiento. Por ejemplo, según se usa en la presente, tratar se puede referir a prevenir una enfermedad, un trastorno o una afección y puede incluir retrasar o prevenir el comienzo de una enfermedad, un trastorno o una afección y puede incluir retrasar o prevenir el comienzo de una enfermedad, un trastorno o una afección o retrasar o prevenir los síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una afección. Según se usa en la presente, tratar también se puede referir a reducir la gravedad de una enfermedad, un trastorno o una afección o los síntomas asociados con tal enfermedad, trastorno o afección antes de que el mamífero sufra la enfermedad, el trastorno o la afección. Tal prevención o reducción de la gravedad de una enfermedad, un trastorno o una afección antes del sufrimiento se refiere a la administración de la composición de la presente invención que se describe en la presente a un sujeto que no es en el momento de la administración cuando sufre la enfermedad, el trastorno o la afección. Según se usa en la presente, tratar también se puede referir a prevenir la recaída de una enfermedad, un trastorno o una afección o de uno o más síntomas asociados con tal enfermedad, trastorno o afección.

Los siguientes Ejemplos junto con las Figuras y los Protocolos de secuencia pretenden ilustrar adicionalmente la invención.

La SEQ ID Nº: 1 muestra la secuencia de ADN y la SEQ ID Nº: 2 muestra la secuencia proteínica del precursor de GDF-5 humano.

SEQ ID Nº: 3 muestra la secuencia de ADN y la SEQ ID Nº: 4 muestra la secuencia proteínica del GDF-5 monómero maduro humano.

Figuras

La FIG. 1 muestra características adicionales de la proteína precursora de GDF-5 humana según la SEQ ID Nº: 2:

aa 001-381 preprodominio (letras en negrita)

aa 001-027 péptido de señal (negrita y subrayado)

aa 382-501 parte proteínica madura

aa 400-501 dominio de nudo de cistina (subrayado)

La FIG. 2 muestra una comparación de los dominios de nudo de cistina de 102 aa de GDF-5 humano (SEQ ID Nº: 2), GDF-6 humano (secuencia 26 de la Pat. EE. UU. Nº 5.658.882) y GDF-7 humano (secuencia 2 de la Pat. EE. UU. Nº 5.658.882). Los residuos de aminoácido que son idénticos en las tres moléculas se destacan mediante márgenes.

La FIG. 3 muestra los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) con mutante de GDF-5 humano recombinante W414R (según se describe en el ejemplo 2).

FIG. 4 muestra los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) con mutante de GDF-5 humano recombinante I449V (según se describe en el ejemplo 3).

FIG. 5 muestra los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) con mutante de GDF-5 humano recombinante R399E (según se describe en el ejemplo 3).

FIG. 6 muestra los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) con mutante de GDF-5 humano recombinante S439E (según se describe en el ejemplo 3).

FIG. 7 muestra los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) con mutante de GDF-5 humano recombinante R399M (según se describe en el ejemplo 3).

FIG. 8 muestra los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) con mutante de GDF-5 humano recombinante W414R (según se describe en el ejemplo 3).

Ejemplo 1: Creación, expresión y purificación de proteínas relacionadas con GDF

Se han aislado ADN que codifican las partes maduras de proteínas de GDF-5 humano, GDF-6 humano y GDF-7 humano de células osteoprogenitoras ROB-C26 humanas (Yamaguchi y cols. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225) a través de la técnica RT-PCR y posteriormente se han ligado a vectores plasmídicos procarióticos. A fin de identificar residuos de aminoácido funcionalmente importantes en las partes maduras de GDF-5, -6 y -7, se han introducido diversas mutaciones individuales en estas secuencias a través de mutagénesis dirigida al sitio.

Todas las mutaciones individuales se crearon al usar el estuche de mutagénesis dirigida al sitio QuickChangeTM con la ADN polimerasa PfuTurboTm y la DPN I endonucleasa de Stratagene según el manual de instrucciones del fabricante.

Usando la cepa bacteriana W3110BP transformada con los plásmidos e inducida con IPTG, las proteínas se expresaron en cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión se aislaron usando un tampón de homogeneización (Tris HCl 25 mM pH 7,3, EDTA NaOH 10 mM pH 8, urea 8 M) y tampón de lavado (urea 1 M, Tris HCl 20 mM, pH 8,3, EDTA NaOH 10 mM pH 8.0) según procedimientos estándar. Se llevó a cabo una purificación adicional en una columna en fase inversa Aquapore Octyl (Applied Biosys, (CV = 7,8 ml) 100x10, 20µ, Nº 186470) con un gradiente de 100% de Eluyente A (TFA al 0,1%, HPLC H2O) a 100% de Eluyente B (TFA al 0,1%, CH3N al 90%, HPLC H2O) en 104 minutos (caudal: 3 ml/min). Después de un control por transferencia Western, las fracciones que contenían la proteína mutante se reunieron y se liofilizaron.

Las proteínas mutantes se disolvieron en tampón de disolución (guanidina HCl 6 M, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, DTT 3 mM, pH = 8,0), la concentración de proteína se ajustó exactamente hasta 2,6 mg/ml y el pH se ajustó entre 8 y 9. Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, se añadió tampón de repliegue (NaCl 1 M, Tris 50 mM, EDTA 5 mM, GSSG 1 mM, GSH 2 mM, Chaps 33 mM, pH = 9,5) bajo agitación suave para alcanzar una concentración final de 0,16 mg/ml.

A continuación, la solución se incubó durante 48 h a 22°C y el repliegue se detuvo al cambiar el pH hasta 3-4 añadiendo HCl al 18%. Después de la centrifugación, el monómero no replegado se separó de la forma dímera al llevar a cabo una segunda RP-HPLC bajo las mismas condiciones. Las fracciones que contenían la proteína dimerizada se reunieron, se liofilizaron y se almacenaron a -70°C.

Ejemplo 2: Medida de la actividad biológica de diferentes variantes de proteínas relacionadas con GDF in vitro mediante ensayo de ALP

Se incubaron 2,0x105 células de C2C12-lb (una línea celular que sobreexpresa establemente el receptor BMPR-IB) y células de C2C12 durante 3-4 días en 20 ml de medio de cultivo celular (α-MEM, penicilina/estreptomicina, Lglutamina 2 mM, FCS al 10%) a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. Posteriormente, las células se lavaron con PBS (solución salina tamponada con fosfato), se tripsinizaron y se resuspendieron en medio de cultivo hasta una densidad de 3x104 células/ml. Se transfirieron 150 µl a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. Después de lavar con medio los pocillos se cargaron con 120 µl de nuevo medio de cultivo. Se añadieron 40 µl de diferentes soluciones de proteína mutante o silvestre (disuelta en HCl 10 mM y diluida al menos 250 veces en medio), seguido por otra etapa de incubación durante 72 h a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. Después de lavar con PBS, se añadieron 150 µl de solución de lisis (0,2% de Nonidet P40, 0,2 g de MgCl2 x 6H2O, ajustado hasta 1.000 ml con agua), seguido por una incubación de 15-18 h a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. Posteriormente, se transfirieron 50 µl de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 µl de solución de sustrato (tampón de sustrato de dietanolamina concentrado 2,5 veces + 148 g/l de PNPP (p-nitrofenilfosfato sódico)) y las placas se incubaron durante 4 min. a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. La reacción de ALP se detuvo posteriormente con 100 µl de 30 g/l de NaOH y finalmente la densidad óptica se midió con un lector de microplacas automático a 405 nm considerante la sustracción del valor del blanco.

Como un ejemplo, los resultados (valores promedio de 2 experimentos independientes) que se refieren a mutante de hGDF-5 W414R para células C2C12-lb se muestran en la FIG. 3. Se han usado en este ensayo cinco concentraciones de proteína diferentes (14 ng/ml, 44,5 ng/ml, 133,2 ng/ml, 400 ng/ml y 1.200 ng/ml). La proteína mutante W414R exhibe actividad biológica en células en las que se sobreexpresa el receptor BMPR-IB (células C2C12-lb), indicando que el sitito de unión a BMPR-IB de W414R es funcionalmente activo. La proteína silvestre (rhGDF-5) servía como un a control en el sistema de ensayo.

Resultados adicionales de la actividad biológica de mutantes de hGDF-5 adicionales para las líneas celulares C2C12 y C2C12-lb se muestran en la tabla 1.

Ejemplo 3: Medida de la actividad biológica de diferentes variantes de proteínas relacionadas con GDF in vitro mediante el ensayo de ALP

Se incubaron 5x105 células para ATDC-5 y 5x105 células para MCHT1/26 durante 3-4 días en 20 ml de medio de cultivo celular (α-MEM, L-glutamina 2 mM, FCS al 10%, para MCHT1/26; DMEM/F12 (1:1), FCS al 5%) a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. Posteriormente, las células se lavaron con PBS (solución salina tamponada con fosfato), se tripsinizaron y se resuspendieron en medio de cultivo hasta una densidad de 3x104 células/ml. Se transfirieron 150 µl a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. Después de lavar con medio los pocillo se cargaron con 120 µl de nuevo medio de cultivo para MCHT1/26 y se añadieron 120 µl de medio de ensayo para ATDC-5 (DMEM/F12 (1:1), FCS al 0,5%) más 40 µl de diferentes diluciones de proteína mutante o silvestre (disuelta en HCl 10 mM y diluida al menos 250 veces en medio), seguido por otra etapa de incubación durante 72 h a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. Después de lavar con PBS, se añadieron 150 µl de solución de lisis (solución de lisis MCHT1/26: Nonidet P40 al 0,2%, MgCl2 1 mM; solución de lisis ATDC-5: glicina Na 100 mM, Nonidet P40 al 1%, MgCl2 1 mM), seguido por 1 h de incubación para ATDC-5 y 15

– 18 h para MCHT1/26 a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. Posteriormente, se transfirieron 50 µl de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 µl de solución de sustrato (tampón de sustrato de dietanolamina concentrado 2,5 veces + 148 g/l de PNPP (p-nitrofenilfosfato sódico)) y las placas se incubaron durante otras 60 min. a 37°C, CO2 al 5%, saturado con H2O. La reacción de ALP se detuvo posteriormente con 100 µl de 30 g/l de NaOH y finalmente la densidad óptica se midió con un lector de microplacas automático a 405 nm considerando la sustracción del valor del blanco.

Resultados ejemplares (valores promedio de 2 experimentos independientes) relativos a los mutantes de hGDF-5 I449V, R399E, S439E, R399M, W414R se muestran en las FIG. 4-8, respectivamente. Se han usado en este ensayo cinco concentraciones de proteína diferentes (14,8 ng/ml, 44,5 ng/ml, 133,2 ng/ml, 400 ng/ml, 1.200 ng/ml). En comparación con GDF-5 silvestre, las proteínas mutantes exhiben una actividad biológicamente superior sobre células ATDC-5 en comparación con células MCHT1/26 en este sistema de ensayo.

Ejemplo 4: Medidas de afinidad con Biacore de proteínas relacionadas con GDF-5

Se usó un sistema BiacoreT100 (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, GB) para todos los experimentos con biosensores. Aproximadamente 200 unidades de resonancia (RU) de los ectodominios receptores de proteínas de fusión de Fc de BMPR-IB, BMPR-IA o BMPR-II se inmovilizaron en chips biosensores G CM5. Se registraron sensogramas de interacción a un caudal de 60 µl/min. a 30°C en HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 300 mM, EDTA 3,4 mM, Tween 20 al 0,005%. Los experimentos se llevaron a cabo por duplicado usando concentraciones de ligando de 0,05 a 100 nM. Todas las afinidades de unión aparentes se obtuvieron usando BIAevaluation v. 2.2.4 (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, GB). Las afinidades para la interacción a receptor tipo de ligando se derivaron al ajustar los datos cinéticos a un modelo de unión de Langmuir 1:1 (KD (kin)). Debido a la cinética de unión rápida (que supera 106 M-1 s-1 (para kon) y 10-2 s-1 (para koff)) las afinidades de unión aparentes para la interacción ligando:BMPR-II se determinaron a partir de la dependencia con la dosis de la unión en equilibrio (KD (eq)).

Los resultados de las medidas de afinidad con Biacore para diferentes variantes de GDF-5 humano se muestran en la tabla 1.

* = Resultados de la medida de afinidad 1 relativos a GDF-5, afinidad a BMPR-IA: 1 nM, afinidad a BMPR-IB: 8 pM

** = Resultados de la medida de afinidad 2 relativos a GDF-5, afinidad a BMPR-IA: 1,1 nM, afinidad a BMPR-IB: 27 pM 0 = Sin actividad de ALP

+: a +++++ = Actividad de ALP, el número + representa la intensidad de la actividad de ALP

n.: d. = no determinado

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH 5 <120> Mutante de GDF-5 para inducir la formación de cartílago

<130> 52328P EP

<160> 4 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2703 15 <212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> CDS 20 <222> (640)..(2142)

<223> precursor de GDF-5

<400> 1

<210> 2

<211> 501

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(360)

<223> GDF-5 monómero maduro humano

<400> 3

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proteína variante de GDF-5 humano maduro representada por los aminoácidos 382 -501 de SEQ ID Nº: 2 y que comprende una sustitución de aminoácido, seleccionada del grupo que consiste en R399E, W417F y W417R.

5 2. Un ácido nucleico que codifica una proteína variante según la reivindicación 1.
3. La proteína variante según la reivindicación 1 o el ácido nucleico según la reivindicación 2, para el uso en el tratamiento de enfermedades, en las que se desea la formación de cartílago pero no se desea la formación de hueso.
4. La proteína variante o el ácido nucleico para el uso según la reivindicación 3 para el uso en el tratamiento de defectos del cartílago o para el tratamiento de la rotura o la separación traumática del cartílago, en particular defectos del cartílago relacionados con la edad, por ejemplo debidos a desgaste, osteoartritis, artritis reumatoide, lesiones relacionadas con el deporte, enfermedades que pueden afectar al cartílago como condrodistrofias,

15 enfermedades caracterizadas por una perturbación del crecimiento y la posterior osificación del cartílago, acondroplasia, costocondritis, hernia discal y reparación discal, policondritis recidivante, reparación de defectos del cartílago asociados con tumores, bien benignos o bien malignos, como condroma o condrosarcoma.
5. Una composición farmacéutica que comprende una proteína variante según la reivindicación 1, un ácido nucleico

20 según la reivindicación 2, un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 2 o una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 2 como el agente activo, opcionalmente en combinación con aditivos o portadores farmacéuticamente aceptables.