CN105985426B - Lgr4蛋白片段及其在制备治疗破骨细胞诱导的骨病的药物中的用途 - Google Patents
Lgr4蛋白片段及其在制备治疗破骨细胞诱导的骨病的药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种分离的具有SEQ ID NO.1所示的LGR4蛋白片段,该蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的蛋白序列。本发明还提供该蛋白片段在用于制备治疗破骨细胞诱导的骨病的药物中的用途,其中所述蛋白片段可抑制体内破骨细胞分化。进一步的,本发明还提供该蛋白片段在用于研究体外或体内抑制破骨细胞分化的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域的LGR4(Leucine-rich repeat containing G-proteincoupled receptor 4,富亮氨酸重复基序G蛋白偶联受体4)的蛋白片段,具体地,本发明涉及一类与骨质疏松症与骨巨细胞瘤相关的LGR4蛋白片段,以及其在制备治疗破骨细胞诱导的骨病的药物中的用途。
背景技术
近年来关于破骨细胞调节人体生理功能的研究不断增多,越来越多的研究证明破骨细胞不仅参与生物体骨代谢的自身平衡,在免疫***调节中也占有一席之地(ImmunolRev.2005Dec;208:19-29.)。更重要的是,在许多病理状态下,破骨细胞功能缺失或者过度活化都时有发生,以至增加疾患者的痛苦与治疗复杂性。比如,类风湿关节炎病症患者往往伴随破骨细胞功能亢进,导致严重的骨质丢失,使病人饱受痛苦;乳腺癌患者晚期往往易发生骨转移,转移至骨的癌细胞能促进破骨细胞过度活化,也能导致骨质疏松,对患者的治疗和生活状态都带来极大不便;畸形性骨炎中破骨细胞的过度活化是患者骨骼畸形的主要原因;骨巨细胞瘤中破骨样细胞剧烈活化,致患者骨质严重丢失,致残致畸;骨胳石化症患者中破骨细胞功能丢失,疾患骨密度过高,易畸形,这些都给生活带来不便。此外,正常生理状况下,妇女绝经后也易发生骨丢失,其主要原因也正在于破骨细胞功能亢进(Nat Rev DrugDiscov.2012 May;11(5):401-19.doi:10.1038/nrd3705.)。因此,针对破骨细胞开发药物靶点的研究在骨疾病领域尤其是骨质疏松症占了绝大比例。
目前针对破骨细胞相关疾病(包括骨质疏松症及骨巨细胞瘤)的药物治疗可以分为两大类,一类是小分子化合物,如双磷酸盐类药物;二是蛋白类药物,如RANKL诱导受体RANK-Fc及OPG蛋白、RANKL单抗地诺单抗(Denosumab)。具体而言,小分子化合物方面,双磷酸盐能够促进成熟破骨细胞凋亡,从而对破骨细胞相关疾病能有治疗作用。截止目前,双磷酸盐类药物发展经历了三代:第一代双磷酸盐是不含氮的双磷酸盐,包括依替膦酸钠、氯屈膦酸钠及替鲁膦酸钠。由于它们的结构与双磷酸基很相似,因此当破骨细胞吸收骨表面矿化区后,它们在二型RNA氨基转移合成酶的作用下能***到新合成的腺苷三磷酸(ATP)中,这种不可水解的ATP类似物在胞内不断累积后会抑制由ATP介导的多种细胞过程,从而对破骨细胞产生细胞毒作用,导致破骨细胞凋亡;与初代双磷酸盐不同的是,第二代及第三代双磷酸盐(阿仑膦酸钠、利塞膦酸钠、埃本膦酸钠、帕米膦酸钠以及唑来膦酸)在R2侧链处存在氮原子,它们引起破骨细胞凋亡的机理与初代双磷酸盐不同。研究表明这两代双磷酸盐能结合并抑制法尼基焦磷酸合成酶,而这种酶调节甲羟戊酸代谢为胆固醇及其他甾醇以及类异戊二烯脂质,由此,调节破骨细胞核心活性(如应力纤维装配、膜皱褶及存活)的蛋白(包括Rab、Rac及Rho)的翻译后修饰(异戊二烯化)会受到抑制并最终引起破骨细胞凋亡。临床上,双磷酸盐对破骨细胞的这一作用使它广泛应用于多种与破骨细胞功能亢进相关的疾病中,包括多种类型的骨质疏松症(如***的、绝经后的或是年老后的骨质疏松症,糖皮质激素诱发的骨质疏松,器官移植及长时间不动引发的骨质疏松以及去雄激素相关的骨质疏松症)、佩吉特氏骨病、成骨不全症、高血钙症及恶性肿瘤骨转移(Mayo ClinProc.2008Sep;83(9):1032-45.doi:10.4065/83.9.1032.)。
蛋白类药物方面,目前基础科研与临床应用主要针对破骨细胞分化及活化所需的RANKL蛋白进行研发,较为知名的是RANKL竞争型受体蛋白及近年来已用于部分临床病症的地诺单抗。已有两种针对RANKL开发的竞争型受体蛋白见诸报道:一是包含RANK受体部分结构域的RANK-Fc多肽,它由RANK的胞外段CRD结构域与IgG1的Fc结构域构成。RANK-Fc能特异性地结合RANKL而不与其他TNF家族配体相互作用,从而在一些临床前模型中发挥抑制骨吸收的作用;二是OPG-Fc多肽。OPG是天然的RANKL诱饵受体,能够与RANK受体竞争结合RANKL从而阻断RANKL-RANK信号通路。OPG-Fc多肽的研发经历了多个阶段,早期研究发现大剂量(>10-30mg/kg)的重组OPG全长多肽能有效抑制小鼠体内的骨吸收现象,这种OPG全长多肽的结构比较固化,因此它的药代动力学参数很不乐观。随着研究深入,又研发出了只包含N末端CRD结构域而缺失C末端发夹结构的OPG多肽,这种多肽的药代动力学水平得到了明显提高,经过对OPG截短体进行大规模筛选后,研究者发现人类OPG蛋白的22-194氨基酸多肽片段与IgG1的Fc结构域融合后形成的OPG-Fc多肽能比全长OPG蛋白有近200倍的活性提高,且这一多肽在体内也具有更长的半衰期。利用原核表达***得到的OPG-Fc多肽的一期临床实验表明它在体内能浓度梯度依赖地迅速促进骨更新,这一实验首次说明阻断RANKL信号对人类骨更新是有效果的。同时,另一种由哺乳动物细胞表达的OPG-Fc多肽(AMGN-0007)也具有这一效果,且其半衰期更长(近10倍于原核表达的OPG-Fc多肽),效果也要好2-3倍,这可能是因为真核***中OPG还发生了糖基化之故。总的来说,针对RANKL设计的竞争受体能有效抑制体内破骨细胞的活性,从而改善骨丢失现象。除去竞争受体之外,近年来还有研究团队开发出了RANKL特异性抗体地诺单抗,开启了破骨细胞的抗体治疗途径。地诺单抗是一类IgG2单克隆抗体,与人RANKL蛋白具有极高亲和力,其解离平衡结合常数(Kd)为3pM,它与可溶性形式及膜结合形式的RANKL都能相互作用,但不识别小鼠及大鼠的RANKL蛋白。临床研究表明,地诺单抗疗效与安全性兼备,对骨质疏松症及癌症引起的骨丢失与骨破坏均具有显著疗效。进一步研究还发现地诺单抗还能迟滞与预防***癌及乳腺癌骨转移的发生。此外,还有研究表明地诺单抗对骨巨细胞瘤患者也有疗效(Nat Rev DrugDiscov.2012May;11(5):401-19.doi:10.1038/nrd3705.)。这些研究表明针对RANKL设计研发形成的药物能有效抑制破骨细胞活性,且对破骨细胞相关的骨质疏松症及骨巨细胞瘤具有显著效果。因此,抑制RANKL分子的药物开发具有广泛用途与价值。
中国专利申请201310047174、发明名称“珍珠母蛋白N16的制备方法及其在制备防治骨科疾病药物中的应用”公开了一种利用基因重组法在细菌中表达珍珠母蛋白N16,建立了N16的分离纯化方案。所制备得到的N16能抑制前体破骨细胞的增殖,抑制RANKL诱导前体破骨细胞分化成为成熟的破骨细胞,抑制破骨细胞标志性酶酸性磷酸酶TRAP的活性,抑制破骨细胞的形成,抑制破骨细胞分化相关基因的表达,抑制破骨细胞分化成熟。实验结果表明,N16蛋白不仅能促进成骨细胞分化,更能抑制破骨细胞分化,从而达到抗骨质疏松和治疗骨折的目的。这预示着该蛋白有可能用于增强成骨细胞的矿化功能,治疗去卵巢引起的骨质疏松症。
中国专利申请201210232648、发明名称“包含cFms胞外片段的融合蛋白质及其制备方法和应用”公开了一种包含巨噬细胞刺激因子受体(cFms)胞外片段的融合蛋白质,该蛋白具有结合白细胞介素-34(IL-34)和结合巨噬细胞刺激因子(M-CSF),阻断IL-34/M-CSF配体跟共用受体cFms的结合的作用,适合治疗异常情况下由IL-34/M-CSF所引起的疾病。对自身免疫性疾病、炎症性疾病、骨质疏松症和肿瘤具有潜在的治疗前景。
国际专利申请WO2010/117011、发明名称为“anti-Siglec 15 antibody”公开了一种能够靶向由在破骨细胞中强烈表达的基因编码的蛋白的抗体。该抗体特异性靶向在巨细胞瘤中特异性表达的Siglec 15基因,并抑制破骨细胞形成的活性,取得良好的效果。
如上所述,目前用于抑制或治疗因破骨细胞引起的骨质类疾病的蛋白类药物,多集中在制备特异性抗体、抑制剂或RANKL竞争型受体方面,而针对G蛋白偶联受体(GPCR)靶点设计开发治疗破骨细胞相关的骨质疏松症与骨巨细胞瘤很少有报道。近些年随着各类生物基因组测序的完成和比较基因组学的发展,人们发现在脊椎动物和非脊椎动物中还存在许多与上述糖蛋白激素受体结构相似或具有同源性的受体蛋白。在脊椎动物中,按照这些受体蛋白被发现的时间先后顺序,依次命名为LGR4、LGR5、LGR6、LGR7和LGR8等。这些结构相似的蛋白构成了GPCR超家族中一个亚家族,即富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体(LGR,Leucine-rich G-protein Coupled Receptor)。***进化分析法显示LGRs可以分成三个亚组:第一组为经典的糖蛋白激素受体,包括***(follicle-stimulating hormone,FSH)受体、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)受体以及***(1uteinizing hormone,LH)受体,其各自与糖蛋白激素FSH,TSH和LH/hCG结合。第二组由LGR4-6组成,一度因其功能和同源配体不明而归属于孤儿受体,近期有研究发现Rspondin家族成员能与LGR家族的胞外段结构发生相互作用并激活WNT信号通路,因此,Rspondin家族成员被认为是LGR家族的天然配体。第三组包括LGR7与LGR8,最近发现分别是松弛素和莱迪希胰岛素样肽(Leydig insulin-like peptide or relaxin-like factor 3,INSL3)受体。迄今为止,LGR已知的生理学功能主要涉及到眼部或肾脏发育和生殖。
关于LGR4,人类LGR4基因定位于染色体的11p14~13上(Am J Med Genet A.2011Jun;155A(6):1272-80.doi:10.1002/ajmg.a.33878.),属G蛋白偶联受体(GPCR)A家族,又属于富亮氨酸重复基序G蛋白偶联受体(LGR)家族(Development 136,2747-2756(2009)doi:10.1242/dev.033571),编码一个含有951个氨基酸的细胞膜受体蛋白。鼠Lgr4基因定位于2号染色体上,也编码一个含有951个氨基酸的细胞膜受体蛋白。LGR4在体内分布相当广泛,包括生殖***、肾脏、肾上腺、骨骼等等,并且早在小鼠胚胎的第7天,LGR4就已开始表达,提示LGR4在小鼠发育中的重要作用(Katoh-Fukui Y,Owaki A,Toyama Y,et al.MousePolycomb M33 is required for splenic vascular and adrenal gland formationthrough regulating Ad4BP/SF1 expression.Blood,2005,106(5):1612-20.)。另外,LGR4基因敲除小鼠子宫内发育迟缓以及出生后的高死亡率也说明LGR4对小鼠的胚胎发育具有非常重要的影响(Mendive F,Laurent P,Van Schoore G,et al.Defective postnataldevelopment of the male reproductive tract in LGR4 knockout mice.Dev Biol,2006,290(2):421-34.),但迄今为止对于LGR4在具体器官胚胎期发育中的功能尚未见有文献报道。而目前研究较为深入的是LGR4对小鼠生殖***出生后发育的影响。LGR4基因敲除小鼠输出小管和附睾出生后发育异常,延伸和扩展障碍,并引起管道堵塞和睾丸积水,最终导致雄性小鼠不育。究其原因可能是LGR4影响生殖道细胞的增殖和分化(Hoshii T,TakeoT,Nakatata N,et al.LGR4 Regulates the Postnatal Development and Integrity ofMale Reproductive Tracts in Mice.Biol Reprod,2007,76(2):303-13.)。此外,LGR4也参与肾脏的发育,LGR4缺陷导致肾小球数目减少(Lala DS,Rice DA,Parker KL,etal.Steroidogenic factor I,a key regulator of steroidogenic enzyme expression,is the mouse homolog of fushi tarazu-factor I.Mol Endocrinol,1992,6(8):1249-58.)。最近还发现LGR4能促进肿瘤细胞的转移,但对细胞的增殖似乎没有影响(Honda S,Morohashi K,Nomura M,et al.Ad4BP regulating steroidogenic P-450gene is amember of steroid hormone receptor superfamily.J Biol Chem,1993,268(10):7494-502.)。目前对于LGR4功能的认识仅限于以上所述。
发明内容
本发明原理在于,发明人是首次创新地研究发现LGR4的蛋白片段(1aa-504aa,LGR4-ECD)能与RANK竞争结合RANKL,从而抑制破骨细胞分化与功能的分子机理,说明LGR4蛋白片段可用于开发RANKL竞争多肽药物从而抑制破骨细胞活性的可能性。鉴于以上发现,发明人利用原核表达***,以重组表达LGR4的蛋白片段,发现原代骨髓单核吞噬细胞经该蛋白处理后,其由RANKL或成骨细胞诱导的向成熟破骨细胞分化的能力能被完全抑制,并呈现浓度梯度依赖性。此外,该蛋白片段还能有效抑制病理状态下骨巨瘤患者肿瘤细胞中巨细胞的分化;同时,在两种小鼠骨质疏松动物模型中的研究进一步发现,该蛋白片段既能预防又能治疗由于破骨细胞过度活化所致的骨丢失现象。
因此,本发明第一个目的是提供一种分离的具有LGR4蛋白质胞外段结构的蛋白片段,所述蛋白片段的序列是选自如下所示的蛋白序列之任一种:
(1)如SEQ ID NO.1所示的蛋白序列;
(2)与SEQ ID NO.1所示的蛋白序列具有至少90%同一性且具有相同功能的蛋白;
(3)在SEQ ID NO.1所示的蛋白序列中发生一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、但具有相同功能的蛋白;
(4)在SEQ ID NO.1所示的蛋白序列的编码序列的基础之上经过一至数个碱基替换和/或一至数个碱基的***和/或缺失、以及大片段的核苷酸序列***、缺失、移位、或倒位后,所表达的且具有相同功能的蛋白片段;或
(5)在中度严格条件下能够与SEQ ID NO.1所示的蛋白序列的编码序列杂交且编码得到的具有相同功能的蛋白片段。
在一个实施方案中,所述蛋白序列优选还包括是发生1至5个突变、并与SEQ IDNO.l序列具有至少99%同源性的蛋白的其他蛋白序列,其中该蛋白具有相同功能。在优选的实施方案中,所述突变是1-4个,更优选是1-3个,或者更优选是1或2个,最优选是发生1个突变。其中,所述突变优选是替换、***或缺失突变。应当指出的是,本发明所涉及的蛋白序列,其通过具有一定序列组成的蛋白所形成的特有空间构象,与RANK竞争结合RANKL,从而抑制破骨细胞分化与功能,其并非直接作用于相关位点或发挥功能来抑制抑制破骨细胞分化与功能。而SEQ ID NO.1所示蛋白序列全长504aa,其具有99%同源性的序列与所述SEQID NO.1所示蛋白序列,二者差别不到5个aa的突变。而对于本领域技术人员而言,对于相同来源(人类基因组)的多个蛋白序列,彼此之间具有99%的同源性且不到5个突变的序列,其更多情况被证实具有相同的功能,而不是被证实其功能缺失。因此本领域技术人员可以预见,在限定上述序列、有限同源性以及突变数量的前提下,所述的其他蛋白序列同样具有相同或相似的功能。
在一个实施方案中,上述(1)中所述如SEQ ID NO:1所示的蛋白片段为人源的LGR4-ECD(以下简称h4),其能与核因子κB配体的受体激活子相结合。
在其它的实施方案中,所述蛋白片段具有抑制RANKL、或抑制RANKL-RANK的结合的功能,从而抑制或治疗因破骨细胞引起的骨质类疾病。
本发明第二个目的是提供以上蛋白片段的基因编码序列或其简并序列。
本发明第三个目的在于提供上述蛋白片段在制备治疗破骨细胞诱导的骨病的药物中的用途。其中,所述蛋白片段用于抑制体内破骨细胞分化。进一步地,包括所述蛋白片段在骨质疏松症与骨巨细胞瘤疾病治疗中的应用,包括所述蛋白片段在制备治疗骨质疏松症与骨巨细胞瘤疾病的药物中的应用。
在一个实施方案中,所述蛋白片段能抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化。
在另一实施方案中,所述蛋白片段能抑制由RANKL过度刺激所引起的体内骨质减少。
在另一实施方案中,所述蛋白片段能缓解患有骨质疏松症小鼠的骨质减少,缓解由于骨质疏松引起的骨质减少。
在另一实施方案中,所述蛋白片段能抑制骨巨瘤患者的破骨细胞活性。
在上述实施方案中,上述制药用途包括制备抑制破骨细胞引起的骨质疏松症的药物、或抑制肿瘤生长和转移的药物。在一具体的实施方案中,其中,所述的抑制破骨细胞引起的骨质疏松症的药物是用于治疗类风湿性关节炎、关节炎、肿瘤转移引起的骨组织吸收过多所致的骨质疏松症的药物;其中,抑制肿瘤生长和转移的药物指抑制骨巨瘤或骨巨细胞瘤的药物,包括制备治疗骨原发的良性侵袭性肿瘤的药物。
在上述实施方案中,所述药物还包括药学上可接受的盐、载体或辅料成分。
在另外的实施方案中,上述药物还可与其他药物活性成分联合制备上述疾病的药物。
本发明第四个目的在于提供上述蛋白片段用于研究体外或体内抑制破骨细胞分化的用途。
在一个实施方案中,所述用途是利用上述蛋白片段研究体外或体内抑制破骨细胞分化的用途。例如,将本发明所述蛋白片段用于制备在体外或体内抑制破骨细胞分化的药物。
在另一个实施方案中,所述用途是利用上述蛋白片段研究体外或体内抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化的用途。例如,将本发明所述蛋白片段用于制备在体外或体内抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化的药物。
在另一实施方案中,所述用途是利用上述蛋白片段研究体外或体内抑制成由RANKL过度刺激所引起的体内骨质减少的用途。例如,将本发明所述蛋白片段用于制备在体外或体内抑制由RANKL过度刺激所引起的体内骨质减少的药物。
在另一实施方案中,所述用途是利用上述蛋白片段研究体外或体内缓解患有骨质疏松症小鼠的骨质减少的用途。例如,将本发明所述蛋白片段用于制备在体外或体内缓解由于骨质疏松症引起的骨质减少的药物。
在另一实施方案中,所述用途是利用上述蛋白片段研究体外或体内抑制骨巨瘤患者的破骨细胞活性的用途。例如,将本发明所述蛋白片段用于制备在体外或体内抑制骨巨瘤中破骨细胞活性的药物。
在以上实施方案中,更具体的用途是利用上述蛋白片段,用于筛选抑制或缓解上述疾病或症状的药物的用途。上述疾病或症状包括,成骨细胞诱导的破骨细胞分化,由RANKL过度刺激所引起的体内骨质减少,由于骨质疏松症引起的骨质减少,骨巨瘤中及破骨细胞活性。
术语和定义
术语“G蛋白偶联受体(G-protein Coupled Receptor,GPCR)”,是一类具有古老起源的保守的细胞表面受体,其对多种环境刺激起反应,引起细胞内的应答,在许多生理学过程中发挥重要作用并且是药物研究的重要靶点。
术语“蛋白片段”,指LGR4活性蛋白中的部分片段。
术语“人源LGR蛋白”指具有富亮氨酸重复基序的人源G蛋白偶联受体(leucinerich repeat containing G prtein coupled receptor)家族。
术语“人源LGR4蛋白片段”指具有SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸的蛋白片段,其长度为504aa。其中,人LGR4蛋白的全长为951aa,其NCBI登录号为NP_060960.2,该全长蛋白的功能为调控了眼、肾、睾丸、卵巢、子宫的脏器及智力发育,并能作为调控白色脂肪向棕色脂肪转换的开关,激活Wnt信号通路并促进结肠癌等癌症的发生。
术语“RANK”,指受体激活型核受体因子κB(Receptor activator of nuclearfactorκB),其NCBI登录号为NP_033425.3,其功能为引起乳腺癌发生,促进破骨细胞形成并调节骨质,促进***发育,增强T细胞生长及树突状细胞的功能。
术语“RANKL”,指受体激活型核受体因子κB配体(Receptor activator ofnuclear factorκB ligand),其NCBI登录号为NP_035743.2,其功能为促进破骨细胞形成,促进树突状细胞的存活,增强T细胞生长及树突状细胞的功能。
术语“RANKL-RANK”,指RANKL与RANK蛋白的相互作用。
术语“Opg敲除小鼠”,指Opg基因敲除小鼠,目前是一种公认的骨质疏松动物模型。
术语“至少90%同一性”,指序列彼此之间相同位点数目的比例超过90%。本发明中,所述蛋白序列优选是具有91%、92%、93%、或94%同一性,更优选是具有95%、96%、或97%同一性,最优选是具有98%、或99%同一性。
术语“中等严格条件”指0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS(w/v)的溶液中,65℃条件下杂交并洗膜的条件。
附图说明
图1所示为LGR4蛋白片段的纯化表达图,其中,
图1a所示为LGR4蛋白片段SDS-PAGE考马斯亮蓝结果图,箭头所示为纯化得到的LGR蛋白片段。
图1b所示为LGR4蛋白片段蛋白免疫印迹结果图,h4组的目的条带为经His标签抗体检测确认的LGR4蛋白片段。NC,阴性对照。
图2所示为LGR4蛋白片段与RANKL相互作用图,其显示LGR4蛋白片段(LGR4 ECD)过表达293T细胞裂解液与RANKL蛋白免疫沉淀结果,RANKL可与LGR4 ECD发生共沉淀,RSPO-1为阳性对照。
图3所示为LGR4蛋白片段与RANK竞争结合RANKL图,其显示LGR4蛋白片段(LGR4ECD)过表达293T细胞裂解液、RANK过表达293T细胞裂解液与RANKL蛋白免疫沉淀结果。RANKL与RANK的相互作用随着LGR4 ECD加入浓度的提高而不断减弱。
图4所示为LGR4蛋白片段体外抑制破骨细胞分化图,其中,
图4a显示抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)酶活检测结果图,酒红色巨细胞为破骨细胞,该结果表明LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化。
图4b显示LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)抑制RANKL诱导的破骨细胞分化计量数据分析图,其中***p<0.001,n=3,p值经student T-test检验而得,p值小于0.001定义为***,以示LGR4蛋白片段抑制破骨细胞分化有无显著性差异;n=3表示该实验一组设计了3个重复孔。
图5所示为LGR4蛋白片段抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化图,其中,
图5a显示抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果图,酒红色巨细胞为破骨细胞。该结果表明LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能抑制由成骨细胞诱导的破骨细胞分化。
图5b显示LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化计量数据分析图,其中*p<0.05,n=3。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,以示LGR4蛋白片段抑制破骨细胞分化有无显著性差异;n=3表示该实验一组设计了3个重复孔。
图6所示为LGR4蛋白片段抑制RANKL注射引起的破骨细胞分化及骨质丢失的动物实验综合图,其中
图6a-1显示抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果图,酒红色信号为破骨细胞;该结果表明LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能抑制RANKL诱导的体内急性破骨细胞分化。图6a-2显示LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)抑制RANKL诱导的体内急性破骨细胞分化破骨细胞表面积计量数据分析图,其中***p<0.001,n=6。p值经student T-test检验而得,p值小于0.001定义为***,以示LGR4蛋白片段抑制体内破骨细胞分化有无显著性差异;n=6表示该实验一组使用了6只小鼠。
图6b-1所示为microCT结果显示注射LGR4胞外段蛋白染色结果图,箭头所示为骨损伤及蛋白片段处理后的修复区,该结果表明注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能缓解RANKL注射所引起的骨质丢失;图6b-2显示LGR4蛋白片段缓解RANKL注射引起的骨质丢失的骨量计量数据分析图,其中*P<0.05,**P<0.01,n=6。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,p值小于0.01定义为**,以示LGR4蛋白片段抑制体内破骨细胞分化有无显著性差异;n=6表示该实验一组使用了6只小鼠。
图7所示为LGR4蛋白片段缓解Opg敲除小鼠破骨细胞的过度活化及骨质疏松症状的动物实验综合结果图
图7a所示为抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果显示注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4,参见表1)能抑制Opg敲除小鼠颅骨中破骨细胞的过度活化,酒红色信号为破骨细胞。图7a-1为染色结果图,图7a-2为数据分析图。**P<0.01,***P<0.001,n=6。p值经student T-test检验而得,p值小于0.01定义为**,p值小于0.001定义为***,以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠体内破骨细胞分化有无显著性差异;n=6表示该实验一组使用了6只小鼠。
图7b所示为microCT结果显示注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4,参见表1)能缓解Opg小鼠颅骨的骨质疏松症状,箭头所示为骨损伤及蛋白片段处理后的修复区。图7b-1为染色结果图,图7b-2为数据分析图。*P<0.05,**P<0.01,n=6。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,p值小于0.01定义为**,以示LGR4蛋白片段缓解Opg敲除小鼠骨质丢失有无显著性差异;n=6表示该实验一组使用了6只小鼠。
图7c所示为抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果显示注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4,参见表1)能抑制Opg敲除小鼠胫骨中破骨细胞的过度活化,酒红色信号为破骨细胞。图7c-1为低倍镜显示结果,图7c-2为高倍镜显示结果,图7c-3为数据分析图。***P<0.001,n=11。p值经student T-test检验而得,p值小于0.001定义为***,以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠体内破骨细胞分化有无显著性差异;n=11表示该实验一组使用了11只小鼠。
图7d所示为microCT结果显示注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4,参见表1)能缓解Opg小鼠胫骨的骨质疏松症状。图7d-1为染色结果图,图7d-2为数据分析图。*P<0.05,n=11。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,以示LGR4蛋白片段缓解Opg敲除小鼠骨质丢失有无显著性差异;n=11表示该实验一组使用了11只小鼠。
图8所示为LGR4蛋白片段体外抑制骨巨细胞瘤患者中巨细胞活化结果图,其中,
图8a所示为抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果图,酒红色巨细胞为破骨细胞;该结果表明LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能抑制骨巨细胞瘤原代细胞中破骨细胞的分化。图8b显示LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)抑制骨巨细胞瘤原代细胞中破骨细胞分化的计量数据分析图,其中*p<0.05,**p<0.01,n=3。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,p值小于0.01定义为**,以示LGR4蛋白片段抑制骨巨细胞瘤中破骨细胞分化有无显著性差异;n=3表示该实验一组设计了3个重复孔。
具体实施方式
现结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
实施例一:LGR4蛋白片段的纯化表达
PCR扩增LGR4基因,将扩增产物构建到PET-28a(+)原核表达载体上,PET-28a-ECD转化Rosetta菌(全式金,cd801-03),构建过程参照表1。
表1
根据“生物物理学报2010年9月第26卷第9期:790-798”报道的一般原核表达方法,将上述载体转化Rosetta菌,诱导表达LGR4蛋白片段,实验结果见图1。
图1a:LGR4蛋白片段(LGR4 ECD,h4)SDS-PAGE考马斯亮蓝结果图,箭头所示为纯化得到的LGR蛋白片段。
图1b:LGR4蛋白片段(LGR4 ECD,h4)蛋白免疫印迹结果图,h4组的目的条带为经His标签抗体检测确认的LGR4蛋白片段。NC,阴性对照。
实施例二:LGR4蛋白片段结合RANKL实验
使用lipofectamine2000按照制造商方案将含有上述LGR4片段的质粒(构建过程参见下文)过表达于293T细胞中,转染24小时后,细胞以PBS洗一遍,用细胞刮刀刮下,经12000rpm离心一分钟后将细胞块以RIPA弱裂解液于冰上裂解15分钟,经12000rpm 4度离心10分钟后取上清于新EP管中,分别加入500ngRANKL及200ngRSPO-1(阳性对照);EP管置静音混合器上4摄氏度孵育过夜(<12小时),翌日每管加入5微升FLAG-M2珠子,继续于4摄氏度孵育3小时,后以3000rpm于4度离心1分钟,去上清,用PBS洗3遍后以1XSDS上样缓冲液裂解珠子,100摄氏度煮沸10分钟后进行免疫印迹实验。免疫印迹实验具体流程如下:
1)配置10%分离胶
2)将全部样品上到胶孔中,60伏跑30分钟,120伏继续跑至溴酚蓝到胶底(约75分钟)
3)转膜,100伏转,40KD以下蛋白转45分钟,40KD~130KD蛋白转90分钟
4)5%脱脂牛奶室温封闭1小时
5)一抗4摄氏度结合过夜
6)PBST洗涤4次,每次5分钟,后上相应荧光二抗,室温1小时
7)PBST洗涤3次,每次5分钟,后用Licor Oddessy机子扫膜,记录结果
实验结果见图2
图2:LGR4蛋白片段(LGR4 ECD)过表达293T细胞裂解液与RANKL蛋白免疫沉淀结果,RANKL可与LGR4 ECD发生共沉淀,RSPO-1为阳性对照。
表2
根据实验结果可见,本发明所述蛋白片段能够与RANKL结合,具有抑制RANKL的效果,本发明所述蛋白片段可用于抑制或治疗因破骨细胞引起的骨质类疾病。
实施例三:LGR4蛋白片段抑制RANKL-RANK结合实验
使用lipofectamine2000按照制造商方案将10ug LGR4片段质粒(参见表2)、6ugRank、4ug FLAG-Vector以及2ugEGFP-N3分别过表达于293T细胞中,转染24小时后,细胞分别以PBS洗一遍,用细胞刮刀刮下,经12000rpm离心一分钟后将细胞块以RIPA弱裂解液于冰上裂解15分钟,经12000rpm4摄氏度离心10分钟后取上清于新EP管中,按如下设计混合蛋白裂解液:2ugEGFP-N3+2ugFLAG、2ugRANK+2ugFLAG、2ugRANK+2ugLGR4片段、2ugRANK+8ugLGR4片段,而后再分别加入100ngRANKL;EP管置静音混合器上4摄氏度孵育过夜,翌日每管先加入4微升RANK抗体(1:50),4摄氏度孵育3小时,再加入20微升proteinA/G珠子,继续于4摄氏度孵育3小时,后以3000rpm于4摄氏度离心1分钟,去上清,用PBS洗3遍后以1XSDS上样缓冲液裂解珠子,100摄氏度煮沸10分钟后进行免疫印迹实验。免疫印迹实验具体流程如下:
1)配置10%分离胶
2)将全部样品上到胶孔中,60伏跑30分钟,120伏继续跑至溴酚蓝到胶底(约75分钟)
3)转膜,100伏转,40KD以下蛋白转45分钟,40KD~130KD蛋白转90分钟
4)5%脱脂牛奶室温封闭1小时
5)一抗4摄氏度结合过夜
6)PBST洗涤4次,每次5分钟,后上荧光二抗,室温1小时
7)PBST洗涤3次,每次5分钟,后用LicorOddessy机子扫膜,记录结果
实验结果见图3
图3:LGR4蛋白片段(LGR4 ECD)过表达293T细胞裂解液、RANK过表达293T细胞裂解液与RANKL蛋白免疫沉淀结果。RANKL与RANK的相互作用随着LGR4 ECD加入浓度的提高而不断减弱。
根据实验结果可见,本发明所述蛋白片段具有抑制RANKL-RANK的结合的效果,本发明所述蛋白片段可用于抑制或治疗因破骨细胞引起的骨质类疾病。
实施例四:LGR4蛋白片段体外抑制破骨细胞分化
取6周大野生型与敲除型小鼠股骨与胫骨组织,剔除非骨组织,经酒精消毒及PBS洗涤后,用剪刀剪开股骨与胫骨的两端,使用10毫升注射器及27G针头按2~3mlα-MEM培养基/股骨将骨髓单核吞噬细胞冲出至50毫升离心管中,细胞悬液经1000rpm离心8分钟后去除上清,以5毫升含双抗的无血清α-MEM培养基重悬细胞,后加入20毫升红细胞裂解液,上下混匀后静置2分钟,再加入25毫升含10%血清的α-MEM培养基终止裂解,经1000rpm离心8分钟后去上清,用适量含10%血清的α-MEM培养基重悬细胞,加入5ng/ml吞噬细胞集落刺激因子,待细胞贴壁过夜后取悬浮细胞至新培养皿中,加入10ng/ml吞噬细胞集落刺激因子培养,待细胞贴壁长满后,以Versene消化细胞并按104个/孔接入24孔板中,以核因子κB受体激活子配体(100ng/ml)及吞噬细胞集落刺激因子(10ng/ml))刺激骨髓单核吞噬细胞向破骨细胞分化,在加入100ng/ml RANKL诱导分化的同时加入浓度梯度(20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)的LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4)(参见表1)处理细胞,经6天分化后根据TRAP染色试剂盒说明书所述(Sigma公司)进行TRAP染色并计数统计细胞分化情况。
实验结果见图4。
图4a显示抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)酶活检测结果图,酒红色巨细胞为破骨细胞,该结果表明LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化。
图4b显示LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)抑制RANKL诱导的破骨细胞分化计量数据分析图,其中***p<0.001,n=3,p值经student T-test检验而得,p值小于0.001定义为***,以示LGR4蛋白片段抑制破骨细胞分化有无显著性差异;n=3表示该实验一组设计了3个重复孔。
根据实验结果可见,本发明所述蛋白片段对破骨细胞的分化具有抑制作用。本发明所述蛋白片段能够抑制由RANKL诱导的破骨细胞的分化。
实施例五:LGR4蛋白片段抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化
根据实施例四方法取得原代骨髓单核吞噬细胞(BMM);同时,选取出生后4天的乳鼠取得成骨细胞,具体方法为:分离4天龄小鼠颅骨,经75%酒精洗涤晾干后用解剖刀刮干净颅骨表面至浸泡PBS中骨面呈白色为止;其后将颅骨置12孔板中,加入3.5毫升普通强度消化液(3.5毫升α-MEM培养基、35微升10mg/ml胶原酶P、88微升0.05%胰酶)于37摄氏度培养箱中消化30分钟,用无菌镊子转移颅骨至6孔板中,加入800微升高强度消化液(1毫升α-MEM培养基、20微升10mg/ml胶原酶P、25微升0.05%胰酶),用无菌剪刀将颅骨剪成小碎片,以一片完整颅骨剪成均匀的30~40片为宜,于37摄氏度培养箱消化60分钟,最后加入2毫升培养基(42毫升α-MEM培养基、7.5毫升胎牛血清、500微升100X双抗)终止消化待其贴壁;贴壁细胞即为成骨细胞。
于96孔板中每孔接入1X104个BMM细胞与1X103个成骨细胞,24小时贴壁培养后加入浓度梯度的LGR4蛋白片段(LGR4-ECD;20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)处理细胞,经7天培养后根据TRAP染色试剂盒说明书所述(Sigma公司)进行TRAP染色并计数统计细胞分化情况。
实验结果见图5。
图5a显示抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果图,酒红色巨细胞为破骨细胞。该结果表明LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能抑制由成骨细胞诱导的破骨细胞分化。
图5b显示LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化计量数据分析图,其中*p<0.05,n=3。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,以示LGR4蛋白片段抑制破骨细胞分化有无显著性差异;n=3表示该实验一组设计了3个重复孔。
根据实验结果可见,本发明所述蛋白片段对破骨细胞的分化具有抑制作用。本发明所述蛋白片段能够抑制由成骨细胞诱导的破骨细胞的分化。
实施例六:LGR4蛋白片段抑制RANKL注射引起的破骨细胞分化及骨质丢失的动物实验
分别设立对照蛋白组、RANKL单注射组、LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4)单注射组及RANKL、LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4)共注射组;将表达蛋白注射于6周龄的C57BL/6小鼠颅骨皮下,连续注射14天后取小鼠颅骨,经4%甲醛固定后,根据TRAP染色试剂盒说明书所述(Sigma公司)对颅骨整体进行TRAP染色,于37摄氏度染色2小时;同时,颅骨样品由上海肿瘤研究所进行micro-CT检测(SKYSCAN公司)。上述实验结果见图6。
图6a-1:抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果图,酒红色信号为破骨细胞;该结果表明LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能抑制RANKL诱导的体内急性破骨细胞分化。图6a-2显示LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)抑制RANKL诱导的体内急性破骨细胞分化破骨细胞表面积计量数据分析图,其中***p<0.001,n=6。p值经student T-test检验而得,p值小于0.001定义为***,以示LGR4蛋白片段抑制体内破骨细胞分化有无显著性差异;n=6表示该实验一组使用了6只小鼠。
图6b-1:microCT结果显示注射LGR4胞外段蛋白染色结果图,箭头所示为骨损伤及蛋白片段处理后的修复区,该结果表明注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能缓解RANKL注射所引起的骨质丢失;图6b-2显示LGR4蛋白片段缓解RANKL注射引起的骨质丢失的骨量计量数据分析图,其中*P<0.05,**P<0.01,n=6。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,p值小于0.01定义为**,以示LGR4蛋白片段抑制体内破骨细胞分化有无显著性差异;n=6表示该实验一组使用了6只小鼠。
根据实验结果可见,本发明所述蛋白片段能够抑制由RANKL过度刺激引起的破骨细胞分化、及体内骨质减少。
实施例七:LGR4蛋白片段缓解Opg敲除小鼠破骨细胞的过度活化及骨质疏松症状的动物实验
对5月龄的野生型小鼠及Opg敲除小鼠分别设立对照蛋白组、LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4)注射组;将表达蛋白分别注射于野生型小鼠及Opg敲除小鼠颅骨皮下,连续注射14天后取小鼠颅骨,经4%甲醛固定后,根据TRAP染色试剂盒说明书所述(Sigma公司)对颅骨整体进行TRAP染色,于37摄氏度染色2小时,实验结果见图7a;同时,颅骨样品由上海肿瘤研究所进行micro-CT检测(SKYSCAN公司),实验结果见图7b;
对5月龄的Opg敲除小鼠的左腿与右腿分别注射PBS及LGR4蛋白片段h4;将表达蛋白分别注射于Opg敲除小鼠的胫骨皮下,连续注射14天后取小鼠胫骨,经4%甲醛固定24小时后,进行脱钙包埋切片,具体流程如下:胫骨样品经清水洗涤后用新鲜4%甲醛再固定6小时,清水洗涤,置0.5MEDTA(PH8.0)分别常温脱钙7天,后用双蒸水清洗10次,置PBS中常温浸泡3小时,之后进行组织石蜡包埋过程,过程如下:样品分别置50%、75%、75%(4摄氏度过夜)、85%、95%、95%(4摄氏度过夜)、100%、100%酒精中脱水2小时,后分别置50%二甲苯(酒精为稀释溶剂)、100%二甲苯、100%二甲苯中透化2小时,再置融化的石蜡油中60摄氏度过夜、新鲜蜡油中2小时,样品包埋;包埋样品经Leica切片机(RM2235)切成6uM切片后进行TRAP染色,染色具体流程如下:
1)切片经60摄氏度化腊1小时;
2)切片分别经100%二甲苯、100%二甲苯、50%二甲苯(酒精为稀释溶剂)、100%酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精、双蒸水、双蒸水水化,每道流程均处理5分钟;
3)根据TRAP染色试剂盒说明书所述(Sigma公司)对切片进行TRAP染色,于37摄氏度染色2小时;
4)切片置双蒸水中终止染色,0.1%甲基绿中复染,封片;
5)切片于Olympus显微镜下采集结果,利用osteomeasure分析软件(查尔斯骨计量公司)进行破骨细胞参数分析,实验结果见图7c;同时,胫骨样品由上海肿瘤研究所进行micro-CT检测(SKYSCAN公司),实验结果见图7d。
图7a:抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果显示注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4,参见表1)能抑制Opg敲除小鼠颅骨中破骨细胞的过度活化,酒红色信号为破骨细胞。**P<0.01,***P<0.001,n=6。p值经student T-test检验而得,p值小于0.01定义为**,p值小于0.001定义为***,以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠体内破骨细胞分化有无显著性差异;n=6表示该实验一组使用了6只小鼠。
图7b:microCT结果显示注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4,参见表1)能缓解Opg小鼠颅骨的骨质疏松症状,箭头所示为骨损伤及蛋白片段处理后的修复区。*P<0.05,**P<0.01,n=6。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,p值小于0.01定义为**,以示LGR4蛋白片段缓解Opg敲除小鼠骨质丢失有无显著性差异;n=6表示该实验一组使用了6只小鼠。
图7c:抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果显示注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4,参见表1)能抑制Opg敲除小鼠胫骨中破骨细胞的过度活化,酒红色信号为破骨细胞。图7c-1为低倍镜显示结果,图7c-2为高倍镜显示结果,图7c-3为数据分析图。***P<0.001,n=11。p值经student T-test检验而得,p值小于0.001定义为***,以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠体内破骨细胞分化有无显著性差异;n=11表示该实验一组使用了11只小鼠。
图7d:microCT结果显示注射LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4,参见表1)能缓解Opg小鼠胫骨的骨质疏松症状。*P<0.05,n=11。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,以示LGR4蛋白片段缓解Opg敲除小鼠骨质丢失有无显著性差异;n=11表示该实验一组使用了11只小鼠。
根据实验结果可见,本发明所述蛋白片段能够缓解骨质疏松症及骨质减少,能够抑制破骨细胞的过度活化,能够抑制由于Opg敲除引起的破骨细胞过度活化,并治疗由于Opg敲除引起破骨细胞过度活化而导致的骨质疏松症。
实施例八:LGR4蛋白片段体外抑制骨巨细胞瘤患者中巨细胞活化
于患者原代分离的骨巨细胞瘤中加入浓度梯度的LGR4蛋白片段(LGR4-ECD,即h4,参见表1;100ng/ml、500ng/ml、2000ng/ml)处理细胞,经4天处理后,根据TRAP染色试剂盒说明书所述(Sigma公司)进行TRAP染色并计数统计细胞分化情况。实验结果见图8。
图8a:抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色结果图,酒红色巨细胞为破骨细胞;该结果表明LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)能抑制骨巨细胞瘤原代细胞中破骨细胞的分化。图8b显示LGR4蛋白片段(LGR4-ECD)抑制骨巨细胞瘤原代细胞中破骨细胞分化的计量数据分析图,其中*p<0.05,**p<0.01,n=3。p值经student T-test检验而得,p值小于0.05定义为*,p值小于0.01定义为**,以示LGR4蛋白片段抑制骨巨细胞瘤中破骨细胞分化有无显著性差异;n=3表示该实验一组设计了3个重复孔。
根据实验结果可见,本发明所述蛋白片段能够抑制骨巨细胞瘤,能够抑制骨巨细胞瘤中破骨细胞的活性,从而抑制肿瘤生长和转移。
Claims (5)
1.具有LGR4蛋白质胞外段结构的如SEQ ID NO.1所示的蛋白片段在制备抑制骨巨细胞瘤的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述蛋白片段能抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化,或能抑制骨巨细胞瘤中的破骨细胞活性。
3.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述药物还包括药学上可接受的盐、载体或辅料成分,和/或所述药物与其他药物活性成分联合制备的药物。
4.具有LGR4蛋白质胞外段结构的如SEQ ID NO.1所示的蛋白片段在制备用于在体外或体内抑制破骨细胞分化的药物中的用途。
5.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述蛋白片段用于制备在体外或体内抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化的药物;或,所述蛋白片段用于制备在体外或体内抑制由RANKL过度刺激所引起的体内骨质减少的药物;或,所述蛋白片段用于制备在体外或体内抑制骨巨细胞瘤中破骨细胞活性的药物。
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