CN1119154C - 双歧三联活菌制剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双歧三联活菌制剂(培菲康)，该制剂是由两歧双歧杆菌(6-1)、粪链球菌和乳酸杆菌与保护剂组成的。本品能用于治疗消化不良、急慢性腹泻，菌群失调等消化***疾病，并有保健用途。本发明提供了制备方法。

Description

双歧三联活菌制剂及制备方法
本发明属微生物产品，具体涉及一种双歧三联活菌制剂及制备方法。
双歧杆菌、乳酸杆菌及粪链球菌是人和动物体内常见的正常菌群重要成员，集中粘附在下肠道粘膜，对机体发挥有益作用，能抑制外籍病原菌的入侵，其代谢产物提供宿主必需的维生素，参与和协助营养的消化和吸收。激发机体的免疫功能，减少肠源性毒性的吸收。由于消化***疾病或大量使用抗生素及随着年龄的增长，体内双歧杆菌逐渐减少。为保持上述有益菌的正常水平，人们开始研究含有这些有益菌的制剂。如中国专利CN1103584报道的三株口服液及其制法，其含有双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌和粪链球菌。但该口服液稳定性差，菌的存活率低，不宜长期保存。
本发明的目的在于克服上述口服液的缺点，设计一种稳定性好、使用方便、菌的存活率高的三菌联合制品。
本发明提供了一种双歧三联活菌制剂(培菲康)，该制剂是由两歧双歧杆菌(6-1)、乳酸杆菌和粪链球菌冷冻干燥活菌粉作为活性成份与保护剂组成的，并且可以按含活性成份为0.01～99.99％与含保护剂为99.99～0.01％的任意配比组成100％的组成，其中两歧双歧杆菌(6-1)与乳酸杆菌和粪链球菌可以按1～5∶1～5∶1～5的任意比例组成活性成份，保护剂可以为含脱脂奶粉10-20％、异乳糖10-20％、维生素C-钠0.01-0.2％、谷氨酸钠0.01-2％、维生素E0.01-2％、β-环糊精6-20％、淀粉6-20％的任意比例组成保护剂。
本发明的菌种来源及其生物学特征如下：
菌种来源及其生物学特征
1、菌种来源
(1)两歧双歧杆菌(6-1)，由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所分离、赠予。
选取健康儿童(1-5岁)的新鲜粪便0.5克，置4.5毫升PBS稀释液中混匀，并做10倍系列稀释，取合适浓度涂BL平板，37℃厌氧培养72小时。在BL平板上长出的双歧杆菌，菌落呈圆形，稍突出，个别中凹，颜色多呈褐色，咖啡色灰白色或乳白色，不透明，有光滑或粗糙型，直径约0.5-2.0毫米。挑取典型菌落纯培养并做需氧试验，在众多的典型菌落中，选到了双歧杆菌6-1株。经镜检，生理生化反应并结合代谢物的分析，鉴定为两歧双歧杆菌(6-1)(B.bifidum6-1株)。结果见表一，鉴定结果符合：BuchananBL et al(1977)：Bergeys Mannual of Determimative Bacteriology 8th ed书中有关Bifidobacterium bifidum的描述。
表一  两歧双歧杆菌与两歧双歧杆菌(6-1)
        菌种的理化特征比较表
             菌株项目 两歧双歧杆菌 两歧双歧杆菌(6-1)
革兰氏染色     G+       G+
动力     -       -
触酶试验     -       -
美兰牛奶试验     -       -
牛奶凝固试验     +       +
6.5％NaCl肉浸液     -       -
明胶液化试验     -       -
糖发酵试验
葡萄糖     +       +
乳糖     +       +
麦芽糖     -       +
棉子糖     -       +
蔗糖     -       -
山梨醇     -       -
甘露醇     -       -
45℃厌氧培养     -       -
45℃需氧培养     -       -
(2)嗜酸乳酸杆菌和粪链球菌的来源
嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus YIT2004)和粪链球菌(Strep.faecalis YIT0027)皆由日本歧阜药科大学赠。
2、生物学特征
(1)培养特征及菌体形态
A两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)(6-1)株，在厌氧或微氧条件下生长，最适生长温度37～38℃，PH6.5-7.4。在BL平板上厌氧或微氧培养72小时的菌落呈圆形，凸起、乳白色、光滑、有粘性、大小不一。
革兰氏染色阳性，着色不均匀，无芽胞、无荚膜、无鞭毛，菌体呈直形或弯曲状，可出现“Y”或“V”型的分叉状，棒状等多形态。
B嗜酸乳酸杆菌Lactobacillus acidophilus YIT2004，为兼性厌氧菌，最适生长温度37～40℃，在45℃条件下能生长，最适PH5.5-6.5。在BL平板上需氧培养48小时的菌落呈圆形，***、乳白色、光滑，直径约1毫米。
革兰氏染色阳性，无芽胞、无荚膜、无鞭毛、两端钝圆的短杆或球杆状，单个或成双排列。
C 粪链球菌Streptococcus Faecalis YIT 0027，为兼性厌氧菌，最适生长温度37～40℃，在45℃条件下能良好生长，最适PH6.5-7.6，在BL平板上需氧培养24小时的菌落呈圆形、凸起。灰白色、光滑。
革兰氏染色阳性，无芽胞、无荚膜、无鞭毛、卵圆形，多成双排列，亦成短链。
本发明的双歧三联活菌制剂(培菲康)的稳定性试验结果如下：
     表2 培菲康胶囊留样测定结果
 批号 贮藏期    原          活     菌        量B.B CFU/G          L.A CFU/G         S.F CFU/G 测   定   结   果   活    菌    量B.B CFU/G         L.A CFU/G         S.F CFU/G
  1 6个月 1.00E+09  8.00E+07  1.50E+07 1.00E+09  2.50E+07 1.60E+07
  2 6个月 1.00E+09  8.00E+07  2.00E+07 1.00E+09  3.00E+07 1.00E+07
  3 6个月 1.00E+09  6.00E+07  4.00E+06 1.00E+08  3.10E+07 1.60E+06
  4 6个月 3.00E+09  2.50E+07  4.00E+07 2.00E+09  1.00E+07 1.30E+07
  5 6个月 1.50E+09  2.00E+08  6.00E+07 3.00E+08  3.00E+07 2.00E+07
  6 6个月 8.00E+08  8.00E+07  4.00E+07 3.00E+08  2.00E+07 2.00E+07
结论：
培菲康在出厂时其总活菌数为1.9～6.5亿CFU/g。置冰箱中保存一年，其总活菌数可达670万～3000万CFU/g。
表3  双歧杆菌冻干粉稳定性试验结果(贮藏温度2-8℃)
批号 贮存期 起始活菌数CFU/G 测定活菌数CFU/G     变化情况
  1   1年     3.5E+09     1.00E+10     无变化
  2 6个月     2.20E+09     2.70E+09     无变化
  3 6个月     1.70E+10     2.70E+09     降E+01
  4   1年     3.00E+07     1.00E+07     无变化
  5   1年     1.00E+07     1.10E+07     无变化
  6   1年     300E+07     2.40E+06     降E+01
表4  乳酸杆菌冻干粉稳定性试验结果(贮藏温度2-8℃)
批号 贮存期 起始活菌数CFU/G 测定活菌数CFU/G     变化情况
  1 1年     4.6×109     1×108     降E+01
  2 1年     3.0×109     1.7×108     降E+01
  3 1年     1.7×109     5.0×107     降E+02
  4 10个月     3.0×109     2.0×108     降E+01
  5 6个月     1.0×1011     8×1010     降E+01
  6 6个月     2.0×1010     1.0×1010     无变化
表5  粪链球菌冻干粉稳定性试验结果(贮藏温度2-8℃)
批号 贮存期 起始活菌数CFU/G 测定活菌数CFU/G     变化情况
  1 1年     3.0×1010     3.0×109     降E+01
  2 1年     3.0×1010     2.8×109     降E+01
  3 1年     2.0×1010     1.5×109     降E+01
  4 11个月     6.0×109     3.5×108     降E+01
  5 6个月     3.0×1010     5×109     降E+01
  6 6个月     3.0×1010     2.2×1010     无变化
本发明的双歧三联活菌制剂(培菲康)的一般药理学研究试验结果如下：一、材料及方法：动物：狗三条，分别为10Kg、12Kg、12Kg。编号为1#、2#、3#。药物：培菲康胶囊(每粒含210mg菌粉，内含两歧双歧杆菌(6-1)4×106CFU、嗜酸乳酸杆菌4×106CFU、粪链球菌2×107CFU)。给药途径：口服三天观察三天后急性给药一次观察。药物剂量：1#，210mg×50(为人剂量的50倍)；210mg×24(为人剂量的20倍)；3#，210mg×12(为人剂量的10倍)。三、结论：
三只狗口服培菲康胶囊(大、中、小剂量)后对神经***、心血管***及呼吸频率和深度均未出现异常变化。
本发明的双歧三联活菌制剂(培菲康)的药效学研究试验结果如下：
为探讨双歧三联活菌制剂(培菲康)对肠道致病菌的作用机理及拮抗效力。我们分别以制剂中的两歧双歧杆菌(6-1)、嗜酸乳酸杆菌加粪链菌及成品制剂，对宋内氏和福氏志贺氏菌的拮抗作用进行了初步研究。
                材料1、菌种与制剂：
两歧双歧杆菌(6-1)(B.bifidum 6-1)，
嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus YIT 2004)，
粪链球菌(Strep.faecalis YIT 0072)，
宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei 73)
福氏志贺氏菌(Shigella flexneri 301)，
双歧三联活菌制剂(培菲康，批号：970107、970721)2、培养基：
PYG汤、BL琼脂、LB琼脂。3、其它：
需氧、厌氧培养装置，试管、吸管、三角瓶、平皿。
                 方法
在试验过程中，所用菌种需在同一环境条件下培养。经预备试验，我们选用了PYG汤为培养液，验证了所用菌种在37℃、厌氧条件下皆生长良好。并以此条件分别做了各种菌的对数生长曲线。一、两歧双歧杆菌(6-1)对宋内氏志贺氏菌的拮抗作用：1、宋氏菌液的制备：
接种宋氏菌于含100ml PYG汤的三角瓶中(接种量约103CFU/ml)，置37℃、厌氧条件下培养5小时(此时为该菌的对数中期)。取此培养液分装12支大试管每管6ml，分组编号为：O、A、B、C，每组三管。2、双歧杆菌液的制备：
接种双歧杆菌于含50ml PYG汤的三角瓶中(接种量约103CFU/ml)，置37℃、厌氧条件下培养16小时(此时该菌的对数中期)，制成菌液(1)。以PYG将菌液(1)做10倍、100倍稀释制成菌液(2)、(3)。3、混合培养：
分别取菌液(1)、(2)、(3)与A、B、C各组试管中的宋氏菌等量混合；在0组三管中分别补加6ml PYG汤做为对照。此时取O组菌液涂LB平板活菌计数，即为零时各组试管中宋氏菌值；取菌液(1)涂BL平板活菌计数，换算出零时A、B、C各组试管中的双歧菌值。
将以上四组12支试管置37℃厌氧条件下培养，不同时间取样涂LB平板计数宋氏菌值。二、嗜酸乳酸杆菌加粪链球菌对宋内氏志贺氏菌的拮抗作用1、宋氏菌液的制备：(同一)2、乳酸杆菌和粪链球菌的制备：
分别接种乳酸杆菌和粪链球菌于含50ml PYG汤的三角瓶中(接种量约103CFU/ml)，置37℃、厌氧条件下，分别培养11和5个小时(此时分别为二者的对数中期)制成两种菌液，取二者等量混和制成菌液(1)，以PYG汤将菌液(1)做10倍、100倍稀释制成菌液(2)、(3)。3、混合培养：(类同一)三、双歧三联活菌制剂(培菲康)对宋内氏和福氏志贺氏菌的拮抗作用1、宋氏和福氏菌液的制备：(类同一)2、制剂悬液的制备：
无菌称取制剂中的粉剂5g，加45ml PYG汤中混匀制成悬液(1)，以PYG汤将(1)液做10倍稀释制得系列悬液。3、混合培养：(类同一)
                   结果
在试管内，双歧三联活菌制剂对宋内氏和福氏志贺氏菌皆有明显的拮抗作用，48小时内能完全抑杀上述两种菌，其最低抑菌浓度为0.5-1mg/ml。
制剂中的三种菌在抑菌过程中体现出时间顺序(粪链球菌和嗜酸乳酸杆菌优先发挥抑菌效能，随后是两歧双歧杆菌(6-1))和协同效应。
本发明的双歧三联活菌制剂(培菲康)的动物毒性试验结果如下：1、全身毒性试验：
取制剂以无菌生理盐水稀释冷成悬液，分别径尾静脉注射、腹腔注射、灌胃、给每组每只小鼠各含160万个活菌的剂量(相当于人每公斤用量的四千多倍，计算方法见后)，(三组，20只小鼠/组，体重20-25克，雌雄各半)，观察七天。2、七天连续毒性试验：
以两歧双歧杆菌(6-1)液，经灌胃给每只小白鼠290万个活菌的剂量(相当于人每公斤用量的7千倍，计算方法同1)。双歧三联菌制剂，经灌胃给每只小鼠含3600万个菌的剂量(相当于人每公斤用量的9万倍，计算方法同1)。同时设生理盐水对照组(每组20只鼠，体重20-25克，雌雄各半)每日按上述剂量连续给七天。(昆明小鼠由预防医学科学院流研所动物室提供)。3、毒性试验结果：
试验过程中动物摄食，活动正常，无不良反应，体重上升，试验组与对照组动物体重增长幅度无显著差别。试验结束时，全身性毒性试验、七天连续毒性试验各组动物无一只死亡。以上结果证明，双歧三联活菌制剂中的两歧双歧杆菌(6-1)、嗜酸乳酸杆菌和粪链球菌均无毒性。
本发明的双歧三联活菌制剂(培菲康)通过动物试验和人体试验对双歧杆菌发酵的安全性进行研究的结果表明：
一、该乳制品对瑞士小白鼠，沪白1号/F 26+13小白鼠，NIH封闭群小白鼠，SD纯系大白鼠及日本大耳白家兔无急性毒性、蓄积毒性及刺激性。
三项致突变性试验均为阴性，表明双歧杆菌无致突变性。
二、从该乳制品对24名志愿受试者受试一月的人体试验和追踪观察一年的结果可知，对人体的健康安全未发现不良作用。
本发明的双歧三联活菌制剂(培菲康)临床研究结果如下：一、入选病例
1、成人急性腹泻：(1)轻型或者普通型急性菌痢：
*轻型--体温38℃以下，临床症状不明显，腹泻次数不超过4-5次/日，大便稀烂，肉眼不见脓血，培养阳性。
*普通型--体温38-39℃左右，白血球＜20,000/ml，有轻度里急后重，大便5-15次/日，带粘液或脓血，神志清醒，无嗜睡、惊厥，心血管功能良好，呼吸平稳。(2)原因不明急性腹泻(包括细菌性和病毒性等)；起病急，有不洁饮食史，腹泻水便＞3次/日，大便外观无脓血，镜检高倍视野白细胞＜15个。
2、成人慢性腹泻：大便＞2-3次/日，大便性状不正常，持续2-3个月以上，反复发作以及近期又犯者。
3、成人便秘：大便＞2-3天/次，便硬干结，且有排便困难，常需依靠开塞露或润肠剂，症状持续1周以上者。
4、小儿各种病因的急、慢性腹泻(感染性和非感染性)或便秘之0+--13周岁门诊或住院病儿。
二、研究方法
拟分试验和对照两组进行，以双盲和开放对比法用培菲康与乳酶生进行对比治疗。研究方案由北京友谊医院消化内科和临床药理室根据***药政局颁发的“消化***药物临床研究指导原则”和“新生物制品人体观察的技术要求”制定，并经各参加临床研究单位讨论通过。各单位严格按照方案的要求，按统一表格记录。资料齐备的合格病例方可定为可评价病例。
统计学处理，根据不同资料采用卡方检验和Ridit分析。
三、给药方法和剂量  病人于治疗前停用其它药物(抗生素、激素、其它止泻药或润肠剂)，随机分组给药；双盲组给外形相同的培菲康和乳酶生胶囊。成人：5粒/次，2-3次/日；儿童：0+--1岁1粒/次，1--6岁2粒/次，6--13岁3粒/次，3次/日。幼儿可剥开胶囊倒出粉剂温开水冲服。
四、结论：
1、本临床研究，用培菲康治疗成人或儿童轻、中型的急性腹泻和原因不明的慢性腹泻共401例；以乳酶生对照治疗139例。综合疗效：试验组，显效率为58.6％、有效率为38.9％、总有效率为87.5％；对照组三者分别为：22.3％、28.1％50.4％。两组疗效比较有显著性差异(P＜0.05)，说明培菲康治疗腹泻优于乳酶生。对比各组疗效可以看出，培菲康治疗急性腹泻的效果优于治疗慢性腹泻(二者疗效相比有显著性差异P＜0.05)。治疗成人和儿童急性腹泻的总有效率分别为92.3％和90.7％(其中显效者占主，分别为76.9％和59.0％)；而对慢性腹泻的总有效率则分别为：80.0％和76.3％(其中显效者分别为：43.6％和39.0％)。
2、培菲康除了可用于治疗原因不明的腹泻外，尚对感染性腹泻(病原包括：痢疾杆菌、沙门氏菌、致病大肠菌、空肠弯曲菌、气单胞菌及轮状病毒等)有疗效。试验组中有52例治疗前检出病原菌(细菌类)，有8例检出轮状病毒，治疗后52例中有50例(96.2％)转阴，8例轮状病毒性肠炎患者治疗后虽未做病毒检验，但全部显效。对照组病原菌的转阴率仅50％，两组比较有明显差异(P＜0.01)。
3、培菲康对慢性腹泻的疗效虽不及对急性腹泻，但确有一定效果。多数慢性腹泻患者试验前均有不同程度的服过其他药物而无明显效果，或长期被诊断为“肠激惹综合症”，服用培菲康后80.0％的成人和76.3％的儿童患者痊愈或有好转。
4、培菲康确具调整肠道菌群的功能。从对19例成人和16例儿童腹泻患者治疗前、后主要肠菌群的检测结果来看，治疗前病人都不同程度的存在肠菌群紊乱，主要表现在：肠杆菌等需氧或兼性厌氧菌偏高，双歧杆菌等厌氧菌偏低，治疗后随着临床症状的消失上述状况得到改善，肠菌群基本恢复正常。
5、培菲康在治疗便秘方面，本项研究6例中有4例有效。
6、本临床试验，未发现服用培菲康后有明显副作用者，证实该品是安全的。
本发明的另一目的是提供了上述双歧三联活菌制剂(培菲康)的制备方法，该方法包括下列步骤：
将脱脂奶粉3.5～4.0％的水溶液与1.0％葡萄糖及3％的酵母膏置于高压锅内灭菌121℃10分钟，冷却至37～38℃分别置于三个罐内并在无菌条件下分别接种10％量的两歧双歧杆菌(6-1)、粪链球菌和乳酸杆菌，然后在37～38℃，罐内压0.3～0.6公斤/平方厘米发酵，其中两歧双歧杆菌(6-1)为充氮厌氧发酵，粪链球菌和乳酸杆菌为无菌空气发酵，发酵后2000rpm离心得菌泥，加等量保护剂，冷冻干燥，得冻干粉，然后将三个菌的冻干粉混合后加入淀粉及预胶化淀粉过40目筛混合后灌装胶囊(210mg/粒)或按常规方法制成颗粒剂、片剂。
本发明的双歧三联活菌制剂(培菲康)经***药品生物制品检定，所检定报如下：菌种鉴定(形态、染色、培养特征、耐氧试验、生化反应)：合格活菌计数：合格大肠杆菌计数：合格总杂菌数：合格安全试验：合格效力试验：合格总评：    合格
本发明的双歧三联活菌制剂(培菲康)能用于治疗消化不良、急慢性腹泻、菌群失调等消化***疾病，并有保健用途，有较好的社会效益和经济价值。
实例一、制备双歧三联活菌胶囊
在三个罐中分别加入脱脂奶粉7kg，葡萄糖12kg，酵母粉500g，溶于200kg水中，调PH6.5左右。121℃，10分钟灭菌，然后在每个罐中分别接种10％两歧双歧杆菌(6-1)、厌氧37℃培养18小时后冷却，嗜酸乳酸杆菌及粪链球菌，在需氧37℃培养20小时后冷却，分别离心得菌泥8kg左右，加入保护剂混匀，在-40℃冻冷干燥，得菌粉5kg左右。将上述三个菌粉混合，加入可压性淀粉20kg、硬脂酸镁400克，过40目筛，直接灌装胶囊。
保护剂配方：脱脂奶粉2kg、谷氨酸钠400克、异乳糖3kg、溶于12kg左右水中，121℃灭菌15分钟。
实例二、制备双歧三联活菌片剂
脱脂奶粉10kg、葡萄糖2kg、酵母粉1kg、硫酸铵500克、磷酸二氢钾150g，磷酸氢二钾300g，溶于200kg水中，调节PH7.0。
121℃，10分钟灭菌，然后按实例一操作，将得到三个冻干菌粉混合后加入β-环糊精2kg粉碎，加可压性淀粉20kg、乳糖2kg，混合过24目筛、压片。
保护剂配方②：脱脂奶粉2kg，维生素E20g，异乳糖3kg，维C钠30g，水12kg、121℃，10分钟灭菌。
实例三、制备双歧三联活菌颗粒剂
脱脂奶粉7kg，葡萄糖1.2kg，酵母粉500g、水200kg，调节PH7.0，121℃，10分钟灭菌。然后按实例一操作，将得到的三个冻干菌粉混合后，用0.1％HPMC溶液制成颗粒奶粉17kg，与菌粉混合，过12目筛，铝塑包装。
保护剂配方(同①)。
实例四、制备双歧三联活菌片剂
脱脂奶粉8kg，葡萄糖2kg，酵母精粉1.0kg、水200kg。调节PH6.5，121℃，10分钟灭菌。然后按实例1操作，将制得三种冻干菌粉，混入β-环糊精2kg、可压性淀粉16kg、乳糖4kg、乙基纤维素4kg，混合过24目筛，压片。
保护剂(同②)
实例五、制备双歧三联活菌胶囊
脱脂奶粉7kg，葡萄糖1.2kg，酵母粉500g、水200kg，调节PH6.5，121℃，10分钟灭菌。其它同实例一。
实例六、制备双歧三联活菌颗粒剂
脱脂奶粉10kg、葡萄糖2kg、酵母粉1.0kg、硫酸铵500g、磷酸二氢钾150g，磷酸氢二钾300g，溶于200kg水中，调节PH7.0左右，121℃，10分钟灭菌。然后按实例一操作，将制得三种冻干菌粉混合，混入β-环糊精2kg，加入用0.1％HPMC溶液制粒的奶粉17kg混和，过12目筛，制成颗粒剂、铝塑包装。
保护剂(同②)。

Claims (4)

1、一种双歧三联活菌制剂，其特征在于该制剂是由两歧双歧杆菌(6-1)、嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus YIT2004)和粪链球菌(Strep.faecalis YIT0027)冷冻干燥活菌粉作为活性成份与保护剂组成的，其中所述的两歧双歧杆菌(6-1)、嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus YIT2004)和粪链球菌(Strep.faecalis YIT0027)的比例为1-5∶1-5∶1-5。
2、根据权利要求1所述的一种双歧三联活菌制剂，其特征在于其中所述的保护剂为脱脂奶粉10-20％、异乳糖10-20％、维生素C-钠0.01-0.2％、谷氨酸钠0.01-2％、维生素E0.01-2％、β-环糊精6-20％、淀粉6-20％。
3、一种制备权利要求1或2的双歧三联活菌制剂的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
将3.5-4.0％脱脂奶粉的水溶液与1.0％葡萄糖及3％的酵母膏置于高压锅内，灭菌121℃10分钟，冷却至37-38℃后，分别置于三个罐内，并在无菌条件下，向三个罐内分别接种10％量的两歧双歧杆菌(6-1)、嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus YIT2004)和粪链球菌(Strep.faecalis YIT0027)，然后在37-38C，罐内压0.3-0.6公斤/平方厘米发酵，发酵后2000rpm离心得菌泥，加等量保护剂，冷冻干燥得冻干粉，然后将三个菌的冻干粉混合后，加入淀粉及预胶化淀粉，过40目筛混合后灌装胶囊或按常规方法制成片剂、颗粒剂。
4、根据权利要求3所述的双歧三联活菌制剂的制备方法，其特征在于其中所述的两歧双歧杆菌(6-1)采用充氮厌氧发酵，嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus YIT2004)和粪链球菌(Strep.faecalis YIT0027)采用无菌空气发酵。
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