ES2258793T5 - Moduladores de la regeneracion tisular. - Google Patents
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Abstract
SE EXPONEN PROTEINAS REGULADAS HACIA ARRIBA EN TEJIDOS LESIONADOS O EN REGENERACION, ASI COMO EL DNA QUE LAS CODIFICA, AL MISMO TIEMPO QUE COMPOSICIONES TERAPEUTICAS Y PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO QUE INCLUYEN ESTOS COMPUESTOS.
Description
Moduladores de la regeneración tisular.
La presente invención describe las proteínas que
son sobrereguladas en lesiones o en regeneración de tejidos, y el
ADN que codifica estas proteínas. Adicionalmente, la invención
describe composiciones terapéuticas y métodos del tratamiento
incluyendo estas proteínas.
Una remodelación dinámica de la arquitectura del
tejido se presenta durante el desarrollo y durante la reparación
del tejido después de una lesión. Para estudiar este proceso, hemos
fijado la atención en un modelo de lesión renal causada por una
lesión isquémica en la perfusión.
El riñón es capaz de reparar una lesión al
epitelio del túbulo proximal a través de una serie compleja de
eventos que involucran muerte celular, proliferación de células
túbulo epiteliales proximales supervivientes, formación de epitelio
regenerativo escasamente diferenciado sobre la membrana basal
desnuda, y la diferenciación del epitelio regenerativo para formar
células túbulo epiteliales proximales completamente funcionales
(Wallin et al., Lab. Invest. 66: 474-484,
1992; Witzgall et al., Mol. Cell. Biol. 13:
1933-1942, 1994; Ichimura et al., Am. J.
Physiol. 269: F653-662, 1995; Thadhani et
al., N. Engl. J. Med. 334: 1448-1460, 1996).
Factores de crecimiento tales como IGF, EGF y HGF han sido
implicados en éste proceso de reparación, así como la molécula de
adhesión de la célula endotelial ICAM- 1. Sin embargo, los
mecanismos mediante los cuales las células epiteliales tubulares se
restauran no se conocen todavía.
Para identificar las moléculas implicadas en el
proceso de lesión y reparación del epitelio tubular, analizamos la
diferencia en las poblaciones de mARN entre lesión/regeneración y
riñones normales empleando un análisis de diferencia
representacional (RDA). RDA es un método PCR-basado
en la sustracción la cual produce un tejido objetivo o fragmentos
de cADN de células específicas mediante sustracción repetitiva y
amplificación (Hubank and Schutz, Nucl. Acids Res. 22:
5640-5648, 1994).
WO 96/04376 revela una proteína receptora del
virus de Hepatitis A aislada del mono verde africano. En 1996, sus
inventores publicaron un abstract donde se relacionaba la
caracterización de una proteína humana conocida como un homólogo
humano de esta proteína de mono verde africano, ver Sociedad
Americana de Virología, 15ta Reunión Anual (1996), Programa
Científico y Abstract, página 178, abstract
P16-8.
La invención generalmente suministra moléculas
renales relacionadas con la lesión (cada una de las cuales se
llamará de ahora en adelante un "KIM") las cuales son
sobrerreguladas en tejido renal después de una lesión renal. Las
proteínas KIM y los péptidos de la invención, y también sus
agonistas y antagonistas, y sus correspondientes son útiles en una
variedad de intervenciones terapéuticas.
La invención suministra una molécula de ADN
purificada y aislada que tiene una secuencia nucleótida publicada
en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. Estas
moléculas de ADN pueden ser recombinantes, y pueden ser ligadas
operativamente a una secuencia de control de expresión.
La invención además suministra un vector que
comprende una molécula de ADN purificada y aislada que tiene una
secuencia de nucleótidos expresada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o una de las otras moléculas de ADN
definidas arriba. Este vector puede ser un plásmido biológicamente
funcional o un vector de ADN viral. Una realización de la invención
suministra una célula huésped procariótica o eucariótica
transformada o transfectada mediante un vector que comprende una
molécula de ADN de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ
ID NO: 6. En otra realización de la invención, se provee un proceso
para la producción de un producto polipéptido KIM codificado
mediante una molécula de ADN como se describe arriba; el proceso
involucra el cultivo, bajo condiciones adecuadas de cultivo, de las
células huésped procarióticas o eucarióticas transformadas o
transfectadas con la molécula de ADN de manera que permite la
expresión de la molécula de ADN, y la recuperación del producto
polipéptido de dicha expresión.
Una proteína KIM humana purificada y aislada
sustancialmente libre de otras proteínas humanas está
específicamente dentro de la invención, como es un proceso para la
producción de un producto de polipéptidos que tiene parte de o toda
la conformación estructural primaria y la actividad biológica de
una proteína KIM. Las proteínas KIM de la invención pueden tener
una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
5, o SEQ ID NO: 7, o una proteína purificada y aislada codificada
mediante el ADN de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ
ID NO: 6. Estas proteínas pueden suministrarse sustancialmente
libres de otras proteínas humanas. La invención además incluye
variantes solubles de estas proteínas o proteínas de fusión. Las
proteínas de fusión KIM de la invención pueden comprender una
inmunoglobulina, una toxina, un compuesto analizable por imágenes o
un radionucleido.
La invención también suministra un anticuerpo
monoclonal específico para las proteínas KIM descritas arriba. El
anticuerpo anti-KIM puede estar asociado con una
toxina, un compuesto analizable por imágenes o radionucleido. Además
enseña una línea celular hibridoma la cual produce un anticuerpo
específico.
Las composiciones farmacéuticas también están
dentro del alcance de la invención. Una composición farmacéutica de
la invención puede comprender una cantidad efectiva
terapéuticamente de una proteína KIM o un anticuerpo
anti-KIM de la invención, junto con un vehículo
aceptable farmacológica mente.
Las posiciones diagnósticas están dentro de la
invención, tales como composiciones adecuadas para valorar la
presencia o la resolución de lesiones renales mediante la medida de
la concentración de KIM en la orina, suero, o sedimentos de orina
de pacientes que padecen o están en riesgo de desarrollar
enfermedades renales.
Las composiciones de la invención incluyen
composiciones apropiadas para el tratamiento de pacientes, que
contienen cantidades de KIM terapéuticamente efectivas, variantes
de KIM, análogos de KIM, proteínas de fusión de KIM, agonistas de
KIM, y anticuerpos para KIM o para ligandos KIM. Otros compuestos
terapéuticos de la invención incluyen ligandos KIM, anticuerpos
anti-KIM, y proteínas de fusión de ligandos KIM.
Estos compuestos pueden ser útiles en métodos terapéuticos ya sean
respuestas celulares estimuladas o inhibidas que dependen de la
función KIM.
Adicionalmente los métodos de la invención
inhiben el crecimiento de células tumorales con expresión de KIM
por el contacto de las células con una proteína de fusión de un
ligando KIM y ya sea una toxina o radionucleido, o con un anticuerpo
anti-KIM conjugado a una toxina o a un
radionucleido. Asímismo, el crecimiento de células tumorales que
expresan un ligando KIM puede ser inhibido mediante el contacto de
las células con una proteína de fusión de un KIM y ya sea una toxina
o radionucleido, o con un anticuerpo ligando
anti-KIM conjugado a una toxina o a un
radionucleido.
La invención también abarca composiciones
adecuadas para terapia génicas. Estas incluyen composiciones
apropiadas para el tratamiento de un sujeto con un trastorno renal,
para promover el crecimiento de nuevo tejido en un sujeto y para
promover la supervivencia de tejido dañado en un sujeto, que
comprende un vector el cual incluye ADN que comprende la secuencia
del nucleótido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID
NO: 6.
Los compuestos de la invención también son
útiles para tejidos similares, tanto in vitro como in
vivo. Un método semejante involucra un compuesto analizable por
imágenes que apunta a una célula que expresa una proteína de SEQ ID
NO:3, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO: 7, que comprende el contacto de la
célula con ya sea un anticuerpo monoclonal de la invención o una
proteína de fusión que comprende una proteína como se describió
anteriormente, fusionada a un compuesto analizable por imágenes.
Para métodos in vivo, la célula está dentro de un sujeto, y
la proteína o el anticuerpo monoclonal es administrada al
sujeto.
La invención también incluye composiciones
apropiadas para métodos de diagnóstico, tales como un método de
identificación de lesiones o regeneración de células renales en un
sujeto, que comprende la comparación del nivel de expresión de ya
sea SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 en
células renales del sujeto para un control del nivel de expresión
de la secuencia en células renales control. Otro método de la
invención incluye la identificación de sobrerregulación de SEQ ID
NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 en células que
comprenden el contacto de las células con una sonda antisentido y
midiendo la hibridización del ARN dentro de la célula.
Otra realización de los métodos de diagnóstico
de la invención incluye la valoración de la presencia o
concentración de una molécula de la invención ya sea en orina,
suero, u otros fluidos del cuerpo, o en sedimentos de orina o
muestras de tejido. La medida de la molécula
lesionada-relacionada puede ser correlacionada con
la presencia, extensión o curso de un proceso patológico. Esta
correlación también puede ser empleada para asegurar la eficiencia
de un régimen terapéutico.
Figura 1 es la secuencia de nucleótido de cADN
3-2 del clon de rata, con un marco de lectura de
proteína supuesto de 615 a 1535.
Figura 2 es una lista de la secuencia de cADN
1-7 del clon de rata, con un marco de lectura de
proteína supuesto de 145. a 1065.
Figura 3 es una lista de la secuencia de cADN
4-7 del clon de rata, con un marco de lectura de
proteína supuesto de 107 a 1822.
Figura 4 es una lista del cADN y de secuencias
de aminoácidos deducida de clones humanos
HI3-10-85, con un marco de lectura
de proteína supuesto de 1 a 1002. La línea superior de la lista es
la secuencia de cADN (SEQ ID NO: 6), y la línea inferior es la
secuencia de aminoácidos deducidas (SEQ ID NO: 7).
Figura 5 es una comparación del mejor ajuste de
la secuencia nucleótida del clon humano
HI3-10-85 con el clon de rata
3-2.
Nosotros identificamos los genes KIM por el
análisis de las diferencias en la expresión del mARN entre riñones
regenerados y riñones normales empleando el análisis diferencial
representativo (RDA). El RDA es un método basado en PCR por
sustracción que produce un tejido objetivo o fragmentos de cADN
célula-específica mediante sustracción repetitiva y
amplificación. La representación del cADN a partir del ARN del
riñón postisquémico de rata adulta después de 48 horas, se sustrae
con la muestra del riñón normal de rata adulta (operada en falso).
En este procedimiento, las secuencias que son comunes a las dos
muestras de riñón postisquémico y normal se extraen, dejando
aquellas secuencias que se expresan significativamente tan sólo en
tejido de riñón lesionado. Tales genes codifican proteínas que
pueden ser benéficas terapéuticamente para trastornos renales o
implicarse en los procesos de lesiones. Varios clones han sido
obtenidos, secuenciados y caracterizados. Luego los clones son
investigados por su prototipo de expresión durante la restauración
del riñón, desarrollo y distribución del tejido mediante un
análisis Northern e hibridización de ARN in situ.
A las secuencias de nucleótido y aminoácido
referidas en la especificación se les dio los siguientes números de
identificación de secuencia:
SEQ ID NO: 1 - secuencia de nucleótido del
inserto de cADN 3-2 de rata
SEQ ID NO: 2 - secuencia de nucleótido del
inserto de cADN 1-7 de rata
SEQ ID NO: 3 - secuencia de aminoácido de KIM- 1
de rata, codificado por cADN 3-2 y
1-7 de rata
SEQ ID NO: 4 - secuencia de nucleótido del
inserto de cADN 4-7 de rata
SEQ ID NO: 5 - secuencia de aminoácido
codificado por inserto cADN 4-7
SEQ ID NO: 6 - secuencia de nucleótido de cADN
humano clon H13-10-85
SEQ ID NO: 7 - secuencia de aminoácido
codificado por cADN humano clon
H13-10-85
Una "proteína KIM", en la presente
utilizada como sinónimo de "KIM", es una proteína codificada
por mARN que es selectivamente sobrerregulada que le sigue a la
lesión de un riñón. Un grupo de proteínas KIM de interés incluyen
aquellas codificadas por mARN que es selectivamente sobrerreguladas
a cualquier tiempo dentro de una semana siguiendo cualquier
agresión la cual resulta en lesión del tejido renal. Ejemplos del
tiempo al cual tal sobrerregulación podría ser identificada,
incluyen 10 horas, 24 horas, 48 horas o 96 horas tras una agresión.
Ejemplos de tipos de agresiones incluyen aquellos que resultan en
isquemia, tóxica u otros tipos de lesiones.
Un "agonista KIM" es una molécula que puede
provocar específicamente una respuesta celular normalmente
provocada por la interacción de KIM con un ligando KIM. Un agonista
KIM puede ser una variante KIM, o un anticuerpo específico a KIM, o
una forma soluble del ligando KIM.
Un "antagonista KIM" es una molécula que
puede asociarse específicamente con un ligando KIM o KIM, por
consiguiente bloqueando o de otra manera inhibiendo el enlace KIM
al ligando KIM. El antagonista que une los bloques o inhibe la
respuesta celular que de otra manera podría ser provocada por la
unión del ligando KIM con el KIM o con un agonista KIM. Ejemplos de
antagonistas KIM incluyen ciertas variantes KIM, proteínas de fusión
KIM y anticuerpos específicos a un ligando KIM o un KIM.
Un "ligando KIM" es cualquier molécula que
se une específica y no-covalentemente a una proteína
KIM. Tal ligando puede ser una proteína, un péptido, un esteroide,
un anticuerpo, un derivado de aminoácido, u otro tipo de molécula,
en cualquier forma, incluyendo una que se produce naturalmente, la
producida recombinantemente, o una sintética. Un ligando KIM puede
ser de cualquier forma, incluyendo soluble, unido a una membrana, o
parte de un constructo de fusión con inmunoglobulina, ácido graso,
u otras fracciones. El ligando KIM puede ser una integrina. Un
ligando KIM unido a una membrana puede actuar como receptor el
cual, cuando se une o se asocia con un KIM, desencadena una
respuesta celular. En algunas interacciones, KIM puede asociarse
con más de un ligando KIM individual, o puede asociarse con un
ligando KIM como parte de un complejo con una o más moléculas o
cofactores. En una situación en donde los dos, el KIM y el ligando
KIM están unidos a las membranas celulares, el KIM puede asociarse
y reaccionar con el ligando KIM el cual está unido a la misma
célula que el KIM, o ésta puede asociarse y reaccionar con el
ligando KIM al estar unida con una segunda célula. Donde la unión
de KIM se da entre moléculas unidas a diferentes células, las dos
células pueden ser iguales o diferentes con respecto al tipo
celular o el origen, el fenotipo o la condición metabólica, o el
tipo o grado de la respuesta celular (por ejemplo, crecimiento,
diferenciación o apoptosis) a determinados estímulos. "Unión
KIM" se refiere al contacto y unión del KIM con el
ligando
KIM.
KIM.
Por "alineación de secuencias" se entiende
la posición de una secuencia, ya sea nucleótido o aminoácido, con
la de otra, para permitir una comparación de la secuencia o porción
relevante de uno con relación al otro. Un ejemplo de un método de
este procedimiento está dado en Needleman et al. (J. Mol.
Biol. 48: 443-453, 1970). El método puede ser
implementado convenientemente por programas computarizados como el
programa Align (ADNstar, Inc.). Como podría ser entendido por
especialistas en el arte, secuencias homólogas o funcionalmente
equivalentes incluyen disposiciones funcionalmente equivalentes de
los residuos de cisteina dentro de los esqueletos conservados de
cisteina, incluyendo inserciones de aminoácidos o supresiones que
alteran la disposición lineal de estas cisteínas, pero no alteran
sus relaciones en el plegado estructural de la proteína. Por
consiguiente, fisuras internas e inserciones de aminoácidos en la
secuencia escogida son ignoradas con el fin de calcular el nivel de
identidad de la secuencia de aminoácidos entre la secuencia
aspirante y la secuencia de referencia. Una característica
frecuentemente empleada para establecer la homologación de
proteínas es la similitud del número y la localización de los
residuos de cisteina entre una proteína y otra.
"ADN antisentido" se refiere a la secuencia
del ADN cromosómico que es transcrita.
Una "sonda antisentido" es una sonda que
comprende al menos una parte del ADN antisentido para una parte de
interés de ácido nucleico.
Por "donación" se entiende el uso de
técnicas de recombinación in vitro para insertar un gen
particular u otra secuencia de ADN dentro de una molécula vector.
Con el fin de clonar exitosamente un gen deseado, es necesario
emplear métodos para la generación de fragmentos de ADN, para
acoplar los fragmentos a las moléculas vector, para introducir la
molécula ADN mezclada dentro de una célula huésped en la cual se
puede replicar, y para seleccionar el clon que tiene el gen diana
entre las células huésped receptoras.
Por "cADN" se entiende ADN complementario o
ADN copia producido a partir de un patrón de ARN por la acción de
la polimerasa ADN (transcriptaza reversa)
ARN-dependiente. De esa manera un "clon cADN"
significa una secuencia doble de ADN complementario a una molécula
de ARN de interés, trasportada en un vector donado.
Por "biblioteca de cADN" se entiende una
colección de moléculas de ADN recombinante que contienen insertos
de cADN que comprenden juntos una representación de las moléculas
mARN presentes en un organismo entero o tejido, dependiendo de la
fuente de los patrones de ARN. Una biblioteca semejante de cADN
puede ser preparada por métodos conocidos por expertos, y descritos,
por ejemplo, en Maniatis et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, supra. Generalmente, el ARN primero es
aislado de las células de un organismo de cuyo genoma se desea
clonar un gen particular. Para los propósitos de la presente
invención se prefieren las líneas celulares de mamíferos,
particularmente humanos. Alternativamente, el ARN puede ser aislado
de una célula tumoral, derivada de un tumor animal, y
preferiblemente de un tumor humano. Así, una biblioteca puede ser
preparada, por ejemplo, a partir de un tumor adrenal humano, pero
cualquier tumor puede ser empleado.
Tal y como es usado en el presente documento, el
término "polimorfismo de ADN" se refiere a la condición en la
cual dos o más secuencias de nucleótidos pueden existir en un punto
particular en el ADN.
"Vector de Expresión" incluye vectores que
son capaces de expresar secuencias de ADN contenidas en ellos, es
decir, las secuencias de codificación están ligadas operativamente
a otras secuencias capaces de efectuar su expresión. Se
sobreentiende, aunque no siempre se indica explícitamente, que esos
vectores de expresión podrían ser replicables en organismos
huéspedes ya sea como episomas o como una parte integral del ADN
del cromosoma. Un elemento útil, pero no necesario, de un vector de
expresión efectivo es una secuencia de codificación marcadora, la
cual es una secuencia que codifica una proteína que resulta en una
propiedad fenotípica de las células (tal como resistencia a la
tetraciclina) que contienen la proteína que permite que dichas
células sean fácilmente identificadas. En suma, el "vector de
expresión" recibe una definición funcional, y cualquier
secuencia de ADN que es capaz de efectuar la expresión de un
contenido específico del código de ADN se incluye en este término,
como se aplica a la secuencia específica. Como en la actualidad,
tales vectores están frecuentemente en la forma de plásmidos, así
"plásmido" y "vector de expresión" son generalmente usados
intercambiablemente. Sin embargo, en la invención se intentó
incluir otras formas tales de vectores de expresión que prestan
funciones equivalentes y que pueden, de vez en cuando hacerse
conocidas en el arte.
Por "derivado funcional" se entienden los
"fragmentos", "variantes", "análogos", o
"derivados químicos" de una molécula. Un "fragmento" de
una molécula, tal como cualquiera de los antígenos de la presente
invención se utiliza para referirse a cualquier subconjunto de
polipéptidos de la molécula. Una "variante" de tales moléculas
se utiliza para referirse a una molécula presente sustancialmente
similar a ya sea la molécula completa, o a un fragmento de ésta. Un
"análogo" de una molécula se utiliza para referirse a una
molécula no-natural sustancialmente similar ya sea
a la molécula completa o a un fragmento de ésta.
El término "gen" significa una secuencia de
polinucleótido que codifica un péptido.
Por "homogéneo" se entiende, al hacer
referencia a un péptido o a una secuencia de ADN, que la estructura
molecular primaria (es decir, la secuencia de aminoácidos o
nucleótidos) de sustancialmente todas las moléculas presentes en la
composición bajo consideración es idéntica.
"Aislada" se refiere a una proteína de la
presente invención, o cualquier gen que codifica a cualquier
proteína, la cual esencialmente libre de otras proteínas o genes,
respectivamente, o de otros contaminantes con los que podrían
encontrarse normalmente en la naturaleza, y como tales existen en
una forma no encontrada en la naturaleza.
El término "marcador" se refiere a una
fracción molecular capaz de detectar incluyendo, a modo de ejemplo,
sin limitación, isótopos radioactivos, enzimas, agentes
luminescentes y colorantes.
El término "sonda" se refiere a un ligando
de cualidades conocidas capaces de unir selectivamente a un
antiligando diana. Como se aplica a ácidos nucleicos, el término
"sonda" se refiere a una hebra de ácido nucleico que tiene una
secuencia base complementaria a una hebra diana.
"Células huésped recombinantes" se refiere
a células que han sido transformadas con vectores construidos
empleando técnicas de ADN recombinante. Como se define en la
presente, el anticuerpo o su modificación que se produce mediante
una célula huésped recombinante ocurre en virtud de su
transformación, y no en cantidades tan pequeñas, o más comúnmente,
en cantidades menos que detectables, como serían producidas por el
huésped no transformado.
Por "sustancialmente puro" se entiende
cualquier proteína de la presente invención, o cualquier gen
codificado de cualquier proteína, la cual es esencialmente libre de
otras proteínas o genes, respectivamente, o de otros contaminantes
con los cuales podría normalmente encontrase en la naturaleza, y
como tales existen en una forma que no se encuentra en la
naturaleza.
Se dice que una molécula es"sustancialmente
similar" a otra molécula si la secuencia de aminoácidos en ambas
moléculas es sustancialmente la misma, y si ambas moléculas poseen
una actividad biológica similar. De esa manera, siempre que dos
moléculas posean una actividad similar, se consideran variantes en
cuanto a tal término es empleado en la presente aún si una de las
moléculas contiene residuos adicionales de aminoácidos no
encontrados en la otra, o si la secuencia de residuos de
aminoácidos no es idéntica. Como es empleada en la presente, una
molécula es un "derivado químico" de otra molécula si contiene
fracciones químicas adicionales que normalmente no son parte de la
molécula. Tales fracciones pueden mejorar la solubilidad de la
molécula, absorción, vida media biológica, etc. Alternativamente,
las fracciones pueden alternativamente aminorar a la toxicidad de la
molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable
de la molécula, etc. Fracciones capaces de mediar tales efectos son
revelados, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences,
16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).
Por "vector" se entiende una molécula de
ADN, derivada de un plásmido o un bacteriófago, dentro del cual los
fragmentos de ADN pueden ser insertados o donados. Un vector
contendrá uno o más puntos de restricción únicos, y pueden ser
capaces de replicación autónoma en un huésped u organismo vehículo
definido de modo tal que la secuencia donada sea reproducible.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención incluye el cADN de SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, y también secuencias que
incluyen la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
o SEQ ID NO: 6, y derivados de estas secuencias. La invención
también incluye vectores, liposomas y otros vehículos que contienen
esta secuencia o derivados de ellas. La invención además incluye
proteínas transcritas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
o SEQ ID NO: 6, es decir, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:
7, y sus derivados y variantes que codifican SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 5 o SEQ ID NO: 7.
Una realización de la invención incluye
variantes solubles de una proteína KIM que es usualmente
sintetizada como una proteína de membrana asociada, y la cual es
sobre-regulada después de una lesión. Las variantes
solubles carecen de al menos una porción de la sección de
transmembrana o intra-membrana de una proteína KIM
nativa. En algunos ejemplos, la variante soluble carece de la
sección de transmembrana o intra-membrana completa
de una proteína KIM nativa. Las variantes solubles incluyen
proteínas de fusión que comprenden derivados de proteínas KIM que
carecen de al menos una porción de la sección de transmembrana o
intra-membrana de una proteína KIM nativa. Se
incluyen todos los tipos de proteínas de fusión KIM,
particularmente aquellos que incorporan las formas de la molécula
his-tag, Ig-tag, y
myc-tag. Estas proteínas de fusión KIM pueden tener
características que son ventajosas terapéuticamente, tales como el
incremento de vida-media conferido por el
Ig-tag. También se incluyen proteínas de fusión que
incorporan porciones de dominios seleccionados de la proteína
KIM.
Del mismo modo en que es posible reemplazar
sustituyentes de la estructura, también es posible sustituir grupos
funcionales unidos a la estructura con grupos con características
similares. Estas sustituciones inicialmente conservadoras, es decir,
el grupo de reemplazo tendrá aproximadamente el mismo tamaño,
forma, hidrofobicidad y carga que el grupo original. Las
modificaciones sin secuencia pueden incluir, por ejemplo,
derivatización química in vivo o in vitro de partes de
proteína KIM que ocurren naturalmente, así como cambios en la
acetilación, metilación, fosforilación, carboxilación o
glicosilación.
También se incluyen dentro de la invención
agentes que se encuentran específicamente unidos a la proteína, o
un fragmenteo de la proteína (SEQ ID NO:3, 5 o 7). Estos agentes
incluyen ligandos y anticuerpos (incluyendo monoclonales, de cadena
simple, de cadena doble, fragmentos Fab, y otros, ya sean nativos,
humanos, humanizados, primatizados o quiméricos). Descripciones
adicionales de estas categorías de agentes se encuentran en la
solicitud de PCT 95/16709.
Los riñones de rata lesionados por isquemia son
generados, como se encuentra descrito por Witzgall et al.
(J. Clin Invest. 93: 2175-2188, 1994). Brevemente,
la arteria renal y la vena de un riñón de una rata adulta
Sprague-Dawley son sujetadas fuertemente durante 40
minutos y luego se permite la perfusión. Los riñones lesionados son
extraídos de las ratas a 24 horas y a 48 horas después de la
perfusión. Riñones de ratas adultas Sprague-Dawley
normales operadas en falso también son extraídos.
El ARN total es preparado de los órganos basados
en el protocolo de Glisin et al. (Biochemistry 13: 2633,
1974). Brevemente, los órganos extraidos son colocados
inmediatamente dentro de la solución estandarizada GNC (Tiocianato
de guanidina 4 M, SDS 0,5%, citrato de sodio 25 Mm, anti espuma
Sigma 0,1%) y se desestabilizaron sobre hielo con un politrón. Los
desechos de células se retiran con un giro a baja velocidad en una
centrífuga clínica y el fluido sobrenadante se coloca sobre un
cojín de CsCl 5,7 M, acetato de sodio 25 mM, EDTA 1 mM. El ARN es
granulado dentro del cojín en un rotor SW40Ti a 22 K durante 15
horas. El ARN se resuspende en agua estéril tratada con DEPC, se
precipitó dos veces con volúmenes 1/10 de acetato de sodio 3 M y
2,5 volúmenes de EtOH. Se aisló el Poli A+ ARN empleando un kit de
purificación de mARN (Pharmacia, catálogo No.
27-9258-02).
El cADN bicatenario se sintetizó a partir de
falsa operación y a partir de riñón post-isquémico
poli A+ ARN después de 48 horas empleando Gibco BRL "Superscript
Choice^{TM} System cADN Synthesis Kit", catálogo No. 18090. La
primera cadena se sintetiza por imprimación con oligo dT y empleando
transcriptaza reversa Superscript II^{TM}. La segunda cadena se
produce empleando polimerasa I ADN E. coli y ARNse H seguido
por polimerasa ADN T4 empleando las condiciones recomendadas por
BRL.
El análisis de RDA es llevado a cabo
esencialmente como se describe por Hubank y Schatz (Nucleic Acid
Research 22: 5640-48, 1994). Brevemente, cADN de
riñón post-isquémico después de 48 horas se digiere
con la enzima de restricción Dpn II, y se liga a oligonucleótidos
R-Bgl-12/24 (ver la referencia para
la secuencia exacta). La amplificación PCR (realizada con un
polimerasa Taq Perkin-Elmer y su correspondiente
solución reguladora PCR) del conector cADN ligado es empleado para
generar la representación inicial. Este producto PCR es designado
"probador amplicón". El mismo procedimiento es empleado para
generar "conductor amplicon" del cADN de riñón de rata
falsamente operada.
La hibridización del probador y el conductor de
amplicones seguido por la amplificación selectiva son realizadas
tres veces para generar el Producto Diferencial Uno (PD1), Dos
(PD2) y Tres (PD3). La generación del producto PD1 es llevada a cabo
como se describe por Hubank y Schatz (Nucleic Acid Research 22:
5640-48, 1994). Los productos PD2 y PD3 también son
generados como describe Hubank y Schatz (id.), salvo que las
relaciones conductor: probador se cambian a 5333: 1 para PD2 y a
40000: 1 ó 4000: 1 para PD3.
Tres productos RDA se clonaron a partir de PD3
dentro del producto pUC 18: RDA vector clonado 1-7
(252bp) cuando el PD3 se generó empleando una relación de 40,000:
1, y el producto RDA 3-2 (445bp) y el
4-7 (483bp) cuando el PD3 se generó empleando una
relación de 4,000: 1. Los fragmentos de ADN se subclonaron
empleando el kit Pharmacia Sureclone^{TM} (catálogo No.
27-9300-01) para reparar los
finales de los fragmentos PCR con enzima Klenow y para facilitar la
unión final directa de los fragmentos dentro del vector pUC18.
Poli A+ ARN (2,5 \mug) a partir de riñón de
rata normal adulta (falsamente operada), a partir de riñón adulto
después de 48 horas de lesión post-isquémica, y de
riñón embrionario de 18 días se analizó por electroforésis y
transferencia Northern (Cate, Cell 45: 685, 1986) en una membrana
(Dupont) GeneScreen^{TM}. La hibridización en solución reguladora
PSB (Tris 7,5 50 mM, NaCl 1M, pirofosfato de sodio 0,1%, PVP 0,2%,
Ficoll 0,2%, BSA 0,2%, SDS 1%), que contiene el 10% de sulfato de
dextran y 100 \mug/ml de tARN, se realiza a 65ºC empleando tres
sondas diferentes: producto RDA 1 -7, producto RDA
3-2 y producto RDA 4-7. Todas son
radiomarcadas empleando el kit de marcación de iniciador al azar
Pharmacia's "Ready to Go^{TM}" (catálogo No.
27-9251-01). Los productos RDA
1-7, 3-2 y 4-7
hibridizan a un mARNs presente en todas las tres muestras, pero más
intensamente en mARNs en las muestras de ARN en el riñón
post-isquémico después de 48 horas.
Un análisis de transferencia Northern de tejido
de rata adulta indica que el gen 1-7 se expresa a
muy bajos niveles en un riñón, testículo, bazo y pulmón adultos
normales. El gen 3-2 se expresa en hígado, riñón,
bazo y cerebro, El gen 4-7 se expresa en bazo,
riñón, pulmón, testículo, corazón, cerebro, hígado y músculo
esquelético. La presencia de diferentes tamaños de mARNs en algunos
tejidos en la o transferencia 1-7 y
3-2 indica que el primer producto de transcripción
del gen 1-7 y del gen 3-2 puede
sufrir empalme y/o poliadenilación alternas.
Una biblioteca de cADN se genera a partir de 4
\mug de poliA+ ARN a partir de un riñón
post-isquémico después de 48 horas, empleando
reactivos de BRL Superscript Choice^{TM} System para síntesis de
cADN, y el kit de clonación Stratagene^{TM} Lambda ZapII
(catálogo No. 236201), de acuerdo con protocolos recomendados por
los fabricantes.
Los clones 10^{5} son cribados con el producto
RDA 3-2 como una sonda (de marcación iniciada al
azar como se describe anteriormente). Ocho clones positivos son
seleccionados y cuatro son escogidos al azar para un análisis
secundario para obtener placas fago. Posterior a la criba
terciaria, cuatro clones fago puros son aislados. Los insertos
clonados del fago son aislados por un procedimiento de escisión
in vivo de acuerdo con el kit Stratagene^{TM} Lambda Zap
II. El inserto más grande, de aproximadamente 2,6 kb (conocidos
como cADN clon 3-2), es sujeto a la secuencia de
ADN. La secuencia del inserto (SEQ ID NO: 1) se muestra en la Figura
1. El clon 3-2 de cADN (E. coli
K-12, SOLR/p3-2#5-1)
ha sido depositado como ATCC No. 98061. La secuencia del clon
3-2 de cADN es idéntica a la del clon
1-7 de cADN (SEQ ID NO: 2), excepto que los
nucleótidos 136-605 de la SEQ ID NO: 1 representan
una inserción. De esa manera, la SEQ ID NO: 2 representa una
variante empalme a partir de la SEQ ID NO: 1. El clon para
1-7 (E. coli K- 12,
SOLR/p1-7#3-1) ha sido depositado
como ATCC No. 98060.
Los clones 10^{5} son cribados con el producto
RDA 1-7 como una sonda (radiomarcada cebada al azar
como se describió anteriormente). Ocho clones positivos son
seleccionados y cuatro son escogidos al azar para análisis
secundarios para obtener placas fago puras. Posterior a la criba
terciaria, cuatro clones fago puros son aislados. Los insertos
clonados a partir del fago son aislados por el procedimiento de
escisión in vivo de acuerdo con el kit Stratagene^{TM}
Lambda Zap II. El inserto más grande de aproximadamente 2,0 kb
(refiriéndose a cADN clon 1-7) es sujeto a la
secuencia de ADN; la secuencia del inserto (SEQ ID NO: 2) se muestra
en la Figura 2.
Los clones 10^{5} son cribados con el producto
RDA 4-7 como una sonda (marcada cebada al azar como
se describió anteriormente e hibridizada en PSB a 65ºC). Ocho clones
positivos son seleccionados y cuatro son escogidos al azar para
análisis secundarios para obtener placas fago puras. Posterior a la
segunda criba, dos clones fago puros son aislados. Los insertos
clonados a partir de fago son aislados por el procedimiento de
escisión in vivo de acuerdo con el kit StratageneTM Lambda
Zap II. El inserto más grande, aproximadamente 2,4 kb (refiriéndose
a cADN clon 4-7), está sujeto a la secuencia de ADN.
La secuencia del inserto, SEQ ID NO: 4, se muestra en la Figura 3.
El clon 4-7 cADN (E. coli
K-12, SOLR/p4-7#
1-1) ha sido depositado como ATCC No. 98062.
La secuencia de cADN 3-2 (Figura
1; SEQ ID NO: 1) contiene un marco de inscripción abierta de 307
aminoácidos (Figura 1; SEQ ID NO:3). Una secuencia simple de 21
aminoácidos es deducida a partir del análisis de Von Heijne (Von
Heijne et al., Nucl. Acid Res. 14: 14683 (1986)), y una
región de transmembrana que abarca aproximadamente aa
235-257 indica que el producto 3-2
es una proteína de la superficie celular.
La secuencia de cADN 1-7 (Figura
2; SEQ ID NO: 2) contiene un armazón de lectura abierta de 307
aminoácidos, la cual es idéntica al armazón de lectura abierta
contenido en la secuencia de cADN 3-2 (SEQ ID NO:
3). La secuencia de cADN 4-7 (Figura 3; SEQ ID NO:
4) contiene un armazón de lectura abierta de 572 aminoácidos (SEQ
ID NO: 5). Una región de transmembrana se localiza aproximadamente
en los aminoácidos 501-521.
La hibridización in situ se lleva a cabo
de acuerdo con el método descrito por Finch et al., Dev.
Dynamics 203: 223-240, 1995. Brevemente, los dos
riñones isquémicos y contralaterales se fijan por perfusión con
paraformaldehido en PBS al 4%. Los riñones además se fijan durante
la noche a 4ºC y se procesan. Las secciones de parafina se
desparafinizan y se rehidratan, fijándose con paraformaldehido en
PBS al 4%, se digieren con proteinasa K, se refijan, luego se
acetilan con anhídrido acético en solución estandarizada de
trietanolamina. Las secciones luego se deshidratan e hibridizan con
ribosondas ^{32}P-marcadas a 55ºC durante la
noche, con ribosondas ^{33}P-marcadas generados a
partir de los productos RDA 3-2 o RDA
1-7 subclonados dentro del lado BamH1 de
pGEM-11Z. Después de la hibridización, las secciones
se lavaron bajo condiciones de severidad alta (2 X SSC, formamida
50% a 65ºC). Las secciones se deshidratan finalmente, la emulsión
(NBT-2) es revestida por autorradriografia, y se
expone por lo menos una semana.
Granos de plata son desarrollados y las
secciones se contratiñeronn con azul de toluidina y se
microfotografiaron.
Los análisis de la expresión mARN
1-7 y 3-2 por hibridización in
situ indican que estos genes son enormemente sobrerregulados en
células de riñón dañadas en comparación con su expresión en
secciones de riñón normal. La expresión vista se encuentra en
células regenerativas de la corteza y médula exterior, la mayoría de
las cuales parecen ser células de túbulo proximal.
El análisis del patrón de expresión de ARN
4-7 in situ también revela abundante
expresión de este gen en el riñón isquémico lesionado comparado con
el riñón adulto normal. El sitio de la expresión aparece para ser
células infiltradas.
Una sonda de ADN
^{32}P-marcado que comprende los nucleótidos
546-969 del inserto del clon 3-2
mostrado en la Figura 1 se genera y emplea para cribar una
biblioteca de cADN gt10 lambda de hígado embrionario humano
(Clontech Catálogo #HL5003a). Las placas 1X10^{6} se criban en
duplicado empleando condiciones estándares como se describe
anteriormente, pero la temperatura de criba fue de 55ºC. Para el
lavado con severidad alta, el filtrado se lavó en 2X SSC a 55ºC. Se
identificaron cincuenta fago positivas y la placa se purificó, y se
preparó el ADN. Los ADNs de fago se someten a un análisis Southern
empleando la misma sonda como la descrita anteriormente. El filtro
de transferencia Southern se somete a un lavado final con 0.5X SSC
a 55ºC. Dos clones son identificados como positivos. El inserto del
clon H13-10-85 es secuenciado y se
encontró una región que codifica una proteína con un nivel alto de
identidad a la proteína 3-2 que se muestra en la
Figura 3.
La secuencia del nucleótido (SEQ ID NO: 6) y la
secuencia del aminoácido pronosticada (SEQ ID NO: 7) de la proteína
relacionada 3-2 de humano se muestran en la Figura
4. Como se muestra por el análisis más adecuado bosquejado en la
Figura 5, la proteína relacionada 3-2 humana es el
43,8% idéntica y el 59,1% similar a la proteína de rata
3-2. Ambas contienen IgG, mucina, transmembrana, y
dominantes citoplasmáticos. Las seis cisteinas son conservadas
dentro del dominante IgG de ambas proteínas.
Una proteína de fusión del dominio extracelular
de KIM y la región Fc de la inmunoglobulina (Ig) es una herramienta
útil para el estudio de la biología molecular y celular de los
riñones lesionados/regenerados y como una molécula terapéutica.
Para producir la proteína de fusión Ig KIM con el dominio
extracelular de humano y la proteína KIM- 1 de rata, un fragmento
del dominio extracelular de cADN KIM- 1 se amplificó por PCR y se
clonó en el vector de expresión Biogen, pCAl25, para expresión
transitoria en las células COS. El vector de expresión pCAl25
produce una proteína de fusión que tiene una estructura a partir de
gen clonado en N-terminal y una región Fc Ig humana
en el C-terminal. Las células COS fueron
tansfectadas con los plásmidos SJR 103 o 104; Estos plásmidos
expresan una proteína de fusión que contiene las secuencias KIM
humanas 263-1147 (SEQ ID NO: 6; SJR 103) o
secuencias KIM de ratas 599-1319 (SEQ ID NO: 1; SJR
104) del dominante extracelular combinado a la región Fc Ig humana.
Las células se cultivaron en FBS al 10% en DMEM en la fábrica de
células (Nunc, Naperville, II). Dos a tres días después de la
post-transfección, el medio se extrajo, se concentró
empleando un concentrador Amicón, y la proteína de fusión se
purificó empleando una columna Sepharose Protein-A.
Después de la purificación, la pureza de la proteína de fusión se
evaluó por SDS-PAGE.
Los anticuerpos anti-KIM de la
invención, que específicamente se unen a la proteína de SEQ ID NO:
3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 o un fragmento de ésta, son útiles
en muchos métodos de diagnóstico. Estos agentes pueden ser marcados
con marcadores detectables, tales como fluoroscópicamente o mediante
sustancias radiográficamente opacas, y administrados al sujeto para
permitir imágenes de tejidos que expresan la proteína KIM. Los
agentes también pueden ser ligados a sustancias, tales como
peroxidasa de rábano picante, que puede ser empleada como tintura
inmunocitoquímica para permitir la visualización de áreas de células
positivas de proteína KIM sobre secciones histológicas. Un
anticuerpo específico podría ser empleado únicamente de ésta manera,
y los sitios donde éste es ligado pueden ser visualizados en un
ensayo tipo sándwich empleando un anticuerpo
anti-inmunoglobulina que es por sí mismo ligado a un
marcador detectable.
Anticuerpos específicos para la proteína KIM
también son útiles en inmunoensayos para medir la presencia o
concentración de KIM en muestras de tejidos del cuerpo y fluidos.
Tales concentraciones pueden ser correlacionadas con diferentes
estados de la enfermedad. Como una realización de particular
interés, la invención incluye composiciones apropiadas para emplear
en un método de diagnóstico de lesión renal, o de monitorear un
proceso de reparación renal, mediante la medida de la concentración
de KIM o de los fragmentos de KIM en orina, plasma o suero de un
paciente. De manera análoga, KIM puede ser medido en sedimento de
orina, en particular en desechos celulares en sedimentos de orina.
Moldes de células del túbulo renal, las cuales pueden estar
presentes en sedimentos de orina de pacientes con enfermedad renal
en curso, pueden contener elevados niveles de proteína KIM y
mARN.
Anticuerpos específicos para la proteína KIM
pueden ser ligados a soportes sólidos, tales como perlas o placas,
y empleados para retirar los ligandos de una solución, ya sea para
la medición, o para la purificación y caracterización de la
proteína o sus atributos (tal como modificaciones
postraslacionales). Tal caracterización de una proteína KIM de
pacientes podría ser útil en la identificación de mutantes nocivos
o procedimiento de defectos que interfieren con la función KIM y
son asociados con fenotipos de paciente anormal. Cada una de estas
técnicas es rutinaria para aquellos expertos en inmunología.
Métodos de imagen adicional utilizan KIM o
fragmentos de KIM, combinado con fracciones analizables por
imágenes, para el diagnóstico de imágenes de tejidos que expresan
ligandos KIM, particularmente tumores.
Además las técnicas de diagnóstico se basan en
la demostración de mARN KIM sobrereguladas, como una indicación de
procesos relacionados con lesiones. Esta técnica ha sido probada y
encontrada factible en un modelo de lesión isquémica en ratas, como
se explicará más adelante.
Para determinar si la cantidad de proteína
KIM-1 se incrementa después de la lesión,
examinamos riñones homogenizados de riñones postisquémicos y
contralaterales después de 24 y 48 horas después de 40 minutos de
pinzamiento de la arteria renal y la vena de un solo riñón para
cada rata. El riñón homogenizado se evaluó para la presencia de la
proteína KIM-1. Análisis de transferencia Western
identifica tres proteínas detectadas por dos diferentes anticuerpos
después de la lesión isquémica, las cuales no son detectables en
homogeneizados a partir de los riñones contralaterales que no
fueron expuestos a lesión isquémica. Los aparentes pesos
moleculares de las bandas son de aproximadamente 40 kDa, 50 kDa y
70-80 kDa. Las tres especies de proteínas detectadas
por transferencia western podrían representar formas glicosiladas
de la misma proteína dando la presencia de sitios potenciales de
glicosilación enlazados N y O. El hecho de que cada una de estas
proteínas reaccione con dos diferentes baterías de anticuerpos
policlonales sustente la idea de que ellos son relacionados con
KIM-1 y no son bandas de reactividad cruzada. La
confirmación de ésta predicción llega de los resultados de división
de CNBr parcial de las tres proteínas que revelan que ellas
comparten fragmentos de división de CNBr comunes. Dado que no está
previsto que el dominio citoplasmático de la proteína KIM 1
contenga ninguna modificación postranslacional importante, los dos
productos más pequeños de la lisis (4,7 kDa y 7,4 kDa) detectados
con anticuerpos directos contra el dominio citoplasmático de
KIM-1 debería ser del mismo tamaño para las tres
diferentes bandas de proteínas KIM-1 si ellas se
originan de la misma proteína. Observamos que las proteínas
KIM-1 de 40 kDa y de 70-80 kDa
producen fragmentos de migración en el tamaño pronosticado. La lisis
de la banda de la proteína de 50 kDa también da la misma firma
C-terminal de la banda del péptido.
La secuencia KIM-1 presenta dos
sitios putativos para N-glicosilación y un dominio
de mucina donde la O-glicosilación podría cubrir la
cadena polipeptídica. Las tres bandas KIM- 1 detectadas en el riñón
postisquémico podrían corresponder a las variantes de glicosilación
del mismo núcleo de la proteína.
De-N-glicosilación con PNGase F
resultó en un cambio de las tres bandas a un peso molecular
inferior, correspondiendo a una pérdida de aproximadamente 3 kDa,
indicando que las tres proteínas son
N-glicosiladas. Las diferencias en
O-glicosilación podrían explicar las diferencias en
tamaños de éstas tres bandas.
Los métodos terapéuticos de la invención
involucran selectivamente promoción o inhibición de respuestas
celulares que dependen de la unión KIM. Donde el KIM o el ligando
KIM son los dos de membrana unida, y expresadas por diferentes
células, la señal de transducción puede aparecer en la célula con
expresión KIM, en la célula con expresión ligando KIM, o en
ambas.
Una respuesta de unión desencadenada KIM en una
célula con expresión ligando KIM puede ser generada por contacto de
la célula con con expresión ligando KIM exógeno, las proteínas de
fusión KIM o los anticuerpos activados contra el ligando KIM, ya
sea in vitro o in vivo. Además, las respuestas de la
célula con expresión ligando KIM que podrían de otra manera ser
desencadenadas por un KIM endógeno serían bloqueadas por contacto
de la célula con expresión ligando KIM con un antagonista ligando
KIM (por ejemplo, un anticuerpo antagonista que se une a un ligando
KIM), o por contacto del KIM endógeno con un anticuerpo
anti-KIM u otra molécula que enlaza KIM que
previene la unión efectiva de un KIM con un ligando KIM.
Del mismo modo, las respuestas desencadenadas
por la unión de KIM en la célula con expresión KIM pueden ser
promocionadas o inhibidas con compuestos exógenos. Por ejemplo, la
respuesta de la unión desencadenada por unión con KIM en una célula
con expresión KIM puede ser generada por contacto de la célula con
un ligando KIM soluble, o ciertos anticuerpos activados
anti-KIM. Además, las respuestas de la célula con
expresión KIM que de otra manera serían desencadenadas por
interacción con un ligando KIM endógeno serían bloqueadas por
contacto de la célula KIM-expresión con un
antagonista a KIM (por ejemplo, un anticuerpo bloqueado que une a
un KIM de una manera eficaz que previene, la unión del KIM que
genera una señal), o por contacto del ligando KIM endógeno con un
anticuerpo ligando anti-KIM u otra molécula que se
une a un ligando KIM que previene el enlace efectivo de un KIM con
el ligando KIM.
Cuales de las intervenciones descritas arriba
son útiles para usos terapéuticos particulares depende del
mecanismo etiológico relevante ya sea del proceso patológico para
ser inhibidos o del proceso deseado médicamente a ser promovido,
como pueden apreciar los expertos en el campo médico. Por ejemplo,
donde la unión KIM produce un crecimiento celular deseable, con
mantenimiento de fenotipo diferenciado, resistencia a apoptosis
inducida por varias injurias, u otras respuestas ventajosas
médicamente, una de las intervenciones antes descritas que impulsan
la respuesta activada por la unión puede ser empleada. En la
alternativa, una de las intervenciones inhibitorias puede ser útil
donde la unión KIM invoca consecuencias no deseadas, tales como
crecimiento neoplásico, pérdida nociva de la función celular,
susceptibilidad a apoptosis, o promoción de eventos de
inflamación.
Los siguientes son ejemplos de los métodos
terapéuticos de la invención, descritos previamente. Un uso
terapéutico de los compuestos de la invención relacionados con KIM
es la preparación de una composición para el tratamiento de un
sujeto con enfermedad renal, estimulando el crecimiento de nuevo
tejido en un sujeto, o estimulando la supervivencia del tejido
dañado en un sujeto, e incluye la preparación de una composición que
comprende una cantidad efectiva terapéuticamente de una proteína KIM
de la invención, o de una composición farmacéutica que incluye una
proteína de la invención. La proteína empleada en éstos métodos
puede ser un fragmento de una proteína KIM
longitud-completa, una proteína de ligando KIM
soluble o un fragmento de fusión, o un agonista KIM. Estos métodos
también pueden ser experimentados mediante la preparación de una
composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
un anticuerpo agonista de la invención, o una composición
farmacéutica que incluye un anticuerpo agonista de la invención. Una
proteína KIM puede ser incluida al mismo tiempo con una cantidad
terapéuticamente efectiva de un segundo compuesto que ejerce un
efecto asociado deseable médicamente. Mientras los tejidos de
interés para estos métodos pueden incluir cualquier tejido, tejidos
preferidos incluyen tejido renal, hígado, tejido neural, corazón,
estómago, intestino delgado, médula espinal, o pulmón. Las
condiciones renales particulares las cuales pueden ser tratadas
provechosamente con los compuestos de la invención incluyen falla
renal aguda, nefritis aguda, falla renal crónica, síndrome
nefrítico, defectos del túbulo renal, transplantes de riñón, lesión
tóxica, lesión hipóxica, y trauma. Los defectos del o túbulo renal
incluyen aquellos ya sean hereditarios o adquiridos naturalmente,
tales como enfermedad renal policística, enfermedad cística medular,
y espogiosis medular renal. Esta lista no es limitada, y puede
incluir muchos otros trastornos renales (ver, por ejemplo,
Harrison's Principies of Internal Medicine, 13th ed., 1994, el cual
está incorporado en la presente como referencia). El sujeto de los
métodos puede ser humano.
Una intervención terapéutica para inhibir el
crecimiento no deseado del tejido con expresión de ligando KIM en
un sujeto incluye la etapa de administración al sujeto de una
cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de KIM (por
ejemplo, un anticuerpo antagonista que une un ligando KIM), o por
administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de un
anticuerpo anti-KIM u otra molécula que enlace a
KIM la cual bloquea un enlace KIM al tejido con expresión de ligando
KIM. En una realización de interés, el antagonista KIM o el
anticuerpo anti-KIM puede ser empleado para
preparar una composición que puede inhibir o bloquear el
crecimiento de tumores que dependen de la proteína KIM para el
crecimiento.
Otros métodos de la invención incluyen la muerte
de células tumorales con expresión de ligando KIM, o la inhibición
de su crecimiento, por el contacto de células con una proteína de
fusión de un KIM y una toxina o radionucleido, o un anticuerpo
ligando anti-KIM conjugado a una toxina o
radionucleido. La célula puede estar dentro de un sujeto, y la
proteína o el anticuerpo conjugado se administran al sujeto.
También se abarca dentro de la invención, una
composición para apuntar una toxina o radionucleido a una célula de
expresión de un KIM, que comprende una proteína de fusión que
contiene un ligando KIM y una toxina o radionucleido, o un
anticuerpo anti-KIM conjugado a una toxina o
radionucleido. Otra realización incluye una composición apropiada
para la supresión del crecimiento de una célula tumoral que expresa
un KIM, que comprende una proteína de fusión de un ligando KIM y
una toxina o radionucleido o un anticuerpo anti-KIM
conjugado a una toxina o radionucleido; la célula puede estar
dentro de un sujeto, y la proteína administrada al sujeto.
El término "sujeto" empleado en el presente
documento significa cualquier mamífero al cual se le puede
administrar KIM. Los sujetos específicamente indicados para el
tratamiento con el método de la invención incluyen humanos, además
de primates no humanos, ovejas, caballos, ganado, cabras, cerdos,
perros, gatos, conejos, cobayas, hámsters, jerbos, ratas y ratones,
así como también, los órganos, tumores y células, derivados u
originarios de estos huéspedes.
Los genes KIM de la invención pueden ser
empleados para preparar composiciones que son insertadas dentro del
tejido dañado, o dentro del tejido donde la estimulación del
crecimiento es deseada. Tal terapia génica estimula la producción
de proteína KIM de las células transfectadas, promoción del
crecimiento celular y/o supervivencia de células que expresan a la
proteína KIM.
En una realización específica de un método de
terapia génica, el gen que codifica una proteína KIM puede ser
empleado para preparar composiciones que son introducidas dentro de
un tejido diana renal. La proteína KIM se expresaría establemente y
estimularía el crecimiento del tejido, la división, o la
diferenciación, o podría potenciar la supervivencia celular.
Adicionalmente, un gen KIM puede ser empleado para preparar
composiciones que son introducidas dentro de una célula diana
empleando una variedad de métodos conocidos que emplean ya sean
estrategias basadas virales o no-virales.
Métodos no-virales incluyen
electroporación, fusión de membrana con liposomas, bombardeo de
alta velocidad con microproyectiles de
ADN-recubierto, incubación con precipitado de
calcio-fosfato-ADN, transfección
mediada de DEAE-dextran, y
micro-inyección directa dentro de células
individuales. Por ejemplo, un gen KIM puede ser insertado dentro de
una célula mediante coprecipitación con fosfato de calcio (Pillicer
et al., Science, 209: 1414-1422 (1980);
microinyección mecánica y/o aceleración de partículas (Anderson
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77:
5399-5403 (1980); transferencia de ADN con base en
liposomas (por ejemplo, LIPOFECTIN- mediated transfection- Fefgner
et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84:
471-477,1987; Gao y Huang, Biochim. Biophys. Res.
Comm., 179: 280-285,1991); transfección mediada con
DEAE Dextran; electroporación (U.S. Patent 4,956,288); o métodos de
polilisina-basados en los que el ADN se conjuga para
entregar ADN preferencialmente a hepatocitos de hígado (Wolff et
al., Science, 247: 465-468,1990; Curiel et
al., Human Gene Therapy 3: 147-154,1992).
Las células objetivo pueden ser transfectadas
con los genes de la invención por transferencia directa de genes.
Ver, por ejemplo, Wolff et al., "Direct Gene Transfer Into
Moose Muscle In Vivo", Science
247:1465-68, 1990. En muchos casos, será deseable
la transfección del vector-mediado. Cualquiera de
los métodos conocidos en el oficio, puede ser empleado, para la
inserción de secuencias de poli nucleótidos dentro del vector.
(Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY, 1989; y Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992.). La activación
promotora puede ser específica en tejido o inducible mediante un
producto metabólico o una sustancia administrada. Semejantes
promotores/potenciadores incluyen, pero no están limitados á, un
promotor de la proteína ligando c-ret nativa, el
promotor/potenciador citomegalovirus
inmediato-temprano (Karasuyama et al., J.
Exp. Med., 169: 13,1989); el promotor humano
beta-actina (Gunning et al., Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 84: 4831,1987); el promotor
glucocorticoide-inducible presente en el virus
repetido terminal de largo tiempo del tumor mamario de ratón (MMTV
LTR) (Klessig et al., Mol. Cell. Biol., 4: 1354, 1984); las
secuencias repetidas terminales de largo tiempo de virus de leucemia
de ratón Moloney (MuLV LTR) (Weiss et al., ARN Tumor
Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,
1985); el promotor de región temprana SV40 (Bemoist y Chambon,
Nature, 290: 304,1981); el promotor del virus del sarcoma de Rous
(RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22: 787,1980); el promotor de
kinasa de timidina del virus de herpes simple (HSV) (Wagner et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 1441,1981); el promotor
adenovirus (Yamada et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82:
3567,1985).
Los genes KIM también pueden ser insertados
mediante vectores específicos virales para su uso en sistemas de
transferencia de genes, utilización que se encuentra muy
establecida actualmente. Ver por ejemplo: Madzak et al., J.
Gen. Virol., 73: 1533-36, 1992 (papovavirus SV40);
Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:
39-61, 1992 (adenovirus); Hofinann et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 10099-10103, 1995
(baculovirus); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol.,
158: 25-38,1992 (virus vaccinia); Muzyczka, Curr.
Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123,1992 (virus
adenoasociado); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:
67-93,1992 (virus de herpes simple (HSV) y virus
Epstein-Barr (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol.
Immunol., 158: 1-24,1992 (retrovirus);
Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4:
749-754,1984 (retrovirus); Miller et al.,
Nature, 357: 455-450,1992 (retrovirus); Anderson,
Science, 256: 808-813,1992 (retrovirus), Current
Protocols in Molecular Biology: Sections 9.10-9.14
(Ausubel et al., Eds.), Greene Publishing Associcates,
1989.
Los vectores preferidos son virus de ADN que
incluyen adenovirus (preferiblemente vectores basados en Ad- 2 o
Ad- 5), baculovirus, virus del herpes (preferiblemente virus del
herpes simple de vectores basados), y parvovirus (preferiblemente
parvovirus "defectuosos" o no-autónomos de
vectores basados, más preferiblemente virus adenoasociados de
vectores basados, más preferiblemente vectores basados AAV- 2).
Ver, por ejemplo, Ali et al., Gene Therapy 1:
367-384,1994; Patente U.S. 4,797,368 y 5,399,346 y
la discusión a continuación.
El cambio de un sistema de vector particular
para transferir, por ejemplo, una secuencia KIM dependerá de una
variedad de factores. Un factor importante es la naturaleza de la
población celular diana. Aunque los vectores retrovirales han sido
estudiados extensamente y empleados en un número de aplicaciones de
terapia génica, generalmente ellos son impropios para células
contagiadas que no están divididas, pero pueden ser útiles en
terapia de cáncer puesto que ellos únicamente integran y expresan
sus genes en la replicación celular. Son útiles para metodologías
ex vivo y atractivos en este respecto debido a su integración
estable dentro del genoma de la célula diana.
Los adenovirus son virus de ADN eucariótico que
pueden ser modificados para entregar eficientemente una terapéutica
o un transgen informador a una variedad de tipos de células. En
general los adenovirus tipos 2 y 5 (Ad2 y Ad5, respectivamente),
los cuales causan enfermedades respiratorias en humanos,
actualmente se desarrollan para terapia génica de Duchenne Muscular
Dystrophy (DMD) y Fibrosis Cística (FC). Ambos Ad2 y Ad5 pertenecen
a una subclase de adenovirus que no son asociados con malignidad en
humanos. Los vectores adenovirus son capaces de suministrar niveles
sumamente altos de gen informador a virtualmente todo tipo de
células, independientemente del estado mitótico. Los títulos altos
(placa moldeada de 10^{13} unidades/ml) de virus recombinante
pueden ser fácilmente de generados en 293 células (una línea
celular de riñón embrionario de complementación de
adenovirus-transformado: ATCC CRL1573) y
crio-almacenadas durante períodos extensos sin
pérdidas considerables. La eficacia de este sistema en la
distribución de un transgen terapéutico in vivo que
complementa un desequilibrio genético ha sido demostrada en modelos
de animal de varios trastornos. Ver Watanabe, Atherosclerosis, 36:
261-268, 1986; Tanzawa et al., FEBS Letters
118 (1): 81-84, 1980; Golasten et al., New
Engl.J. Med. 309: 288-296, 1983; Ishibashi et
al., J. Clin. Invest. 92: 883-893, 1993; y
Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 93:
1889-1893, 1994, todos de los cuales están
incorporados en la presente por referencia. Ciertamente, la
replicación de recombinantes defectuosos de adenovirus codificando
un cADN para el regulador de transmembrana de fibrosis cística
(CFTR) ha sido aprobado para emplear en al menos dos pruebas
clínicas de FC humanas. Ver, por ejemplo, Wilson, Nature 365:
691-692, 1993. Adicionalmente un soporte de la
seguridad de adenovirus recombinante para terapia génica es la
experiencia extensa de vacunas de adenovirus vivos en poblaciones
humanas.
El recombinante de
primera-generación, adenovirus
replicación-deficiente que ha sido desarrollado para
terapia génica de DMD y otros trastornos heredados contiene
supresiones del Ela entero y parte de las regiones E1b. Este virus
de replicación-defectiva es cultivado en 293 células
que contienen un adenovirus funcional del gen E la que suministra
una tramitación de una proteína E1a. Los virus
E1-suprimidos son capaces de la replicación y
producción de virus infeccioso en las 293 células, que suministra
productos de genes en la región E1a y E1b trans. El virus
resultante es capaz de infectar muchos tipos de células y pueden
expresar el gen introducido (siempre y cuando tenga su propio
promotor), pero no puede replicar en una célula que no lleva la
región El del ADN a menos que la célula se infecte con una muy alta
multiplicidad de infecciones. Los adenovirus tienen la ventaja de
tener un rango de huésped amplio, pueden infectar células
diferenciales inactivas o terminales tales como neuronas, y parecen
esencialmente no-oncogénicos. Los adenovirus no
parecen integrar dentro del genoma del huésped. Dado que existen
fuera de los cromosomas, el riesgo de mutagénesis insercional se
reduce enormemente. Ali et al., supra., at 373. Los
adenovirus recombinantes (rAdV) producen títulos muy altos, las
partículas virales son moderadamente estables, los niveles de
expresión son altos, y un amplio rango de células pueden ser
infectadas. Sus células huésped naturales tienen epitelio de las
vías respiratorias, y por ello son útiles para la terapia de
cánceres de pulmón.
La transferencia mediada por baculovirus tiene
muchas ventajas. La transferencia del gen baculoviral puede
presentarse en la replicación y la no-replicación de
células, y puede presentarse en células renales, hepatocitos,
células neurales, bazo, piel y músculo. El baculovirus es
no-replicado y no-patogénico en
células de mamífero. Los humanos carecen de anticuerpos
pre-existentes para recombinar baculovirus los
cuales podrían bloquear la infección. Además, el baculovirus es
capaz de incorporar y transducir insertos de ADN muy grandes.
Los virus adeno-asociados (AAV)
también han sido ocupados como vectores para terapia génica
somática. El AAV es un pequeño, virus de ADN de una cadena simple
con una organización genómica simple (4-7 kb) que lo
hace un sustrato ideal para la ingeniería genética. Dos armazones
de lectura abierta codifican una serie de polipéptidos rep y
cap. Los polipéptidos rep (rep78, rep68, rep 62 y rep
40) son implicados en la replicación, rescate e integración del
genoma AAV. Las proteínas cap (VP1, VP2 y VP3) a partir de la
cápsida del virion. El flanqueo de los armazones de lectura abierta
rep y cap en los finales 5' y 3' son 145 bp
repeticiones terminales invertidas (ITR), el primero de 125 bp de
los cuales son capaces de formar estructuras dobles con forma de Y
o T. De importancia para el desarrollo de vectores AAV, los
dominios rep y cap completos pueden ser extirpados y
remplazados con un transgen terapéutico o informador. Ver B.J.
Carter, in Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press,
pp. 155-168 (1990). Se ha mostrado que el ITR
representa la secuencia mínima requerida para la replicación,
rescate, empaquetado, e integración del genoma AAV.
Los virus adeno-asociados (AAV)
tienen potencial significado en la terapia génica. Las partículas
virales son muy estables y recombinantes AAVs (rAAV), tienen
características similares a los medicamentos ya que los rAAV pueden
ser purificados por granulación o por agrupación en gradiente de
bandas CsCl. Son estables al calor y pueden ser liofilizados a un
polvo y rehidratados para una actividad total. Su ADN estable se
integra dentro de los cromosomas huésped y de esta manera la
expresión es de largo-término. Su rango de huésped
es amplio y AAV no causa enfermedades conocidas de manera que los
vectores recombinantes no son tóxicos.
Una vez insertados dentro de una célula diana,
las secuencias de interés pueden ser identificadas por métodos
convencionales tales como sondas de hibridización de ácidos
nucleicos que comprenden secuencias que son
homólogas/complementarias a las secuencias de gen insertado del
vector. En otra aproximación, la(s) secuencia(s)
puede(n) ser identificada(s) por la presencia o
ausencia de una función del gen "marcador" (por ejemplo,
actividad de la kinasa timidina, resistencia al antibiótico y
parecidos) causada por la inserción del vector de expresión dentro
de la célula diana.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de la invención son formulados de
acuerdo con la práctica estándar, tal como preparado en un
vehículo, El término "vehículo aceptable farmacéuticamente"
significa uno o más ingredientes orgánicos o inorgánicos, naturales
o sintéticos, con los cuales el mutante
proto-oncógeno o el mutante oncoproteína es
combinado para facilitar su aplicación. Un vehículo apropiado
incluye solución salina estéril aunque otras soluciones isotónicas
acuosas y no- acuosas y suspensiones estériles conocidas por ser
farmacéuticamente aceptables por aquellos de ordinaria habilidad en
el oficio. En esta consideración, el término "vehículo" abarca
liposomas y la proteína tat HIV-1 (Ver Chen et
al., Anal. Biochem. 227: 168- 75, 1995) y también cualquier
plásmido y vectores de expresión viral.
Cualquiera de los polipéptidos novedosos de esta
invención puede ser empleado en la forma de una sal
farmacéuticamente aceptable. Apropiados ácidos y bases que son
capaces de formar sales con los polipéptidos de la presente
invención son conocidos por expertos en el arte, e incluyen ácidos
y bases orgánicos e inorgánicos.
Un compuesto de la invención es administrado a
un sujeto en una cantidad terapéuticamente efectiva, lo que
significa una cantidad del compuesto que produce un resultado
deseado médicamente o ejerce una influencia sobre una condición que
está siendo tratada. Una cantidad efectiva de un compuesto de la
invención es capaz de mejorar o retrasar la progresión de la
enfermedad, condición degenerativa o lesión. La cantidad efectiva
puede ser determinada sobre una base individual y se basará, en
parte, sobre consideraciones de los atributos físicos del sujeto, de
los síntomas a ser tratados y los resultados buscados. Una cantidad
efectiva puede ser determinada por un experto en la materia,
empleando tales factores y usando no más de una rutina de
experimentación.
Un sistema de entrega de liposomas para un
compuesto de la invención puede ser cualquiera de una variedad de
vesículas unilamelares, vesículas multilamelares, o vesículas
plurilamelares estables, y pueden ser preparados y administrados de
acuerdo con métodos conocidos por expertos en el arte, por ejemplo
de acuerdo con los enseñados en la patente de los Estados Unidos
5169637, 4762915, 5000958 ó 5185154. Además, esto puede ser deseado
para expresar los polipéptidos novedosos de esta invención, y
también otros polipéptidos, como lipoproteínas, con el fin de
realzar su enlace a los liposomas. Como un ejemplo, el tratamiento
de fallo renal agudo en humanos con proteínas KIM encapsuladas en
liposomas, puede ser llevado a cabo in vivo mediante la
inserción de una proteína KIM dentro de células con necesidad de
semejante tratamiento utilizando liposomas. Los liposomas pueden ser
entregados mediante un catéter a la arteria renal. La proteína KIM
recombinante se purifica, por ejemplo, a partir de células CHO por
cromatografia de inmunoafinidad o cualquier otro método
conveniente, luego se mezcla con liposomas y se incorporan dentro
de ellos a alta eficiencia. La proteína encapsulada puede ser
probada in vitro para cualquier efecto sobre la estimulación
del crecimiento celular.
Los compuestos de la invención pueden ser
administrados de cualquier manera que sea aceptable médicamente.
Ésta puede incluir inyecciones, por rutas parenterales tales como
intravenosa, intravascular, intraarterial, subcutánea,
intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, intraventricular,
intraepidural, u otras también como, oral, nasal, oftálmica,
rectal, o tópica. La administración con liberación sostenida
también es específicamente incluida en la invención, por tales
medios como inyecciones depósito o implantes erosionables. Entregas
localizadas se contemplan particularmente, por medios tales como
entrega mediante catéter a una o más arterias, tales como la
arteria renal o un recipiente suministrado a un tumor
localizado.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Michele Sanicola-Nadel
\hskip4cmJoseph V. Bonventre
\hskip4cmCatherine A. Hession
\hskip4cmTakaharu Ichimura
\hskip4cmHenry Wei
\hskip4cmRichard L. Cate
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: MODULADORES DE REGENERACIÓN TISULAR
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Biogen, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 14 Cambridge Center
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02142
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patente en lanzamiento #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-MAYO-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD PRECEDENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/018,228
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 24-MAYO-1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- PROCURADOR/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Levine, Leslie M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 35,245
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: A010 PCT CIP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 679-2810
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617) 679-2838
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2566 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/LLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 615..1535
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2084 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/LLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 145..1065
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 307 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2303 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/LLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 107..1822
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 572 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1795 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/LLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 278..1279
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 334 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5
o SEQ ID NO: 7.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en
donde el polipéptido consiste en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ
ID NO: 7.
3. Un polipéptido que comprende una variante
soluble del polipéptido de las reivindicaciones 1 ó 2.
4. Una proteína de fusión que comprende el
dominio extracelular del polipéptido de las reivindicaciones 1 ó 2 y
una región Fc de una inmunoglobulina.
5. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Un ácido nucleico que codifica la proteína de
fusión de la reivindicación 4.
7. El ácido nucleico de la reivindicación 5, en
donde el ácido nucleico comprende una secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ
ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.
8. Un vector que comprende el ácido nucleico de
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
9. Una célula huésped que comprende el vector de
la reivindicación 8.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un método de producción de un polipéptido,
en donde el método comprende:
- \quad
- el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 9 en un medio de cultivo celular; y
- \quad
- la recuperación del polipéptido expresado a partir del vector dentro de la célula huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un anticuerpo que se une al polipéptido de
la reivindicación 2.
12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en
donde el anticuerpo es conjugado a una toxina o radionucleido.
13. El anticuerpo de la reivindicación 11, en
donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
14. El anticuerpo de la reivindicación 11, en
donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo
humano, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento Fab o un
fragmento quimérico.
15. Un hibridoma que produce el anticuerpo de la
reivindicación 11.
16. Una composición farmacéutica que comprende
(i) el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, la
proteína de fusión de la reivindicación 4, o el anticuerpo de
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, y (ii) un vehículo
farmacológicamente aceptable.
17. El uso del polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, la proteína de fusión de la reivindicación
4 o el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14
para la preparación de una composición para el tratamiento de
lesión o enfermedad renal en un sujeto que padece una lesión o
enfermedad renal.
18. El uso del polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, de la proteína de fusión de la
reivindicación 4, o del anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14 para la preparación de una composición
diagnóstico para evaluar la presencia o el curso de una lesión o
enfermedad renal en un sujeto que padece una lesión o enfermedad
renal.
19. El uso de las reivindicaciones 17 ó 18, en
donde el sujeto es humano.
20. El uso del anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14 para la preparación de una composición
diagnóstico para la imagen de células o tejidos con expresión del
polipéptido de la reivindicación 2.
21. El uso del anticuerpo de la reivindicación
12 para la preparación de una composición farmacéutica para
focalizar una toxina o radionucleido para células con expresión del
polipéptido de la reivindicación 2.
22. El polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, la proteína de fusión de la reivindicación
4, o el anticuerpo de las reivindicaciones 11 a 14 para un uso en
terapia o en diagnóstico.
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