BR112012022672B1 - anticorpo monoclonal, sequência de nucleotídeos, vetor de expressão, célula hospedeira procariótica recombinante, composição farmacêutica, uso do anticorpo, métodos para produzir um anticorpo, para detectar a presença de c-met em uma amostra, e, kit para detectar a presença de c-met em uma amostra - Google Patents

anticorpo monoclonal, sequência de nucleotídeos, vetor de expressão, célula hospedeira procariótica recombinante, composição farmacêutica, uso do anticorpo, métodos para produzir um anticorpo, para detectar a presença de c-met em uma amostra, e, kit para detectar a presença de c-met em uma amostra Download PDF

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Abstract

anticorpo monoclonal, sequência de nucleotídeos, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, uso do anticorpo, métodos para inibir o crescimento e/ou a proliferação de uma célula de tumor, para produzir um anticorpo, para detectar a presença de c-met em uma amostra, kit para detectar a presença de c-met em uma amostra, e, anticorpo anti-idiotípico. dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, caracterizado pelo fato de que é para controlar um mecanismo de transmissão escalonada (30), que inclui uma primeira embreagem (32) a ser acoplada na partida, e uma segunda embreagem (33), diferente da primeira embreagem (32), e é travado quando uma pressão hidráulica é suprida à primeira embreagem (32) e à segunda embreagem (33), e a primeira embreagem (32) e a segunda embreagem (33) são completamente acopladas, compreendendo: um meio de controle de pressão hidráulica (12) adaptado para controlar um pressão hidráulica suprida ao mecanismo de transmissão escalonada (30), de modo que a primeira embreagem (32) seja colocada em um estado completamente acoplado, e a segunda embreagem (33) seja colocada em um estado de travamento deslizante, no qual a segunda embreagem (33) não fica completamente acoplada, no caso de um retorno de um controle de parada inativa, no qual um motor (1) é automaticamente parado. dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com a revivindicação1, caracterizado pelo fato de que o meio de controle de pressão hidráulica (12) começa a reduzir a pressão hidráulica, suprida à segunda embreagem (33), quando uma proporção aumentada de um avelocidade de rotação de motor por unidade de tempo fica menor do que um primeiro valor predeterminado. dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com a reinvidicação 1 ou 2 , caracterizado pelo fato de que o meio de controle de pressão hidráulica (12) controla a pressão hidráulica, suprida à segunda embreagem (33), de modo que uma proporção diminuída da pressão hidráulica, suprida à segunda embreagem (33), por unidade de tempo se torna um segundo valor predeterminado. dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio de controle de pressão hidráulica (12): inclui o meio de cálculo de torque de saída alvo (12), adaptado para calcular um torque de saída alvo por adição de um terceiro valor predeterminado a um torque de saída alvo calculado da última vez; e controla a pressão hidráulica suprida à segunda embreagem (33), com base no torque de saída alvo calculado pelo meio de cálculo de torque de saída alvo (12). dispositico de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com a reinvidicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de controle hidráulico (12); inclui o meio de cálculo de torque de saída alvo (120, adaptado para calcular um torque de entrada do mecanismo de transmissão escalonada, com base em uma velocidade de rotação de motor, e calcular um torque de saída alvo do mecanismo de transmissão escalonada (30), com base em um desvio entre o torque de entrada do mecanismo de transmissão escalonada (30), calculada nesse momento, e o torque de entrada do mecqanismo de transmissão escalonada (30), calculado da última vez, e um quatro valor predeterminado; e controla a pressão hidráulica suprida à segunda embreagem (33), com base no torque de saída alvo calculado pelo meio de cálculo de torque de saída alvo (12). dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio de controle de torque de saída alvo (12) calcula o torque de saída alvo, nesse momento, por adição do desvio para o torque de saída alvo, calculado da última vez, quando o desvio é maior do que o quarto valor predeterminado, ou por adição do quarto valor predeterminado para o torque de saída alvo, calculado da última vez, quando o desvio é menor do que o quarto valor predeterminado. dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o meio de detecção de gradiente (47), adaptado para detectar um gradiente de uma superfície de via de rolamento, em uma direção de deslocamento de um veículo, em que: uma pressão hidráulica inicial aumenta na medida em que um gradiente ascendente da superfície da via de rolamento, na direção de deslocamento do veículo, aumenta. dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o meio de detecção de gradiente (47), adaptado para detectar um gradiente de uma superfície de via de rolamento, em uma direção de deslocamento de um veículo, em que: o meio de controle de pressão hidráulica (12) faz com que a pressão hidráulica, suprida à sentido de incongruidade (33), seja reduzida de uma pressão hidráulica inicial, a uma sincronização mais cedo, na medida em que um gradiente ascendente da superfície da via de rolamento, na direção de deslocamento do veículo, aumenta. dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o meio de detecção de gradiente (47), adaptado para detectar um gradiente de uma superfície de via de rolamento, em uma direção de deslocamento de um veículo, em que: o meio de controle de pressão hidráulica (12) reduz uma proporção diminuída da pressão hidráulica, suprida à segunda embreagem (33), por unidade de tempo, na medisa em que um gradiente ascendente da superfície de via de rolamento, na direção de deslocamento do veículo, aumenta. dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o meio de controle de pressão hidráulica (12) inicia o suprimento da pressão hidráulica à segunda embreagem (33), de modo que a segunda embreagem (33) seja ajustada no estado de travamento deslizante, quando um veículo pára. dispositivo de controle para um mecanismo de transmissão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o controle de parda inativa é iniciado, após a segunda embreagem (33) ser ajustada no estado de travamento deslizante. método de controle para um mecanismo de transmissão escalonada, que inclui uma primeira embreagem (32), a ser acoplada na partida, e uma segunda embreagem (33), diferente da primeira embreagem (31), e que é travado quando uma pressão hidráulica é suprida à primeira embreagem (32) e à segunda embreagem (33), e a primeira embreagem (32) e a segunda embreagem (33) são completamente acopladas, caracterizado pelo fato de que compreende: controle de uma pressão hidráulica suprida ao mecanismo de transmissão, de modo que a primeira embreagem (32) seja colocada em um estado completamente acoplado, e a segunda embreagem (33) seja colocada em um estado de travamento deslizante, no qul a segunda embreagem (33) não fica completamente acoplada, no caso de um retorno de um controle de parada inativa, no qual um motor (1) é automaticamente parado.

Description

“ANTICORPO MONOCLONAL, SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA PROCARIÓTICA RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO ANTICORPO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, PARA DETECTAR A PRESENÇA DE C-MET EM UMA AMOSTRA, E, KIT PARA DETECTAR A PRESENÇA DE C-MET EM UMA AMOSTRA”
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se aos anticorpos monoclonais direcionados contra c-Met de humano, ao receptor de crescimento de hepatócito, e aos usos de tais anticorpos, em especial ao uso deles no tratamento de câncer.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO c-Met é uma proteína tirosina-cinase receptora atravessadora de membrana. O precursor de cadeia principalmente única é clivado depois da tradução para produzir a forma madura do heterodímero de c-Met que consiste de uma cadeia-α extracelular (50 kDa) e uma cadeia-β de transmembrana mais longa (145 kDa), que são ligadas por dissulfeto (Birchmeier et al. 2003. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4:915). A parte extracelular de c-Met é composta de três tipos de domínios. O domínio SEMA N-terminal é formado pela subunidade-α inteira e parte da subunidade-β, e inclui homologia com as proteínas semaforina. O domínio SEMA é seguido por um domínio rico em cisteína e depois por quatro domínios semelhantes à imunoglobulina (Ig). A parte citoplasmática contém um domínio de cinase de justamembrana e uma cauda carbóxi-terminal que é essencial para a sinalização a jusante. O único conhecido ligante de afinidade alta por c-Met, fator de crescimento de hepatócito (HGF), é principalmente expressado sob condições normais por fibroblastos (Li e Tseng 1995. J. Cell. Physiol.163:61) e por células de tumor (Ferracini et al. 1995. Oncogene 10:739). HGF (também chamado de fator de dispersão, SF) é sintetizado como um precursor que é proteoliticamente convertido em um
Petição 870190140759, de 27/12/2019, pág. 8/18
2/121 heterodímero α/β ativo. Baseado na estrutura cristalina do fragmento ligante do receptor, é considerado que HGF se liga em c-Met como um dímero (Chirgadze et al. 1999. Nat. Struct. Biol. 6:72). A cadeia-α de HGF se liga com afinidade alta no domínio semelhante à Ig em c-Met, enquanto que a cadeia β de HGF se liga apenas com afinidade baixa no domínio SEMA de c-Met (Basilico et al. 2008. J. Biol. Chem. 283:21267). A última interação é responsável pela dimerização de cMet e pela ativação da tirosina-cinase receptora sob ligação do heterodímero de HGF ativo. Autofosforilação do receptor resulta em um sítio de contato singular para recrutamento de efetores, dos quais ligação de Gab1 (proteína ligadora 1 associada ao receptor de fator de crescimento ligado à proteína 2) é essencial para as principais rotas de sinalização a jusante de c-Met (Comoglio et al. 2008. Nat. Rev. Drug. Discov. 7:504):
• rota Ras-ERK1/2: proliferação.
• rota Ras-Rac: invasão, motilidade, transição epitelial-paramesenquimal.
• rota PI3K-Akt: sobrevivência.
[002] c-Met é expressada sobre a superfície de células epiteliais e endoteliais de muitos órgãos durante a embriogênese e em idade adulta, incluindo o fígado, o pâncreas, a próstata, os rins, músculo, e medula óssea. Ativação de c-Met desempenha uma função essencial no denominado programa de “crescimento invasivo” que consiste de uma série de processos, incluindo proliferação, motilidade, angiogênese e proteção contra apoptose (Boccaccio e Comoglio 2006. Nat. Rev. Cancer 6:637). Estes processos regulados por c-Met ocorrem sob condições fisiológicas normais durante o desenvolvimento embrionário, os reparos de lesões hepática e cardíaca, e patologicamente durante oncogênese (Eder et al. 2009. Clin. Cancer Res. 15:2207).
[003] Sinalização inapropriada de c-Met ocorre virtualmente em todos os tipos de tumores sólidos, tais como cânceres de bexiga, de mama, cervical,
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3/121 colorretal, gástrico, de cabeça e pescoço, de fígado, de pulmão, ovariano, pancreático, de próstata, renal, e de tireoide, bem como em vários sarcomas, malignidades hematopoiéticas e melanoma (Birchmeier et al. 2003. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4:915; Comoglio et al. 2008. Nat. Rev. Drug Discov. 7:504; Peruzzi e Bottaro 2006. Clin. Cancer Res. 12:3657). Os mecanismos subjacentes à tumorigenicidade de c-Met são tipicamente realizados em três maneiras:
• alças autócrinas de HGF/c-Met, • supraexpressão de c-Met ou HGF, • mutações ativadoras de cinase na sequência codificadora de receptor de c-Met.
[004] Mais notavelmente, mutações ativadoras de c-Met têm sido identificadas em pacientes com câncer renal papilar hereditário (Schmidt et al. 1997. Nat. Genet. 16:68). Ativação constitutiva de c-Met contribui para um ou mais fenótipos de câncer proliferativo, invasivo, sobrevivente, ou angiogênico. Tem sido mostrado que silenciamento de gene de c-Met endogenamente expressada em células de tumor resulta em falta de proliferação e crescimento de tumor e regressão de metástase estabelecida, bem como em geração decrescida de metástases novas (Corso et al. 2008. Oncogene 27:684).
[005] Visto que c-Met contribui para múltiplos estágios de desenvolvimento de câncer, desde a iniciação até a progressão para metástase, c-Met e seu ligante HGF têm se tornado candidatos líderes para terapias de câncer selecionadas (Comoglio et al. 2008. Nat. Rev. Drug. Discov. 7:504; Knudsen e Vande Woude 2008. Curr. Opin. Genet. Dev. 18:87). Várias estratégias estão sendo exploradas para alcançar este objetivo:
• Receptores decoy: sub-regiões de HGF ou c-Met ou análogos moleculares podem atuar antagonisticamente como competidores estequiométricos pelo bloqueio de ligação de ligante ou dimerização de receptor. Um exemplo de uma sub-região antagonística de HGF é NK4
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4/121 (Kringle Pharma).
• Inibidores de tirosina-cinase de molécula pequena (TKIs): Três TKIs específicos para c-Met em diferentes estágios de avaliação clínica são ARQ197 (ArQule), JNJ 38877605 (Johnson & Johnson) e PF-04217903 (Pfizer).
• Anticorpos monoclonais anti-HGF, tais como AMG102, rilotumumab (Amgen), HuL2G7 (Takeda), e AV-299 (Schering).
• Anticorpos monoclonais anti-c-Met têm sido descritos em
WO2005016382, WO2006015371, WO2007090807, WO2007126799
WO2009007427, WO2009142738 e van der Horst et al. (van der Horst et al. 2009. Neoplasia 11:355). MetMAb (Genentech) é um anticorpo monovalente humanizado (de um braço) OA-5D5 que se liga no domínio extracelular de cMet, evitando com isso a ligação de HGF e a subsequente ativação de receptor (Jin et al. 2008. Cancer Res. 68:4360). Em modelos de xenoenxerto em camundongo, foi verificado que tratamento com MetMAb inibe o crescimento de tumor de glioblastoma ortotópico ativado por HGF e de tumores pancreáticos subcutâneos (Jin et al. 2008. Cancer Res. 68:4360; Martens et al. 2006. Clin. Cancer Res. 12:6144). h224G11 (Pierre Fabre) (Corvaia e Boute 2009. Abstract 835 AACR 100o Encontro Anual) é um anticorpo IgG bivalente humanizado anti-c-Met. Efeitos antitumorais desta anticorpo têm sido observados em camundongos (Goetsch et al. 2009. Abstract 2792 AACR 100o Encontro Anual). CE-355621 (Pfizer) é uma IgG2 de humano que bloqueia a ligação de ligante pela ligação no domínio extracelular de c-Met e inibe o crescimento dependente de HGF em modelos de xenoenxerto de tumor (Tseng et al. 2008. J. Nucl. Med. 49:129).
[006] Em conclusão, vários produtos anti-c-Met estão senso investigados, mas até agora nenhum produto tem sido aprovado para uso terapêutico. Permanece uma necessidade de produtos eficazes e seguros para tratar doenças relacionadas com c-Met, tal como câncer.
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SUMÁRIO DA INVENÇÃO [007] Um objetivo da presente invenção é fornecer anticorpos monoclonais anti-c-Met elevadamente específicos e eficazes para uso médico. Os anticorpos da invenção exibem características de ligação em c-Met que diferem dos anticorpos descritos na arte. Em modalidades preferidas, os anticorpos da invenção têm uma afinidade alta por c-Met de humano, são antagonísticos e têm um perfil farmacocinético favorável para uso em pacientes humanos.
DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS [008] Figura 1: Alinhamento de sequências de região variável de cadeia pesada de HuMabs. Baseando-se nestas sequências, sequência de consenso pode ser definida para algumas das sequências de CDR. Estas sequências de consenso são apresentadas em Tabela 4.
[009] Figura 2: Alinhamento de sequências de região variável de cadeia leve de HuMabs. Baseando-se nestas sequências, sequência de consenso pode ser definida para algumas das sequências de CDR. Estas sequências de consenso são apresentadas em Tabela 4.
[0010] Figura 3: Curvas de ligação de formas monovalente e bivalente de anticorpos anti-c-Met para células A431 expressando c-Met. Dados mostrados são MFI de um experimento representativo. Devido ao fato de que IgG1-024 e Uni-068 não mostraram ligação saturada em células A431 não foi possível calcular um valor acurado de EC50.
[0011] Figura 4: Ligação de anticorpos em c-Met expressado em células epiteliais de macaco Rhesus. Dados mostrados são MFI de um experimento.
[0012] Figura 5: Inibição induzida por anticorpo anti-c-Met da ligação de HGF no domínio extracelular do receptor de c-Met. Dados mostrados são um experimento representativo.
[0013] Figura 6: Curvas de inibição de ligação de HGF dos vários
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6/121 anticorpos anti-c-Met para ligação em cMetSEMA_567His8 testado com TRFRET. Dados mostrados são MFI médio ± desvio padrão de três experimentos independentes.
[0014] Figura 7: Inibição percentual de células KP4 viáveis após tratamento com anticorpo anti-c-Met em comparação com células não tratadas (0%). Dados mostrados são percentagens de inibição de células viáveis de dois experimentos independentes ± o desvio padrão. IgG1-1016-022 foi apenas positiva em um experimento.
[0015] Figura 8: Eficácia de anticorpos anti-c-Met para inibir crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto de KP4 em camundongos SCID. Camundongos foram tratados com 400 gg de anticorpo no dia 9 seguido semanalmente por uma dose de manutenção de 200 gg. São mostrados os tamanhos médios de tumor por grupo de tratamento.
[0016] Figura 9: Eficácia de anticorpos anti-c-Met para inibir o crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto de KP4 em camundongos SCID. Camundongos foram tratados com 400 gg de anticorpo no dia 9 seguido semanalmente por uma dose de manutenção de 200 gg. Efeito de tratamento sobre incidência de tumor no tempo. É mostrada a percentagem de camundongos livres de tumor (tamanhos de tumor < 500 mm3). Formação de tumor é retardada em camundongos tratados com anticorpos antagonísticos em comparação com anticorpos de controle.
[0017] Figura 10: Eficácia de anticorpos anti-c-Met para inibir o crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto de MKN45 em camundongos SCID. Camundongos foram tratados com 40 mg/kg de anticorpo no dos 7 e 20 mg/kg de anticorpo nos dias 14, 21 e 28. São mostrados os tamanhos médios de tumor até 50% dos camundongos alcançaram ponto final de 700 mm3, por grupo de tratamento.
[0018] Figura 11: Eficácia de anticorpos anti-c-Met para inibir o crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto de MKN45 em
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7/121 camundongos SCID. Camundongos foram tratados com 40 mg/kg de anticorpo no dos 7 e 20 mg/kg de anticorpo nos dias 14, 21 e 28. Percentagem de camundongos com tamanhos de tumor menores do que 700 mm3 é mostrada em uma plotagem de Kaplan Meier. Formação de tumor é atrasada em camundongos tratados com anticorpos anti-c-Met em comparação com o anticorpo de controle isótipo.
[0019] Figura 12: Ensaio de viabilidade de KP4 para determinar o efeito de flexibilidade de anticorpo sobre atividade antagonística. O formato IgA2m(1) não induziu proliferação, ao contrário dos formatos IgA1 e IgG1 do mesmo anticorpo. Variantes do anticorpo 5D5 anti-c-Met (veja US6468529 e Exemplo 2) foram usadas neste tratamento.
[0020] Figura 13: Análise por SDS-PAGE não reduzida de mutantes de flexibilidade de (069). Não foram observados multímeros aberrantes ou produtos de degradação enquanto que pareamento de cadeia leve foi visível como uma banda de 50 kD ((LQ2) nos mutantes C220S, AC220 e IgG1articulação IgG3.
[0021] Figura 14: ELISA de ligação de antígeno para medir a ligação em c-Met de mutantes de articulação dos anticorpos anti-c-Met. Todos os mutantes se ligam com afinidade comparável em c-Met como mostrado em ELISA.
[0022] Figura 15: Fosforilação de c-Met como leitura para atividade agonística de anticorpos contra c-Met. Figura 15 mostra resultados de Western blot de lipases A549; membranas coradas com anticorpos contra cMet fosforilada, c-Met total ou β-actina.
[0023] Figura 16: Ensaio de proliferação com células NCI-H441. Massa celular foi determinada após 7 dias de incubação na presença do anticorpo ou de controles e plotada como percentagem de amostras não tratadas (atribuídas a 100%).
[0024] Figura 17: Ensaio de viabilidade de KP4. Foi testado o efeito
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8/121 de anticorpos contra c-Met sobre a viabilidade total de células KP4. A capacidade de IgG1-1016-069 para reduzir a viabilidade de KP4 foi retida e/ou aperfeiçoada pela introdução de mutações que decrescem a flexibilidade dos anticorpos.
[0025] Figura 18: Inframodulação conforme medida como níveis totais de c-Met em lisados de A549 usando ELISA. Todas as variantes de anticorpo (069) retiveram a capacidade de inframodulação.
[0026] Figura 19: Ensaio de ADCC para comparar versões alta e baixa em fucose do anticorpo IgG1-1016-069.
[0027] Figura 20: Falta de ligação de anticorpos anti-c-Met em células em sangue inteiro em ensaio de ligação usando FACS (fracionador de células ativado por fluorescência). Os resultados são mostrados para células B; monócitos e granulócitos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições [0028] O termo “c-Met”, quando aqui usado, refere-se ao receptor de fator de crescimento de hepatócito (Número de acesso ao Banco de Genes NM 000245) e inclui quaisquer variantes, isoformas e homólogos de espécie de c-Met de humano que são naturalmente expressados por células ou são expressados sobre células transfectadas com o gene de c-Met.
[0029] O termo “imunoglobulina” refere-se a uma classe de glicoproteínas estruturalmente relacionadas consistindo de dois pares de cadeias de polipeptídeo, um par de cadeias leves (L) de peso molecular baixo e um par de cadeia pesadas (H), todas as quatro interconectadas por ligações de dissulfeto. A estrutura das imunoglobulinas tem sido bem caracterizada. Veja por exemplo “Fundamental Immunology” Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, Nova Iorque (1989)). Resumidamente, cada cadeia pesada tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região
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9/121 constante de cadeia pesada tipicamente é compreendida de três domínios, Ch1, Ch2, e Ch3. Cada cadeia leve tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como Vl ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve tipicamente é compreendida de um domínio, Cl. As regiões Vh e Vl podem ser adicionalmente divididas em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis em sequência e/ou forma de alças estruturalmente definidas), também chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), entremeadas com regiões que estão mais conservadas, chamadas de regiões de molde (FRs). Cada Vh e Vl é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, posicionadas desde a terminação amino até a terminação-carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (veja também Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196. 901-917 (1987)). Tipicamente, a numeração de resíduos de aminoácido nesta região é realizada pelo método descrito em Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5o Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (frases tais como numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat ou de acordo com Kabat referem-se aqui a este sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve). Pelo uso deste sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real de um peptídeo pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais correspondendo a um encurtamento de, ou a uma inserção em, uma FR ou CDR de um domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de Vh CDR2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada pera um dado anticorpo pelo alinhamento em regiões de homologia da sequência do
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10/121 anticorpo com uma sequência numerada por Kabat “padrão”.
[0030] O termo “anticorpo” (Ab) no contexto da presente invenção refere-se a uma molécula de imunoglobulina, a um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, ou a um derivado de qualquer uma das mesmas, que tem a capacidade para especificamente se ligar em um antígeno sob condições fisiológicas típicas com uma meia-vida de períodos de tempo significativos, tais como de pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias, etc., ou qualquer outro período funcionalmente definido relevante (tal como um tempo suficiente para induzir, promover, intensificar, e/ou modular uma resposta fisiológica associada com ligação de anticorpo no antígeno e/ou tempo suficiente para o anticorpo recrutar uma atividade efetora). As regiões variáveis das cadeia pesada e leve da molécula de imunoglobulina contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos (Abs) podem mediar a ligação da imunoglobulina com tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (tais como células efetoras) e componentes do sistema de complemento tal como C1q, o primeiro componente na rota clássica de ativação de complemento. Um anticorpo antic-Met também pode ser um anticorpo biespecífico, diacorpo, ou molécula similar (veja, por exemplo, PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) para uma descrição de diacorpos). De fato, anticorpos biespecíficos, diacorpos, e semelhantes, fornecidos pela presente invenção podem se ligar em qualquer alvo adequado em adição a uma porção de c-Met. Como indicado acima, o termo anticorpo aqui, salvo indicação em contrário ou claramente contradito pelo contexto, inclui fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade para especificamente se ligar no antígeno. Tem sido mostrado que a função de
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11/121 ligação em antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação incluídos dentro do termo “anticorpo” incluem (i) um fragmento Fab' ou Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CH1, ou um anticorpo monovalente como descrito em WO2007059782 (Genmab); (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo essencialmente dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo essencialmente dos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento de dAb (Ward et al., Nature 341. 544-546 (1989)), que consiste essencialmente de um domínio Vh e também chamado de anticorpos de domínio (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90); (vi) anticorpos de camelídeo ou nanocorpos (Revets et al.; Expert Opin. Biol. Ther. 2005 Jan;5(1):111-24) e (vii) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Ademais, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por dois genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético que permite que eles sejam preparados como uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH pareiam para formarem moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeia única (Fv, scFv), veja, por exemplo, Bird et al., Science 242. 423426 (1988) e Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única estão incluídos dentro do termo anticorpo salvo indicação em contrário ou claramente indicado pelo contexto. Embora tais fragmentos estejam geralmente incluídos dentro do significado de anticorpo, coletivamente e cada um independentemente são características singulares da presente invenção, exibindo utilidade e propriedades biológicas diferentes. Estes e outros fragmentos de anticorpo úteis no contexto da presente invenção são discutidos aqui doravante. Também deve ser entendido que o termo
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12/121 anticorpo, salvo indicação em contrário, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), polipeptídeos semelhantes a anticorpo, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, e fragmentos de anticorpo retendo a capacidade para se ligar especificamente no antígeno (fragmentos ligadores de antígeno) fornecidos por qualquer técnica conhecida, tal como clivagem enzimática, síntese de peptídeo, e técnicas recombinantes. Um anticorpo como gerado pode possuir qualquer isótipo. [0031] Como aqui usado, “isótipo” refere-se à classe de imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM) que é codificada pelos genes de região constante de cadeia pesada.
[0032] O termo “anticorpo monovalente” significa no contexto da presente invenção que uma molécula de anticorpo é capaz de se ligar em uma única molécula do antígeno, e assim não é capaz de realizar ligação cruzada de antígenos.
[0033] Um “anticorpo deficiente em função efetora” ou um “anticorpo que é deficiente em função efetora” refere-se a um anticorpo que tem uma capacidade significativamente reduzida, ou nenhuma capacidade, para ativar um ou mais mecanismos efetores, tais como ativação de complemento ou ligação de receptor de Fc. Assim, anticorpos deficientes em função efetora têm capacidade significativamente reduzida ou nenhuma capacidade para mediarem citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Um exemplo de um tal anticorpo é IgG4.
[0034] Um “anticorpo anti-c-Met” é um anticorpo como descrito acima, que se liga especificamente no antígeno c-Met.
[0035] O termo “anticorpo de humano”, como aqui usado, é intencionado para incluir anticorpos tendo regiões constantes e variáveis derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa de humano. Os anticorpos de humano da invenção podem incluir resíduos de
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13/121 aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa de humano (p. ex., mutações introduzidas por mutagênese sítioespecífica ou aleatória in vitro ou por mutação somática in vivo). Contudo, o termo “anticorpo de humano”, como aqui usado, não é intencionado para incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, tal como um camundongo, têm sido graftizadas em sequências de região de molde de humano.
[0036] Como aqui usado, um anticorpo de humano é “derivado de” uma sequência de linhagem germinativa especial se o anticorpo é obtido de um sistema usando sequências de imunoglobulinas de humano, por exemplo, por imunização de um camundongo transgênico trazendo genes de imunoglobulina de humano ou por triagem de uma biblioteca de genes de imunoglobulinas de humano, e sendo que o anticorpo de humano selecionado é pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, por exemplo, pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% idêntico em sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa. Tipicamente, fora da CDR3 de cadeia pesada, um anticorpo de humano derivado de uma sequência de linhagem germinativa de humano especial exibirá não mais do que 20 aminoácidos diferentes, p. ex., não mais do que 10 aminoácidos diferentes, tal como não mais do que 9, 8, 7, 6 ou 5, por exemplo, não mais do que 4, 3, 2, ou 1 aminoácido(s) diferente(s) da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.
[0037] Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção é isolado. Um “anticorpo isolado”, como aqui usado, é intencionado para se referir a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se liga em c-Met está substancialmente livre de
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14/121 anticorpos que especificamente se ligam em antígenos diferentes de c-Met). Um anticorpo isolado que especificamente se liga em um epitopo, uma isoforma ou uma variante de c-Met pode, contudo, ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, de outras espécies (tais como homólogos de espécies de c-Met). Além disso, um anticorpo isolado pode estar substancialmente livre de outros compostos químicos e/ou materiais celulares. Em uma modalidade da presente invenção, dois ou mais anticorpos monoclonais “isolados” tendo especificidades de ligação em antígeno diferentes são combinados em uma composição bem definida.
[0038] Quando aqui usado no contexto de dois ou mais anticorpos, o termo “compete com” ou “compete cruzadamente com” indica que os dois ou mais anticorpos competem pela ligação na c-Met, p. ex., competem pela ligação na c-Met no ensaio descrito aqui nos Exemplos. Para alguns pares de anticorpos, competição no ensaio de Exemplos é apenas observada quando um anticorpo é revestido sobre a placa e o outro é usado para competir, e não vice-versa. O termo “compete com” quando aqui usado também é intencionado para cobrir tais combinações de anticorpos.
[0039] O termo “epitopo” significa um determinante de proteína capaz de se ligar especificamente em um anticorpo. Epitopos habitualmente consistem de agrupamentos de superfície de moléculas tais como aminoácidos ou cadeia laterais de açúcar e habitualmente características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de que a ligação dos primeiros, mas não dos últimos é perdida na presença de solventes desnaturantes. O epitopo pode compreender resíduos de aminoácido diretamente envolvidos na ligação (também chamados de componente imunodominante do epitopo) e outros resíduos de aminoácido, que não estão diretamente envolvidos na ligação, tais como resíduos de aminoácido que são efetivamente bloqueados pelo peptídeo ligante específico de antígeno (em
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15/121 outras palavras, o resíduo de aminoácido está dentro do raio de ação do peptídeo ligante específico de antígeno).
[0040] O termo “anticorpo monoclonal” como aqui usado refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade de ligação e afinidade por um epitopo especial. Consequentemente, o termo “anticorpo monoclonal de humano” refere-se aos anticorpos exibindo uma especificidade de ligação única que tem regiões constante e variável derivadas de sequências de imunoglobulinas de linhagem germinativa de humano. Os anticorpos monoclonais de humano podem ser gerados por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico ou transcromossômico, tal como um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve, fusionados em uma célula imortalizada.
[0041] Como aqui usado, o termo “ligação” no contexto da ligação de um anticorpo em um antígeno predeterminado tipicamente é uma ligação com uma afinidade correspondendo a uma Kd de cerca de 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos, cerca de 10-10 M ou menos, ou cerca de 10-11 M ou ainda menor quando determinada, por exemplo, por tecnologia de ressonância de plasmon de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando o antígeno como o ligante e o anticorpo como o analito, e ligações no antígeno predeterminado com uma afinidade correspondendo a uma KD que é pelo menos dez vezes menor, tal como pelo menos 100 vezes menor, por exemplo, pelo menos 1.000 vezes menor, tal como pelo menos 10.000 vezes menor, por exemplo, pelo menos 100.000 vezes menor do que sua afinidade pela ligação em um antígeno não específico (p. ex., BSA, caseína) diferente do antígeno predeterminado ou um antígeno proximamente relacionado. A quantidade com a qual a afinidade é menor é dependente da KD do anticorpo, de modo que quando a KD do
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16/121 anticorpo é muito baixa (isto é, o anticorpo é elevadamente específico), então a quantidade com a qual a afinidade para com o antígeno é menor do que a afinidade para com um antígeno não específico pode ser pelo menos de 10.000 vezes.
[0042] O termo “kd” (s-1), como aqui usado, refere-se à constante da velocidade de dissociação de uma interação especial de anticorpo-antígeno. Dito valor também é chamado de o valor de koff.
[0043] O termo “ka” (M-1 x s-1), como aqui usado, refere-se à constante de velocidade de associação de uma interação especial de anticorpoantígeno.
[0044] O termo “KD” (M), como aqui usado, refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação especial de anticorpo-antígeno.
[0045] O termo “Ka” (M-1), como aqui usado, refere-se à constante de equilíbrio de associação de uma interação especial de anticorpo-antígeno e é obtida pela divisão de ka por kd.
[0046] Como aqui usado, o termo “inibe o crescimento” (p. ex., referindo-se às células, tais como células de tumor) é intencionado para incluir qualquer decréscimo mensurável no crescimento de células quando contatadas com um anticorpo anti-c-Met em comparação com o crescimento das mesmas células não em contato com um anticorpo anti-c-Met, p. ex., a inibição do crescimento de uma cultura de células é de pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, ou 100%. Um tal decréscimo em crescimento de células pode ocorrer por uma variedade de mecanismos, p. ex., fagocitose de célula efetora, ADCC, CDC, e/ou apoptose. [0047] A presente invenção também fornece anticorpos compreendendo variantes funcionais da região VL, da região VH, ou de uma ou mais CDRs dos anticorpos dos exemplos. Uma variante funcional de uma VL, VH, ou CDR usada no contexto de um anticorpo anti-c-Met ainda permite que o anticorpo retenha pelo menos uma proporção substancial (pelo menos
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17/121 cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) da afinidade / avidez e/ou da especificidade / seletividade do anticorpo parental e em alguns casos um anticorpo anti-c-Met pode estar associado com afinidade, seletividade e/ou especificidade maior do que a do anticorpo parental.
[0048] Tais variantes funcionais tipicamente retêm identidade de sequência significativa com o anticorpo parental. A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequência (i.e., homologia % = [número de posições idênticas / número total de posições] x 100), considerando-se microorganismo número de lacunas, o comprimento de cada lacuna, que necessitam ser introduzidas para alinhamento ótimo das duas sequências. A identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos ou sequências de aminoácidos pode ser p. ex., determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4, 11-17 (1988) que tem sido incorporado no programa ALIGN (version 2.0), usando uma tabela de resíduo ponderal PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Em adição, a identidade percentual entre as duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970).
[0049] A sequência de variantes de CDR podem diferir da sequência da CDR das sequências de anticorpo parental por meio de substituições em sua maioria conservativas; por exemplo, pelo menos 10, tal como pelo menos 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 das substituições na variante são substituições conservativas de resíduo de aminoácido.
[0050] No contexto da presente invenção, substituições conservativas podem ser definidas por substituições dentro das classes de aminoácidos refletidas na seguinte tabela:
Classes de resíduos de aminoácido para substituições conservativas
Resíduos Ácidos Asp (D) e Glu (E)
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Resíduos Básicos Lys (K), Arg (R), e His (H)
Resíduos Hidrofílicos Não Carregados Ser (S), Thr (T), Asn (N), e Gln (Q)
Resíduos Alifáticos Não Carregados Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), e Ile (I)
Resíduos Não polares Não Carregados Cys (C), Met (M), e Pro (P)
Resíduos Aromáticos Phe (F), Tyr (Y), e Trp (W)
[0051] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”), como aqui usado, é intencionado para se referir a uma célula para dentro da qual um vetor de expressão tem sido introduzido, p. ex., um vetor de expressão codificador de um anticorpo da invenção. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células HEK293, células NS/0, e células linfocíticas.
[0052] O termo “animal não humano transgênico” refere-se a um animal não humano tendo um genoma compreendendo um ou mais transcromossomos ou transgenes de cadeias pesada e/ou leve de humano (quer integrados quer não integrados no DNA genômico natural do animal) e que é capaz de expressar anticorpos totalmente de humano. Por exemplo, um camundongo transgênico pode ter um transgene de cadeia leve de humano e quer um transgene de cadeia pesada de humano quer transcromossomo de cadeia pesada de humano, de tal modo que o camundongo produza anticorpos de humano anti-c-Met quando imunizado com antígeno c-Met e/ou células expressando c-Met. O transgene de cadeia pesada de humano pode ser integrado no DNA cromossômico do camundongo, como é o caso para camundongos transgênicos, tais como camundongos HCo7 ou HCo12, ou o transgene de cadeia pesada de humano pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para camundongos KM extracromossômicos como descritos em WO02/43478. Camundongos similares, tendo um repertório de genes de Ab de humano maior, incluem HCo7 e HCo20 (veja p. ex., WO2009097006). Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos (coletivamente aqui chamados de “camundongos transgênicos”) são capazes de produzir múltiplos isótipos de anticorpos monoclonais de humano para um dado antígeno (tais como IgG,
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IgA, IgM, IgD e/ou IgE) pela sujeição à recombinação V-D-J e à comutação de isótipo. Animal transgênico, de não humano também pode ser usado para produção de anticorpos contra um antígeno específico pela introdução de genes codificadores de tal anticorpo específico, por exemplo por ligação operativa dos genes em um gene que é expressado no leite do animal.
[0053] “Tratamento” refere-se à administração de uma quantidade efetiva de um composto terapeuticamente ativo da presente invenção com o propósito de facilitar, melhorar, interromper ou erradicar (curar) sintomas ou estados doentios.
[0054] Uma “quantidade efetiva” refere-se a uma quantidade efetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-c-Met pode variar de acordo com fatores tais como o estado doentio, a idade, o sexo, e o peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo anti-c-Met para produzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente efetiva também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou da porção do anticorpo são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéfico.
[0055] Um anticorpo “anti-idiotípico” é um anticorpo que reconhece determinantes singulares geralmente associados com o sítio de ligação de antígeno de um anticorpo.
Outros aspectos e outras modalidades da invenção [0056] Como descrito acima, em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal que se liga em uma c-Met de humano.
[0057] Anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser p. ex., produzidos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante. Anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fagos usando as técnicas descritas, por exemplo,
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20/121 em Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Anticorpos monoclonais podem ser obtidos de qualquer fonte adequada. Assim, por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser obtidos de hibridomas preparados de células B esplênicas murinas obtidas de camundongos imunizados com um antígeno de interesse, por exemplo na forma de células expressando o antígeno sobre a superfície, ou um ácido nucleico codificador de um antígeno de interesse. Anticorpos monoclonais também podem ser obtidos de hibridomas derivados de células expressando anticorpo de mamíferos humanos ou não humanos imunizados tais como ratos, cães, primatas, etc.
[0058] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um anticorpo de humano. Anticorpos monoclonais de humano produzidos contra c-Met podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos transportando partes do sistema imune de humano em vez de o sistema imune de camundongo. Tais camundongos transgênicos ou transcromossômicos incluem camundongos aqui chamados de camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente aqui chamados de “camundongos transgênicos”.
[0059] O camundongo HuMAb contém um minilocus de gene de imunoglobulina de humano que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia leve κ e cadeias pesadas (μ e γ) de humano não rearranjadas, juntamente com mutações selecionadas que inativam os loci de cadeias μ e κ endógenas (Lonberg, N. et al., Nature 368. 856-859 (1994)). Consequentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de camundongo em resposta à imunização, os transgenes de cadeias leve e pesada de humano introduzidos, sofrem comutação de classe e mutação somática para gerarem anticorpos monoclonais IgG,K de humano de afinidade alta (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. e Huszar, D.,
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Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) e Harding, F. e Lonberg, N. Ann. Nova Iorque. Acad. Sci. 764 536-546 (1995)). A preparação de camundongos HuMAb é descrita em detalhe em Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al. , Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Veja também US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187.
[0060] Os camundongos HCo7 têm uma disrupção JKD em seus genes de cadeia leve (kappa) endógenos (como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), uma disrupção CMD em seus genes de cadeia pesada endógenos (como descrito em Exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene de cadeia leve kappa de humano KCo5 (como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), e um transgene de cadeia pesada de humano HCo7 (como descrito em US 5,770,429).
[0061] Os camundongos HCo12 têm uma disrupção JKD em seus genes de cadeia leve (kappa) endógenos (como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), uma disrupção CMD em seus genes de cadeia pesada endógenos (como descrito em Exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene de cadeia leve kappa de humano KCo5 (como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), e um transgene de cadeia pesada de humano HCo12 (como descrito em Exemplo 2 de WO 01/14424).
[0062] Na cepa de camundongo KM, o gene de cadeia leve kappa de camundongo endógeno tem sido submetido à disrupção homozigótica como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno tem sido submetido à disrupção homozigótica como descrito em Exemplo 1 de WO 01/09187. Esta cepa de
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22/121 camundongo transporta um transgene de cadeia leve kappa de humano, KCo5, como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de camundongo também transporta um transcromossomo de cadeia pesada de humano composto de fragmento hCF de cromossomo 14 (SC20) como descrito em WO 02/43478.
[0063] Esplenócitos destes camundongos transgênicos podem ser usados para gerar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais de humano de acordo com técnicas bem conhecidas.
[0064] Ademais, anticorpos de humano da presente invenção ou anticorpos da presente invenção de outras espécies podem ser identificados por meio de tecnologia do tipo exibição, incluindo, sem limitação, exibição de fago, exibição retroviral, exibição ribossomal, e outras técnicas, usando técnicas bem conhecidas na arte e as moléculas resultantes podem ser submetidas à maturação adicional, tal como maturação de afinidade, como tais técnicas são conhecidas na arte (veja por exemplo Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (exibição de fago), Vaughan et al., Nature Biotech. 14, 309 (1996) (exibição de fago), Hanes e Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (exibição ribossomal), Parmley e Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (exibição de fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 10811085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell e McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), e US 5.733.743). Se tecnologias de exibição são utilizadas para produzir anticorpos que não são de humano, tais anticorpos podem ser humanizados.
[0065] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é de isótipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM.
[0066] Em uma primeira modalidade principal do anticorpo da invenção, o anticorpo compete para ligar em cMetECDHis solúvel com um anticorpo imobilizado, sendo que dito anticorpo imobilizado compreende uma
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23/121 região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 33 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 37 (024), preferivelmente sendo que o anticorpo compete em mais do que 50%, tal como mais do que 75% com dito anticorpo imobilizado, quando determinado como descrito em Exemplo 17.
[0067] Em mais uma modalidade, o anticorpo não compete para ligar em cMetECDHis solúvel com um anticorpo selecionado do grupo consistindo de:
a) um anticorpo imobilizado compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 5 (005)
b) um anticorpo imobilizado compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 17 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 21 (008)
c) um anticorpo imobilizado compreendendo a região VH e a região VL de anticorpo 5D5, e
d) um anticorpo imobilizado compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 49 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 53 (045), preferivelmente sendo que o anticorpo compete em menos do que 25%, tal como menos do que 20% com dito anticorpo imobilizado, quando determinado como descrito em Exemplo 17.
[0068] Em mais uma modalidade, o anticorpo liga-se no mesmo epitopo que o de um anticorpo selecionado do grupo consistindo de:
a) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 33 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 37 (024)
b) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 65 e uma região VL
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24/121 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 69 (061)
c) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 77 (062)
d) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 85 (064)
e) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 89 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 93 (068)
f) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 97 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 101 (069)
g) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 113 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 117 (098)
h) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 121 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 125 (101), e
i) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 129 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 133 (181).
[0069] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH CDR3 tendo a sequência como apresentada em
a) SEQ ID NO: 36 (024)
b) SEQ ID NO: 193, tal como uma região VH CDR3 como apresentada em SEQ ID NO: 68, 76, 84 ou 92 (061, 062, 064, 068)
c) SEQ ID NO: 196, tal como uma região VH CDR3 como apresentada em SEQ ID NO: 100 ou 132 (069, 181)
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d) SEQ ID NO: 116 (098), ou
e) SEQ ID NO: 201, tal como uma região VH CDR3 como apresentada em SEQ ID NO: 124 (101).
[0070] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende:
a) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 34, 185 e 36 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 38, 39 e 206, tal como um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 34, 35 e 36 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 38, 39 e 40, (024)
b) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 191, 192 e 193 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 78, 79 e 208, tal como um anticorpo compreendendo
a. uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 66, 67 e 68 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 70, 71 e 72 (061)
b. uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 74, 75 e 76 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 78, 79 e 80, (062)
c. uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 82, 83 e 84 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 86, 87 e 88, (064), ou
d. uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 90, 91 e 92 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 94, 95 e 96, (068)
c) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 194, 195 e 196 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 209, 210 e 104, tal como um
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26/121 anticorpo compreendendo
a. uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 98, 99 e 100 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 102, 103 e 104, (069), ou
b. uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 130, 131 e 132 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 134, 135 e 136, (181)
d) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 197, 198 e 116 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 118, 119 e 211, tal como um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 114, 115 e 116 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 118, 119 e 120 (098), ou
e) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 199, 200 e 201 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 126, 212 e 128, tal como um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 122, 123 e 124 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 126, 127 e 128 (101).
[0071 ] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende:
a) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 33 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 37 (024)
b) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 61 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 69 (061)
c) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID
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NO: 73 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 77 (062)
d) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 85 (064)
e) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 89 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 93 (068)
f) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:
e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 101 (069)
g) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 113 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 117 (098)
h) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 121 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 125 (101)
i) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:
129 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 133 (181)
j) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:
159 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 160 (078)
k) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 161 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 162 (084)
l) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:
163 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 164 (063)
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m) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 165 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 166 (087)
n) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 137 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 138 (066)
o) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 139 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 140 (065)
p) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 141 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 142 (082)
q) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 143 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 144 (089), ou
r) uma variante de qualquer um de ditos anticorpos, sendo que dita variante preferivelmente tem no máximo 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tais como substituições de aminoácido conservativas em ditas sequências.
[0072] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH compreendendo a sequência de CDR3 de SEQ ID NO: 100 e uma região VL compreendendo a sequência de CDR3 de SEQ ID NO: 104, (069).
[0073] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 98, 99 e 100 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 102, 103 e 104, (069).
[0074] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 97 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 101 (069).
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29/121 [0075] Em outra modalidade principal do anticorpo da invenção:
- o anticorpo compete para ligar em cMetECDHis solúvel com um anticorpo imobilizado, sendo que dito anticorpo imobilizado compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 9 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 13 (006), preferivelmente sendo que o anticorpo compete em mais do que 50%, tal como mais do que 75% com dito anticorpo imobilizado, quando determinado como descrito em Exemplo 17, e
- o anticorpo não compete para ligar em cMetECDHis solúvel com um anticorpo imobilizado compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 49 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 53 (045), preferivelmente sendo que o anticorpo compete menos do que 50%, p. ex., menos do que 25%, tal como menos do que 20% com dito anticorpo imobilizado, quando determinado como descrito em Exemplo 17 e
- o anticorpo liga-se no domínio SEMA de c-Met, preferivelmente sendo que o anticorpo é capaz de inibir a ligação de HGF no domínio SEMA com uma IC50 de menos do que 10 gg/mL, tal como menos do que 2 gg/mL como descrito em Exemplo 9.
[0076] Em mais uma modalidade, o anticorpo não compete para ligar em cMetECDHis solúvel com um anticorpo imobilizado compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 33 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 37 (024), preferivelmente sendo que o anticorpo compete em menos do que 25%, tal como menos do que 20% com dito anticorpo imobilizado, quando determinado como descrito em Exemplo 17.
[0077] Em mais uma modalidade, o anticorpo liga-se no mesmo epitopo que o de um anticorpo selecionado do grupo consistindo de:
a) um anticorpo compreendendo uma região VH
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30/121 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 5 (005)
b) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 9 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 13 (006)
c) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 25 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 29 (022), e
d) um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 57 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 61 (058).
[0078] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH CDR3 tendo a sequência como apresentada em
a) SEQ ID NO: 181, tal como uma região VH CDR3 como apresentada em SEQ ID NO: 4 ou 12 (005, 006)
b) SEQ ID NO: 28 (022), ou
c) SEQ ID NO: 60 (058).
[0079] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende:
a) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 179, 180 e 181 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 6, 7 e 202, tal como um anticorpo compreendendo
a. uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 2, 3 e 4 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 6, 7 e 8, (005), ou
b. uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 10, 11 e 12 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 14, 15 e 16, (006)
b) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e
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31/121 de SEQ ID NO: 26, 184 e 28 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 30, 31 e 205, tal como um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 26, 27 e 28 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 30, 31 e 32 (022), ou
c) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 189, 190 e 60 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 62, 63 e 207, tal como um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 58, 59 e 60 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 62, 63 e 64 (058) [0080] Em ainda mais uma modalidade, o anticorpo compreende:
a) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 5 (005)
b) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 9 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 13 (006)
c) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 25 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 29 (022)
d) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 57 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 61 (058)
e) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 145 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 146 (031)
f) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:
147 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ
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ID NO: 148 (007)
g) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 149 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 150 (011)
h) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 151 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 152 (017)
i) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 153 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 154 (025), ou
j) uma variante de qualquer um de ditos anticorpos, sendo que dita variante preferivelmente tem no máximo 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tais como substituições de aminoácido conservativas em ditas sequências.
[0081] Em outra modalidade principal do anticorpo da invenção:
- o anticorpo compete para ligar em cMetECDHis solúvel com um anticorpo imobilizado, sendo que dito anticorpo imobilizado compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 49 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 53 (045), preferivelmente sendo que o anticorpo compete em mais do que 50%, tal como mais do que 75% com dito anticorpo imobilizado, quando determinado como descrito em Exemplo 17, e
- o anticorpo não compete para ligar em cMetECDHis solúvel com um anticorpo imobilizado, sendo que dito anticorpo imobilizado compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 9 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 13 (006), preferivelmente sendo que o anticorpo compete em menos do que 25%, tal como menos do que 20% com dito anticorpo imobilizado, quando determinado como descrito em Exemplo 17.
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33/121 [0082] Em mais uma modalidade, o anticorpo não compete para ligar em cMetECDHis solúvel com um anticorpo selecionado do grupo consistindo de:
a) um anticorpo imobilizado compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 17 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 21 (008), e
b) um anticorpo imobilizado compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 33 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 37 (024), preferivelmente sendo que o anticorpo compete em menos do que 25%, tal como menos do que 20% com dito anticorpo imobilizado, quando determinado como descrito em Exemplo 17.
[0083] Em mais uma modalidade, o anticorpo liga-se no mesmo epitopo que o de um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 49 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 53 (045).
[0084] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH CDR3 tendo a sequência como apresentada em SEQ ID NO: 188, tal como uma região VH CDR3 como apresentada em SEQ ID NO: 52 (045).
[0085] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 186, 187 e 188 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 54, 55 e 56, tal como um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 50, 51 e 52 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 54, 55 e 56 (045).
[0086] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende:
a) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 49 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de
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SEQ ID NO: 53 (045)
b) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 155 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 156 (040)
c) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 157 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 158 (039), ou
d) uma variante de qualquer um de ditos anticorpos, sendo que dita variante preferivelmente tem no máximo 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tais como substituições de aminoácido conservativas em ditas sequências.
[0087] Em mais uma modalidade, o anticorpo liga-se no domínio SEMA de c-Met, preferivelmente sendo que o anticorpo é capaz de inibir a ligação de HGF no domínio SEMA com uma IC50 de menos do que 10 pg/mL, tal como menos do que 2 pg/mL como descrito em Exemplo 9.
[0088] Em outra modalidade principal do anticorpo da invenção, o anticorpo liga-se no mesmo epitopo que o de um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 17 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 21 (008) ou liga-se no mesmo epitopo que o de um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 41 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 45 (035) ou liga-se no mesmo epitopo que o de um anticorpo compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 105 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 109 (096).
[0089] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH CDR3 tendo a sequência como apresentada em SEQ ID NO: 183, tal como uma região VH CDR3 como apresentada em SEQ ID NO: 20, 44 ou 108 (008, 035, 096).
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35/121 [0090] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 18, 182 e 183 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 22, 203 e 204, tal como um anticorpo compreendendo
a) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 18, 19 e 20 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 22, 23 e 24, (008), ou
b) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 42, 43 e 44 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 46, 47 e 48, (035), ou
c) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 106, 107 e 108 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 110, 111 e 112 (096).
[0091] Em mais uma modalidade, o anticorpo compreende:
a) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 17 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 21 (008)
b) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 41 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 45 (035)
c) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 105 e, preferivelmente, uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 109 (096) ou
d) uma variante de qualquer um de ditos anticorpos, sendo que dita variante preferivelmente tem no máximo 1 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tais como substituições de aminoácido conservativas em ditas sequências.
[0092] Em mais uma modalidade, o anticorpo liga-se em células A431 com uma EC50 de 10 nM ou menos, tal como uma EC50 de 2 nM ou
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36/121 menos, preferivelmente como determinada de acordo com Exemplo 13.
[0093] Em ainda mais uma modalidade, o anticorpo liga-se em c-Met com uma constante de afinidade (Kd) de 20 nM ou menos, tal como uma afinidade de 5 nM ou menos, preferivelmente como determinada de acordo com Exemplo 14.
[0094] Em ainda mais uma modalidade, o anticorpo liga-se em c-Met de Rhesus, preferivelmente sendo que o sinal de ligação de anticorpo em cMet de Rhesus é pelo menos 5 vezes aquele de um anticorpo de controle negativo, como determinado de acordo com Exemplo 15.
[0095] Em ainda mais uma modalidade, o anticorpo inibe a ligação de HGF no domínio extracelular de c-Met, preferivelmente sendo que o anticorpo inibe a ligação em mais do que 40%, tal como mais do que 50%, p. ex., mais do que 60%, p. ex., mais do que 70%, p. ex., mais do que 80%, p. ex., mais do que 90%, como determinada de acordo com Exemplo 16.
[0096] Em ainda uma modalidade adicional, o anticorpo é capaz de inibir a viabilidade de células KP4, preferivelmente sendo que o anticorpo é capaz de inibir a viabilidade em mais do que 10%, tal como mais do que 25%, p. ex., mais do que 40%, preferivelmente como descrito em Exemplo 19.
Formatos de anticorpo [0097] A presente invenção fornece anticorpos antagonísticos e não antagonísticos anti-c-Met. Embora alguns anticorpos atuem antagonisticamente sobre células alvo independente de se são monovalentes ou bivalentes, para outros anticorpos, o efeito funcional depende da valência. Como mostrado aqui em Exemplo 19, anticorpos 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181, por exemplo, (que estão todos dentro do mesmo grupo de bloqueio cruzado veja Exemplo 17) têm propriedades antagonísticas em um ensaio de viabilidade de KP4 independente do formato. Anticorpos 022 e 058, por outro lado, comportam-se antagonisticamente neste ensaio em um formato monovalente, mas agonisticamente (ou pelo menos não antagonisticamente)
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37/121 em um formato bivalente. Assim, dependendo das propriedades funcionais para um uso especial, anticorpos especiais podem ser selecionados do conjunto de anticorpos fornecidos na presente invenção e/ou seu formato pode ser adaptado à mudança de valência.
[0098] Ademais, o anticorpo da invenção pode ser de qualquer isótipo. A escolha de isótipo tipicamente será direcionada pelas funções efetoras desejadas, tal como indução de ADCC. Isótopos exemplares são IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Podem ser usadas quaisquer regiões constantes de cadeia leve de humano, kappa ou lambda. Se desejado, a classe de um anticorpo anti-c-Met da presente invenção pode ser comutada por métodos conhecidos. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção que era originalmente IgM pode ter a classe comutada para um anticorpo IgG da presente invenção. Ademais, técnicas de comutação de classe podem ser usadas para converter uma subclasse IgG em outra, por exemplo de IgG1 para IgG2. Assim, a função efetora dos anticorpos da presente invenção pode ser modificada pela comutação de isótipo para, p. ex., um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM para vários usos terapêuticos. Em uma modalidade um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG1, por exemplo um IgG1,K.
[0099] Inframodulação de c-Met induzida por anticorpos antagonísticos representa um mecanismo de ação de anticorpos anti-c-Met terapêuticos. Consequentemente, em um aspecto da invenção anticorpos com propriedades agonísticas reduzidas, mas com capacidade retida para induzir inframodulação de c-Met são desejáveis.
[00100] Tem sido revelado que pela redução da flexibilidade conformacional dos anticorpos as atividades agonísticas residuais potenciais dos anticorpos IgG1 bivalentes são minimizadas.
[00101] Consequentemente, em mais uma modalidade, o anticorpo da invenção tem sido modificado para se tornar mais flexível, tal como por
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38/121 mutações da região de articulação.
[00102] As mudanças conformacionais maiores são o resultado da flexibilidade da articulação, que permite uma ampla variedade de ângulos de Fab-Fc (Ollmann Saphire, E., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton e I.A. Wilson. 2002. “Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility”. J. Mol. Biol. 319: 9- 18). Uma maneira para reduzir a flexibilidade do braço Fab em imunoglobulinas é prevenir a formação de ligações de dissulfeto entre a cadeia leve e a cadeia pesada por meio de modificação genética. Em um anticorpo IgG1 natural a cadeia leve é conectada covalentemente na cadeia pesada via uma ligação de dissulfeto, conectando a cisteína C-terminal da cadeia leve na cisteína em posição 220 (numeração EU C220) na articulação do Fc da cadeia pesada. Quer por mutação do aminoácido C220 para serina ou outro aminoácido natural, quer por remoção de C220, pela remoção de articulação completa, quer por substituição da articulação de IgG1 por uma articulação de IgG3, é formada uma molécula na qual as cadeias leves são conectadas via suas cisteínas C-terminais, análoga à situação encontrada no isótipo de humano IgA2m(1). Isto resulta em uma flexibilidade reduzida dos Fabs em relação ao Fc e consequentemente em capacidade de ligação cruzada reduzida, como mostrado nos Exemplos.
[00103] Outra estratégia para reduzir a flexibilidade de uma molécula de IgG1 é substituir a articulação de IgG1 pela articulação de IgG2 ou pela articulação de semelhante de IgG2. (Dangl et al. EMBO J. 1988;7:1989-94). Esta região de articulação tem duas propriedades distintas daquela de IgG1, que são consideradas em tornarem as moléculas menos flexíveis. Primeiro, comparada com a articulação de IgG1 a articulação de IgG2 é 3 aminoácidos mais curta. Secundo, a articulação de IgG2 contém uma cisteína adicional, assim serão formadas três em vez de duas pontes de dissulfeto intercadeias pesadas. Alternativamente, uma variante da articulação de IgG1 que se parece
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39/121 com a articulação de IgG2 pode ser introduzida. Este mutante (ΤΗ7Δ6-9) (WO2010063746) contém mutação T223C e duas deleções (K222 e T225) com o propósito de criar uma articulação mais curta com uma cisteína adicional.
[00104] Em mais uma modalidade, o anticorpo da invenção é do subtipo IgG1, no qual a articulação tem sido modificada por:
(i) deleção da região de articulação da sequência EPKSCDKTHTCPPCP e sua substituição pela região de articulação de IgG2 da sequência: ERKCCVECPPCP (IgG1-IgG2);
(ii) deleção da posição 220 de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 ΔC220);
(iii) substituição da cisteína em posição 220 por qualquer outro aminoácido natural (X) de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSXDKTHTCPPCP (IgG1 C220X);
(iv) deleção da região de articulação de sequência
EPKSCDKTHTCPPCP (UniBody IgG1);
(v) deleção da região de articulação da sequência
EPKSCDKTHTCPPCP e sua substituição pela região de articulação de IgG3 da sequência
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPK SCDTPPPCPRCP (IgG1 articulação-IgG3'); ou (vi) substituição de treonina em posição 223 por cisteína, e deleção de lisina em posição 222 e treonina em posição 225, de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSCDCHCPPCP (IgG1 ΤΗ7Δ6-9).
[00105] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo da invenção é do subtipo IgG1, no qual a região de articulação tem sido modificada por deleção da posição 220 de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 ΔC220) ou por substituição da cisteína em
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40/121 posição 220 por qualquer outro aminoácido natural (X) de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSXDKTHTCPPCP (IgG1 C220X);
[00106] Em mais uma modalidade, o anticorpo da invenção é do subtipo IgG1, no qual a região de articulação tem sido modificada por substituição da cisteína em posição 220 por serina de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S). Em mais uma modalidade, o anticorpo da invenção é de subtipo IgG2.
[00107] Em mais uma modalidade, o anticorpo da invenção está glicoengenhado para reduzir fucose e assim intensificar ADCC, p. ex., pela adição de compostos no meio de cultura durante a produção de anticorpo como descrito em US2009317869 ou como descrito em van Berkel et al. (2010) Biotechnol. Bioeng. 105:350 ou pelo uso de células inativadas FUT8, p. ex., como descrito em Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614. ADCC pode ser alternativamente otimizada usando o método descrito por Umana et al. (1999) Nature Biotech. 17:176.
[00108] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH compreendendo a sequência de CDR3 de SEQ ID NO: 100 e uma região VL compreendendo a sequência de CDR3 de SEQ ID NO: 104 (069) do subtipo IgG1, no qual a região de articulação tem sido modificada por substituição da cisteína em posição 220 por serina de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).
[00109] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 98, 99 e 100 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 102, 103 e 104 (069) do subtipo IgG1, no qual a região de articulação tem sido modificada por substituição da cisteína em posição 220 por serina de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).
[00110] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região VH
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41/121 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 97 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 101 (069) do subtipo IgG1, no qual a região de articulação tem sido modificada por substituição da cisteína em posição 220 por serina de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).
[00111] Várias publicações têm demonstrado a correlação entre fucosilação em núcleo e atividade de ADCC intensificada in vitro (Shields RL. 2002 JBC; 277:26733-26740, Shinkawa T. 2003 JBC; 278(5):3466-3473, Umana P. Nat. Biotechnol. 1999 Feb;17(2):176- 80).
[00112] Em mais uma modalidade, o anticorpo da invenção tem estado modificado para reduzir a fucosilação em núcleo abaixo de 10%, tal como abaixo de 5% como determinada com cromatografia de troca aniônica de desempenho alto acoplada com detecção amperométrica pulsada (HPAECPAD). Isto pode ser realizado por métodos bem conhecidos na arte anterior, p. ex., tratamento com kifunensina ou produção em células negativas FUT8.
[00113] Em mais uma modalidade, o anticorpo da invenção tem estado engenhado para intensificar ativação de complemento, p. ex., como descrito em Natsume et al. (2009) Cancer Sci. 100:2411.
[00114] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um anticorpo de comprimento total, preferivelmente um anticorpo IgG1, em especial um anticorpo IgG1,K. Em outra modalidade, o anticorpo da invenção é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
[00115] Fragmentos de anticorpo podem ser p. ex., obtidos por fragmentação usando técnicas convencionais, e os fragmentos selecionados para utilidade na mesma maneira como aqui descrita para os anticorpos inteiros. Por exemplo, fragmentos F(ab'b podem ser gerados pelo tratamento do anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab’)2 resultante pode ser tratado para reduzir as pontes de dissulfeto para produzir fragmentos Fab’. Os fragmentos Fab podem ser obtidos pelo tratamento de um anticorpo IgG com
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42/121 papaína; fragmentos Fab' podem ser obtidos com digestão com pepsina do anticorpo IgG. Um fragmento F(ab') também pode ser produzido por ligação de Fab' descrito abaixo via uma ligação tio-éter ou uma ligação dissulfeto. Um fragmento Fab' é um fragmento de anticorpo obtido pelo corte de uma ligação dissulfeto da região de articulação do F(ab')2. Um fragmento Fab' pode ser obtido pelo tratamento de um fragmento F(ab')2 com um agente redutor, tal como ditiotreitol. Fragmento de anticorpo também pode ser gerado pela expressão de ácidos nucleicos codificadores de tais fragmentos em células recombinantes (veja por exemplo Evans et al., J. Immunol. Meth. 184. 123-38 (1995)). Por exemplo, um gene quimérico codificador de uma porção de fragmento F(ab')2 poderia incluir sequências de DNA codificadoras do domínio CH1 e da região de articulação da cadeia H, seguidas por um códon de terminação de tradução para dar uma tal molécula de fragmento de anticorpo truncada.
[00116] Como explanado acima, em uma modalidade, o anticorpo antic-Met da invenção é um anticorpo bivalente.
[00117] Em outra modalidade, o anticorpo anti-c-Met da invenção é um anticorpo monovalente.
[00118] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um fragmento Fab ou um anticorpo de um braço, tal como descrito em US20080063641 (Genentech) ou outro anticorpo monovalente, p. ex., tal como descrito em WO2007048037 (Amgen).
[00119] Em uma modalidade preferida, um anticorpo monovalente tem uma estrutura como descrita em WO2007059782 (Genmab) (aqui incorporada como referência) tendo uma deleção da região de articulação. Consequentemente, em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo monovalente, sendo que dito anticorpo anti-c-Met é construído por um método compreendendo:
i) obter um construto de ácido nucleico codificador da cadeia
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43/121 leve de dito anticorpo monovalente, dito construto compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificadora da região VL de um anticorpo específico para antígeno selecionado anti-c-Met e uma sequência de nucleotídeos codificadora da região CL constante de uma Ig, sendo que dita sequência de nucleotídeos codificadora da região VL de um anticorpo específico para antígeno selecionado e dita sequência de nucleotídeos codificadora da região CL de uma Ig estão operativamente ligadas juntas, e sendo que, no caso de um subtipo de IgG1, a sequência de nucleotídeos codificadora da região CL tem sido modificada de tal modo que a região CL não contém nenhuns aminoácidos capazes de formar ligações dissulfeto ou ligações covalentes com outros peptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos idênticos da região de CL na presença de IgG policlonal de humano ou quando administrado a um animal ou ser humano;
ii) obter um construto de ácido nucleico codificador da cadeia pesada de dito anticorpo monovalente, dito construto compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificadora da região VH de um anticorpo específico para antígeno selecionado e uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma região CH constante de uma Ig de humano, sendo que a sequência de nucleotídeos codificadora da região CH tem sido modificada de tal modo que a região correspondendo à região de articulação e, como exigidas pelo subtipo Ig, outras regiões da região CH, tal como a região CH3, não compreenda nenhuns resíduos de aminoácido que participam na formação de ligações dissulfeto ou ligações covalentes ou não covalentes estáveis de intercadeias pesadas com outros peptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica da região CH da Ig de humano na presença de IgG policlonal de humano ou quando administrado a um animal ou ser humano, sendo que dita sequência de nucleotídeos codificadora da região VH de um anticorpo específico para antígeno selecionado e dita sequência de nucleotídeos codificadora da região CH de dita Ig estão operativamente
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44/121 ligadas juntas;
iii) obter um sistema de expressão em célula para produzir dito anticorpo monovalente;
iv) produzir dito anticorpo monovalente pela coexpressão dos construtos de ácido nucleico de (i) e (ii) em células do sistema de expressão em célula de (iii).
[00120] Similarmente, em uma modalidade, o anticorpo anti-c-Met é um anticorpo monovalente, que compreende (i) uma região variável de um anticorpo da invenção como aqui descrito ou uma parte de ligação em antígeno da dita região, e (ii) uma região CH de uma imunoglobulina ou um seu fragmento compreendendo as regiões Ch2 e Ch3, sendo que a região Ch ou seu fragmento tem sido modificada de tal modo que a região correspondendo à região de articulação e, se a imunoglobulina não for um subtipo IgG4, outras regiões da região CH, tal como a região CH3, não compreendem nenhuns resíduos de aminoácido, que são capazes de formar ligações dissulfeto com uma região CH idêntica ou outras ligações covalentes ou não covalentes estáveis intercadeias pesadas com uma região CH idêntica na presença de IgG policlonal de humano.
[00121] Em mais uma sua modalidade, a cadeia pesada do anticorpo monovalente anti-c-Met tem sido modificada de tal modo que a articulação inteira tem estado deletada.
[00122] Em outra modalidade adicional, dito anticorpo monoclonal é do subtipo IgG4, mas a região CH3 tem sido modificada de modo que uma ou mais das seguintes substituições de aminoácido têm sido feitas:
_____________________Numeração de mutações CH3
KABAT* Índice EU G4* Mutações
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E378 E357 E357A ou E357T ou E357V ou E357I
S387 S364 S364R ou S364K
T389 T366 T366A ou T366R ou T366K ou T366N
L391 L368 L368A ou L368V ou L368E ou L368G ou L368S ou L368T
D427 D399 D399A ou D399T ou D399S F405A ou F405L ou F405T ou F405D ou F405R ou F405Q
F436 F405 ou F405K ou F405Y
Y438 Y407 Y407A ou Y407E ou Y407Q ou Y407K ou Y407F
F436 e Y438 F405 e Y407 (F405T e Y407E) ou (F405D e Y407E)
D427 e Y438 D399 e Y407 (D399S e Y407Q) ou (D399S e Y407K) ou
(D399S e Y407E) *KABAT indica numeração de aminoácido de acordo com Kabat (Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Índice EU indica numeração de aminoácido de acordo com índice EU como resumido em Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
[00123] Em outra modalidade adicional, a sequência de dito anticorpo monovalente tem sido modificada de modo que não compreenda nenhuns sítios aceptores para glicosilação N-ligada.
[00124] Anticorpos anti-c-Met da invenção também incluem anticorpos de cadeia única. Anticorpos de cadeia única são peptídeos nos quais as regiões Fv de cadeias pesada e leve estão conectadas. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um Fv de cadeia única (Fv, scFv) sendo que as cadeias pesada e leve no Fv de um anticorpo anti-c-Met da presente invenção estão unidas com um ligador peptídeo flexível (tipicamente de cerca de 10, 12, 15 ou mais resíduos de aminoácido) em uma cadeia de peptídeo única. Métodos de produzir tais anticorpos são descritos em por exemplo US 4.946.778, Pluckthun em “The Pharmacology of Monclonal Antibodies”, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al.,
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PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) e McCafferty et al., Nature 348. 552-554 (1990). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas uma única Vh e Vl são usadas, bivalente, se duas Vh e Vl são usadas, ou polivalente, se mais do que duas VH e VL são usadas.
[00125] Em uma modalidade, o anticorpo anti-c-Met da invenção é um anticorpo deficiente em função efetora. Em uma modalidade, o anticorpo antic-Met deficiente em função efetora é um anticorpo IgG4 estabilizado, que tem sido modificado para prevenir a troca do braço Fab (van der Neut Kolfschoten et al. (2007) Science 317(5844):1554-7). Exemplos de anticorpos IgG4 estabilizados adequados são anticorpos, nos quais arginina na posição 409 em uma região constante de cadeia pesada de IgG4 de humano, que é indicada no índice EU como em Kabat et al., está substituída por lisina, treonina, metionina, ou leucina, preferivelmente lisina (descrito em WO2006033386 (Kirin)) e/ou no qual a região de articulação tem sido modificada para compreender uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys.
[00126] Em mais uma modalidade, o anticorpo IgG4 anti-c-Met estabilizado é um anticorpo IgG4 compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, no qual dita cadeia pesada compreende uma região constante de IgG4 de humano tendo um resíduo selecionado do grupo consistindo de: Lys, Ala, Thr, Met e Leu na posição correspondendo a 409 e/ou um resíduo selecionado do grupo consistindo de: Ala, Val, Gly, Ile e Leu na posição correspondendo a 405, e sendo que dito anticorpo opcionalmente compreende uma ou mais substituições, deleções e/ou inserções adicionais, mas não compreende uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys na região de articulação. Preferivelmente, dito anticorpo compreende um resíduo Lys ou Ala na posição correspondendo a 409 ou a região CH3 do anticorpo tem sido substituída pela região CH3 de IgG1 de humano, de IgG2 de humano ou de IgG3 de humano. Veja também WO2008145142 (Genmab).
[00127] Em ainda mais uma modalidade, o anticorpo IgG4 anti-c-Met
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47/121 estabilizado é um anticorpo IgG4 compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, no qual dita cadeia pesada compreende uma região constante de IgG4 de humano tendo um resíduo selecionado do grupo consistindo de: Lys, Ala, Thr, Met e Leu na posição correspondendo a 409 e/ou um resíduo selecionado do grupo consistindo de: Ala, Val, Gly, Ile e Leu na posição correspondendo a 405, e sendo que dito anticorpo opcionalmente compreende uma ou mais substituições, deleções e/ou inserções adicionais e sendo que dito anticorpo compreende uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys na região de articulação. Preferivelmente, dito anticorpo compreende um resíduo Lys ou Ala na posição correspondendo a 409 ou a região CH3 do anticorpo tem sido substituída pela região CH3 de IgG1 de humano, de IgG2 de humano ou de IgG3 de humano.
[00128] Em mais uma modalidade, o anticorpo anti-c-Met deficiente em função efetora é um anticorpo de um tipo não-IgG4, p. ex., IgG1, IgG2 ou IgG3 que tem sido mutado de tal modo que a capacidade para mediar funções efetoras, tal como ADCC, tem sido reduzida ou mesmo eliminada. Tais mutações têm sido descritas p. ex., em Dall'Acqua WF et al., J. Immunol. 177(2):1129-1138 (2006) e Hezareh M, J. Virol.; 75(24): 12161-12168 (2001).
Conjugados [00129] Em mais uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo anti-c-Met conjugado com um grupo terapêutico, tal como uma citotoxina, uma droga quimioterapêutica, um agente imunossupressor, ou um radioisótopo. Tais conjugados são aqui chamados de “imunoconjugados”. Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são chamados de “imunotoxinas”.
[00130] Uma citotoxina ou um agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial (p. ex., extermina) células. Agentes terapêuticos adequados para formar imunoconjugados da presente invenção incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina,
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48/121 etoposide, tenoposide, vincristina, vimblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, di-hidróxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidro-testosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina, antimetabólitos (tais como metotrexato, 6-mercapto-purina, 6-tio-guanina, citarabina, fludarabina, 5-fluoro-uracila, decarbazina, hidróxi-ureia, asparaginase, gencitabina, cladribina), agentes alquilantes (tais como mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tal como carboplatina), antibióticos (tais como dactinomicina (outrora actinomicina), bleomicina, daunorubicina (outrora daunomicina), doxorubicina, idarubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), toxina da difteria e moléculas relacionadas (tais como cadeia A de difteria e seus fragmentos ativos e moléculas híbridas), toxina ricina (tal como ricina A ou uma toxina de cadeia A de ricina desglicosilada), toxina do cólera, uma toxina Shigasemelhante (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina de pertussis, toxina do tétano, inibidor de Bowman-Birk protease de soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modeccina, gelanina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas dianthin, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, toxinas gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, e enomicina. Outras moléculas conjugadas adequadas incluem ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina-A estafilococal, proteína antiviral de erva-dos-cancros, toxina diterina, e endotoxina de Pseudomonas. Veja, por exemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) e Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Agentes terapêuticos, que podem ser administrados em combinação com um anticorpo anti-c-Met da
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49/121 presente invenção como descrito aqui alhures, também podem ser candidatos para grupos terapêuticos úteis para conjugação em um anticorpo da presente invenção.
[00131] Em outra modalidade, um anticorpo anti-c-Met da invenção compreende um ácido nucleico conjugado ou uma molécula associada a ácido nucleico conjugada. Em uma tal faceta da presente invenção, o ácido nucleico conjugado é uma ribonuclease citotóxica, um ácido nucleico antissenso, uma molécula de RNA inibitória (p. ex., uma molécula de siRNA) ou um ácido nucleico imunoestimulante (p. ex., uma molécula de DNA contendo o motivo CpG imunoestimulante). Em outra modalidade, um anticorpo anti-c-Met da invenção está conjugado com um aptâmero ou uma ribozima.
[00132] Em uma modalidade, são obtidos anticorpos anti-c-Met compreendendo um ou mais aminoácidos radiomarcados. Um anticorpo antic-Met radiomarcado pode ser usado para ambos os propósitos diagnóstico e terapêutico (conjugação em moléculas radiomarcadas é outra característica possível). Exemplos não limitantes de marcadores para polipeptídeos incluem 3h 14c 15n 35S 90y 99m„ _ 125t 131t „ I86q„ , , , , , c, e , , e e.
[00133] Anticorpos anti-c-Met também podem ser quimicamente modificados por conjugação covalente em um polímero por exemplo para aumentar sua meia-vida de circulação. Polímeros exemplares, e métodos para ligá-los em peptídeos, são ilustrados por exemplo em US 4.766.106, US 4.179.337, US 4.495.285 e US 4.609.546. Polímeros adicionais incluem poliois polioxietilados e poli(etileno-glicol) (PEG) (p. ex., um PEG com um peso molecular de entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000, tal como entre cerca de 2.000 e cerca de 20.000).
[00134] Qualquer método conhecido na arte para conjugar o anticorpo anti-c-Met em molécula(s) conjugada(s), tais como aquelas descritas acima, pode ser utilizado, incluindo os métodos descritos por Hunter et al., Nature 144. 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J.
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Immunol. Meth. 40, 219 (1981) e Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Tais anticorpos podem ser produzidos por conjugação química de outro grupo no lado N-terminal ou no lado C-terminal do anticorpo anti-c-Met ou seu fragmento (p. ex., uma cadeia H ou L de anticorpo anti-c-Met) (veja, p. ex., “Antibody Engineering Handbook”, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Tais derivados de anticorpo conjugado também podem ser gerados em açúcares ou resíduos internos, se apropriado. Os agentes podem ser copulados quer direta quer indiretamente em um anticorpo anti-c-Met da presente invenção. Um exemplo de copulação indireta de um segundo agente é copulação por um grupo espaçador. Em uma modalidade, o anticorpo anti-c-Met da presente invenção é ligado em um ligador quelante, p. ex., tiuxetan, que permite que o anticorpo seja conjugado em um radioisótopo.
Anticorpos biespecíficos [00135] Em mais um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica compreendendo um primeiro sítio de ligação em antígeno de um anticorpo anti-c-Met da invenção como descrito aqui acima e um segundo sítio de ligação em antígeno com uma especificidade de ligação diferente, tal como uma especificidade de ligação para uma célula efetora de humano, um receptor Fc de humano, um receptor de célula T, um receptor de célula B ou uma especificidade de ligação para um epitopo não sobreposto de c-Met, i.e. um anticorpo biespecífico no qual os primeiro e segundo sítios de ligação em antígeno não competem pela ligação em c-Met, p. ex., quando testado como descrito em Exemplo 17.
[00136] Moléculas de anticorpo biespecífico exemplares da invenção compreendem (i) dois anticorpos, que estão conjugados juntos, um com uma especificidade para c-Met e outro para um segundo alvo, (ii) um anticorpo único que tem uma cadeia ou um braço
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51/121 específica(o) para c-Met e uma segunda cadeia ou um segundo braço específica(o) para uma segunda molécula, e (iii) um anticorpo de cadeia única que tem especificidade para c-Met e uma segunda molécula. Em uma modalidade, a segunda molécula é um antígeno associado a tumor / antígeno de câncer tal como antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno específico de próstata (PSA), RAGE (antígeno renal), α-fetoproteína, CAMEL (antígeno reconhecido por CTL sobre melanoma), antígenos CT (tais como MAGE-B5, -B6, -C2, -C3, e D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE, e SAGE), antígenos de mucina (p. ex., MUC1, mucina-CA125, etc.), antígenos de gangliosídeo, tirosinase, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7, Ep-CAM ou uma integrina associada ao câncer, tal como integrina α5β3. Em outra modalidade, a segunda molécula é um fator angiogênico ou outro fator de crescimento de câncer, tal como um fator de crescimento endotelial vascular, um fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento epidermal, angiogenina ou um receptor de qualquer um destes, especialmente receptores associados com progressão de câncer (por exemplo um dos receptores HER1-HER4). Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico da presente invenção é um diacorpo.
Sequências de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras [00137] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se às sequências de ácido nucleico, tais como sequências de DNA, codificadoras de cadeias pesada e leve de um anticorpo da invenção.
[00138] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 e 178.
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52/121 [00139] Em outra modalidade especial, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos de VH selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157,
159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177.
[00140] Em outra modalidade especial, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos de VL selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158,
160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 e 178.
[00141] Em mais um aspecto adicional, a invenção refere-se a um vetor de expressão, ou um conjunto de vetores de expressão, codificador de um anticorpo da invenção. As cadeias pesada e leve do anticorpo podem ser codificadas pelo mesmo vetor ou por vetor diferente.
[00142] Tais vetores de expressão podem ser usados para produção recombinante de anticorpos da invenção.
[00143] Em uma modalidade, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma ou mais das sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 e 178.
[00144] Em outra modalidade especial, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma ou mais das sequências de aminoácidos de VH selecionadas do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163,
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165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177.
[00145] Em outra modalidade especial, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos codificadora uma ou mais das sequências de aminoácidos de VL selecionadas do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 e 178.
[00146] Em mais uma modalidade, o vetor de expressão adicionalmente compreende uma sequência de nucleotídeos codificadora da região constante de uma cadeia leve, de uma cadeia pesada ou de ambas cadeias leve e pesada de um anticorpo, p. ex., um anticorpo de humano.
[00147] Um vetor de expressão no contexto da presente invenção pode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores cromossômicos, não cromossômicos, e de ácido nucleico sintético (uma sequência de ácido nucleico compreendendo um conjunto adequado de elementos de controle de expressão). Exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40, plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, e vetores de ácido nucleico viral (RNA ou DNA). Em uma modalidade, um ácido nucleico codificador de anticorpo anti-c-Met é compreendido de um vetor de DNA ou de RNA nu, incluindo, por exemplo, um elemento de expressão linear (como descrito em por exemplo Sykes e Johnston, Nat. Biotech. 17, 355-59 (1997)), um vetor de ácido nucleico compactado (como descrito em por exemplo US 6.077.835 e/ou WO 00/70087), um vetor plasmídeo tal como pBR322, pUC 19/18, ou pUC118/119, um vetor de ácido nucleico minimamente “midge” (como descrito em por exemplo Schakowski et al., Mol. Ther. 3, 793-800 (2001)), ou como um construto de vetor de ácido nucleico precipitado, tal como um construto precipitado por CaPO4- (como descrito em por exemplo WO 00/46147, Benvenisty e Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler
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54/121 et al., Cell 14, 725 (1978), e Coraro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Tais vetores de ácido nucleico e o seu uso são bem conhecidos na arte (veja por exemplo US 5.589.466 e US 5.973.972).
[00148] Em uma modalidade, o vetor é adequado para expressão do anticorpo anti-c-Met em uma célula bacteriana. Exemplos de tais vetores incluem vetores de expressão tais como vetores BlueScript (Stratagene), pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264. 5503-5509 (1989), vetores pET (Novagen, Madison WI) e semelhantes).
[00149] Um vetor de expressão também pode ou alternativamente ser um vetor adequado para expressão em um sistema de levedura. Qualquer vetor adequado para expressão em um sistema de levedura pode ser utilizado. Vetores apropriados incluem, por exemplo, vetores compreendendo promotores constitutivos ou induzíveis tais como fator alfa, álcool-oxidase e PGH (revisto em: F. Ausubel et al., ed. “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing e Wiley InterScience Nova Iorque (1987), e Grant et al., Methods in Enzymol. 153. 516-544 (1987)).
[00150] Um vetor de expressão também pode ou alternativamente ser um vetor adequado para expressão em células de mamífero, p. ex., um vetor compreendendo glutamina-sintetase como um marcador selecionável, tal como os vetores descritos em (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175).
[00151] Um ácido nucleico e/ou vetor também pode compreender uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma sequência de secreção / localização, que pode selecionar um polipeptídeo, tal como uma cadeia de polipeptídeo nascente, no espaço periplásmico ou para dentro do meio de cultura de células. Tais sequências são conhecidas na arte, e incluem peptídeos de sinal ou líderes de expressão.
[00152] Em um vetor de expressão da invenção, ácidos nucleicos codificadores de anticorpo anti-c-Met podem compreender ou estar associados com qualquer promotor, intensificador ou outros elementos
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55/121 facilitadores de expressão adequados. Exemplos de tais elementos incluem promotores fortes (p. ex., intensificador / promotor de CMV IE de humano bem como promotores RSV, SV40, SL3-3, MMTV, e HIV LTR), sequências de terminação poli (A) efetivas, uma origem de replicação para produto de plasmídeo em E. coli, um gene de resistência a antibiótico como marcador selecionável, e/ou um sítio de clonagem conveniente (p. ex., um poliligador). Ácidos nucleicos também podem compreender um promotor induzível contrariamente a um promotor constitutivo tal como CMV IE.
[00153] Em uma modalidade, o vetor de expressão codificador de anticorpo anti-c-Met pode estar posicionado em e/ou ser liberado para a célula hospedeira ou animal hospedeiro via um vetor viral.
[00154] Em mais um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica recombinante, tal como um transfectoma, que produz um anticorpo da invenção como aqui definido. Exemplos de células hospedeiras incluem células de levedura, bacterianas, e de mamífero, tais como células CHO ou HEK. Por exemplo, em uma modalidade, a presente invenção fornece uma célula compreendendo um ácido nucleico estavelmente integrado no genoma celular que compreende uma sequência codificadora para expressão de um anticorpo anti-c-Met da presente invenção. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma célula compreendendo um ácido nucleico não integrado, tal como um plasmídeo, cosmídeo, fagomídeo, ou elemento de expressão linear, que compreende uma sequência codificadora de um anticorpo anti-c-Met da invenção.
[00155] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um hibridoma que produz um anticorpo da invenção como aqui definido. Em mais um aspecto adicional, a invenção refere-se a um animal não humano transgênico ou a uma planta transgênica compreendendo ácidos nucleicos codificadores de uma cadeia pesada de humano e uma cadeia leve de humano, sendo que o animal ou a planta produz um anticorpo da invenção da invenção.
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56/121 [00156] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para produzir um anticorpo anti-c-Met da invenção, dito método compreendendo as etapas de
a) cultivar um hibridoma ou uma célula hospedeira da invenção como descrito aqui acima, e
b) purificar o anticorpo da invenção do meio de cultura.
Composições [00157] Em mais um aspecto principal, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo:
- um anticorpo anti-c-Met como aqui definido, e
- um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00158] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter um anticorpo da presente invenção ou uma combinação de diferentes anticorpos da presente invenção.
[00159] As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com técnicas convencionais tais como aquelas reveladas em “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode p. ex., incluir diluentes, cargas, sais, tampões, detergentes (e. g., um detergente não iônico, tal como Tween-20 ou Tween80), estabilizadores (e. g., açúcares ou aminoácidos livres de proteína), conservantes, fixadores de tecido, agentes de solubilização, e/ou outros materiais adequados para inclusão em uma composição farmacêutica.
[00160] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer um e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade, antioxidantes e agentes retardantes de absorção adequados, e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis com um composto da presente invenção. Exemplos de veículos aquosos e não aquosos apropriados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas
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57/121 da presente invenção incluem água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, etanol, dextrose, poliois (tais como glicerol, propileno-glicol, poli(etileno-glicol), e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, soluções coloidais de carbóxi-metil-celulose, goma tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila, e/ou vários tampões. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem dispersões ou soluções aquosas estéreis e pós-estéreis para a preparação extemporânea de dispersão ou soluções injetáveis estéreis. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.
[00161] Composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis por exemplo (1) antioxidantes solúveis em águam tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidróxi-anisol butilado, hidróxi-tolueno butilado, lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol, e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etileno-diamino-tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e semelhantes.
[00162] Composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender agentes de isotonicidade, tais como açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.
[00163] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem conter um ou mais adjuvantes apropriados para a rota de administração escolhida tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificadores, agentes dispersantes, conservantes ou tampões, que podem intensificar a meia-vida ou a efetividade da composição farmacêutica. Os compostos da presente invenção podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de
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58/121 liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdermais, e sistemas de liberação microencapsulados. Tais veículos podem incluir gelatina, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila, polímeros biodegradáveis, biocompatíveis tais como polímeros de etileno-acetato de vinila, polianidridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, e poli(ácido lático) sozinho ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na arte. Métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte.
[00164] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ingrediente ou uma combinação de ingredientes p. ex., como enumerados acima, se exigidos, seguida por esterilização por microfiltração. Geralmente, dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos p. ex., daqueles enumerados acima. No caso de pós-estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que dá um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma sua solução previamente esterilmente filtrada.
[00165] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas podem ser variados de modo a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que é efetiva para alcançar a resposta terapêutica para um paciente especial, composição especial, e modo de administração especial, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições especiais da presente invenção utilizadas, ou a sua amida, a rota de administração, a taxa de excreção do composto especial sendo utilizado, a duração do tratamento, outras(os)
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59/121 drogas, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições especiais utilizadas, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e a história médica anterior do paciente sendo tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas.
[00166] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer rota ou modo adequada(o). Em uma modalidade, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada parenteralmente. “Administrada parenteralmente” como aqui usado significa modos de administração diferentes de administração enteral e tópica, habitualmente por injeção, e incluem injeção epidermal, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, intracranial, intratorácica, epidural e intraesternal e infusão.
[00167] Em uma modalidade a composição farmacêutica é administrada por injeção intravenosa ou subcutânea ou por infusão.
Usos [00168] Em mais um aspecto principal, a invenção refere-se a um anticorpo anti-c-Met da invenção para uso como um medicamento.
[00169] Os anticorpos anti-c-Met da invenção podem ser usados para numerosos propósitos. Em especial, os anticorpos da invenção podem ser usados para o tratamento de várias formas de câncer, incluindo câncer metastático e câncer refratário. Tal câncer pode ser dependente de HGF ou independente de HGF.
[00170] Em uma modalidade, os anticorpos anti-c-Met da invenção são usados para o tratamento de uma forma de câncer selecionada do grupo consistindo de: câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cabeça e pescoço, câncer renal, câncer de fígado, câncer
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60/121 de pulmão (tal como câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC)), câncer nasofaringeal, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de vesícula biliar, câncer de próstata e câncer de tiroide.
[00171] Em outra modalidade, os anticorpos anti-c-Met da invenção são usados para o tratamento de uma forma de câncer selecionada do grupo consistindo de: osteossarcoma, rabdomiossarcoma e sarcoma sinovial.
[00172] Em outra modalidade, os anticorpos anti-c-Met da invenção são usados para o tratamento de uma forma de câncer selecionada do grupo consistindo de: sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, histiocitoma fibroso maligno e fibrossarcoma.
[00173] Em outra modalidade, os anticorpos anti-c-Met da invenção são usados para o tratamento de malignidades hematopoiéticas, tal como uma malignidade selecionada do grupo consistindo de: leucemia mielógena aguda, leucemia de célula T de adulto, leucemia mieloide crônica, linfoma e mieloma múltiplo.
[00174] Em mais uma modalidade, os anticorpos anti-c-Met da invenção são usados para o tratamento de um neoplasma selecionado do grupo consistindo de: glioblastoma, astrocitoma, melanoma, mesotelioma e tumor de Wilm.
[00175] Em mais uma modalidade, os anticorpos anti-c-Met da invenção são usados para o tratamento de tumores MiT, incluindo sarcoma de células claras (CCS), sarcoma alveolar de partes moles (ASPS) e sarcoma de célula renal associado à translocação.
[00176] Em outra modalidade, anticorpos agonísticos anti-c-Met da invenção são usados para a regulação de produção de citocina e a indução de mobilização de célula progenitora endotelial, p. ex., em pacientes com doença cardíaca coronariana (Yang et al. (2009) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 36:790).
[00177] Em outra modalidade, anticorpos agonísticos anti-c-Met da
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61/121 invenção são usados para inibir ou melhorar insuficiência renal crônica (Mizuno et al. (2008) Front Biosci. 13:7072).
[00178] Similarmente, a invenção refere-se a um método para inibir o crescimento e/ou a proliferação de uma célula de tumor expressando c-Met, compreendendo administração, a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade efetiva de um anticorpo da invenção.
[00179] Em uma modalidade, dita célula de tumor está envolvida em uma forma de câncer selecionada do grupo consistindo de: câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cabeça e pescoço, câncer renal, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer nasofaringeal, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de vesícula biliar, câncer de próstata, câncer de tiroide, osteossarcoma, rabdomiossarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrossarcoma, leucemia mielógena aguda, leucemia de célula T de adulto, leucemia mieloide crônica, linfoma, mieloma múltiplo, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, mesotelioma e tumor de Wilm.
[00180] Também, a invenção refere-se ao uso de um anticorpo monoclonal que se liga em c-Met de humano para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer, tal como uma das indicações de câncer específicas mencionadas acima.
[00181] Em uma modalidade, seleção de pacientes a serem tratados com um anticorpo anti-c-Met é baseada no nível de (supra)expressão de cMet e/ou HGF sobre as células de tumor relevantes de ditos pacientes.
[00182] Em mais uma modalidade dos métodos de tratamento da presente invenção, a eficácia do tratamento está sendo monitorada durante a terapia, p. ex., em instantes predeterminados de tempo, pela determinação de níveis de expressão de c-Met sobre as células de tumor relevantes.
[00183] Regimes de dosagem nos métodos de tratamento e usos acima
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62/121 são ajustados para fornecer a resposta desejada ótima (p. ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas no decorrer do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Composições parenterais podem ser formuladas em forma de dosagem unitária para facilitação da administração e uniformidade de dosagem.
[00184] As dosagens eficientes e os regimes de dosagem para os anticorpos anti-c-Met dependem da doença ou condição a ser tratada e podem ser determinadas(os) pelas pessoas experientes na arte. Uma faixa exemplar, não limitante, para uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto da presente invenção é cerca de 0,1-100 mg/kg, tal como cerca de 0,1-50 mg/kg, por exemplo cerca de 0,1-20 mg/kg, tal como cerca de 0,1-10 mg/kg, por exemplo cerca de 0,5, cerca de tal como 0,3, cerca de 1, cerca de 3, cerca de 5, ou cerca de 8 mg/kg.
[00185] Um médico ou veterinário tendo experiência comum na arte pode prontamente determinar e receitar a quantidade efetiva da composição farmacêutica exigida. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar com doses do anticorpo anti-c-Met utilizado na composição farmacêutica em níveis menores do que aqueles exigidos com o propósito de alcançar o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até o efeito desejado ser alcançado. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição da presente invenção será aquela quantidade do composto que é a dose efetiva mais baixa para produzir um efeito terapêutico. Administração pode p. ex., ser parenteral, tal como intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em uma modalidade, os anticorpos anti-c-Met podem ser administrados por infusão em uma dosagem semanal de 10 a 500 mg/m2, tal como de 200 a 400 mg/m2. Tal administração pode ser repetida, p. ex., 1 a 8 vezes, tal como 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua durante um
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63/121 período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Em uma modalidade, os anticorpos anti-c-Met podem ser administrados por infusão contínua lenta durante um período longo, tal como mais do que 24 horas, com o propósito de reduzir os efeitos colaterais tóxicos.
[00186] Em uma modalidade os anticorpos anti-c-Met podem ser administrados em uma dosagem semanal de 250 mg a 2000 mg, tal como por exemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ou 2000 mg, por até 8 vezes, tal como de 4 a 6 vezes. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes se necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada pela medição da quantidade de composto da presente invenção no sangue sob administração por exemplo por coleta de uma amostra biológica e usando anticorpos anti-idiotípicos que selecionam a região de ligação em antígeno dos anticorpos anti-c-Met da presente invenção.
[00187] Em uma modalidade, os anticorpos anti-c-Met podem ser administrados por terapia de manutenção, tal como, p. ex., uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.
[00188] Um anticorpo anti-c-Met também pode ser administrado profilaticamente com o propósito de reduzir o risco de desenvolver câncer, retardar o início da ocorrência de um evento de progressão de câncer, e/ou reduzir o risco de recorrência quando um câncer está em remissão.
[00189] Anticorpos anti-c-Met também podem ser administrados em terapia de combinação, i.e., combinados com outros agentes terapêuticos relevantes para a doença ou condição a ser tratada. Consequentemente, em uma modalidade, o medicamento contendo anticorpo é para combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tal como um agente citotóxico, quimioterapêutico ou antiangiogênico.
[00190] Tal administração combinada pode ser simultânea, separada ou sequencial. Para administração simultânea os agentes podem ser administrados como uma composição ou como composições separadas, se
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64/121 apropriado. A presente invenção portanto fornece métodos para tratar um distúrbio envolvendo células expressando c-Met como descrito acima, cujos métodos compreendem administração de um anticorpo anti-c-Met da presente invenção combinado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais como descrito abaixo.
[00191] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células expressando c-Met em um sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-c-Met da presente invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional a um sujeito em necessidade do mesmo.
[00192] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir câncer, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-c-Met da presente invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional a um sujeito em necessidade do mesmo.
[00193] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um antimetabólito, tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tio-guanina, citarabina, fludarabina, 5-fluoro-uracila, decarbazina, hidróxi-ureia, asparaginase, gencitabina ou cladribina.
[00194] Em outra modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um agente alquilante, tal como mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromo-manitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tal como carboplatina.
[00195] Em outra modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um agente antimitótico, tal como taxanos, por exemplo docetaxel, e paclitaxel, e alcaloides de vinca, por exemplo vindesina, vincristina, vimblastina, e vinorelbina.
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65/121 [00196] Em outra modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um inibidor de topoisomerase, tal como topotecan ou irinotecan, ou uma droga citostática, tal como etoposide e teniposide.
[00197] Em outra modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um inibidor de fator de crescimento, tal como um inibidor de ErbB1 (EGFR) (tal como um anticorpo anti-EGFR, p. ex., zalutumumab, cetuximab, panitumumab ou nimotuzumab ou outros inibidores de EGFR, tal como gefitinib ou erlotinib), um inibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como um anticorpo anti- HER2, p. ex., trastuzumab, trastuzumab-DM1 ou pertuzumab) ou um inibidor de ambos EGFR e HER2, tal como lapatinib).
[00198] Em outra modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um inibidor de tirosina-cinase, tal como imatinib (Glivec, Gleevec STI571) ou lapatinib, PTK787/ZK222584.
[00199] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células expressando c-Met em um sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-c-Met da presente invenção e pelo menos um inibidor de angiogênese, neovascularização, e/ou outra vascularização em um sujeito em necessidade do mesmo.
[00200] Exemplos de tais inibidores de angiogênese são inibidores de urocinase, inibidores de metaloprotease de matriz (tais como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 e agentes similares), inibidores de migração e proliferação de células endoteliais (tais como TNP470, esqualamina, 2-metóxi-estradiol, combretastatinas, endostatina, angiostatina, penicil-amina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) e agentes similares), antagonistas de fatores de crescimento angiogênico (tais como ZD6474, SU6668, anticorpos contra agentes angiogênicos e/ou seus receptores (tais como VEGF (p. ex., bevacizumab), bFGF, e angiopoietina-1),
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66/121 talidomida, análogos de talidomida (tal como CC-5013), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogênica (tal como angiozima), interferon α (tal como interferon a2a), suramina e agentes similares), inibidores de VEGF-R cinase e outros inibidores de tirosina-cinase antiangiogênicos (tal como SU011248), inibidores de sinalização de sobrevivência / integrina endotelialespecífica (tal como vitaxina e agentes similares), quelantes / antagonistas de cobre (tais como tetratiomolibdato, captopril e agentes similares), carbóxiamido-triazol (CAI), ABT-627, CM101, interleucina-12 (IL-12), IM862, PNU145156E bem como moléculas de nucleotídeo inibidoras de angiogênese (tais como antissenso-VEGF-cDNA, cDNA codificador de angiostatina, cDNA codificador de p53 e cDNA codificador de receptor-2 de VEGF deficiente).
[00201] Outros exemplos de tais inibidores de angiogênese, neovascularização, e/ou outra vascularização são derivados de heparina antiangiogênicos(p. ex., heparinase III), temozolomida, NK4, fator inibidor de migração de macrófago, inibidores de ciclooxigenase-2, inibidores de fator-1 induzível por hipoxia, isoflavonas de soja antiangiogênicas, oltipraz, fumagilina e seus análogos, análogos de somatostatina, polissulfato de pentosana, tecogalan sódico, dalteparina, tunstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticorpos contra outros agentes, tais como anticorpos anti-alfa-v/beta-3-integrina e anti-quininostatina.
[00202] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um imunógeno anticâncer, tal como antígeno de câncer / antígeno associado a tumor (p. ex., molécula de adesão em célula epitelial (EpCAM/TACSTD1), mucina 1 (MUC1), antígeno carcinoembriônico (CEA), glicoproteína-72 associada a tumor (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vacinas virais associadas a câncer (p. ex., vacinas de papilomavírus de humano) ou proteínas de choque térmico derivadas de tumor.
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67/121 [00203] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser uma quimiocina, citocina anticâncer, ou combinação das mesmas. Exemplos de citocinas e de fatores de crescimento adequados incluem IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (p. ex., INFa2b), ΙΡΝβ, GM-CSF, CD40L, ligante Flt3, fator de célula-tronco, ancestima, e TNFa. Quimiocinas adequadas incluem quimiocinas negativas para Glu-Leu-Arg (ELR) tais como IP-10, MCP-3, MIG, e SDF-Ια das famílias de quimiocinas CXC e C-C de humano. Citocinas adequadas incluem derivados de citocina, variantes de citocina, fragmentos de citocina, e proteínas de fusão de citocina. [00204] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um regulador de apoptose / controle de ciclo celular (ou “agente regulador”). Um regulador de apoptose / controle de ciclo celular inclui moléculas que selecionam e modulam reguladores de apoptose / controle de ciclo celular tais como (i) cdc-25 (tal como NSC 663284), (ii) cinases dependentes de ciclina que supra-estimulam o ciclo celular (tal como flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidróxi-estaurosporina (UCN-01, KW2401), e roscovitina (R-roscovitina, CYC202)), e (iii) moduladores de telomerase (tais como BIBR1532, SOT-095, GRN163 e composições descrita em por exemplo US 6.440.735 e US 6.713.055). Exemplos não limitantes de moléculas que interferem com as rotas apoptóticas incluem ligante indutor de apoptose relacionado com TNF (TRAIL) / ligante de apoptose-2 (Apo-2L), anticorpos que ativam receptores de TRAIL, IFNs, e Bcl-2 de antissenso.
[00205] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um agente regulador hormonal, tais como agentes úteis para terapia antiandrogênio e antiestrogênio. Exemplos de tais agentes
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68/121 reguladores hormonais são tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietil-estilbestrol, etinil-estradiol/estinil, um antiandrogênio (tal como flutaminde/eulexin), uma progestina (tal como caproato de hidróxi-progesterona, medróxi-progesterona/provera, acepato de megestrol / megace), um adrenocorticosteroide (tal como hidrocortisona, prednisona), hormônio liberador de hormônio luteinizante (e seus análogos e outros agonistas de LHRH tais como buserelina e goserelina), um inibidor de aromatase (tal como anastrazol/arimidex, amino-glutetimida / citraden, exemestano) ou um inibidor de hormônio (tal como octreotide/sandostatina). [00206] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um agente antianérgico, tais como compostos que são moléculas que bloqueiam a atividade de CTLA-4, p. ex., ipilimumab.
[00207] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um ácido nucleico anticâncer ou uma molécula de RNA inibitória anticâncer.
[00208] Exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevante como agentes terapêuticos para uso em combinação com um anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios descritos acima são agentes indutores de diferenciação, análogos de ácido retinoico (tais como todos os ácido trans-retinoicos, ácidos 13-cis-retinoicos e agentes similares), análogos de vitamina D (tais como seocalcitol e agentes similares), inibidores de ErbB3, ErbB4, IGF-IR, receptor de insulina, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, RON (tal como um anticorpo anti-RON), Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 e agentes similares.
[00209] Exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um
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69/121 anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios descritos acima são estramustina e epirubicina.
[00210] Exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios descritos acima são um inibidor de HSP90 como 17-alil-amino-geldanamicina, anticorpos direcionados contra um antígeno de tumor tal como PSA, CA125, KSA, integrinas, p. ex., integrina β1, ou inibidores de VCAM.
[00211] Exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um anticorpo anti-c-Met para tratar os distúrbios descritos acima são inibidores de calcineurina (tais como valspodar, PSC 833 e outros inibidores de MDR-1 ou p-glicoproteína), inibidores de TOR (tais como sirolimus, everolimus e rapamcina), e inibidores de mecanismos de “alojamento de linfócito” (tal como FTY720), e agentes com efeitos sobre sinalização celular tais como inibidores de molécula de adesão (por exemplo anti-LFA).
[00212] Em uma modalidade, o anticorpo anti-c-Met da invenção é para uso em combinação com um ou mais outros anticorpos terapêuticos, tais como ofatumumab, zanolimumab, daratumumab, ranibizumab, Zenapax, Simulect, Remicade, Humira, Tysabri, Xolair, raptiva e/ou rituximab.
[00213] Outros anticorpos terapêuticos que podem ser usados em combinação com o anticorpo da presente invenção são anticorpos anti-c-Met que se ligam em outras regiões de c-Met, tais como os anticorpos descritos em WO2005016382, WO2006015371, WO2007090807, WO2007126799 ou WO2009007427 (todas aqui incorporadas como referências).
[00214] Em outra modalidade, dois ou mais anticorpos diferentes da invenção como aqui descritos são usados em combinação para o tratamento de doença. Combinações especialmente interessantes incluem dois ou mais anticorpos não competidores. Tal terapia de combinação pode ocasionar a
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70/121 ligação de um número aumentado de moléculas de anticorpo por célula, que pode dar eficácia aumentada, p. ex., via ativação de lise mediada por complemento.
[00215] Em adição ao acima, outras modalidades das terapias de combinação da invenção incluem as seguintes:
• Para o tratamento de câncer de pulmão de célula não pequena, um anticorpo anti-c-Met em combinação com inibidores de EGFR, tal como um anticorpo anti-EGFR, p. ex., zalutumumab, cetuximab, panitumumab ou nimotuzumab ou outros inibidores de EGFR, tal como gefitinib ou erlotinib), ou em combinação com um inibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como um anticorpo anti-HER2, p. ex., trastuzumab, trastuzumab-DM1 ou pertuzumab) ou em combinação com um inibidor de ambos EGFR e HER2, tal como lapatinib, ou em combinação com um inibidor de HER3.
• Para o tratamento de glioma, um anticorpo anti-c-Met em combinação com temozolomide ou um inibidor de angiogênese, tal como bevacizumab.
• Para o tratamento de câncer colorretal um anticorpo anti-cMet em combinação com um ou mais compostos selecionados de: gencitabina, bevacizumab, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, IFL, oxaliplatina, irinotecan, 5-FU/LV, Capecitabina, UFT, agentes selecionadores de EGFR, tais como cetuximab. panitumumab, zalutumumab; inibidores de VEGF, ou inibidores de tirosina-cinase tal como sunitinib.
• Para o tratamento de câncer de próstata um anticorpo anti-cMet em combinação com um ou mais compostos selecionados de terapias hormonais / anti-hormonais; tais como antiandrogênios, agonistas de hormônio liberador de hormônio luteinizante (LHRH), e agentes quimioterapêuticos tais como taxanos, mitoxantrona, estramustina, 5FU, vimblastina, ixabepilona.
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Radioterapia - cirurgia [00216] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células expressando c-Met em um sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-c-Met, tal como um anticorpo anti-c-Met da presente invenção, e radioterapia a um sujeito em necessidade da mesma.
[00217] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir câncer, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-c-Met, tal como um anticorpo anti-c-Met da presente invenção, e radioterapia a um sujeito em necessidade da mesma.
[00218] Em uma modalidade, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-c-Met, tal como um anticorpo anti-c-Met da presente invenção, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar câncer a ser administrada em combinação com radioterapia.
[00219] Radioterapia pode compreender radiação ou é fornecida administração de radiofármacos associada a um paciente. A fonte de radiação pode ser quer externa quer interna ao paciente sendo tratado (tratamento com radiação pode, por exemplo, estar na forma de terapia de radiação de feixe externo (EBRT) ou braquiterapia (BT)). Elementos radioativos que podem ser usados na prática de tais métodos incluem, p. ex., rádio, césio-137, irídio-192, amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodo-123, iodo131, e índio-111.
[00220] Em mais uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir câncer, cujo método compreende administração a um sujeito em necessidade da mesma de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-c-Met, tal como um anticorpo anti-c-Met da presente invenção, em combinação com cirurgia.
[00221] Usos diagnósticos
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72/121 [00222] Os anticorpos anti-c-Met da invenção também podem ser usados para propósitos diagnósticos. Portanto, em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma composição diagnóstica compreendendo um anticorpo anti-c-Met como aqui definido.
[00223] Em uma modalidade, os anticorpos anti-c-Met da presente invenção podem ser usados in vivo ou in vitro para diagnosticar doenças nas quais células ativadas expressando c-Met desempenham uma função ativa na patogênese, pela detecção de níveis de c-Met, ou de níveis de células que contêm c-Met sobre a superfície de membrana delas. Isto pode ser realizado, por exemplo, pelo contato de uma amostra a ser testada, opcionalmente juntamente com uma amostra de controle, com o anticorpo anti-c-Met sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e c-Met.
[00224] Assim, em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para detectar a presença de antígeno c-Met, ou uma célula expressando c-Met, em uma amostra compreendendo:
- contatar a amostra com um anticorpo anti-c-Met da invenção sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e c-Met; e
- analisar se um complexo tem sido formado.
[00225] Em uma modalidade, o método é realizado in vitro.
[00226] Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para a identificação de, e diagnose de tecidos e células invasivas, e outras células selecionadas por anticorpos anti-c-Met da presente invenção, e para a monitoração do progresso de tratamento terapêutico, do estado após o tratamento, do risco de desenvolvimento de câncer, da progressão de câncer, e semelhantes.
[00227] Marcadores adequados para o anticorpo anti-c-Met e/ou anticorpos secundários usados em tais técnicas são bem conhecidos na arte.
[00228] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um kit para
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73/121 detectar a presença de antígeno c-Met, ou uma célula expressando c-Met, em uma amostra compreendendo
- um anticorpo anti-c-Met da invenção ou uma molécula biespecífica da invenção; e
- instruções para uso do kit.
[00229] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um kit para diagnose de câncer compreendendo um recipiente compreendendo um anticorpo anti-c-Met, e um ou mais reagentes para detectar a ligação do anticorpo anti-c-Met em c-Met. Reagentes podem incluir, por exemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas, ou outras etiquetas detectáveis. Os reagentes também podem incluir anticorpos secundários ou terciários ou reagentes para reações enzimáticas, sendo que as reações enzimáticas produzem um produto que pode ser visualizado.
Anticorpos anti-idiotípicos [00230] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a anticorpo anti-idiotípico que se liga em um anticorpo anti-c-Met da invenção como aqui descrito.
[00231] Um anticorpo anti-idiotípico (Id) é um anticorpo que reconhece determinantes singulares geralmente associados com o sítio de ligação em antígeno de um anticorpo. Um anticorpo Id pode ser preparado pela imunização de um animal da mesma espécie e do mesmo tipo que a fonte de um mAb anti-c-Met com o mAb para o qual o anti-Id está sendo preparado. O animal imunizado tipicamente pode reconhecer e responder aos determinantes idiotípicos do anticorpo imunizador pela produção de um anticorpo para estes determinantes idiotípicos (o anticorpo anti-Id).
[00232] Um anticorpo anti-Id também pode ser usado como um “imunógeno” para induzir uma resposta imune em ainda outro animal, produzindo um denominado anticorpo anti-anticorpo anti-Id. Um anticorpo anti-anticorpo anti-Id pode ser epitopicamente idêntico ao mAb original, que
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74/121 induziu o anticorpo anti-Id. Assim pelo uso de anticorpos para os determinantes idiotípicos de um mAb, é possível identificar outros clones expressando anticorpos de especificidades idênticas.
[00233] A presente invenção é doravante ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser entendidos como limitantes adicionais.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Construtos de expressão para c-Met [00234] Foram gerados construtos códon-otimizados para expressão de c-Met, o domínio extracelular (ECD) (aa 1- 932 e uma etiqueta His6 Cterminal ou o domínio SEMA de c-Met (aa 1-567 e uma etiqueta His9 Cterminal), em células HEK ou CHO. As proteínas codificadas por estes construtos são idênticas ao Número de acesso ao Banco de Genes NM 000245 para c-Met. Os construtos continham sítios de restrição adequados para clonagem e uma sequência Kozak ótima (Kozak et al. (1999) Gene 234: 187208). Os construtos foram clonados no vetor de expressão de mamífero pEE13.4 (Lonza Biologies) (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169175), obtendo pEE13.4cMet, pEE13.4cMetECDHis e pEE13.4cMetSEMA567His8.
Exemplo 2: Construtos de expressão para 5D5v1, 5D5 e G11-HZ [00235] Foram gerados construtos códon-otimizados para expressão das cadeia pesada (HC) e da cadeia leve (LC) dos anticorpos IgG1: 5D5vl, 5D5 e G11-HZ em células HEK. As proteínas codificadas por estes construtos são idênticas àquelas descritas em patente US 6468529 (números de sequência 3 e 4) para cadeia pesada e cadeia leve 5D5v1, WO 2006/015371 A2 (fig. 13) para cadeia pesada e cadeia leve 5D5 e WO 2009/007427 A2 (sequência foi extraída de múltiplas figuras) para cadeias pesada e leve 224G11. 224G11 é também aqui chamada de G11-HZ.
Exemplo 3: Expressão transiente em células HEK-293F
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75/121 [00236] Células Freestyle™ 293-F (um subclone HEK-293 adaptado para crescimento em suspensão e meio Freestyle quimicamente definido (HEK-293F)) foram obtidas de Invitrogen e transfectadas com DNA plasmídeo apropriado, usando 293fectin (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Expressão de c-Met foi testada por meio de análise usando FACS como descrita abaixo. No caso e expressão de anticorpo, os vetores de expressão de cadeia pesada e de cadeia leve apropriados foram coexpressados.
Exemplo 4: Expressão transiente em células CHO [00237] pEE13.4cMet foi transientemente transfectado em linhagem celular Freestyle™ CHO-S (Invitrogen) usando um reagente de transfecção Freestyle MAX (Invitrogen). Expressão de c-Met foi testada por meio da análise usando FACS como descrita abaixo.
Exemplo 5: Clonagem e expressão de anticorpos monovalentes (moléculas UniBody®) [00238] Para a expressão de anticorpos monovalentes em células de mamífero a região constante de HC de IgG4, faltante da região de articulação (Ch) (aminoácidos E99-P110) e contendo 2 mutações F405T e Y407E na região CH3, foi sintetizada como um construto códon-otimizado em vetor de expressão de mamífero pcDNA3.3 (Invitrogen) e chamado de pUniTE. Um vetor separado foi construído pela inserção da região constante códonotimizada dispersão aquosa região de cadeia leve kappa de humano em pcDNA3.3 e chamado pKappa.
[00239] Regiões VH e VL relevantes foram inseridas respectivamente em pUniTE e pKappa resultando em vetores para a expressão das cadeias pesada e leve dos anticorpos específicos. Cotransfecção dos vetores de cadeias pesada e leve de um anticorpo específico em células HEK-293F (Invitrogen), resultou na produção transiente de anticorpos monovalentes com as especificidades desejadas. Purificação foi realizada usando cromatografia
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76/121 em coluna de afinidade por Proteína A (como descrito em Exemplo 11).
Exemplo 6: Purificação de c-Met etiquetada com His [00240] cMetECDHis e cMetSEMAHis foram expressadas em células HEK-293F. A etiqueta-His em cMetECDHis e cMetSEMAHis permite a purificação por cromatografia de afinidade de metal imobilizado. Neste processo, um quelante fixado sobre a resina cromatográfica é carregado com cátions Co2+. Sobrenadantes contendo cMetECDHis e cMetSEMAHis foram incubados com a resina no modo em batelada (i.e. solução). A proteína etiquetada com His liga-se fortemente nas contas de resina, enquanto que outras proteínas presentes no sobrenadante de cultura não se ligam fortemente. Após incubação as contas são recuperadas do sobrenadante e empacotadas para dentro de uma coluna. A coluna é lavada com o propósito de remover as proteínas fracamente ligadas. As proteínas cMetECDHis e cMetSEMAHis fortemente ligadas são então eluídas com um tampão contendo imidazol, que compete com a ligação de His em Co2+. O eluente é removido da proteína por troca de tampão em uma coluna de dessalinização.
Exemplo 7: Procedimento de imunização de camundongos transgênicos [00241] Anticorpos 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 031, 035, 039, 040, 045, 093, 095, 096, 101 e 104 foram derivados das seguintes imunizações: um camundongo HCo20 (1 fêmea, cepa GG2713), um camundongo HCo17 (fêmea, cepa GG2714) e dois camundongos HCo12Balb/C (2 fêmeas, cepa GG2811) (Medarex, San Jose, CA, USA; para referências veja acima parágrafo sobre camundongo HuMab, WO2009097006 e US2005191293) foram imunizados cada quinzena alternando com 5x106 NCI-H441 células de tumor intraperitonealmente (IP) e 20 pg de proteína cMetECDHis copulada com o hapteno hemocianina de lapa “buraco de fechadura” [Diodora aspera] (KLH) subcutaneamente (SC).
[00242] Anticorpos 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078,
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082, 084, 087, 089, 098 e 181 foram derivados das seguintes imunizações: dois camundongos HCo20 (1 macho e 1 fêmea, cepa GG2713) e um camundongo HCo12-Balb/C (1 macho, cepa GG2811) (Medarex, San Jose, CA, USA; para referências veja acima parágrafo sobre camundongo HuMab) foram imunizados cada quinzena alternando com 5x106 de células CHOK1SV transientemente transfectadas com cMetECD intraperitonealmente (IP) e 20 gg de proteína cMetECDHis copulada em hapteno hemocianina de lapa “buraco de fechadura” (KLH) subcutaneamente (SC).
[00243] Um máximo de oito imunizações foi realizado por camundongo, quatro imunizações IP e quatro imunizações SC na base da cauda. A primeira imunização com células foi feita em adjuvante de Freund completo (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA). Para todas as outras imunizações, as células foram injetadas IP em PBS e cMetECD copulada com KLH foi injetada SC usando adjuvante de Freund incompleto (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Camundongos com pelo menos dois títulos de anticorpo específico para c-Met sequenciais de 200 (diluições de soro de 1/200) ou mais alto, detectados no ensaio FMAT de seleção específica de antígeno como descrito em Exemplo 8, tiveram células esplenócitos e de linfonodos fusionadas em uma linhagem de célula de mieloma de camundongo.
Exemplo 8: Ensaio de seleção específica de antígeno homogênea [00244] A presença de anticorpos anti-c-Met em soros de camundongos imunizados ou sobrenadante de cultura de transfectoma ou hibridoma HuMab (anticorpo monoclonal de humano) foi determinada por ensaios de seleção específica de antígeno homogênea (quatro quadrantes) usando Tecnologia de Ensaio Microvolumétrico Fluorométrico (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Para isto, foi usada uma combinação de 3 ensaios baseados em célula e um ensaio baseado em contas.
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Nos ensaios baseados em célula, foi determinada a ligação em TH1016-cMet (célula HEK-293F transientemente expressando o domínio extracelular do receptor de c-Met; produzida como descrito acima) e célula HT29 (que expressa c-Met na superfície da célula) bem como em células de tipo selvagem HEK293 (controle negativo que não expressa c-Met). Para o ensaio baseado em contas, foi determinada a ligação em SB1016-cMet (cMetECDHis obtida de células transientemente transfectadas HEK-293F como descrito acima, biotinilada e copulada em contas revestidas com estreptavidina). Amostras foram adicionadas nas células/contas para permitir a ligação em c-Met. Subsequentemente, a ligação de HuMab foi detectada usando um conjugado fluorescente (anticorpo Cy5 de Cabra anti-IgG de humano, Jackson ImmunoResearch). O anticorpo quimérico 5D5v1 específico para c-Met (produzido em células HEK-293F) foi usado como um controle positivo e o soro reunido de camundongo-HuMab e HuMab-KLH foram usados como controles negativos. As amostras foram escaneadas usando um Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System (8200 CDS) e ‘contagens x fluorescência' foi usada como leitura. Amostras foram classificadas como positivas quando as contagens foram acima de 50 e contagens x fluorescência foram pelo menos três vezes mais altas do que o controle negativo HuMab-KLH.
Exemplo 9: Geração de hibridoma HuMab [00245] Camundongos HuMab com desenvolvimento de título específico para antígeno suficiente (como definido acima) foram mortos e o baço e os linfonodos flanqueando a aorta abdominal e a veia cava foram coletados. Fusão de células esplenócitos e de linfonodos em uma linhagem de célula de mieloma de camundongo foi realizada por eletrofusão usando um CEEF 50 Electrofusion System (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA), essencialmente de acordo com as instruções do fabricante. Placas de fusão foram selecionadas com o ensaio de ligação específica para antígeno
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79/121 como descrito acima e as positivas deste ensaio foram testadas em um ensaio ERK-phosphorylation Alphascreen® SureFire® e ensaio Octet de classificação de afinidade como descritos abaixo. Anticorpos 031, 035, 087 e 089 foram expandidos e cultivados baseado em protocolos padrão (p. ex., como descrito em Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. e Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006).
[00246] Em paralelo anticorpos 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 035, 039, 040, 045, 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 093, 095, 096, 098, 101, 104 e 181 foram clonados usando o sistema ClonePix (Genetix, Hampshire, Reino Unido). Hibridomas da cavidade primários específicos foram semeados em meio sólido feito de 40% de CloneMedia (Genetix, Hampshire, Reino Unido) e 60% de meio completo HyQ 2x (Hyclone, Waltham, EUA) e aproximadamente 100 subclones de hibridoma primário da cavidade foram selecionados. Os subclones foram testados de novo no ensaio de ligação específica para antígeno como previamente descrito e níveis de IgG foram medidos usando Octet com o propósito de selecionar o melhor clone produtor e específico por hibridoma primário de cavidade para expansão adicional. Expansão adicional e cultura dos hibridomas HuMab resultantes foram feitas baseando-se em protocolos padrão (p. ex., como descrito em Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. e Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006).
Exemplo 10: Espectrometria de massa de anticorpos purificados [00247] Alíquotas pequenas de 0,8 mL de sobrenadante de hibridoma contendo anticorpo de estágio Hyperflask ou de 6 cavidades foram purificadas usando colunas PhyTip contendo resina de Proteína G (PhyNexus Inc., San Jose, USA) em uma estação de trabalho Sciclone ALH 3000 (Caliper
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Lifesciences, Hopkinton, EUA). As colunas PhyTip foram usadas de acordo com as instruções do fabricante, mas os tampões foram substituídos por: Tampão de Ligação PBS (B. Braun, Medical B.V., Oss, Países-Baixos) e Tampão de Eluição Glicina-HCl 0,1 M pH 2,7 (Fluka Riedel-de Haen, Buchs, Alemanha). Após purificação, as amostras foram neutralizadas com Tris-HCl 2 M pH 9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países-Baixos). Alternativamente, em alguns casos volumes maiores de sobrenadante de cultura foram purificados usando cromatografia de coluna de afinidade por Proteína A.
[00248] Após a purificação, as amostras foram aplicadas em uma placa de 384 cavidades (Waters, placa de cavidades quadradas de 100 pL, número da peça 186002631). As amostras foram desglicosiladas durante a noite a 37°C com N-glicosidase F. DTT (15 mg/mL) foi adicionado (1 pL / cavidade) e incubado por 1 h a 37°C. As amostras (5 ou 6 pL) foram dessalinizadas em um Acquity UPLC™ (Waters, Milford, EUA) com uma coluna BEH300 C18, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm a 60°C. Água MQ e acetonitrila de grau LC-MS (Biosolve, número de catálogo 01204101, Valkenswaard, Países-Baixos) ambas com 0,1% de ácido fórmico (Fluka, número de catálogo 56302, Buchs, Alemanha), foram usadas como Eluentes A e B, respectivamente. Espectros de massa de tempo de voo com ionização por pulverização de elétrons foram registrados em um espectrômetro de massa micrOTOF™ (Bruker, Bremen, Alemanha) operando no modo de íon positivo. Antes da análise, uma escala de 900-3.000 m/z foi calibrada com mistura de ajuste de ES (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA). Espectros de massa foram submetidos à deconvolução por DataAnalysis™ software v. 3.4 (Bruker) usando a pesquisa com algoritmo Maximal Entropy para pesos moleculares entre 5 e 80 kDa.
[00249] Após a deconvolução, as massas de cadeias pesada e leve para todas as amostras foram comparadas com o propósito de encontrar anticorpos duplicados. Na comparação das cadeias pesadas a possível presença de variantes de lisina C-terminal foi levada em consideração. Isto resultou em
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81/121 uma lista de anticorpos singulares, na qual singular é definido como uma combinação singular de cadeias pesada e leve. No caso de terem sido encontrados anticorpos duplicados, os resultados dos outros testes foram usados para decidir qual anticorpo foi o melhor material para continuar com os experimentos.
Exemplo 11: Análise de sequências dos domínios variáveis de anticorpo anti-c-Met e clonagem em vetores de expressão [00250] RNA total dos HuMabs anti-c-Met foi preparado de 5x106 células de hibridoma e 5'-RACE-Complementary DNA (cDNA) foi preparado a partir de 100 ng de RNA total, usando o SMART RACE cDNA Amplification kit (Clontech), de acordo com as instruções do fabricante. Regiões codificadoras de VH (região variável de cadeia pesada) e de VL (região variável de cadeia leve) foram amplificadas por PCR e clonadas em matriz nos vetores de região constante pG1f (contendo a região constante, totalmente sintética, códon-otimizada da cadeia pesada de IgG1 de humano (alótipo f) no vetor de expressão de mamífero pEE6.4 (Lonza Biologies, Slough, Reino Unido (Bebbington et al. (1992) Biotechnology 10:169-175)) e pKappa (contendo a região constante, totalmente sintética, códon-otimizada da cadeia leve kappa de humano (alótipo Km3) no vetor de expressão de mamífero pEE12.4 (Lonza Biologies, Slough, Reino Unido (Bebbington et al. (1992) Biotechnology 10:169-175)) usando uma estratégia de clonagem independente de ligação (Aslanidis et al. 1990 Nucleic Acids Res. 18:60696074). Para cada HuMab, 12 clones VL e 8 clones VH foram sequenciados e suas massas teóricas foram calculadas e comparadas com os dados de espectrometria de massa de anticorpo disponíveis. As sequências são apresentadas na Listagem de Sequências e em Tabela 1 aqui abaixo. Sequências de CDR são definidas de acordo com Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Tabela 2 e Tabela 3 dão uma
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82/121 visão geral da informação de sequências de anticorpo e sequências de linhagem germinativa mais homólogas.
Tabela 1: Sequências de região variável de cadeia pesada (VH), de região variável de cadeia leve (VL) e de CDR de HuMabs
SEQ ID No: 1 VH 005 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF SSYGFGWVRQAPGQGLEWMGRISPILGIA NYAQMFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLR SEDTAVYYCARDVGYDWPDTFDIWGQGT MVIVSS
SEQ ID No: 2 VH 005, CDR1 SYGFG
SEQ ID No: 3 VH 005, CDR2 RISPILGIANYAQMFQG
SEQ ID No: 4 VH 005, CDR3 DVGYDWPDTFDI
SEQ ID No: 5 VL 005 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPS RFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YNSFPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 6 VL 005, CDR1 RASQGISSWLA
SEQ ID No: 7 VL 005, CDR2 AASSLQS
SEQ ID No: 8 VL 005, CDR3 QQYNSFPPT
SEQ ID No: 9 VH 006 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF SSFGIGWVRQAPGQGLEWMGRIFPILGTAN YAQMFQGRVTITADKSTSTAYMELTSLRS EDTAVYYCARDVGYDSADAFDIWGQGTM VTVSS
SEQ ID No: 10 VH 006, CDR1 SFGIG
SEQ ID No: 11 VH 006, CDR2 RIFPILGTANYAQMFQG
SEQ ID No: 12 VH 006, CDR3 DVGYDSADAFDI
SEQ ID No: 13 VL 006 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQY NSYPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 14 VL 006, CDR1 RASQGISSWLA
SEQ ID No: 15 VL 006, CDR2 AASSLQS
SEQ ID No: 16 VL 006, CDR3 QQYNSYPPT
SEQ ID No: 17 VH 008 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT SYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSETR YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKAS DTAMYYCARQEITGEFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 18 VH 008, CDR1 SYWIG
SEQ ID No: 19 VH 008, CDR2 IIYPGDSETRYSPSFQG
SEQ ID No: 20 VH 008, CDR3 QEITGEFDY
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SEQ ID No: 21 VL 008 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISS ALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQF NSYPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 22 VL 008, CDR1 RASQGISSALA
SEQ ID No: 23 VL 008, CDR2 DASSLES
SEQ ID No: 24 VL 008, CDR3 QQFNSYPRT
SEQ ID No: 25 VH 022 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNK YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARELLWFGELWGYFDLWGR GTLVTVSS
SEQ ID No: 26 VH 022, CDR1 SYAMH
SEQ ID No: 27 VH 022, CDR2 VISYDGSNKYYADSVKG
SEQ ID No: 28 VH 022, CDR3 ELLWFGELWGYFDL
SEQ ID No: 29 VL 022 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQEA SSFTWTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 30 VL 022, CDR1 RASQGISSWLA
SEQ ID No: 31 VL 022, CDR2 AASSLQS
SEQ ID No: 32 VL 022, CDR3 QEASSFTWT
SEQ ID No: 33 VH 024 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFS SYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSSGGST YYVDSVKGRFTISRANSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCAKDLDRGWMGYFGYWGQG TLVTVSS
SEQ ID No: 34 VH 024, CDR1 SYAMS
SEQ ID No: 35 VH 024, CDR2 AISGSSGGSTYYVDSVKG
SEQ ID No: 36 VH 024, CDR3 DLDRGWMGYFGY
SEQ ID No: 37 VL 024 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPTFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 38 VL 024, CDR1 RASQGISSWLA
SEQ ID No: 39 VL 024, CDR2 AASSLQS
SEQ ID No: 40 VL 024, CDR3 QQANSFPT
SEQ ID No: 41 VH 035 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT SYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDT RYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWNSLKA SDTAMYYCARQEITGEFDYWGQGTLVTVS S
SEQ ID No: 42 VH 035, CDR1 SYWIG
SEQ ID No: 43 VH 035, CDR2 IIYPGDSDTRYSPSFQG
SEQ ID No: 44 VH 035, CDR3 QEITGEFDY
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SEQ ID No: 45 VL 035 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISS ALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQF NSYPMYTFGQGTKLEIK
SEQ ID No: 46 VL 035, CDR1 RASQGISSALA
SEQ ID No: 47 VL 035, CDR2 DASSLES
SEQ ID No: 48 VL 035, CDR3 QQFNSYPMYT
SEQ ID No: 49 VH 045 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGITY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARDRGWGSDYWGQGTLVTVS S
SEQ ID No: 50 VH 045, CDR1 SYAMS
SEQ ID No: 51 VH 045, CDR2 VISGSGGITYYADSVKG
SEQ ID No: 52 VH 045, CDR3 DRGWGSDY
SEQ ID No: 53 VL 045 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQR SNWPFTFGPGTKVDIK
SEQ ID No: 54 VL 045, CDR1 RASQSVSSYLA
SEQ ID No: 55 VL 045, CDR2 DASNRAT
SEQ ID No: 56 VL 045, CDR3 QQRSNWPFT
SEQ ID No: 57 VH 058 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS DYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDDGSYT YYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLK SEDTAMYYCAREGLYYYGSGSYYNQDYW GQGTLVTVSS
SEQ ID No: 58 VH 058, CDR1 DYYMY
SEQ ID No: 59 VH 058, CDR2 TISDDGSYTYYPDSVKG
SEQ ID No: 60 VH 058, CDR3 EGLYYYGSGSYYNQDY
SEQ ID No: 61 VL 058 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGLSS ALAWYRQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQF TSYPQITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 62 VL 058, CDR1 RASQGLSSALA
SEQ ID No: 63 VL 058, CDR2 DASSLES
SEQ ID No: 64 VL 058, CDR3 QQFTSYPQIT
SEQ ID No: 65 VH 061 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISS GGHSWSWIRQPPGKGLEWIGX1IYHSGNT YDNPSLKSRVTIAVDRSKNQLSLKLSFLTA ADTAVYYCARSSYDFLTDWGQGTLVTVS, sendo que X1 é qualquer aminoácido, preferivelmente C, S, Y ou A
SEQ ID No: 66 VH 061, CDR1 SGGHSWS
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SEQ ID No: 67 VH 061, CDR2 X1IYHSGNTYDNPSLKS, sendo que X1 é qualquer aminoácido, preferivelmente C, S, Y ou A
SEQ ID No: 68 VH 061, CDR3 SSYDFLTD
SEQ ID No: 69 VL 061 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NGFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 70 VL 061, CDR1 RASQGISSWLA
SEQ ID No: 71 VL 061, CDR2 AASSLQS
SEQ ID No: 72 VL 061, CDR3 QQANGFPIT
SEQ ID No: 73 VH 062 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISS GGHSWSWIRQPPGKGLEWIGX1IYHSGNT YDNPSLKSRVTIAVDRSKNQLSLKLSFVTA ADTAVYYCARSSYDILTDWGQGTLVTVSS, sendo que X1 é qualquer aminoácido, preferivelmente C, S, Y ou A
SEQ ID No: 74 VH 062, CDR1 SGGHSWS
SEQ ID No: 75 VH 062, CDR2 X1IYHSGNTYDNPSLKS, sendo que X1 é qualquer aminoácido, preferivelmente C, S, Y ou A
SEQ ID No: 76 VH 062, CDR3 SSYDILTD
SEQ ID No: 77 VL 062 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NGFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 78 VL 062, CDR1 RASQGISSWLA
SEQ ID No: 79 VL 062, CDR2 AASSLQS
SEQ ID No: 80 VL 062, CDR3 QQANGFPIT
SEQ ID No: 81 VH 064 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISS GGHSWSWIRQPPGKGLEWIGX 1 IYHSGNT YDNPSLKSRVTISVDRSKNQVSLKLSSVTA ADTAVYYCARSSYDILTDWGQGTLVTVSS, sendo que X1 é qualquer aminoácido, preferivelmente C, S, Y ou A
SEQ ID No: 82 VH 064, CDR1 SGGHSWS
SEQ ID No: 83 VH 064, CDR2 X1IYHSGNTYDNPSLKS, sendo que X1 é qualquer aminoácido, preferivelmente C, S, Y ou A
SEQ ID No: 84 VH 064, CDR3 SSYDILTD
SEQ ID No: 85 VL 064 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NGFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 86 VL 064, CDR1 RASQGISSWLA
SEQ ID No: 87 VL 064, CDR2 AASSLQS
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SEQ ID No: 88 VL 064, CDR3 QQANGFPIT
SEQ ID No: 89 VH 068 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISS GGYSWSWIRQPPGKGLEWIGX1IYHSGSTY YNPSLKSRVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARSSYDILTDWGQGTLVTVSS, sendo que X1 é qualquer aminoácido, preferivelmente C, S, Y ou A
SEQ ID No: 90 VH 068, CDR1 SGGYSWS
SEQ ID No: 91 VH 068, CDR2 X1IYHSGSTYYNPSLKS, sendo que X1 é qualquer aminoácido, preferivelmente C, S, Y ou A
SEQ ID No: 92 VH 068, CDR3 SSYDILTD
SEQ ID No: 93 VL 068 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 94 VL 068, CDR1 RASQGISSWLA
SEQ ID No: 95 VL 068, CDR2 AASSLQS
SEQ ID No: 96 VL 068, CDR3 QQANSFPIT
SEQ ID No: 97 VH 069 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTF TSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGY TNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSL RSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTL VTVSS
SEQ ID No: 98 VH 069, CDR1 SYGIS
SEQ ID No: 99 VH 069, CDR2 WISAYNGYTNYAQKLQG
SEQ ID No: 100 VH 069, CDR3 DLRGTNYFDY
SEQ ID No: 101 VL 069 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISN WLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 102 VL 069, CDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID No: 103 VL 069, CDR2 AASSLLS
SEQ ID No: 104 VL 069, CDR3 QQANSFPIT
SEQ ID No: 105 VH 096 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT SYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASD TAMYYCARQEITGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 106 VH 096, CDR1 SYWIG
SEQ ID No: 107 VH 096, CDR2 IIYPGDSDTRYSPSFQG
SEQ ID No: 108 VH 096, CDR3 QEITGDFDY
SEQ ID No: 109 VL 096 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSA LAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNS YPLTFGGGTKVEIK
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SEQ ID No: 110 VL 096, CDR1 RASQGISSALA
SEQ ID No: 111 VL 096, CDR2 AASSLES
SEQ ID No: 112 VL 096, CDR3 QQFNSYPLT
SEQ ID No: 113 VH 098 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TNFGISWVRQAPGQGLEWMGWISAFNGHT DYSQKVQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLR SDDTAVFYCARSHYYGSGSPFDYWGQGTL VTVSS
SEQ ID No: 114 VH 098, CDR1 NFGIS
SEQ ID No: 115 VH 098, CDR2 WISAFNGHTDYSQKVQG
SEQ ID No: 116 VH 098, CDR3 SHYYGSGSPFDY
SEQ ID No: 117 VL 098 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISN WLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQY KSYPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 118 VL 098, CDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID No: 119 VL 098, CDR2 AASSLQS
SEQ ID No: 120 VL 098, CDR3 HQYKSYPWT
SEQ ID No: 121 VH 101 QVQLVQSGGEVKKPGASVKVSCKASGYTF TRHGITWVRQAPGQGLEWMGWISADNGN TNYAQKFQDRVTMTTDTSTSTAYMELRSL RSDDTAVYFCARVFRYFDWLLPYFDYWG QGTLVTVST
SEQ ID No: 122 VH 101, CDR1 RHGIT
SEQ ID No: 123 VH 101, CDR2 WISADNGNTNYAQKFQD
SEQ ID No: 124 VH 101, CDR3 VFRYFDWLLPYFDY
SEQ ID No: 125 VL 101 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYGVFSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY GSSPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID No: 126 VL 101, CDR1 RASQSVSSSYLA
SEQ ID No: 127 VL 101, CDR2 GVFSRAT
SEQ ID No: 128 VL 101, CDR3 QQYGSSPYT
SEQ ID No: 129 VH 181 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNGYT NYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLR SDDTAVYYCARDLRGTAYFDYWGQGTLV TVSS
SEQ ID No: 130 VH 181, CDR1 SYGIS
SEQ ID No: 131 VH 181, CDR2 WISTYNGYTNYAQKLQG
SEQ ID No: 132 VH 181, CDR3 DLRGTAYFDY
SEQ ID No: 133 VL 181 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISN WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPITFGQGTRLEIK
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SEQ ID No: 134 VL 181, CDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID No: 135 VL 181, CDR2 AASSLLS
SEQ ID No: 136 VL 181, CDR3 QQANSFPIT
SEQ ID No: 137 VH 066 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTF TSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGY TNYAQKLQGRVTMTADTSTSTAYMELRSL RSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTL VTVSS
SEQ ID No: 138 VL 066 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISN WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 139 VH 065 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTF TNYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGY TNYAQKLQGRVTMTTDTSTTTAYMELRSL RSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTL VTVSS
SEQ ID No: 140 VL 065 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISN WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 141 VH 082 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTF TSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGY TNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSL RSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTL VTVSS
SEQ ID No: 142 VL 082 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISN WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 143 VH 089 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTF TSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGY TNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSL RSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTL VTVSS
SEQ ID No: 144 VL 089 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISN WLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 145 VH 031 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF SSYGFGWVRQAPGQGLEWMGRISPILGITN YAQMFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE DTAVYYCARDVGYDWPDTFDIWGQGTMV IVSS
SEQ ID No: 146 VL 031 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPS RFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YNSFPPTFGQGTKVEIK
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SEQ ID No: 147 VH 007 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF SSYGIGWVRQAPGQGLEWMGRIFPILGTAN YAQMFQGRVTITADKSTSTAYIELTSLRSE DTAVYYCARDVGYDSADAFDIWGQGTMV TVSS
SEQ ID No: 148 VL 007 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQY NSYPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 149 VH 011 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF SSYGIGWVRQAPGQGLEWMGRVFPILGTA NYAQMFQGRVTITADKSTSTAYMELTSLR SEDTAVYYCARDVGYDSADAFDIWGQGT MVTVSS
SEQ ID No: 150 VL 011 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQY NSYPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 151 VH 017 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNK YFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARELLWFGELWGYFDLWGRG TLVTVSS
SEQ ID No: 152 VL 017 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQEA NSFTWTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 153 VH 025 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSSK DYADSVKGRFTIFRDNSKNTLYLQMSSLRA ADTAVYYCARELLWFGELWGYFDLWGRG TLVTVSS
SEQ ID No: 154 VL 025 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQT NSFTWTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 155 VH 040 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGITY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARDRGWGSDYWGQGTLVTVS S
SEQ ID No: 156 VL 040 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQR SNWPFTFGPGTKVDIK
SEQ ID No: 157 VH 039 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN NYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGITY YADSEKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAKDRGWGSDCWGQGTLVTVSS
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SEQ ID No: 158 VL 039 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQR SNWPFTFGPGTKVDIK
SEQ ID No: 159 VH 078 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISS GGHSWSWIRQPPGKGLEWIGCLYHSGNTY YNPSLKSRVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARSSYDILTDWGQGILVTVSS
SEQ ID No: 160 VL 078 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 161 VH 084 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCGVSGGSISS GGHSWSWIRQPPGKGLEWIGCLYHSGNTY YNPSLKSRVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARSSYDILTDWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 162 VL 084 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NSFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 163 VH 063 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISS GGHSWSWIRQPPGKGLEWIGCIYHSGNTY DNPSLKSRVTIAVDRSKNQLSLKLSFVTAA DTAVYYCARSSYDILTDWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 164 VL 063 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NGFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 165 VH 087 QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGGSISS GGHSWSWIRQPPGKGLEWIGCIYHSGNTY DNPSLKSRVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARSSYDILTDWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 166 VL 087 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISS WLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQA NGFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID No: 167 VH 016 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYIFTS YWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASD TAMYYCARQEVTGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 168 VL 016 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSA LAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNS YPLTFGGGTKVEIK
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SEQ ID No: 169 VH 028 EVQLVQSGGEVKKPGESLKISCKGSGYSFT SYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASD TAMYYCARQEVTGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 170 VL 028 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSA LAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNS YPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID No: 171 VH 012 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT SYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASD TAMYYCARQEITGEFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 172 VL 012 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSA LAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNS YPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID No: 173 VH 095 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT SYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSNTR YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASD TAMYYCARQEITGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 174 VL 095 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSA LAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNS YPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID No: 175 VH 093 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT SYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASD TAMYYCARQEITGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 176 VL 093 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSA LAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNS YPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID No: 177 VH 104 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFIS YWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASD TAMYYCARQEITGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No: 178 VL 104 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSA LAWYQQKPGKAPKLLIYVASSLESGVPSRF SGSGSGTDFTLTITSLQPEDFATYYCQQFNS YPITFGQGTRLEIK
Tabela 2: Homologias de sequências de cadeia pesada e de origem de camundongo
Anticorpo: número de camundongo: cepa de camundongo: VH de linhagem germinativa:
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TH1016-005 339732 HCo12B, C1 IgHV1-69-4
TH1016-006 339732 HCo12B, C1 IgHV1-69-4
TH1016-008 339732 HCo12B, C1 IgHV5-51-1
TH1016-022 339733 HCo12B, C1 IgHV3-30-3*1
TH1016-024 339733 HCo12B, C1 IgHV3-23-1
TH1016-035-D09 339732 HCo12B, C1 IgHV5-51-1
TH1016-045 339282 HCo17, C1 IgHV3-23-1
TH1016-058 343191 HCo12B, C2 IgHV3-11-3
TH1016-061 348072 HCo20, C2 IgHV4-30-2*1
TH1016-062 348072 HCo20, C2 IgHV4-30-2*1
TH1016-064 348072 HCo20, C2 IgHV4-30-2*1
TH1016-068 348072 HCo20, C2 IgHV4-30-2*1
TH1016-069 348072 HCo20, C2 IgHV1-18-1
TH1016-096 339732 HCo12B, C1 IgHV5-51-1
TH1016-098 347330 HCo20, C2 IgHV1-18-1
TH1016-101 340659 HCo20, C1 IgHV1-18-1
TH1016-181 348072 HCo20, C2 IgHV1-18-1
Tabela 3: Homologias de sequências de cadeia leve e de origem de camundongo
Anticorpo: número de camundongo: cepa de camundongo: VL de linhagem germinativa:
PC1016-005 339732 HCo12B, C1 IGKV1D-16*01
PC1016-006 339732 HCo12B, C1 IGKV1D-16*01
PC1016-008 339732 HCo12B, C1 IGKV1-13*02
PC1016-022 339733 HCo12B, C1 IGKV1-12*01
PC1016-024 339733 HCo12B, C1 IGKV1-12*01
P1016-035 339732 HCo12B, C1 IGKV1-13*02
PC1016-045 339282 HCo17, C1 IGKV3-11*01
PC1016-058 343191 HCo12B, C2 IGKV1-13*02
PC1016-061 348072 HCo20, C2 IGKV1-12*01
PC1016-062 348072 HCo20, C2 IGKV1-12*01
PC1016-064 348072 HCo20, C2 IGKV1-12*01
PC1016-068 348072 HCo20, C2 IGKV1-12*01
PC1016-069 348072 HCo20, C2 IGKV1-12*01
PC1016-096 339732 HCo12B, C1 IGKV1-13*02
PC1016-098 347330 HCo20, C2 IGKV1D-16*01
PC1016-101 340659 HCo20, C1 IGKV3-20*01
PC1016-181 348072 HCo20, C2 IGKV1-12*01
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93/121 [00251] Figuras 1 e 2 mostram um alinhamento de sequências de HuMabs. Baseando-se nestas sequências, a sequência de consenso pode ser definida para algumas das sequências de CDR. Estas sequências de consenso são apresentadas em Tabela 4.
Tabela 4: Sequências de consenso
SEQ ID No: 179 005-006 IgHV1-69-4 CDR1 SX1X2X3X4 sendo que X1=Y ou F, X2=A ou G, X3 = F ou I, X4 = S ou G. Preferivelmente, sendo que X1=Y ou F, X2 = G,X3 = Para I e X4=G.
SEQ ID No: 180 005-006 IgHV1-69-4 CDR2 RX1X2PILGX3X4N YAQX5FQG sendo que X1=I ou V, X2 = I,S ou F, X3=I ou T, X4=A ou T, X5 = K ou M. Preferivelmente, sendo que X1=I ou V, X2=S ou F, X3=I ou T, X4=A ou T e X5 = M.
SEQ ID No: 181 005-006 IgHV1-69-4 CDR3 DVGYDX1X2DX3FD I sendo que X1=W ou S, X2 = P ou A, X3=T ou A
SEQ ID No: 182 008-035 IgHV5-51-1 CDR2 IIYPGDSXITRYSPSF QG sendo que X1 = D, E ou N
SEQ ID No: 183 008-035- 096 IgHV5-51-1 CDR3 QEX1TGX2FDY sendo que X1=V ou I, X2 = E ou D
SEQ ID No: 184 022 IgHV3-30- 3*1 CDR2 X1ISYDGSX2KX3X4 ADSVKG sendo que X1=V ou F, X2 = N ou S, X3 = D ou Y, X4=Y ou F
SEQ ID No: 185 024 IgHV3-23-1 CDR2 AISGSX1GGSTYYX2 DSVKG sendo que X1 = S ou no aa, X2=V ou A
SEQ ID No: 186 045 IgHV3-23-1 CDR1 Χ1ΥΑΜΧ2 sendo que X1 = S ou N, X2=S ou T
SEQ ID No: 187 045 IgHV3-23-1 CDR2 X1ISGSGGX2TYYAD SX3KG sendo que X1=A ou V, X2 = S ou I, X3=V ou E. Preferivelmente, sendo que X1=A ou V, X2 = I e X3=V ou E.
SEQ ID No: 188 045 IgHV3-23-1 CDR3 DRGWGSDX1 sendo que X1=Y ou C
SEQ ID No: 189 058 IgHV3-11-3 CDR1 DYYMX1 sendo que X1=Y ou S
SEQ ID No: 190 058 IgHV3-11-3 CDR2 X1ISX2X3X4SYTX5 YX6DSVKG sendo que X1=T ou Y, X2 = D ou S, X3= D ou S, X4 = G ou S, X5=Y ou N, X6 = P ou A
SEQ ID No: 191 062-064- IgHV4-30- 2*1 CDR1 SGGX1SWS sendo que X1=Y ou H
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068
SEQ ID No: 192 062-064- 068 IgHV4-302*1 CDR2 X1X2YHSGX3TYX4 NPSLKS sendo que X1 = qualquer aminoácido, preferivelmente C, Y, S ou A, X2 = I ou L, X3=S ou N, X4=Y ou D
SEQ ID No: 193 062-064- 068 IgHV4-30- 2*1 CDR3 SSYDX1LTD sendo que X1 = F ou I
SEQ ID No: 194 069-181 IgHV1-18-1 CDR1 X1YGIS sendo que X1=S ou N
SEQ ID No: 195 069-181 IgHV1-18-1 CDR2 WISX1YNGX2TNYA QKLQG sendo que X1=A ou T, X2 = N ou Y. Preferivelmente sendo que X1=A ou T e X2=Y
SEQ ID No: 196 069-181 IgHV1-18-1 CDR3 DLRGTX1YFDY sendo que X1=A ou N
SEQ ID No: 197 098 IgHV1-18-1 CDR1 X1X2GIS sendo que X1 = N ou S, X2 = F ou Y
SEQ ID No: 198 098 IgHV1-18-1 CDR2 WISAX1NGX2TX3Y X4QKX5QG sendo que X1 = F ou Y, X2 = H ou N, X3 = D ou N, X4=S ou A, X5=V ou L
SEQ ID No: 199 101 IgHV1-18-1 CDR1 X1X2GIX3 sendo que X1 = R ou S, X2 = H ou Y, X3=T ou S
SEQ ID No: 200 101 IgHV1-18-1 CDR2 WISAX1NGNTNYAQ KX2QX3 sendo que X1 = D ou Y, X2 = F ou L, X3 = D ou G
SEQ ID No: 201 101 IgHV1-18-1 CDR3 VX1RYFD W LLX 2YFDY sendo que X1 = F ou L, X2 = P ou no aa
SEQ ID No: 202 005-006 IGKV1D- 16*01 CDR3 QQYNSX1PX2T sendo que X1=Y ou F, X2 = P ou W. Preferivelmente, sendo que X1=Y ou F e X2 = P
SEQ ID No: 203 008-035 IGKV1- 13*02 CDR2 X1ASSLES sendo que X1 = D, V ou A
SEQ ID No: 204 008-035 IGKV1- 13*02 CDR3 QQFNSYPLX1T sendo que X1 = R, I, L, W ou MY
SEQ ID No: 205 022 IGKV1- 12*01 CDR3 QX1X2X3SFX4WT sendo que X1 = Q ou E, X2=A ou T, X3 = N ou S; X4 = P ou T
SEQ ID No: 206 024 IGKV1- 12*01 CDR3 QQANSFPX1T sendo que X1 = I ou no aa
SEQ ID No: 207 058 IGKV1- 13*02 CDR3 QQFX1SYPX2IT sendo que X1=T ou N, X2 = Q ou no aa
SEQ ID No: 208 062-064- 068 IGKV1- 12*01 CDR3 QQANX1FPIT sendo que X1 = G ou S
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SEQ ID No: 209 069-181 IGKV1- 12*01 CDR1 RASQGISX1WLA sendo que X1=S ou N
SEQ ID No: 210 069-181 IGKV1- 12*01 CDR2 AASSLX1S sendo que X1=Q ou L
SEQ ID No: 211 098 IGKV1D- 16*01 CDR3 X1QYX2SYPWT sendo que X1 = H ou Q, X2 = K ou N
SEQ ID No: 212 101 IGKV3- 20*01 CDR2 GX1X2SRAT sendo que X1=V ou A, X2 = F ou S
Exemplo 12: Purificação de anticorpos [00252] Sobrenadante de cultura foi filtrado sobre filtros de extremidade fechada de 0,2 pm e carregado em colunas MabSelect SuRe de 5 mL (GE Health Care) e eluído com citrato de sódio-NaOH 0,1 M, pH 3. O eluato foi imediatamente neutralizado com Tris-HCl 2 M, pH 9 e dialisado durante a noite para NaH2PO4 12,6 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 (B.Braun). Alternativamente, subsequente à purificação o eluato foi carregado em uma coluna HiPrep Desalting e o anticorpo foi trocado para tampão NaH2PO4 12,6 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 (B.Braun). Após a diálise ou a troca de tampão as amostras foram esterilmente filtradas sobre filtros de extremidade fechada de 0,2 pm. A pureza foi determinada por SDS-PAGE e a concentração foi medida por nefelometria e absorbância a 280n m. Anticorpos purificados foram armazenados a 4°C. Espectrometria de massa foi realizada para identificar a massa molecular das cadeia pesada e leve do anticorpo expressadas pelos hibridomas como descrito em Exemplo 10.
Exemplo 13: Ligação de clones anti-c-Met em células de tumor expressando c-Met ligada em membrana medida por meio de análise usando FACS [00253] A ligação de anticorpos anti-c-Met e de suas formas monovalentes (também chamadas aqui de “moléculas UniBody”, veja Exemplo 5) em células A431 expressando c-Met ligada em membrana (adquirida em ATCC, CRL-1555) foi testada usando citometria de fluxo (FACS Canto II, BD Biosciences). Análise Qifi (Dako, Glostrup, Dinamarca) revelou que as células A431expressam em média 30.000 cópias de proteína c
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Met por célula. Ligação de anticorpos anti-c-Met e de moléculas UniBody foi detectada usando um anticorpo de cabra anti-IgG de humano conjugado com Ficoeritrina (Jackson). IgG1-5D5 foi usado como anticorpo de controle positivo, e HuMab-KLH foi usado como anticorpo de controle de isótipo. Valores de EC50 foram determinados por meio de regressão não linear (curva sigmoide de resposta à dose com inclinação variável) usando o software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[00254] Figura 3 mostra que todos os anticorpos anti-c-Met e moléculas UniBody testados se ligaram em c-Met expressada sobre células A431 em uma maneira dependente da dose. Os valores de EC50 para ligação variaram entre 0,28 nM e 1,92 nM para IgG e 0,52 nM e 13,89 nM para moléculas UniBody. Curiosamente, anticorpo IgG1-024 demonstrou níveis de ligação insaturada elevados em células A431, que não foi observado quando ligação em células HT-29 (adquiridas em ATCC, HTB-38™) foi testada (dados não mostrados). Para anticorpos 022, 024, 062, 064, 069, 098, 101 e 181, foram observados nenhuns valores de EC50 ou valores de EC50 menos do que 2 vezes decrescidos entre IgG1's e moléculas UniBody de clones idênticos. Também níveis de ligação máximos permaneceram não modificados entre IgG1's e moléculas UniBody. Para anticorpos 005, 006, 008, 035, 045 e 058, por outro lado, um decréscimo maior do que 2 vezes em valor de EC50 bem como um decréscimo em nível de ligação máximo foram observados quando se compara IgG1 com sua contraparte UniBody. Isto foi mais provavelmente devido às dissociações mais baixas (Kd) destes anticorpos (veja Exemplo 14).
Exemplo 14: Ensaio Octet de classificação de afinidade [00255] Ligação de anticorpo em cMetECDHis foi analisada por meio de tecnologia Bio-layer Interferometry (BLI) no Octet System (Fortebio, Menlo Park, EUA). Foram usados biossensores anti-IgG de humano (Fcespecíficos) para capturar anticorpos anti-c-Met de acordo com o
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97/121 procedimento recomendado pelo fabricante. cMetECDHis derivada de células HEK293 foi carregada sobre o topo de anticorpos anti-c-Met imobilizados pelo posicionamento do biossensor carregado dentro de uma cavidade contendo 10 iig/mL de cMetECDHis diluídos 10 vezes com tampão cinética (Fortebio). A diferença em reflexão de luz (Δλ, nm) da superfície do biossensor devido à ligação de cMetECDHis foi medida em tempo real durante aproximadamente 10 minutos e foi usada pelo software Octet (V4.0, Fortebio) para calcular a constante de associação (ka [1/M x s]). A seguir, o biossensor carregado foi posicionado dentro de uma cavidade contendo apenas tampão cinética (10 vezes diluído em PBS) para determinar a constante de dissociação (kd [1/s]). Análise cinética foi realizada para determinar a afinidade (Kd [M]) usando o modelo 1:1 (langmuir). Como um controle positivo, foi usado 0,2 pg/mL de 5D5 IgG1 produzido em células HEK293.
[00256] Tabela 5 mostra que todos os anticorpos anti-c-Met ligaram-se em cMetECDHis com afinidades nanomolares dentro da faixa de 0,6-13,9 nM.
Tabela 5: Constantes cinéticas (ka, kd e Kd) de anticorpos para ligação em cMetECDHis
Clone K [1/Ms] kd [1/ s] Kd [M]
5D5 2,14E+05 1,25E-03 5,86E-09
005 3,18E+05 2,52E-03 7,92E-09
006 4,25E+05 4,20E-03 9,89E-09
008 3,08E+05 1,57E-03 5,12E-09
022 2,36E+05 2,51E-04 1,06E-09
024 1,45E+05 2,28E-04 1,57E-09
035 2,64E+05 3,68E-03 1,39E-08
045 7,21E+05 2,07E-03 2,87E-09
058 4,64E+05 1,25E-03 2,70E-09
061 2,56E+05 1,53E-04 5,96E-10
062 2,73E+05 3,19E-04 1,17E-09
064 2,84E+05 3,24E-04 1,14E-09
068 3,21E+05 1,35E-03 4,21E-09
069 2,12E+05 2,67E-04 1,26E-09
096 1,96E+05 5,00E-04 2,55E-09
098 1,64E+05 2,97E-04 1,82E-09
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101 1,69E+05 2,14E-04 1,27E-09
181 2,37E+05 5,31E-04 2,23E-09
[00257] Exceto para 5D5, cada amostra foi medida uma vez.
Exemplo 15: Ligação de anticorpos anti-c-Met em c-Met ligada em membrana expressada sobre células epiteliais de macaco Rhesus medida por meio de análise usando FACS [00258] Para determinar a reatividade cruzada com c-Met de macaco Rhesus, a ligação de anticorpos anti-c-Met em células epiteliais de macaco Rhesus positivas para c-Met (4MBr-5 adquiridas em ATCC) foi testada por citometria de fluxo (FACS Canto II, BD Biosciences). Um anticorpo de cabra anti-IgG de humano conjugado com Ficoeritrina (Jackson) foi usado como um conjugado secundário. HuMab-KLH foi usado como anticorpo de controle de isótipo.
[00259] Figura 4 demonstra que todos os anticorpos anti-c-Met testados reagem cruzadamente com c-Met de macaco Rhesus. Em ambas as concentrações testadas (0,5 pg/mL e 10 pg/mL) os anticorpos anti-c-Met foram capazes de se ligarem especificamente em c-Met de macaco Rhesus. Para todos os anticorpos, o sinal foi pelo menos 5 vezes mais alto do que o para o anticorpo de controle de isótipo HuMab-KLH. Curiosamente, P1016035 demonstrou níveis de fluorescência de topo muito mais elevados (MFI de ~200,000) em comparação com outros anticorpos específicos para c-Met. Esta diferença não foi observada em linhagens celulares expressando receptor de cMet de humano.
Exemplo 16: Bloqueio de ligação de HGF no domínio extracelular de c-Met determinado com Ensaio Imunossorbente Ligado à Enzima (ELISA) [00260] Um ELISA foi realizado para analisar de anticorpos anti-c-Met poderiam bloquear a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) em receptor de c-Met. Portanto, domínio extracelular revestido de c-Met foi incubado com um anticorpo anti-c-Met não marcado e HGF
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99/121 fluorescentemente marcado. Anticorpos não bloqueadores não competem com o HGF marcado pela ligação em c-Met, resultando em sinal de fluorescência máximo. Anticorpos bloqueadores competem com HGF marcado pela ligação em c-Met, resultando em um sinal de fluorescência decrescido.
[00261] HGF (ProSpec Tany, Rehovot, Israel) foi fluorescentemente marcado por conjugação com Európio3+ (PerkinElmer, Turku, Finlândia). Cavidades de ELISA foram revestidas durante a noite a 4°C com 0,5 pg/mL de domínio extracelular de c-Met recombinante de humano (R&D systems, Minneapolis, USA) diluído em PBS. A seguir, as cavidades de ELISA foram lavadas com PBST (PBS suplementada com 0,05% de Tween-20 [SigmaAldrich, Zwijndrecht, Países-Baixos]) e bloqueadas por uma hora na temperatura ambiente (RT) com PBST suplementada com 2% (v/v) de soro de galinha (Gibco, Paisley, Escócia). Após a lavagem com PBST, as cavidades de ELISA foram incubadas por uma hora na RT protegidas da luz com uma mistura de 50 pL de anticorpo anti-c-Met serialmente diluído (0,128-10.000 ng/mL em diluições de 5 vezes) e 50 pL de HGF conjugado com Európio3+ 0,44 pg/mL em PBST. A seguir, HGF conjugado com Európio3+ não ligado foi removido por lavagem com PBST e HGF conjugado com Európio3+ ligado foi incubado por 30 minutos na RT no escuro com Delfia Enhancement Solution (PerkinElmer) para aumentar o sinal fluorescente. A intensidade de fluorescência a 615 nm foi medida usando o leitor EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer) aplicando as seguintes configurações: espelho dual Lance/Delfia, filtro de emissão 615, filtro de excitação 340 nm, tempo de atraso 400 ps, janela 400 ps, 100 flashes, 2000 ps por ciclo e leitura bidirecional de fila por fila. Para determinar os valores de IC50, as curvas de ligação foram analisadas com regressão não linear (curva sigmoide de resposta à dose com inclinação variável, valores de topo restringidos para um valor compartilhado para todos os conjuntos de dados) usando o software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
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100/121 [00262] Figura 5 mostra exemplos representativos de curvas de inibição de ligação de HGF de anticorpos anti-c-Met para ligação no domínio extracelular de c-Met recombinante de humano. 5D5 foi usado como anticorpo de controle positivo. Todos os anticorpos anti-c-Met nos experimento mostrado foram capazes de competir com HGF conjugado com Európio3+ pela ligação com c-Met recombinante. Valores de IC50 variaram entre 0,0011 pg/mL e 0,0794 pg/mL. Sem adição de HGF conjugado com Európio3+, foram detectadas aproximadamente ~600 unidades fluorescentes relativas (RFU), indicando o sinal quando inibição máxima foi alcançada. Quando a ligação em HGF conjugado com Európio3+ não foi inibida, foram detectadas aproximadamente ~66.000 RFU. Anticorpos 005, 006, 058, 101 e o anticorpo de controle positivo 5D5 foram capazes de inibir 84,5-92,1% de ligação de HGF no receptor de c-Met. Todos os outros anticorpos foram capazes de inibir pelo menos 55% de ligação de HGF em c-Met. Visto que HGF pode se ligar no receptor de c-Met tanto no domínio SEMA quando na região Ig, alguns anticorpos podem inibir apenas uma destas interações. Para determinar qual interação foi inibida, foi realizado um ensaio de transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvida no tempo (TR-FRET) de inibição baseada em cMetSEMAHis.
Exemplo 17: Competição de anticorpos anti-c-Met pela ligação em cMetECDHis solúvel medida com ELISA-sanduíche [00263] Primeiro, foram determinadas as concentrações de revestimento ótimas dos anticorpos anti-c-Met testados e a concentração ótima de cMetECDHis. Portanto, cavidades de ELISA foram revestidas durante a noite a 4°C com HuMabs anti-c-Met serialmente diluídos em PBS (8 pg/mL em diluições duplas). A seguir, as cavidades de ELISA foram lavadas com PBST (PBS suplementada com 0,05% de Tween-20 [SigmaAldrich, Zwijndrecht, Países-Baixos]) e bloqueadas por uma hora na temperatura ambiente (RT) com PBSTC (PBST suplementada com 2% [v/v]
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101/121 de soro de galinha [Gibco, Paisley, Escócia]). Subsequentemente, as cavidades de ELISA foram lavadas com PBST e incubadas por uma hora na RT com cMetECDHis biotinilada serialmente diluída com PBSTC (1 pg/mL em diluições duplas). cMetECDHis biotinilada não ligada foi removida por lavagem com PBST, e cMetECDHis biotinilada ligada foi incubada por uma hora na RT com 0,1 pg/mL de Estreptavidina-poli-HRP (Sanquin, Amsterdam, Países-Baixos) diluída com PBST. Após lavagem, a reação foi visualizada durante uma incubação de 15 minutos com ácido 2,2'-azino-bis (3-etil-benzotiazolina-6- sulfônico (ABTS: diluir um tablete de ABTS em 50 mL de tampão ABTS [Roche Diagnostics, Almere, Países-Baixos]) na RT protegido da luz. A coloração foi interrompida pela adição de um volume igual de ácido oxálico (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países-Baixos). Fluorescência a 405 nm foi medida em um leitor de placa de microtitulação (Biotek Instruments, Winooski, EUA). As condições que resultaram em ligação sub-ótima (aproximadamente 80%) de cada anticorpo foram determinadas e usadas para seguir os experimentos de bloqueio cruzado.
[00264] Cavidades de ELISA foram revestidas com anticorpo anti-cMet em uma dose sub-ótima como descrito acima. Após bloqueio das cavidades de ELISA, elas foram incubadas com a concentração predeterminada de cMetECDHis biotinilada na presença de um excesso de anticorpo anti-c-Met. A reação foi revelada como descrito acima. Ligação residual foi expressada como uma percentagem relativa à ligação observada na ausência de anticorpo competidor.
[00265] Tabela 6: Quando adicionados como competidores, todos os anticorpos anti-c-Met foram capazes de competir pela ligação com suas contrapartes imobilizadas. 022, 058 e 5D5, quando adicionados como anticorpos competidores, competiram com anticorpos 005 e 006. Contudo, a reação inversa revelou apenas competição parcial pelos anticorpos 005 e 006. Estas diferenças podem ser explicadas pelas afinidades mais baixas de
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102/121 anticorpos 005 e 006 pela cMetECDHis biotinilada. Anticorpo 5D5, quando adicionado como anticorpo competidor, também demonstrou competição parcial com anticorpos 008 e 045, enquanto que nenhuma competição ou competição mínima foi observada na reação inversa. Em adição, anticorpos 024, 062, 064, 068 e 181, quando adicionados como anticorpos competidores, demonstraram competição parcial com anticorpo 101, enquanto que a reação inversa demonstrou inibição completa de ligação em cMetECDHis. Valores mais altos do que 100% podem ser explicados pelos efeitos de avidez e pela formação de complexos de anticorpo-cMetECDHis contendo dois anticorpos não competidores.
[00266] Anticorpos 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 e 181 competem uns com os outros pela ligação em cMetECDHis. Anticorpos 005, 006, 022 e 058 foram considerados pertencentes a um grupo de bloqueio cruzado, um grupo que é caracterizado por competição completa com 005, 006, 022, 058 e 5D5. Contudo, anticorpo 5D5 foi o único anticorpo que também foi capaz de competir pela ligação com anticorpo 045. Outro grupo de anticorpos que competem pela ligação em cMetECDHis é formado por 008, 035 e G11-HZ.
Tabela 6: Competição de anticorpos anti-c-Met pela ligação em cMetECDHis biotinilada
Anticorpo competidor
Anticorpo imobilizado 005 006 008 022 024 035 045 058
005 7,7 ±1,1 18,2 ±3,6 81,9 ±3,1 4,9 ±1,3 113,5 ±5,0 84,9 116,9 3,6
±0,2 ±7,0 ±0,1
006 11,3 ±0,9 14,6 ±0,7 58,8 ±2,2 4,6 ±0,3 113,3 ±1,0 67,5 114,5 3,6
±4,2 ±3,5 ±0,3
008 63,9 ±3,1 47,3 ±1,2 5,4 ±0,3 82,1 103,2 ±0,4 32,9 100,4 40,8
±3,0 ±1,0 ±3,8 ±0,8
022 37,9 ±3,9 60,5 ±4,0 94,1 ±3,5 3,8 ±1,2 99,4 ±4,8 92,4 95,7 5,8
±0,4 ±3,5 ±0,0
024 98,4 101,4* 104,2* 100,2* 5,4 ±0,5 108,1* 98,1* 102,8*
±10,4 ±16,7 ±12,7 ±9,0 ±5,8 ±11,9 ±12,8
035 36,7 ±1,0 33,0 7,2 ±1,7 54,6 121,4 ±27,8 10,6 125,0 18,5
±17,6 ±6,5 ±0,3 ±16,8 ±2,5
045 111,4 110,6 98,5 ±3,1 105,3 102,4 ±5,6 105,4 21,3 115,3*
±1,5 ±3,5 ±2,5 ±5,5 ±0,1 ±6,5
058 31,4 ±3,6 43,6 ±2,1 90,2 ±2,5 6,8 ±0,3 109,0 ±4,1 90,1 111,7 4,0
±5,4 ±4,9 ±0,2
062 95,8 ±5,1 95,2 ±6,8 97,4 ±5,3 94,6 7,3 ±2,9 90,6 97,0 94,4
±4,0 ±11,5 ±3,0 ±4,3
064 90,4 ±1,9 90,1* 94,6* 94,2 7,5 ±2,5 83,5 95,0 95,5
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103/121
±1,4 ±0,5 ±3,6 ±12,2 ±4,9 ±0,6
068 101,1 98,5 ±6,7 101,7 99,6 4,7 ±2,3 88,6 100,4 101,5
±7,6 ±5,5 ±4,0 ±12,7 ±9,0 ±5,1
069 102,3 100,3 102,1 97,8 6,6 ±4,1 91,7 99,8 100,6
±11,2 ±12,3 ±12,8 ±12,5 ±27,3 ±14,4 ±14,1
098 99,6 ±6,3 97,9 ±6,7 99,8 ±4,2 95,8 12,9 ±4,2 89,4 96,7 98,6
±5,4 ±20,6 ±3,7 ±2,9
101 91,5 ±7,2 89,7 ±7,9 94,0 ±6,3 90,7 40,5 ±5,4 96,7 94,7 93,1
±5,3 ±1,9 ±5,1 ±5,2
181 95,9 ±7,8 93,7 ±8,4 98,7 ±5,8 92,5 4,3 ±1,9 96,0 96,8 98,9
±7,4 ±9,6 ±6,7 ±9,8
5D5 42,3 58,8 90,2 ±9,9 12,4 94,2 ±9,7 98,1 83,9 6,6
±14,7 ±19,4 ±4,7 ±13,4 ±3,2
G11-HZ 50,5 ±7,6 47,7 ±2,9 33,3 ±0,2 54,3 98,8 ±5,6 32,8 72,0 27,6
±3,7 ±4,0 ±9,9 ±4,3
- competição >100%
- competição de 74%
- competição de 24%
Anticorpo competidor
Anticorpo imobilizado 062 064 068 069 098 101 181 5D5 G11- HZ
005 117,7 118,2 128,7 124,0 110,4 103,2 131,0 2,9 76,8
±10,7 ±7,8 ±9,5 ±8,0 ±7,6 ±5,0 ±7,7 ±0,1 ±4,4
006 118,8 122,2 128,6 124,5 110,6 105,9 123,5 3,1 54,0
±8,4 ±5,3 ±6,5 ±1,0 ±2,3 ±4,1 ±6,1 ±0,0 ±35,1
008 100,5 107,1 112,2 104,1 106,6 101,0 111,3 32,4 2,7
±2,5 ±6,2 ±5,1 ±4,4 ±2,6 ±2,5 ±1,3 ±0,8 ±0,2
022 99,4 101,9 104,1 99,6 104,8 103,6 107,1 4,2 85,9
±2,0 ±3,2 ±3,3 ±6,0 ±4,0 ±5,1 ±5,2 ±2,1 ±8,3
024 2,3 2,3 12,0 2,9 10,4 4,8 7,1 95,5 98,2*
±0,6 ±0,6 ±5,5 ±0,5 ±4,2 ±1,0 ±2,8 * ±1,3
±1,1
035 119,6 131,7 175,1 150,9 126,2 113,0 159,1 25,5 7,8
±11,2 ±20,0 ±30,2 ±24,9 ±19,9 ±4,6 ±12,9 ±9,9 ±3,2
045 103,1 103,7 113,1 97,0 76,4 101,5 99,4 27,8 99,3
±3,5 ±5,7 ±1,4 ±5,2 ±11,7 ±5,1 ±3,8 ±3,9 ±5,3
058 109,1 108,8 118,8 112,6 111,8 104,4 121,3 2,8 81,5
±4,6 ±4,4 ±4,2 ±4,0 ±6,2 ±0,8 ±3,1 ±0,4 ±8,6
062 2,4 2,2 14,2 2,9 13,2 7,8 9,4 97,7 101,3
±0,5 ±0,2 ±1,8 ±0,1 ±0,9 ±1,1 ±1,6 ±8,5 ±0,9
064 2,2 2,0 13,0 2,7 14,7 7,6 10,1 94,9 102,0
±0,6 ±0,2 ±0,9 ±0,2 ±1,2 ±0,8 ±3,0 * ±10,5
±4,6
068 2,0 2,0 6,6 2,4 8,2 4,8 5,2 94,8 110,3
±0,3 ±0,3 ±0,7 ±0,4 ±1,3 ±0,7 ±0,6 ±2,7 ±6,6
069 2,2 2,3 10,1 2,4 12,5 3,9 6,3 99,4 110,4
±0,4 ±0,5 ±2,6 ±0,7 ±3,1 ±0,5 ±1,0 ±16, 2 ±13,2
098 8,8 9,3 18,0 3,4 2,6 4,0 12,0 94,9 99,6
±0,6 ±1,3 ±2,5 ±0,6 ±0,4 ±0,6 ±2,1 ±1,2 ±1,2
101 36,9 37,4 45,9 9,5 9,7 3,7 41,9 97,2 98,3
±3,3 ±3,7 ±4,3 ±1,2 ±1,5 ±2,4 ±0,8 ±4,6 ±2,1
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104/121
181 2,0 2,1 6,5 2,2 5,1 2,4 3,6 94,2 98,7
±0,2 ±0,3 ±1,1 ±0,3 ±1,1 ±0,2 ±0,2 ±4,5 ±6,7
5D5 97,6 97,1 97,8 99,6 97,6 97,9 103,4 4,1 97,3
±8,1 ±12,7 ±6,6 ±3,9 ±4,9 ±10,6 ±4,3 ±1,5
G11-HZ 95,3 99,2 102,6 95,0 96,2 90,1 101,1 29,1 2,6
±3,1 ±0,6 ±1,3 ±8,4 ±11,8 ±6,8 ±5,2 ±9,2 ±0,4
[00267] Dados mostrados são percentagens de inibição de ligação ± o desvio padrão de 3 experimentos independentes. Para anticorpos 035, 5D5 e G11-HZ o ELISA de bloqueio cruzado foi realizado apenas duas vezes. Em adição, numerosas reações de competição (*) resultaram em valores de Densidade Óptica maiores do que 5,0, que estão acima do limite de detecção do leitor de ELISA. Estes resultados foram desconsiderados da análise resultando em medições realizadas duas vezes.
Exemplo 18: Bloqueio de ligação de HGF em cMetSEMA567His8 determinado por meio de transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvida no tempo (TR-FRET) [00268] HGF pode ser ligar no receptor de c-Met tanto no domínio SEMA quanto na região IgG. Contudo, apenas HGF ligado no domínio SEMA foi verificado como sendo crucial para a ativação de receptor. Portanto, a interação de anticorpos anti-c-Met com o domínio SEMA do receptor de c-Met foi estudada usando a tecnologia TR-FRET. Com o propósito de realizar este ensaio baseado em proximidade homogênea, fator de crescimento de hepatócito (HGF, ProSpec Tany, Rehovot, Israel) foi conjugado com um corante aceptor fluorescente; AlexaFluor-647 (Invitrogen, Breda, Países-Baixos). cMetSEMA-567His8 foi marcada com uma molécula doadora fluorescente contra a etiqueta histidina (Anti-6xhis Európio3+, PerkinElmer, Turku, Finlândia). Ligação de HGF conjugado com AlexaFluor647 na cMetSEMA-567His8 marcada com Európio3+ permite uma transferência de energia da molécula doadora (excitação a 340 nm) para a molécula aceptora (emissão a 665 nm). A intensidade fluorescente média a 665 nm foi medida no EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer). Competição de anticorpos não marcados anti-c-Met com HGF conjugado com
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AlexaFluor-647 foi medida por um decréscimo em sinal de TR-FRET a 665 nm, porque no estado não ligado, a distância entre os fluoróforos doador e aceptor é muito grande para ocorrer a transferência de energia.
[00269] Todas as diluições foram feitas em tampão de detecção 0.5x Lance (PerkinElmer) suplementado com solução de Estabilizador 2,67% (PerkinElmer) e 0,03% (v/v) de Tween-20 (Riedel de Haen, Seelze, Alemanha). 25 pL de cMetSEMA-567His8 foram adicionados em 25 pL de HGF conjugado com AlexaFluor-647, 25 pL de anti-6xhis Európio3+ e 25 pL de anticorpo não marcado anti-c-Met em uma placa opti-branco de 96 cavidades (PerkinElmer). Foi obtida uma concentração final de 2,93 pg/mL de cMetSEMA- 567His8, 0,96 pg/mL de HGF conjugado com AlexaFluor647 e 0,4 pg/mL de anti-6xhis Európio3+. Foi testada uma diluição serial quádrupla de anticorpo não marcado anti-c-Met variando de 0,49- 8.000 ng/mL. Após incubação durante a noite a 4°C no escuro, foi medida a intensidade de fluorescência média a 665 nm usando EnVision 2101 Multilabel reader aplicando as seguintes configurações: espelho dual Lance/Delfia, filtro de emissão 615-665 nm, filtro de excitação 320 nm, tempo de atraso 60 ps, janela 100 ps, 100 flashes, 2000 ps por ciclo e leitura bidirecional de fila para fila. Para determinar os valores de IC50, as curvas de ligação foram analisadas com regressão não linear (curva sigmoide de resposta à dose com inclinação variável) usando software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[00270] Figura 6 mostra as curvas de inibição de ligação de HGF dos vários anticorpos anti-c-Met para ligação em cMetSEMA_567His8 testada com TR-FRET. Exceto para os anticorpos 008, 035 e 096, todos os anticorpos foram capazes de competir com HGF conjugado com AlexaFluor-647 pela ligação em cMetSEMA-567His8. Anticorpo 022 foi capaz de inibir ~ 80% da ligação de HGF, enquanto que os anticorpos 005, 006, 024, 045, 058, 061, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181 e o anticorpo de controle positivo 5D5
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106/121 foram capazes de inibir > 90% de ligação de HGF em cMetSEMA- 567His8. Foram determinados os valores de IC50 variando de 0,082-0,623 pg/mL.
Tabela 7: Valores de IC50 (pg/mL) e percentagem de inibição de ligante de anticorpos anti-c-Met para ligação em cMetSEMA567His8 determinada com TR-FRET
mAb IC50 Inibição %
005 0,16 92
006 0,16 92
008 ND 4
022 0,37 77
024 0,39 95
035 ND 19
045 0,17 92
058 0,15 99
061 0,49 96
062 0,58 97
064 0,07 97
068 0,26 96
069 0,54 97
096 ND 16
098 0,55 98
101 0,53 96
181 0,34 93
5D5 0,2 95
[00271] Dados mostrados são MFI médio de três experimentos independentes.
Exemplo 19: Ensaio de viabilidade de KP4 [00272] Anticorpos anti-c-Met foram testados para sua capacidade para inibir a viabilidade de células KP4 (Riken BioResource Center Cell Bank, RCB1005). Células KP4, que expressam níveis altos de ambos c-Met e HGF em uma maneira autócrina, foram semeadas em uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha) (10,000 células/cavidade) em meio livre de soro (1 parte de HAM's F12K [Cambrex, East Rutherford, New Jersey] e 1 parte de DMEM [Cambrex]). Foi preparada diluição de anticorpo anti-c-Met 66,7 nM em meio livre de soro e adicionada nas células. Após incubação de 3 dias, a quantidade de células viáveis foi quantificada com azul Alamar (BioSource International, San Francisco, US)
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107/121 de acordo com a instrução do fabricante. Fluorescência foi monitorada usando o leitor EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Turku, Finlândia) com calibrações padrão com azul Alamar. O sinal de azul Alamar de células tratadas com anticorpo foi plotado como um sinal percentual em comparação com as células não tratadas.
[00273] Figura 7 mostra a inibição percentual de células KP4 viáveis após o tratamento com anticorpo anti-c-Met em comparação com células não tratadas (0%). Os clones dentro de retângulo são anticorpos que competem cruzadamente uns com os outros como descrito em Exemplo 17. Curiosamente, anticorpos 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 e 181, que pertencem ao mesmo grupo de bloqueio cruzado, foram todos capazes de inibir a viabilidade de KP4 (18-46%), tanto como IgG1 quanto como molécula UniBody. Também moléculas IgG1 de anticorpos 008, 061 e 096 foram capazes de inibir a viabilidade de KP4. Em contraposição, anticorpo 045 não inibiu a viabilidade de KP4 como IgG1 nem como molécula UniBody. Para Uni-1016-045-TE isto pode ser devido à sua afinidade aparente baixa por c-Met ligada em membrana, conforme medida por análise usando FACS (Exemplo 13). Os anticorpos IgG1 de clones 005, 006, 022 e 058 não inibiram a viabilidade de KP4 de modo significativo, enquanto que Uni-1016-022-TE, Uni-1016-058-TE e IgG1-1016-058-wtFab inibiram 57%, 38% e 44% a viabilidade de KP4, respectivamente. Uni-1016-005 e Uni1016-006 também competem cruzadamente com clones 022 e 058 mas não inibiram a viabilidade de KP4 de modo significativo. Isto pode ser devido às suas afinidades aparentes baixas conforme medidas pela análise usando FACS (Exemplo 13). Curiosamente também IgG4-1016-058 demonstrou alguma inibição da viabilidade de KP4. Isto não foi observado com IgG4-5D5.
[00274] No todo os dados indicam que para alguns grupos de bloqueio cruzado, ligação monovalente é exigida para inibir a viabilidade de KP4, enquanto que para outros grupos de bloqueio cruzado ambos anticorpos
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108/121 monovalentes e bivalentes podem inibir a viabilidade de KP4.
Exemplo 20: Modelo de tumor de xenoenxerto de KP4 em camundongos SCID [00275] Um modelo de tumor de xenoenxerto de KP4 em camundongos SCID foi realizado para determinar a eficácia de HuMabs antic-Met para inibir o crescimento de in vivo. Camundongos fêmeas SCID de onze semanas de idade, cepa C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL, foram adquiridos de Charles River Laboratories Nederland (Maastricht, Países-Baixos) e mantidos sob condições estéreis em gaiolas de topo com filtro com alimento e água fornecidos ad libitum. Microchips (PLEXX BV, Elst, Países-Baixos) foram posicionados para identificação de camundongo. Todos os experimentos foram aprovados pelo Utrecht University Animal Ethics Committee.
[00276] No dia 0, 10x106 células KP4 foram inoculadas subcutaneamente em 200 pL de PBS no flanco direito. Os camundongos foram examinados pelo menos duas vezes por semana para sinais clínicos de doença. O tamanho de tumor foi determinado pelo menos uma vez por semana. Volumes (mm3) são calculados a partir de medições por compasso de calibre (PLEXX) como 0,52 x (comprimento) x (largura)2, começando no dia
16. No dia 9, tamanhos médios de tumor foram medidos e os camundongos foram divididos em 8 grupos de 7 camundongos cada. Anticorpos anti-c-Met (008, 058, 069 e 098) foram injetados intraperitonealmente. Anticorpo G11HZ foi usado como um anticorpo de controle positivo, enquanto que 5D5 e anticorpos de controle de isótipo foram usados como anticorpos de controle negativo. Camundongos receberam uma dose de carga de 400 pg/camundongo seguida semanalmente por uma dose de manutenção de 200 pg/camundongo, durante 7 semanas.
[00277] Adicionalmente, amostras de plasma, coletadas antes da administração de 1a, 3a e 5a doses de manutenção e quanto os camundongos foram terminados, a presença de IgG de humano foi verificada usando contas
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109/121 de látex no nefelômetro BNII (Dade Behring, Atterbury, Reino Unido). [00278] Figuras 8 e 9 mostram que o crescimento de tumor de células KP4 foi inibido por HuMabs 008, 069, 098 e controle positivo G11-HZ. A inibição foi comparada com o tratamento com anticorpo de controle de isótipo. Crescimento de tumor de células KP4 foi retardado mas não completamente inibido pelo anticorpo de controle G11-HZ. Clones 069 e 098 mostraram inibição mais potente em comparação com os clones 008 e G11HZ. Anticorpos 5D5 e 058 não inibiram o crescimento de tumor. Isto esteve consistente com os dados in vitro como descrito em Exemplo 19. Considerados juntos, estes dados indicam que para alguns grupos de bloqueio cruzado anticorpos de ligação bivalentes podem inibir o crescimento de tumor de KP4.
Exemplo 21: Modelo de tumor de xenoenxerto de MKN45 [00279] Um modelo de tumor de xenoenxerto de adenocarcinoma gástrico de humano MKN45 em camundongos nus foi usado para determinar a eficácia de HuMabs anti-c-Met para inibir o crescimento de tumor in vivo. [00280] Células de adenocarcinoma gástrico de humano MKN45 foram cultivadas a 37°C e 5% de CO2 em meio RPMI-1640 contendo 100 unidades/mL de penicilina G sódica, 100 pg/mL de sulfato de estreptomicina, 25 pg/mL de gentamicina, 20% de soro fetal bovino, e 2 mM de glutamina. Foram usados camundongos nus fêmeas de sete a oito semanas de idade (nu/nu, Harlan) (pesos corporais variando de 17,0 a 26,4 g no início do estudo). Os animais foram alimentados com água e ração ad libitum. Os camundongos foram alojados sob condições de acordo com as recomendações do “Guide for Care and Use of Laboratory Animals”. O programa de uso e cuidado de animal foi credenciado por AAALAC. No dia 0, 1x10e7 células MKN45 foram inoculadas subcutaneamente em 200 pL de matrigel 50% em PBS no flanco de cada camundongo. No dia 7, os animais foram distribuídos em cinco grupos (n = 10) com um volume de tumor médio de 80 a 120 mm3 e
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110/121 tratamento foi iniciado. Anticorpos anti-c-Met (008, 058, 069) foram injetados na veia da cauda (iv). Anticorpo G11-HZ foi usado como um anticorpo de controle positivo e um anticorpo de controle de isótipo foi utilizado como um anticorpo de controle negativo. Todos os camundongos receberam 40 mg/kg de anticorpo no dia 7 e 20 mg/kg de anticorpo nos dias 14, 21, e 28.
[00281] Tumores foram medidos semanalmente usando compassos de calibre até um volume de tumor de ponto final de 700 mm3 ou até o término do estudo (dia 62). Figuras 10 e 11 mostram que o crescimento de tumor de células MKN45 foi significativamente retardado pelos anticorpos 008, 058, 069 e pelo anticorpo de controle G11-HZ comparado com o tratamento com o anticorpo de controle de isótipo.
Exemplo 22: Atividade agonística residual decrescente de anticorpos IgG1 anti-c-Met pela redução da flexibilidade conformacional [00282] O ligante natural de c-Met, HGF, é um dímero funcional que induz a dimerização de duas moléculas de c-Met. A fosforilação intracelular subsequente do domínio intracelular de c-Met resulta na ativação de várias rotas de sinalização que estão envolvidas em proliferação, invasão e sobrevivência de células. Anticorpos bivalentes contra c-Met mostram em sua maioria efeitos comparáveis como os de HGF sobre morte celular, especialmente quando os epitopos ligantes do anticorpo estão localizados próximos do ou no domínio SEMA de c-Met.
[00283] Para minimizar a atividade agonística residual potencial dos anticorpos IgG1 bivalentes, foi utilizada uma estratégia para reduzir a flexibilidade conformacional. Em uma IgG1 há um grau elevado de liberdade para os braços Fab se moverem em relação ao domínio Fc. As mudanças conformacionais maiores são o resultado da flexibilidade da articulação, que permite uma ampla faixa de ângulos Fab-Fc (Ollmann Saphire, E., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R.
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Burton e I.A. Wilson. 2002. “Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility”. J. Mol. Biol. 319: 9-18). Uma maneira para reduzir a flexibilidade do braço Fab em imunoglobulinas é evitar a formação de ligações dissulfeto entre a cadeia leve e a cadeia pesada por intermédio de modificação genética. Em um anticorpo IgG1 natural a cadeia leve está conectada covalentemente na cadeia pesada via uma ligação dissulfeto, conectando a cisteína C-terminal da cadeia leva na cisteína em posição 220 (numeração EU C220) na articulação do Fc da cadeia pesada. Quer pela mutação de aminoácido C220 para serina ou quaisquer outros aminoácidos naturais, pela remoção de C220, pela remoção da articulação completa, quer pela substituição da articulação de IgG1 por uma articulação de IgG3, é formada uma molécula na qual as cadeia leves são conectadas via suas cisteínas C-terminais, análogas à situação encontrada no isótipo de humano IgA2m(1). Isto resulta em uma flexibilidade reduzida dos Fabs em relação Fc e consequentemente capacidade de ligação cruzada reduzida, como mostrado em estudos comparativos com formatos de IgG1 e IgA2m(1) de um anticorpo agonístico anti-c-Met (5D5) em um ensaio de viabilidade de KP4 (Figura 12). [00284] Outra estratégia par reduzir a flexibilidade de uma molécula de IgG1 é substituir a articulação de IgG1 pela articulação de IgG2 ou pela articulação de IgG2-semelhante. (Dangl et al. EMBO J. 1988;7:1989-94). Esta região de articulação tem duas propriedades distintas daquela de IgG1, que consideradamente tornam as moléculas menos flexíveis. Primeiro, comparada com a articulação de IgG1 a articulação de IgG2 é de 3 aminoácidos mais curta. Segundo, a articulação de IgG2 contém uma cisteína adicional, assim serão formadas três em vez de duas pontes de dissulfeto intercadeias pesadas. Alternativamente, uma variante da articulação de IgG1 que se parece com a articulação de IgG2 pode ser introduzida. Este mutante (ΤΗ7Δ6-9) (WO2010063746) contém uma mutação T223C e duas deleções (K222 e T225) com o propósito de criar uma articulação mais curta com uma
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112/121 cisteína adicional.
Exemplo 23: Geração de moléculas de IgG1 com flexibilidade reduzida (moléculas de IgG1 enrijecidas)
Clonagem e expressão [00285] Anticorpos IgG1 mutantes foram planejados e clonados usando técnicas de biologia molecular padrão. Uma visão geral das sequências de todas as mutações de região de articulação geradas é mostrada em Tabela 8 abaixo.
Tabela 8: Sequência de aminoácidos da articulação de anticorpos IgG1 mutantes. Deleções estão marcadas com ‘-’ e mutações estão sublinhadas.
IgG1 WT EPKSCDKTHTCPPCP
IgG1 articulação-IgG2 ERKCCVE---CPPCP
IgG1 AC220 EPKS-DKTHTCPPCP
IgG1 AC22S EPKSSDKTHTCPPCP
IgG1 TH7A6-9 EPKSCD-CH-CPPCP
IgG1 com articulação deletada (Uni-IgG1) --------------------------IgG1 articulação- ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP
IgG3 [00286] Para a expressão dos anticorpos IgG1 enrijecidos resultantes em células de mamífero, a região constante de HC de IgG1, contendo mutações na região de articulação (veja acima a Tabela 8), foi sintetizada como um construto códon-otimizado em vetor de expressão de mamífero pcDNA3.3 (Invitrogen). Um vetor separado foi construído pela inserção da região constante códon-otimizada da região de cadeia leve kappa de humano em pcDIMA3.3. Regiões VH e VL de clone 069 e anticorpo de controle 5D5 foram inseridas no plasmídeo constante de HC e plasmídeo de cadeia leve Kappa respectivamente resultando em vetores para a expressão das cadeias leve e pesada (mutada) dos anticorpos específicos. Cotransfecção dos vetores de cadeia pesada e leve de um anticorpo específico em células HEK-293F (Invitrogen), resultou na produção transiente de anticorpos mutantes. Purificação dos anticorpos foi realizada usando cromatografia em coluna de afinidade por Proteína A (como descrito em Exemplo 11).
Caracterização bioquímica
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Expressão transiente [00287] Todos os mutantes foram expressados em níveis suficientes e não mostraram formação aberrante de multímeros como determinada por MS (pureza > 99%) e SDS-PAGE.
[00288] Os resultados de SDS-PAGE são mostrados em Figura 13. Nos mutantes C220 (C220S e AC220) e as variantes de IgG1 com articulação deletada (as variantes de IgG1 com articulação deletada também são chamadas de UniBody-IgG1 ou Uni-IgG1) foi observado pareamento de cadeia leves, visível como uma banda de proteína de cerca de 50 kD em análise SDS-PAGE não reduzida. A variante com uma articulação de IgG3 também mostrou pareamento de cadeia leves, enquanto que a variante com uma articulação de IgG2 e a mutante IgG1 ΤΗ7Α6-9 mostraram pareamento normal de cadeias leve-pesada.
Exemplo 24: Propriedades de ligação em c-Met dos mutantes [00289] Propriedades de ligação em c-Met dos mutantes foram testadas em um ELISA. Cavidades de placa de ELISA foram revestidas durante a noite a 4°C com rhHGF R/Fc Chimera (R&D Systems; Cat.358MT/CF) em PBS (1 pg/mL). A seguir, as cavidades foram lavadas com PBST (PBS suplementada com 0,05% de Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, PaísesBaixos]) e bloqueadas por uma hora na temperatura ambiente (RT) com PBSTC (PBST suplementada com de 2% [v/v] de soro de galinha [Gibco, Paisley, Escócia]). Subsequentemente, as cavidades foram lavadas com PBST e incubadas por uma hora na RT com os anticorpos anti-cMet e variantes serialmente diluídos em PBSTC (10 pg/mL em diluições quádruplas). Anticorpo não ligado foi removido por lavagem com PBST, e anticorpo ligado no revestimento foi detectado por incubação por uma hora na RT com anticorpo de cabra anti-IgG F(ab')2-HRP de humano diluído em PBST (Jackson, número de catálogo 109-035-097). Após a lavagem, a reação foi
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114/121 visualizada por uma incubação de 15 min com ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS: diluir um tablete de ABTS em 50 mL de tampão ABTS [Roche Diagnostics, Almere, Países-Baixos]) na RT protegido da luz. A coloração foi interrompida pela adição de um volume igual de ácido oxálico (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países-Baixos). Fluorescência a 405 nm foi medida em uma leitor de placa de microtitulação (Biotek Instruments, Winooski, USA). Todos os mutantes ligaram com afinidades aparentes comparáveis (EC50) em c-Met (Figura 14). Tabela 10 mostra os valores de EC50 dos mutantes obtidos neste experimento.
Tabela 9: Os valores de EC50 conforme determinados por ELISA
IgG1- 1016- 069 IgG1- 1016069- AC220 IgG1- 1016069C220S IgG11016- 069articulaç ão IgG2 IgG21016069 IgG1- 1016- 069 ΤΗ7Α6- 9 Uni1016069- TE IgG1- 1016- 069 IgG1- 1016069articula ção IgG3 Uni- IgG1- 1016069
EC50 (ng/mL) 49.5 18.87 15.56 23.03 29.61 18.81 30.08 45.43 14.18 15.39
Exemplo 25: Efeito agonístico reduzido de anticorpos IgG1 enrijecidos anti-c-Met
Fosforilação de receptor [00290] Para determinar as propriedades agonísticas dos anticorpos enrijecidos foi realizado o feito dos anticorpos sobre a fosforilação de c-Met. Com a dimerização de dois receptores c-Met adjacentes quer por ligante natural HGF quer por anticorpos principalmente bivalentes, três resíduos de tirosina (posições 1230, 1234 e 1235) no domínio intracelular de c-Met são cruzadamente fosforilados, o que é seguido por fosforilação subsequente de vários outros aminoácidos do domínio intracelular e pela ativação de numerosas cascatas de sinalização. As dimerização e ativação de c-Met podem ser portanto monitoradas pelo uso de anticorpos específicos para o receptor fosforilado nestas posições, e assim usados como uma leitura para o agonismo potencial dos anticorpos anti-c-Met.
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115/121 [00291] Células A549, CCL-185 obtidas de ATCC, foram crescidas em meio DMEM contendo soro até que fosse alcançada a confluência de 70%. Após tripsinização e lavagem as células foram plaqueadas em uma placa de cultura de 6 cavidades a 1*106 células / cavidade em meio de cultura contendo soro. Após incubação durante a noite as células foram tratadas quer com HGF (R&D systems; número de catálogo 294- HG) (50 ng/mL) quer com o painel de anticorpos (30 pg/mL) e incubadas por 15 minutos a 37°C. As células foram então lavadas duas vezes com PBS gelada e lisadas com tampão de lise (Cell Signaling; número de catálogo 9803) suplementado com um coquetel de inibidores de protease (Roche; número de catálogo 11836170001) e as amostras foram armazenadas a -80°C. Ativação de receptor foi determinada por medição da fosforilação por meio de Western blot usando anticorpos específicos para fosfo-c-Met. As proteínas no lisado de células foram separadas sobre um gel de SDS-PAGE 4-12% e transferidas para membrana de nitro-celulose que foi subsequentemente corada com anticorpo específico para c-Met fosforilada (Y1234/1235) (Cell Signaling, número de catálogo 3129). Para controlar o carregamento do gel, foram usados anticorpos contra c-Met e beta-actina total. Resultados das Western blots são mostrados em Figura 15.
[00292] Células e controles em meio de cultura de tecido tratados com o formato monovalente UniBody de anticorpo 5D5 não mostraram fosforilação do receptor. Em contraposição, análise por Western blot de células tratadas com o controle positivo HGF ou anticorpo agonista IgG11016-058 mostraram uma banda evidente na altura esperada. Anticorpo IgG11016-069 mostrou fosforilação de receptor baixa, porém detectável indicando que ocorre alguma ligação cruzada do receptor. Contudo, variantes que foram planejadas para reduzir a flexibilidade da molécula de anticorpo mostraram mínima ativação de receptor, abaixo de um nível comparável aos níveis detectados em células tratadas com controle monovalente Uni-5D5-TE.
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116/121 (Figura 15).
Efeito de anticorpos anti-c-Met sobre proliferação de NCIH441 in vitro [00293] A atividade agonística proliferativa potencial de anticorpos anti-c-Met foi testada usando linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão NCI-H441 (ATCC, HTB-174™), que expressa níveis altos de c-Met, mas não produz seu ligante HGF. Células NCI-H441 foram semeadas em uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha) (5.000 células/cavidade) em RPMI (Lonza) sem soro. Diluições de anticorpo anti-c-Met (66,7 nM) foram preparadas em RPMI sem soro e adicionadas nas células. Após incubação de 7 dias a 37°C/5% de CO2, a quantidade de células viáveis foi quantificada com azul Alamar (BioSource International, San Francisco, US) de acordo com a instrução do fabricante. Fluorescência foi monitorada usando o leitor EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Turku, Finlândia) com calibrações com azul Alamar padrão.
[00294] Como aparece da Figura 17 a proliferação das células NCIH441 foi fortemente induzida pelos mAbs de controle agonísticos IgG1-058 e IgG1-5D5. Anticorpo IgG1-1016-069 também mostrou algum efeito agonístico em comparação com as células tratadas com o controle de isótipo. A atividade agonística de IgG1-1016-069 poderia ser completamente removida pela introdução dos mutantes-C220 C220S e -del, e parcialmente pelas variantes com a articulação de ΤΗ7Δ6-9 e IgG2 ou a estrutura principal de IgG2. Amostras de controle tratadas com o controle de isótipo e a versão monovalente de 5D5 (Uni-5D5-TE) não induziram crescimento das células.
Ensaio de viabilidade de KP4 [00295] A capacidade para inibir células dependentes de HGF também foi determinada para os mutantes de anticorpo anti-c-Met em um ensaio de viabilidade de KP4(veja Exemplo 19 para procedimentos experimentais). Os
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117/121 resultados são mostrados em Figura 17. A eficácia dos mutantes baseados em IgG1-1016-069 foi completamente retida ou foi um pouco melhor nos mutantes de C220. Notavelmente, mutação de C220 no anticorpo agonístico 5D5 resultou em uma redução notável da viabilidade de KP4. Não foram observados efeitos agonísticos dos anticorpos 058 e 5D5 em formato IgG1 devido à expressão elevada de HGF por KP4 (alça autócrina de HGF).
Inframodulação [00296] Inframodulação de c-Met induzida por anticorpos antagonísticos representa um mecanismo de ação de anticorpos anti-c-Met terapêuticos. Consequentemente, em uma modalidade são desejáveis anticorpos com propriedades agonísticas reduzidas, mas com capacidade retida para induzir inframodulação de c-Met. Para determinar a inframodulação potencial dos anticorpos, células A549 (CCL-185 obtidas de ATCC) foram semeadas em placas de cultura de tecido de 6 cavidades (500.000 células/cavidade) em meio de cultura de células contendo soro e cultivadas durante a noite a 37°C. Na manhã seguinte, os anticorpos anti-cMet foram adicionados em uma concentração final de 10 pg/mL e a placa foi incubadas por mais 2 horas a 37°C. Após lavagem com PBS, células foram lisadas por incubação por 30 min na temperatura ambiente com 250 pL de tampão de Lise (Cell Signaling, Danvers, EUA). Níveis totais de proteína foram quantificados usando reagente ácido bicinconínico (BCA) de ensaio de proteína (Pierce) seguindo o protocolo do fabricante. Níveis de proteína c-Met em lisados celulares foram quantificados usando um ELISA-sanduíche específico para c-Met. Para este fim, cavidades das placas de ELISA foram revestidas durante a noite a 4°C com anticorpo de cabra anti-c-Met de humano direcionados contra o domínio extracelular de c-Met (R&D systems), diluído com PBS (1 pg/mL). A seguir, as cavidades foram lavadas com PBST (PBS suplementada com 0,05% de Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países-Baixos]) e bloqueadas por uma hora na RT com PBSTC (PBST
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118/121 suplementada com 2% [v/v] de soro de galinha [Gibco, Paisley, Escócia]). Lisados celulases não diluídos foram adicionados (100 pL) e incubados por uma hora na RT. Após lavagem com PBST, as cavidades foram incubadas por uma hora na RT com um anticorpo de camundongo direcionado contra o resíduo de Tirosina-1234 intracelular de c-Met de humano (Cell Signaling), diluído 1:1.000 em PBSC. As cavidades foram lavadas de novo com PBST e incubadas por uma hora na RT com um anticorpo de cabra anti-Fc-HRP de camundongo (Jackson) diluído 1:5.000 em PBSC. Após lavagem com PBST, a reação foi visualizada por uma incubação de 30 minutos com ácido 2,2’azino-bis (3-etil-benzotiazolina-6- sulfônico) (ABTS: diluir um tablete de ABTS em 50 mL de tampão ABTS [Roche Diagnostics, Almere, PaísesBaixos]) na RT protegido da luz. A coloração foi interrompida pela adição de um volume igual de ácido oxálico (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, PaísesBaixos). Fluorescência a 405 nm foi medida em um leitor de placa de microtitulação (Biotek Instruments, Winooski, USA). Como aparece da Figura 18 todos os mutantes de anticorpo 069 foram capazes de induzir inframodulação.
Exemplo 26: Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) [00297] Células MKN45 (adquiridas de RIKEN BioResource Center, Tsukuba, Japão, RCB1001) foram colhidas (5x106 células), lavadas (duas vezes em PBS, 1.500 rpm, 5 min) e colhidas em 1 mL de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino cosmic (CCS) (HyClone, Logan, UT, EUA), no qual foram adicionados 200 pCi 51Cr (Cromo-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Países-Baixos). A mistura foi incubada em um banho de água agitado por 1,5 horas a 37°C. Após lavagem das células (duas vezes em PBS, 1.500 rpm, 5 min), as células foram ressuspensas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de CCS, contadas por exclusão de azul de tripano e diluídas para uma concentração de 1x105
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119/121 células/mL.
[00298] Entrementes, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas de leucócitos novas (Sanquin, Amsterdam, Países-Baixos) usando centrifugação por densidade em Ficoll padrão de acordo com as instruções do fabricante (meio de separação de linfócitos; Lonza, Verviers, França). Após ressuspensão de células em meio RPMI 1640 suplementado com10% de CCS, as células foram contadas por exclusão de azul de tripano e concentradas para 1x107 células/mL.
[00299] Para cada experimento de ADCC, 50 pL de células MKN45 marcadas com 51Cr (5.000 células) foram pré-incubados com 15 pg/mL de anticorpo anti-cMet em um volume total de 100 pL de meio RPMI suplementado com 10% de CCS em uma placa de microtitulação de 96 cavidades. Após 15 min na RT, 50 pL de PBMCs (500.000 células) foram adicionadas, resultando em uma proporção de célula efetora para célula alvo de 100:1. A quantidade máxima de lise de célula foi determinada pela incubação de células MKN45 marcadas com 51Cr (5.000 células) com 100 pL de Triton-X100 5%. A quantidade de lise espontânea foi determinada por incubação de 5.000 células MKN45 marcadas com 51Cr em 150 pL de meio, sem anticorpo ou células efetoras. O nível de lise de célula independente de anticorpo foi determinado por incubação de 5.000 células MKN45 com 500.000 PBMCs sem anticorpo. Subsequentemente, as células foram incubadas 4 horas a 37°C, 5% de CO2. As células foram centrifugadas (1.200 rpm, 3 min) e 75 pL de sobrenadante foram transferidos para tubos micronic, após o qual o 51Cr liberado foi contado usando um contador gama. As contagens por minuto (cpm) medidas foram usadas para calcular a percentagem de lise mediada por anticorpo como segue:
[(cpm de amostra - cpm de lise independente de Ab)/(cpm de lise máxima - cpm de lise espontânea)]x 100%
Várias publicações têm demonstrado a correlação entre a
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120/121 fucosilação de núcleo reduzida e a atividade de ADCC intensificada in vitro (Shields RL. 2002 JBC; 277:26733-26740, Shinkawa T. 2003 JBC; 278(5):3466-3473). Figura 19 demonstra que o anticorpo 069 does não induz lise de células MKN45 por meio de ADCC. Contudo quando fucosilação de núcleo foi reduzida devido à presença de kifunensina durante a produção de mAb em células HEK, anticorpo 069 foi capaz de induzir mais do que 30% de lise de células MKN45. Além disso, lise já foi observada em concentrações de anticorpo abaixo de 0,01 pg/mL. Valores mostrados são as percentagens máximas médias de liberação de 51Cr ± o desvio padrão de um experimento de ADCC representativo in vitro ADCC com células MKN45. 069 baixo em fucose foi produzido em células HEK 293 na presença de kifunensina, resultando em uma fucosilação de não núcleo de ~99,5% (i.e. ausência de fucose). 069 alto em fucose foi produzido em células HEK 293 sem kifunensina, resultando em fucosilação de não núcleo de ~2,11%, como determinado com cromatografia de troca aniônica de desempenho alto acoplada com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) (dados não mostrados).
Exemplo 27: Falta de ligação de anticorpos anti-c-Met em células de sangue periférico de humano [00300] Com o propósito de solucionar a ligação de clone 069 em três tipos de células (células-B, monócitos e granulócitos) presentes em sangue periférico foi realizado um ensaio de ligação usando FACS. Clone 069 fluorescentemente marcado foi usado para permitir medição direta em FACS sem o uso de anticorpos de detecção secundários. A população de células no sangue foi identificada no ensaio usando anticorpos comerciais fluorescentes contra marcadores específicos sobre as células de interesse.
[00301] Sangue periférico de voluntários saudáveis (University Medical Center Utrecht) foi diluído dez vezes em tampão FACS (PBS + 0,4% de BSA + 0,02% de NaN3) e incubado com anticorpos anti-c-Met conjugados
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121/121 com Alexa488 e anticorpos anti-CD19, -CD16 e -CD14 conjugados com FITC (concentração final de 10 pg/mL) e anticorpos anti-CD19, -CD16 e -CD14 marcados com ficoeritrina (PE) (BD Biosciences, San Jose CA) para identificar populações de células (resp. células B, granulócitos e monócitos) em um volume final de 100 pL. Após 30 minutos a 4°C, as amostras foram centrifugadas (300 g, 3 min), o sobrenadante foi removido, eritrócitos foram lisados por incubação (10 min, 4°C) com 200 pL de solução de lise-Ery (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM [pH 7,4]), e amostras foram lavadas duas vezes em tampão FACS. Amostras foram ressuspensas em 100 pL de tampão FACS e analisadas usando um FACS Canto II (BD Biosciences).
[00302] Figura 20 é uma plotagem de FACS representativa que demonstra que 069 conjugado com Alexa488 não se liga em população de células B (células CD19-PE+ dentro da porta de linfócito). Ligação de rituximab conjugado com Alexa488 foi usada como controle positivo. Ligação em outras populações de células foi analisada similarmente e resultados representativos para 1 de 3 doadores também são plotados em Figura 21. Anticorpo 069-Alexa488 não se ligou em células B, monócitos ou granulócitos, enquanto que os anticorpos de controle positivo demonstraram ligação específica.

Claims (29)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que se liga em uma c-Met de humano, em que o anticorpo compreende:
    a) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e
    3 de SEQ ID NO:34, 35 e 36 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:38, 39 e 40, (024), ou
    b) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e
    3 de SEQ ID NO:74, 75 e 76 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:78, 79 e 80, (062), ou
    c) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e
    3 de SEQ ID NO:82, 83 e 84 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:86, 87 e 88, (064), ou
    d) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e
    3 de SEQ ID NO:90, 91 e 92 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:94, 95 e 96, (068), ou
    e) uma região VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e
    3 de SEQ ID NO:98, 99 e 100 e uma região VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:102, 103 e 104, (069), ou
    f) uma região de VH compreendendo as sequências de CDR1,
  2. 2 e 3 de SEQ ID NO:130, 131 e 132 e uma região de VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:134, 135 e 136, (181)
    g) uma região de VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:114, 115 e 116 e uma região de VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 118, 119 e 120 (098), ou
    h) uma região de VH compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:122, 123 e 124 e uma região de VL compreendendo as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:126, 127 e 128 (101).
    2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender:
    Petição 870190140759, de 27/12/2019, pág. 9/18
    2/7
    a) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 33 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 37 (024)
    b) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 77 (062)
    c) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 85 (064)
    d) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 89 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 93 (068)
    e) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 97 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 101 (069)
    f) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:
    113 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 117 (098)
    g) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 121 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 125 (101)
    h) uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 129 e uma região VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 133 (181); ou
    i) uma variante de qualquer um de ditos anticorpos, sendo que dita variante preferivelmente tem no máximo 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tais como substituições de aminoácido conservativas em ditas sequências.
  3. 3. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se no domínio SEMA de
    Petição 870190140759, de 27/12/2019, pág. 10/18
    3/7 c-Met, preferivelmente em que o anticorpo é capaz de inibir a ligação de HGF no domínio SEMA com uma IC50 de menos do que 10 pg/mL, tal como menos do que 2 pg/mL.
  4. 4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se em células A431 com uma EC50 de 10 nM ou menos, tal como uma EC50 de 2 nM ou menos.
  5. 5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo bivalente.
  6. 6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se em c-Met com uma constante de afinidade (KD) de 20 nM ou menos, tal como uma afinidade de 5 nM ou menos.
  7. 7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a ligação de HGF no domínio extracelular de c-Met, preferivelmente em que o anticorpo inibe a ligação em mais do que 40%, tal como mais do que 50%, p. ex., mais do que 60%, p. ex., mais do que 70%, p. ex., mais do que 80%, p. ex., mais do que 90%.
  8. 8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a viabilidade de células KP4, preferivelmente em que o anticorpo é capaz de inibir a viabilidade em mais do que 10%, tal como mais do que 25%, p. ex., mais do que 40%.
  9. 9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total, preferivelmente um anticorpo IgG1, em especial um anticorpo IgG1,K.
  10. 10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações
    Petição 870190140759, de 27/12/2019, pág. 11/18
    4/7 precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo está conjugado em outro grupo, tal como um grupo citotóxico, um radioisótopo ou uma droga.
  11. 11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo deficiente em função efetora, p. ex., um anticorpo IgG4 estabilizado de humano, tal como um anticorpo no qual arginina na posição 409 na região constante de cadeia pesada de IgG4 de humano está substituída por lisina, treonina, metionina, ou leucina, preferivelmente lisina e/ou no qual a região de articulação compreende uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys.
  12. 12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monovalente.
  13. 13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monovalente compreende:
    (i) uma região variável de um anticorpo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 ou uma parte que se liga ao antígeno da dita região, e (ii) uma região CH de uma imunoglobulina ou um fragmento do mesmo compreendendo as regiões CH2 e CH3, em que a região CH ou fragmento do mesmo foi modificado de tal modo que a região correspondente à região de articulação e, se a imunoglobulina não é um subtipo IgG4, outras regiões da região CH, tal como a região CH3, não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos que sejam capazes de formar ligações dissulfeto com uma região CH idêntico ou outras ligações covalente ou não-covalente estáveis inter-cadeias pesadas com uma região CH idêntica na presença de um IgG policlonal humano.
  14. 14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo foi modificado para torná-lo menos flexível, tal como por mutações em região de articulação.
  15. 15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado
    Petição 870190140759, de 27/12/2019, pág. 12/18
    5Π pelo fato de que o anticorpo é do subtipo IgG1, e no qual a região de articulação tem sido modificada por:
    (i) deleção da região de articulação da sequência EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 213) e sua substituição pela região de articulação de IgG2 da sequência: ERKCCVECPPCP (IgG1 articulaçãoIgG2) (SEQ ID NO: 214);
    (ii) deleção da posição 220 de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 AC220) (SEQ ID NO: 215);
    (iii) substituição da cisteína em posição 220 por qualquer outro aminoácido natural (X) de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSXDKTHTCPPCP (IgG1 C220X) (SEQ ID NO: 216);
    (iv) deleção da região de articulação de sequência
    EPKSCDKTHTCPPCP (UniBody IgG1) (SEQ ID NO: 213);
    (v) deleção da região de articulação da sequência
    EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 213) e sua substituição pela região de articulação de IgG3 da sequência
    ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDT PPPCPRCP (IgG1 articulação-IgG3) (SEQ ID NO: 217); ou (vi) substituição de treonina em posição 223 por cisteína, e deleção de lisina em posição 222 e treonina em posição 225, de modo que a região de articulação tenha a sequência de EPKSCDCHCPPCP (IgG1 ΤΗ7Α6-9) (SEQ ID NO: 218).
  16. 16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a região de articulação foi modificada pela substituição de cisteína na posição 220 por serina de modo que a região de articulação modificada tem a sequência de EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S) (SEQ ID NO: 219).
  17. 17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo foi modificado para
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    6/7 reduzir a fucosilação em núcleo abaixo de 10%, tal como abaixo de 5%, como determinada por cromatografia de troca aniônica de desempenho alto acoplada com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD).
  18. 18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico, compreendendo um sítio de ligação de c-Met, como definido em qualquer uma das reivindicações precendentes, e um segundo sítio de ligação de antígeno tendo uma especificidade de ligação diferente.
  19. 19. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o segundo sítio de ligação de antígeno tem uma especificidade de ligação para uma célula efetora de humano, um receptor Fc de humano, um receptor de célula B ou um epítopo de não sobreposição de c-Met.
  20. 20. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que codifica as regiões VH e VL de um anticorpo como definido na reivindicação
    2.
  21. 21. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos como definido na reivindicação 20, sendo que o vetor adicionalmente codifica uma região constante operativamente ligada de uma cadeia leve, região constante de uma cadeia pesada ou de ambas cadeias leve e pesada de um anticorpo.
  22. 22. Célula hospedeira procariótica recombinante, caracterizada pelo fato de produzir um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
  23. 23. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  24. 24. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.
  25. 25. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações
    Petição 870190140759, de 27/12/2019, pág. 14/18
    7/7
    1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de câncer, tal como um câncer dependente de HGF ou um câncer independente de HGF.
  26. 26. Método para produzir um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que dito método compreende as etapas de
    a) cultivar uma célula hospedeira como definida na reivindicação 22, e
    b) purificar o anticorpo do meio de cultura.
  27. 27. Método para detectar a presença de c-Met em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender:
    - contatar a amostra com o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e c-Met; e
    - analisar se um complexo foi formado.
  28. 28. Kit para detectar a presença de c-Met em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender:
    - um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19; e
    - instruções para uso do kit.
  29. 29. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratamento de câncer.
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