CN112513281A - 抗肿瘤组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够共表达白介素12的溶瘤腺病毒和抑制C‑met的寡核苷酸；以及包括所述溶瘤腺病毒的抗肿瘤免疫推进组合物和抗癌组合物。本发明首先标识了在癌症基因治疗中具有IL‑12表达和C‑met抑制的同时作用的腺病毒***。本发明的所述腺病毒***能够在表达白介素12的同时抑制C‑met，从而在肿瘤环境中恢复免疫功能以增强抗癌作用，诸如肿瘤复发和肿瘤生长的所述抑制，并且抑制肿瘤迁移。因此，本发明的所述腺病毒***可以被有效地用于癌症的所述治疗。

Description

抗肿瘤组合物
技术领域
本发明涉及一种用于抗肿瘤或增强抗肿瘤免疫的组合物，其包括共表达白介素12(IL-12)的重组腺病毒和抑制酪氨酸激酶Met(C-met)表达的核酸分子。
背景技术
肿瘤免疫疗法是通过增强人体的整体免疫功能并通过其***来诱导针对肿瘤的免疫应答的方法。肿瘤免疫疗法的研究正在积极进行中。然而，免疫抑制环境几乎总是在生成癌症的阶段形成，因此，即使人体的免疫***正在积极起作用，也难以轻易地去除肿瘤。肿瘤细胞本身表达许多异常抗原。这些抗原通过免疫监视引起根除反应，即使人体的免疫***活跃，也允许肿瘤细胞逃避免疫监视。另外，已经发现该现象是由肿瘤细胞产生的各种因素介导的。据报道，肿瘤组织可以产生免疫抑制分子，诸如血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤生长因子(TGF)-β和白介素(IL)-10，并且调节性T细胞穿透免疫抑制的肿瘤。进一步地，活化的T细胞对称为PD-1的抑制性受体表达的刺激持续增加，并且在癌细胞的情况下，大量表达作为与PD-1特异性结合的配体的PD-L1，以使活化的T细胞失活以避免免疫应答，从而在肿瘤中产生免疫抑制微环境和免疫耐受性。
最近的研究证明，抑制T细胞活性所涉及的能够抑制PD-1的免疫检查点的抑制剂诱导了强烈的抗肿瘤免疫应答。因此，克服免疫监视避免是免疫疗法的主要策略。因此，作为克服这些限制的方式，积极地进行将具有免疫促进作用的细胞因子基因直接引入癌细胞中以从癌细胞中产生和分泌细胞因子并因此通过诱导抗肿瘤免疫应答来特异性地消除癌细胞的研究。在迄今为止已经报道了抗肿瘤作用的免疫增强细胞因子基因中，白介素12(IL-12)是最有效且最有前景的细胞因子之一。
作为包含通过二硫键连接的40kDa和35kDa亚基的异二聚体蛋白，白介素12(IL-12)是从抗原呈递细胞(APC)分泌的，诸如活化的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和活化的B淋巴细胞，并且直接作用于T细胞和NK细胞，其可以有效地消除癌细胞以激活T细胞和NK细胞并诱导IFN-γ的分泌，以及增强T细胞和NK细胞对癌细胞的杀伤能力。IL-12的局部表达使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性敏感，从而抑制肿瘤生长并建立全身免疫。
然而，IL-12的临床应用存在困难，因为IL-12的施用可能会引起全身细胞因子关联的毒性，从而限制了患者的可接受剂量。另外，由于IFN-γ和TNF-β表达减少，会导致免疫作用的整体下调，患者血清中的IL-10表达增加以及从Th1免疫到Th2免疫的IL-12极化。因此，有时会重复施用IL-12。这些临床结果表明IL-12作为单一疗法治疗癌症的限制。
最近，关于生长因子及其受体作为反映恶性肿瘤程度的生物学指标的研究正在进行中。其中，关于酪氨酸激酶受体家族成员C-met的研究正在积极进行中。C-met充当肝细胞生长因子/散射因子(HGF/SF)的受体，并在多种癌症中过表达。C-met过表达的大多数患者癌症治疗预后较差。
C-met的过表达由于HGF/SF-Met信号***而增强了有丝***和细胞运动，抑制了细胞凋亡，形成了血管，并诱导了进入细胞外基质(ECM)的侵袭和迁移，即，引起恶性肿瘤的增加。由于由C-met的过表达诱导的癌细胞的快速增殖和迁移超过了免疫***中癌细胞的去除速率，因此难以通过免疫应答消除癌细胞。此外，由于随着肿瘤大小的增大，肿瘤微环境中免疫应答的中心严重倾向于抑制，因此使用单一疗法更难控制肿瘤细胞，并且通过抗肿瘤免疫疗法无法改善抗肿瘤作用。
因此，开发不具有依赖于剂量等的副作用的抗癌疗法，同时通过提高抗肿瘤免疫而具有更好的抗癌作用仍然是本领域中要解决的任务。
发明内容
技术问题
因此，鉴于上述问题提出了本发明，并且本发明人试图开发能够减小剂量同时具有优异的抗肿瘤作用的治疗靶，并提出了一种可以通过使用治疗靶向IL-12和C-met的组合更有效地治疗癌症的方法。与仅单独使用每种治疗靶的情况相比，本发明人证实了通过使用能够在癌症的治疗中表达白介素12的同时抑制C-met过表达的腺病毒，可以抑制肿瘤并克服免疫监视避免以在治疗癌症时获得协同作用，从而完成本发明。
在整个本说明书中，引用了许多论文和专利文件并指示了引证。所引证的论文和专利文件的公开内容通过引用整体地并入到本说明书中，从而更清楚地描述了本发明所属的技术领域的水平和本发明的内容。
技术方案
根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供一种基因传递***来实现，包括白介素12(IL-12)编码基因；以及表达寡核苷酸的基因，该寡核苷酸与C-met的mRNA互补以抑制C-met表达。
根据本发明的另一方面，提供了一种包括基因传递***的药物组合物，该基因传递***包括：白介素12(IL-12)编码核酸序列；以及表达与C-met基因互补结合并抑制C-met表达的寡核苷酸的核酸序列。
基因传递***可以是腺病毒***，并且腺病毒***可以是重组腺病毒或重组腺病毒DNA。
药物组合物可以是抗癌组合物或用于增强抗肿瘤免疫的组合物。
有益效果
根据本发明的共表达白介素12和C-met表达抑制核酸分子的腺病毒***可以在肿瘤环境中恢复免疫功能，以显着增强抗癌作用，诸如肿瘤重塑和迁移抑制以及肿瘤生长抑制。具体地，由于两种治疗基因的共表达，腺病毒***可以在癌症的治疗中提供显着的协同作用。
附图说明
图1图示了根据本发明的实施例构建的腺病毒质粒DNA的结构。
图2图示了根据本发明的实施例构建的腺病毒质粒DNA可以在细胞中表达小鼠白介素12(mIL-12)或人类白介素12(hIL-12)。
图3图示了根据本发明的实施例构建的腺病毒增加白介素12(IL-12)的表达并抑制C-met的表达。
图4图示了共表达根据本发明的实施例构建的IL-12和shc-met的抗癌腺病毒结构。
图5a和5b分别图示了在小鼠来源的B16-F10和CT26细胞中共表达根据本发明的实施例的IL-12和shc-met的抗癌腺病毒的体内抗肿瘤作用。
图6图示了在小鼠来源的B16-F10细胞中共表达根据本发明的实施例的IL-12和shc-met的抗癌腺病毒pDNA/PPA复合物的体内抗肿瘤作用。
图7a和7b图示了在人肺癌细胞系H1975中共表达根据本发明的实施例的IL-12和shc-met的抗癌腺病毒的体内IL-12表达(图7a)和体内C-met表达抑制能力(图7b)。
图8a和8b图示了在常氧条件(8a)和低氧条件(8b)下在人肺癌细胞系H1975中表达根据本发明的实施例的IL-12和/或shc-met的抗癌腺病毒的癌细胞杀伤能力。
图9a、9b、9c和9d图示了根据本发明的实施例的表达IL-12和/或shc-met的抗癌腺病毒的HUVEC细胞迁移(9a和9b)和侵袭(9c和9d)抑制作用。
图10图示了根据本发明的实施例的通过表达IL-12和/或shc-met的抗癌腺病毒在HUVEC细胞中通过内皮向间质转化(Endo-MT)抑制来抑制肿瘤细胞迁移。
图11图示了根据本发明的实施例的在人类异种移植肿瘤模型(H1975)中通过表达IL-12和/或shc-met的抗癌腺病毒的抗肿瘤作用。
图12示意性地图示了根据本发明的实施例的共表达IL-12的基因传递***和包括C-met-靶向的指导RNA的CRISPR/Cas***的结构。
图13a、13b和13c图示了根据本发明的实施例的通过共表达IL-12和Lbcpf1-crMET的抗癌病毒的细胞间IL-12表达作用(13a)和C-met抑制作用(13b和13c)。
图14图示了根据本发明的实施例的在人类异种移植肿瘤模型(H1975)中共表达IL-12和Lbcpf1-crMET的抗癌病毒的抗肿瘤作用。
具体实施方式
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种基因传递***，其包括白介素12(IL-12)编码基因；以及表达与C-met基因互补结合以抑制C-met表达的寡核苷酸的基因。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种包括基因传递***的抗癌组合物，该***包括白介素12(IL-12)编码基因；以及表达与C-met基因互补结合以抑制C-met表达的寡核苷酸的基因；包括基因传递***的用于癌细胞的抗转移组合物；或包括基因传递***的用于增强抗肿瘤免疫的药物组合物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了基因传递***的用途，该***包括白介素12(IL-12)编码基因；以及表达寡核苷酸作为抗癌剂的基因，该寡核苷酸与C-met基因互补结合以抑制C-met的表达。
根据本发明的再一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括施用基因传递***，该***包括白介素12(IL-12)编码基因；以及表达与C-met基因互补结合以抑制C-met表达的寡核苷酸的基因，或者包括向受试者的基因传递***的药物组合物。
在本发明中，术语“基因传递***”是指用于将基因传递到细胞中的载体***。在本发明中，除非另有规定，否则基因传递***、腺病毒载体、腺病毒***或腺病毒载体***具有相同的含义。本发明的腺病毒***包括腺病毒和腺病毒的DNA(病毒DNA)。优选地，腺病毒***可以是用于增强抗癌或抗肿瘤免疫的重组腺病毒或重组腺病毒DNA。
腺病毒***可以包括腺病毒的基因组序列，使得通过腺病毒或传递到细胞中的重组DNA生成腺病毒，从而具有抗癌或抗肿瘤免疫作用。在本发明中，由于分别表达IL-12和shc-met的基因可以***到腺病毒基因组中并且可以以腺病毒本身或其重组DNA的形式传递到细胞，所以除非另有说明，否则在本发明的整个本说明书中，腺病毒既包括重组腺病毒，又包括重组腺病毒DNA。
根据本发明的优选实施例，本发明的腺病毒***可以是仅在肿瘤中特异性增殖并选择性杀死肿瘤细胞的溶瘤腺病毒(oAd)。在本说明书中，“溶瘤腺病毒”可以与诸如抗癌病毒、oAd或肿瘤杀伤病毒等术语互换使用。通过本发明所属领域中使用的常规技术进行基因修饰的所有溶瘤腺病毒都包括在本发明的腺病毒***中。例如，可以从腺病毒基因组中去除E1A和/或E1B，使其仅在癌细胞中增殖，从而在正常细胞中不增殖，或者可以改变病毒蛋白的靶序列以使用从癌细胞分泌的蛋白酶，或者将表达配体的序列***到病毒基因组中，以表达与癌细胞中存在的受体(例如EGFR)结合的受体配体。
另外，为了提高癌细胞的杀伤能力，可以将TRAIL基因***到本发明的肿瘤选择性溶瘤腺病毒中，使得细胞死亡很好地发生，或者可以将IFN基因应用于肿瘤选择性溶瘤腺病毒以将其***到癌细胞中并在其中有效地表达，从而发生免疫应答。
用于本发明的重组腺病毒包括在动物细胞(优选地哺乳动物细胞)中可操作的启动子。适合于本发明的启动子包括衍生自哺乳动物病毒的启动子和衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子。***到重组腺病毒中的转基因优选地***到启动子-转基因多聚A序列的表达盒中。在这种情况下，作为启动子，本发明的基因表达控制序列(HRE-TERT、HRE-E2F、HRE-TERT-E2F、HRE-E2F-TERT、HRE-E2F-5myc-TERT，并且HRE可以包括两次)，或者可以使用通用启动子。
结合转基因的一般启动子优选地在动物细胞(更优选地哺乳动物细胞)中操作，以控制转基因的转录。通用启动子包括衍生自哺乳动物病毒的启动子和衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子。通用启动子的示例包括U6启动子、H1启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人类IL-2基因启动子、人类IFN基因启动子、人类IL-4基因启动子、人类淋巴毒素基因启动子、人类GM-CSF基因启动子、诱导型启动子、肿瘤细胞特异性启动子(例如TERT启动子、PSA启动子、PSMA启动子、CEA启动子、E2F启动子和AFP启动子)和组织特异性启动子(例如白蛋白启动子)，但是本公开不限于此。优选地用于表达转基因的表达构建体包括结合至转基因下游的聚腺苷酸化序列。聚腺苷酸化序列包括牛生长激素终止子(Gimmi、E.R.等人，Nucleic Acids Res.17:6983-6998(1989))、衍生自SV40的聚腺苷酸化序列(Schek、N等人，Mol.Cell Biol.12:5386-5393(1992))、HIV-1polyA(Klasens、B.I.F.等人，Nucleic Acids Res.26:1870-1876(1998))、β-球蛋白polyA(Gil、A.等人，Cell 49:399-406(1987))、HSV TK polyA(Cole、C.N.和T.P.Stacy，Mol.Cell.Biol.5:2104-2113(1985))或多瘤病毒polyA(Batt、D.B和G.G.Carmichael，Mol.Cell.Biol.15:4783-4790(1995))，但是本公开不限于此。
在用于本发明的重组腺病毒中，IL-12基因序列和表达抑制C-met的RNA的序列与启动子可操作地连接。在本说明书中，术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的阵列)与另一核酸序列之间的功能连接。因此，调节序列控制不同核酸序列的转录和/或翻译。
本发明的重组腺病毒可以附加地包括抗生素抗性基因和报道基因(例如绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶和β-葡糖醛酸糖苷酶)作为可选择标志物。抗生素抗性基因包括本领域通常使用的抗生素抗性基因，并且例如可以是针对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素或四环素的抗性基因，优选地为新霉素抗性基因。可选择标志物可以由单独的启动子、内部核糖体进入位点(IRES)或通过2A***连接的表达***表达，并且本发明中使用的IRES是在几种病毒和细胞的RNA中发现的调节序列(McBratney等人，Current Opinion in Cell Biol ogy 5:961(1993))。另外，“2A肽”是指编码可切割的小(18-22个氨基酸)肽的序列，其允许在单个编码序列内有效、一致地表达离散蛋白产物。例如，可以使用来自诸如***病毒(F2A)、马甲鼻炎病毒，猪捷申病毒-1(P2A)或Thosea asigna病毒(T2A)等病毒的2A肽或者Szymczak-Workman、A.等人在“Designand Construction of 2A Peptide-Linked Multicistronic Vectors”描述的任何2A钛。
本发明包括白介素12(IL-12)编码基因；以及表达寡核苷酸的基因，该寡核苷酸与C-met的mRNA(酪氨酸激酶Met)互补，并抑制C-met的表达，并且通过共表达这两个基因而在增强抗癌和抗肿瘤免疫方面提供协同作用。另外，本技术的显着之处在于尽管少量施用IL-12仍可以提供优异的治疗作用，并解决了常规细胞因子施用引起的副作用问题。
在本说明书中，术语“白介素12(IL-12)”是指由通过二硫键结合的40kDa亚基(p40亚基)和35kDa亚基(p35亚基)形成的异二聚体细胞因子。IL-12由抗原呈递细胞(诸如巨噬细胞)产生，并与活化T细胞、B细胞和NK细胞的细胞表面上的受体结合。IL-12促进T细胞和NK细胞的增殖；增强T细胞、NK细胞和巨噬细胞的细胞毒性作用；诱导产生IFN-γ、TNF-α和GM-CSF；并诱导Th1细胞活化。另外，IL-12被公认为是Th1克隆增殖的重要辅助刺激剂，并已知会增加血清中IgG2a抗体的产生。在本发明中，术语“p35亚基”和“p40亚基”不仅包括实施例中例证的亚基，还包括能够执行每个亚基的独特功能的亚基的所有类似物。
本发明的腺病毒***包含以可表达形式编码IL-12的基因，并在感染肿瘤细胞后分泌IL-12以诱导强烈的抗肿瘤免疫应答。
本发明的腺病毒***可以包括表达IL-12A(p35)和IL-12B(p40)的IL-12A(p35)基因和IL-12B(p40)基因作为亚基，从而有效地表达IL-12。另外，可以在IL-12A(p35)基因序列和IL-12B(p40)基因序列之间附加地包括接头序列以用于连接两个亚基，或者还可以包括用于提高蛋白表达效率的内部核糖体进入位点(IRES)序列。
接头是指可以包括在两个基因之间的任何序列，并且在本发明中，接头是指可以包括在IL-12A(p35)基因和IL-12B(p40)基因之间的序列。接头包括已知***基因之间的所有常规接头序列或随机设计的序列，并且任何接头可以包括在本发明中，只要它们不会不利地影响IL-12的表达或损害IL-12的功能性即可。例如，类似物可以是序列ID号19的序列，但是本发明不限于此。
可以在本发明中使用的“IL-12A亚基(p35亚基)”的氨基酸序列可以是GenBank登录号AAD56385中描述的那些(当需要表达小鼠p35的氨基酸序列时，GenBank登录号AAA39292)。另外，作为编码IL-12A亚基的序列，IL-12A(p35)基因可以是与GenBank登录号AF180562中描述的序列中的编码序列(CDS)相对应的核苷酸序列(当需要使用小鼠序列时，指M86672中描述的序列中的CDS序列)。另外，IL-12A(p35)基因可以具有在本发明的实施例中使用的序列ID号1或序列ID号4的序列(在小鼠的情况下，序列ID号7的序列)。
可以在本发明中使用的“IL-12B亚基(p40亚基)”的氨基酸序列可以是GenBank登录号AAD56386中描述的那些(当需要表达小鼠p40的氨基酸序列时，GenBank登录号AAA39296)。另外，作为编码IL-12A亚基的序列，IL-12A(p35)基因可以是与GenBank登录号AF18056中描述的序列中的编码序列(CDS)相对应的核苷酸序列(当需要使用小鼠序列时，指M86671中描述的序列中的CDS序列)。另外，IL-12A(p35)基因可以具有在本发明的实施例中使用的序列ID号2或序列ID号5的序列(在小鼠的情况下，序列ID号8的序列)。
在本发明的实施例中，证实了通过使用序列ID号3或序列ID号6(在小鼠的情况下为序列ID号9)的IL-12基因可以在肿瘤细胞中表达IL-12，特别是当与RNA同时表达用于C-met时，12的表达水平显着提高。
在本说明书中，术语“C-met”是酪氨酸激酶受体家族之一。C-met充当肝细胞生长因子/散射因子(HGF/SF)的受体，并在多种癌症中过表达。c-met过表达的大多数患者癌症治疗预后较差。本发明的C-met基因可以是与GenBank登录号gi:4557746中公开的mRNA序列中的编码序列(CDS)相对应的核苷酸序列(当需要使用小鼠序列时，指在登录号gi:146198695中描述的序列中的CDS序列)。
C-met的过表达由于HGF/SF-Met信号***而增加了有丝***和细胞运动，并诱导了进入细胞外基质的侵袭和迁移，从而增加了癌症的恶性程度。因此，在癌症的治疗中，抑制C-met表达是非常重要的问题。本发明使用与C-met的mRNA互补的寡核苷酸抑制C-met的表达，并且抑制了C-met的表达，特别证实了与仅抑制C-met的表达的群组相比，当寡核苷酸与IL-12共表达时，对C-met表达的抑制显着增强。
在实施例中，在本发明中作为抑制靶的C-met的mRNA可以是序列ID号10所示的序列(在小鼠的情况下为序列ID号11)。
与C-met基因结合以抑制C-met表达的寡核苷酸可以是选自shRNA、miRNA、siRNA、反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶、三链造成寡核苷酸(TFO)、肽核酸(PNA)和CRISPR的指导RNA中的一种或多种。
抑制C-met表达的寡核苷酸序列可以包括与序列ID号10的C-met mRNA序列的一部分相同或互补的序列，优选地包括与序列ID号10的序列中的4个或多个连续核苷酸的序列相同或互补的序列。
在本发明的实施例中，证实了通过使用shRNA作为寡核苷酸可以有效地抑制肿瘤细胞中C-met的表达，该shRNA包括与C-met的mRNA互补的序列，并且能够抑制C-met的表达。
在本发明中，具有发夹结构的人工RNA分子的“shRNA”(小发夹RNA或短发夹RNA)用于通过RNA干扰来抑制靶基因的表达。shRNA主要经由质粒、细菌或病毒载体转运到细胞中。shRNA具有相对较低的降解率和周转率的优点。
在本发明的实施例中，证实了通过使用由序列ID号12(人类)或序列ID号14(小鼠)的基因编码的shRNA、“Hshc-met(靶向序列ID号13的序列)”或“shc-met(靶向序列ID号15的序列)“作为shRNA以抑制C-met表达的本发明的病毒***有效地抑制了C-met的表达。
结合C-met基因以抑制C-met表达的寡核苷酸可能是CRISPR的指导RNA。当本发明的基因传递***表达CRISPR-CAS***时，还可以包括表达Cas蛋白的序列。
在本发明中，“CRISPR-CAS***”是指识别存在于靶DNA上的特异性核苷酸序列并用限制酶切割DNA以校正基因的技术。在本发明中，CRISPR-CAS***的特征在于，当将表达用于靶基因C-met的指导RNA的序列***到腺病毒***中并且所表达的指导RNA与靶C-met杂交时，使用Cas蛋白切割靶位点以抑制C-met的表达。
除非另有说明，否则可以使用本发明的技术领域中常用的技术来使用构建CRISPR-CAS***的方法、要在CRISPR-CAS***中使用的限制酶蛋白的类型等。
用于本发明的Cas蛋白可以是Cas9或Cas12蛋白。可以不受限制地使用在本发明中使用的Cas9或Cas12(也称为Cas12a或Cpf1)蛋白，只要它是在本发明的技术领域中通常用于实施CRISPR/Cas***的Cas蛋白即可。另外，Cas9或Cas12蛋白的特定类型的示例如下面的表1所示，但不限于此。表1中列出的引用整体上包括在本发明的说明书中。
[表1]
Figure BDA0002892454510000091
Figure BDA0002892454510000101
Cpf1是一种CRISPR/Cas***，并且被分类为2类5型CRISPR/Cas***。Cpf1像Cas9一样作为单个亚基效应子模块工作，但在功能性上与Cas9略有不同，因此，虽然Cas9需要tracrRNA来切割基因，但Cpf1却不需要tracrRNA。在Cas9的情况下，在包含大量鸟嘌呤的前间区序列邻近基序(PAM)的区域中的基因被切除，而Cpf1可以有效地切割具有大量胸腺嘧啶的区域。另外，Cpf1具有切割基因时生成4至5个核苷酸突出端的特性。由于这些各种特征和结构差异，即使Cpf1的操作效率比Cas9中的操作效率略低，它仍表现出较高的准确度。
用于表达本发明的CRISPR-CAS***的启动子可以是任何启动子，没有限制，只要在本发明所属技术领域的CRISPR/Cas***中使用即可。例如，可以使用属于III型类的RNA聚合酶III启动子或U6启动子。在这种情况下，由于常用的U6启动子需要鸟苷核苷酸来发起转录，因此使用U6启动子还可以将基因组靶向位点限制到GN19N GG(Mali等人(2013)Science 339:823-826；Ding等人(2013)Cell Stem Cell 12:393-394)。T7、T3或SP6启动子也可以用于本发明的载体***(Adhya等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:147-151；Melton等人(1984)Nucleic Acids Res.12:7035-7056；Pleiss等人(1998)RNA 4:1313-1317)。
在本发明的实施例中，证实了通过使用序列ID号10的人类C-met mRNA中的第55个至第77个核苷酸作为靶序列(序列ID号17)，并通过使用包括序列ID号16的基因(表达可以与靶序列互补杂交的CRISPR的指导RNA)；表达Lbcpf1的序列ID号18的基因的腺病毒***，可以通过crRNA-LbCpf1的CRISPR-CAS***有效地抑制C-met的表达。
在本发明的实施例中，使用包含表达LbCpf1的基因序列的重组腺病毒载体表达CRISPR-CAS***，如图13所示。
在本发明中，术语“互补”是指不仅涵盖100％互补，而且包括足以通过RNA干扰机制抑制C-met基因表达的不完全互补性，优选地为90％互补性，更优选地为98％互补性，最优选地为100％互补性。在本说明书中，当表达100％互补性时，其被描述为“完全互补”。
根据本发明的实施例，包括在本发明的腺病毒中的shRNA序列包括与序列ID号10的一些序列互补的序列，优选地与序列ID号10的C-met mRNA序列的第1987个核苷酸至第2007个核苷酸的序列互补的序列。
根据本发明的特定实施例，作为能够抑制C-met表达的寡核苷酸的shRNA可以由序列ID号12或序列ID号16的基因(在小鼠的情况下为序列ID号14的基因)编码。
本发明中使用的“基因或基因序列”被解释为包括与本发明中提出的序列号的每个序列示出基本同一性或基本相似性的基因序列。当本发明的序列和任何其他序列尽可能地比对以彼此对应时，并且当使用本领域中常用的算法分析比对序列时，基本同一性是指表现出同源性大于70％的序列，优选地80％同源性，更优选地90％同源性，并且最优选地95％同源性。基本相似性通常是指以下情况L：IL-12基因序列的改变(诸如一个或多个碱基的缺失或***)不影响本发明的目的，以最小化与重组载体***的同源重组。因此，本发明的IL-12基因序列不限于例证的序列列表，并且只要它基本不影响本发明的期望的最终产物的活性，就被解释为包括在本发明的范围内。
本发明的腺病毒***可以通过使用腺病毒的基因组骨架来实现癌症的治疗。腺病毒由于其中等的基因组大小，易于操纵，高滴度，广泛的靶细胞和优异的感染性而被广泛用作基因传递***。基因组的两端都包含100到200bp的反向末端受体(ITP)，这是DNA复制和包装的重要组成部分。基因组的E1区域(E1A和E1B)编码调节转录和宿主细胞基因转录的蛋白质。E2区域(E2A和E2B)编码病毒DNA复制所涉及的蛋白质。由于已知顺式仅需要腺病毒基因组的一小部分(Tooza、J.，Molecular bio logy of DNA Tumor viruses，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1981))，因此腺病毒具有携带外来DNA分子的能力。
在本发明的腺病毒***的基因组中，可以缺失E1和E3区域。具体地，本发明的腺病毒***可以包括E1A基因和灭活的E1B 19基因、灭活的E1B 55基因或灭活的E1B 19基因和E1B 55基因。
在本说明书中，与基因相关使用的术语“失活”是指该基因的转录和/或翻译没有正常执行，并且该基因编码的正常蛋白质的功能没有出现。例如，在灭活的E1B 19基因的情况下，由于E1B 19基因的突变(取代、添加、部分缺失或全部缺失)，无法产生活性的E1B19kDa蛋白。当缺失E1B 19时，可以增加细胞凋亡，并且当缺失E1B 55基因时，表现出肿瘤细胞的特异性(参见专利申请号2002-23760)。在本说明书中，关于基因或序列使用的术语“缺失”具有不仅包括对应序列的完全缺失并且还包括其部分缺失的含义。
本发明的重组腺病毒可以具有其中编码位于ElA基因序列中的Rb结合位点的核苷酸序列的第45个Glu残基被Gly取代的突变以及其中其第121个至第127个氨基酸序列全部被Gly取代的突变。
根据本发明的实施例，重组腺病毒可以包括E1A位点，并且其中的E1B 19kDa和E3位点(ΔE3)可以缺失。包括E1A基因的重组腺病毒具有可复制的性质。IL-12基因和C-met表达抑制寡核苷酸可以分别***到腺病毒的缺失的E1和E3位点中。
本发明的腺病毒***还可以包括生物相容性聚合物，以通过被传递到细胞中来提高腺病毒或其病毒DNA的细胞内传递能力，或增加剩余时间等。具体地，生物相容性聚合物可以以与腺病毒或腺病毒质粒DNA组合的形式包括在本发明的***中。
生物相容性聚合物可以是任何一种，只要它可以用于本发明的技术领域中用于基因传递的载体***中即可。
例如，本发明的生物相容性聚合物可以是pH敏感的生物还原性聚合物，其包括(a)免疫反应可逃避的部分，(b)可带电荷的部分，以及(c)包括二硫键的生物可还原的部分。
免疫反应可逃避的部分(a)的功能是允许聚合物结合的病毒避免体内免疫应答(包括细胞和全身免疫反应)。可以用于免疫反应可逃避部分的材料具体地是能够逃避体内免疫应答(包括细胞和全身免疫反应)的聚合物，更具体地是PEG(聚乙二醇)、亚乙氧基(例如聚氧化乙烯、聚氧丙烯或其共聚物(聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷共聚物))、聚苯醚、PEG与亚乙氧基的共聚物、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙酯)、聚(甲基丙烯酰基磷脂酰胆碱)、全氟聚醚、右旋糖酐或聚乙烯吡咯烷酮，更具体地是PEG、亚乙氧基或PEG与亚乙氧基的共聚物，甚至更具体地是PEG。
可带电荷的部分(b)可以在体内pH下(特别是在中性pH附近)通过与带负电荷的病毒的表面或DNA相互作用而结合来使聚合物带正电荷。备选地，与上文相反，取决于病毒表面或DNA的荷电率，可带电荷部分(b)可以使聚合物带负电荷。因此，可带电荷部分(b)包括使聚合物带正电荷或负电荷的材料。例如，当赋予负电荷时，可以在可带电荷部分(b)中使用羧酸根基团，而当赋予正电荷时，可以将具有叔胺基或氨基的单体用于可带电荷部分(b)。
包括二硫键的生物可还原部分(c)可以包括在本发明中，而不受限于单体的类型，只要它包括二硫键即可。
生物可还原部分(c)在酸性环境中在体内被还原，从而使二硫键转换为巯基，从而破坏了聚合物结构，最终使裸露病毒或DNA与聚合物-病毒复合物或聚合物-DNA复合物的结合被释放。
在另一实施例中，本发明的生物相容性聚合物可以包括所有聚合物、纳米材料、树状大分子和水凝胶。生物相容性聚合物优选地选自PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI(PAPS)、mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG(PPSA)、PICION(聚乙二醇化和氧化铁纳米粒子交联的邻苯二酚接枝聚赖氨酸(PLL))、精氨酸接枝的生物可降解聚合物(ABP)、聚乙二醇化和PTX共轭的聚合物胶束(APP)、mPEG-b-Pip-CBA(PPCBA)、PPCBA-PEI-精氨酸(PPA)、聚乙二醇(PEG)、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚羟基乙酸(PLGA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚乙烯胺(PEI)、透明质酸(HA)、明胶、壳聚糖和血清白蛋白。
PAPS聚合物是PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI，并且可以具有以下结构式1的结构：
[结构式1]
Figure BDA0002892454510000141
在结构式1中，x和y可以分别独立地为1至500的整数。
PPSA聚合物是mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG，并且可以具有以下结构式2的结构：
[结构式2]
Figure BDA0002892454510000142
在结构式2中，n和m可以分别独立地为1至500的整数。
PICION是聚乙二醇化和氧化铁纳米粒子交联的邻苯二酚接枝聚赖氨酸(PLL)，并且可以具有以下结构，其中以下结构式3的邻苯二酚接枝聚赖氨酸与氧化铁粒子交联，并且在其表面上修饰mPEG：
[结构式3]
Figure BDA0002892454510000151
在结构式3中，n可以是1至500的整数。
ABP聚合物是精氨酸接枝的生物可降解聚合物(精氨酸接枝的生物可还原聚合物)，并且可以具有以下结构式4的结构：
[结构式4]
Figure BDA0002892454510000152
在结构式4中，n可以是1至500的整数。
APP是聚乙二醇化和PTX共轭的聚合物胶束(聚乙二醇化和PTX共轭的聚合物胶束，并且可以具有以下结构式5的结构：
[结构式5]
Figure BDA0002892454510000161
在结构式5中，n和m可以分别独立地为1至500的整数。
PPCBA聚合物是mPEG-b-Pip-CBA，属于pH敏感的可生物降解聚合物，并且可以具有以下结构式6的结构：
[结构式6]
Figure BDA0002892454510000162
在结构式6中，n和m可以分别独立地为1至500的整数。
PPA是PPCBA-PEI-精氨酸，属于pH敏感的可生物降解聚合物，并且可以是PEI和精氨酸进一步结合于PPCBA的聚合物。PPA可以具有以下结构式7的结构：
[结构式7]
Figure BDA0002892454510000163
在结构式7中，a、b和c可以分别独立地是1至500的整数。例如，a可以是100至200，b可以是1至10，并且c可以是1至5，或者a可以是113，b可以是6，并且c可以是1，但是本发明不限于此。
聚乙烯胺(PEI)可以包括结构式8的单体所结合的所有线性或支链聚乙烯胺。
[结构式8]
Figure BDA0002892454510000171
在结构式8中，n可以是1至500的整数。
支链聚乙烯胺除了一般的支链聚乙烯胺以外还可以包括树状大分子，其中分子链根据一定的规则以三维方式从中心向外规则地散布。
[结构式9]
Figure BDA0002892454510000172
结构式9表示支链聚乙烯胺的示例。此处，n可以是1至500的整数。
本发明的可生物降解聚合物包括树状大分子聚合物，该树状大分子聚合物是包括乙烯胺作为单体的结构式8的聚合物的示例。例如，树状大分子型支链聚乙烯胺可以是结构式10或11的聚合物，但是本公开不限于此。结构式11的聚合物是聚(酰胺基胺)聚合物，并且也可以称为PAMAM。
[结构式10]
Figure BDA0002892454510000181
[结构式11]
Figure BDA0002892454510000182
生物相容性聚合物与本发明的重组腺病毒或病毒DNA结合，以提高流入细胞的效率，提高个体的稳定性，并通过降低免疫原性而提高病毒或病毒DNA向靶位点的传递效率，从而显着提高由于本发明的腺病毒或病毒DNA引起的癌症治疗作用。
生物相容性聚合物和腺病毒***可以通过静电相互作用、离子相互作用或化学键连接。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种包括基因传递***的药物组合物，该***包括白介素12(IL-12)编码核酸序列；以及表达与C-met基因互补结合并抑制C-met表达的寡核苷酸的核酸序列。该组合物可以是抗癌组合物、用于癌细胞的抗转移组合物或用于增强抗肿瘤免疫的组合物。
该组合物可以包括治疗有效量的本发明的腺病毒***。另外，该组合物还可以包括药学上可接受的载体。
该抗癌组合物用于抑制肿瘤细胞的存活、增殖和/或迁移，以抑制癌细胞的增殖或诱导或促进癌细胞的死亡。本发明的重组腺病毒***或包括其的组合物可以有效地诱导癌细胞的死亡并抑制其迁移。
用于癌细胞的抗转移组合物具有通过迁移抑制癌细胞迁移的作用。例如，可以证实抗转移组合物抑制癌细胞中的EMT，从而抑制其迁移。本发明的抗转移组合物可以通过杀死癌细胞而具有抗癌作用，并且可以具有抑制癌细胞迁移的作用。
用于增强抗肿瘤免疫的组合物能够通过使用在肿瘤组织中产生的免疫抑制分子克服对肿瘤的免疫监视避免来治疗癌症，并且可以包括在抗癌组合物中。具体地，抗肿瘤免疫组合物用于使肿瘤组织中免疫细胞的失衡正常化并通过IL-12诱导T协助细胞的分化，从而激活细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性，从而导致增强的抗癌免疫。
本发明的药物组合物表达IL-12以增强癌症受试者的抗癌免疫。另外，通过针对C-met的shRNA抑制了C-met的表达，从而还放大了IL-12的功能。在本发明的实施例中，已经证实，即使在注射了人源癌细胞的小鼠模型中，当注射本发明的IL-12和sh c-met共表达腺病毒时，也出现了显着的抗癌作用和肿瘤迁移作用。
另外，该组合物可以是用于辅佐治疗的组合物，以增强标准疗法的治疗作用，或者可以是用于辅佐治疗的组合物，以提高或增强标准治疗剂的作用，包括其他抗癌剂、免疫检查点抑制剂和免疫治疗剂等。
本发明的抗癌组合物使用前面提及的组合物中包括的重组腺病毒来增强抗肿瘤免疫。因此，省略了相同内容的描述以避免本说明书的过度复杂。
根据本发明的实施例，癌症可以选自胃癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、结肠癌、***、骨癌、非小细胞骨癌、血癌、皮肤癌(黑色素瘤等)、头颈癌、子宫癌、直肠癌、***癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、多倍体癌、唾液腺癌、肉瘤癌、假性粘液瘤、肝母细胞瘤、睾丸癌、成胶质细胞瘤、唇裂癌、卵巢生殖细胞瘤、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、胆囊癌、脉络膜黑色素瘤、壶腹癌、腹膜癌、肾上腺癌、舌癌、小细胞癌、小儿淋巴瘤、神经母细胞瘤、十二指肠癌、输尿管癌、星形细胞瘤、脑膜瘤、肾癌、外阴癌、胸腺癌、中枢神经***(CN S)肿瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤，但是本发明不限于此。
本发明的所有前面提及的组合物均包括药学上可接受的载体。在本发明中使用的药学上可接受的载体是通常在制剂中使用的载体，并且包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、***胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等，但本发明不限于此。除了上述组成部分以外，本发明的药物组合物还可以包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。在雷明顿药物科学(第19版，1995)中详细描述了合适的药学上可接受的载体和制剂。
本发明的组合物可以口服或肠胃外给药。肠胃外给药可以是肿瘤内注射、静脉内注射、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射、心内注射、胸腔内注射、动脉内注射、骨内注射、关节内注射、经皮给药等，优选地为肠胃外给药。
另外，该组合物可以用于局部或全身给药。
根据本发明的实施例，本发明的抗肿瘤免疫增强组合物优选地直接在肿瘤内施用，从而具有抗肿瘤免疫增强作用。
本发明的组合物的合适剂量可以根据诸如配制方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况和饮食、给药时间、给药途径、***率和应答敏感度等因素而变化。本发明的药物组合物的日剂量为例如0.2至1,000mg/kg。然而，可以考虑各种相关因素(诸如要分化和增殖的靶组织细胞的量、给药途径以及患者的体重、年龄和性别)来确定活性成分的实际剂量。因此，可以以任何形式提供剂量，而不限制本发明的范围。
根据本发明的又一方面，本发明提供了作为抗癌剂的基因传递***的用途，该***包括白介素12(IL-12)编码基因；以及表达与C-met基因互补结合以抑制C-met表达的寡核苷酸的基因。本发明的基因传递***共表达IL-12和C-met抑制RNA，从而抑制肿瘤迁移，同时还提高IL-12的抗肿瘤免疫作用。本发明的基因传递***作为抗癌剂的用途在细节上作必要修改后应用于基因传递***或药物组合物的以上描述，以避免重复的描述。
根据本发明的再一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括施用基因传递***，该***包括白介素12(IL-12)编码基因；以及表达与C-met基因互补结合以抑制C-met表达的寡核苷酸的基因，或包括向受试者的基因传递***的药物组合物。
本发明的基因传递***共表达IL-12和C-met抑制RNA，从而抑制肿瘤迁移，同时还提高归因于IL-12的抗肿瘤免疫作用，从而在癌症治疗中产生协同作用。用本发明的基因传递***作为抗癌剂治疗的方法在细节上作必要修改后应用于基因传递***或药物组合物的以上描述，以避免重复的描述。
在下文中，将参照以下示例对本发明进行更详细的描述。对于本领域技术人员显而易见的是，示例仅用于具体解释本发明，因此，无意将本发明限制于示例。
实施例
实验的制备和重组载体的构建
【制备示例1】细胞获得和培养
作为细胞培养基，使用了Dulbecco改良的Eagle’s培养基(DMEM；试剂盒，纽约格兰德岛)、洛斯维公园纪念所培养基(RPMI；试剂盒)或含有10％胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mmol/L)、青霉素(100IU/mL)和链霉素(50mg/mL)的最小必需培养基(MEM；试剂盒)。HEK293(表达腺病毒E1位点，人类胚胎肾细胞系)、H1975(人类非小肺癌细胞系)和HaK(仓鼠肾癌细胞系)购自马纳萨斯的美国模式培养物集存库(ATCC，VA)。HaP-T1(仓鼠胰腺癌细胞系)由MasatoAbei博士(日本茨城筑波大学)提供。所有细胞系均在37℃和5％CO2的潮湿环境中培养，并使用Hoeschst染料、细胞培养进行支原体阴性测试，并且在Luria Bertani培养基中在37℃下培养P CR.E.coli(大肠杆菌)。
【制备示例1】表达IL-12和/或shc-met的溶瘤腺病毒***的构建
制备示例1-1.表达人源IL-12和shc-met的pDNA的构建
为了调查使用Ad载体的抗肿瘤作用和抗肿瘤免疫应答，构建基于mT-Rd19-RGD重组的两个溶瘤腺病毒质粒DNA(称为Ad pDNA或oAd pDNA)，以表达抗肿瘤免疫基因、人类白介素12(hIL-12)和/或与C-met互补结合以抑制C-met的表达在癌细胞生长和分化中起重要作用的短发夹RNA(在下文中称为“shc-met”)(图1)：(mT-Rd19-RGD和mT-Rd19-RGD/hIL-12/shc-met)。
[表2]
Figure BDA0002892454510000221
制备示例1至2.表达小鼠来源的IL-12和shc-met的聚合物-病毒DNA复合物的构建
另外，基于HE5cT-Rd19-RGD***表达小鼠来源的IL-12p35(序列ID号7)和I L-12p40(序列ID号8)的基因。另外，使用序列ID号11的小鼠C-met基因的第4398个至第4422个核苷酸作为靶序列(序列ID号15)设计了shRNA。构建了***序列ID号14的核苷酸序列的与C-MET基因互补结合并表达能够抑制C-MET基因表达的shc-met的HE5cT-Rd19-RGD/scIL-12/shc-met质粒DNA。将所构建的HE5cT-Rd19-RGD/scIL-12/shc-met质粒DNA与PPCBA-PEI-精氨酸(PPA)聚合物混合，从而构建pDNA/PPA聚合物复合物。
【制备示例2】表达IL-12和/或shc-met的重组溶瘤腺病毒的构建
为了调查由于共表达IL-12和shc-met的抗癌腺病毒引起的抗肿瘤作用和抗肿瘤免疫应答，构建了一种抗癌腺病毒(图4，当重组腺病毒包括人源序列时，分别标记为HscIL-12和Hshc-met)：
HE5cT-Rd19-RGD：不包含表达基因的Ad载体
HE5cT-Rd19-RGD/scIL-12:仅表达IL-12的Ad载体
HE5cT-Rd19-RGD/shc-met:表达针对C-Met基因的shRNA的Ad载体
HE5cT-Rd19-RGD/scIL-12/shc-met：表达针对IL-12和C-Met基因的shRNA的Ad载体
更具体地，将分别表达人源IL-12p35(序列ID号1)和IL-12p40(序列ID号2)的基因分别***到HE5cT-Rd19-RGD中。另外，将以序列ID号10的人类C-met的m RNA的第1987个至第2007个核苷酸作为靶序列(序列ID号13)的序列ID号12的序列的shRNA***到重组腺病毒载体中。
另外，以与上述相同的方式，***了分别表达小鼠来源的IL-12p35(序列ID号8)和IL-12p40(序列ID号9)的每个基因以及以序列ID号11的小鼠来源的C-MET基因的第4398个至第4422个核苷酸作为靶序列(序列ID号15)并与该核苷酸互补结合以抑制其表达的shc-met表达序列(序列ID号14)以制备共表达IL-12和shcmet的腺病毒载体。
【制备示例3】动物模型建立
3-1.人类异种移植肺癌肿瘤模型
当从Orient购买的裸鼠为6至8周大时，将人肺癌细胞系(H1975)以3×106个细胞/50μL皮下注射到裸鼠中。接下来，当肿瘤的大小达到平均100mm3时，向其施用制备示例1或2的抗癌腺病毒，并证实了其作用。
3-2.小鼠肿瘤模型
为了进行实验，从Daehan Biolink购买了C57BL6(B16-F10肿瘤模型)小鼠，并且从Orient购买了BALB/C(CT26肿瘤模型)小鼠。当小鼠处于6至8周大时，将小鼠皮肤癌细胞系(B16-F10)或小鼠胃癌细胞系(CT26)分别以5x105个细胞/50μL皮下注射到小鼠中，然后当肿瘤的大小达到平均100mm3时，施用制备示例1或2的抗癌腺病毒，并证实了其作用。
【实验示例1】通过Ad pDNA证实细胞中mIL-12和hIL-12的表达
为了调查通过根据制备示例1构建的Ad pDNA表达人类IL-12(hIL-12)基因，使mT-Rd19-RGD和mT-Rd19-RGD/hIL-12/shc-met Ad pDNA在室温下与脂质体反应，然后使50％融合的293A(具有良好的细胞内传递效率的人类胚胎肾细胞系)与反应产物反应。在处理后72小时，收集细胞培养基以执行hIL-12ELISA。
如图2所示，在示例(mT-Rd19-RGD/hIL-12/shc-met Ad pDNA；两个Pac I)的情况下，证实了hIL-12以97,500±6,384pg/mL表达。因此，证实了根据示例构建的A d pDNA在细胞中有效地诱导了治疗基因白介素12的表达。
【实验示例2】证实腺病毒(Ad)pDNA共表达细胞间IL-12和C-met
考虑到根据制备示例1构建的腺病毒pDNA的细胞内传递效率，在293A细胞系中调查了mT-Rd19-RGD/hIL-12/shc-met Ad pDNA对hIL-12的表达。然而，在293A细胞系中未证实通过C-met特异性shRNA的表达抑制C-met表达，因为在正常的293A细胞中C-met未过表达。
因此，为了验证示例的mT-Rd19-RGD/hIL-12/shc-met(两个Pac I)的C-met表达抑制能力，制备mT-Rd19-RGD/hIL-12/shc-met腺病毒(Ad)，用20μl的所制备的m T-Rd19-RGD/hIL-12/shc-met腺病毒(Ad)处理在6孔板中过表达C-met的50％融合的人肺癌细胞系A549。在处理后48小时，收集细胞培养基并执行hIL-12和C-met的ELISA。使用未处理的A549人肺癌细胞系中的hIL-12和C-met的表达量作为对照。
如图3所示，证实了与对照相比，mT-Rd19-RGD/hIL-12/shc-met Ad的hIL-12的表达(235,000±20,518pg/mL)增加，并且用mT-Rd19-RGD/hIL-12/shc-met Ad处理的群组中C-met的表达减少了1.2倍。因此，可以证实通过根据本发明制备的Ad***有效地诱导了治疗基因IL-12和shc-met的表达。
【实验示例3】证实共表达IL-12和shc-met的抗癌腺病毒的体内抗肿瘤作用(小鼠同基因肿瘤模型)
为了验证根据制备示例2构建的共表达小鼠IL-12和小鼠C-met靶向shc-met的抗癌腺病毒的抗癌治疗作用，使用小鼠皮肤癌细胞系B16-F10或小鼠胃癌细胞系CT26建立相应的肿瘤模型，并且证实了抗肿瘤作用。
在以5x105个细胞/50μL将小鼠皮肤癌细胞系B16-F10或小鼠胃癌细胞系CT26皮下注射到小鼠中后，当肿瘤的大小达到平均100mm3时，分别将PBS或HE5cT-Rd19-RGD/scIL-12/shc-met注射到小鼠中。在以两天的间隔(1×1010VP)对肿瘤给药三次后，测量肿瘤的大小以观察抗肿瘤作用。
如图5a和5b所示，证实了使用两种类型的小鼠肿瘤模型，在PBS处理组中肿瘤快速生长，但是在施用HE5cT-Rd19-RGD/scIL-12/shc-met的所有受试者中肿瘤完全消失。
【实验示例4】证实共表达IL-12和shc-met的抗癌腺病毒pDNA/PPA复合物的体内抗肿瘤作用(小鼠同基因肿瘤模型)
构建根据制备示例1至2构建的HE5cT-Rd19-RGD/scIL-12/shc-met病毒DNA)和PPA聚合物的复合物(pDNA/PPA)，以证实抗癌治疗作用。具体地，使用小鼠皮肤癌细胞系B16-F10建立了肿瘤模型，并证实了其中的抗肿瘤作用。将小鼠皮肤癌细胞系(B16-F10)以5x105个细胞/50μL皮下注射到小鼠中，然后，当肿瘤大小达到平均100mm3时，将PBS和HE5cT-Rd19-RGD/scIL-12/shc-met Ad pDNA/PPA复合物分别注入到小鼠模型中。在每天对肿瘤给药7次后，测量肿瘤的大小以观察抗肿瘤作用。
如图6所示，证实了在PBS施用组中肿瘤的大小增加到2514.7±202.1mm3，而在施用抗癌病毒pDNA/PPA复合物的群组的所有受试者中均表现出显着的抗肿瘤作用。施用HE5cT-Rd19-RGD/scIL-12/shc-met Ad pDNA/PPA复合物的群组中的平均肿瘤大小为1387.6±171.8mm3，与PBS施用组相比低44.8％。该结果指示共表达IL-12和s hc-met的病毒DNA也诱导了提高的抗肿瘤作用。
【实验示例5】通过共表达IL-12和shc-met(人类)的抗癌腺病毒证实IL-12和shc-met的细胞间表达
为了调查通过共表达IL-12和shc-met的抗癌腺病毒表达人类IL-12或人类c-Met靶向shc-Met，以2MOI(图7b)或5MOI(图7a)对人肺癌细胞系H1975施用了根据制备示例2构建的重组腺病毒HE5cT-Rd19-RGD、HE5cT-Rd19-RGD/shc-met、HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12/shc-met中的每一种。在处理后48小时，收集细胞和培养基以执行人类IL-12的ELISA和c-Met的蛋白质印迹，并证实每种基因的表达。
如图7a所示，证实了在HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12(3066.3±165.7pg/mg)和HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12/shc-met(94922.6±185.8pg/mg)重组载体中表达了人类IL-12。
另外，如图7b所示，证实了与HE5cT-Rd19-RGD对照相比，在用HE5cT-Rd19-R GD/shc-met或HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12/shc-met重组载体处理的细胞中，C-met的表达受到抑制。因此，证实了可以有效地诱导***到本发明中制备的重组抗癌腺病毒载体中的治疗基因IL-12和shc-met的表达。
【实验示例6】验证共表达人源IL-12和shc-met的抗癌腺病毒的癌细胞杀伤能力
为了调查共表达人源IL-12和shc-met的抗癌腺病毒的癌细胞杀伤能力，以2、5、10、20或50MOI用根据制备示例2制备的抗癌腺病毒HE5cT-Rd19-RGD；HE5cT-R d19-RGD/hscIL-12；HE5cT-Rd19-RGD/shc-met；或HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12/shc-me t感染人肺癌细胞系H1975，并在常氧条件(常氧)和低氧条件(低氧)下观察到腺病毒的癌细胞杀伤能力。
如图8a和8b所示，证实了HE5cT-Rd19-RGD、HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12、HE5cT-Rd19-RGD/shc-met或HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12/shc-met的癌细胞杀伤能力在常氧条件和低氧条件下与病毒滴度成比例地提高。另外，在50MOI感染条件下，用单一治疗基因(即，HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12或HE5cT-Rd19-RGD/shc-met)处理的群组的癌细胞杀伤能力与HE5cT-Rd19-RGD相比有所提高，但是与单一处理组相比，共表达组(即，HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12/shc-met)诱导了显着提高的癌细胞杀伤能力。该结果指示IL-12和shc-met的共表达在化学疗法中表现出协同作用。
【实验示例7】验证共表达人源IL-12和shc-met的抗癌腺病毒抑制HUVEC迁移和侵袭的能力
据报道在癌细胞中表达的HGF通过激活血管内皮细胞中的C-met信号***来增加癌细胞的迁移和侵袭，并因此诱导异常的血管形成。因此，进行以下实验以证实共表达IL-12和shc-met的抗癌腺病毒是否可以降低HUVEC的转移和侵袭能力。
人肺癌细胞系H1975已感染HE5cT-Rd19-RGD、HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12、HE5cT-Rd19-RGD/shc-met或HE5cT-Rd19-RGD/hscIL-12/shc-met，然后收集上清液以执行迁移和侵袭试验。作为对照，使用未注射抗癌病毒的未处理培养基(新鲜培养基，5％FBS RPMI)和癌细胞培养基(H1975培养基，H1975-CM)。
如图9a、9b、9c和9d所示，证实了与用未处理培养基(新鲜培养基)处理的群组相比，HUVEC在H1975-CM(未被抗癌病毒感染的癌细胞培养基)中的迁移和侵袭能力提高。另一方面，已证实在用HE5cT-Rd19-RGD/HscIL-12或HE5cT-Rd19-RGD/Hsh c-met感染的培养基处理过的癌细胞群组中，与感染HE5cT-Rd19-RGD的群组相比，H UVEC的迁移和侵袭能力降低，具体地，在感染HE5cT-Rd19-RGD/HscIL-12/Hshc-met的癌细胞培养基中，HUVEC的迁移和侵袭能力被显着抑制。这些结果指示，在癌细胞中表达的HGF的量被共表达IL-12和shc-met的抗癌腺病毒有效地抑制，从而在降低HUVEC的迁移和侵袭能力方面产生协同作用。
【实验示例8】证实共表达人源IL-12和shc-met的抗癌腺病毒的上皮间质突变(Endo-MT)抑制作用
为了验证由共表达IL-12和shc-met、H1975的抗癌腺病毒诱导的血管正常化作用，人肺癌细胞系感染了HE5cT-Rd19-RGD、HE5cT-Rd19-RGD/HscIL-12、HE5cT-Rd19-R GD/Hshc-met或HE5cT-Rd19-RGD/HscIL-12/Hshc-met，然后从中收集上清液。在上清液中培养HUVEC细胞，然后通过蛋白质印迹调查内皮或间充质标志物表达的变化。作为对照，使用未处理的培养基(新鲜培养基，5％FBS RPMI)和未感染抗癌病毒的癌细胞培养基。
如图10所示，证实了在用从感染了HE5cT-Rd19-RGD/Hshc-met或HE5cT-Rd19-RGD/HscIL-12/Hshc-met的癌细胞中收集的培养基处理的群组的情况下，与对照(新鲜培养基处理组)相比，间质标志物N-钙粘蛋白和a-SMA的表达减少。其中，用共表达IL-12和shc-met的腺病毒处理的群组表现出最优异的表达减少作用。这些结果指示，IL-12和shc-met的共表达不仅抑制HUVEC细胞的迁移和侵袭能力，而且还抑制endo-MT转化，从而表现出优异的血管再正常化作用。
【实验示例9】证实在人类异种移植肿瘤模型中共表达IL-12和shc-met的抗癌腺病毒的体内抗肿瘤作用
为了验证在人类异种移植肿瘤模型中共表达IL-12和shc-met的本发明的抗癌腺病毒的抗癌治疗作用，使用人肺癌细胞系H1975建立肿瘤模型，并调查其中的抗肿瘤作用。
为了建立人类异种移植肿瘤模型，具体地，以3x106个细胞/50μL将人肺癌细胞系(H1975)皮下注射到裸鼠中，然后，当肿瘤大小达到平均100mm3时，分别施用PBS、HE5cT-Rd19-RGD、HE5cT-Rd19-RGD/HscIL-12、HE5cT-Rd19-RGD/HscIL-met和HE5cT-Rd19-RGD/Hshc-12/Hshc-met。在每两天对肿瘤给药两次(5x106 pfu)后，测量肿瘤大小。
如图11所示，已证实在PBS施用组中肿瘤迅速增殖，但是在施用抗癌腺病毒的所有群组中均观察到显着的抗肿瘤作用。具体地，可以证实，与PBS施用组相比，HE5cT-Rd19-RGD中的肿瘤大小减小了81.7％，HE5cT-Rd19-RGD/HscIL-12中的肿瘤大小减小了85.5％，HE5cT-Rd19-RGD/Hshc-met中的肿瘤大小减小了92.2％，并且HE5cT-Rd19-RGD/HscIL-12/Hshc-met中的肿瘤大小减小了94.6％。通过这些结果，可以证实与单一处理组相比，当使用共表达IL-12和shc-met的抗癌腺病毒时，可以提供协同作用。
【实验示例10】通过共表达IL-12和Lbcpf1-crMET的抗癌腺病毒证实细胞中IL-12表达和C-met表达减少
【实验示例10-1】构建共表达IL-12和C-met靶向CRISPR RNA的抗癌腺病毒
使用3.5代基因剪刀(CRISPR/Cpf1)构建CRISPR RNA***(LbCpf1-crRNA***)，该剪刀可以在切割目标DNA的过程中允许基因校正和期望的突变发生，然后通过细胞内修复***将其重新连接，以调查当在本发明的腺病毒***中使用CRISPR***时是否表现出相同的作用。IL-12序列以与制备示例2相同的方式位于重组载体中，但是包括IRES编码序列(序列ID号20)的序列(序列ID号6)(在图12中指示为HIL-12)放置在IL-12的p35编码序列(序列ID号4)和IL-12的p40编码序列(序列ID号5)之间。
使用程序选择C-met靶指导RNA序列，然后通过仿生学进行寡聚体合成。通过复性执行克隆。将Cpf1蛋白编码基因(序列ID号18)***到RdB-RGD腺病毒的E1位点中，并且将U6启动子定位在表达指导RNA(crC-met)的位点的上游。另外，将IL-12编码序列；以及表达C-met-靶向指导RNA的序列(序列ID号16)***到RdB-RGD腺病毒的E3区域中，从而构建共表达IL-12和CRISPR-CAS***的重组腺病毒。将指导RNA设计为靶向序列ID号10的人类C-met序列的第55个至第77个核苷酸(图12)。
已证实当由所构建的重组腺病毒表达的指导RNA(crcmet)识别靶基因的靶位点并指定要校正的位置时，基因剪刀Cpf1可以切割靶位点，因此可以有效地抑制C-met。
【实验示例10-2】调查由于共表达IL-12和C-met靶向CRISPR RNA的抗癌腺病毒而导致的C-met抑制作用
为了调查由于共表达IL-12和Lbcpf1-crMET的抗癌腺病毒而导致的人源IL-12的表达或通过Lbcpf1-crMET***的C-met表达减少，以5MOI或100MOI用抗癌腺病毒感染人肺癌细胞系H1975，并且在48小时后，收集细胞和培养基并进行人类IL-12ELISA的ELISA或c-Met的蛋白质印迹。
如图13a、13b和13c所示，在分别用RdB-RGD/Lbcpf1/HscIL-12和RdB-RGD/Lbcpf1/HscIL-12-crMET处理的群组中分别证实了9000.0±600.0pg/mL和17400.0±1200.0pg/mL的IL-12表达。另外，证实了在用抗癌病毒处理的所有群组中C-met的表达均被抑制。具体地，RdB-RGD/Lbcpf1/HscIL-12-crMET最有效地减少了C-met的表达。
【实验示例11】证实在人类异种移植肿瘤模型中共表达IL-12和Lbcpf1-crMET的抗癌腺病毒的体内抗肿瘤作用
进行实验以调查通过CRISPR而不是shRNA的C-met表达抑制是否可以与IL-12在人类异种移植肿瘤模型中的表达一起实现。
使用根据实验示例10-1构建的Lbcpf1-crMET***调查了CRISPR对C-met表达的抑制。
为了验证共表达IL-12和Lbcpf1-crMET的抗癌腺病毒的抗癌治疗作用，使用人肺癌细胞系H1975建立肿瘤模型，并调查其中的抗肿瘤作用。以3x106个细胞/50μL将人肺癌细胞系H1975皮下注射到裸鼠中，然后，当肿瘤大小达到平均90mm3时，分别施用PBS、RdB-RGD/Lbcpf1、RdB-RGD/Lbcpf1/HscIL和RdB-RGD/Lbcpf1/HscIL-12-crMET。两天对肿瘤给药三次(5x106 VP)后，测量肿瘤大小以观察抗肿瘤作用。
如图14所示，在PBS施用组中，肿瘤大小在第25天迅速增加到1486.5±221.1mm3，但是在用抗癌病毒处理的所有群组中观察到显着的抗肿瘤作用。在用抗癌病毒处理的群组中，平均肿瘤大小分别为876.9±146.2mm3(RdB-RGD/Lbcpf1)、792.0±230.3mm3(RdB-RGD/Lbcpf1/scIL-12)和535.6±172.6mm3(RdB-RGD/Lbcpf1/scIL-12-crMET)。即，与PBS施用组相比，在用抗癌病毒处理的群组中，肿瘤的大小减少了41.0％、46.7％或64％。具体地，在使用CRISPR方法与IL-12共表达的情况下，肿瘤大小显着减小。因此，证实了当使用CRISPR***时，还表现出由于两个治疗基因而导致的协同作用。
序列表
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60
catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120
ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180
gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240
gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300
gaagagattg atcatgtaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420
aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480
atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540
atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600
atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660
gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcc 759
<210> 2
<211> 921
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atatgggaac tgaagaaaga tgtttatgtc gtagaattgg attggtatcc ggatgcccct 60
ggagaaatgg tggtcctcac ctgtgacacc cctgaagaag atggtatcac ctggaccttg 120
gaccagagca gtgaggtctt aggctctggc aaaaccctga ccatccgagt caaagagttt 180
ggagatgctg gccagtacac ctgtcacaaa ggaggcgagg ttctaagcca ttcgctcctg 240
ctgcttcaca aaaaggaaga tggaatttgg tccactgata ttttaaagga ccagaaagaa 300
cccaaaaata agacctttct aagatgcgag gccaagaatt attctggacg tttcacctgc 360
tggtggctga cgacaatcag tactgatttg acattcagtg tcaaaagcag cagaggctct 420
tctgaccccc aaggggtgac gtgcggagct gctacactct ctgcagagag agtcagaggg 480
gacaacaagg agtatgagta ctcagtggag tgccaggagg acagtgcctg cccagctgct 540
gaggagagtc tgcccattga ggtcatggtg gatgccgttc acaagctcaa gtatgaaaac 600
tacaccagca gcttcttcat cagggacatc atcaaacctg acccacccaa gaacttgcag 660
ctgaagccat taaagaattc tcggcaggtg gaggtcagct gggagtaccc tgacacctgg 720
agtactccac attcctactt ctccctgaca ttctgcgttc aggtccaggg caagagcaag 780
agagaaaaga aagatagagt cttcacggac aagacctcag ccacggtcat ctgccgcaaa 840
aatgccagca ttagcgtgcg ggcccaggac cgctactata gctcatcttg gagcgaatgg 900
gcatctgtgc cctgcagtta g 921
<210> 3
<211> 1725
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human IL-12 (p35-linker-p40)
<400> 3
atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60
catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120
ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180
gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240
gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300
gaagagattg atcatgtaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420
aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480
atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540
atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600
atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660
gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttccg gtggcggtgg ctcgggcggt 780
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctatatgg gaactgaaga aagatgttta tgtcgtagaa 840
ttggattggt atccggatgc ccctggagaa atggtggtcc tcacctgtga cacccctgaa 900
gaagatggta tcacctggac cttggaccag agcagtgagg tcttaggctc tggcaaaacc 960
ctgaccatcc gagtcaaaga gtttggagat gctggccagt acacctgtca caaaggaggc 1020
gaggttctaa gccattcgct cctgctgctt cacaaaaagg aagatggaat ttggtccact 1080
gatattttaa aggaccagaa agaacccaaa aataagacct ttctaagatg cgaggccaag 1140
aattattctg gacgtttcac ctgctggtgg ctgacgacaa tcagtactga tttgacattc 1200
agtgtcaaaa gcagcagagg ctcttctgac ccccaagggg tgacgtgcgg agctgctaca 1260
ctctctgcag agagagtcag aggggacaac aaggagtatg agtactcagt ggagtgccag 1320
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gttcacaagc tcaagtatga aaactacacc agcagcttct tcatcaggga catcatcaaa 1440
cctgacccac ccaagaactt gcagctgaag ccattaaaga attctcggca ggtggaggtc 1500
agctgggagt accctgacac ctggagtact ccacattcct acttctccct gacattctgc 1560
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tatagctcat cttggagcga atgggcatct gtgccctgca gttag 1725
<210> 4
<211> 762
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60
catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120
ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180
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gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420
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gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa 762
<210> 5
<211> 987
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
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accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
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ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
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<210> 6
<211> 2331
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human IL-12 (p35-lRES-p40)
<400> 6
atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60
catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120
ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180
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gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300
gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420
aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480
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gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aagccccccc ccctaacgtt 780
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accccattgt atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc 1260
gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 1320
acgatgataa tatggccaca accaatgtgt caccagcagt tggtcatctc ttggttttcc 1380
ctggtttttc tggcatctcc cctcgtggcc atatgggaac tgaagaaaga tgtttatgtc 1440
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cctgaagaag atggtatcac ctggaccttg gaccagagca gtgaggtctt aggctctggc 1560
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ggaggcgagg ttctaagcca ttcgctcctg ctgcttcaca aaaaggaaga tggaatttgg 1680
tccactgata ttttaaagga ccagaaagaa cccaaaaata agacctttct aagatgcgag 1740
gccaagaatt attctggacg tttcacctgc tggtggctga cgacaatcag tactgatttg 1800
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gctacactct ctgcagagag agtcagaggg gacaacaagg agtatgagta ctcagtggag 1920
tgccaggagg acagtgcctg cccagctgct gaggagagtc tgcccattga ggtcatggtg 1980
gatgccgttc acaagctcaa gtatgaaaac tacaccagca gcttcttcat cagggacatc 2040
atcaaacctg acccacccaa gaacttgcag ctgaagccat taaagaattc tcggcaggtg 2100
gaggtcagct gggagtaccc tgacacctgg agtactccac attcctactt ctccctgaca 2160
ttctgcgttc aggtccaggg caagagcaag agagaaaaga aagatagagt cttcacggac 2220
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cgctactata gctcatcttg gagcgaatgg gcatctgtgc cctgcagtta g 2331
<210> 7
<211> 645
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 7
atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60
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<210> 8
<211> 1005
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 8
tgtcctcaga agctaaccat ctcctggttt gccatcgttt tgctggtgtc tccactcatg 60
gccatgtggg agctggagaa agacgtttat gttgtagagg tggactggac tcccgatgcc 120
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ctgctgctcc acaagaagga aaatggaatt tggtccactg aaattttaaa aaatttcaaa 360
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ccccattcct acttctccct caagttcttt gttcgaatcc agcgcaagaa agaaaagatg 840
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tcatgcagca agtgggcatg tgttccctgc agggtccgat cctag 1005
<210> 9
<211> 1695
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Mouse IL-12 (p35-linker-p40)
<400> 9
atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60
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actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc aaaccagcac attgaagacc 240
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cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat 480
gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga 540
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acgcctgaag aagatgacat cacctggacc tcagaccaga gacatggagt cataggctct 900
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tggtccactg aaattttaaa aaatttcaaa aacaagactt tcctgaagtg tgaagcacca 1080
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ctgtctgcag agaaggtcac actggaccaa agggactatg agaagtattc agtgtcctgc 1260
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<210> 10
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
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cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240
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tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360
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atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540
ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600
ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660
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ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780
ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840
ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900
acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960
tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020
attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080
gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140
aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200
acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260
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tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380
cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440
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agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620
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gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtacttg gtggaaagaa 2280
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acagcactgt tattactact tgggtttttc ctgtggctga aaaagagaaa gcaaattaaa 2940
gatctgggca gtgaattagt tcgctacgat gcaagagtac acactcctca tttggatagg 3000
cttgtaagtg cccgaagtgt aagcccaact acagaaatgg tttcaaatga atctgtagac 3060
taccgagcta cttttccaga agatcagttt cctaattcat ctcagaacgg ttcatgccga 3120
caagtgcagt atcctctgac agacatgtcc cccatcctaa ctagtgggga ctctgatata 3180
tccagtccat tactgcaaaa tactgtccac attgacctca gtgctctaaa tccagagctg 3240
gtccaggcag tgcagcatgt agtgattggg cccagtagcc tgattgtgca tttcaatgaa 3300
gtcataggaa gagggcattt tggttgtgta tatcatggga ctttgttgga caatgatggc 3360
aagaaaattc actgtgctgt gaaatccttg aacagaatca ctgacatagg agaagtttcc 3420
caatttctga ccgagggaat catcatgaaa gattttagtc atcccaatgt cctctcgctc 3480
ctgggaatct gcctgcgaag tgaagggtct ccgctggtgg tcctaccata catgaaacat 3540
ggagatcttc gaaatttcat tcgaaatgag actcataatc caactgtaaa agatcttatt 3600
ggctttggtc ttcaagtagc caaagcgatg aaatatcttg caagcaaaaa gtttgtccac 3660
agagacttgg ctgcaagaaa ctgtatgctg gatgaaaaat tcacagtcaa ggttgctgat 3720
tttggtcttg ccagagacat gtatgataaa gaatactata gtgtacacaa caaaacaggt 3780
gcaaagctgc cagtgaagtg gatggctttg gaaagtctgc aaactcaaaa gtttaccacc 3840
aagtcagatg tgtggtcctt tggcgtcgtc ctctgggagc tgatgacaag aggagcccca 3900
ccttatcctg acgtaaacac ctttgatata actgtttact tgttgcaagg gagaagactc 3960
ctacaacccg aatactgccc agacccctta tatgaagtaa tgctaaaatg ctggcaccct 4020
aaagccgaaa tgcgcccatc cttttctgaa ctggtgtccc ggatatcagc gatcttctct 4080
actttcattg gggagcacta tgtccatgtg aacgctactt atgtgaacgt aaaatgtgtc 4140
gctccgtatc cttctctgtt gtcatcagaa gataacgctg atgatgaggt ggacacacga 4200
ccagcctcct tctgggagac atcatag 4227
<210> 11
<211> 6652
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 11
gctcggcggg gttcggcccg ggccgcaggt gacccggacg gcctcgccgc ccgcagcgtc 60
cgagcccggg tgaccctgtg cggagccaga tgctgggcga ccgctgactc gctggagaag 120
ggcggagcgc gcgggtggtc cccagccggc tgacttcggc gccgcgcgct ccgggcaccc 180
caaggtacaa actccagccg cgtcgatcag gcacccagcc tctcccagcc cctctgcttt 240
ctttgttcca ctaagggaac tggctactgc tctggaggac aagaccaccg aggatggctg 300
tggagagaaa gctgacggtg tagcagaacg cttggcatgt gatcaactcc tcacaatgaa 360
ggctcccacc gtgctggcac ctggcattct ggtgctgctg ttgtccttgg tgcagaggag 420
ccatggggag tgcaaggagg ccctagtgaa gtctgagatg aacgtgaaca tgaagtatca 480
gctccccaac ttcacggcag aaacccccat ccagaatgtc gtcctacacg gccatcatat 540
ttatctcgga gccacaaact acatttatgt tttaaatgac aaagaccttc agaaggtatc 600
cgaattcaag accgggcccg tgttggaaca cccagattgt ttaccttgtc gggactgcag 660
cagcaaagcc aattcatcag gaggggtttg gaaagacaac atcaacatgg ctctgcttgt 720
tgacacatac tatgatgatc aactcattag ctgtggcagt gtcaacagag ggacttgcca 780
gcggcatgtc cttcctcctg acaattctgc tgacatccag tctgaggtcc actgcatgtt 840
ctccccagaa gaggagtcag ggcagtgtcc tgactgtgta gtgagtgccc tcggagccaa 900
agtcctcctg tcggaaaagg accggttcat caatttcttt gtggggaata cgatcaattc 960
ctcctatcct cctggttatt cactgcattc gatatcggtg agacggctga aggaaaccca 1020
agatggtttt aagtttttga cagaccagtc ctatattgat gtcttaccag aattccaaga 1080
ttcctacccc ataaagtaca tacatgcctt cgaaagcaac cattttattt actttctgac 1140
tgtccaaaag gaaactctag atgctcagac ttttcataca agaataatca ggttctgttc 1200
cgtagactct gggttgcact cctacatgga aatgcccctg gaatgcatcc tgacagaaaa 1260
aagaaggaag agatccacaa gggaagaagt gtttaatatc ctccaagccg cgtatgtcag 1320
taaaccaggg gccaatcttg ctaagcaaat aggagctagc ccttctgatg acattctctt 1380
cggggtgttt gcacaaagca agccagattc tgctgaacct gtgaatcgat cagcagtctg 1440
tgcattcccc atcaaatatg tcaatgactt cttcaacaag attgtcaaca aaaacaacgt 1500
gagatgtctc cagcattttt acggacccaa ccatgagcac tgtttcaata ggaccctgct 1560
gagaaactct tccggctgtg aagcgcgcag tgacgagtat cggacagagt ttaccacggc 1620
tttgcagcgc gtcgacttat tcatgggccg gcttaaccaa gtgctcctga catccatctc 1680
caccttcatc aaaggtgacc tcaccattgc taatctaggg acgtcagaag gtcgcttcat 1740
gcaggtggtg ctctctcgaa cagcacacct cactcctcat gtgaacttcc tcctggactc 1800
ccatcctgta tctccagaag ttattgttga gcatccatca aatcaaaatg gctatacatt 1860
ggttgtcaca ggaaagaaga tcaccaagat tccattgaat ggcctgggct gtggacattt 1920
ccaatcctgc agtcagtgcc tctctgcccc ttactttata cagtgtggct ggtgccacaa 1980
tcaatgtgtg cgttttgatg aatgccccag cggtacatgg actcaagaga tctgtctgcc 2040
ggcggtttat aaggtgttcc ccaccagcgc gccccttgaa ggaggaacag tgttgaccat 2100
atgtggctgg gactttggat tcaggaagaa taataaattt gatttaagga aaaccaaagt 2160
tctgcttggc aacgagagct gtaccttgac cttaagcgag agcacgacaa atacgttgaa 2220
atgcacagtt ggtcccgcga tgagtgagca cttcaatgtg tctgtaatta tctcaaacag 2280
tcgagagacg acgcaataca gtgcattctc ctatgtagat cctgtaataa caagcatttc 2340
tccgaggtac ggccctcagg ctggaggcac cttactcact cttactggga aatacctcaa 2400
cagtggcaat tctagacaca tttcaattgg agggaaaaca tgtactttaa aaagtgtatc 2460
agatagtatt cttgaatgct acaccccagc ccaaactacc tctgatgagt ttcctgtgaa 2520
attgaagatt gacttggcta accgagagac cagcagcttc agttaccggg aagaccccgt 2580
tgtctatgaa atccacccga ccaaatcttt tattagtggt ggaagcacaa taacgggtat 2640
tgggaagacc ctgaactcgg ttagcctccc aaagctggta atagatgtgc atgaagtggg 2700
tgtgaactac acagtggcat gtcagcatcg ctcaaattca gagatcatct gctgcactac 2760
tccttcactg aaacagctgg gcctgcaact ccccctgaag accaaagcct tcttcctgtt 2820
agacgggatt ctttccaaac actttgatct cacttatgtg cataatcctg tgtttgagcc 2880
ttttgaaaag ccagtaatga tctcaatagg caatgaaaat gtagtggaaa ttaagggaaa 2940
caatattgac cctgaagcag ttaaaggtga agtgttaaaa gttggaaatc agagctgcga 3000
gagtctccac tggcactctg gagctgtgtt gtgtacagtc cccagtgacc tgctcaaact 3060
gaacagcgag ctaaatatag agtggaagca agcagtctct tcaactgttc ttggaaaagt 3120
gatcgttcaa ccggatcaga attttgcagg attgatcatt ggtgcggtct caatatcagt 3180
agtagttttg ttattatccg ggctcttcct gtggatgaga aagagaaagc ataaagatct 3240
gggcagtgaa ttagttcgct atgacgcaag agtacacact cctcatttgg ataggcttgt 3300
aagtgcccga agtgtaagtc caactacaga gatggtttca aatgagtctg tagactacag 3360
agctactttt ccagaagacc agtttcccaa ctcctctcag aatggagcat gcagacaagt 3420
gcaataccct ctgacagacc tgtcccctat cctgacaagt ggagactctg atatatccag 3480
cccattacta caaaatactg ttcacattga cctcagtgct ctaaatccag agctggtcca 3540
agcagttcag cacgtagtga ttggacccag cagcctgatt gtgcatttca atgaagtcat 3600
aggaagaggg cattttggct gtgtctatca tgggactttg ctggacaatg acggaaagaa 3660
aattcactgt gctgtgaaat ccttaaatag aatcacagat atagaagagg tctcccagtt 3720
tctgactgag ggaatcatca tgaaagactt cagccatccc aatgttctct cactcttggg 3780
aatctgcctg aggagtgaag ggtctcctct ggtggtcctg ccctatatga agcatggaga 3840
tctgcgaaat ttcattcgaa acgagactca taatccaact gtgaaagatc ttataggatt 3900
tggccttcaa gtagccaaag gcatgaaata tcttgccagc aaaaagtttg tccacagaga 3960
cttagctgca agaaactgca tgttggatga aaaattcact gtcaaggttg ctgatttcgg 4020
tcttgccaga gacatgtacg ataaagagta ctatagtgtc cacaacaaga cgggtgccaa 4080
gctaccagta aagtggatgg ctttagagag tctgcaaacg cagaagttca ccaccaagtc 4140
agatgtgtgg tcctttggtg tgctcctctg ggagctcatg acgagaggag cccctcctta 4200
tcccgacgtg aacacatttg atatcactat ctacctgttg caaggcagaa gactcttgca 4260
accagaatac tgtccagacg ccttgtacga agtgatgcta aaatgctggc accccaaagc 4320
ggaaatgcgc ccgtcctttt ccgaactggt ctccaggata tcctcaatct tctccacgtt 4380
cattggggaa cactacgtcc acgtgaacgc tacttatgtg aatgtaaaat gtgttgctcc 4440
atatccttct ctgttgccat cccaagacaa cattgatggc gaggggaaca catgatgaat 4500
gagaggtcca ccagcccact tccaagaaac agttctggcc caaaccagac tatcccttcc 4560
ccaacagttc tcactgcctg gcctttggaa ggtcacttaa catttgttgt tgttttgttt 4620
tgttttttgt tttgcttttg cggtaactgc accactatga aacattgact tgctatttca 4680
aattcctgga ttctaaggaa tttctcatct gacaatggaa cagaaataga agcatggccc 4740
ccacaggctg gggaccagtg gcaacctgca gctacaacac tcctatctca gcggaattct 4800
aaatctcagt tctggcttaa aagttttaaa aataagatat atatacatat atatatccaa 4860
tacaatgaac tttgaagatt tctcagaaaa ctcagaagaa acgccctctt tcaggataaa 4920
tgtggtgttc ctagcaggct gcttgttgaa attccagtgt tttaaaaata tttttgttgt 4980
gttgcagtcg tgaacatttt ccatttctga tgttgtctgc ccatcaggca aacattccct 5040
tttaaatgct tatatacaca ttccttaggt tggaagaata tccacggaca atgcacttat 5100
ttttaaacga gcatgacatg aggtgtgttt ataaattatc agggatttta tgtattgtac 5160
atagatgaca ataggaaatt gtttatttca agaaatagct ttgttacagt aaaatatttg 5220
tcatttaaaa cccagctgtt tagcaaggag tgttggctca cacctacaat cccagcattt 5280
gggaagctga ggcaagcaga ttaccacaag tttgaaacca accttggctg catacagatg 5340
atgtatatat aggccagcat gggttacact gtctgtctta gcaaacaaaa tttcaactgt 5400
ttgagaaaga ttttgttctg atctaatgaa tgtggacatt taaatttttt atctgttttt 5460
taatggcaac tttggaaata agtaacttgc ggtgataaat ctttttaaag gcaactcagt 5520
attttttaaa ggacaaaata aactgactga agggttcgct acttccagtc acaacctgtg 5580
tatagaagaa agaaagggtc agtgatcgag aatcagacac tctcgttcag gaggaggctt 5640
ctcgcctgaa acaattgcac ccaacacttt tggggaagtc tcatttttgc attaggacat 5700
attttaggtt aaacaaaagc atattttaga aacagacaaa agccaactga aaatcgtgga 5760
tgaatagtta ctctggacag gacttttgac atgtcttgct ctgtggaatt ttgtgcttac 5820
tactgtatag tgcatgtggc ttaggttacc ctagctggtt ttgtccgtgt aaacattgaa 5880
agtattatat ttttatagaa atgtttattt ttaatgatgt aagaaaaatt ttccttaggc 5940
cgcagaaatc ctgcactgtg agcatttcag aagaggtatg tgagacccag ttcaacgaca 6000
gcatgatttt ttaaatggct gtaagttatg ataaggaaat gtactgattg ccagtgcact 6060
ccaccctcat tacgtcacca ggacttgaag ccaagggtta agagggcaag ctatgacatg 6120
ggtgtgtggt ctgctgaaac ccaatcgttg aacttggctg ttgttacagg aaaatgatgg 6180
catcaacagg tctttgatgg tggtggagca tatcagaaca cataaggaac tgtagcccag 6240
atttatttca attcaaatat tactgcttcg taattatgaa gagtagtgca aatttacaga 6300
gcactgtcaa agactgacag aaaaaaaaaa gatctgctct gtagaaagaa ttgtctgcca 6360
ttacagggtc aagaaaatga atgcgccaat aacagtaaga gctgtggaag acacccatac 6420
ctgtatatac atgctcgaga aagctgtaat gtgaaaatca tgttctctat ttatgactct 6480
tcctagggca atgtgtctgg acagattgta agagtaagtc attttcctaa agaattagat 6540
atttgtcact gcctatacct gcagttgagc tgaatggtac tccatgtgtt aataattgtt 6600
ctgatgaatc atacagttga aataaagtga cgtaacatct tgtatactgt ga 6652
<210> 12
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> shRNA SEQ. for Human c-met
<400> 12
caaactagag ttctccttgg aattcaagag attccaagga gaactctagt ttttttttgg 60
aa 62
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Target sequence in Human c-met
<400> 13
aaactagagt tctccttgga a 21
<210> 14
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> shRNA SEQ for Mouse c-met
<400> 14
ctccacgtga acgctactta tgtgaattca agagattcac ataagtagcg ttcacgtgga 60
tttttggaa 69
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Target sequence in Mouse c-met
<400> 15
tccacgtgaa cgctacttat gtgaa 25
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CRISPR gRNA SEQ for Human c-met
<400> 16
aatttctact aagtgtagat aatttctact aagtgtagat cactccccat tgctcctctg 60
cac 63
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Target sequence in Human c-met
<400> 17
gtgcagagga gcaatgggga gtg 23
<210> 18
<211> 3684
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lbcpf1 SEQ
<400> 18
atgagcaagc tggagaagtt tacaaactgc tactccctgt ctaagaccct gaggttcaag 60
gccatccctg tgggcaagac ccaggagaac atcgacaata agcggctgct ggtggaggac 120
gagaagagag ccgaggatta taagggcgtg aagaagctgc tggatcgcta ctatctgtct 180
tttatcaacg acgtgctgca cagcatcaag ctgaagaatc tgaacaatta catcagcctg 240
ttccggaaga aaaccagaac cgagaaggag aataaggagc tggagaacct ggagatcaat 300
ctgcggaagg agatcgccaa ggccttcaag ggcaacgagg gctacaagtc cctgtttaag 360
aaggatatca tcgagacaat cctgccagag ttcctggacg ataaggacga gatcgccctg 420
gtgaacagct tcaatggctt taccacagcc ttcaccggct tctttgataa cagagagaat 480
atgttttccg aggaggccaa gagcacatcc atcgccttca ggtgtatcaa cgagaatctg 540
acccgctaca tctctaatat ggacatcttc gagaaggtgg acgccatctt tgataagcac 600
gaggtgcagg agatcaagga gaagatcctg aacagcgact atgatgtgga ggatttcttt 660
gagggcgagt tctttaactt tgtgctgaca caggagggca tcgacgtgta taacgccatc 720
atcggcggct tcgtgaccga gagcggcgag aagatcaagg gcctgaacga gtacatcaac 780
ctgtataatc agaaaaccaa gcagaagctg cctaagttta agccactgta taagcaggtg 840
ctgagcgatc gggagtctct gagcttctac ggcgagggct atacatccga tgaggaggtg 900
ctggaggtgt ttagaaacac cctgaacaag aacagcgaga tcttcagctc catcaagaag 960
ctggagaagc tgttcaagaa ttttgacgag tactctagcg ccggcatctt tgtgaagaac 1020
ggccccgcca tcagcacaat ctccaaggat atcttcggcg agtggaacgt gatccgggac 1080
aagtggaatg ccgagtatga cgatatccac ctgaagaaga aggccgtggt gaccgagaag 1140
tacgaggacg atcggagaaa gtccttcaag aagatcggct ccttttctct ggagcagctg 1200
caggagtacg ccgacgccga tctgtctgtg gtggagaagc tgaaggagat catcatccag 1260
aaggtggatg agatctacaa ggtgtatggc tcctctgaga agctgttcga cgccgatttt 1320
gtgctggaga agagcctgaa gaagaacgac gccgtggtgg ccatcatgaa ggacctgctg 1380
gattctgtga agagcttcga gaattacatc aaggccttct ttggcgaggg caaggagaca 1440
aacagggacg agtccttcta tggcgatttt gtgctggcct acgacatcct gctgaaggtg 1500
gaccacatct acgatgccat ccgcaattat gtgacccaga agccctactc taaggataag 1560
ttcaagctgt attttcagaa ccctcagttc atgggcggct gggacaagga taaggagaca 1620
gactatcggg ccaccatcct gagatacggc tccaagtact atctggccat catggataag 1680
aagtacgcca agtgcctgca gaagatcgac aaggacgatg tgaacggcaa ttacgagaag 1740
atcaactata agctgctgcc cggccctaat aagatgctgc caaaggtgtt cttttctaag 1800
aagtggatgg cctactataa ccccagcgag gacatccaga agatctacaa gaatggcaca 1860
ttcaagaagg gcgatatgtt taacctgaat gactgtcaca agctgatcga cttctttaag 1920
gatagcatct cccggtatcc aaagtggtcc aatgcctacg atttcaactt ttctgagaca 1980
gagaagtata aggacatcgc cggcttttac agagaggtgg aggagcaggg ctataaggtg 2040
agcttcgagt ctgccagcaa gaaggaggtg gataagctgg tggaggaggg caagctgtat 2100
atgttccaga tctataacaa ggacttttcc gataagtctc acggcacacc caatctgcac 2160
accatgtact tcaagctgct gtttgacgag aacaatcacg gacagatcag gctgagcgga 2220
ggagcagagc tgttcatgag gcgcgcctcc ctgaagaagg aggagctggt ggtgcaccca 2280
gccaactccc ctatcgccaa caagaatcca gataatccca agaaaaccac aaccctgtcc 2340
tacgacgtgt ataaggataa gaggttttct gaggaccagt acgagctgca catcccaatc 2400
gccatcaata agtgccccaa gaacatcttc aagatcaata cagaggtgcg cgtgctgctg 2460
aagcacgacg ataaccccta tgtgatcggc atcgataggg gcgagcgcaa tctgctgtat 2520
atcgtggtgg tggacggcaa gggcaacatc gtggagcagt attccctgaa cgagatcatc 2580
aacaacttca acggcatcag gatcaagaca gattaccact ctctgctgga caagaaggag 2640
aaggagaggt tcgaggcccg ccagaactgg acctccatcg agaatatcaa ggagctgaag 2700
gccggctata tctctcaggt ggtgcacaag atctgcgagc tggtggagaa gtacgatgcc 2760
gtgatcgccc tggaggacct gaactctggc tttaagaata gccgcgtgaa ggtggagaag 2820
caggtgtatc agaagttcga gaagatgctg atcgataagc tgaactacat ggtggacaag 2880
aagtctaatc cttgtgcaac aggcggcgcc ctgaagggct atcagatcac caataagttc 2940
gagagcttta agtccatgtc tacccagaac ggcttcatct tttacatccc tgcctggctg 3000
acatccaaga tcgatccatc taccggcttt gtgaacctgc tgaaaaccaa gtataccagc 3060
atcgccgatt ccaagaagtt catcagctcc tttgacagga tcatgtacgt gcccgaggag 3120
gatctgttcg agtttgccct ggactataag aacttctctc gcacagacgc cgattacatc 3180
aagaagtgga agctgtactc ctacggcaac cggatcagaa tcttccggaa tcctaagaag 3240
aacaacgtgt tcgactggga ggaggtgtgc ctgaccagcg cctataagga gctgttcaac 3300
aagtacggca tcaattatca gcagggcgat atcagagccc tgctgtgcga gcagtccgac 3360
aaggccttct actctagctt tatggccctg atgagcctga tgctgcagat gcggaacagc 3420
atcacaggcc gcaccgacgt ggattttctg atcagccctg tgaagaactc cgacggcatc 3480
ttctacgata gccggaacta tgaggcccag gagaatgcca tcctgccaaa gaacgccgac 3540
gccaatggcg cctataacat cgccagaaag gtgctgtggg ccatcggcca gttcaagaag 3600
gccgaggacg agaagctgga taaggtgaag atcgccatct ctaacaagga gtggctggag 3660
tacgcccaga ccagcgtgaa gcac 3684
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> linker sequence for IL-12
<400> 19
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 20
<211> 582
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> lRES sequence
<400> 20
gccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc 60
tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc 120
cctgtcttct tgacgagcat tcctagctag gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca 180
aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac 240
gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg 300
ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt 360
gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca acaaggggct 420
gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg 480
ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt 540
ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata tggccacaac ca 582

Claims (15)

1.一种腺病毒***，包括：
白介素12(IL-12)编码基因；以及
表达寡核苷酸的基因，所述寡核苷酸与C-met的mRNA互补并抑制C-met的表达。
2.根据权利要求1所述的腺病毒***，其特征在于，所述白介素12编码基因包括IL-12A(p35)基因序列和IL-12B(p40)基因序列。
3.根据权利要求1所述的腺病毒***，其特征在于，所述白介素12(IL-12)编码基因在所述IL-12A(p35)基因序列与所述IL-12B(p40)基因序列之间还包括接头序列或内部核糖体进入位点(IRES)序列。
4.根据权利要求1所述的腺病毒***，其特征在于，所述白介素12(IL-12)编码基因被***到所述腺病毒***中腺病毒基因的E1B或E3区域中。
5.根据权利要求1所述的腺病毒***，其特征在于，与所述C-met基因互补结合以抑制C-met表达的所述寡核苷酸是选自包括小发夹RNA(shRNA)、miRNA、siRNA、反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶、肽核酸(PNA)和CRISPR的指导RNA的所述群组的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的腺病毒***，其特征在于，编码抑制C-met表达的所述寡核苷酸的所述基因被***到所述腺病毒***中腺病毒基因的E1B或E3区域中。
7.根据权利要求1所述的腺病毒***，其中所述腺病毒***是重组腺病毒或重组腺病毒DNA。
8.根据权利要求1所述的腺病毒***，其特征在于，当与所述C-met基因互补结合以抑制C-met表达的所述寡核苷酸是CRISPR的指导RNA时，所述腺病毒***还包括表达Cas蛋白的核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的腺病毒***，其特征在于，还包括与所述腺病毒***组合的形式的生物相容性聚合物。
10.根据权利要求9所述的腺病毒***，其特征在于，所述生物相容性聚合物选自PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI(PAPS)、mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG(PPSA)、聚乙二醇化和氧化铁纳米粒子交联的邻苯二酚接枝聚赖氨酸(PICION)、精氨酸接枝的生物可降解聚合物(ABP)、聚乙二醇化和PTX共轭的聚合物胶束(APP)、mPEG-b-Pip-CBA(PPCBA)、PPCBA-PEI-精氨酸(PPA)、聚(酰胺基胺)树状大分子(PAMAM)、聚乙二醇(PEG)、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚羟基乙酸(PLGA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚乙烯胺(PEI)、透明质酸(HA)、明胶、壳聚糖和血清白蛋白。
11.一种抗癌组合物，其包括根据权利要求1至10中任一项的所述腺病毒***。
12.根据权利要求11所述的抗癌组合物，其特征在于，所述癌症是胃癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、结肠癌、***、骨癌、非小细胞骨癌、血癌、皮肤癌(黑色素瘤等)、头颈癌、子宫癌、直肠癌、***癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、多倍体癌、唾液腺癌、肉瘤癌、假性粘液瘤、肝母细胞瘤、睾丸癌、成胶质细胞瘤、唇裂癌、卵巢生殖细胞瘤、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、胆囊癌、脉络膜黑色素瘤、壶腹癌、腹膜癌、肾上腺癌、舌癌、小细胞癌、小儿淋巴瘤、神经母细胞瘤、十二指肠癌、输尿管癌、星形细胞瘤、脑膜瘤、肾癌、外阴癌、胸腺癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤。
13.根据权利要求11所述的抗癌组合物，其特征在于，所述组合物是肿瘤内给药的。
14.一种用于增强抗肿瘤免疫的组合物，其包括根据权利要求1至10中任一项的所述腺病毒***。
15.根据权利要求14所述的用于增强抗肿瘤免疫的组合物，其特征在于，所述组合物是肿瘤内给药的。
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