ES2748295T3 - Anticuerpos anti-MET y composiciones - Google Patents

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Abstract

Una composición de anticuerpos que comprende un primer anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo y un segundo anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde: a) la cadena pesada (H) CDR1-3 y la cadena ligera (L) CDR1-3 de dicho primer anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente; y b) la cadena pesada (H) CDR1-3 y la cadena ligera (L) CDR1-3 de dicho segundo anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-MET y composiciones
Campo de la Invención
Esta invención se refiere a anticuerpos anti-MET y composiciones de anticuerpos y sus usos para el tratamiento del cáncer.
Antecedentes de la Invención
MET (también conocido como c-MET) es un receptor de tirosina quinasa que comprende una subunidad a de 50 kDa y una subunidad p de 145 kDab. El único ligando conocido para MET es el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), que también se conoce como factor de dispersión. La unión de HGF a MET conduce a dimerización del receptor y autofosforilación de los residuos de subunidad p Y1349 y Y1356, que activan las vías de señalización en dirección 3’ que incluyen la vía de fosfoinositol 3-quinasa (PI3K)-proteína quinasa B (Akt), la vía del transductor de señal y activador del factor de transcripción (STAT), la vía de proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), y la vía del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NFkB). Esto conduce en última instancia al aumento de la mitogénesis, proliferación celular, supervivencia celular y motilidad celular. La desregulación de la actividad de MET o HGF puede ocurrir, por ejemplo, mediante sobreexpresión, amplificación génica, mutación o empalme alternativo de MET, o mediante señalización de bucle autocrino/paracrino inducida por ligando de HGF. Esa desregulación juega un papel en muchos cánceres facilitando la invasividad del cáncer, angiogénesis, metástasis y crecimiento tumoral, conduciendo así a un fenotipo de cáncer más agresivo y un peor pronóstico.
También se sabe que MET interactúa con las vías de señalización que implica otros receptores, tales como EGFR, TGF-p, y HER3, y puede jugar un papel en la resistencia a los tratamientos dirigidos a esos receptores. Los inhibidores de MET, tales como anticuerpos anti-MET, por lo tanto pueden ser eficaces en combinación con otros inhibidores de receptores para superar los fenotipos resistentes.
Los inhibidores de MET actuales incluyen tanto anticuerpos monoclonales, que pueden ser dirigidos ya sea a MET o su ligando, HGF, e inhibidores de la quinasa de molécula pequeña. Los anticuerpos conocidos dirigidos a la vía MET incluyen el anticuerpo anti-MET humanizado onartuzumab (OA-5D5, OAM4558g, MetMAb); el anticuerpo anti-HGF humanizado ficlatuzumab (AV-299); el anticuerpo anti-HGF humano rilotumumab (AMG102); el anticuerpo anti-HGF humanizado TAK701; el anticuerpo IgG4 anti-c-MET humanizado LY2875358/LA480; el anticuerpo anti-c-MET humanizado ABT-700 (H224G11); y el anticuerpo anti-c-MET ARGX-111 (36C4). Los inhibidores del receptor de tirosina quinasa de molécula pequeña anti-MET conocidos incluyen tivantinib, cabozantinib, foretinib, golvatinib y crizotinib. Sin embargo, no se han aprobado anticuerpos anti-MET para uso terapéutico. Se han evaluado anticuerpos anti-met en varios modelos de xenoinjerto de ratón (documentos WO 2012/059562, WO 2010/059654, WO 2009/142738 y Van der Horst et al. (2009), Neoplasia 11 (4):355-364). En ninguno de estos modelos se observó regresión tumoral.
En vista del papel fundamental de MET en la progresión del cáncer, hay una necesidad de nuevas y mejores terapias que se dirigen a MET.
Sumario de la Invención
La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos recombinantes dirigidos a MET, así como composiciones que comprenden dos o más de estos anticuerpos, y el uso de los anticuerpos y composiciones para el tratamiento de cánceres incluyendo el cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, cáncer esofágico, cáncer colorrectal, carcinoma de células papilares de riñón, glioblastoma, carcinoma adrenocortical, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y otros cánceres que expresan o sobreexpresan MET o se basan en la activación de la vía MET. En comparación con los tratamientos actualmente disponibles para esos cánceres, incluyendo tratamientos de anticuerpos, se contempla que los anticuerpos de la invención proveen una respuesta clínica superior ya sea solos o en una composición que comprende dos o más de esos anticuerpos. La invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Se describe en el presente documento una composición de anticuerpos que comprende un primer anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo y un segundo anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo.
El primer anticuerpo anti-MET puede competir por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-c Dr3 que comprenden la secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente, y el segundo anticuerpo anti-MET compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
El primer anticuerpo anti-MET se puede unir al mismo epítopo de MET humano como un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente, y el segundo anticuerpo anti-MET se une al mismo epítopo de MET humano como un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente. En algunas modalidades, el primer anticuerpo MET puede unirse a SEMA-a hoja 3, y el segundo anticuerpo MET puede unirse a SEMA-a hoja 2. Una combinación de estos anticuerpos se dirige a ambos epítopos y produce efectos inhibidores sinérgicos sorprendentes sobre la vía de señalización de MET. Los inventores de la presente han descubierto que el direccionamiento combinado de estos epítopos produce una actividad inhibidora sorprendentemente alta sobre la vía de señalización MET.
Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende una H-CDR1, H-DR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 21, 22 y 23, respectivamente. Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que es por lo menos 90% idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14. Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14. Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende una cadena pesada (HC) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, 25 y 26, respectivamente. Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que es por lo menos 90% idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 16. Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 16. Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende una cadena ligera (LC) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET comprende una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En la invención, el primer anticuerpo anti-MET comprende una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente. En algunas modalidades, el primer anticuerpo anti-MET comprende un VH que es por lo menos 90% idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14 y un VL que es por lo menos 90% idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 16. En algunas modalidades, el primer anticuerpo anti-MET comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID: 8 o 16. En algunas modalidades, el primer anticuerpo anti-MET comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, el primer anticuerpo anti-MET comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, el primer anticuerpo anti-MET comprende una HC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28 y 29, respectivamente. Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende un VH que es por lo menos 90% idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 18. Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 18. Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende una HC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende una L-CDR1, L-CDR2 Y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 31 y 32, respectivamente. Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende un VL que es por lo menos 90% idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20. Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20. Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
Tal como se describe en el presente documento, el segundo anticuerpo anti-MET comprende una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En la invención, el segundo anticuerpo anti-MET comprende una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente. En algunas modalidades, el segundo anticuerpo anti-MET comprende un VH que es por lo menos 90% idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 18 y un VL que es por lo menos 90% idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20. En algunas modalidades, el segundo anticuerpo anti-MET comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 18 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20. En algunas modalidades, el segundo anticuerpo anti-MET comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el segundo anticuerpo anti-MET comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En algunas modalidades, el segundo anticuerpo anti-MET comprende una HC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
Las composiciones de anticuerpos que comprenden cualquier combinación del primer y segundo anticuerpos anti-MET también se describen en este documento.
Tal como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo anti-MET tiene una H-CDR3 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 23 y 26, respectivamente, y el segundo anticuerpo anti-MET tiene una H-CDR3 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 29 y 32, respectivamente. En la invención, el primer anticuerpo anti-MET tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3 y L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente, y el segundo anticuerpo anti-MET tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3 y L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
En algunas modalidades, el VH y VL del primer anticuerpo anti-MET son por lo menos 90% idénticos en secuencia a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6 y 8, respectivamente, y el VH y VL del segundo anticuerpo anti-MET son por lo menos 90% idénticos en secuencia a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 10 y 12, respectivamente. En algunas modalidades, el VH y VL del primer anticuerpo anti-MET son por lo menos 90% idénticos en secuencia a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 14 y 16, respectivamente, y el VH y VL del segundo anticuerpo anti-MET por lo menos 90% idénticos en secuencia a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 y 20, respectivamente. En algunas modalidades, el VH y VL del primer anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y 8, respectivamente, y el VH y VL del segundo anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 10 y 12, respectivamente. En algunas modalidades, el VH y VL del primer anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y 16, respectivamente, y el VH y VL del segundo anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 y 20, respectivamente. En algunas modalidades, el HC y LC del primer anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y 33, respectivamente, y el HC y LC del segundo anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 36 y 35, respectivamente.
En algunas modalidades de las composiciones de anticuerpos anti-MET descritos en este documento, el primer anticuerpo anti-MET, el segundo anticuerpo anti-MET, o ambos, son de isotipo IgG. En ciertas modalidades, el primer anticuerpo anti-MET, el segundo anticuerpo anti-MET, o ambos, son de la subclase de isotipo IgG1.
En algunas modalidades, por lo menos uno, por lo menos dos, o todos de los anticuerpos anti-MET en una composición descrita en la presente memoria inhiben el crecimiento tumoral in vivo y preden, además, tener por lo menos una propiedad, o cualquier combinación de propiedades, seleccionadas del grupo constituido por:
• no se une a MET de ratón o de pollo;
• se une a un epítopo de MET humano que comprende residuos que están presentes en el dominio SEMA;
• induce la degradación del MET;
• se une a MET humano con una Kd de 1 x 10-9 M o menos;
• inhibe el crecimiento in vitro de por lo menos una línea celular seleccionada de SNU5, EBC1, MKN45, KatoII, OE33 y Okajima;
• inhibe la fosforilación de MET;
• inhibe la señalización en dirección 3’ de MET; e
• inhibe la proliferación de células endoteliales primarias en presencia o ausencia de HGF.
En algunas modalidades, cualquiera de las composiciones de anticuerpos anti-MET descritos en este documento inhiben el crecimiento tumoral in vivo y preden, además, tener por lo menos una propiedad, o cualquier combinación de propiedades, seleccionadas del grupo constituido por:
• induce la degradación del MET;
• inhibe el crecimiento in vitro de por lo menos una línea celular seleccionada de SNU5, EBC1, MKN45, KatoII, OE33 y Okajima;
• inhibe la fosforilación de MET;
• inhibe la señalización en dirección 3’ de MET; e
• inhibe la proliferación de células endoteliales primarias en presencia o ausencia de HGF.
La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las composiciones de anticuerpos anti-MET descritos en este documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también provee un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo o porción puede competir por la unión a MET humano con un anticuerpo cuyas H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos de la SeQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente. El anticuerpo o porción puede competir por la unión a MET humano con un anticuerpo cuyas H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos de la sEq ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
El anticuerpo o porción se puede unir al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo cuyas H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente. El anticuerpo o porción se puede unir al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo, cuyas H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y/o una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22 y 23, respectivamente y/o una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 24, 25 y 26, respectivamente, un VH con una identidad de secuencia de por lo menos 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14 y/o un VL con una identidad de secuencia de por lo menos 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 16; o un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14 y/o un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 16. En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende una HC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 23; una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22 y 23, respectivamente; un VH con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14; un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14; o una HC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; y que comprende además una cadena ligera que comprende una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 24, 25 y 26, respectivamente; un VL con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 8 o 16; un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 16; o una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y/o una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28 y 29, respectivamente y/o una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 30, 31 y 32, respectivamente; un VH con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 10 o 18; y/o un VL con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20; o un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 18 y/o un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20. En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una HC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 29; una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28 y 29, respectivamente; un VH con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 18; un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 18; o una HC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; y comprende además una cadena ligera que comprende una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, 31 y 32, respectivamente; un VL con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20; un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20; o una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
En la invención, el anticuerpo tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente.
En la invención, el anticuerpo tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
En algunas modalidades, el anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14 y un dominio variable de cadena ligera (VL) con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 16.
En algunas modalidades, el anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 18 y un dominio variable de cadena ligera (VL) con por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20.
En algunas modalidades, el anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En algunas modalidades, el anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, el anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En algunas modalidades, el anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
En algunas modalidades, el anticuerpo tiene una cadena pesada (HC) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera (LC) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
En algunas modalidades, el anticuerpo tiene una cadena pesada (HC) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera (LC) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
La invención también provee versiones humanizadas de anticuerpos quiméricos y porciones de unión a antígeno aquí descritas, en particular los anticuerpos y porciones de unión a antígeno con secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera en relación con SEQ ID NOs: 6 y 8, respectivamente, o SEQ ID NOs: 10 y 12, respectivamente.
En algunas modalidades de los anticuerpos y porciones de unión a antígeno que se describen en el presente documento, el anticuerpo puede ser de isotipo IgG. En ciertas modalidades, el anticuerpo es de la subclase de isotipos IgG1.
En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe el crecimiento tumoral in vivo y puede, además, tener por lo menos una propiedad, o cualquier combinación de propiedades, seleccionada del grupo constituido por:
• no se une a MET de ratón o de pollo;
• se une a un epítopo de MET humano que comprende residuos que están presentes en el dominio SEMA;
• induce la degradación de MET;
• se une a MET humano con una Kd de 1 x 10-9 M o menos;
• inhibe el crecimiento in vitro de por lo menos una línea celular seleccionada de SNU5, EBC1, MKN45, KatoII, OE33 y Okajima;
• inhibe la fosforilación de MET;
• inhibe la señalización en dirección 3’ de MET; e
• inhibe la proliferación de células endoteliales primarias en presencia o ausencia de HGF.
La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende ambos de los anticuerpos anti-MET o porciones de unión a antígeno de los mismos descritos en este documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se describe en el presente documento una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno del mismo, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígeno del mismo, o ambos, de un anticuerpo anti-MET descrito en el presente documento. La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 o 19.
La presente invención también provee un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada, en donde el vector comprende además una secuencia de control de expresión.
También se describe en el presente documento una célula hospedera que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígeno de la misma, o ambos, de un anticuerpo anti-MET descrito en el presente documento. La célula hospedera comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 o 19.
También se describe en el presente documento un animal transgénico no humano o planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígeno de la misma, o ambos, de un anticuerpo anti-MET descrito en el presente documento, en donde el animal o planta expresa la secuencia o secuencias de nucleótidos. El animal o planta puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 o 19.
La presente invención también provee un método para producir un anticuerpo anti-MET o parte de unión a antígeno del mismo descrito en este documento, que comprende proveer la célula hospedera descrita anteriormente, cultivar la célula hospedera en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o porción, y aislar el anticuerpo o porción resultante.
La presente invención también provee un método para producir una composición de anticuerpos anti-MET descrita en este documento, que comprende proveer una primera célula hospedera capaz de expresar un primer anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno como se describe en este documento y una segunda célula hospedera capaz de expresar un segundo anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno como se describe en este documento, cultivar la primera y segunda células hospederas en condiciones adecuadas para la expresión de los anticuerpos o porciones, y aislar los anticuerpos o porciones resultantes. En ciertas modalidades, la primera y segunda células hospederas se cultivan en un biorreactor único. En otras modalidades, la primera y segunda células hospederas se cultivan en biorreactores separados.
La presente invención también provee una línea celular policlonal capaz de expresar una composición de anticuerpos anti-MET, en donde la línea celular policlonal comprende una primera célula hospedera capaz de expresar un primer anticuerpo anti-MET o parte de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento y una segunda célula hospedera capaz de expresar un segundo anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo como se describe en este documento.
La presente invención también provee una molécula de unión biespecífica que tiene las especificidades de unión del primer y segundo anticuerpos anti-MET o porciones de unión a antígeno de los mismos de una composición de anticuerpos anti-MET se describe aquí. En ciertas modalidades, la molécula de unión biespecífica comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo cuyas H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nos: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente; y una porción de unión a antígeno de un anticuerpo cuyas H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nos: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
También se describe en el presente documento un uso de la composición de anticuerpos anti-MET como se describe en el presente documento o la composición farmacéutica que comprende la composición de anticuerpos anti-MET para tratar a un paciente con un trastorno mediado por MET.
También se describe en el presente documento un uso de anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno como se describe en el presente documento o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno para tratar a un paciente con un trastorno mediado por MET.
La presente invención también provee una composición de anticuerpos anti-MET como se describe en el presente documento o una composición farmacéutica que comprende la composición de anticuerpos anti-MET para uso en el tratamiento contra el cáncer. En algunas modalidades, el cáncer depende de la activación de MET. El cáncer puede ser cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de células papilares de riñón, glioblastoma, carcinoma de células renales, cáncer de próstata o carcinoma adrenocortical.
La presente invención también provee un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno como se describe en el presente documento o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno para uso en el tratamiento contra el cáncer. También se describe en el presente documento los usos de un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno como se describe en el presente documento o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer. En algunas modalidades, el cáncer depende de la activación MET. El cáncer puede ser cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de células papilares de riñón, glioblastoma, carcinoma de células renales, cáncer de próstata o carcinoma adrenocortical. El uso médico puede comprender también la administración de un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico, un agente antiangiogénico, un inhibidor de tirosina quinasa u otro inhibidor de la vía MET.
En algunos de los usos médicos descritos en el presente documento, el paciente es un mamífero. El paciente puede ser un primate. En modalidades particulares, el paciente es un ser humano.
Breve Descripción de los Dibujos
La figura 1 muestra una matriz de competencia por trece anticuerpos de MET probados unos contra otros. Una inhibición de por lo menos 50% se usó para diferenciar pre-clasificadores de epítopo (cuadrados grises). Cuadros punteados: competencia unidireccional. Cuadros enmarcados negros: competencia con anticuerpos idénticos.
La figura 2 muestra un resumen de la unión de anticuerpos de MET para diferentes constructos de MET humanos, de ratón, de pollo y quiméricos expresados en células HEK293. Los números de secuencia de aminoácidos (AA) se refieren a la secuencia de MET humano que fue intercambiada ya sea a la de pollo o de ratón. Se muestran ilustraciones esquemáticas de los diferentes constructos. Los dominios o subdominios individuales se indican. SP: péptido señal. SV5-GPI: secuencia del péptido SV5 seguido de enlazador de glicina-serina y anclaje de GPI. Cabe notar que la ilustración de la ubicación de las mutaciones es aproximada. Cuadros blancos: secuencia de MET humano. Cuadros grises: la secuencia de pollo. Cuadros rayados: secuencia de ratón. La unión positiva a las células transfectadas se indica como . La unión débil, como (+). Sin unión como -.
La figura 3 muestra los resultados de un análisis Western Blot de los niveles del receptor de MET en líneas celulares tratadas con el anticuerpo de control negativo, 9006, 9338 o 9006+9338 durante 24 o 48 horas.
La figura 4 muestra los resultados de un análisis Western simple de los niveles de MET en líneas celulares tratadas con el anticuerpo de control negativo, 9006+9338, o el anticuerpo C8-H241 durante 24 horas.
Las figuras 5A-5B muestran un análisis Western simple de los niveles de fosforilación de MET en las líneas de células tratadas con anticuerpos quiméricos 9006 o 9338, o la mezcla de anticuerpos 9006+9338.
Las figuras 6A-6B muestran un análisis Western simple de los niveles de fosforilación de AKT y ERK2 en líneas de células tratadas con anticuerpos quiméricos 9006 o 9338 o la mezcla de anticuerpos 9006+9338.
La figura 7A muestra el número de HUVECs después del tratamiento con anticuerpo quimérico 9006 o 9338, la mezcla de anticuerpos 9006+9338, o un anticuerpo de control. Se usa 25 pg/ml de anticuerpo total (tanto individualmente como en la mezcla de anticuerpos). La figura 7B ilustra los resultados del ensayo en el punto de tiempo final de 404 horas de incubación. Los datos se normalizaron a las células no tratadas (100%).
La figura 8A muestra el número de HUVECs después del tratamiento con anticuerpo quimérico 9006 o 9338, la mezcla de anticuerpos 9006+9338, o un anticuerpo de control, en presencia de HGF a 20 ng/ml. Se usa 25 pg/ml de anticuerpo total (tanto individualmente como en la mezcla de anticuerpos). La figura 8B representa los resultados del ensayo en el punto de tiempo final de 404 horas de incubación/estimulación con HGF. Los datos se normalizaron a las células no tratadas (100%).
Las figuras 9A-9B muestran curvas de titulación de la cantidad de HUVECs después del tratamiento con cantidades variables de anticuerpos quiméricos 9338 y 9006 (A y B, respectivamente).
La figura 10 muestra las curvas de valoración del número de HUVECs después del tratamiento con cantidades variables de la mezcla de anticuerpos 9006+9338.
La figura 11 ilustra los resultados en el punto de tiempo final de las Figuras 9 y 10. Los datos se normalizan a las células no tratadas.
Las figuras 12A-12C muestran los resultados de un ensayo de actividad metabólica que indica el efecto antiproliferativo de quimérico (panel izquierdo) o humanizado (panel derecho) 9006, 9338 o 9006+9338 sobre las líneas celulares HCC827R1_cet#3 (12A), HCC827R1_cet#1 (12B) y MKN45 (12C).
Las figuras 13A-13C muestran los resultados de un ensayo de actividad metabólica que indica el efecto antiproliferativo de quimérico (panel izquierdo) o humanizado (panel derecho) 9006, 9338 o 9006+9338 sobre las líneas celulares EBC-1 (13A), KatoII (13B) y Okajima (13C).
La figura 14 muestra los resultados de viabilidad de las titulaciones de los anticuerpos Hu9338+Hu9006, 13-MET, 28-MET y 13-MET 28-MET en las líneas celulares EBC1, MKN45, SNU5 y KatoII.
La figura 15 muestra el efecto del tratamiento con 9006, 9338, 9006+9338, o vehículo quimérico sobre el crecimiento tumoral de xenoinjertos de la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas EBC-1 en ratones. El área gris indica el período de tratamiento.
La figura 16 muestra el efecto del tratamiento con quimérico 9006+9338 en cuatro concentraciones diferentes en comparación con el tratamiento con vehículo sobre el crecimiento tumoral de xenoinjertos de la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas EBC-1 en ratones. El área gris indica el período de tratamiento.
La figura 17 muestra el efecto del tratamiento con 9006, 9338, 9006+9338, o vehículo quimérico sobre el crecimiento tumoral de xenoinjertos de la línea celular de cáncer gástrico humano MKN-45 en ratones. El área gris indica el período de tratamiento.
La figura 18 muestra el efecto del tratamiento con quimérico 9006, 9338, 9006+9338, o vehículo sobre el crecimiento tumoral de xenoinjertos de la línea celular de cáncer gástrico humano SNU5 en ratones. El área gris indica el período de tratamiento.
La figura 19 muestra el efecto del tratamiento con mezcla de anticuerpos quiméricos 9006+9338 o vehículo sobre el crecimiento tumoral de xenoinjertos del modelo de xenoinjerto LI1037 derivado de paciente con HCC humano en ratones. El área gris indica el período de tratamiento.
La figura 20 muestra el efecto de 9006+9338, Hu9006+Hu9338 o tratamiento con vehículo sobre el crecimiento tumoral de xenoinjertos de la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas EBC-1. El área gris indica el período de tratamiento.
La figura 21 muestra el efecto del tratamiento con quimérico 9006+9338, 9006+9338 humanizado (Hu9006+Hu9338), o vehículo sobre el crecimiento de tumores de xenoinjertos de la línea celular de cáncer de esófago-gástrica humana OE33. El área gris indica el período de tratamiento.
La figura 22 muestra el efecto del tratamiento con C8-H241, Hu9006+Hu9338 o vehículo sobre el crecimiento tumoral de xenoinjertos de la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas EBC-1 (n = 10 ratones por grupo). Las áreas grises indican los períodos de tratamiento. Línea de puntos marca el inicio de un nuevo tratamiento de los ratones restantes (n = 4) en el grupo tratado con C8-H241 Hu9006+Hu9338.
La figura 23 muestra el efecto del tratamiento con C8-H241, Hu9006, Hu9338, Hu9006+Hu9338 o vehículo sobre el crecimiento tumoral de xenoinjertos de la línea celular de cáncer gástrico humano Hs746T (n = 8 ratones por grupo). El área gris indica el período de tratamiento inicial. La línea punteada indica el re-tratamiento de dosis única con Hu9006+Hu9338 de ratones restantes en los grupos C8-H241, Hu9006 y Hu9338.
La figura 24 muestra el efecto del tratamiento con C8-H241, Hu9006+Hu9338 o vehículo sobre el crecimiento del tumor en cuatro modelos de xenoinjerto derivado de pacientes (n = 5 ratones por grupo para LU0858, L1901 y LU2503; n = 8 ratones por grupo para LXFA0526). El área gris denota el período de tratamiento.
La figura 25 muestra el efecto de proporciones equilibradas o sesgadas de Hu9006+Hu9338 o vehículo sobre el crecimiento de tumores de xenoinjertos de la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano EBC-1 (n = 8 ratones por grupo). El área gris indica el período de tratamiento.
La figura 26 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de dominio variable de cadenas pesada y ligera del anticuerpo quimérico 9006 (SEQ ID NOs: 5-8). Las CDRs (SEQ ID NOs: 21-26) están marcadas por flechas.
La figura 27 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de dominio variable de cadenas pesada y ligera del anticuerpo quimérico 9338 (SEQ ID NOs: 9-12). Las CDRs (SEQ ID NOs: 27-32) están marcadas por flechas.
La figura 28 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de dominio variable de cadenas pesada y ligera del anticuerpo humanizado 9006 (SEQ ID NOS: 13-16). Las CDRs están marcadas por las flechas (SEQ ID NOS: 21-26). La figura 29 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de dominio variable de cadenas pesada y ligera del anticuerpo humanizado 9338 (SEQ ID NOS: 17-20). Las CDRs (SEQ ID NOS: 27-32) están marcadas por flechas. La figura 30 muestra las secuencias de aminoácidos de cadenas pesada y ligera completas del anticuerpo humanizado 9006 (SEQ ID NOs: 33 y 34, respectivamente) y el anticuerpo humanizado 9338 (SEQ ID NOs: 35 y 36, respectivamente). Las CDRs están marcadas por flechas.
La figura 31 muestra la estructura de MET.
Descripción Detallada de la Invención
Definiciones y técnicas generales
A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que son entendidos comúnmente por los expertos en la técnica. Métodos y materiales ilustrativos se describen a continuación. En caso de conflicto, se optará por lo que dicte la presente especificación, incluyendo las definiciones. Aunque un número de documentos se citan en el presente documento, esta cita no constituye una admisión de que cualquiera de estos documentos forma parte del conocimiento general común en la técnica.
Además, a menos que sea requerido por el contexto, los términos singulares incluirán el plural y los términos en plural incluirán el singular. En general, la nomenclatura usada en relación con, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, química analítica, química orgánica sintética, química medicinal y farmacéutica, y química de proteínas y de ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, como comúnmente se logra en la técnica o como se describe en el presente documento.
A lo largo de esta especificación y modalidades, las palabras “tienen” y “comprenden”, o variaciones tales como “tiene”, “que tiene”, “comprende” o “que comprende” se entenderá que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros determinados pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. Definiciones relacionadas con anticuerpos
A menos que se indique lo contrario, como se usa en este documento, “MET” se refiere a MET humano (también conocido como c-MET humano). Una secuencia de polipéptido MET humano está disponible bajo el No. de Acceso a NCBI NM_000245.2, mostrado aquí como SEQ ID NO: 1. A menos que se especifique lo contrario, “MET humano” se refiere a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. MET humano también existe en una isoforma diferente (isoforma 2; SEQ ID NO: 2) en la cual 19 aminoácidos se insertan en dominio de IPT 3 (755 a 755: S ^ STWWKEPLNIVSFLFCFAS (SEQ ID NO: 2)).
El término “anticuerpo” (Ab) o “inmunoglobulina” (Ig), tal como se usa en el presente documento, se refiere a un tetrámero que comprende dos cadenas pesadas (H) (aproximadamente 50-70 kDa) y dos cadenas ligeras (L) (aproximadamente 25 kDa) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta de un dominio variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Cada cadena ligera está compuesta de un dominio variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Los dominios VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de complementariedad” (CDRs), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas “regiones de marco” (FRs). Cada VH y VL está compuesta por tres CDRs (H-CDR en el presente documento designa una CDR de la cadena pesada; y L-CDR en el presente documento designa una CDR de la cadena ligera) y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La asignación de aminoácidos a cada región puede estar de acuerdo con definiciones de IMGT® (Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27 (1): 55-77 (2003), o las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 y 1991)); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), o Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989).
El término “anticuerpo recombinante” se refiere a un anticuerpo que se expresa a partir de una línea celular o célula que comprende la(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican el anticuerpo, en donde la(s) secuencia(s) de nucleótidos no se asocia(n) naturalmente con la célula.
El término “composición de anticuerpos” se refiere a una combinación de dos o más anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos. Una composición de anticuerpos puede ser monoclonal (es decir, que consta de anticuerpos idénticos o moléculas de la porción de unión a antígeno) o policlonales (es decir, que consta de dos o más diferentes anticuerpos o porciones de unión a antígeno que reaccionan con los mismos o diferentes epítopos en el mismo antígeno o incluso sobre distintos, antígenos diferentes).
El término “proteína aislada”, “péptido aislado” o “anticuerpo aislado” se refiere a una proteína, polipéptido o anticuerpo que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes asociados que de manera natural lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido que es sintetizado químicamente o que es sintetizado en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina de forma natural será “aislado” a partir de sus componentes asociados de forma natural. Una proteína también puede volverse sustancialmente libre de componentes asociados de manera natural por aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica.
Como se usa en este documento, el término “línea germinal” se refiere a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los genes de anticuerpos y los segmentos de genes, a medida que son transmitidos de padres a hijos a través de las células germinales. Las secuencias de la línea germinal se distinguen de las secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos en células B maduras, que han sido alterados por los eventos de recombinación e hipermutación en el transcurso de la maduración de células B. Un anticuerpo que “utiliza” una secuencia de línea germinal particular tiene una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que se alinea con la secuencia de línea germinal de nucleótidos o con la secuencia de aminoácidos que especifica más de cerca que con cualquier otra secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la línea germinal.
El término “afinidad” se refiere a una medida de la atracción entre un antígeno y un anticuerpo. El atractivo intrínseco del anticuerpo para el antígeno se expresa normalmente como el de unión constante de afinidad de equilibrio (KD) de una interacción particular anticuerpo-antígeno. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la Kd es < 1 mM, preferiblemente < 100 nM. Una constante de afinidad de unión KD se puede medir, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial (BIAcore™) o interferometría de bio-capa, por ejemplo usando el sistema OctetTM.
El término “Kdis” se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno. Una constante de velocidad de disociación Kdis se puede medir por interferometría de bio-capa, por ejemplo usando el sistema OctetTM o por resonancia de plasmón superficial (BIAcore™).
El término “epítopo”, como se usa en este documento, se refiere a una porción (determinante) de un antígeno que se une específicamente a un anticuerpo o una molécula relacionada tal como una molécula de unión biespecífica. Los determinantes epitópicos consisten generalmente de agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o carbohidratos o cadenas laterales de azúcares y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser “lineal” o “conformacional”. En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre una proteína (por ejemplo, un antígeno) y una molécula de interacción (tal como un anticuerpo) se producen linealmente a lo largo de la primaria secuencia de aminoácidos de la proteína. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se producen a través de residuos de aminoácidos en la proteína que están separados unos de otros en la secuencia primaria de aminoácidos. Una vez que se determina un epítopo en un antígeno deseado, es posible generar anticuerpos para ese epítopo usando técnicas bien conocidas en la técnica. Además, la generación y caracterización de anticuerpos pueden dilucidar información acerca de epítopos deseables. A partir de esta información, es posible entonces detectar competitivamente anticuerpos por la unión a los mismos o similares epítopos, por ejemplo, al realizar estudios de competencia para encontrar anticuerpos que compiten por la unión al antígeno.
Se puede determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo o compite en forma cruzada por la unión con un anticuerpo anti-MET mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se permite que el anticuerpo anti-MET de la invención se una a MET bajo condiciones de saturación y luego se mide la capacidad del anticuerpo de prueba para unirse a MET. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a MET, al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia anti-MET, entonces el anticuerpo de prueba se une a un epítopo diferente que el anticuerpo de referencia anti-MET. Sin embargo, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse a MET, al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo, un epítopo de solapamiento, o un epítopo que se encuentra en las proximidades del epítopo unido por el anticuerpo anti-MET de la invención. Este experimento se puede realizar usando ELISA, RIA, BIACORE™, interferometría de bio-capa o citometría de flujo. Para probar si un anticuerpo anti-MET compite en forma cruzada con otro anticuerpo anti-MET, se puede usar el método de competencia descrito anteriormente en dos direcciones, es decir, determinar si el anticuerpo conocido bloquea el anticuerpo de prueba y viceversa. En un aspecto preferido de la divulgación, el experimento se realiza usando Octet™.
El término “anticuerpo quimérico” se refiere en su sentido más amplio a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos, normalmente un anticuerpo que es parcialmente de origen humano y parcialmente de origen no humano, es decir, derivado en parte de un animal no humano, por ejemplo un ratón, rata u otro roedor, o un ave tal como un pollo. Los anticuerpos quiméricos son preferibles a los anticuerpos no humanos con el fin de reducir el riesgo de una respuesta anti-anticuerpo humano, por ejemplo, una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano en el caso de un anticuerpo de murino. Un ejemplo de un anticuerpo quimérico típico es uno en el cual las secuencias de región variable son de murino mientras que las secuencias de la región constante son de humano. En el caso de un anticuerpo quimérico, las partes no humanas pueden ser sometidas a una alteración adicional con el fin de humanizar el anticuerpo. Los anticuerpos quiméricos que se describen en este documento tienen secuencias de dominio variable de murino y secuencias de dominios constantes de humano.
El término “humanizar” se refiere al hecho de que, cuando un anticuerpo es totalmente o parcialmente de origen no humano, por ejemplo un anticuerpo de murino obtenido a partir de la inmunización de ratones con un antígeno de interés o un anticuerpo quimérico con base en el anticuerpo de murino, es posible reemplazar ciertos aminoácidos, en particular en las regiones de marco y los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera, con el fin de evitar o reducir al mínimo una respuesta inmunitaria en seres humanos. La especificidad de una interacción del anticuerpo con un antígeno objetivo radica principalmente en los residuos de aminoácidos situados en las seis CDRs de las cadenas pesada y ligera. Las secuencias de aminoácidos dentro de las CDRs son por lo tanto mucho más variables entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDRs. Debido a que las secuencias de CDRs son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que simulan las propiedades de un anticuerpo de origen natural específico, o en forma más general cualquier anticuerpo específico con una determinada secuencia de aminoácidos, por ejemplo, mediante la construcción de vectores de expresión que expresan secuencias de CDR procedentes del anticuerpo específico injertado en secuencias de marco de un anticuerpo diferente. Como resultado, es posible “humanizar” un anticuerpo no humano y todavía mantener sustancialmente la especificidad de unión y afinidad del anticuerpo original. Aunque no es posible predecir con precisión la inmunogenicidad y de esta manera la respuesta anti-anticuerpo humano de un anticuerpo particular, los anticuerpos no humanos tienden a ser más inmunogénicos que los anticuerpos humanos. Los anticuerpos quiméricos, en los que las regiones constantes extrañas (por lo general de roedores) han sido reemplazadas por secuencias de origen humano, se ha mostrado que son generalmente menos inmunogénicos que los anticuerpos de origen totalmente extraños, y la tendencia de los anticuerpos terapéuticos es hacia los anticuerpos humanizados o completamente humanos. Los anticuerpos quiméricos u otros anticuerpos de origen no humano por lo tanto pueden humanizarse para reducir el riesgo de una respuesta anti-anticuerpo humano.
Para los anticuerpos quiméricos, la humanización normalmente implica la modificación de las regiones de marco de las secuencias de región variable. Los residuos de aminoácidos que forman parte de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) más a menudo no serán alterados en relación con la humanización, aunque en ciertos casos, puede ser deseable alterar residuos de aminoácidos de CDR individuales, por ejemplo para eliminar un sitio de glicosilación, un sitio de desamidación, un sitio de isomerización de aspartato o un residuo de cisteína o metionina no deseado. La glicosilación ligada a N se produce mediante la unión de una cadena de oligosacárido a un residuo de asparagina en la secuencia de tripéptido Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro. La eliminación de un sitio de N-glicosilación se puede lograr mediante la mutación ya sea del residuo Asn o el residuo Ser/Thr a un residuo diferente, preferiblemente por medio de sustitución conservativa. La desamidación de residuos de asparagina y glutamina puede ocurrir dependiendo de factores tales como el pH y la exposición de la superficie. Los residuos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor medida en otras secuencias de dipéptidos tales como Asn-Ala. Cuando ese sitio de desamidación, en particular Asn-Gly, está presente en una secuencia de CDR, por lo tanto puede ser deseable remover el sitio, normalmente mediante sustitución conservativa para remover uno de los residuos implicados.
Se conocen en la técnica numerosos métodos para la humanización de una secuencia de anticuerpo; véase, por ejemplo, la revisión por parte de Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008). Un método usado comúnmente es injertar CDR, que, por ejemplo, para un anticuerpo quimérico derivado de murino implica la identificación de las contrapartes de genes de línea germinal humana a los genes de región variable de murino e injertar las secuencias de CDR de murino en este marco. El injerto de CDR se puede basar en las definiciones de Kabat de CDR, aunque una publicación más reciente (Magdelaine-Beuzelin et al,. Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210-225 (2007)) ha sugerido que la definición IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) puede mejorar el resultado de la humanización (ver Lefranc et al., Dev Comp Immunol. 27:55-77 (2003)). En algunos casos, el injerto de CDR puede reducir la especificidad de unión y afinidad, y por lo tanto la actividad biológica, de un anticuerpo no humano injertado con CDR, en comparación con el anticuerpo progenitor del cual se obtienen las CDRs. Mutaciones de retroceso (a veces referidas como “reparación de marco”) pueden ser introducidas en las posiciones seleccionadas del anticuerpo injertado con CDR, normalmente en las regiones de marco, con el fin de restablecer la especificidad de unión y afinidad del anticuerpo progenitor. La identificación de posiciones para posibles mutaciones de retroceso se puede realizar usando la información disponible en la literatura y en las bases de datos de anticuerpos. Los residuos de aminoácidos que son candidatos para mutaciones de retroceso son generalmente aquellos que se encuentran en la superficie de una molécula de anticuerpo, mientras que los residuos que están enterrados o que tienen un bajo grado de exposición en la superficie normalmente no son alterados. Una técnica de humanización alternativa al injerto de CDR y la retromutación es la re-superficialización, en la cual los residuos no expuestos en la superficie de origen no humano son conservados, mientras que residuos en la superficie son alterados a los residuos humanos.
En ciertos casos, puede ser también deseable alterar uno o más residuos de aminoácidos de CDR con el fin de mejorar la afinidad de unión al epítopo objetivo. Esto se conoce como “maduración de afinidad” y opcionalmente se puede realizar en relación con la humanización, por ejemplo, en situaciones en las que la humanización de un anticuerpo conduce a la reducción de la especificidad de unión o afinidad y no es posible mejorar suficientemente la especificidad de unión o afinidad por las mutaciones de retroceso solas. Diversos métodos de maduración de afinidad son conocidos en la técnica, por ejemplo el método de mutagénesis de saturación de exploración in vitro descrito por Burks et al,. Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417 (1997), y el método de afinidad de maduración paso a paso in vitro de Wu et al. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 6037-6042 (1998).
El término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de unión”), como se usa en el presente documento, se refiere a una o más partes o fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, MET humano, o una parte del mismo). Se ha demostrado que ciertos fragmentos de un anticuerpo de longitud completa pueden realizar la función de unión a antígeno del anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “porción de unión a antígeno” incluyen (i) un fragmento Fab: un fragmento monovalente constituido por los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1 ; (ii) un fragmento F(ab’)2: un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd constituido por los dominios Vh y Ch1 ; (iv) un fragmento Fv constituido por los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb, constituido por un dominio Vh; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, capaz de unirse específicamente a un antígeno. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, son codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite ser hechos como una única cadena de proteína en la cual el par de regiones Vl y Vh forman moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv)). También dentro de la invención están las moléculas de unión a antígeno que comprenden un Vh y/o un Vl. En el caso de un Vh, la molécula puede comprender también uno o más de una región CH1, bisagra, CH2 o CH3. También se pretende incluir esos anticuerpos de cadena sencilla dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que los dominios Vh y Vl se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.
Porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab’)2, se pueden preparar a partir de anticuerpos enteros usando técnicas convencionales, tales como digestión de anticuerpos completos papaína o pepsina. Por otra parte, anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse usando técnicas de ADN recombinante estándar, por ejemplo, como se describe en el presente documento.
En una modalidad, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal. Como se usa en este documento, el acrónimo “mAb” se refiere a un anticuerpo monoclonal, es decir, un anticuerpo sintetizado y secretado por una población clonal individual de células. La población clonal puede ser una población clonal de células inmortalizadas. En algunas modalidades, las células inmortalizadas de la población clonal son células híbridas -hibridomas- producidas normalmente por la fusión de los linfocitos B individuales de un animal inmunizado con células individuales de un tumor linfocítico.
La clase (isotipo) y la subclase de anticuerpos anti-MET se pueden determinar por cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo se pueden determinar usando anticuerpos que son específicos para una clase y subclase de anticuerpo particular. Esos anticuerpos están comercialmente disponibles. La clase y subclase se pueden determinar por ELISA, Western Blot, así como otras técnicas. Alternativamente, la clase y subclase se pueden determinar mediante secuenciación de todos o una porción de los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos.
Anticuerpos anti-MET
La presente invención se refiere a un anticuerpo dirigido contra MET humano, o una porción de unión a antígeno de ese anticuerpo. La invención provee nuevos anticuerpos anti-MET 9006 y 9338 tanto en formas quiméricas como humanizadas. Las figuras 26-30 ilustran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada y ligera de longitud larga (HC y LC) y dominio variable (VH y VL) de estos anticuerpos. La tabla 1 siguiente provee las sEq ID NOs de estas secuencias. La tabla 2 siguiente provee las SEQ ID NOs para las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y ligera de los anticuerpos 9006 y 9338 (que son los mismos entre las formas quimérica y humanizada). Las secuencias de CDR fueron asignados de acuerdo con definiciones de IMGT®.
Tabla 1: SEQ ID NOs para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los dominios variables de cadenas pesada y ligera de anticuerpos 9006 y 9338
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I ambién se describen en el presente documento:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 o 29. También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo que tiene una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 o 32. Tal como se describe en el presente documento el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo, tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 o 29 y una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 o 32. Tal como se describe en el presente documento el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo comprende:
- la secuencia de H-CDR3 de SEQ ID NO: 23 y la secuencia de L-CDR3 de SEQ ID NO: 26; o
la secuencia de H-CDR3 de SEQ ID NO: 29 y la secuencia de L-CDR3 de SEQ ID NO: 32.
Tal como se describe en el presente documento el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo comprende:
- una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 21, 22 y 23, respectivamente; o
- una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 27, 28 y 29, respectivamente.
Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo comprende:
- una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 24, 25 y 26, respectivamente; o
- una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 30, 31 y 32, respectivamente.
En una modalidad, el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo comprende:
- una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22 y 23, respectivamente, y una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 24, 25 y 26, respectivamente; o
- una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28 y 29, respectivamente, y una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 30, 31 y 32, respectivamente.
Tal como se describe en el presente documento el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo, tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 10, 14 o 18. Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 12, 16 o 20. Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 10, 14 o 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 12, 16 o 20. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
- un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
- un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o
- un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
También se describe en el presente documento una variante de un anticuerpo o porción del mismo como se describió anteriormente, en donde la variante difiere del anticuerpo o porción del mismo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos.
También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-MET que comprende un dominio variable de cadena pesada que es por lo menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 6, 10, 14 o 18, o una porción de unión a antígeno de ese anticuerpo. Tal como se describe en el presente documento el dominio variable de cadena pesada es de por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 6, 10, 14 o 18. También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-MET que comprende un dominio variable de cadena ligera que es por lo menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 8, 12, 16 o 20, o una porción de unión a antígeno de ese anticuerpo. Tal como se describe en el presente documento el dominio variable de cadena ligera es de por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 8, 12, 16 o 20. El anticuerpo anti-MET también puede comprender cualquier combinación de los dominios variables de cadena pesada y ligera referenciados anteriormente.
También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-MET que comprende una cadena pesada que es por lo menos 90% idéntica en secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 34 o 36, o una porción de unión a antígeno de ese anticuerpo. Tal como se describe en el presente documento, la cadena pesada es de por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica en secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 34 o 36. También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-MET que comprende una cadena ligera que es por lo menos 90% idéntica en secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 33 o 35, o una porción de unión a antígeno de ese anticuerpo. Tal como se describe en el presente documento la cadena ligera es de por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica en secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 33 o 35. El anticuerpo anti-MET también puede comprender cualquier combinación de los dominios variables de cadena pesada y ligera referenciados anteriormente.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente usando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas hace coincidir secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit” que se pueden usar con los parámetros por defecto para determinar homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Secuencias de polipéptido también pueden compararse usando FASTA que utiliza parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) provee alineaciones y por ciento de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).
La longitud de secuencias de polipéptido comparadas para la homología generalmente será de por lo menos aproximadamente 16 residuos de aminoácidos, normalmente por lo menos aproximadamente 20 residuos, muy habitualmente por lo menos aproximadamente 24 residuos, normalmente por lo menos aproximadamente 28 residuos, y preferiblemente más de aproximadamente 35 residuos.
De conformidad con la invención, un tipo de sustitución de aminoácidos que se pueda hacer es cambiar una o más cisteínas en el anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivo, a otro residuo, tal como, sin limitación, alanina o serina. En una modalidad, hay una sustitución de una cisteína no canónica. La sustitución puede hacerse en una región CDR o de marco de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. En algunas modalidades, la cisteína es canónica.
Otro tipo de sustitución de aminoácidos que puede hacerse es remover los sitios proteolíticos potenciales en el anticuerpo. Esos sitios pueden aparecer en una región de CDR o de marco de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. La sustitución de residuos de cisteína y la eliminación de los sitios proteolíticos puede disminuir el riesgo de heterogeneidad en el producto de anticuerpo y por lo tanto aumentar su homogeneidad.
Otro tipo de sustitución de aminoácidos es eliminar los pares de asparagina-glicina, que forman sitios de desamidación potenciales, mediante la alteración de uno o ambos de los residuos.
Otro tipo de sustitución de aminoácidos que se puede hacer en una de las variantes de conformidad con la invención es una sustitución conservativa de aminoácidos. Una “sustitución conservativa de aminoácidos” es una en la cual un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o carácter hidrófobo). En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia o grado de similitud pueden ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol.
243:307-31 (1994).
Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifático: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina.
Como alternativa, un reemplazo conservativo puede definirse como cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrito en Gonnet et al., Science 256:1443-1445 (1992). Un reemplazo “meramente conservativo” es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácidos a un anticuerpo o porción de unión a antígeno de la invención son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para la formación de complejos de proteínas, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de los análogos, pero todavía conservan la unión específica a MET humano. Los análogos pueden incluir diversas sustituciones en la secuencia del péptido que se produce normalmente. Por ejemplo, sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples, preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas, se pueden hacer en la secuencia que se produce normalmente, por ejemplo en la porción del polipéptido fuera del dominio(s) que forman contactos intermoleculares. Las sustituciones de aminoácidos también pueden hacerse en el dominio(s) que forma contactos intermoleculares que pueden mejorar la actividad del polipéptido. Una sustitución conservativa de aminoácidos no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia progenitora; por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe alterar la lámina p anti-paralela que constituye el dominio de unión a inmunoglobulina que se produce en la secuencia progenitora, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia progenitora. En general, la glicina y la prolina no se usarían en una lámina p anti-paralela. Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds, Garland Publishing, Nueva York, Nueva York (1991)); y Thornton et al., Nature 354:105 (1991).
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo puede ser desinmunizado para reducir su inmunogenicidad usando las técnicas descritas en, por ejemplo, las publicaciones del PCT WO 98/52976 y WO 00/34317.
En algunas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-MET o porciones de unión a antígeno que se describen en este documento inhiben el crecimiento tumoral in vivo y también pueden tener por lo menos una propiedad funcional seleccionada del grupo constituido por:
- no se une a MET de ratón o de pollo;
- se une a un epítopo de MET humano que comprende residuos que están presentes en el dominio de SEMA;
- induce la degradación de MET;
- se une a MET humano con una Kd de 1 x 10-9 M o menos; y
- inhibe el crecimiento in vitro de por lo menos una línea celular seleccionada de SNU5, EBC1, MKN45, KatoII, OE33 y Okajima;
o cualquier combinación de esas propiedades funcionales. En algunas modalidades, la unión de uno o más anticuerpos o porciones de unión a antígeno de la invención (y en particular una composición de anticuerpos anti-MET de la invención) a MET puede inhibir el crecimiento y proliferación de células que expresan los receptores (es decir, las células tumorales).
En algunas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-MET o porciones de unión a antígeno que se describen en este documento pueden inhibir la unión de HGF alfa o HGF beta a MET. En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones pueden inhibir la unión de HGF sin procesar a MET.
Como se usa en este documento, el término “inhibe el crecimiento” (por ejemplo, en referencia a las células) está destinado a incluir cualquier disminución medible en la proliferación (aumento del número de células) o el metabolismo de una célula cuando entra en contacto con un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno o composición de anticuerpos anti-MET en comparación con el crecimiento de las mismas células en ausencia del anticuerpo o composición, por ejemplo, la inhibición de crecimiento de un cultivo celular en por lo menos aproximadamente 10%, y muy preferiblemente, tal como por lo menos aproximadamente 20% o 30%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 40% o 50%, tal como por lo menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%, o incluso aproximadamente 100%. La inhibición del crecimiento se puede determinar en líneas celulares de cáncer pertinentes, por ejemplo, como se describe en los siguientes ejemplos.
La clase de un anticuerpo anti-MET obtenido por los métodos descritos en el presente documento puede ser conmutada con otra clase. Una molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH se aísla usando procedimientos bien conocidos en la técnica tal que no incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican CL o CH. Las moléculas de ácido nucleico que codifican VL o VH entonces se enlazan operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una CL o Ch , respectivamente, de una clase diferente de molécula de inmunoglobulina. Esto se puede conseguir usando un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una cadena CL o CH, como se describió anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-MET que originalmente era IgM puede ser cambiado a la clase IgG. Además, el cambio de clase puede usarse para convertir una subclase IgG a otra, por ejemplo de IgG1 a IgG2. Un método preferido para producir un anticuerpo de la invención con un isotipo deseado comprende los pasos de aislar una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-MET y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-MET, obteniendo el dominio variable de la cadena pesada, ligando el dominio variable de la cadena pesada con el dominio constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresando la cadena ligera y la cadena pesada ligada en una célula, y recogiendo el anticuerpo anti-MET con el isotipo deseado.
El anticuerpo anti-MET de la invención puede ser una IgG, una IgM, una IgE, una IgA, o una molécula de IgD. En una modalidad, el anticuerpo anti-MET es una molécula de IgG y es de la subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En ciertas modalidades, el anticuerpo es de la subclase IgG 1.
En ciertas modalidades, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la invención puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión mayor, formada por enlaces covalentes o asociación no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Ejemplos de esas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región del núcleo de estreptavidina para hacer una molécula tetramérica scFv (Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para hacer moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al., Mol Immunol. 31:1047-1058 (1994)). Otros ejemplos incluyen en donde las CDR de un anticuerpo se incorporan en una molécula ya sea covalentemente o no covalentemente para que sea una inmunoadhesina que se une específicamente a un antígeno de interés. En esas modalidades, las CDR se pueden incorporar como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede ser unida covalentemente a otra cadena polipeptídica, o puede incorporarse de manera no covalente.
En otra modalidad, un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina puede estar hecho de modo que comprenda la totalidad o una porción de un anticuerpo anti-MET de la invención enlazado a otro polipéptido. En ciertas modalidades, sólo los dominios variables del anticuerpo anti-MET se enlazan al polipéptido. En ciertas modalidades, el dominio VH de un anticuerpo anti-MET es enlazado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-MET es enlazado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de una manera tal que los dominios VH y VL pueden interaccionar entre sí para formar un sitio de unión a antígeno. En otra modalidad preferida, el dominio VH se separa del dominio VL por un enlazador de modo que los dominios VH y VL pueden interaccionar entre sí (por ejemplo, anticuerpos de cadena única). El anticuerpo VH-enlazador-VL se enlaza después al polipéptido de interés. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los cuales dos (o más) anticuerpos de cadena única son enlazados el uno al otro. Esto es útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una única cadena polipeptídica, o si se quiere crear un anticuerpo biespecífico.
Para crear un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están unidos operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de tal manera que la secuencias de VH y VL se pueden expresar como una proteína de cadena sencilla contigua, con los dominios VL y VH unidos por el enlazador flexible. Véase, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); y McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si sólo se usa VH y VL sencillos; bivalente, si se usan dos VH y VL; o polivalente, si se usan más de dos VH y VL. Se pueden generar anticuerpos biespecíficos o polivalentes que se unen específicamente, por ejemplo, a MET humano y a otra molécula.
En otras modalidades, otros anticuerpos modificados se pueden preparar usando moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-MET. Por ejemplo, “cuerpos kappa” (Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)) (Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)), “diacuerpos” (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)), o “Janusins” (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) y Traunecker et al., Int. J. Cancer (Supl.) 7: 51-52 (1992)) se pueden preparar usando técnicas de biología molecular convencionales siguiendo las enseñanzas de la especificación.
Un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno de la invención se puede derivar o enlazar a otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o partes de los mismos se derivan de tal manera que la unión a MET no se ve afectada negativamente por la derivación o el etiquetado. Por consiguiente, se pretende que los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención incluyan tanto las formas intactas como modificadas de los anticuerpos anti-MET humanos descritos en este documento. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede enlazar funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente de detección, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivado se produce mediante reticulación de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Esos engarces están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Il.
Un anticuerpo anti-MET también se puede derivar con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la vida media en suero.
Un anticuerpo de conformidad con la presente invención también puede ser etiquetado. Como se usa en el presente documento, los términos “etiqueta” o “etiquetado” se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una modalidad, la etiqueta es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de porciones biotinilo que pueden ser detectadas por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada por métodos ópticos o colorimétricos). En otra modalidad, la etiqueta o el marcador puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de fármaco o toxina. Varios métodos de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas son conocidos en la técnica y pueden ser usados. Ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111 In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, pgalactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como la toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. En algunas modalidades, los marcadores se unen por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.
En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención pueden estar presentes en una forma neutra (incluyendo formas zwitteriónicas) o como una especie positiva o con carga negativa. En algunas modalidades, los anticuerpos pueden formar complejos con un contraión para formar una sal farmacéuticamente aceptable.
El término “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a un complejo que comprende uno o más anticuerpos y uno o más contraiones, en donde los contraiones se derivan de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables.
Las bases inorgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen iones metálicos que incluyen, pero no se limitan a, sales de metal alcalino apropiadas, sales de metal alcalinotérreo y otros iones de metales aceptables fisiológicos. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen aluminio, amonio, calcio, cobalto, níquel, molibdeno, vanadio, manganeso, cromo, selenio, estaño, cobre, férrico, ferroso, litio, magnesio, sales mangánicas o de manganeso, potasio, rubidio, sodio y zinc, por ejemplo, en sus valencias usuales.
Las sales ácidas de adición farmacéuticamente aceptables de los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar a partir de los siguientes ácidos, incluyendo, sin limitación, ácido fórmico, acético, acetamidobenzoico, adípico, ascórbico, bórico, propiónico, benzoico, alcanfórico, carbónico, ciclámico, dehidrocólico, malónico, edético, etilsulfúrico, fendizoico, metafosfórico, succínico, glicólico, glucónico, láctico, málico, tartárico, tánico, cítrico, nítrico, ascórbico, glucurónico, maleico, fólico, fumárico, propiónico, pirúvico, aspártico, glutámico, benzoico, clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, lisina, isocítrico, trifluoroacético, pamoico, propiónico, antranílico, mesílico, orótico, oxálico, oxalacético, oleico, esteárico, salicílico, aminosalicílico, silicato, p-hidroxibenzoico, nicotínico, fenilacético, mandélico, embónico, sulfónico, metanosulfónico, fosfórico, fosfónico, etanosulfónico, etanodisulfónico, amonio, bencenosulfónico, pantoténico, naftalenosulfónico, toluenosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, sulfanílico, sulfúrico, nítrico, nitroso, éster monometílico del ácido sulfúrico, ciclohexilaminosulfónico, p-hidroxibutírico, glicina, glicilglicina, glutámico, cacodilato, diaminohexanoico, alcanforsulfónico, glucónico, tiociánico, oxoglutárico, 5-fosfato de piridoxal, clorofenoxiacético, undecanoico, N-acetil-L-aspártico, galactárico y galacturónico.
Las bases orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen trimetilamina, dietilamina, N,N’-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dibencilamina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglucamina), procaína, aminas cíclicas, cationes de amonio cuaternario, arginina, betaína, cafeína, clemizol, 2-etilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanodiamina, butilamina, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, etilglucamina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, imidazol, isopropilamina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piridina, piridoxina, neodimio, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, tripropilamina, trietanolamina, trometamina, metilamina, taurina, colato, 6-amino-2-metil-2-heptanol, 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol, 2-amino-2-metil-1-propanol, ácidos alifáticos mono- y dicarboxílico, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, estroncio, tricina, hidrazina, fenilciclohexilamina, 2-(N-morfolino)- etanosulfónico, bis(2-hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)- metano, ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico, ácido 1,4-piperazinadietanosulfónico, ácido 3-morfolino-2-hidroxipropanosulfónico, 1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino]propano, ácido 4-morfolinopropanosulfónico, ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico, ácido 2-[(2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino]etanosulfónico, ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico, ácido 4-(N-morfolino)butanosulfónico, ácido 3-(N,N-bis[2-hidroxietil]amino)-2-hidroxipropanosulfónico, ácido 2-hidroxi-3-[tris(hidroximetil)metilamino]-1-propanosulfónico, ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-(2-hidroxipropanosulfónico), dihidrato de ácido piperazina-1,4-bis(2-hidroxipropanosulfónico), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinapropanosulfónico, N,N-bis(2-hidroxietil)glicina, ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(4-butanosulfónico), ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropanosulfónico, ácido N-tris(hidroximetil)metil-4-aminobutanosulfónico, ácido N-(1,1-dimetil-2-hidroxietil)-3-amino-2-hidroxipropanosulfónico, ácido 2-(ciclohexilamino) etanosulfónico, ácido 3-(ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-propanosulfónico, ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico, ácido N-(2-acetamido)iminodiacético, ácido 4-(ciclohexilamino)-1-butanosulfónico, N-[tris (hidroximetil)metil]glicina, 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol, y trometamol.
Composiciones de anticuerpos anti-MET
En un aspecto, la invención provee una composición de anticuerpos que comprende por lo menos dos anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención. El término “composición de anticuerpos anti-MET” se refiere a una composición que comprende por lo menos dos anticuerpos anti-MET o porciones de unión a antígeno de los mismos.
En una modalidad, la composición de anticuerpo comprende un primer anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo y un segundo anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo, donde el primer anticuerpo anti-MET se selecciona del grupo constituido por:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22 y 23, respectivamente, y una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 24, 25 y 26, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33;
y donde el segundo anticuerpo anti-MET se selecciona del grupo constituido por:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, 28 y 29, respectivamente, y una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, 31 y 32, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
Tal como se describe en la presente la composición de anticuerpos comprende un primer anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo y un segundo anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el primer anticuerpo anti-MET se selecciona del grupo constituido por:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 21,22 y 23, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 24, 25 y 26, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 14; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 16;
y en donde el segundo anticuerpo anti-MET se selecciona del grupo constituido por:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 27, 28 y 29, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 30, 31 y 32, respectivamente;
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 18; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 20;
Se contempla cualquier combinación del primer y segundo anticuerpos anti-MET anteriores.
La composición de anticuerpos puede comprender:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
La composición de anticuerpos puede comprender:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
La composición de anticuerpos puede comprender:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
La composición de anticuerpos puede comprender:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
La composición de anticuerpos puede comprender:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a MET humano con un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
La composición de anticuerpos puede comprender:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y - un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. La composición de anticuerpos puede comprender:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. La composición de anticuerpos puede comprender:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de MET humano que un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
Tal como se describe en el presente documento, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
Tal como se describe en el presente documento, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
Tal como se describe en el presente documento, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una L-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
Tal como se describe en el presente documento, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 21,22 y 23, respectivamente; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 27, 28 y 29, respectivamente.
Tal como se describe en el presente documento, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 24, 25 y 26, respectivamente; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 30, 31 y 32, respectivamente.
Tal como se describe en el presente documento, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22 y 23, respectivamente, y una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 24, 25 y 26, respectivamente; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28 y 29, respectivamente, y una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 30, 31 y 32, respectivamente.
En la invención, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En una modalidad, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
En una modalidad, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
En una modalidad, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
Se contempla cualquier combinación de los porcentajes de identidad anteriores del primer y segundo anticuerpos. En una modalidad, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
Se contempla cualquier combinación de los porcentajes de identidad anteriores del primer y segundo anticuerpos. En una modalidad, la composición de anticuerpos comprende:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 33; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
Se contempla cualquier combinación de los porcentajes de identidad anteriores del primer y segundo anticuerpos. Moléculas de unión biespecíficas
En un aspecto adicional, las especificidades de unión de cualquiera de los dos anticuerpos individuales descritos en este documento pueden ser combinados en una molécula de unión biespecífica. Por ejemplo, una molécula de unión biespecífica puede tener las especificidades de unión de anticuerpos anti-MET 9006 y 9338. En algunas modalidades, la molécula de unión biespecífica puede tener las especificidades de unión de:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22 y 23, respectivamente, y una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 24, 25 y 26, respectivamente; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28 y 29, respectivamente, y una L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 30, 31 y 32, respectivamente.
En algunas modalidades, la molécula de unión biespecífica puede tener las especificidades de unión de:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, la molécula de unión biespecífica puede tener las especificidades de unión de:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
En algunas modalidades, la molécula de unión biespecífica puede tener las especificidades de unión de:
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y
- un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
La molécula de unión biespecífica puede ser un anticuerpo dual dominio variable, es decir, en donde los dos brazos del anticuerpo comprenden dos dominios variables diferentes, o pueden estar en la forma de un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab biespecífico o un scFv biespecífico.
Moléculas de ácido nucleico y vectores
La presente invención también provee moléculas de ácido nucleico y secuencias que codifican anticuerpos anti-MET o porciones de unión a antígeno de los mismos descritos en este documento. En algunas modalidades, diferentes moléculas de ácido nucleico codifican las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y de cadena pesada del anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo. En otras modalidades, la misma molécula de ácido nucleico codifica las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y de cadena pesada del anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo.
Una referencia a una secuencia de nucleótidos abarca su complemento a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, debe entenderse que una referencia a un ácido nucleico que tiene una secuencia particular abarca su hebra complementaria, con su secuencia complementaria. El término “polinucleótido”, como se refiere en este documento, significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de hebra sencilla y doble.
También se describen en el presente documento secuencias de nucleótidos que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticas a una o más de las secuencias de nucleótidos anteriormente mencionadas o a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 33-36. El término “por ciento de identidad de secuencia”, en el contexto de secuencias de ácido nucleico, se refiere a los residuos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima. La comparación de la identidad de longitud de la secuencia puede ser sobre un tramo de por lo menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos, muy habitualmente por lo menos aproximadamente 24 nucleótidos, normalmente por lo menos aproximadamente 28 nucleótidos, muy normalmente por lo menos aproximadamente 32 nucleótidos, y preferiblemente por lo menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. Hay un número de diferentes algoritmos conocidos en la técnica que se puede usar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, provee alineaciones y por ciento de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol.
132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol Biol. 276:71-84 (1998). A menos que se especifique lo contrario, se usan los parámetros por defecto para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el por ciento de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros por defecto según se provee en GCG Versión 6.1.
También se describe en el presente documento una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico puede comprender las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOs: 5 y 7, 9 y 11, 13 y 15, o 17 y 19.
En un aspecto adicional, la presente invención provee un vector adecuado para la expresión de ambas cadenas de un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento. El término “vector”, como se usa en este documento, significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. En algunas modalidades, el vector es un plásmido, es decir, una pieza de doble hebra circular de ADN en donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. En algunas modalidades, el vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. En algunas modalidades, los vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedera en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episómicos de mamífero). En otras modalidades, los vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedera tras la introducción en la célula hospedera, y de ese modo se replican junto con el genoma del hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados. Esos vectores se denominan en este documento “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente, “vectores de expresión”).
También se describen o se reivindican en el presente documento vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada de un anticuerpo anti-MET de la invención o una porción de unión a antígeno del mismo, la cadena ligera de un anticuerpo anti-MET de la invención o una porción de unión a antígeno del mismo, o ambas de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo anti-MET de la invención o una porción de unión a antígeno del mismo. La invención provee además vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo, y sondas de los mismos.
Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-MET o porción del mismo puede aislarse de cualquier fuente que produzca un anticuerpo o porción de este tipo. En diversas modalidades, las moléculas de ácido nucleico se aíslan de células B que expresan un anticuerpo anti-MET aislado de un animal inmunizado con un antígeno de MET humano, o de una célula inmortalizada producida a partir de la célula B. Los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo son bien conocidos en la técnica. El ARNm se puede aislar y usar para producir ADNc para usarse en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o clonación de ADNc de genes de anticuerpos. En ciertas modalidades, una molécula de ácido nucleico de la invención puede ser sintetizada en vez de ser aislada.
En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VH de un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno de la invención unida en marco a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de cadena pesada de cualquier fuente. De manera similar, una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VL de un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno de la invención unida en marco a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de cadena ligera de cualquier fuente.
En un aspecto adicional de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican el dominio variable de las cadenas pesada (VH) y/o ligera (VL) pueden ser “convertidas” en genes de anticuerpos de longitud completa. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios VH o VL son convertidas en genes de anticuerpos de longitud completa por la inserción en un vector de expresión que ya codifican dominios constantes de cadena pesada (CH) o constante de cadena ligera (CL), respectivamente, de manera que el segmento VH se une operativamente al segmento(s) CH dentro del vector, y el segmento VL se une operativamente al segmento CL dentro del vector. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL son convertidas en genes de anticuerpos de longitud completa mediante el enlace de, por ejemplo, ligando, una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio VH y/o VL de una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio CH y/o CL usando técnicas de biología molecular estándares. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y/o ligera de longitud completa entonces se pueden expresar a partir de una célula en la cual se han introducido y el anticuerpo anti-MET se puede aislar.
Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para expresar de manera recombinante grandes cantidades de anticuerpos anti-MET. Las moléculas de ácido nucleico también se pueden usar para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos de hebra sencilla, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpos, como se describe en el presente documento.
Una molécula de ácido nucleico de la invención se puede utilizar como una sonda o cebador de PCR para una secuencia de anticuerpo específico. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede usar como una sonda en los métodos de diagnóstico o como un cebador de PCR para amplificar regiones de ADN que podrían usarse, entre otras cosas, para aislar moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican los dominios variables de los anticuerpos anti-MET. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser de dominios altamente variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de interés. Los oligonucleótidos pueden codificar toda o una parte de una o más de las CDRs de los anticuerpos anti-MET o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención como se describe en este documento.
En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico y vectores se pueden usar para producir anticuerpos anti-MET mutados. Los anticuerpos pueden ser mutados en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera, por ejemplo, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Una mutación puede hacerse en una o más de las regiones CDR para aumentar o disminuir la Kd del anticuerpo anti-MET, para aumentar o disminuir kdis, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. En otra modalidad, una o más mutaciones se realizan en un residuo de aminoácido que se sabe que es cambiado en comparación con la línea germinal en un anticuerpo monoclonal de la invención. Las mutaciones se pueden hacer en una región CDR o marco de la región de un dominio variable, o en un dominio constante. En una modalidad preferida, las mutaciones se hacen en un dominio variable. En algunas modalidades, una o más mutaciones se hacen en un residuo de aminoácido que se sabe que es cambiado en comparación con la línea germinal en una región marco de un dominio variable de un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la invención.
En otra modalidad, la región(es) de marco son mutadas de modo que la región(es) de marco resultante tiene la secuencia de aminoácidos del gen de la línea germinal correspondiente. Una mutación puede hacerse en una región marco o dominio constante para aumentar la vida media del anticuerpo anti-MET. Véase, por ejemplo, la publicación del PCT WO 00/09560. Una mutación en una región marco o dominio constante también se puede hacer para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, y/o para proveer un sitio para unión covalente o no covalente a otra molécula. De conformidad con la invención, un solo anticuerpo puede tener mutaciones en uno cualquiera o más de las regiones de marco del dominio variable o en el dominio constante.
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-MET de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos se expresan mediante la inserción de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, obtenidas como se describió anteriormente, en vectores de expresión de tal manera que los genes son enlazados operativamente a secuencias de control de expresión necesarias, tales como secuencias de control de transcripción y traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), virus de plantas tales como el virus mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, cósmidos, YACs, episomas derivados de EBV, y similares. El gen del anticuerpo se puede ligar en un vector tal que las secuencias de control de la transcripción y de la traducción dentro del vector sirven su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión o las secuencias de control de expresión se pueden escoger para ser compatibles con la célula hospedera de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vectores separados. En una modalidad, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se pueden insertar en el vector de expresión por métodos estándares (por ejemplo, la ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligación de extremos romos si no hay sitios de restricción presentes).
Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina de CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados diseñados de modo que cualquier secuencia de VH o VL pueda ser fácilmente insertada y expresada, como se describió anteriormente. En esos vectores, el empalme se produce habitualmente entre el sitio donante de empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede al dominio C humano, y también en las regiones de empalme que se producen dentro de los exones CH humanos. La poliadenilación y la terminación de la transcripción pueden ocurrir en sitios cromosómicos nativos cadena en dirección 3’ de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula hospedera. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el péptido señal se una en fase al extremo amino terminal de la cadena de inmunoglobulina. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).
Además de los genes de la cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden llevar secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula hospedera. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que ha de ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células hospederas de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), virus simiano 40 (Simian Virus 40 o SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores fuertes de mamíferos tales como promotores de inmunoglobulina y actina nativos. Para una descripción adicional de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A.
5,168,062, 4,510,245 y 4,968,615. Los métodos para expresar anticuerpos en plantas, incluyendo una descripción de los promotores y vectores, así como la transformación de plantas, son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 6,517,529. Métodos de expresión de polipéptidos en células bacterianas o células fúngicas, por ejemplo, células de levadura, también son bien conocidos en la técnica.
Además de los genes de la cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospederas (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospederas en las que se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo, normalmente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera en la cual se ha introducido el vector. Por ejemplo, los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usarse en células dhfr-hospederas con selección/amplificación con metotrexato), el gen neo (para selección con G418), y el gen de la glutamato sintetasa.
El término “secuencia de control de expresión”, como se usa en el presente documento, significa secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las cuales están ligadas. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de iniciación de la transcripción, terminación, promotoras y potenciadoras apropiadas; señales de procesamiento del ARN eficaces tales como las señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de traducción (es decir, secuencia consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de esas secuencias de control difieren dependiendo del organismo hospedero; en procariotas, esas secuencias de control incluyen generalmente secuencias de promotor, sitio de unión ribosomal, y de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, esas secuencias de control incluyen secuencias de promotor y de terminación de la transcripción. Se pretende que el término “secuencias de control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.
Métodos de hibridoma para producir anticuerpos y composiciones de anticuerpos de la invención
También se divulgan métodos para producir una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal humano o una porción de unión a antígeno del mismo dirigido contra MET, que comprende (a) inmunizar un animal transgénico no humano con MET, una porción de MET o una célula o tejido que expresa MET; (b) permitir que el animal transgénico monte una respuesta inmunitaria a MET; (c) aislar las células productoras de anticuerpos a partir del animal transgénico; (d) inmortalizar las células productoras de anticuerpos; (e) crear poblaciones monoclonales individuales de las células productoras de anticuerpos inmortalizadas; y (f) cribar las células productoras de anticuerpos inmortalizadas para identificar un anticuerpo dirigido contra MET.
En otro aspecto, la invención provee una línea celular que produce un anticuerpo anti-MET humano. En algunas modalidades, la línea celular es una línea celular de hibridoma. En algunas modalidades, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se describió anteriormente. En otras modalidades, los hibridomas se producen en una especie no humana, especies diferentes al ratón tales como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas humanos.
Un animal transgénico puede ser inmunizado con un antígeno MET, células primarias, por ejemplo, células B de bazo o sangre periférica, aisladas del animal transgénico inmunizado y células individuales productoras de anticuerpos específicos para el antígeno deseado pueden ser identificadas. El ARNm poliadenilado de cada célula individual puede aislarse y una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) se puede llevar a cabo usando los cebadores sentido de que hibridan con secuencias de dominio variable, por ejemplo, cebadores degenerados que reconocen la mayor parte o todas las regiones FR1 de cadena pesada y ligera humana los genes de dominio variable y cebadores antisentido que hibridan con secuencias de la región constante o de unión. Los ADNc de los dominios variables de cadena pesada y ligera pueden entonces clonarse y expresarse en cualquier célula hospedera adecuada, por ejemplo, una célula de mieloma, como anticuerpos quiméricos con regiones constantes de inmunoglobulina respectivas, tales como los dominios constantes de cadena pesada y k o A. Véase Babcook et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:7843-48 (1996). Los anticuerpos anti-MET pueden ser entonces identificados y aislados como se describe en este documento.
Bibliotecas de presentación en fagos
También se describe en el presente documento un método para producir un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo que comprende los pasos de sintetizar una biblioteca de anticuerpos humanos en fagos, cribar la biblioteca con MET o una porción de unión de anticuerpos del mismo, aislar el fago que su une a MET, y obtener el anticuerpo del fago. A modo de ejemplo, un método para la preparación de la biblioteca de anticuerpos para su uso en técnicas de presentación en fagos comprende los pasos de inmunizar un animal no humano con MET o una porción antigénica de la misma para crear una respuesta inmunitaria, extraer células productoras de anticuerpos del animal inmunizado; aislar ARN que codifica las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de la invención de las células extraídas, someter a transcripción inversa el ARN para producir ADNc, amplificar el ADNc usando cebadores, e insertar el ADNc en un vector de presentación en fagos tal que los anticuerpos se expresen en el fago. Los anticuerpos anti-MET recombinantes de la invención pueden obtenerse de esta manera.
Los anticuerpos anti-MET humanos recombinantes de la invención se pueden aislar por cribado de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante. Preferiblemente, la biblioteca es una biblioteca de presentación en fagos de scFv, generada usando los ADNc de VL y VH humanos preparados a partir de ARNm aislado de células B. Los métodos para preparar y cribar esas bibliotecas se conocen en la técnica. Los kits para generar bibliotecas de presentación en fagos están disponibles comercialmente (por ejemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, no. de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación en fagos Stratagene SurfZAP™, no. de catálogo 240612). También hay otros métodos y reactivos que se pueden usar en la generación y selección de bibliotecas de presentación de anticuerpos (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos 5,223,409; Publicaciones PCT. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, y WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991) ; Hay et al., Hum Antibod Hybrídomas 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J Mol Biol 226:889-896 (1992) ; Clackson et al,. Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al, Nuc Acid Res 19:4133-4137 (1991); y Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 7978-7982 (1991).
Con el fin de aislar y producir anticuerpos anti-MET humanos con las características deseadas, un anticuerpo anti-MET humano como se describe en el presente documento se puede usar primero para seleccionar secuencias de cadena pesada y ligera humanas que tienen actividad de unión similar hacia MET, usando los métodos de impronta de epítopo descritos en la publicación PCT WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpos usadas en este método son preferiblemente bibliotecas de scFv preparadas y examinadas como se describe en la publicación PCT WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); y Griffiths et al., EMBO J 12:725-734 (1993). Las bibliotecas de anticuerpos scFv se seleccionan preferiblemente usando MET humano como antígeno.
Una vez que se seleccionan los dominios VL y VH humanos iniciales, se pueden realizar experimentos de “mezclar y coincidir”, en donde diferentes pares de los segmentos VL y VH inicialmente seleccionzados se criban para unión de MET para seleccionar combinaciones de pares VL/VH preferidas. Además, para mejorar aún más la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH del par(es) VL/VH preferido se pueden mutar al azar, preferiblemente dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable de la maduración de afinidad de los anticuerpos durante una respuesta inmunitaria natural. Esta maduración de afinidad in vitro puede lograrse mediante la amplificación de los dominios VH y VL usando cebadores de PCR complementarios a la CDR3 de VH o CDR3 de VL, respectivamente, esos cebadores han sido “fortalecidos” con una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotídicas en ciertas posiciones de tal manera que los productos resultantes de la PCR codifican segmentos VH y VL en lo cuales las mutaciones al azar han sido introducidas en las regiones CDR3 de VH y/o VL. Estos segmentos VH y VL mutados aleatoriamente pueden ser cribados nuevamente para la unión a MET.
Después del cribado y aislamiento de un anticuerpo anti-MET de la invención a partir de una biblioteca de presentación de inmunoglobulinas recombinantes, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo seleccionado se puede recuperar del paquete de presentación (por ejemplo, del genoma del fago) y subclonar en otros vectores de expresión por técnicas de ADN recombinante estándares. Si se desea, el ácido nucleico puede además manipularse para crear otras formas de anticuerpo de la invención, como se describe en el presente documento. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado mediante cribado de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en una célula hospedera de mamífero, como se describe en el presente documento.
Células hospederas que no son hibridma y métodos de producción de anticuerpos y composición de anticuerpos
Un aspecto adicional de la invención se refiere a métodos para producir las composiciones de anticuerpos y anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención. Una modalidad de este aspecto de la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo como se define aquí, que comprende proveer una célula hospedera recombinante capaz de expresar el anticuerpo, cultivar la célula hospedera en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y aislar el anticuerpo resultante. Los anticuerpos producidos por la expresión en esas células hospederas recombinantes se denominan aquí “anticuerpos recombinantes”. La invención también provee células de la progenie de esas células hospederas, y los anticuerpos producidos por las mismas.
El término “célula hospedera recombinante” (o simplemente “célula hospedera”), como se usa aquí, significa una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. La invención provee células hospederas que pueden comprender, por ejemplo, un vector de conformidad con la invención descrita anteriormente. La invención también provee células hospederas que comprenden, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígeno de la misma, o ambas, de un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo de la invención. Debe entenderse que “célula hospedera recombinante” y “célula hospedera” significan no sólo la célula objeto particular, sino también la progenie de la célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, esa progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero todavía se incluye dentro del alcance del término “célula hospedera” como se usa en el presente documento.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-MET y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico se pueden usar para la transfección de una célula de mamífero, vegetal, célula hospedera bacteriana o de levadura adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedera. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de polinucleótido(s) en liposomas, y microinyección directa de ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamífero por vectores virales. Los métodos de transformación de células son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455. Los métodos de transformación de células de plantas son bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación viral. Los métodos de transformación de células bacterianas y de levadura son también bien conocidos en la técnica.
Las líneas de células de mamífero disponibles como hospederos para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, entre otras cosas, células de ovario de hámster chino (CHO), células NS0, células SP2, células HEK-293T, células 293 Freestyle (Invitrogen), células NIH-3T3, células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido (BHK), células de riñón de mono verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, y un número de otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan determinando qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9 o Sf21. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos se introducen en células hospederas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde se cultivan las células hospederas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales. Las células hospederas vegetales incluyen, por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lenteja de agua, maíz, trigo, patata, etc. Las células hospederas bacterianas incluyen E. coli y especies de Streptomyces. Las células hospederas de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Además, la expresión de anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos a partir de líneas celulares de producción se puede mejorar usando una serie de técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión de gen de glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque común para potenciar la expresión bajo ciertas condiciones. El sistema GS se describe, en su totalidad o parte en relación con las patentes EP 0216846, 0256055, 0 323 997 y 0338841.
Es probable que los anticuerpos expresados por diferentes líneas celulares o en animales transgénicos tengan diferentes patrones de glicosilación unos de otros. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico provistas en este documento, o que comprenden las secuencias de aminoácidos provistas en este documento son parte de la presente invención, independientemente del estado de glicosilación de los anticuerpos, y más en general, independientemente de la presencia o ausencia de modificación(es) post-traduccional(es).
En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para producir una composición de anticuerpos que comprende por lo menos dos anticuerpos anti-MET, el método comprende:
- proveer por lo menos primera y segunda células hospederas, en donde la primera célula hospedera es capaz de expresar un primer anticuerpo anti-MET de la invención y la segunda célula hospedera es capaz de expresar un segundo anticuerpo anti-MET de la invención;
- cultivar la primera y segunda células hospederas bajo condiciones adecuadas para la expresión de los anticuerpos anti-MET; y
- aislar los anticuerpos resultantes.
Un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo o composición de anticuerpos de la presente invención se pueden producir por métodos generalmente conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales recombinantes. Por lo tanto, en el caso de la producción de un solo anticuerpo de la invención, cualquier método conocido en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales recombinantes se puede usar. Para la producción de una composición de anticuerpos de la invención que comprende una mezcla de anticuerpos, los anticuerpos individuales que se pueden producir por separado, es decir, cada anticuerpo es producido en un biorreactor separado, o los anticuerpos individuales pueden ser producidos juntos en un solo biorreactor. Si la composición de anticuerpos se produce en más de un biorreactor, la composición de anticuerpos purificada puede obtenerse a través de la combinación de los anticuerpos obtenidos a partir de sobrenadantes purificados individualmente de cada biorreactor. Diversos enfoques para la producción de una composición de anticuerpos policlonal en múltiples biorreactores, en donde las líneas de células o las preparaciones de anticuerpos se combinan en un punto posterior en dirección 5’ o antes de o durante el procesamiento en dirección 3’, se describen en el documento WO 2009/129814.
En el caso de producir anticuerpos individuales en un solo biorreactor, esto se puede realizar, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2004/061104 o WO 2008/145133. El método descrito en el documento Wo 2004/061104 se basa en la integración específica de sitio de la secuencia codificadora del anticuerpo en el genoma de las células hospederas particulares, mientras que el método del documento WO 2008/145133 implica un enfoque alternativo usando la integración aleatoria para producir anticuerpos en un solo biorreactor.
Para más información acerca de los métodos adecuados para preparar los anticuerpos y composiciones de la invención se puede encontrar en el documento WO 2012/059857.
Animales y plantas transgénicos
Los anticuerpos anti-MET y porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención también pueden ser producidos por transgénesis mediante la generación de un mamífero o una planta que son transgénicos para las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable del mismo. En relación con la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos anti-MET y sus porciones pueden ser producidos en, y recuperados de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 y 5,741,957. Los animales no humanos transgénicos que comprenden loci de inmunoglobulina humana se pueden inmunizar con MET humano o una porción inmunogénica del mismo, como se describió anteriormente. Los métodos para preparar anticuerpos en plantas se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. 6,046,037 y 5,959,177.
Los animales no humanos o plantas transgénicos se pueden producir mediante la introducción de una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo de la invención (por ejemplo, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente que codifican un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo) en el animal o planta por técnicas transgénicas estándares. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 6,417,429. Las células transgénicas usadas para fabricar el animal transgénico pueden ser células madre embrionarias o células somáticas o un óvulo fertilizado. Los organismos no humanos transgénicos pueden ser quiméricos, heterocigotos no quiméricos, y homocigotos no quiméricos. Véase, por ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). Los animales transgénicos no humanos pueden tener una alteración dirigida y reemplazo por un constructo de direccionamiento que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de interés. Los animales no humanos o plantas transgénicos pueden comprender, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de la misma y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MET de la invención. Los animales transgénicos pueden comprender y expresar moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesada y ligera, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a MET humano. Los anticuerpos o porciones anti-MET se pueden hacer en cualquier animal transgénico. Los animales no humanos pueden ser ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. El animal transgénico no humano puede expresar esos polipéptidos codificados en, por ejemplo, sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, moco y otros líquidos corporales.
Composiciones farmacéuticas
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo (o como el único ingrediente activo) un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo o composición de anticuerpos anti-MET de la invención. La composición farmacéutica puede comprender cualquier composición de anticuerpos anti-MET o anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento. En algunas modalidades, las composiciones están destinadas para el uso en el tratamiento del cáncer. En ciertas modalidades, las composiciones están destinadas para el uso en el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de células papilares de riñón, glioblastoma, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, y/o carcinoma adrenocortical.
En general, los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos son adecuados para ser administrados como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término “excipiente” se usa en el presente documento para describir cualquier ingrediente distinto del compuesto(s) de la invención. La elección del excipiente(s) voluntad en gran medida dependerá de factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y estabilidad, y la naturaleza de la forma de dosificación.
Como se usa en este documento, “excipiente farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina regulada en su pH con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o reguladores de pH, que potencian la vida útil o eficacia del anticuerpo.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención y métodos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Esas composiciones y métodos para su preparación pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edición (Mack Publishing Company, 1995). Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferentemente bajo condiciones de GMP (buenas prácticas de fabricación).
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, empacarse o comercializarse a granel, como una sola dosis unitaria o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en este documento, una “dosis unitaria” es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que se administra a un sujeto o una fracción conveniente de esa dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de esa dosificación.
Cualquier método para la administración de péptidos, proteínas o anticuerpos aceptado en la técnica puede ser adecuadamente utilizado para los anticuerpos y porciones de unión a antígeno de la invención.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son normalmente adecuadas para administración parenteral. Como se usa en este documento, “administración parenteral” de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la formación de una brecha física de un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la brecha en el tejido, de este modo por lo general da como resultado la administración directa en el torrente sanguíneo, en el músculo o en un órgano interno. Por tanto, la administración parenteral incluye, pero no se limita a, la administración de una composición farmacéutica mediante inyección de la composición, por aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, por aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica de penetración en tejido, y similares. En particular, se contempla que la administración parenteral incluye, pero no se limita a, inyección o infusiones subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal, intravenosa, intraarterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracraneal, intrasinovial; y técnicas de infusión dialítica renal. También se contempla la perfusión regional. Las modalidades preferidas incluyen las vías intravenosa y subcutánea.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuadas para administración parenteral comprenden normalmente el ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Esas formulaciones pueden prepararse, empacarse o comercializarse en una forma adecuada para la administración en bolo o para la administración continua. Las formulaciones inyectables pueden prepararse, empacarse o comercializarse en forma de dosificación unitaria, tal como en ampollas o en envases multidosis que contienen un conservante. Las formulaciones para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas, y similares. Esas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitarse a, agentes de suspensión, estabilización o dispersión. En una modalidad de una formulación para administración parenteral, el ingrediente activo se provee en forma seca (es decir, polvo o granular) para reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las formulaciones parenterales también incluyen soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes reguladores de pH (preferiblemente a un pH de 3 a 9), pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse más adecuadamente como una solución no acuosa estéril o como una forma seca para usarse junto con un vehículo adecuado tal como agua estéril, libre de pirógenos. Formas de administración parenteral ilustrativas incluyen soluciones o suspensiones en soluciones acuosas estériles, por ejemplo, propilenglicol acuoso o soluciones de dextrosa. Esas formas de dosificación pueden ser adecuadamente reguladas en su pH, si se desea. Otras formulaciones parenteralmente administrables que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina o en una preparación liposómica. Las formulaciones para administración parenteral pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, sostenida, por pulsos, controlada, dirigida y programada.
Por ejemplo, en un aspecto, soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo o composición de anticuerpos anti-MET en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado bajo vacío y liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensoactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina, y/o mediante el uso de recubrimientos de liberación modificada (por ejemplo, recubrimientos de liberación lenta).
Los anticuerpos de la invención pueden administrarse también por vía intranasal o por inhalación, normalmente en forma de un polvo seco (ya sea solo, como una mezcla, o como una partícula de componentes mezclados, por ejemplo, mezclado con un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado) desde un inhalador de polvo seco, como un aspersor de aerosol desde un recipiente presurizado, bomba, aspersor, atomizador (preferiblemente un atomizador que usa electrodinámica para producir una niebla fina) o nebulizador, con o sin el uso de un propulsor adecuado, o como nasales.
El recipiente presurizado, bomba, aspersor, atomizador o nebulizador contiene generalmente una solución o suspensión de un anticuerpo de la invención que comprende, por ejemplo, un agente adecuado para dispersar, solubilizar o extender la liberación del compuesto activo, un propelente(s) como solvente.
Antes de usarse en un polvo seco o formulación de suspensión, el producto fármaco se microniza en general a un tamaño adecuado para la administración por inhalación (normalmente menos de 5 micras). Esto se puede conseguir por cualquier método de trituración apropiado, tal como molienda con chorro en espiral, de lecho fluido de molienda con chorro, procesamiento de fluido supercrítico para formar nanopartículas, homogeneización a alta presión o secado por aspersión.
Las cápsulas, ampollas y cartuchos para usarse en un inhalador o insuflador se pueden formular para contener una mezcla en polvo del compuesto de la invención, una base en polvo adecuada y un modificador de rendimiento.
Una formulación de solución adecuada para usarse en un atomizador que usa electrodinámica para producir una niebla fina puede contener una dosis adecuada del anticuerpo de la invención por actuación y el volumen de accionamiento puede variar, por ejemplo, de 1 pL a 100 pL.
Sabores adecuados, tales como mentol y levomentol, o edulcorantes, tales como sacarina o sacarina sódica, pueden añadirse a las formulaciones de la invención destinadas para la administración inhalada/intranasal.
Las formulaciones para administración inhalada/ intranasal pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, sostenida, por pulsos, controlada, dirigida y programada.
En el caso de inhaladores de polvo seco y aerosoles, la unidad de dosificación se determina por medio de una válvula que suministra una cantidad medida. Las unidades de conformidad con la invención se disponen normalmente para administrar una dosis medida o “bocanada” de un anticuerpo de la invención. La dosis diaria total normalmente se administrará en una sola dosis o, muy habitualmente, como dosis divididas durante todo el día.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención también se pueden formular para una administración por vía oral. La administración oral puede implicar deglutir, de modo que el compuesto entra en el tracto gastrointestinal, y/o bucal, lingual, o sublingual por la cual el compuesto entra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.
Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen sistemas sólidos, semi-sólidos y líquidos tales como comprimidos; cápsulas blandas o duras que contienen multi o nano-partículas, líquidos o en polvo; pastillas (incluyendo rellenas de líquido); pastillas masticables; geles; formas de dosificación de dispersión rápida; películas; óvulos; aerosoles; y parches bucales/mucoadhesivos.
Las formulaciones líquidas incluyen suspensiones, soluciones, jarabes y elixires. Esas formulaciones pueden usarse como cargas en cápsulas blandas o duras (hechas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa) y normalmente comprenden un vehículo, por ejemplo, agua, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, metilcelulosa, o un aceite adecuado, y uno o más agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión. Las formulaciones líquidas también pueden prepararse por reconstitución de un sólido, por ejemplo, desde un sobre.
Inmunoconjugados
Otra opción para el uso terapéutico de las composiciones y anticuerpos de anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención es en forma de inmunoconjugados, es decir, anticuerpos o porciones de unión a antígeno conjugado con uno o más agentes tales como agentes anti-cáncer. Las composiciones de la invención que comprenden dos o más anticuerpos anti-MET pueden contener un único anticuerpo en la forma de un inmunoconjugado, o pueden contener dos o más anticuerpos en forma de un inmunoconjugado.
Varios tipos de agentes contra el cáncer se pueden conjugar a los anticuerpos de la invención, incluyendo agentes citotóxicos (por ejemplo, agentes de quimioterapia convencionales y otros fármacos de molécula pequeña contra el cáncer), citoquinas (en cuyo caso el conjugado puede denominarse una “inmunocitoquina”), toxinas (en cuyo caso el conjugado puede denominarse una “inmunotoxina”) y radionucleidos. Unos inmunoconjugados ya han sido aprobados para uso clínico. Estos incluyen Zevalin® (un anticuerpo anti-CD20 murino conjugado con 90Y), Bexxar® (un anticuerpo de murino anti-CD20 conjugado con 131I) y Mylotarg® (un anticuerpo humanizado anti-CD33 conjugado con caliqueamicina). Otros inmunoconjugados que han sido probados en ensayos clínicos incluyen anticuerpos conjugados, por ejemplo, con doxorrubicina o un compuesto de maitansinoide. Las inmunotoxinas que han sido probadas en ensayos clínicos incluyen varios anticuerpos conjugados a una exotoxina A de Pseudomonas truncada. Una inmunocitoquina que comprende un anticuerpo EpCAM humanizado conjugado con IL-2 también ha sido probado.
En el caso de anticuerpos de la invención conjugados con agentes citotóxicos, éstos pueden pertenecer, por ejemplo, a cualquiera de las clases principales de fármacos quimioterapéuticos, incluyendo agentes alquilantes (por ejemplo, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino), antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, capecitabina, gemcitabina), antraciclinas (por ejemplo, bleomicina, doxorrubicina, mitomicina-C) y alcaloides vegetales (por ejemplo, taxanos tales como docetaxel y paclitaxel, y alcaloides de la vinca tales como vinblastina, vincristina y vinorelbina). Puesto que el uso de inmunoconjugados dirige específicamente el agente anti-cáncer a los tumores, los inmunoconjugados basados en los anticuerpos de la invención pueden estar basados ventajosamente en agentes altamente citotóxicos tales como derivados de caliqueamicina o maitansina, o en toxinas tales como toxinas bacterianas (por ejemplo, exotoxina A de Pseudomonas, toxinas de la difteria) o toxinas de plantas (por ejemplo, ricina).
El agente anti-cáncer conjugado en un inmunoconjugado es generalmente enlazado al anticuerpo por medio de un enlazador lábil que es relativamente estable en suero, pero que permite la liberación del agente cuando el inmunoconjugado se internaliza en la célula objetivo. Enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores químicos que son estables a pH neutro en el suero, pero son sometidos a hidrólisis ácida en las condiciones ligeramente ácidas dentro de los lisosomas posteriores a la internalización, enlazadores de disulfuro que se escinden por tioles intracelulares, y enlazadores peptídicos que son estables en el suero, pero que se someten a escisión enzimática en compartimentos intracelulares.
Varias disposiciones de conjugación pueden contemplarse en composiciones que contienen dos o más anticuerpos de la invención. Por ejemplo, con dos anticuerpos que se podría conjugar los anticuerpos a dos o más diferentes fármacos anti-cáncer o conjugar un anticuerpo a un profármaco que es activado por un agente tal como una enzima conjugada con el otro anticuerpo. El concepto general de la terapia con profármacos enzimáticos dirigida por anticuerpos (ADEPT) se ha descrito para los anticuerpos monoclonales, en donde un profármaco es activado por una enzima dirigida al tumor por un conjugado mAB-enzima, pero la presente invención puede proveer una oportunidad para ajustar este enfoque a condiciones particulares. Por lo tanto, puede ser posible aumentar específicamente destrucción de células tumorales sin afectar o reducir el daño a los tejidos normales.
Para más información sobre inmunoconjugados contra el cáncer, véase Wu et al., Nature Biotechnology 23(9):1137-1146 (2005); Schrama et al, Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159 (2006); y Rohrer, Chimica Oggi/Chemistry Today 27(5):56-60 (2009).
Usos terapéuticos de anticuerpos y composiciones de la invención
En un aspecto, los anticuerpos anti-MET y porciones de unión a antígeno del mismo y composiciones anti-MET de la invención se usan en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de células papilares de riñón, glioblastoma, carcinoma adrenocortical, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y otros cánceres que expresan o sobreexpresan MET o dependen de la activación de la vía MET.
En algunos aspectos, los anticuerpos o composiciones de anticuerpos se usan para tratar un un cáncer, que se caracteriza por la hiperactividad anormal de MET. En algunas modalidades, la hiperactividad anormal se debe a la amplificación del gen, la sobreexpresión de proteínas, una mutación de gen de activación de MET (por ejemplo, una mutación puntual o evento anormal de empalme de genes), o la sobreexpresión de HGF.
En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-MET y porciones de unión a antígeno de los mismos y composiciones anti-MET de la invención pueden usarse para tratar a un paciente que es resistente al tratamiento con un agente de direccionamiento de un receptor tirosina quinasa diferente. En algunas modalidades, el paciente es resistente al tratamiento con un inhibidor de quinasa ErbB. En ciertas modalidades, el inhibidor de quinasa ErbB se dirige a EGFR, ErbB2, ErbB3 o ErbB4. En una modalidad particular, el inhibidor de quinasa ErbB se dirige a EGFR. En otra modalidad, el inhibidor de quinasa ErbB se dirige a HER3. El inhibidor de quinasa ErbB puede seleccionarse de, por ejemplo, gefitinib, erlotinib, cetuximab, pantinumumab, trastuzumab, o cualquier combinación de los mismos.
“Tratar”, “tratando” y “tratamiento” se refieren a un método para aliviar o anular un trastorno biológico y/o por lo menos uno de sus síntomas concomitantes. Como se usa en este documento, “aliviar” una enfermedad, trastorno o afección significa reducir la gravedad y/o frecuencia de ocurrencia de los síntomas de la enfermedad, trastorno o condición. Además, las referencias en este documento a un “tratamiento” incluyen referencias a tratamiento curativo, paliativo y profiláctico.
En un aspecto, el sujeto del tratamiento, o paciente, es un mamífero, preferiblemente un sujeto humano. Ese sujeto puede ser de sexo masculino o femenino, de cualquier edad.
“Cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad del agente terapéutico que se administra para aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas del trastorno a tratar.
La relación entre los anticuerpos individuales en una composición terapéutica de la invención, o en el caso de los anticuerpos individuales de la invención que se administran simultáneamente, secuencialmente o por separado, a menudo será tal que los anticuerpos se administran en cantidades iguales, pero esto no tiene por qué ser necesariamente el caso. Por lo tanto, una composición de la invención que comprende dos anticuerpos anti-MET o porciones de unión a antígeno de los mismos a menudo los contiene en una relación de aproximadamente 1:1, pero dependiendo de las características de los anticuerpos individuales, puede ser deseable usar cantidades desiguales de los anticuerpos o porciones. Por ejemplo, la relación de un anticuerpo o porción con respecto a otro anticuerpo o porción en una composición de dos anticuerpos puede ser, por ejemplo, entre 5 y 95%, entre 10 y 90%, entre 20 y 80%, entre 30 y 70%, entre 40 y 60%, o entre 45 y 55%.
Las composiciones de anticuerpos, o anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden administrarse solos o en combinación con uno o más de otros fármacos o anticuerpos (o como cualquier combinación de los mismos). Las composiciones farmacéuticas, métodos y usos de la invención por lo tanto también abarcan modalidades de combinaciones (co-administración) con otros agentes activos, como se detalla a continuación. Como se usa en el presente documento, se entiende que los términos “co-administración”, “co-administrado” y “en combinación con”, refiriéndose a las composiciones de anticuerpos y anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos con uno o varios de los demás agentes terapéuticos, significan, y se refieren a e incluyen lo siguiente:
- administración simultánea de la combinación de composición de anticuerpo/anticuerpo/porción de unión a antígeno de la invención y el agente(s) terapéutico a un paciente que necesita tratamiento, cuando los componentes se formulan juntos en una sola forma de dosificación que libera esos componentes sustancialmente al mismo tiempo al paciente, - administración sustancialmente simultánea de la combinación de composición de anticuerpo/anticuerpo/porción de unión a antígeno de la invención y el agente(s) terapéutico a un paciente que necesita tratamiento, cuando los componentes se formulan aparte uno de otro en formas de dosificación separadas que son tomadas sustancialmente al mismo tiempo por el paciente, después de lo cual esos componentes son liberados sustancialmente al mismo tiempo al paciente,
- administración secuencial de la combinación de composición de anticuerpo/anticuerpo/porción de unión a antígeno de la invención y el agente(s) terapéutico a un paciente que necesita tratamiento, cuando los componentes se formulan aparte uno de otro en formas de dosificación separadas que son tomadas en tiempos consecutivos por el paciente con un intervalo de tiempo significativo entre cada administración, después de lo cual los componentes son liberados en tiempos sustancialmente diferentes al paciente; y
- administración secuencial de la combinación de composición de anticuerpo/anticuerpo/porción de unión a antígeno de la invención y el agente(s) terapéutico a un paciente que necesita tratamiento, cuando los componentes se formulan juntos en una sola forma de dosificación que libera los componentes de manera controlada con que son liberados en forma concurrente, consecutiva y/o superpuesta al mismo tiempo y/o diferentes tiempos al paciente, en donde cada parte puede ser administrada ya sea por la misma vía o por una vía diferente.
Las composiciones de anticuerpos y anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención se pueden administrar sin tratamientos terapéuticos adicionales, es decir, como una terapia autónoma. Alternativamente, el tratamiento con las composiciones de anticuerpos y anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención puede incluir por lo menos un tratamiento terapéutico adicional (terapia de combinación). En algunas modalidades, la composición de anticuerpos o anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se pueden administrar conjuntamente o formular con otro medicamento/fármaco para el tratamiento del cáncer. El tratamiento terapéutico adicional puede comprender, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, anti-neoplásico, o agente antiangiogénico, un anticuerpo anti-cáncer diferente, y/o terapia de radiación.
Mediante la combinación de las composiciones de anticuerpos, anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de la invención con agentes conocidos para inducir la diferenciación terminal de las células cancerosas, el efecto se puede mejorar adicionalmente. Esos compuestos pueden, por ejemplo, ser seleccionados del grupo constituido por ácido retinoico, ácidos trans-retinoico, ácidos cis-retinoicos, fenilbutirato, factor de crecimiento de nervio, sulfóxido de dimetilo, forma activa de vitamina D3, receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma, 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol, hexametilen-bis-acetamida, factor de crecimiento transformante beta, ácido butírico, AMP cíclico, y vesnarinona. En algunas modalidades, el compuesto se selecciona del grupo constituido por ácido retinoico, fenilbutirato, ácido todo-trans-retinoico y la forma activa de la vitamina D.
Los artículos farmacéuticos que comprenden una composición de anticuerpos anti-MET o anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo de la invención y por lo menos otro agente (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, anti-neoplásico o anti-angiogénico) puede usarse como un tratamiento de combinación para la administración simultánea, separada o sucesiva en la terapia del cáncer. El otro agente puede ser cualquier agente adecuado para el tratamiento del cáncer en cuestión, por ejemplo, un agente seleccionado del grupo constituido por agentes alquilantes, por ejemplo, derivados de platino tales como cisplatino, carboplatino y/u oxaliplatino; alcaloides de plantas, por ejemplo, paclitaxel, docetaxel y/o irinotecan; antibióticos antitumorales, por ejemplo, doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, epirrubicina, mitoxantrona idarrubicina, dactinomicina, bleomicina, actinomicina, luteomicina, y/o mitomicina; inhibidores de la topoisomerasa tales como topotecan; y/o antimetabolitos, por ejemplo, fluorouracilo y/u otras fluoropirimidinas. También se contempla que un anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno del mismo o composición anti-MET de anticuerpo de la invención pueden usarse en terapia adyuvante en relación con inhibidores de la tirosina quinasa. Estas son moléculas sintéticas, de bajo peso molecular, derivadas principalmente de quinazolina, que interaccionan con el dominio de tirosina quinasa intracelular de los receptores y que inhiben la fosforilación del receptor inducida por ligando al competir por el sitio de unión de Mg-ATP intracelular. Los artículos farmacéuticos que comprenden una composición de anticuerpos de la invención y por lo menos un TKI que se dirige a MET por lo tanto también se pueden usar como un tratamiento de combinación para la administración simultánea, separada o sucesiva en la terapia del cáncer.
En ciertos aspectos, las composiciones de anticuerpos y anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención se pueden administrar en combinación con otro inhibidor de la vía MET, que puede dirigirse a MET o HGF. En algunas modalidades, el inhibidor se selecciona del grupo constituido por, pero no se limita a, AMG 102, AMG 208, AMG 458, ARQ 197, AV299, BAY-853474, CGEN241, DN30, E7050, EMD 1204831, EMD 1214063, INCB28060, JNJ38877605, K252a, LY-2875358, MGCD265, MK-2461, MP-470, NK4, OA-5D5, PF-02341066, PF-04217903, PF-02341066, PHA-665752, SGX-523, SU5416, SU11274, TAK701, XL184, XL880, cabozantinib, crizotinib, ficlatuzumab, foretinib, golvatinib, onartuzumab, rilotumumab y tivantinib.
En algunas modalidades, las composiciones de anticuerpos y anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención se pueden administrar en combinación con un inhibidor de ErbB (tal como gefitinib o erlotinib) o un inhibidor de la proteína de choque térmico 90 (hsp90) (tal como 17-AAG).
En otras modalidades, las composiciones de anticuerpos y anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden usarse en combinación con otros agentes terapéuticos de anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo contra VEGF (por ejemplo, Avastin®). En otras modalidades adicionales, las composiciones de anticuerpos de la presente invención se pueden usar en combinación con un agente conocido para estimular las células del sistema inmunológico, el tratamiento de combinación conduce al aumento en la mejora inmuno-mediada de la eficacia de las composiciones de anticuerpos de la invención. Ejemplos de esos agentes estimulantes del sistema inmunológico incluyen interleucinas recombinantes (por ejemplo, iL-21 e IL-2).
Dosis y vía de administración
Las composiciones de anticuerpos de la invención se administrarán en una cantidad eficaz para el tratamiento de la condición en cuestión, es decir, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para alcanzar un resultado deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores tales como la condición particular que se está tratando, la edad, el sexo y el peso del paciente, y si los anticuerpos se administran como un tratamiento independiente o en combinación con uno o más tratamientos anti-cáncer adicionales.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proveer la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, un único bolo puede ser administrado, varias dosis divididas se pueden administrar con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de unida de dosificación, como se usa en el presente documento, se refiere a físicamente a unidades discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los pacientes/sujetos que han de ser tratados; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención son generalmente dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del agente quimioterapéutico y el efecto terapéutico o profiláctico en particular, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición de un compuesto activo tal para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Por lo tanto, el experto en la técnica apreciaría, con base en la descripción provista en el presente documento, que el régimen de dosis y la dosificación se ajustan de acuerdo con métodos bien conocidos en las técnicas terapéuticas. Es decir, la dosis máxima tolerable puede ser fácilmente establecida, y la cantidad eficaz que provee un beneficio terapéutico detectable a un paciente también puede determinarse, al igual que los requisitos temporales para la administración de cada agente para proveer un beneficio terapéutico detectable para el paciente. Por consiguiente, mientras que ciertas dosis y regímenes de administración se representan como ejemplos en el presente documento, estos ejemplos de ninguna manera limitan el régimen de dosis y administración que puede ser provista a un paciente en la práctica de la presente invención.
Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección que se ha de aliviar, y pueden incluir dosis únicas o múltiples. Es de entenderse además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación establecidos en este documento son ilustrativos solamente y no están destinados a limitar el alcance o práctica de la composición incorporada. Además, el régimen de dosificación con las composiciones de esta invención puede estar basado en una variedad de factores, incluyendo el tipo de enfermedad, la edad, peso, sexo, estado médico del paciente, la gravedad de la condición, la vía de administración, y el anticuerpo particular usado. Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero se puede determinar rutinariamente usando métodos estándares. Por ejemplo, las dosis pueden ser ajustadas con base en parámetros farmacocinéticos o farmacodinámicos, que pueden incluir efectos clínicos tales como efectos tóxicos y/o los valores de laboratorio. Por lo tanto, la presente invención abarca escalada de dosis intra-paciente según lo determinado por el experto en la técnica. La determinación de dosificaciones y regímenes adecuados son bien conocidos en la técnica relevante y se entiende que son abarcados por el experto en la técnica una vez que se proveen las enseñanzas descritas en este documento.
Se contempla que una dosis adecuada de una composición de anticuerpos de la invención estará en el intervalo de 0.1­ 100 mg/kg, tal como aproximadamente 0.5 a 50 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 1-20 mg/kg. La composición de anticuerpos, por ejemplo, puede administrarse en una dosis de por lo menos 0.25 mg/kg, por ejemplo, por lo menos 0.5 mg/kg, tal como por lo menos 1 mg/kg, por ejemplo, por lo menos 1.5 mg/kg, tal como por lo menos 2 mg/kg, por ejemplo, por lo menos 3 mg/kg, tal como por lo menos 4 mg/kg, por ejemplo, por lo menos 5 mg/kg; y, por ejemplo, hasta un máximo de 50 mg/kg, tal como hasta como máximo 30 mg/kg, por ejemplo, hasta como máximo 20 mg/kg, tal como hasta como máximo 15 mg/kg. La administración normalmente se repite a intervalos adecuados, por ejemplo, una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas, y durante el tiempo que se considere apropiado por el médico responsable, que opcionalmente pueden aumentar o disminuir la dosis según sea necesario.
Una cantidad eficaz para la terapia de tumor puede medirse por su capacidad para estabilizar la progresión de la enfermedad y/o mejorar los síntomas en un paciente, y preferiblemente de revertir la progresión de la enfermedad, por ejemplo, mediante la reducción de tamaño del tumor. La capacidad de un anticuerpo o composición de la invención para inhibir el cáncer puede ser evaluada por ensayos in vitro, por ejemplo, como se describe en los ejemplos, así como en modelos animales adecuados que son predictivos de la eficacia en tumores humanos. Los regímenes de dosificación adecuados se seleccionarán con el fin de proveer una respuesta terapéutica óptima en cada situación particular, por ejemplo, se administra como un único bolo o como una infusión continua, y con posible ajuste de la dosis como se indica por las exigencias de cada caso.
Usos de diagnóstico y composiciones
Los anticuerpos de la presente invención también son útiles en procesos de diagnóstico (por ejemplo, in vitro, ex vivo). Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse para detectar y/o medir el nivel de MET en una muestra de un paciente (por ejemplo, una muestra de tejido, o una muestra de fluido corporal tal como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal, saliva o en la orina). Los métodos de detección y medición adecuados incluyen métodos inmunológicos, tales como la citometría de flujo, ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA), ensayos de quimioluminiscencia, radioinmunoensayo e inmunohistología. También se describen en el presente documento kits (por ejemplo, kits de diagnóstico) que comprenden los anticuerpos descritos en el presente documento.
Para que esta invención pueda entenderse mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son para fines de ilustración solamente.
Ejemplos
Ejemplo 1: Clonación de Anticuerpos Anti-MET
Los anticuerpos anti-MET se obtuvieron usando el procedimiento Symplex™ esencialmente como se describe en el documento WO 2005/042774. En pocas palabras, ratones BALB/c, C57 y C3H fueron inmunizados dos veces por semana con líneas celulares de cáncer humano que sobreexpresan MET (HCT-116), proteína MET humano recombinante (Sino Biologicals), proteína MET humano recombinante pre-incubada con ligando (HGF), o MET digerida con tripsina. Las células plasmáticas de murino obtenidas a partir de los bazos y los ganglios linfáticos inguinales fueron ordenados por FACS, y el enlace de las secuencias de codificación de VH y VL se realizó en las células plasmáticas ordenadas, facilitando el emparejamiento afín de las secuencias, utilizando un procedimiento de PCR de dos pasos basado en una RT-PCR de extensión de solapamiento multiplex de un paso seguido por PCR anidada. El principio para el enlace de las secuencias de VH y VL afines se describe en detalle en el documento WO 2005/042774 y en Meijer et al., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006).
Para identificar anticuerpos con especificidad de unión de MET, las secuencias que codifican VH y VL obtenidas anteriormente se expresaron como anticuerpos de longitud completa. Esto implicó la inserción del repertorio de pares de codificación de VH y VL en un vector de expresión y la transfección en una célula hospedera usando el método descrito en el documento WO 2012/059858.
La especificidad de los anticuerpos producidos se determinó mediante ELISA usando como antígeno, ya sea el dominio extracelular de la proteína MET o el dominio extracelular de la proteína MET traduccionalmente fusionado a un dominio Fc de inmunoglobulina humana. Placas Nunc MaxiSorp (Cat. No. 464718) se recubrieron con 1 pg/ml de la proteína MET recombinante diluida en PBS a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron una vez con PBS 0.05% de Tween 20 (PBS-T) antes de bloqueo en 50 ql de 2% de leche-PBS-T. Las placas se lavaron una vez más con PBS-T, después, 20 ql de 2% de leche-PBS-T. Se añadieron 10 ql de los sobrenadantes de los transfectantes FreeStyle293 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual las placas se lavaron una vez con PBS-T. Anticuerpo secundario (cadena ligera kappa anti-humana de cabra,-HRP, Serotec, Cat No. STAR 100P) diluido 1:25000 en 2% de leche-PBS-T se añadió para detectar los anticuerpos unidos a los pozos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez en PBS-T antes de la adición de 25 ql de sustrato (Kem-En-Tec Diagnostics, Cat. No. 4518) e incubación durante 5 min. Se añadió 25 ql de ácido sulfúrico 1 M después de la incubación para detener la reacción. Se detectó señal específica en un lector de ELISA a 450 nm. A partir de los datos de ELISA, se identificaron clones de anticuerpos positivos y se seleccionaron para análisis de secuencia y validación de la unión a MET.
Ejemplo 2: Proyección de mezclas de anticuerpos anti-MET funcionales Este ejemplo describe pruebas in vitro de anticuerpos monoclonales quiméricos dirigidos a MET y mezclas de estos anticuerpos monoclonales para identificar candidatos a líder. Se evaluaron los anticuerpos monoclonales y las mezclas por su capacidad para inhibir el crecimiento de las líneas celulares de cáncer EBC1, MKN45, OE33 y SNU5.
Métodos
Los anticuerpos derivados de ratón dirigidos a MET humano se analizaron para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de líneas celulares de cáncer humano in vitro. Los anticuerpos monoclonales y mezclas de 2-anticuerpos (mezclas 1:1 de dos anticuerpos monoclonales) se diluyeron a una concentración de anticuerpo total final de 100 qg/ml en un medio RPMI 1640 Glutamax suplementado con 2% de FBS y 1% de P/S, produciendo una concentración final de 5 qg/ml. Números correspondientes de las células (EBC1: 1500 células/pozo, MKN45: 2000 células/pozo, OE33 4300 células/pozo y SNU5: 800 células/pozo) se añadieron luego a los pozos experimentales en una placa de 384 pozos, y se incubaron con anticuerpos durante 4 días en una incubadora humidificada a 37°C. Reactivo WST-1 se añadió posteriormente a las placas, y se incubó durante una hora a 37°C. La absorbancia se midió a 450 nm y 620 nm (longitud de onda de referencia) usando un lector de ELISA. La absorbancia a 620 nm se resta de la absorbancia a 450 nM. La cantidad de células metabólicamente activas (MAC) se calculó como un porcentaje del control no tratado como sigue:
% de MAC= --------- ° Dexp - ODmdio------------ X100
ODno tratado ODmedio
Se supone que la actividad metabólica se correlaciona con el número de células viables, lo que significa que un menor % de MAC corresponde a un mayor nivel de inhibición del crecimiento celular por los anticuerpos.
Resultados
Mezclas de anticuerpos se clasificaron con base en su capacidad para inhibir el crecimiento celular entre un panel de líneas celulares de cáncer. Los resultados de viabilidad de los anticuerpos monoclonales y las mezclas de dos anticuerpos en la actividad metabólica de las líneas celulares EBC1, MKN45, OE33 y SNU5 se muestran en la tabla 3. Siete mezclas diferentes de dos anticuerpos inhiben la actividad metabólica a un promedio por debajo de 50%.
Entre las mezclas más eficaces, la combinación de los dos anticuerpos 9006 y 9338 mostró una actividad inhibidora del crecimiento de células amplia. Curiosamente, cada anticuerpo por sí solo mostró una eficacia más baja que la combinación, lo que sugiere que los dos anticuerpos pueden actuar sinérgicamente. Además de 9006+9338, puede verse en la tabla 3 que otras mezclas altamente eficaces incluyen 9206+9232, 8955+9338, 9206+9338, 9006+9232, 8955+9006, 8955+9096, y 8955+9232. Además, será evidente que estas ocho mejores mezclas se basan en relativamente pocos anticuerpos monoclonales individuales, en particular 8955, 9006, 9232, 9338 y 9206.
Tabla 3. Efecto anti-proliferativo de anticuerpos monoclonales y las mezclas de anticuerpos
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Ejemplo 3: Humanización de los anticuerpos 9006 y 9338
Este ejemplo describe la humanización de las regiones de marco de anticuerpos de murino de los anticuerpos 9006 y 9338. La humanización de anticuerpos se lleva a cabo para producir una molécula con inmunogenicidad mínima cuando se aplica a seres humanos, mientras conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano progenitor.
Métodos
La humanización de los anticuerpos 9006 y 9338 se llevó a cabo usando el enfoque de “injerto de CDR”. En primer lugar, los genes de la línea germinal de murino original fueron identificados sometiendo a BLAST las secuencias de genes de V 9006 (Figura 26) y 9338 (Figura 27) contra las bases de datos de genes de línea germinal de ratón V y J. Esto indica que los genes de la línea germinal del ratón más cercanos fueron IGHV9-1*02/IGHJ4*01 e IGKV8-28*01/IGKJ2*01 para los genes pesados variables y ligeros variables de 9006, respectivamente. De manera similar, los genes de la línea germinal de ratón más cercanos fueron IGHV1-4*01/IGHJ3*01 e IGKV4-79*01/IGKJ4*01 para los genes pesados variables y ligeros variables de 9338, respectivamente. En segundo lugar, los genes VH y VL del anticuerpo fueron alineados contra las líneas germinales de murino para identificar mutaciones somáticas en las regiones de marco que pueden desempeñar un papel en la función y/o estructura del anticuerpo. Esos residuos pueden incluirse en los genes de anticuerpos humanizados finales llamados residuos de “retromutación”. Las secuencias de anticuerpos variables 9006 y 9338 fueron entonces sometidas a BLAST contra las bases de datos de inmunoglobulina humana para identificar las líneas germinales humanas más cercanas cuyas regiones de marco serán usadas para la humanización de anticuerpos. Para el anticuerpo 9006, las líneas germinales humanas retenidas fueron IGHV7-4-1*02/IGHJ6*01 e IGKV4-1*01/IGKJ2*01 para los genes pesados variables y ligeros variables, respectivamente. Para el anticuerpo 9338, las líneas germinales humanas retenidas fueron IGHV1-69*08/IGHJ1*01 e iGkV3-11*01/IGKJ2*01 para los genes pesados variables y ligeros variables, respectivamente. Por último, para cada anticuerpo, las regiones CDR de los anticuerpos quiméricos se injertaron en el marco humano seleccionado y segmentos de gen J. Las secuencias de CDR fueron asignadas de acuerdo con definiciones de IMGT®.
Resultados
Las secuencias finales de anticuerpo humanizado 9006 y 9338 se muestran en la figura 28 y la figura 29, respectivamente.
Ejemplo 4 Clonación de análogos de anticuerpo de referencia anti-MET Este ejemplo da una lista de las fuentes de las secuencias de aminoácidos y el formato final de anticuerpo usado para la generación de análogos de anticuerpo de referencia anti-MET. Algunos de los anticuerpos listados se han caracterizado ampliamente y tienen epítopos bien definidos. Un número de los anticuerpos también han entrado en evaluación clínica. Métodos
Las secuencias de aminoácidos que codifican los dominios de cadena pesada y ligera variables de los análogos de anticuerpos de la tabla 4 se obtuvieron de las patentes o solicitudes de patentes listadas. Las secuencias de proteína se tradujeron en forma inversa a secuencias de ADN con el uso de codones humanos. Las secuencias de ADN correspondientes fueron sintetizadas por genes y clonadas en vectores de expresión que contenían dominios de cadena pesada o ligera humanos constantes, lo que da por resultado la expresión de anticuerpos de longitud completa. Una excepción fue para el anticuerpo 5D5 que se expresó como un fragmento Fab. El isotipo de anticuerpo humano seleccionado para la expresión se lista en la columna del formato de anticuerpos junto con otras mutaciones introducidas en la región Fc en donde es aplicable. Las células CHO se transfectaron con los plásmidos de expresión correspondientes usando un sistema de expresión de proteína estándar, con la excepción del clon de hibridoma HB-12093, que se cultivó usando la técnica de cultivo de hibridoma estándar. Los sobrenadantes de anticuerpos correspondientes fueron purificados usando cromatografía en columna de purificación de proteína A estándar.
Tabla 4. Listado de análogos de anticuerpos sintetizados por genes y el formato de anticuerpo correspondiente
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Ejemplo 5: Clasificación de epítopos de anticuerpos MET
Este ejemplo ilustra cómo los anticuerpos MET se agruparon en clases de epítopos con base en los patrones de competencia por parejas. Los anticuerpos pertenecientes a diferentes clases de epítopos reconocen diferentes epítopos en el dominio extracelular MET (ECD).
Métodos
La investigación de la competencia por parejas de anticuerpos se realizó por análisis de Interferometría de bio-capa (BLI) usando un instrumento Octet QK384 (Fortebio, E.U.A.). Proteína de fusión Fc de MET humano comercialmente disponible (R&D Systems) fue capturada en los chips de sensores de Fc anti-humano (Fortebio, E.U.A.) y los sitios anti-Fc residuales bloqueados con anticuerpo de control negativo Herceptin. La superficie revestida de antígeno se saturó con una concentración de anticuerpo anti-MET de 80 gg/ml, seguido por la evaluación de combinaciones de anticuerpos anti-MET por parejas en experimentos de unión competitiva. La superficie del sensor se regeneró por incubación con 10 mM de glicina-HCl, pH 1.5 y se reutilizó para un nuevo ciclo de competencia.
Resultados
El patrón de competencia de los 13 anticuerpos MET probados se presenta en la figura 1. Se encontró que los anticuerpos MET se agrupan en 12 clases de epítopos distintas. Se encontró que el anticuerpo Hu9006 se une a un epítopo distinto que se traslapó con C8-H241. Sin embargo, el epítopo fue diferente en comparación con C8-H241, ya que C8-H241 también fue bloqueado por Hu9338 y 36C4, mientras que Hu9006 no lo fue. Por consiguiente, Hu9006 y C8-H241 fueron asignados a diferentes clases de epítopo. El epítopo de Hu9338 superpuesto con 36C4 y ambos anticuerpos mostraron patrones de competencia idénticos con otros anticuerpos en el panel probado, y éstos, por consiguiente, fueron asignados a la misma clase de epítopo.
Los anticuerpos 224G11, 28-MET, 5D5, 9206 y 13-MET mostraron en algunos casos inhibición unidireccional. Este fenómeno observado podría ser causado por efectos alostéricos y se observó en los experimentos de competencia repetidas.
Ejemplo 6: Análisis de anticuerpos MET para actividad de bloqueo de ligando HGF Este ejemplo ilustra cómo se analizó el panel de anticuerpos anti-MET de HGF para actividad de bloqueo de ligando mediante la modalidad de un ensayo de competencia usando el análisis de interferometría de bio-capa.
Métodos
La investigación de la actividad de bloqueo de ligando HGF se realizó por análisis de interferometría de bio-capa (BLI) usando un instrumento Octet QK384 (Fortebio, E.U.A.). Proteína de fusión Fc de MET humano comercialmente disponible (R&D Systems) fue capturada en los chips de sensores de Fc anti-humano (Fortebio, E.U.A.) y los sitios anti-Fc residuales bloqueados con anticuerpo de control negativo Herceptin. A continuación, la superficie revestida de antígeno se saturó con una concentración de anticuerpo anti-MET de 80 gg/ml (533 nM), excepto para el fragmento 5D5 Fab, que se diluyó a 26.7 gg/ml (533 nM). Después de la saturación de MET con la actividad de bloqueo de anticuerpos de ligando HGF se evaluó mediante incubación con ligando HGF humano (R&D Systems) probado en 20 gg/ml (222 nm). Herceptin IgG1 se usó como anticuerpo de control negativo.
Resultados
El resultado del análisis de la competencia se presenta en la siguiente tabla 5. Se encontró que los anticuerpos Hu9006 y Hu9338 inhibieron la unión al ligando HGF en aproximadamente 80%, mientras se encontró que 5D5 Fab bloqueó completamente la unión a HGF (100%). Cuando se mezclaron concentraciones equimolares de Hu9006 y Hu9338 (80 gg/ml de concentración total, 533 nM), la unión a ligando HGF fue inhibida por aproximadamente 90%. Por consiguiente, la actividad de bloqueo de ligando HGF más eficaz se obtuvo mezclando anticuerpos Hu9006 y Hu9338 1:1. Se encontró que los anticuerpos C8-H241 y 36C4 inhibieron la unión a ligando HGF por aproximadamente 80 y 75%, respectivamente, mientras que los anticuerpos 13-MET y 28-MET bloquearon la unión a HGF por aproximadamente 80 y 50%, respectivamente. El anticuerpo agonista 5882 y el anticuerpo control negativo Herceptin no bloquearon la unión a HGF (3-7% de inhibición de unión a HGF).
Tabla 5. Inhibición de unión a HGF después de la saturación de anticuerpos MET
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Ejemplo 7: Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-MET
Este ejemplo ilustra cómo los epítopos de unión de los anticuerpos MET de la invención se mapearon a la hoja 2 o 3 en el dominio SEMA-a, mediante el análisis de unión a constructos de MET quiméricos expresados en las células. El ejemplo también ilustra cómo los epítopos de los anticuerpos de la invención son distintos en comparación con los análogos de anticuerpos de referencia probados.
Métodos
El receptor de MET humano consta de un dominio extracelular de 907 aminoácidos (residuos 25-932). El dominio extracelular puede ser subdividido en el dominio SEMA (residuos 27-515), un dominio Plexin Semaforina Integrin rico en cisteína (dominio PSI, residuos 520-561) y cuatro dominios tipo inmunoglobulina definidos por las siguientes secuencias de aminoácidos. IPT1: AA 563-655. IPT2: AA 657-739. IPT3: AA 742-836. IPT4: AA 837-932. Las definiciones de dominio se describen en Gherardi et al, Proc Natl Acad Sci USA 100(21):12039-44 (2003) y entrada Uniprot P08581. El dominio SEMA consta de siete láminas beta (hojas) que se pliegan en una estructura de hélice de siete hojas (Stamos J. et al, EMBO J. 23:2325-2335 (2004)). Un sitio de escisión de furina está presente en la posición 307-308, dividiendo el dominio SEMA en cadenas a y p. El dominio SEMA-a es codificado por los residuos de aminoácidos 27-307 que componen las láminas 1-4 y el dominio SEMA-p es codificado por los residuos de aminoácidos 308-515 que componen las láminas 5-7. El dominio SEMA-a contiene un sitio de unión para la cadena p del ligando HGF, mientras que el sitio de unión a MET de la cadena- a de HGF sigue siendo difícil de alcanzar (Merchant et al., Proc Natl Acad Sci USA 110(32):E2987-96 (2013)). Un solo reporte afirma que los dominios IPT3 e IPT4 de MET ECD también median la unión a hGf de alta afinidad (Basilico et al., J Biol Chem 283 (30):21267-21277 (2008)).
La secuencia de ARNm de la isoforma 1 de MET humano ha sido descargada de NCBI (ACCESO NM_000245.2; la secuencia de aminoácidos está representada en SEQ ID NO: 1). MET humano también existe en una isoforma diferente (isoforma 2) en la que 19 aminoácidos (STWWKEPLNIVSFLFCFAS (SEQ ID NO: 2)) reemplazan a S755 en el dominio IPT 3. La secuencia de aminoácidos de la isoforma 2 se muestra como SEQ ID NO: 2. Las secuencias de proteína MET de pollo y de murino de longitud completa incluyendo secuencias de péptido líder se descargaron de NCBI (ACCESO NP_990543 (SEQ ID NO: 3) y NP_032617 (SEQ ID NO: 4), respectivamente). Variantes de intercambio de dominio humano/de pollo quimérico del dominio extracelular (ECD), en donde cada dominio o subdominio fue reemplazado secuencialmente por secuencia de ADN de pollo, se sintetizaron por genes junto con genes de ECD de MET completamente humano, de murino o de pollo. Constructos quiméricos en donde cada uno de las siete hojas en el dominio SEMA se intercambiaron secuencialmente de la secuencia humana a la de ratón también se sintetizaron.
Las constructos usados para determinar la especificidad de unión de hoja fueron los siguientes (los números se refieren a la secuencia intercambiada con la secuencia de ratón): Hoja de ratón 1: AA 25-83. Hoja de ratón 1-2: AA 25-162. Hoja de ratón 1-3: AA 25-233. Hoja de ratón 1-4: AA 25-295. Hoja de ratón 1-5: AA 25-430. Hoja de ratón 1-6: AA 25-479. Hoja de ratón 1-7: AA 25-513. También se hicieron constructos inversos. PSI-IPT4 de ratón: (AA 515-932). Hoja de ratón 7-IPT4: (AA 480-932). Hoja de ratón 6-IPT4: (AA 431-932). Hoja de ratón 5b-IPT4: (AA 382-932). Hoja de ratón 5a-IPT4: (AA 293-932). Hoja de ratón 4-IPT4: (AA 234-932). Hoja de ratón 3-IPT4: (AA 163-932). Hoja de ratón 2-IPT4: (AA 84-932). Las hojas 1-4 se encuentran en el subdominio SEMA-a y las hojas 5-7 en el subdominio SEMA-p.
Recientemente otros constructos quiméricos en donde las secuencias de llama se intercambiaron con secuencias humanas en el dominio SEMA de MET se han descrito (Basilico C. et al J. Clin Invest 124:3172-3186 (2014)). Estos constructos se sintetizaron también, pero con la modificación de que la secuencia de ratón se insertó en lugar de la secuencia de llama, ya que la secuencia de MET de llama no estaba públicamente disponible. Las definiciones de secuencia para las proteínas quiméricas adicionales fueron las siguientes (los números AA se refieren a secuencia intercambiada a la secuencia de ratón): LS1: AA25-122, LS2: AA25-224, LS3: AA25-312, LS4: AA25-371, LS5: AA25-473. LS1-3 residen en el subdominio SEMA-a y LS4-6 en el subdominio SEMA-p. Por último, los constructos en donde 15 AA de la secuencia de ECD de MET humano en el subdominio SEMA-a fueron intercambiados en forma secuencial a la secuencia de ratón se sintetizaron para el mapeo más detallado de epítopos lineales. Para el constructo 109-120 sólo 11 aminoácidos se intercambiaron con la secuencia del ratón. Cada constructo fue diseñado para superponerse con 2 aminoácidos, y en total 22 constructos con hasta 15 sustituciones de AA se hicieron cubriendo la secuencia del subdominio SEMA-a de MET humano después de la hoja 1 (AA 89-313).
Todos los constructos quiméricos o de tipo silvestre sintetizados descritos anteriormente se subclonaron en vectores de expresión que contenían una etiqueta de péptido SV5, un enlazador de glicina serina y la secuencia de codificación para un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) que resultó en la fusión C-terminal de este casete para el gen de interés (Bouquin T. et al., J. Biotechnol. 125:516-528 (2006). Los constructos de expresión generados se usaron para transfección FreeStyleTM transitoria de células HEK293 y las proteínas de fusión producidas fueron dirigidas a la membrana celular a través del anclaje GPI. Los anticuerpos MET se analizaron para la unión a las células transfectadas mediante citometría de flujo usando un iQue® Screener (corporación IntelliCyt). Los anticuerpos se probaron en un experimento de titulación de 8 puntos usando diluciones de 3 veces a partir de 50 pg/ml y detección con un colorante anti-IgG-humana (H+L) Alexa Fluor® 647. Los niveles de expresión de los constructos de MET fueron monitorizados por anti-SV5 mAb MCA1360B biotinilada y detección con estreptavidina APC Cy7. Los valores de corte se definen como la fluorescencia la señal promedio de todos los anticuerpos probados a 50 pg/ml para el constructo MET de pollo o ratón de control negativo cuatro desviaciones estándar para discriminar la unión de fondo de la unión específica para el intercambio de dominios o constructos de intercambio de hojas. La unión de anticuerpos a constructos, en donde los aminoácidos individuales o 15 aminoácidos se intercambiaron con la secuencia de ratón se normalizaron a unión 5D5 probada a 3 pg/ml, ya que las mutaciones se localizaron en el subdominio SEMA-a y se mostró que no influyeron en la unión de 5D5 dirigida contra el subdominio SEMA-p.
Resultados
El nivel de expresión de superficie de los constructos ECD de MET humano, de pollo o de ratón de tipo silvestre y quimérico se evaluó con tinción SV5. Todos los constructos evaluados expresaron bien y pudieron ser teñidos con el anticuerpo SV5, excepto el constructo que contenía el subdominio SEMA-p de pollo. Se evaluaron los títulos de cada anticuerpo MET que se unía a los constructos (no se muestran datos). Un resumen del anticuerpo que se une a los diferentes constructos quiméricos probados se presenta en la figura 2. Un resumen de anticuerpo diferencial que se une a constructos ECD de MET humano en donde 15 segmentos AA en el subdominio SEMA-a se intercambiaron secuencialmente a ratón se presenta en la tabla 6, y un resumen del anticuerpo diferencial que se une a constructos ECD de MET humano en donde los residuos expuestos en la superficie en el subdominio SEMAa se mutaron a la secuencia de ratón se presenta en la tabla 7. Por último, un resumen de todos los hallazgos de epítopo se muestra en la tabla 8.
Se encontró que todos los anticuerpos probados, excepto 5D5 y 224G11 se unieron al subdominio a la SEMA-a.
El mapeo de epítopos fino usando los constructos quiméricos que introduce mutaciones en el dominio SEMA-a ilustra que Hu9338 se une a un epítopo lineal situado en la hoja 2, como se ilustra por una pérdida significativa de unión (36% de unión en comparación con 5D5), cuando el segmento de secuencia AA 99-113 se intercambió a ratón (Tabla 6). El epítopo para Hu9338 fue distinto y no se encontró en los otros anticuerpos en el panel de MET probado. Se encontró que Hu9006 se une a un epítopo presente en un fragmento de la hoja 3 (AA 163 a 224). Ninguno de los constructos de MET mutados mediante mutación puntual de aminoácido individual o constructos de MET con secuencia de MET de ratón insertada de 15 AA mostró unión significativamente diferente de hu9006 en comparación con ECD de MET totalmente humana. Por consiguiente, el epítopo de hu9006 fue distinto en comparación con los otros miembros del panel de anticuerpos anti-MET. El hallazgo de que Hu9338 y Hu9006 se unieron a epítopos situados en la hoja 2 y 3 respectivamente fue coherente con que estos anticuerpos no son competitivos y que pertenecen a diferentes clases de epítopo.
También se encontró que el anticuerpo agonista 5882 se unen a la hoja 3 (AA 163-224), pero con residuos de contacto en las posiciones F206, D208, H209 y P210 como se revela en por lo menos un 50% o menos en comparación con la unión de 5D5, cuando se intercambian estas posiciones a la secuencia de ratón. Es importante destacar que estas mutaciones estrechamente ubicadas no afectaron significativamente la unión de los otros anticuerpos en el panel, lo que ilustra que la fuerte actividad agonista de 5882 se relaciona con la unión de la región definida por estas 4 sustituciones.
Se encontró que el anticuerpo C8-H241 se une a epítopos situados en la hoja 2 y 3. Aunque los constructos de intercambio de hojas mostraron que este anticuerpo se une a un epítopo importante en la hoja 3 (AA 163-224), podría obtenerse un mayor refinamiento de epítopo por la reducción observada de la unión a constructos donde 15 AA en la hoja 2 (AA 119-133) o 24 AA en la hoja 3 (AA 209-233) se intercambiaron a la secuencia de ratón (68-30%, respectivamente, en comparación con la unión a 5D5). Por último, un residuo de contacto identificado en la hoja 3 (K223), que dio como resultado sólo 19% de unión en comparación con 5D5 indicó que el epítopo del núcleo del anticuerpo C8-H241 se encuentra en la hoja 3. Los resultados concordaron bien con los datos publicados previamente (Liu L. et al, Clin Cancer Res 20:6059-6070 (2014)) que muestra que los epítopos lineales de C8-H241 según lo determinado por espectroscopia de masas de intercambio HD estaban presentes en las posiciones 123-128, 144-156, 192-195 y 220-227.
Por último, los inventores de la presente han sido capaces de mapear el epítopo de 36C4 de forma más precisa. Mientras Basilico et al. (Basilico C. et al., J. Clin Invest 124:3172-3186 (2014)) describieron que el epítopo de 36C4 estaba presente en la lámina 2 y 3 (AA 98 a 199), se demostró que la especificidad se puede dividir en un epítopo lineal en la posición 129-143 en la hoja 2 (58% de unión en comparación con 5D5) y un residuo de contacto en la posición H209 en la hoja 3 (43% de unión en comparación con 5D5). El residuo de contacto en la posición H209 también fue compartido con el anticuerpo agonístico 5882, pero puesto que 5882 se unió también a otros tres residuos de contacto cercanamente ubicados, la unión y por lo tanto las propiedades agonistas son claramente diferentes.
La estructura cristalina de unión de 5D5 al dominio SEMA ha sido publicada anteriormente (Merchant M. et al., Proc Natl Acad Sci USA 110:E2987-E2996 (2013)), y el estudio mostró que 5D5 reconoció principalmente la hoja 5 y 6 en el subdominio SEMA p. Los residuos de aminoácidos clave en las posiciones Q328, R331, L337 y N338 estuvieron presentes en la hoja 5, y cuando mutaron a residuos de ratón éstos redujeron significativamente la afinidad de unión. Este resultado concuerda con el análisis de unión de los inventores que mostró claramente que 5D5 reconoció un epítopo crucial en la hoja 5 (AA 313-371).
Los inventores también encontraron que el anticuerpo 224G11 reconoció el dominio ITP1 de acuerdo con la información provista por Basilico y sus colegas (Basilico C. et al., J. Clin Invest 124:3172-3186 (2014).
Tabla 6. Unión del anticuerpo a constructos ECD de MET humano expresados en células HEK293, donde 15 segmentos AA en el dominio SEMA-a se intercambian en forma secuencial a ratón
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La unión de anticuerpo se expresa como el porcentaje de unión a 5D5. Las celdas grises indican menos de 70% de unión del anticuerpo en comparación con 5D5.
Tabla 7. Unión del anticuerpo a constructos ECD de MET humano expresados en células HEK293, donde los residuos expuestos en la superficie en el dominio SEMA-a dominio se intercambiaron a ratón
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La unión de anticuerpo se expresa como el porcentaje de unión a 5D5. Las celdas grises indican menos de 50% de unión del anticuerpo en comparación con 5D5.
Tabla 8. Resumen de los epítopos de unión identificados para anticuerpos MET probados usando constructos de MET mutados expresados en la superficie celular
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Abreviaturas: AA: secuencia de aminoácidos. N.A.: No aplicable. N.D.: No determinado. B.L.: Hoja.
Ejemplo 8: Mediciones de afinidad para anticuerpos anti-MET quiméricos y humanizados
Este ejemplo demuestra que las variantes humanizadas de los anticuerpos anti-MET 9006 y 9338 tienen afinidades comparables a sus contrapartes quiméricas, lo que indica que los anticuerpos humanizados tienen la actividad funcional completa de los anticuerpos quiméricos. Además, los anticuerpos anti-MET humanizados muestran unión comparable a ECD de MET tanto de humanos como de cynomolgus.
Métodos
El análisis cinético de unión de las variantes 9006 y 9338 humanizadas y quiméricas purificadas se realizó en un biosensor de interferometría de bio-capa Octet QK384 (BLI) (Fortebio, E.U.A.) o un biosensor de resonancia de plasmón de superficie XPR-36 (SPR) (Bio-Rad, E.U.A.).
Antígenos de ECD de MET humanos o de cynomolgus con etiqueta His fueron adquiridos de Sinobiological, China. La cinética de unión se midió bajo condiciones de antígeno monovalente mediante la inmovilización de anticuerpos anti-MET y al mantener el antígeno MET monovalente en solución como se ha descrito anteriormente (Canziani et al, Anal. Biochem. 325(2):301-307 (2004). La densidad de anticuerpo anti-MET más baja posible se aplicó para evitar la unión no específica y limitación de transporte de masa. Para medir la cinética de anticuerpos en el sistema Octet, los anticuerpos a una concentración de 1.5 pg/ml fueron capturados en los sensores de Fc anti-humano (Fortebio, E.U.A.), y se probaron para la unión a antígeno ECD de MET humano (100 nM) dos veces diluido en serie siete veces. Las mediciones se llevaron a cabo con una velocidad de rotación la placa de 1000 rpm y los sensores se regeneraron y se reutilizaron por breves alternancias de 5 segundos entre la exposición a 10 mM de glicina:regulador de pH de HCl (pH 1.5) o regulador de pH PBS que contenía 1% de BSA y 0.001% de Tween 20 tres veces. Para los experimentos de resonancia de plasmón de superficie realizados en el instrumento Bio-Rad XPR-36, los anticuerpos anti-MET se ajustaron a una concentración de 0.25-0.5 pg/ml y se capturaron sobre las superficies de IgG Fc anti-humano generadas por la inmovilización de un anticuerpo Fc anti-humano monoclonal (Biacore, Dinamarca). Los anticuerpos anti-MET se probaron para la unión a ECD de MET humano o de cynomolgus en un intervalo de concentración 2 veces de 25 nM a 1.56 nM seguido por la regeneración de las superficies con regulador de pH de regeneración MgCl2 3 M (Biacore, Dinamarca). Las respuestas de unión registradas se ajustaron a un simple modelo Langmuir 1:1 para el cálculo de la velocidad de asociación (kasoc. o ka), velocidad de disociación (kdis. o kd) y afinidad (KD) usando doble referencia.
Resultados
Las mediciones cinéticas usando el biosensor Octet mostraron que la variante humanizada de 9006 con 3 mutaciones de retroceso (Hu9006) y la variante humanizada de 9338 (Hu9338) sin mutaciones de retroceso tienen afinidad ligeramente mejorada para el antígeno MET humano en comparación con los anticuerpos progenitores quiméricos (Tabla 9).
Tabla 9. Cinética de unión de anticuerpos MET quiméricos y humanizados a ECD de MET humano como se miden mediante interferometría de bio-capa (BLI)
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Las mediciones cinéticas usando el instrumento Bio-Rad XPR36 SPR mostraron que Hu9006 y Hu9338 reconocen ECD de MET tanto humano como de cynomolgus con afinidades en el intervalo de pM (Tabla 10).
Tabla 10. Cinética de unión de anticuerpos MET humanizados a ECD de MET humano o de cynomolgus como se mide por resonancia de plasmón de superficie (SPR)
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Ejemplo 9: Degradación de MET con anticuerpos anti-MET
Este ejemplo demuestra que los anticuerpos anti-MET 9006 y 9338 inducen la degradación de MET, solos y en combinación. La combinación de los dos anticuerpos induce la degradación más eficaz del receptor MET que cualquier anticuerpo solo.
Métodos
Para investigar el nivel de degradación del receptor MET inducida por anticuerpos anti-MET individuales 9006 y 9338, la mezcla de 9006 y 9338, y el análogo de C8-H241 (véase la tabla 4), se realizó el análisis Western Blot o análisis Western simple en lisados de células enteras de células SNU5, EBC1 y MKN45 tratadas con anticuerpo durante 24 o 48 horas. En resumen, las células fueron cultivadas en matraces de cultivo T-75, y cuando hubo 50% de confluencia se eliminó el medio de cultivo, las células se lavaron y se trataron con una concentración de anticuerpo total de 20 gg/ml de cualquiera de C8-H241, 9006, 9338, 9338+9006, o un anticuerpo control negativo (IgG1 humana frente a un objetivo no mamífero) durante 24 o 48 horas en una incubadora humidificada a 37°C. Lisados de células enteras se prepararon usando regulador de pH RIPA estándar. La concentración total de proteína se determinó usando un ensayo de BCA y 1 -10 gg de proteína analizada por el inmunoensayo automatizado de Western simple en un instrumento Sally (ProteinSimple) o por análisis Western Blot usando anticuerpos de detección primaria contra MET. Un anticuerpo contra actina p se usó como control de carga para el análisis Western Blot.
Resultados
Los resultados de la investigación Western Blot (Figura 3) muestran que el tratamiento con los anticuerpos individuales (especialmente 9006) induce una cierta degradación de MET en todas las líneas celulares probadas. Sin embargo, la mezcla de anticuerpos anti-MET 9338 9006 induce la degradación potenciada del receptor de MET en comparación con los anticuerpos individuales (9006 o 9338) en todas las líneas celulares probadas. El nivel de receptor de MET celular después de 24 horas o tratamiento con 9006+9338 o C8-H241 se comparó mediante análisis Western simple en las tres líneas celulares SNU5, EBC y MKN45. Los resultados mostrados en la figura 4 demuestran la degradación potenciada de MET después del tratamiento con 9006+9338 en las tres líneas celulares.
Ejemplo 10: Inhibición de la fosforilación de MET y señalización en dirección 3’ con anticuerpos anti-MET
Este ejemplo demuestra que los anticuerpos anti-MET 9006 y 9338 tienen efectos diferenciales y dependientes de la línea celular sobre la fosforilación de MET y señalización en dirección 3’ (según lo determinan los niveles de pERK2 y pAKT). La mezcla de anticuerpo anti-MET 9006+9338 induce la inhibición eficaz de la fosforilación de MET y señalización en dirección 3’.
Métodos
Para investigar el nivel de inhibición de la fosforilación de MET y la señalización en dirección 3’ inducida por anticuerpos anti-MET 9006 y 9338 y la mezcla de anticuerpos anti-MET 9006+9338, el análisis Western simple se realizó en lisados de células enteras de MKN45 y células EBC-1 tratadas con anticuerpo durante 24 horas. Las células se cultivaron en placas de 6 pozos. Cuando hubo 50% de confluencia, se retiró el medio de cultivo, y las células se lavaron en 1xPBS y se trataron con una concentración de anticuerpos total de 20 gg/ml (9006, 9338, 9006+9338, o el anticuerpo de control negativo Synagis®) durante 24 horas en una incubadora humidificada a 37°C. Lisados de células enteras se prepararon usando regulador de pH RIPA estándar. La concentración total de proteína se determinó usando un ensayo de BCA, y aproximadamente 1 mg/ml de proteína se analizó por análisis Western simple usando un instrumento Sally (sistema de inmunoensayo basado en tamaño automático, ProteinSimple) y mediante el uso de anticuerpos primarios contra MET fosforilada (Tyr1234/1235 y Tyr1349), ERK2 fosforilada (pErK2) y AKT fosforilada (pAKT). Un anticuerpo contra actina p se usó como control de carga (no se muestran datos).
Resultados
Los resultados del análisis Western simple de los niveles de fosforilación de MET (Figura 5) y ERK2 y AKT (Figura 6) muestran que el tratamiento con 9006 o 9338 por sí solos induce efectos diferenciales y dependientes de línea celular sobre la fosforilación en las líneas celulares probadas. La mezcla de anticuerpo anti-MET 9006+9338, sin embargo, induce la inhibición eficicaz de la fosforilación de MET y la señalización en dirección 3’ en comparación con el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-MET 9006 o 9338 tanto en células MKN45 como en EBC-1.
Ejemplo 11: Efecto antiproliferativo de anticuerpos anti-MET quiméricos en células endoteliales primarias Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) son células endoteliales primarias adecuadas para la evaluación de efectos biológicos en un modelo vascular sensible. Se muestra que los anticuerpos anti-MET 9006 y 9338 y la mezcla de anticuerpos 9006+9338 son capaces de inhibir el crecimiento de HUVECs, tanto en ausencia como en presencia del ligando HGF de MET.
Materiales y métodos
Se descongelaron células de fibroblastos dérmicos y se sembraron en medio de siembra en placas de 96 pozos. Después de la sedimentación de los fibroblastos a temperatura ambiente, se descongeló un vial de HUVECs marcadas con GFP. Las HUVECs, resuspendidas en un medio de siembra, se añadieron en la parte superior de la suspensión de fibroblastos y se incubaron durante la noche en un instrumento Incucyte (Essen Bioscience) a 37°C y 5% de CO2. Después de la incubación durante la noche, el medio de las células co-cultivadas fue retirado y reemplazado por medio de crecimiento durante 24 horas adicionales. El día siguiente, el medio de ensayo se preparó, y diferentes mezclas de ligando/anticuerpo se combinaron y se mezclaron en el medio de ensayo. El medio de crecimiento fue retirado y reemplazado por el medio de ensayo que contenía la diferente combinación de anticuerpos/ ligandos. El medio se intercambió con medio de ensayo fresco que contenía mezclas de anticuerpos/ligando cada dos a tres días. Imágenes de GFP-HUVEC se registraron cada cuatro horas. Varios parámetros de las células, incluyendo el número de células, longitud de la red celular, y el número de puntos de ramificación de la red se analizaron usando software Incucyte. Resultados
Las figuras 7 a 11 muestran la eficacia de los anticuerpos 9006 y 9338 para inhibir específicamente la proliferación de células endoteliales primarias, a diferencia de un control anticuerpo no relacionado que no muestra ningún efecto inhibidor. La mezcla anticuerpo 9006+9338 demuestra inhibición superior de la proliferación de HUVEC, particularmente cuando HGF está presente en el medio.
Ejemplo 12: Comparación in vitro de anticuerpos anti-MET quiméricos y humanizados Este ejemplo describe la comparación in vitro de 9006 quimérico, 9338 quimérico y 9338+9006 quimérico con las variantes humanizadas, es decir 9006 humanizado (Hu9006), 9338 humanizado (Hu9338) y 9338+9006 humanizado (Hu9338+Hu9006). Los anticuerpos monoclonales y la mezcla se evaluaron para su capacidad de inhibir el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer: Okajima, EBC1, MKN45, HCC827R1_cet#3, HCC827R1_cet#1 y KatoII.
Métodos
El 9006, 9338, 9338+9006 (mezcla 1:1 de los dos componentes), Hu9006, Hu9338 y Hu9338+Hu9006 (mezcla 1:1 de los dos componentes) junto con el anticuerpo de control negativo (Synagis®) se diluyeron a una concentración de anticuerpo total final de 100 pg/ml en medio RPMI 1640 Glutamax complementado con 2% de FBS y 1% de P/S, produciendo una concentración final de 25 pg/ml en los pozos que contenían la concentración de anticuerpo más alta. Después se realizó una dilución en serie doble de los anticuerpos, dando hasta 17 concentraciones diferentes. Números correspondientes de las células (Okajima: 1000 células/pozo, EBC1: 750 células/pozo, MKN45: 500 células/pozo, HCC827R1_cet#3: 500 células/pozo, HCC827R1_cet#1: 500 células/pozo; KatoII: 750 células/pozo) se añadieron a los pozos experimentales en una placa de 384 pozos, y se incubaron con anticuerpos durante 4 días en una incubadora humidificada a 37°C. Reactivo WST-1 se añadió posteriormente a las placas y se incubó durante una hora a 37°C. La absorbancia se midió a 450 nm y 620 nm (longitud de onda de referencia) usando un lector de ELISA. La absorbancia a 620 nm se restó de la absorbancia a 450 nM, y la cantidad de células metabólicamente activas (MAC) se calculó como un porcentaje del control no tratado como se describe en el Ejemplo 2.
Resultados
Las figuras 12 y 13 ilustran los resultados de viabilidad de las titulaciones de anticuerpos 9006 y 9338 quiméricos y humanizados y la mezcla de anticuerpos 9006+9338 quiméricos y humanizados en las líneas celulares HCC827R1_cet#3 (12a), HCC827R1_cet#1 (12B), MKN45 (12C), EBC-1 (13A), KatoII (13B) y Okajima (13C). Es evidente a partir de las gráficas que Hu9006, Hu9338, y Hu9338 Hu9006 tienen un efecto anti-proliferativo comparable con el de sus contrapartes quiméricas.
Ejemplo 13: Comparación in vitro de 9338 9006 y 13-MET+28-MET humanizados Este ejemplo describe las pruebas in vitro de 9338 9006 (Hu9338+Hu9006), 13-MET, 28-MET y 13-MET+28-MET humanizados (véase la tabla 4). Los anticuerpos monoclonales y las mezclas se evaluaron por su capacidad para inhibir el crecimiento de cuatro líneas celulares de cáncer: EBC1, MKN45, SNU5 y KatoII.
Métodos
Los anticuerpos Hu9338+Hu9006 (mezcla 1:1 de los dos componentes), 13-MET, 28-MET y 13-MET+28-MET (mezcla 1:1 de los dos componentes) junto con el anticuerpo de control negativo (Synagis®) se probaron para el efecto antimetabólico en EBC1 (500 células/pozo), MKN45 (750 células/pozo), SNU5 (750 células/pozo) y KatoII (750 células/pozo) como se describió anteriormente.
Resultados
Los resultados de viabilidad de las titulaciones de los anticuerpos Hu9338+Hu9006, 13-MET, 28-MET y 13-MET+28-MET en las líneas celulares EBC1, MKN45, SNU5 y KatoII y se muestran en la figura 14. Es evidente que los anticuerpos anti-MET tienen diferentes niveles de eficacia y potencia dependiendo de la línea de células probada. Sin embargo, la combinación de Hu9338 y Hu9006 demuestra la inhibición superior de la actividad metabólica, en comparación con 13-MET, 28-MET y 13-MET+28-MET en todas las líneas celulares probadas.
Ejemplo 14: Eficacia in vivo de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 quiméricos en modelo de xenoinjerto de tumor EBC-1 humano
Este ejemplo demuestra la eficacia in vivo de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 en xenoinjertos de la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas EBC-1 amplificada con MET humano.
Métodos
5 x 106 células EBC-1 se inocularon por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos atímicos hembra de 8 a 9 semanas de edad. Los tumores se midieron tres veces por semana mediante un calibrador en dos dimensiones y el volumen del tumor en mm3 se calculó según la fórmula: (anchura)2 x longitud x 0.5. En un tamaño promedio del tumor de 120 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron tres veces por semana durante un total de diez tratamientos por inyección intraperitoneal de regulador de pH de vehículo (citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6.0), anticuerpo monoclonal 9006, anticuerpo monoclonal 9338, o una mezcla 1:1 de anticuerpos monoclonales 9006+9338, seguido de un período de observación. Todos los tratamientos con anticuerpos se administraron a una concentración de anticuerpo total de 50 mg/kg. Por lo tanto, los animales tratados con 9006 y 9338 fueron dosificados con 50 mg/kg de 9006 o 9338, respectivamente, mientras que los animales tratados con 9006+9338 fueron dosificados con una mezcla que contenía 25 mg/kg de cada anticuerpo.
Resultados
El día 10 después de la inoculación, con un tamaño promedio del tumor de 120 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos de ocho animales y se inició el tratamiento. Como se muestra en la figura 15, el tratamiento con anticuerpo monoclonal 9338 no afectó el crecimiento del tumor en los animales en comparación con el control del vehículo. Por el contrario, el tratamiento con 9006 dio lugar a retraso del crecimiento del tumor, mientras que el tratamiento con 9006+9338 indujo la estabilización del crecimiento durante el tratamiento y fue superior a todos los otros tratamientos en este modelo. Los estudios de los grupos tratados con vehículo o con 9006 o 9338 por sí solos se cerraron durante el período de tratamiento debido a la excrecencia tumoral o ulceraciones relacionadas con tumor, mientras que los animales en el grupo de 9006+9338 completaron el tratamiento y la observación de dos a tres semanas después del final del tratamiento.
Ejemplo 15: Eficacia in vivo de dosis crecientes de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 quimérico en modelo de xenoinjerto de tumor EBC-1 humano
Este ejemplo demuestra la eficacia in vivo de dosis crecientes de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 en xenoinjertos de la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas EBC-1 amplificada con MET humano.
Métodos
5 x 106 células EBC-1 se inocularon por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos atímicos hembra de 8 a 9 semanas de edad. Los tumores se midieron tres veces por semana mediante un calibrador en dos dimensiones y el volumen del tumor en mm3 se calculó según la fórmula: (anchura)2 x longitud x 0.5. En un tamaño promedio del tumor de 150 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron tres veces por semana durante un total de diez tratamientos por inyección intraperitoneal de regulador de pH de vehículo (citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6.0), o una mezcla 1:1 de anticuerpos monoclonales 9006+9338, seguido de un período de observación. La mezcla 1:1 de 9006+9338 se administró a una concentración de anticuerpo total de 50, 25, 5 o 1 mg/kg por dosis inyectada.
Resultados
El día 11 después de la inoculación, con un tamaño promedio del tumor de 120 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cinco grupos de diez animales y se inició el tratamiento. Como se muestra en la figura 16, el crecimiento del tumor no se vio afectado en los animales tratados con la concentración más baja de 9006+9338 (1 mg/kg) en comparación con los animales tratados de control del vehículo. El tratamiento con 5 mg/kg de 9006+9338 dio lugar al retraso del crecimiento tumoral en puntos de tiempo posteriores, mientras que el tratamiento con 25 o 50 mg/kg de 9006+9338 indujeron niveles comparables de inhibición del tumor potente con estabilización de crecimiento.
Ejemplo 16: Eficacia in vivo de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 quiméricos en un modelo de xenoinjerto de tumor MKM-45 humano
En este ejemplo se demuestra la eficacia in vivo de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 en xenoinjertos de la línea celular de cáncer gástrico MKN-45 amplificada con MET humano.
Métodos
5 x 106 células MKN-45 se inocularon por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos atímicos hembra de 8 a 9 semanas de edad. Los tumores se midieron tres veces por semana mediante un calibrador en dos dimensiones y el volumen del tumor en mm3 se calculó según la fórmula: (anchura)2 x longitud x 0.5. En un tamaño promedio del tumor de 80 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron tres veces por semana durante un total de diez tratamientos por inyección intraperitoneal de regulador de pH de vehículo (citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6.0), anticuerpo monoclonal 9006, anticuerpo monoclonal 9338, o una mezcla 1:1 de anticuerpos monoclonales 9006+9338, seguido de un período de observación. Todos los tratamientos con anticuerpos se administraron a una concentración de anticuerpo total de 50 mg/kg. Por lo tanto, los animales tratados con 9006 y 9338 fueron dosificados con 50 mg/kg de 9006 o 9338, respectivamente, mientras que los animales tratados con 9006+9338 fueron dosificados con una mezcla que contenía 25 mg/kg de cada anticuerpo.
Resultados
El día 10 después de la inoculación, con un tamaño promedio del tumor de 80 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos de ocho animales y se inició el tratamiento. Como se muestra en la figura 17, el crecimiento del tumor fue ligeramente inhibido en los animales tratados con el anticuerpo monoclonal 9006 o 9338 por sí solo en comparación con los animales tratados de control de vehículo. Por el contrario, el tratamiento con 9006+9338 indujo la estabilización del crecimiento durante el tratamiento y fue superior a todos los otros tratamientos en este modelo. Los estudios de los grupos tratados con vehículo o 9006 por sí solo se cerraron durante el período de tratamiento debido a la excrecencia del tumor o ulceraciones relacionadas con el tumor, mientras que los animales en los grupos 9338 y 9006+9338 completaron el tratamiento. El grupo 9006+9338 se observó durante 2 semanas después del final del tratamiento, y la estabilización del crecimiento se mantuvo durante la mayor parte de este período.
Ejemplo 17: Eficacia in vivo de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 quiméricos en un modelo de xenoinjerto de tumor SNU5 humano
Este ejemplo demuestra la eficacia in vivo de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 en xenoinjertos de línea celular de cáncer gástrico SNU5 amplificada con MET humano.
Métodos
1 x 107 células SNU5 se inocularon por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos atímicos hembra de 8 a 9 semanas de edad. Los tumores se midieron tres veces por semana mediante un calibrador en dos dimensiones y el volumen del tumor en mm3 se calculó según la fórmula: (anchura)2 x longitud x 0.5. En un tamaño promedio del tumor de 165 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron tres veces por semana durante un total de diez tratamientos por inyección intraperitoneal de regulador de pH de vehículo (citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6.0), anticuerpo monoclonal 9006, anticuerpo monoclonal 9338, o una mezcla 1:1 de anticuerpos monoclonales 9006+9338, seguido de un período de observación. Todos los tratamientos con anticuerpos se administraron a una concentración de anticuerpo total de 50 mg/kg. Por lo tanto, los animales tratados con 9006 y 9338 fueron dosificados con 50 mg/kg de 9006 o 9338, respectivamente, mientras que los animales tratados con 9006+9338 fueron dosificados con una mezcla que contenía 25 mg/kg de cada anticuerpo.
Resultados
El día 15 después de la inoculación, con un tamaño promedio del tumor de 165 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos de ocho animales y se inició el tratamiento. Como se muestra en la figura 18, se observó regresión del tumor en los animales tratados con el anticuerpo monoclonal 9006 o 9338 o con la mezcla de anticuerpos 9006+9338 en comparación con los animales tratados de control de vehículo. El tratamiento con 9006 o 9006+9338 fue superior al tratamiento con 9338, y la regresión del tumor se mantuvo durante más de 50 días después del final del tratamiento en los grupos tratados con 9006 y 9006+9338.
Ejemplo 18: Eficacia in vivo de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 quiméricos en un modelo de xenoinjerto derivado de paciente con carcinoma hepatocelular humano
Este ejemplo demuestra la eficacia in vivo de la mezcla de anticuerpos 9006+9338 en un modelo de xenoinjerto derivado de paciente (LI1037) de carcinoma hepatocelular humano (HCC).
Métodos
La fuente de tumor para el modelo LI1037 se deriva de un tumor de paciente con cáncer de hígado que luego se mantuvo por vía subcutánea en ratones desnudos. Los tumores se trituraron en fragmentos de 3 mm3, y un fragmento se implantó por vía subcutánea en un flanco delantero en cada ratón. Los animales fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de tratamiento cuando el tumor alcanzó 220 mm3 de volumen medio. Los ratones se trataron tres veces por semana durante un total de diez tratamientos por inyección intraperitoneal de regulador de pH de vehículo (citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6.0) o una mezcla 1:1 de anticuerpos monoclonales 9006+9338, seguido de un período de observación. Todos los tratamientos con anticuerpos se administraron a una concentración de anticuerpo total de 50 mg/kg. Por lo tanto, los animales tratados con 9006+9338 se dosificaron con una mezcla que contenía 25 mg/kg de cada anticuerpo.
Resultados
El día 21 después de la inoculación, con un tamaño promedio del tumor de 220 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos de cuatro animales y se inició el tratamiento. Como se muestra en la figura 19, se observó inhibición del crecimiento tumoral en animales tratados con la mezcla de anticuerpos 9006+9338 en comparación con los animales tratados con control de vehículo.
Ejemplo 19: Comparación in vivo de mezclas de anticuerpos quiméricos y humanizados en un modelo de xenoinjerto de tumor EBC-1 humano
En este ejemplo, la eficacia in vivo de las mezclas de anticuerpos 9006+9338 quiméricos y Hu9006+Hu9338 humanizados se comparan en xenoinjertos de la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas EBC-1 amplificada con MET humano.
Métodos
5x106 células EBC-1 se inocularon por vía subcutánea en el flanco de ratones desnudos atímicos hembra de 8 a 9 semanas de edad. Los tumores se midieron tres veces por semana mediante un calibrador en dos dimensiones y el volumen del tumor en mm3 se calculó según la fórmula: (anchura)2 x longitud x 0.5. El día 20 después de la inoculación de las células a un tamaño promedio del tumor de ~130 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos de 10 animales y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron tres veces por semana con un total de diez inyecciones intraperitoneales de regulador de pH de vehículo, una mezcla 1:1 de 9006+9338 quimérico o 9006+9338 humanizado (Hu9006+Hu9338) seguido de un período de observación. Todos los tratamientos con anticuerpos fueron dosificados a una concentración de anticuerpo total de 50 mg/kg. Por lo tanto, los animales tratados con 9006+9338 y Hu9006+Hu9338 fueron dosificados con una mezcla que contenía 25 mg/kg de cada anticuerpo.
Resultados
Como se muestra en la figura 20, se observó regresión del tumor en los animales tratados tanto con 9006+9338 como con Hu9006+Hu9338 en comparación con los animales tratados de control de vehículo. El efecto inhibidor de tumor de Hu9006+Hu9338 y 9006+9338 pareció muy similar.
Ejemplo 20: Comparación in vivo de mezclas de anticuerpos quiméricos y humanizados en un modelo de xenoinjerto de tumor OE33 humeno
En este ejemplo, las eficacias in vivo de las mezclas de anticuerpos 9006+9338 quiméricos y Hu9006+Hu9338 humanizados se comparan en xenoinjertos de la línea celular de cáncer esofagogástrico OE33 amplificada con MET humano.
Métodos
Los tumores OE33 se trasplantaron en serie a partir de tumores previamente establecidos. Los tumores se habían hecho pasar ocho veces en el tiempo del estudio. Fragmentos de tumor que medían ~1 mm3 se trasplantaron por vía subcutánea en el flanco de ratones desnudos atímicos hembra de 8 a 9 semanas de edad. Los tumores se midieron tres veces por semana mediante un calibrador en dos dimensiones y el volumen del tumor en mm3 se calculó según la fórmula: (anchura)2 x longitud x 0.5. El día 30 después de la inoculación de tumor a un tamaño promedio del tumor de 200 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos de siete animales y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron tres veces por semana con un total de diez tratamientos por inyección intraperitoneal de regulador de pH de vehículo, una mezcla 1:1 de 9006+9338 quimérico o 9006+9338 humanizado (Hu9006+Hu9338) seguido de un período de observación. Todos los tratamientos con anticuerpos fueron dosificados a una concentración de anticuerpo total de 30 mg/kg. Por lo tanto, los animales tratados con 9006+9338 y Hu9006+Hu9338 fueron dosificados con una mezcla que contenía 15 mg/kg de cada anticuerpo.
Resultados
Como se muestra en la figura 21, se observó regresión tumoral en los animales tratados tanto con 9006+9338 como con Hu9006+Hu9338 en comparación con los animales tratados de control de vehículo y las curvas de crecimiento son muy similares.
Ejemplo 21: Comparación in vivo del anticuerpo monoclonal C8-H241 y la mezcla de anticuerpos Hu9006+Hu9338 en modelos de xenoinjertos de tumor humano
En este ejemplo, las eficacias in vivo de la mazcla de anticuerpos Hu9006+Hu9338 y el anticuerpo monoclonal comparador C8-H241 (véase la tabla 4) se comparan en xenoinjertos de línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas EBC-1 amplificada con MET humano y la línea celular de cáncer gástrico Hs746T amplificada con MET humano, que también porta una deleción del exón 14 de MET.
Métodos
5x106 células EBC-1 o 3.7x106 células Hs746T se inocularon por vía subcutánea en el flanco de ratones atímicos hembra. Los tumores se midieron tres veces por semana mediante un calibrador en dos dimensiones y el volumen del tumor en mm3 se calculó según la fórmula: (anchura)2 x longitud x 0.5. A un tamaño tumoral promedio de 140 mm3 para EBC-1 y 120 mm3 para Hs746T los ratones fueron distribuidos aleatoriamente y se inició el tratamiento.
Protocolo de tratamiento para EBC-1: Los ratones se trataron tres veces por semana con un total de diez inyecciones intraperitoneales de regulador de pH de vehículo, anticuerpo monoclonal C8-H241, o una mezcla 1:1 de anticuerpos monoclonales Hu9006+Hu9338 seguido de un período de observación. Después de 21 días de observación, los ratones restantes en el grupo C8-H241 fueron tratados nuevamente con Hu9006+Hu9338 tres veces por semana hasta la terminación del estudio en el día 139 después de la inoculación de las células tumorales.
Protocolo de tratamiento para Hs746T: Los ratones se trataron tres veces por semana con un total de diez inyecciones intraperitoneales de regulador de pH de vehículo, el anticuerpo monoclonal C8-H241, anticuerpo monoclona1Hu9006, anticuerpo monoclonal Hu9338 o una mezcla 1:1 de anticuerpos monoclonales Hu9006+Hu9338. Después de un período de observación de una semana todos los ratones restantes en los grupos Hu9006, Hu9338 y C8-H241 fueron tratados con una dosis única de Hu9006+Hu9338 y se observaron durante 9 días.
Todos los tratamientos con anticuerpos se dosificaron a una concentración de anticuerpo total 50 mg/kg. Por lo tanto, los animales tratados con C8-H241, Hu9006 y Hu9338 fueron dosificados con 50 mg/kg de anticuerpo, mientras que los animales tratados con Hu9006+Hu9338 fueron dosificados con una mezcla que contenía 25 mg/kg de cada anticuerpo. Resultados
EBC-1: En el día 15 después de la inoculación a un tamaño promedio del tumor de 140 mm3 los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos de diez animales y se inició el tratamiento. Como se muestra en la figura 22, se observó una respuesta limitada en ratones tratados con C8-H241 en comparación con los animales tratados de control de vehículo. Por el contrario, el tratamiento con Hu9006+Hu9338 indujo regresión tumoral. 21 días después de la última dosis, a un volumen de tumor promedio de 500 mm3, los ratones restantes en el grupo tratado con C8-H241 fueron tratados nuevamente con Hu9006+Hu9338. La figura 22 también muestra que los ratones respondieron con regresión del tumor en el tratamiento secundario.
Hs746T: El día 35 después de la inoculación con un tamaño promedio del tumor de 120 mm3 los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cinco grupos de ocho animales y se inició el tratamiento. Como se muestra en la figura 23, se observó una respuesta inhibitoria inicial limitada en ratones tratados con C8-H241, Hu9006 o Hu9338 en comparación con los animales tratados de control de vehículo, pero aproximadamente a medio camino a través del período de tratamiento, los tumores comenzaron a crecer de nuevo. Por el contrario, el tratamiento con Hu9006+Hu9338 indujo la regresión del tumor y la erradicación completa del tumor en todos los ocho ratones tratados. Nueve días después de la última dosis, los ratones restantes en los grupos tratados con C8-H241, Hu9006 y Hu9338 fueron tratados nuevamente con una dosis única de Hu9006+Hu9338. La figura 23 también muestra que los ratones respondieron con la regresión del tumor en el tratamiento secundario.
Ejemplo 22: Comparación in vivo del anticuerpo monoclonal C8-H241 y la mezcla de anticuerpos Hu9006+Hu9338 en cuatro modelos de xenoinjerto derivado del paciente humano En este ejemplo, la eficacia in vivo de la mezcla de anticuerpos Hu9006+Hu9338 y el anticuerpo monoclonal comparador C8-H241 (véase la tabla 4) se compararon en cuatro modelos de xenoinjerto derivado del paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) amplificado con MET humano.
Métodos
Cada ratón se inoculó por vía subcutánea en el flanco con fragmentos de tejido de NSCLC primario de modelo LXFA0526, LU0858, LU1901 o LU2503 (2-3 mm de diámetro) para el desarrollo del tumor. Los tumores se midieron dos veces a la semana mediante un calibrador en dos dimensiones y el volumen del tumor en mm3 se calculó según la fórmula: (anchura)2 x longitud x 0.5.
Cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó 100 a 200 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos (n = 5-8 ratones por grupo) y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron tres veces por semana para un total de diez inyecciones intraperitoneales con anticuerpo monoclonal C8-H241, mezcla de anticuerpos Hu9006+Hu9338 (anticuerpos monoclonales individuales mezclados en la misma relación) o control de regulador de pH de vehículo seguido por un período de observación de hasta tres semanas.
Todos los tratamientos con anticuerpos se dosificaron a una concentración de anticuerpo total de 50 mg/kg. Por lo tanto, los animales tratados C8-H241 fueron dosificados con 50 mg/kg de anticuerpo, mientras que los animales tratados con Hu9006+Hu9338 fueron dosificados con una mezcla que contenía 25 mg/kg de cada anticuerpo.
Resultados
Como se muestra en la figura 24, se observaron diferentes respuestas en los cuatro modelos bajo tratamiento con C8-H241. Por el contrario, el tratamiento con Hu9006+Hu9338 indujo regresión tumoral en los 4 modelos con una eficacia superior y/o tiempo retardado para la progresión en comparación con C8-H241. Anteriormente se reportó que C8-H241 fue altamente eficaz en un modelo de xenoinjerto NSCLC (LXFA-1647) amplificado con MET primario, amplificado con MET diferente, (Liu et al Clin Cancer Res. 20:6059-6070 (2014)).
Ejemplo 23: Comparación in vivo de composiciones de relación equilibrada y sesgada de la mezcla de anticuerpos Hu9006+Hu9338 en un modelo de xenoinjerto de tumor humano En este ejemplo, la eficacia in vivo de las mezclas que consistían de diferentes relaciones de los dos anticuerpos Hu9006 y Hu9338 se comparó en xenoinjertos de la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas EBC-1 amplificada con MET humano.
Métodos
5x106 células EBC-1 se inocularon por vía subcutánea en el flanco de ratones desnudos atímicos hembra de 8 a 9 semanas de edad. Los tumores se midieron tres veces por semana mediante un calibrador en dos dimensiones y el volumen del tumor en mm3 se calculó según la fórmula: (anchura)2 x longitud x 0.5. El día 13 después de la inoculación a un tamaño promedio del tumor de 150 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos de diez animales y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron tres veces por semana con un total de diez inyecciones intraperitoneales de regulador de pH de vehículo, mezclas de relación de anticuerpo sesgada de 1:1, 2:1 o 1:2 de anticuerpos monoclonales Hu9006+Hu9338 seguido por un período de observación. Los tratamientos de anticuerpos fueron dosificados a ya sea 50 mg/kg o, para las mezclas de relación de anticuerpo sesgadas, la concentración de anticuerpo total de 10 mg/kg como sigue: relación 1:1 de animales dosificados se dosificaron con una mezcla que contenía 25 mg/kg de cada anticuerpo. Relación 1:2 de animales dosificados se dosificaron con una mezcla que contenía 3 mg/kg de Hu9006 y 7 mg/kg de Hu9338 para una dosificación total de 10 mg/kg o con una mezcla que contenía 17 mg/kg de Hu9006 y 33 mg/kg de Hu9338 para una dosificación total de 50 mg/kg. Análogamente, relación 2:1 de animales dosificados se dosificaron con una mezcla que contenía 7 mg/kg de Hu9006 y 3 mg/kg de Hu9338 para una dosificación total de 10 mg/kg o con una mezcla que contenía 33 mg/kg de Hu9006 y 17 mg/kg de Hu9338 para una dosificación total de 50 mg/kg.
Resultados
Como se muestra en la figura 25, el tratamiento con Hu9006+Hu9338 a ambas relaciones equilibrados y sesgadas y a ambas dosis indujeron regresión del tumor. El nivel de regresión del tumor pareció similar para todos los tratamientos con anticuerpos probados indicando que Hu9006+Hu9338 produce una inhibición del crecimiento del tumor sólida y consistente en ambas composiciones de anticuerpos simples equilibradas y sesgadas.
Tabla 11: Diagrama de SEQ ID NO
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de anticuerpos que comprende un primer anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo y un segundo anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde:
a) la cadena pesada (H) CDR1-3 y la cadena ligera (L) CDR1-3 de dicho primer anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21,22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente; y
b) la cadena pesada (H) CDR1-3 y la cadena ligera (L) CDR1-3 de dicho segundo anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
2. La composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 1, en donde
a) el dominio variable de cadena pesada (VH) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de dicho primer anticuerpo anti-MET son por lo menos un 90% idénticos en secuencia respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6 y 8, respectivamente, y el VH y el VL de dicho segundo anticuerpo anti-MET son por lo menos un 90% idénticos en secuencia respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 10 y 12, respectivamente;
b) el VH y el VL de dicho primer anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6 y 8, respectivamente, y el VH y el VL de dicho segundo anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 10 y 12, respectivamente;
c) el VH y el VL de dicho primer anticuerpo anti-MET son por lo menos un 90% idénticos en secuencia respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 14 y 16, respectivamente, y el VH y el VL de dicho segundo anticuerpo anti-MET son por lo menos un 90% idénticos en secuencia respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 y 20, respectivamente; o
d) el VH y el VL de dicho primer anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 14 y 16, respectivamente, y el VH y el VL de dicho segundo anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SeQ ID NOs: 18 y 20, respectivamente.
3. La composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 1, en donde
la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de dicho primer anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 34 y 33, respectivamente, y
la HC y la LC de dicho segundo anticuerpo anti-MET comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y 35, respectivamente.
4. La composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque esa composición tiene por lo menos una propiedad seleccionada del grupo constituido por:
a) induce la degradación de MET;
b) inhibe el crecimiento in vitro de por lo menos una línea celular seleccionada de SNU5, EBC1, MKN45, KatoII, OE33 y Okajima;
c) inhibe la fosforilación de MET;
d) inhibe MET señalización en dirección 3’; e
e) inhibe la proliferación de células endoteliales primarias en presencia o ausencia de HGF.
5. Un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde dicho anticuerpo:
a) tiene H-CDR1-3 y L-CDR1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente;
b) tiene un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
c) tiene un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o
d) tiene una HC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
6. Un anticuerpo anti-MET o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde dicho anticuerpo:
a) tiene H-CDR1-3 y L-CDR1-3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente;
b) tiene un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
c) tiene un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; o
d) tiene un HC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
7. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno del mismo, y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígeno del mismo, del anticuerpo anti-MET de la reivindicación 5 o 6.
8. Una célula hospedera que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de la misma, y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígeno de la misma, del anticuerpo anti-MET de la reivindicación 5 o 6.
9. Un método para producir el anticuerpo o porción de unión a antígeno de la reivindicación 5 o 6, que comprende: proporcionar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8,
cultivar dicha célula hospedera en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o porción, y
aislar el anticuerpo o porción resultante.
10. Un método para producir la composición de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende proporcionar una primera célula hospedera capaz de expresar el primer anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno y una segunda célula hospedera capaz de expresar el segundo anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno,
cultivar dichas primera y segunda células hospederas en condiciones adecuadas para la expresión de los anticuerpos o porciones, y
aislar los anticuerpos o porciones resultantes, opcionalmente en donde la primera y segunda células hospederas se cultivan en un único biorreactor.
11. Una composición farmacéutica que comprende la composición de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno de la reivindicación 5 o 6, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Una molécula de unión biespecífica que tiene las especificidades de unión del primer y segundo anticuerpos anti-MET o porciones de unión a antígeno de la composición de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la molécula de unión biespecífica comprende un primer sitio de unión a antígeno que comprende las secuencias de aminoácidos de H-CDR1-3 y L-CDR1-3 de SEQ ID NOs: 21,22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente, y un segundo sitio de unión a antígeno que comprende las secuencias de aminoácidos de H-CDR1-3 y L-CDR1-3 de SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
13. La composición de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el anticuerpo anti-MET o porción de unión a antígeno de la reivindicación 5 o 6, la composición farmacéutica de la reivindicación 11, o la molécula de unión biespecífica de la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de un paciente humano con cáncer.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017201204A1 (en) 2016-05-17 2017-11-23 Abbvie Biotherapeutics Inc. ANTI-cMet ANTIBODY DRUG CONJUGATES AND METHODS FOR THEIR USE
US11299547B2 (en) * 2016-09-29 2022-04-12 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation CMET monoclonal binding agents, drug conjugates thereof and uses thereof
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
WO2018223958A1 (zh) 2017-06-06 2018-12-13 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种含c-Met抗体药物偶联物的药物组合物及其用途
US20210163604A1 (en) * 2018-03-28 2021-06-03 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation DRUG CONJUGATES OF cMET MONOCLONAL BINDING AGENTS, AND USES THEREOF
KR102221755B1 (ko) * 2018-05-02 2021-03-02 (주)에임드바이오 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
KR102433184B1 (ko) * 2018-12-07 2022-08-17 서울대학교 산학협력단 항 c-Met 아고니스트 항체 및 이의 용도
CN114222760A (zh) * 2019-06-26 2022-03-22 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 Il1rap结合蛋白
KR20220063185A (ko) 2019-09-16 2022-05-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 면역-pet 영상화를 위한 방사성 표지된 met 결합 단백질
WO2021058735A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Symphogen A/S Cancer treatment with anti-met antibody compositions
WO2022204332A1 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 Combangio, Inc. Compositions comprising c-met agonist antibodies and methods for use in ocular treatment
EP4320152A1 (en) 2021-04-08 2024-02-14 Byondis B.V. Anti-c-met antibodies and antibody-drug conjugates
WO2023150632A2 (en) * 2022-02-02 2023-08-10 The Broad Institute, Inc. Targeting moieties promoting transduction of central nervous system cells and tissues and methods of use
WO2023225336A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Novartis Ag Met bcl-xl inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use thereof

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
CA1319120C (en) 1985-04-01 1993-06-15 John Henry Kenten Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ES2330052T3 (es) 1991-03-01 2009-12-03 Dyax Corporation Proteina quimerica que comprende micro-proteinas que tienen dos o mas puentes disulfuro y relaizaciones de las mismas.
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
EP0805203B1 (en) 1992-09-18 2007-08-01 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Medical use of an antibody or antibody fragment against the extracellular domain of Met for the prevention of metastasis
EP0804070B1 (en) 1993-03-09 2000-05-24 Genzyme Corporation Process of isolation of proteins from milk
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5707624A (en) 1994-06-03 1998-01-13 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of Kaposi's sarcoma by inhibition of scatter factor
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US6214344B1 (en) 1995-06-02 2001-04-10 Genetech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonists and uses thereof
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
CA2258153C (en) 1996-07-03 2004-08-17 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor agonists and uses thereof
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
PT1583830E (pt) 2003-01-07 2006-11-30 Symphogen As Método para produzir proteínas policlonais recombinantes
ITMI20031127A1 (it) 2003-06-05 2004-12-06 Uni Degli Studi Del Piemont E Orientale Am Anticorpi anti-hgf-r e loro uso
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
TWI333977B (en) 2003-09-18 2010-12-01 Symphogen As Method for linking sequences of interest
WO2005117973A2 (en) 2004-05-05 2005-12-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents for modulating biological activity
AU2005267720B2 (en) 2004-08-05 2012-02-23 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
ZA200707953B (en) 2005-03-25 2009-06-24 Genenthech Inc Methods and compositions for modulating hyperstabilized c-met
ATE541584T1 (de) 2005-11-16 2012-02-15 Fariba Nayeri Verfahren zur hemmung von krebsbildung und/oder metastasen bei einer person durch endogene c-met- liganden und -hemmer
SI1981981T1 (sl) 2006-02-06 2012-01-31 Metheresis Translational Res Sa Anti-met monoklonalno protitelesce, njegovi fragmenti in vektorji, za zdravljenje tumorjev in ustrezni proizvodi
CA2646620C (en) 2006-03-20 2015-07-14 Seikagaku Corporation Therapeutic agent for rheumatoid arthritis
EP2004693B1 (en) 2006-03-30 2012-06-06 Novartis AG Compositions and methods of use for antibodies of c-met
US8039598B2 (en) 2007-01-19 2011-10-18 Van Andel Research Institute Met fab and SCFV fragments
JP5941616B2 (ja) 2007-05-25 2016-06-29 シムフォゲン・アクティーゼルスカブＳｙｍｐｈｏｇｅｎ Ａ／Ｓ 組み換えポリクローナルタンパク質を製造する方法
EP2014681A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
US7892770B2 (en) 2007-08-24 2011-02-22 Van Andel Research Institute Monoclonal antibody which binds cMet (HGFR) in formalin-fixed and paraffin-embedded tissues and related methods
JP2011518790A (ja) 2008-04-23 2011-06-30 シムフォゲン・アクティーゼルスカブ ポリクローナルタンパク質を製造する方法
WO2009142738A2 (en) * 2008-05-21 2009-11-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
EP2337801A4 (en) * 2008-10-06 2012-07-25 Minerva Biotechnologies Corp MUC1 ANTIBODIES *
PA8849001A1 (es) 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
AU2011226103C1 (en) 2010-03-10 2016-04-28 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-Met
WO2012059858A1 (en) 2010-11-01 2012-05-10 Symphogen A/S Anti-her3 antibodies and compositions
US8637027B2 (en) * 2010-11-03 2014-01-28 Argen-X B.V. Anti c-Met antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
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US10450376B2 (en) 2019-10-22
AU2015316522B2 (en) 2021-01-21
JP6927875B2 (ja) 2021-09-01
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JP2017534259A (ja) 2017-11-24

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