JP2014157056A

JP2014157056A - ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の検出方法

Info

Publication number: JP2014157056A
Application number: JP2013027404A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Ise; 伸之伊勢; Kazuya Komi; 和也小見; Shigeki Higashiyama; 繁樹東山; Nobuaki Takemori; 信暁武森
Original assignee: Fujirebio Inc; Ehime University NUC
Current assignee: Fujirebio Inc; Ehime University NUC
Priority date: 2013-02-15
Filing date: 2013-02-15
Publication date: 2014-08-28
Also published as: US20150362498A1; EP2957907A1; WO2014125879A1; EP2957907A4

Abstract

【課題】ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の検出方法を提供すること。
【解決手段】ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を利用して、サンプルにおいて該可溶性ｃ−ＭＥＴを測定することを含む、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の検出方法などに関する。

癌遺伝子の一つである受容体チロシンキナーゼｃ−ＭＥＴを阻害することにより所定の癌の増殖を阻害することが可能であることが示されており、ｃ−ＭＥＴに対する阻害剤の抗癌剤としての開発が進められている。このｃ−ＭＥＴに対する阻害剤が有効な癌に関しては今のところ不明な点も多いが、ｃ−ＭＥＴの異常な活性化（例、ｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅、およびｃ−ＭＥＴ遺伝子の変異）を伴う癌が有力な候補として挙げられている。したがって、癌の特質を診断することにより、ｃ−ＭＥＴ阻害剤で治療すべき癌を選択することが可能となると考えられる。

ｃ−ＭＥＴの異常な活性化を伴う癌のうちｃ−ＭＥＴの遺伝子増幅を伴う癌については、遺伝子増幅を直接的に検出可能なＦＩＳＨ法が有力であるが、ＦＩＳＨ法は、癌細胞の処理および遺伝子増幅の検出において煩雑な工程を要するため、自動化が難しいという問題点がある。したがって、ｃ−ＭＥＴの遺伝子増幅を伴う癌について、より簡便な診断方法の開発が期待される。

ｃ−ＭＥＴの遺伝子増幅に伴う現象として、ｃ−ＭＥＴが細胞外ドメイン中で切断されることにより可溶性ｃ−ＭＥＴが細胞外に分泌され、さらには血中に移行する現象が見出されている（特許文献１）。しかしながら、ｃ−ＭＥＴの細胞外ドメインを構成するポリペプチドのみからなる可溶性スプライシングバリアントの存在（非特許文献１）、および異なるプロテアーゼによりｃ−ＭＥＴが細胞外ドメイン中で切断される現象（非特許文献２、３）について報告されており、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴わない細胞もまた、可溶性スプライシングバリアントおよび／または異なる可溶性ｃ−ＭＥＴを血中に分泌すると考えられる。したがって、ｃ−ＭＥＴの遺伝子増幅を伴う癌の診断をより高精度で行うためには、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴う癌細胞により分泌され得る特定の可溶性ｃ−ＭＥＴを、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴わない細胞により分泌され得る異なる可溶性ｃ−ＭＥＴおよび可溶性スプライシングバリアントと区別して測定する必要があると考えられる。

国際公開第２０１１／１２５４５８号

ＪｉｎＰｅｔａｌ．，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｅｓＴｈｅｒ．２００８；１０（４）：Ｒ７３（Ａｖａｉｌａｂｌｅｏｎｌｉｎｅｈｔｔｐ：／／ａｒｔｈｒｉｔｉｓ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０／４／Ｒ７３）ＫｏｐｉｔｚＣｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００７；６７：８６１５−８６２３．ＳｃｈｅｌｔｅｒＦｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２０１０；２８５（３４）：２６３３５−４０

本発明は、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の検出方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討した結果、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞により特異的に分泌される特定の可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントが、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成すること、およびこの切断がＡＤＡＭ１７により主に引き起こされること、ならびにサンプルにおいて特定の可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントを特異的に測定することにより、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞を特異的に検出できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を利用して、サンプルにおいて該可溶性ｃ−ＭＥＴを測定することを含む、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の検出方法。
〔２〕癌の検査方法である。〔１〕の方法。
〔３〕サンプルがヒトに由来する、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕サンプルが液体サンプルである、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞が肺癌細胞である、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕以下（１）および（２）を含む方法である、〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法：
（１）サンプルをプロテアーゼで処理すること；および
（２）ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントを測定すること。
〔７〕前記可溶性ｃ−ＭＥＴの測定が、ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントを質量分析により検出することにより行われる、〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法。
〔８〕前記可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントが、ＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１０）またはＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１１）のアミノ酸配列からなるペプチドである、〔６〕または〔７〕の方法。
〔９〕ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する親和性物質。
〔１０〕親和性物質が抗体である、〔９〕の親和性物質。
〔１１〕ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する親和性物質を含む、癌の診断用試薬。

本発明の方法は、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞を特異的に検出できるため、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴う癌の検査に有用である。本発明の方法はまた、癌に対する抗癌剤（例、ｃ−ＭＥＴ阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤等の分子標的薬）の治療効果を簡便に判定でき、また、癌に対する抗癌剤の治療効果を簡便にモニタリングできる。

図１は、ＡＤＡＭ１７遺伝子のノックダウンによるｃ−ＭＥＴ分泌の阻害を示す図である。ｓｉ−Ｎ．Ｃ．：ネガティブコントロールｓｉ−ＲＮＡ；ｓｉ−ＡＤ１０：ＡＤＡＭ１０遺伝子をターゲットとしたｓｉ−ＲＮＡ；ｓｉ−ＡＤ１７：ＡＤＡＭ１７遺伝子をターゲットとしたｓｉ−ＲＮＡ。図２は、培養上清中のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの検出を示す図である。図３は、トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃおよびキモトリプシンによる消化により生成する、９２２ＫをＣ末端に有するペプチド断片の検出を示す図である。

本発明は、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の検出方法を提供する。
本発明の方法は、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を利用して、サンプルにおいて該可溶性ｃ−ＭＥＴを測定することを含む。

ｃ−ＭＥＴは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の受容体であり、ＨＧＦが結合することにより細胞内シグナル伝達を活性化する。ｃ−ＭＥＴは、ｃ−ＭＥＴの前駆体（プロｃ−ＭＥＴ）が切断されることにより生じるα鎖およびβ鎖からなり、ジスルフィド結合により二量体を形成する。ｃ−ＭＥＴは、細胞膜を貫通する受容体であり、α鎖の全体およびβ鎖の一部が細胞外に存在している（例えば、Ｍａｒｋら，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，Ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．３６，ｐｐ．２６１６６−２６１７１；医学のあゆみ，２００８，Ｖｏｌ．２２４，Ｎｏ．１，ｐｐ．５１−５５を参照）。ヒトｃ−ＭＥＴならびにそのα鎖およびβ鎖については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００２３６．２（配列番号１）を参照のこと。

本明細書中で用いられる場合、用語「可溶性ｃ−ＭＥＴ」は、外部ドメイン排出（ＥｃｔｏｄｏｍａｉｎＳｈｅｄｄｉｎｇ）により分泌されるｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域のポリペプチドをいう。ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴う癌細胞は、実施例１で実証されているように、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴを生成する。ヒトでは、このような特定の可溶性ｃ−ＭＥＴは、配列番号１のアミノ酸配列において１〜９２２位のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列からなる。
このような特定の可溶性ｃ−ＭＥＴは、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成される。ヒト由来の可溶性ｃ−ＭＥＴでは、リジン残基（Ｋ）は、配列番号１のアミノ酸配列における９２２位のアミノ酸残基に対応し、バリン残基（Ｖ）は、配列番号１のアミノ酸配列における９２３位のアミノ酸残基に対応する。ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインにおいて、リジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間で切断されるべき部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）は、好ましくはＬＧＫＶＩＶ（配列番号３）であり、より好ましくはＶＬＧＫＶＩＶＱ（配列番号４）であり、さらにより好ましくはＴＶＬＧＫＶＩＶＱＰ（配列番号５）である。上記切断は、例えば、１回膜貫通型のマルチドメインタンパク質であるＡＤＡＭ（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）ファミリーに属するＡＤＡＭ１７により主に引き起こされ得る。ＡＤＡＭ１７は、ＴＡＣＥ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ）と呼称されることもある。
上記切断により生成される特定の可溶性ｃ−ＭＥＴは、ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する。このような特定の可溶性ｃ−ＭＥＴがＣ末端に有するペプチド単位は、好ましくはＬＧＫであり、より好ましくはＶＬＧＫ（配列番号６）であり、さらにより好ましくはＴＶＬＧＫ（配列番号７）である。

用語「可溶性（ｃ−ＭＥＴ）スプライシングバリアント」とは、外部ドメイン排出ではなくオルタネイティブスプライシングにより生成される、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列のみからなるポリペプチドをいう。可溶性スプライシングバリアントとしては、例えば、バリアント１（ＡＣＦ４７６０３．１）、バリアント２（ＡＣＦ４７６０４．１）、バリアント３（ＡＣＦ４７６０５．１）、バリアント４（ＡＣＦ４７６０６．１）、バリアント５（ＡＣＦ４７６０７．１）、バリアント６（ＡＣＦ４７６０８．１）、バリアント７（ＡＣＦ４７６０９．１）、バリアント８（ＡＣＦ４７６１０．１）、バリアント９（ＡＣＦ４７６１１．１）、バリアント１０（ＡＣＦ４７６１２．１）、バリアント１１（ＡＣＦ４７６１３．１）、バリアント１２（ＡＣＦ４７６１４．１）、バリアント１３（ＡＣＦ４７６１５．１）、バリアント１４（ＡＣＦ４７６１６．１）、バリアント１５（ＡＣＦ４７６１７．１）が挙げられる（非特許文献１を参照）。

特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域とは、上述した特定の可溶性ｃ−ＭＥＴ中には存在するが、可溶性スプライシングバリアント中には存在し得ない領域をいう。ヒトでは、上述した特定の可溶性ｃ−ＭＥＴは、ｃ−ＭＥＴをコードする配列番号１のアミノ酸配列において１〜９２２位のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列からなる。一方、上述したいずれかの可溶性スプライシングバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列における１〜８６１位までのアミノ酸残基からなる部分領域を有する。しかしながら、いずれの可溶性スプライシングバリアントも、配列番号１のアミノ酸配列における８６２〜９２２位のアミノ酸残基からなる部分領域を有し得ない。したがって、ヒトでは、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域は、配列番号１のアミノ酸配列における８６２〜９２２位のアミノ酸残基からなる部分領域であり得る。

特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を利用することによる特定の可溶性ｃ−ＭＥＴの測定は、例えば、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する親和性物質を用いて行うことができる。このような親和性物質としては、例えば、抗体およびアプタマーが挙げられる。特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する親和性物質は、例えば、ＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１０）またはＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１１）のアミノ酸配列からなるペプチドに対する親和性物質であってもよい。このような親和性物質を用いる特定の可溶性ｃ−ＭＥＴの測定は、免疫学的手法により行なわれてもよい。免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。

特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態、またはストリップ等の支持体中に含侵された形態で提供されてもよい。抗体は、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域からなるペプチドまたはその部分ペプチドを抗原として用いて、自体公知の方法により作製できる。

ポリクローナル抗体は、例えば、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域からなるペプチドまたはその部分ペプチドを抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。

モノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域からなるペプチドまたはその部分ペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。

特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対するアプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸと呼ばれる手法により作製できる。

特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する親和性物質は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供されてもよい。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。

特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を利用することによる特定の可溶性ｃ−ＭＥＴの測定はまた、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成される、ジペプチド単位ＶＩをＮ末端に有するｃ−ＭＥＴフラグメントに対する親和性物質を、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する親和性物質と併用して行われてもよい。このような併用により、ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する特定の可溶性ｃ−ＭＥＴをより特異的に測定することができる。

特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を利用することによる特定の可溶性ｃ−ＭＥＴの測定はまた、例えば、サンプルをプロテアーゼで処理した後、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に由来するペプチドを検出することにより行われてもよい。プロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、アスパラギニルエンドペプチダーゼ、アルギニルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼが挙げられる。このようなペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列における８６２〜９２２位のアミノ酸残基からなる部分領域に由来する任意のペプチドであり、例えば、ＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１０）またはＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１１）のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。検出は、例えば、ＨＰＬＣ、質量分析などの方法によって行うことができる。

特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を利用することによる特定の可溶性ｃ−ＭＥＴの測定はまた、質量分析により行われてもよい。質量分析による測定では、先ず、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴを含むサンプルを直接質量分析計に導入した後、アルゴンや窒素などのガスと衝突させて衝突誘起解離を行う。次いで、生じたフラグメントイオンの中から特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に由来するペプチド（例、ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメント）を検出することにより、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴを測定することができる。

本発明の方法は、癌の検査、例えば、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴う癌の診断に有用である。本明細書中で用いられる場合、用語「癌」とは、ｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅を伴い得る癌をいう。このような癌としては、例えば、肺癌（例、扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌等の非小細胞癌、ならびに小細胞癌）、消化器系癌（例、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、肉腫、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、固形癌、上皮性癌、中皮腫が挙げられる。

サンプルとしては、上述したような特定の可溶性ｃ−ＭＥＴを含有する可能性があるものである限り特に限定されず、例えば、液体サンプル（例、血液、血清、尿、唾液、腹水、組織抽出液、細胞抽出液）、非液体サンプル（例、組織サンプル、細胞サンプル）が挙げられる。なお、侵襲性の低さの観点からは、上記のうち、血液、血清、尿、唾液が好ましい。必要に応じて、サンプルは、測定前に、事前に処理されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、濃縮、分画、細胞固定、組織固定、組織凍結、組織薄片化が挙げられる。

サンプルは、液体サンプルであることが好ましい。液体サンプルが、全長ｃ−ＭＥＴ発現細胞（換言すれば、膜結合型ｃ−ＭＥＴ）を含む可能性がある場合、本発明の方法は、このような細胞を除去することを含んでいてもよい。細胞の除去は、例えば、上述したような事前処理（例、遠心分離、分画）により行うことができる。細胞の除去後の液体サンプルは、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴ、ならびに異なる可溶性ｃ−ＭＥＴおよび可溶性スプライシングバリアントを含み得るが、全長ｃ−ＭＥＴ（即ち、上述したような特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を有する膜結合型ｃ−ＭＥＴ）を含まない。したがって、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を利用することで、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴを特異的に測定することができる。

サンプルが由来する被験体としては、例えば、癌に罹患している哺乳動物、または癌に罹患していると疑われる哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、愛玩動物、使役動物が挙げられる。具体的には、哺乳動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、マウス、ラットが挙げられるが、好ましくは、ヒトである。

ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴う癌を保有する被験体は、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅に起因して、特定のプロテアーゼ（例、ＡＤＡＭ１７）により切断される基質タンパク質ｃ−ＭＥＴを多量に発現していると考えられる。このような被験体では、多量に発現しているｃ−ＭＥＴと相関して、ｃ−ＭＥＴの切断により生成する特定の可溶性ｃ−ＭＥＴの濃度も増加していると考えられる。今回、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により、特定の可溶性ｃ−ＭＥＴが分泌されることが見出されている。ｃ−ＭＥＴの遺伝子増幅を伴う癌の診断をより高精度で行うためには、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴う癌細胞により分泌され得る特定の可溶性ｃ−ＭＥＴを、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴わない細胞により分泌され得る異なる可溶性ｃ−ＭＥＴおよび可溶性スプライシングバリアントと区別して測定する必要があるところ、上記特定の可溶性ｃ−ＭＥＴの濃度は、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の有無および量の指標として、ひいてはｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴う癌に罹患しているか否かを高精度に判定するための指標として利用できると考えられる。

サンプルが由来する被験体は、特定の抗癌剤による治療が検討されている癌患者であってもよい。特定の抗癌剤としては、例えば、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、およびｃ−ＭＥＴ阻害剤以外の抗癌剤が挙げられる。ｃ−ＭＥＴ阻害剤としては、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＸＬ−８８０、ＸＬ−１８４、ＡＲＱ１９７、ＡＭＧ２０８、ＡＭＧ４５８、ＣＥ−３５５６２１、ＭＰ４７０が挙げられる。ｃ−ＭＥＴ阻害剤以外の抗癌剤としては、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤が挙げられる。ＥＧＦＲ阻害剤としては、例えば、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ＺＤ６４７４、ＣＬ−３８７７８５、ＨＫＩ−２７２、ＸＬ６４７、ＰＤ１５３０３５、ＣＩ−１０３３、ＡＥＥ７８８、ＢＩＢＷ−２９９２、ＥＫＢ−５６９、ＰＦ−２９９８０４が挙げられる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＴＡＥ６８４、ＰＦ−２３４１０６６が挙げられる。ＰＤＧＦＲ阻害剤としては、例えば、グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ヴァラチニブ（Ｖａｌａｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）が挙げられる。ｃ−ＫＩＴ阻害剤としては、例えば、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ヴァラチニブ（Ｖａｌａｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、マシチニブ（Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ）、モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）が挙げられる。本発明の方法は、例えば、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性である、またはｃ−ＭＥＴ阻害剤以外の抗癌剤に耐性である、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴う癌を保有する患者、およびｃ−ＭＥＴ阻害剤に耐性である、またはｃ−ＭＥＴ阻害剤以外の抗癌剤に感受性である、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴わない癌を保有する患者の選別に有用である。例えば、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメント（特定の可溶性ｃ−ＭＥＴ）の濃度を測定することにより、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴い得る、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性の癌を、特異的に判定できることを開示している国際公開第２０１１／１２５４５８号を参照のこと。

サンプルが由来する被験体は、特定の抗癌剤による治療効果がモニタリングされている癌患者であってもよい。癌患者はまた、特定の抗癌剤による治療効果の低下が認められた場合に、別の抗癌剤による治療に切り替えるかどうかの判断が求められている患者であってもよい。抗癌剤は、例えば、上述した抗癌剤と同様であり得る。

特定の実施形態では、本発明の方法は、以下を含むものであってもよい：
（１）サンプルをプロテアーゼで処理すること；および
（２）ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントを測定すること。

（１）において、サンプルは、上述した液体サンプルであることが好ましい。液体サンプルが、全長ｃ−ＭＥＴ発現細胞（換言すれば、膜結合型ｃ−ＭＥＴ）を含む可能性がある場合、上述したように、本発明の方法は、このような細胞を除去することを含んでいてもよい。

サンプルを上述したようなプロテアーゼで処理した場合、サンプル中に含まれ得る特定の可溶性ｃ−ＭＥＴに由来する、ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントが生じる。一方、異なる可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントおよび可溶性スプライシングバリアントをプロテアーゼで処理しても、ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントは生じない。したがって、ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する特定の可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントの測定により、サンプルにおける特定の可溶性ｃ−ＭＥＴの有無および量を評価することができ、ひいてはサンプルが由来する被験体におけるｃ−ＭＥＴ増幅細胞を定性的または定量的に検出することができる。

本発明はまた、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する親和性物質を提供する。ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域は、上述したとおりであるが、好ましくは、配列番号１０または１１のアミノ酸配列からなるペプチド領域である。親和性物質は、上述したとおりであるが、好ましくは抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。親和性物質は、必要に応じて、上述したような標識用物質で標識された形態で提供されてもよい。

本発明はさらに、上述したような親和性物質を含む、癌の診断用試薬を提供する。癌、および診断される被験体は、上述したとおりである。

本発明の試薬は、上述したような親和性物質に加えて、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。この場合、キットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供されてもよい。例えば、親和性物質が標識用物質で標識されていない場合、このようなキットは、標識用物質をさらに含んでいてもよい。このようなキットはまた、上記切断により生成される、ジペプチド単位ＶＩをＮ末端に有するｃ−ＭＥＴフラグメントに対する親和性物質を含んでいてもよい。このようなキットはさらに、ポジティブコントロールとして、上述したような特定の可溶性ｃ−ＭＥＴまたはその部分ペプチドを含んでいてもよい。

本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、上述したような親和性物質の種類に応じたさらなる構成要素を含んでいてもよい。例えば、親和性物質が抗体である場合、キットは、２次抗体（例、抗ＩｇＧ抗体）、２次抗体の検出試薬をさらに含んでいてもよい。

本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、液体サンプル等のサンプルを採取し得る器具をさらに含んでいてもよい。サンプルを採取し得る器具は、被験体からサンプルを入手可能である限り特に限定されないが、例えば、注射器等の採血器具が挙げられる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：ＡＤＡＭ１７による可溶性ｃ−ＭＥＴの分泌
ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３に対してネガティブコントロールｓｉ−ＲＮＡ（ｓｉ−Ｎ．Ｃ．）、ＡＤＡＭ１０遺伝子あるいはＡＤＡＭ１７遺伝子をターゲットとしたｓｉ−ＲＮＡ（ｓｉ−ＡＤ１０、ｓｉ−ＡＤ１７）をトランスフェクションした。トランスフェクション後２４時間の時点で無血清培地に交換し、２４時間インキュベートした後の培養上清を回収した。フィルターろ過した培養上清を限外ろ過膜により濃縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写した。可溶性ｃ−ＭＥＴの分泌に対するＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７ノックダウンの効果を、細胞外ドメイン（ＭＥＴ−α鎖）を認識する抗体によるウェスタンブロット法により確認した。
その結果、ｃ−ＭＥＴの分泌は、ＡＤＡＭ１０ノックダウンにより阻害されなかったのに対して、ＡＤＡＭ１７のノックダウンにより顕著に阻害された（図１）。したがって、ｃ−ＭＥＴの切断により生じる癌細胞に特異的な特定の可溶性ｃ−ＭＥＴは、主に、ＡＤＡＭ１７による切断作用を介して分泌されることが示された。

実施例２：可溶性ｃ−ＭＥＴの免疫沈降法による濃縮
サブコンフルエントとなったｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３を無血清培地中で７日間インキュベートした後、培養上清を回収した。フィルターろ過した培養上清を限外ろ過膜により濃縮した後、ｃ−ＭＥＴの細胞外領域を認識する抗体により免疫沈降した。免疫沈降複合体を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により展開し、バイオセーフティーＣＢＢ染色液により染色した。
その結果、培養上清と抗体を混合したサンプルにおいて、１５０ｋＤａの抗体由来バンドとは異なる、癌細胞に発現しているｃ−ＭＥＴの切断により生じる特定の可溶性ｃ−ＭＥＴ（ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメント）に対応すると考えられるバンドが検出された（図２）。

実施例３：ＬＣ−タンデム質量分析法による可溶性ｃ−ＭＥＴのＣ末端候補特定
可溶性ｃ−ＭＥＴ相当の移動度を示す染色部分をカッターで切断し、ゲル内トリプシンあるいはキモトリプシン消化を行った。消化物をＬＣ−タンデムマス装置（ＴｈｅｒｍｏＬＴＱＸＬ）により分析し、可溶性ｃ−ＭＥＴの仮想配列からなるポリペプチドのデータセットをレファレンス配列として利用することにより、ＳＥＱＵＥＳＴ解析を行った。
その結果、トリプシン消化物から９２１Ｇ及び９２２ＫをＣ末端に有するペプチド断片が検出され、Ｌｙｓ−Ｃ消化物から９２２ＫをＣ末端に有するペプチド断片が検出された（図３）。キモトリプシン消化物から９２２ＫをＣ末端に有するペプチド断片が検出された。トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ及びキモトリプシンの配列認識特性から、９２１Ｇはトリプシンの誤消化によるものあるいは質量分析計による誤認識である可能性が高いと考えられた。したがって、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞により分泌される特定の可溶性ｃ−ＭＥＴのＣ末端のアミノ酸残基が９２２Ｋであること、ならびに、このような特定の可溶性ｃ−ＭＥＴは、細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成することが示された。

実施例４：Ｃ末端候補ペプチドのタンデムマススペクトル
可溶性ｃ−ＭＥＴサンプルより検出された全てのタンデムマススペクトルデータから、予想されるプレカーサーイオン及びプロダクトイオンのｍ／ｚ値情報を基に、トリプシン消化物あるいはキモトリプシン消化物に含まれるＣ末端ペプチド断片由来タンデムマススペクトルを特定した。それぞれのスペクトルに対して予想されるｍ／ｚ値を持つプロダクトイオンを帰属したところ、消化物は、トリプシン消化断片ＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１０）及びキモトリプシン消化断片ＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１１）を含有することが判明した。
したがって、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞において、可溶性ｃ−ＭＥＴは、細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成することが示された。

本発明の方法は、癌の検査などに有用である。

Claims

ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域を利用して、サンプルにおいて該可溶性ｃ−ＭＥＴを測定することを含む、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞の検出方法。
癌の検査方法である。請求項１記載の方法。
サンプルがヒトに由来する、請求項１または２記載の方法。
サンプルが液体サンプルである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅細胞が肺癌細胞である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
以下（１）および（２）を含む方法である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法：
（１）サンプルをプロテアーゼで処理すること；および
（２）ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントを測定すること。
前記可溶性ｃ−ＭＥＴの測定が、ジペプチド単位ＧＫをＣ末端に有する可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントを質量分析により検出することにより行われる、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
前記可溶性ｃ−ＭＥＴフラグメントが、ＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１０）またはＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫ（配列番号１１）のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項６または７記載の方法。
ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する親和性物質。
親和性物質が抗体である、請求項９記載の親和性物質。
ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメイン中の部分領域ＧＫＶＩ（配列番号２）におけるリジン残基（Ｋ）とバリン残基（Ｖ）との間の切断により生成する可溶性ｃ−ＭＥＴに特異的な領域に対する親和性物質を含む、癌の診断用試薬。