WO2021137500A1 - 소포체 내 글루타치온 측정용 실시간 형광 이미징 센서 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents
소포체 내 글루타치온 측정용 실시간 형광 이미징 센서 및 이를 이용하는 방법 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a real-time fluorescence imaging sensor for measuring glutathione in the endoplasmic reticulum (ER) and a method using the same. More specifically, the present invention relates to a novel compound for measuring glutathione in the endoplasmic reticulum (ER) and a method for measuring glutathione in the endoplasmic reticulum (ER) using the novel compound.
- the body maintains homeostasis by properly removing reactive oxygen species through the action of the antioxidant system, but when the balance between ROS generation and the action of the antioxidant system is disrupted, oxidative stress increases, which leads to aging, degenerative arthritis, and cataracts.
- aging-related degenerative diseases such as Alzheimer's, various cancers, fibrotic diseases, and recently, it is attracting attention as an important common causative factor in the onset of metabolic syndrome such as diabetes, obesity, and cardiovascular disease.
- the ROS is unstable and highly reactive, so it oxidizes biomolecules to cause biochemical and physiological damage, which is one of the main mechanisms of aging. Therefore, not only the degree of oxidation of the human body, but also the degree of antioxidant or antioxidant ability can be a major biomarker for measuring the age of the body.
- mesenchymal stem cells are stem cells having multipotent properties derived from various adult cells, such as bone marrow, umbilical cord blood, placenta (or placental tissue cells), fat (or adipose tissue cells).
- mesenchymal stem cells derived from bone marrow are undergoing various studies for development as a cell therapy agent due to their multipotency that can be differentiated into adipose tissue, bone/cartilage tissue, and muscle tissue.
- stem cells which are the main component of cell therapy, lose pluripotency and tissue regeneration ability and are prone to aging during the culturing process after isolation, and during several passages to obtain a large amount of cells corresponding to a therapeutically effective amount, this risk gets bigger
- the stem cells obtained from the tissue are very small, and when using them, a large amount of cells is required, so culture to proliferate the number of stem cells is performed.
- a method of measuring the antioxidant activity of stem cells in relation to the quality of stem cells and managing the quality accordingly, a method of measuring the antioxidant activity in cells has been disclosed.
- the present inventors use a novel ER-FT (Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer) according to the present invention, according to the amount of thiol in the endoplasmic reticulum (ER), the fluorescence intensity is continuous, ratiometric, and reversible
- ER-FT Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer
- the present invention was completed by confirming that it can be usefully used as a biosensor with remarkable sensitivity to quantitatively or qualitatively detect the amount of thiol in the endoplasmic reticulum (ER) in living cells in real time. .
- an object of the present invention is to provide an Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer (ER-FT) represented by Chemical Formulas IV to VII.
- ER-FT Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer
- Another object of the present invention is to provide a composition for detecting thiol of the endoplasmic reticulum (ER) containing ER-FT (Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer).
- ER endoplasmic reticulum
- Another object of the present invention is to provide a method for screening a thiol-increasing agent or inhibitor of the endoplasmic reticulum (ER) in living cells using ER-FT.
- ratiometric means that the output is directly proportional to the input. Specifically, in one embodiment of the present invention, “ratiometric” means that the fluorescence intensity of the composition of the present invention is increased or decreased in direct proportion according to the amount of thiol added.
- detection refers to measuring the presence or absence or amount of a chemical species or biological material in a sample.
- the term “reversible” refers to a state in which a mixture of reactants and products in a chemical reaction is capable of producing an equilibrium mixture. More specifically, in the present specification, the reaction between the compound represented by Formula I and the thiol is in an equilibrium state, which means that the reaction can proceed reversibly by a forward reaction or a reverse reaction depending on the amount of thiol.
- thiol refers to an organic compound including a sulfhydryl group bonded to carbon, and a sulfhydryl group or a thiol group is used interchangeably.
- cell refers to a structural or functional unit constituting an organism, and for the purpose of the present invention, it may include, without limitation, cells undergoing cellular senescence.
- the term "senescence of cells” refers to the deterioration of the trait and function of cells, and includes a series of processes until cell death or proliferation arrest following it. The trait and function degradation may be irreversible.
- senescence of cells is not limited thereto, but compared to standard cells or standard individuals, a decrease in proliferative capacity, loss of pluripotency and tissue regeneration ability, lipofuscin accumulation, increase in ⁇ -galactosidase activity, mitochondrial activity may refer to a process involving or causing an increase in oxygen, or a combination thereof. Aging of a cell or individual may further include a process that includes or causes a decrease in autophagy activity or a decrease in mitochondrial membrane potential.
- a young cell or individual may represent an increase in proliferative capacity, a decrease in lipofuscin accumulation, a decrease in ⁇ -galactosidase activity, or a combination thereof as compared to a standard cell or individual.
- senescent cells have a division time of 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 9 times or more, A cell can be said to be a senescent cell when it is increased by more than 10 times, more than 50 times, or more than 100 times.
- the cellular senescence can be induced early when actively dividing cells both in vitro and in vivo through the application of endogenous and exogenous stimuli that induce proliferative stress and/or DNA damage.
- stimuli include aberrant expression and/or activation of oncogenes, direct DNA damage due to exposure to ionizing radiation, free radicals, chemotherapeutic drugs, and increased passage numbers due to cell passage. Consequently, cellular senescence can positively influence cellular stress responses, cancer development and treatment outcomes, and stem cell treatment outcomes.
- cellular senescence may refer to quantitatively or qualitatively measuring the degree of cellular senescence.
- antioxidant capacity is the ability of an antioxidant to prevent oxidation, which can be measured simply by placing the fat in a closed container with oxygen and measuring the oxygen consumption rate.
- antioxidant capacity is the ability of an antioxidant to prevent oxidation, which can be measured simply by placing the fat in a closed container with oxygen and measuring the oxygen consumption rate.
- the measurement of antioxidant capacity of antioxidants in the biochemistry of organisms is becoming important.
- antioxidant refers to a substance that prevents oxidation and is called an antioxidant or antioxidant.
- antioxidant means inhibition of oxidation. It is a concept that appears mainly when explaining the aging process of cells and their prevention.
- Cellular aging means oxidation of cells. Oxygen that enters the body through respiration has beneficial effects on the body, but active oxygen is produced in this process. Excessive free radicals cause the oxygen to be exposed to an unstable state, which adversely affects the animal's body. Therefore, proper maintenance of free radicals may prevent cellular oxidation and cellular aging, but is not limited thereto.
- the antioxidant of the present invention includes carotenoids (beta-carotene, lycopene, lutein), flavonoids (anthocyanin, catechin, resveratrol, proanthocyanidin), isoflavones (genistein, daidzein), vitamins, minerals, Substances outside and inside cells such as glutathione, coenzyme Q-10, catalase, superoxide dismutase, glutathione-dependent peroxidase and peroxiredoxin may be included, but is not limited thereto.
- oxidative stress refers to the destruction of the balance between the oxidizing substances generated in the living body (or cells) and the corresponding antioxidants, and as the oxidation rate (active oxygen ratio) increases, the living body (or cells) It refers to stress that occurs while the antioxidant capacity is lowered, and the terms “oxidative damage” to “oxidation degree” are generically used to refer to various damage (gene damage, cellular metabolic abnormality, etc.) in a living body or cell caused by such oxidative stress. It may be used for, but is not limited thereto.
- oxidative damage material or oxidative damage inducer
- oxidative stress material or oxidative stress inducer
- the present invention can measure the presence or absence of a substance to be detected or an oxidative damage substance causing oxidative stress by measuring oxidative stress, and the concentration thereof.
- the present invention provides a composition for detecting thiol in the endoplasmic reticulum (ER) comprising a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof:
- m is an integer of 1-6, and n, p, and q are each independently an integer of 1-4;
- R 4 is a substituent represented by the following formula (II);
- R 5 is a substituent represented by the following formula (III):
- the present inventors made intensive research efforts to develop a biosensor with remarkable sensitivity for quantitatively or qualitatively detecting the amount of thiol in the intracellular endoplasmic reticulum (ER) in real time.
- the fluorescence intensity of the ER-FT (Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer) of the present invention represented by the above formula (I) is continuous and ratiometric according to the amount of thiol in the intracellular endoplasmic reticulum (ER).
- the fluorescence intensity of the emission wavelength may be increased or decreased in the range of 430 nm to 680 nm.
- Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer (ER-FresH, ER-FT) is a coumarin derivative having a cyanoacrylamide electrophile and is represented by Formula I It means a compound, and is used as a fluorescent substance for thiol detection in the endoplasmic reticulum (ER) in the present invention.
- the endoplasmic reticulum (ER) of the present invention is contained in living cells.
- the composition of the present invention is not limited to the endoplasmic reticulum (ER) isolated from the cell, and has a feature that can measure the thiol level in the endoplasmic reticulum (ER) in a state contained within the cell have.
- R 1 of the present invention is a 6-membered ring heterocycloalkyl including one or two N, and the heterocycloalkyl is R 2 A substituent is bonded thereto, and R 2 is substituted or unsubstituted It is a substituted amide group.
- the term “6-membered ring” included in “6-membered heterocycloalkyl” refers to a monocyclic compound that is not in the form of a cyclic compound in which a plurality of rings are fused, such as a bicyclic compound or a spiro compound.
- heterocycloalkyl is a non-aromatic cyclic alkyl wherein at least one of the carbon atoms contained in the ring is replaced by a heteroatom such as nitrogen, oxygen or sulfur. means to be replaced.
- R 1 is a 6-membered ring heterocycloalkyl including 1 or 2 nitrogens as heteroatoms included in the ring.
- the compound represented by the formula (I) is any one or more of the compounds represented by the following formulas IV to VII:
- the compound represented by Formula I of the present invention increases the amount of thiol binding to ER-FT as the amount of thiol in the endoplasmic reticulum (ER) in living cells increases.
- the compound represented by Formula I preferably the compound represented by Formula IV to VII, exhibits a maximum emission wavelength at 550 to 680 nm in a free state and 430 to 550 in a thiol-bound state. It may be a compound represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which exhibits a maximum emission wavelength in nm.
- the compound represented by Formula I preferably the compound represented by Formula IV to VII, has a maximum emission wavelength at 550 to 650, 550 to 620, 550 to 600, 570 to 590 or 580 nm in the free state. indicates
- the compound represented by Formula I preferably the compound represented by Formula IV to VII, is 450 to 550, 470 to 550, 470 to 530, 490 to 530, 500 to 520 in a thiol-bonded state. Alternatively, it exhibits a maximum emission wavelength at 510 nm.
- the fluorescence intensity of the emission wavelength may be increased or decreased in the range of 430 nm to 680 nm, the compound represented by Formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
- the compound represented by Formula I of the present invention may be a composition for measuring antioxidant activity in living cells comprising a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient. have.
- the measurement of the antioxidant activity may be a measurement of a thiol level in living cells
- the measurement of the thiol level may be a measurement of a thiol level in an organelle of a living cell
- the organelle may be the endoplasmic reticulum (ER).
- the measurement of the thiol level in the present invention is that as the thiol increases, the fluorescence intensity of 550 to 680 nm shown by the free compound decreases, and the fluorescence intensity at 430 to 550 nm shown by the compound to which the thiol is bound increases.
- the fluorescence intensity can be increased or decreased ratiometrically and reversibly.
- the thiol level measurement is carried out by obtaining a ratio (ratio) of the fluorescence intensity at 430 to 550 nm and the fluorescence intensity at 550 to 680 nm, and the ratio is at 430 to 550 nm. It may be a relationship between the fluorescence intensity and the fluorescence intensity at 550 to 680 nm.
- the relationship is a mathematical ratio relationship between the fluorescence intensity at 430 to 550 nm and the fluorescence intensity at 550 to 680 nm, and the mathematical ratio relationship is proportional to the amount of thiol in the endoplasmic reticulum (ER). may be reversibly increased or decreased to indicate the amount of thiol in the organelle in the cell in real time.
- the measurement of the thiol level may be a qualitative or quantitative detection of thiol in the endoplasmic reticulum (ER), and the measurement of the thiol level may be a real-time quantitative measurement.
- ER endoplasmic reticulum
- the measurement of the thiol level may indicate the degree of oxidative stress or oxidation of the cell, and the measurement of the thiol level may indicate the degree of senescence of the cell.
- the thiol may be glutathione (GSH), homocysteine (Hcy), cysteine (cysteine, Cys), or a thiol in a cysteine residue of a protein.
- the antioxidant capacity of the endoplasmic reticulum (ER), an intracellular organelle of all cells, including stem cells, can be measured to accurately measure the cellular activity related to the antioxidant activity, and cells with high activity classification is possible.
- Measurement of cell activity using the composition of the present invention includes, but is not limited to, measurement of antioxidant capacity.
- the compound represented by Formula I preferably the compound represented by Formula IV to VII; racemates, optical isomers, diastereomers, mixtures of optical isomers, or mixtures of diastereomers thereof; It is possible to provide a composition for measuring the antioxidant capacity of intracellular organelles comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
- the compound represented by the formula (I), preferably a composition comprising the compound represented by the formulas (IV) to (VII) as an active ingredient, and a candidate substance are correlated at the same time or in order sequentially administering to living cells without; (b) obtaining a ratio of fluorescence intensity at 430 to 550 nm and fluorescence intensity at 550 to 680 nm and comparing it with standard data; (c) determining the test substance as a thiol increasing agent or inhibitor: and (d) determining as a thiol inhibitor when the ratio of the fluorescence intensity at 430 to 550 nm to the fluorescence intensity at 550 to 680 nm decreases, , it may be a thiol increasing agent or inhibitor screening method in living cells comprising the step of determining as a thiol increasing agent when the ratio of fluorescence intensity increases.
- the ratio (510/580 ratio) of the fluorescence intensity at 510 nm to the fluorescence intensity at 580 nm decreases, it is determined as a thiol inhibitor, and the fluorescence intensity at 510 nm is 580
- the ratio (510/580 ratio) to the fluorescence intensity at nm increases, it may be determined by the thiol increasing agent.
- the measurement of the fluorescence ratio may be measured with respect to the endoplasmic reticulum (ER).
- oxidative stress-induced disease refers to a disease caused by oxidative stress, and is used in the same sense as “reactive oxygen species (ROS)-related disease”.
- ROS reactive oxygen species
- the oxidative stress-induced disease is aging, degenerative arthritis, cataract, Alzheimer's disease, cancer, fibrotic disease, diabetes, obesity, ischemia, ischemic reperfusion injury, inflammation, systemic lupus erythematosus, myocardial infarction, thrombotic stroke, hemorrhagic stroke, Bleeding, spinal cord trauma, Down syndrome, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, uveitis, emphysema, gastric ulcer, oxygen intoxication, tumor or radiation, but is not limited thereto.
- kit refers to a tool capable of evaluating the expression level of thiol by labeling the detectable compound of the present invention that specifically binds to thiol with a label. It includes not only direct labeling of a detectable substance by reaction with a substrate, but also indirect labeling in which a color-generating label is conjugated by reactivity with another directly labeled reagent. It may include a chromogenic substrate solution, a washing solution, and other solutions to undergo a color reaction with the label, and may be prepared including reagent components used.
- the kit of the present invention is not limited thereto, as long as it is known in the art.
- the kit of the present invention may further include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method, and labels such as fluorescein and dye may be used, but the present invention is limited thereto. it's not going to be
- step (a) may be to measure the ratio (510/580 ratio) of the fluorescence intensity at 510 nm to the fluorescence intensity at 580 nm in real time.
- the ratio value of the fluorescence intensity recovers to the fluorescence intensity ratio value of live cells not administered with the oxidizing agent or the fluorescence intensity ratio value before administration of the oxidizing agent. Further comprising the step of measuring, it may be determined that the shorter the time, the higher the antioxidant activity.
- the oxidizing agent is administered from the oxidizing agent administration point of the difference between the fluorescence intensity ratio value of the live cells to which the oxidizing agent is not administered and the fluorescence intensity ratio value of the live cells to which the oxidizing agent is administered
- the method may further include the step of measuring an integral value up to the time point of recovery to the value of the fluorescence intensity ratio before the following, and it may be determined that the antioxidant activity is higher as the integral value is smaller.
- the method for measuring the antioxidant capacity further comprises titrating the minimum concentration of the oxidizing agent at which the fluorescence intensity ratio value of the live cells to which the oxidizing agent is administered after the step (d) starts to decrease, and the minimum concentration is high. It may be judged that the higher the antioxidant capacity, the higher.
- the measuring method may be measuring the endoplasmic reticulum (ER), which is an organelle in living cells.
- ER endoplasmic reticulum
- the antioxidant ability of living cells particularly the endoplasmic reticulum (ER), an organelle in stem cells, can be measured, and the high activity of the endoplasmic reticulum (ER) is determined by the measurement result.
- stem cells can be selected.
- Figure 2 shows the structure of ER-FT represented by the formula (V).
- FIG. 5 is a confocal microscope photograph of ER-FT represented by Formulas IV to VII observed in UC-MSC cell endoplasmic reticulum.
- FIG. 11 is a confocal microscope of what was observed in UC-MSC cell endoplasmic reticulum by adding Diamide after ER-FT treatment represented by Chemical Formula V.
- FIG. 11 is a confocal microscope of what was observed in UC-MSC cell endoplasmic reticulum by adding Diamide after ER-FT treatment represented by Chemical Formula V.
- FIG. 12 is a confocal microscope of what was observed in UC-MSC cell endoplasmic reticulum by adding Diamide and DTT after ER-FT treatment represented by Formula V.
- FIG. 12 is a confocal microscope of what was observed in UC-MSC cell endoplasmic reticulum by adding Diamide and DTT after ER-FT treatment represented by Formula V.
- An object of the present invention is to provide an Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer (ER-FT) represented by Formulas IV to VII.
- ER-FT Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer
- the preparation method of the compound (ER-FT) used to measure the antioxidant capacity of the endoplasmic reticulum (ER), which is the endoplasmic reticulum (ER), is as follows.
- Palladium on activated carbon (Pd-C; 10 wt%, 45 mg) was added to a solution of Compound 1 (0.45 g, 1.1 mmol) in 10 mL of MeOH, followed by stirring under H 2 gas (1 atm) for 15 hours.
- the filtrate obtained by passing the mixture through a celite layer was distilled under reduced pressure to remove the solvent.
- Pd-C (10 wt%, 53 mg) was added to a solution of compound 7 (0.53 g, 1.3 mmol) in 10 mL of MeOH, followed by stirring under H 2 gas (1 atm) for 2 hours.
- the filtrate obtained by passing the mixture through a celite layer was distilled under reduced pressure to remove the solvent.
- Part of the solid obtained by vacuum drying (0.10 g, 0.37 mmol) and DIEA (0.13 mL, 2.0 equiv.) were dissolved in CH 2 Cl 2 3 mL in 3 mL of pentafluorobenzoyl chloride (52 ⁇ L, 1.0 equiv) was added. After stirring for 2 hours.
- the mixture is diluted with CH 2 Cl 2 and washed with NaHCO 3 aqueous solution and NaCl saturated aqueous solution. After separating the organic layer, Na 2 SO 4 was added and dried, and the solution obtained by filtration was distilled under reduced pressure to remove the solvent. The remaining mixture is purified by SiO 2 column chromatography to obtain compound 8 (0.12 g, 73%).
- N-(tert-butoxycarbonyl)-4,7,10 to trioxa-1,13-tridecanediamine (0.10 g, 0.31 mmol) and DIEA (0.1 mL, 2.0 equiv) in CH 2 Cl 2 3 mL of pentafluorobenzoyl chloride (44 ⁇ L, 1.0 equiv) was added and stirred for 2 hours.
- the mixture is diluted with CH 2 Cl 2 and washed with NaHCO 3 aqueous solution and NaCl saturated aqueous solution. After separating the organic layer, Na 2 SO 4 was added and dried, and the solution obtained by filtration was distilled under reduced pressure to remove the solvent. The remaining mixture is purified by SiO 2 column chromatography to obtain compound 10 (0.15 g, 94%).
- 5 is a confocal microscope of ER-FT represented by Formulas IV to VII observed in the UC-MSC endoplasmic reticulum.
- UC-MSC cells (4 x 10 3 cells/well) were cultured in a 96 well dish for 24 hours.
- 2ml of ER-FT-derived compounds (Formulas IV to VII) at concentrations of 5, 10, 20, and 40 ⁇ M were prepared and treated, and then cultured at 37° C. for 24 hours.
- 3 ⁇ l of 10X EZ-cytox was added to each well and incubated for 3 hours.
- Absorbance was measured at 450 nm using a plate reader (reference wavelength 600-650 nm).
- FIG. 11 is a confocal microscope of what was observed in UC-MSC cell endoplasmic reticulum by adding diamide after ER-FT treatment represented by Chemical Formula V.
- FIG. 11 is a confocal microscope of what was observed in UC-MSC cell endoplasmic reticulum by adding diamide after ER-FT treatment represented by Chemical Formula V.
- FIG. 12 is a confocal microscope of what was observed in UC-MSC cell endoplasmic reticulum by adding Diamide and DTT after ER-FT treatment represented by Formula V.
- FIG. 12 is a confocal microscope of what was observed in UC-MSC cell endoplasmic reticulum by adding Diamide and DTT after ER-FT treatment represented by Formula V.
- Figure 15 is taken with a confocal microscope what was observed in the UC-MSC endoplasmic reticulum by adding diamide after ER-FT treatment represented by Formula VII.
- the compound or composition according to the present invention it is possible to measure the antioxidant capacity of the endoplasmic reticulum (ER) and the Golgi organ, which are organelles in living cells. By applying this to stem cells, it is possible to increase the efficiency of cell therapeutics by selecting highly active stem cells according to the measurement result of antioxidant activity in the stem cells.
- ER endoplasmic reticulum
- Golgi organ which are organelles in living cells.
- the present invention relates to a real-time fluorescence imaging sensor for measuring glutathione in the endoplasmic reticulum (ER) and a method using the same. More specifically, the present invention relates to a novel compound for measuring glutathione in the endoplasmic reticulum (ER) and a method for measuring glutathione in the endoplasmic reticulum (ER) using the novel compound.
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Abstract
본 발명은 소포체(ER) 내 글루타치온 측정용 실시간 형광 이미징 센서 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 소포체(ER) 내 글루타치온 측정용 측정용 신규 화합물, 신규 화합물의 제조 방법, 상기 신규 화합물을 포함하는 소포체(ER) 내 글루타치온 측정용 실시간 이미징 센서, 이의 제조 방법 및 상기 이미징 센서를 이용한 소포체(ER) 내 글루타치온 측정 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 소포체(ER) 내 글루타치온 측정용 실시간 형광 이미징 센서 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 소포체(ER) 내 글루타치온 측정용 신규 화합물 및 상기 신규 화합물을 이용한 소포체(ER) 내 글루타치온 측정 방법에 관한 것이다.
인체는 항산화계의 작용을 통해 활성 산소종을 적절히 제거하여 항상성을 유지하나, ROS 생성과 항산화계 작용 사이의 균형이 깨지면 산화적 스트레스(oxidative stress)가 증가하고, 이는 노화를 비롯하여 퇴행성 관절염, 백내장, 알쯔하이머 등의 노화 관련 퇴행성 질환, 각종 암, 섬유화 질환을 비롯하여 최근에는 당뇨병, 비만, 심혈관 질환 등의 대사성 증후군의 발병에 중요한 공통 원인 인자로 주목받고 있다. 상기 ROS는 불안정하고 반응성이 높아 생체 분자를 산화시켜 생화학적, 생리적 손상을 유발시키고 이는 노화의 주요 기전 중 하나이다. 따라서 인체의 산화도뿐 아니라 항산화도나 항산화 능력은 생체 나이 계측에 주요한 바이오 마커가 될 수 있다.
한편, 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)는 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래하는 다분화성의 성질을 갖는 줄기 세포이다. 예를 들어, 골수(bone marrow)로부터 유래된 중간엽 줄기 세포는 지방조직, 뼈/연골 조직, 근육조직으로 분화될 수 있는 다분화성에 의해 세포치료제로서의 개발을 위해 다양한 연구가 진행되고 있다.
하지만, 세포 치료제의 주요 성분인 줄기세포는 분리 후 배양 과정에서 다분화능, 조직 재생능을 상실하고 노화되기 쉬우며, 치료적 유효량에 해당하는 대량의 세포를 수득하기 위해 여러 계대를 거치는 동안 이러한 위험성은 더욱 커진다. 또한, 조직으로부터 얻어지는 줄기세포는 매우 적은 양이고, 이를 이용 시에는 대량의 세포가 필요하므로 줄기세포의 수를 증식시키는 배양이 수행된다. 최근에는, 줄기세포의 품질과 관련하여 줄기세포의 항산화 활성을 측정하여 이에 따라 품질을 관리하는 방법으로서, 세포 내 항산화 활성을 측정하는 방법이 개시되고 있다.
하지만, 줄기세포의 항산화 활성 측정을 통해 높은 활성을 갖춘 고품질의 줄기세포 선별 방법에 대한 연구는 부족한 실정이다. 따라서, 희소가치가 높은 세포 치료제 자원인 줄기세포의 사용 효율성을 높이기 위해, 고활성의 줄기세포 선별에 필요한 항산화능 측정용 조성물의 개발이 필요한 실정이다.
또한, 상기와 같이 줄기세포를 포함하는 세포의 항산화능 측정에 있어서 생체 시료에서 티올을 함유하는 물질의 검출 및 식별은 매우 중요하다. 이에 따라, 세포를 파쇄하지 않고 생세포(living cell)에서의 티올을 효과적으로 검출하는 형광 방법들이 개발되고 있으나, 소포체 내 다양한 소스의 티올 측정에 의한 항산화능 측정 물질이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 신규한 ER-FT(Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer)를 사용하여 소포체(Endoplasmic Reticulum; ER) 내의 티올의 양에 따라 형광세기가 연속적이고 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명하고, 살아있는 세포 내 소포체(ER)에서의 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 ER-FT(Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer)를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 ER-FT(Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer)를 포함하는 소포체(ER)의 티올 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 ER-FT를 이용한 생세포 내 소포체(ER)의 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 명세서 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에서, 용어 "비율계량적(ratiometric)"은 산출량이 투입량(input)에 직접적으로 비례하는 것을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 일 구현예에서, "비율계량적"은 본 발명의 조성물이 티올 투입량에 따라 직접적으로 비례해서 형광세기가 증가 또는 감소하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "검출"은 시료 속에서 화학종이나 생물학적 물질의 존재 유무나 그 양을 측정하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "가역적(reversible)"은 화학반응에서 반응물과 생성물의 혼합물이 평형상태의 혼합물을 생성하는 것이 가능한 상태를 의미한다. 보다 구체적으로는, 본 명세서에서 화학식 I로 표시되는 화합물과 티올의 반응이 평형상태를 이루어, 티올의 양에 따라 정반응 또는 역반응하여 가역적으로 반응이 진행될 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "티올(thiol)"은 탄소와 결합된 설프히드릴기를 포함하는 유기 화합물을 의미하고, 설프히드릴기 또는 티올기는 혼용되어 사용된다.
본 발명에서 용어, "세포"는 생물체를 구성하는 구조적 또는 기능적 단위를 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 세포 노화가 진행되는 세포를 제한없이 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어, "세포의 노화"는 세포의 형질 및 기능 퇴화를 의미하고, 그것에 이어지는 세포사 또는 증식 정지가 일어날 때까지의 일련의 과정을 포함한다. 상기 형질 및 기능 퇴화는 비가역적인 것일 수 있다. 또한, 세포의 노화는 이에 한정하지는 않지만, 표준 세포 또는 표준 개체에 비하여 세포의 증식능의 감소, 다분화능 및 조직 재생능 상실, 리포푸신(lipofuscin) 축적, β-갈락토시다제 활성 증가, 미토콘드리아 활성 산소 증가, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 그를 야기하는 과정을 나타낼 수 있다. 세포 또는 개체의 노화는 자식작용(autophagy) 활성 감소 또는 미토콘드리아 막 전위 감소를 포함하거나, 이들을 야기하는 과정을 더 포함할 수 있다. 젊은(young) 세포 또는 개체는 표준 세포 또는 개체에 비하여 세포의 증식능의 증가, 리포푸신 축적 감소, β-갈락토시다제 활성 감소, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 노화 세포는 계대수 2의 분열 시간(doubling time)에 비해 분열 시간이 2 배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상 증가한 경우 그 세포는 노화 세포라고 할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포 노화는 증식성 스트레스 및/또는 DNA 손상을 유발하는 내인성 및 외인성 자극의 적용을 통해 시험 관내 및 생체 내 모두에서 세포를 능동적으로 분열시키는 경우 조기에 유도 될 수 있다. 이러한 자극에는 발암 유전자의 비정상적 발현 및/또는 활성화, 이온화 방사선 노출로 인한 직접적인 DNA 손상, 활성 산소, 화학 요법 약물 및 세포 계대배양으로 인한 계대수의 증가가 포함된다. 결과적으로, 세포 노화는 세포 스트레스 반응, 암 발생 및 치료 결과 및 줄기세포 치료 결과에 적극적인 영향을 미칠 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "세포의 노화도"는 세포의 노화의 정도를 정량적 또는 정성적으로 측정한 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "항산화능"이란 항산화제가 산화를 방지하는 능력으로, 지방을 산소가 있는 밀폐 된 용기에 넣고 산소 소비율을 측정함으로써 간단히 측정 할 수 있다. 그러나, 유기체의 생화학에서 항산화제의 항산화능 측정이 중요해지고 있다.
본 명세서에서, 상기 "항산화제"란 항산화물질 또는 산화방지제 등으로 불리우며 산화를 방지하는 물질을 두루 가리키는 말이다. 여기서 항산화는 산화의 억제를 뜻한다. 세포의 노화과정과 그에 대한 예방을 설명할 때 주로 등장하는 개념으로 세포의 노화는 곧 세포의 산화를 의미한다. 호흡하여 몸에 들어온 산소는 몸에 이로운 작용을 하지만 이 과정에서 활성산소가 만들어진다. 지나친 활성산소가 산소를 불안정한 상태에 노출시키는 것을 야기하는데 이는 동물의 몸에 나쁜 영향을 준다. 따라서, 활성산소를 적절히 유지하는 것이 세포의 산화, 세포의 노화를 막는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 항산화제로는 카로테노이드류(베타카로틴, 라이코펜, 루테인), 플라보노이드류(안토시아닌, 카테킨, 레스베라트롤, 프로안토시아니딘), 이소플라본류(제니스테인, 다이드제인), 비타민류, 미네랄, 글루타치온, 코엔자임Q-10, 카탈라아제(catalase), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 글루타치온-의존성 페록시다제(glutathione-dependent peroxidase) 및 퍼옥시리독신(peroxiredoxin) 등과 같은 세포 외부 및 내부의 물질들일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서, 용어 "산화적 스트레스"란 생체 (또는 세포) 내에서 발생하는 산화물질과 이에 대응하는 항산화제 사이의 균형이 파괴되어 산화 비율 (활성 산소 비율)이 증가함에 따라 생체 (또는 세포) 내 항산화력이 저하되면서 발생하는 스트레스를 의미하고, 용어 "산화적 손상" 내지 "산화도"는 이러한 산화적 스트레스에 의하여 유발되는 생체 또는 세포 내의 각종 손상 (유전자 손상, 세포 대사 이상 등)을 총칭 하기 위하여 사용되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 특별한 언급이 없는 한, 산화적 손상 물질(또는 산화적 손상 유발 물질)과 산화적 스트레스 물질(또는 산화적 스트레스 유발 물질)은 동등한 의미로 사용된다.
본 발명은 산화적 스트레스를 측정하여 산화적 스트레스를 유발하는 피검출 물질 또는 산화적 손상 물질의 존재여부, 및 그 농도를 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 소포체(ER)에서의 티올 검출용 조성물을 제공한다:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서 R1은 하나 이상의 N을 포함하는 3-7원 고리인 헤테로사이클로알킬이고, 상기 헤테로사이클로알킬은 R2 치환기가 결합되어 있으며; 상기 R2는 아마이드기이고; 상기 R2는 -(C(=O)NH)-R3이며; 상기 R3는 -(CH2)m-R4, -(CH2)m-R5, -(CH2)n-(CH20CH2)p-(CH2)q-R4 또는 -(CH2)n-(CH20CH2)p-(CH2)q-R5일 수 있다. 여기서, 상기 m은 1-6의 정수이고, 상기 n, p 및 q는 각각 독립적으로 1-4의 정수이며; 상기 R4는 다음 화학식 Ⅱ로 표시되는 치환기이고; 상기 R5는 다음 화학식 Ⅲ로 표시되는 치환기이다:
[화학식 Ⅱ]
[화학식 Ⅲ]
본 발명자들은 세포 내 소포체(ER)에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 I로 표시되는 본 발명의 ER-FT(Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer)가 세포 내 소포체(ER)에서의 티올의 양에 따라 형광세기가 연속적이고 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명하고, 세포 내 소포체(ER)에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다는 것을 입증하였다.
본 발명에서 상기 방출파장의 형광세기는 430 nm 내지 680 nm의 범위에서 증감할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer (ER-FresH, ER-FT)"는 시아노아크릴아마이드 친전자체(cyanoacrylamide electrophile)를 갖는 쿠마린(coumarin) 유도체로서 화학식 I로 표시되는 화합물을 의미하고, 본 발명에서의 소포체(ER) 내 티올 검출용 형광물질로서 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 소포체(ER)는 생세포(living cell) 내에 포함된 것이다. 본 발명의 조성물은 소포체(ER) 내 티올 수준을 측정하는데 있어서, 세포로부터 분리된 소포체(ER)에 국한되지 않고, 세포 내에 포함된 상태의 소포체(ER) 내 티올 수준을 측정할 수 있는 특징이 있다. 특히 살아있는 세포 내 소포체(ER)에서의 티올 수준을 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 R1은 1 또는 2개의 N을 포함하는 6원고리 헤테로사이클로알킬이고, 상기 헤테로사이클로알킬은 R2 치환기가 결합되어 있으며 상기 R2는 치환 또는 비치환된 아마이드기이다. 본 발명에서 "6원고리 헤테로사이클로알킬"에 포함된 용어 "6원고리"는 바이사이클릭 화합물(bicyclic compound) 또는 스피로 화합물(Spiro compound)과 같이 복수개의 고리가 접합된 고리화합물 형태가 아닌 모노사이클릭 화합물로서의 하나의 6각고리 형태를 의미하고, "헤테로사이클로알킬"은 비-방향족성 고리형 알킬로서, 고리 내에 포함된 탄소 원자 중 적어도 하나가 헤테로원자, 예컨대 질소, 산소 또는 황에 의해 치환되어 있는 것을 의미한다. 본 구현예에서, R1은 6원고리 헤테로사이클로알킬로서 1개 또는 2개의 질소를 고리 내에 포함된 헤테로원자로서 포함한다.
본 발명에서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 다음 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상이다:
[화학식 Ⅳ(ER-FresH A, MSH3-16, ER-Ts)]
[화학식 Ⅴ(ER-FresH B, MSH3-39, ER-Ts-L)]
[화학식 Ⅵ(ER-FresH C, ER-F5)]
[화학식 Ⅶ(ER-FresH D, ER-F5-L)]
본 발명의 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물, 바람직하게는 상기 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 화합물은 생세포 내 소포체(ER)에서 티올의 양이 증가함에 따라 ER-FT에 결합하는 티올의 양이 증가할 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물, 바람직하게는 상기 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 화합물은 프리(free) 상태에서 550 내지 680 nm에서 최대방출파장을 나타내고 티올과 결합된 상태에서 430 내지 550 nm에서 최대방출파장을 나타내는 것인, 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 바람직하게는 상기 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 화합물은 프리 상태에서 550 내지 650, 550 내지 620, 550 내지 600, 570 내지 590 또는 580 nm에서 최대방출파장을 나타낸다.
본 발명에서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 바람직하게는 상기 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 화합물은 티올과 결합된 상태에서 450 내지 550, 470 내지 550, 470 내지 530, 490 내지 530, 500 내지 520 또는 510 nm에서 최대방출파장을 나타낸다.
본 발명에서, 상기 방출파장의 형광세기는 430 nm 내지 680 nm의 범위에서 증감하는 것인, 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물, 바람직하게는 상기 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 생세포(living cell)에서의 항산화능 측정용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 상기 항산화능 측정은 생세포에서의 티올 수준 측정인 것일 수 있고, 상기 티올 수준 측정은 생세포의 세포 소기관에서의 티올 수준 측정일 수 있으며, 상기 세포 소기관은 소포체(ER)일 수 있다.
본 발명에서 상기 티올 수준의 측정은 티올이 증가함에 따라 프리 상태의 화합물이 나타내는 550 내지 680 nm의 형광세기는 감소하고, 티올이 결합되어 있는 화합물이 나타내는 430 내지 550 nm의 형광세기는 증가하는 것일 수 있다.
본 발명에서 형광세기는 비율계량적이고 가역적으로 증감할 수 있다.
본 발명에서 상기 티올 수준 측정은 430 내지 550 nm에서의 형광세기 및 550 내지 680 nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 수득하여(obtaining) 실시하는 것이고, 상기 비율은 상기 430 내지 550 nm에서의 형광세기 및 550 내지 680 nm에서의 형광세기의 관계(relationship) 일 수 있다.
본 발명에서 상기 관계는 상기 430 내지 550 nm에서의 형광세기 및 550 내지 680 nm에서의 형광세기의 수학적 비율관계이고 상기 수학적 비율관계는 소포체(ER)에서 티올의 양에 따라 비율계량적(ratiometrically)으로 가역적으로 증감하여 세포 내 소기관에서의 티올 양을 실시간으로 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 티올 수준 측정은 소포체(ER) 내 티올의 정성 또는 정량적 검출인 것일 수 있고, 상기 티올 수준 측정은 실시간 정량적 측정인 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 티올 수준 측정은 세포의 산화적 스트레스 또는 산화도를 나타내는 것일 수 있고, 상기 티올 수준 측정은 세포의 노화도를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 티올은 글루타치온(glutathione, GSH), 호모 시스테인(homocysteine, Hcy), 시스테인(cysteine, Cys) 또는 단백질의 시스테인 잔기에 있는 티올일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물을 사용하여, 줄기세포를 포함하는 모든 세포의 세포 내 소기관인 소포체(ER)의 항산화능을 측정하여 항산화능에 관련된 세포 활성을 정확하게 측정할 수 있고 고활성의 세포 분류가 가능하다. 본 발명의 조성물을 사용한 세포의 활성 측정은 항산화능 측정을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 바람직하게는 상기 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 화합물은; 이의 라세미체, 광학이성질체, 부분입체이성질체, 광학이성질체의 혼합물, 또는 부분입체이성질체의 혼합물; 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 내 소기관의 항산화능 측정용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, (a) 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물, 바람직하게는 상기 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 후보물질을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 생세포에 투여하는 단계; (b) 430 내지 550 nm에서의 형광세기 및 550 내지 680 nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 수득하여 표준데이터와 비교하는 단계; (c) 상기 시험물질을 티올 증가제 또는 억제제로 결정하는 단계: 및 (d) 430 내지 550 nm에서의 형광세기의 550 내지 680 nm에서의 형광세기에 대한 비율이 감소하는 경우 티올 억제제로 결정하고, 형광세기의 비율이 증가하는 경우 티올 증가제로 결정하는 단계를 포함하는 생세포 내 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명에서, 상기 (d) 단계는 510 nm에서의 형광세기의 580 nm에서의 형광세기에 대한 비율(510/580 ratio)이 감소하는 경우 티올 억제제로 결정하고, 510 nm에서의 형광세기의 580 nm에서의 형광세기에 대한 비율(510/580 ratio)이 증가하는 경우 티올 증가제로 결정하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 형광 비율 측정은 소포체(ER)에 대하여 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물을 포함하는 산화 스트레스 유발 질환 진단 키트를 제공한다. 본 명세서의 용어 "산화 스트레스 유발 질환"은 산화 스트레스에 의하여 발생하는 질환을 의미하며, "활성 산소종(ROS) 연관 질환"과 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에서 상기 산화 스트레스 유발 질환은 노화, 퇴행성 관절염, 백내장, 알쯔하이머병, 암, 섬유화 질환, 당뇨병, 비만, 허혈, 허혈성 재관류 손상, 염증, 전신성 홍반 루푸스, 심근경색, 혈전성 뇌졸증, 출혈성 뇌졸증, 출혈, 척수 외상, 다운증후군, 크론병, 류마티스 관절염, 포도막염, 폐기종, 위궤양, 산소 중독, 종양 또는 방사선증일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "키트"는 티올에 특이적으로 결합하는 본 발명의 검출 가능한 화합물을 표지로 표지하여 티올의 발현 수준을 평가할 수 있는 도구를 말한다. 검출 가능한 물질을 기질과의 반응에 의해서 직접적으로 표지하는 것뿐만 아니라, 직접적으로 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 발색하는 표지체가 접합된 간접적 표지도 포함한다. 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 기타 다른 용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하여 제작될 수 있다. 본 발명의 키트는 당 업계에 공지되어 있는 것이라면, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있고, 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면 (a) 생세포에서의 430 내지 550nm에서의 형광세기 및 550 내지 680nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 실시간으로 측정하는 단계; (b) 제 6항에 따른 조성물을 생세포에 투여하는 단계; (c) 산화제를 단계 (b)의 세포에 투여하는 단계; 및 (d) 상기 형광세기의 비율 값의 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 (a) 단계는 510 nm에서의 형광세기의580 nm에서의 형광세기에 대한 비율(510/580 ratio)을 실시간으로 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시간을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하고, 상기 시간이 짧을수록 항산화능이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값과 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값의 차이의 산화제 투여 시점부터 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시점까지의 적분값을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하고, 상기 적분값이 작을수록 항산화능이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값이 감소하기 시작하는 상기 산화제의 최소 농도를 적정하는 단계를 추가적으로 포함하고, 상기 최소 농도가 높을수록 항산화능이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 측정 방법은 생세포 내 소기관인 소포체(ER)에 대하여 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물을 사용하여 생세포(living cell), 특히 줄기 세포 내 소기관인 소포체(ER)의 항산화능을 측정할 수 있고, 소포체(ER)의 항산화능 측정 결과에 의해 고활성의 줄기 세포를 선별할 수 있다.
도 1은 화학식 Ⅳ로 나타내어지는 ER-FT의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 화학식 Ⅴ로 나타내어지는 ER-FT의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 화학식 Ⅵ으로 나타내어지는 ER-FT의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 화학식 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT가 UC-MSC 세포 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 6은 화학식 Ⅳ내지 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT의 IC50을 나타낸 독성실험 결과이다.
도 7은 화학식 Ⅳ 내지 Ⅵ으로 나타내어지는 ER-FT의 UC-MSC 보유 시간에 대해 510nm 파장, 580nm 파장의 강도, 510nm, 580nm 파장의 강도 및 양 파장 강도 비로 측정한 실험 결과이다.
도 8은 화학식 Ⅳ 내지 Ⅴ 및 Ⅵ으로 나타내어지는 ER-FT의 UC-MSC 보유 시간에 대해 510nm 파장, 580nm 파장의 강도, 510nm, 580nm 파장의 강도 및 양 파장 강도 비로 측정한 실험 결과이다.
도 9는 화학식 Ⅳ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide를 추가하여 UC-MSC 세포에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 10는 화학식 Ⅳ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 및 DTT를 추가하여 UC-MSC 세포에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 11은 화학식 Ⅴ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide를 추가하여 UC-MSC 세포 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 12는 화학식 Ⅴ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 및 DTT를 추가하여 UC-MSC 세포 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 13은 화학식 Ⅵ으로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide를 추가하여 UC-MSC 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 14는 화학식 Ⅵ으로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 및 DTT를 추가하여 UC-MSC 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 15는 화학식 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide를 추가하여 UC-MSC 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 16은 화학식 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 및 DTT을 추가하여 UC-MSC 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
본 발명의 목적은 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 표시되는 ER-FT(Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer)를 제공하는데 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[제조예] 소포체(ER) 항산화능 측정용 화합물의 합성
소포체(ER)인 소포체(ER)의 항산화능 측정에 사용하는 화합물(ER-FT)의 제조 방법은 하기와 같다.
1. ER-FresH A (화학식 Ⅳ) 제조 방법
화합물 1
1-(carbobenzyloxy)-4-piperidinecarboxylic acid (0.30 g, 1.1 mmol)와 N-(tert-butoxycarbonyl)-ethylenediamine (0.19 mL, 1.0 당량), 1-hydroxybenzotriazol (HOBt; 0.23 g, 1.5 당량), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDCI; 0.29 g, 1.5 당량)를 N,N-dimethylformamide (DMF) 5 mL에 녹인 용액을 상온에서 15시간 교반한다. 혼합물을 EtOAc로 희석한 후 NaHCO3 수용액과 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 1을 얻는다(0.45 g, 98%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.31-7.37 (m, 5H), 6.63 (br, 1H), 5.12-5.14 (m, 3H), 4.18-4.21 (m, 2H), 3.32-3.35 (m, 2H), 3.25-3.28 (m, 2H), 2.80 내지 2.85 (m, 2H), 2.22-2.27 (m, 1H), 1.80 내지 1.84 (m, 2H), 1.60 내지 1.67 (m, 2H), 1.42 (s, 9H).
화합물 2
화합물 1(0.45 g, 1.1 mmol)을 MeOH 10 mL에 녹인 용액에 palladium on activated carbon (Pd-C; 10 wt%, 45 mg)을 첨가하고 H2 기체(1 atm) 하에서 15시간 교반한다. 혼합물을 celite 층을 통과시켜서 얻은 여과액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 진공건조하여 얻은 고체의 일부(0.15 g, 0.55 mmol)와 cyanoacetic acid (48 mg, 1.0 당량), HOBt (0.11 g, 1.3 당량), EDCI (0.14 g, 1.3 당량), N,N-diisopropylethylamine (DIEA; 0.15 mL, 1.5 당량)을 DMF 5 mL에 녹인 용액을 상온에서 14시간 교반한다. 감압증류하여 용매를 제거하고 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 2를 얻는다(0.17 g, 90%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 6.62 (br, 1H), 4.96 (br, 1H), 4.46-4.49 (m, 1H), 3.74-3.77 (m, 1H), 3.51 (s, 2H), 3.34-3.37 (m, 2H), 3.28-3.31 (m, 2H), 3.18-3.24 (m, 1H), 2.80 내지 2.85 (m, 1H), 2.34-2.40 (m, 1H), 1.90 내지 1.98 (m, 2H), 1.63-1.80 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
화합물 3
10-oxo-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H,10H-11-oxa-3a-azabenzo[de]anthracene-9-carbaldehyde (0.12 g, 0.45 mmol)과 화합물 2 (0.17 g, 1.1 당량), piperidine (44 μL, 1.0 당량)을 2-propanol 3 mL에 녹인 용액을 60°C에서 16시간 가열한 후 상온으로 냉각한다. 감압증류하여 용매를 제거하고 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 3을 얻는다(0.25 g, 96%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-이형태체) 8.63 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.55 (br, 1H), 4.97 (br, 1H), 4.29 (br, 2H), 3.28-3.38 (m, 8H), 3.06 (br, 2H), 2.86 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.36-2.42 (m, 1H), 1.94-2.00 (m, 6H), 1.71-1.80 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
ER-FresH A
화합물 3(0.25 g, 0.42 mmol)을 trifluoroacetic acid (TFA; 2 mL) / CH2Cl2 (2 mL) 혼합용액에 녹인 후 상온에서 2시간 교반한다. 감압증류하여 용매를 제거한 후 남은 화합물과 p-toluenesulfonyl chloride (TsCl; 32 mg, 1.0 당량), DIEA (58 μL, 2.0 당량)을 DMF 2 mL에 녹인 용액을 상온에서 4시간 교반한다. 감압증류하여 용매를 제거하고 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 ER-FReSH A를 얻는다(23 mg, 22%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-이형태체) 8.63 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.00 (s, 1H), 6.52 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 5.66 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 4.26 (br, 2H), 3.32-3.38 (m, 6H), 3.02-3.08 (m, 4H), 2.85 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.36-2.42 (m, 1H), 1.86-1.99 (m, 6H), 1.68-1.77 (m, 2H).
2. ER-FresH B (화학식 Ⅴ) 제조 방법
화합물 4
1-(carbobenzyloxy)-4-piperidinecarboxylic acid (0.24 g, 0.87 mmol)와 N-(tert-butoxycarbonyl)-4,7,10 내지 trioxa-1,13-tridecanediamine (0.28 g, 1.0 당량), HOBt (0.18 g, 1.3 당량), EDCI (0.22 g, 1.3 당량)를 DMF 10 mL에 녹인 용액을 상온에서 18시간 교반한다. 혼합물을 EtOAc로 희석한 후 NaHCO3 수용액과 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 4를 얻는다(0.49 g, 99%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.31-7.36 (m, 5H), 6.37 (br, 1H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br, 1H), 4.17-4.23 (m, 2H), 3.57-3.64 (m, 10H), 3.52 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.35-3.39 (m, 2H), 3.19-3.23 (m, 2H), 2.81-2.86 (m, 2H), 2.20 내지 2.26 (m, 1H), 1.73-1.83 (m, 6H), 1.61-1.68 (m, 2H), 1.43 (s, 9H).
화합물 5
화합물 4(0.49 g, 0.87 mmol)를 MeOH 5 mL에 녹인 용액에 Pd-C (10 wt%, 49 mg)을 첨가하고 H2 기체(1 atm) 하에서 14시간 교반한다. 혼합물을 celite 층을 통과시켜서 얻은 여과액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 진공건조하여 얻은 고체와 cyanoacetic acid (74 mg, 1.0 당량), HOBt (0.17 g, 1.3 당량), EDCI (0.22 g, 1.3 당량), DIEA (0.23 mL, 1.5 당량)를 DMF 5 mL에 녹인 용액을 상온에서 12시간 교반한다. 감압증류하여 용매를 제거하고 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 5를 얻는다(0.34 g, 79%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 6.53 (br, 1H), 4.95 (br, 1H), 4.43-4.47 (m, 1H), 3.75-3.79 (m, 1H), 3.57-3.66 (m, 10H), 3.53 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.52 (s, 2H), 3.36-3.39 (m, 2H), 3.18-3.23 (m, 3H), 2.81-2.87 (m, 1H), 2.33-2.39 (m, 1H), 1.87-1.94 (m, 2H), 1.73-1.82 (m, 5H), 1.64-1.72 (m, 1H), 1.44 (s, 9H).
화합물 6
화합물 5(0.13 g, 0.26 mmol)를 TFA (2 mL) / CH2Cl2 (1 mL) 혼합용액에 녹인 후 상온에서 3시간 교반한다. 감압증류하여 용매를 제거한 후 남은 화합물과 DIEA (0.12 mL, 2.6 당량)를 CH2Cl2 3 mL에 녹인 용액을 0 ℃로 냉각한다. p-TsCl (63 mg, 1.3 당량)을 첨가한 후 온도를 상온으로 올리면서 4시간 교반한다. 혼합물을 CH2Cl2로 희석한 후 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 6을 얻는다(68 mg, 47%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.77 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.62 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.85 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.42-4.46 (m, 1H), 3.67-3.73 (m, 5H), 3.62-3.64 (m, 2H), 3.58 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.50 내지 3.55 (m, 6H), 3.33-3.37 (m, 2H), 3.14-3.20 (m, 1H), 3.04-3.08 (m, 2H), 2.74-2.80 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.35-2.41 (m, 1H), 1.82-1.91 (m, 2H), 1.58-1.80 (m, 6H).
ER-FresH B
10-oxo-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H,10H-11-oxa-3a-azabenzo[de]anthracene-9-carbaldehyde (30 mg, 0.11 mmol)과 화합물 6 (68 mg, 1.1 당량), piperidine (11 μL, 1.0 당량)을 2-propanol 1 mL에 녹인 용액을 상온에서 15시간 교반한다. 감압증류하여 용매를 제거하고 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 ER-FT B를 얻는다(77 mg, 86%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-이형태체) 8.63 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.99 (s, 1H), 6.53 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 5.74 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.25 (br, 2H), 3.67-3.69 (m, 4H), 3.62-3.64 (m, 2H), 3.53-3.60 (m, 4H), 3.50 내지 3.52 (m, 2H), 3.32-3.39 (m, 6H), 3.04-3.08 (m, 2H), 3.02 (br, 2H), 2.87 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.42 (s, 3H), 2.34-2.41 (m, 1H), 1.95-2.00 (m, 4H), 1.89-1.92 (m, 2H), 1.66-1.81 (m, 6H).
3. ER-FresH C (화학식 Ⅵ) 합성
화합물 7
1-(tert-butoxycarbonyl)-4-piperidinecarboxylic acid (0.30 g, 1.3 mmol)와 N-carbobenzyloxy- ethylenediamine hydrochloride (0.31 g, 1.0 당량), HOBt (0.27 g, 1.3 당량), EDCI (0.33 g, 1.3 당량), DIEA (0.34 mL, 1.5 당량)를 DMF 10 mL에 녹인 용액을 상온에서 18시간 교반한다. 혼합물을 EtOAc로 희석한 후 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 7을 얻는다(0.53 g, 100%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.31-7.38 (m, 5H), 6.24 (br, 1H), 5.22 (br, 1H), 5.10 (s, 2H), 4.08-4.14 (m, 2H), 3.33-3.39 (m, 4H), 2.68-2.73 (m, 2H), 2.14-2.20 (m, 1H), 1.73-1.76 (m, 2H), 1.52-1.60 (m, 2H), 1.46 (s, 9H).
화합물 8
화합물 7(0.53 g, 1.3 mmol)을 MeOH 10 mL에 녹인 용액에 Pd-C (10 wt%, 53 mg)을 첨가하고 H2 기체(1 atm) 하에서 2시간 교반한다. 혼합물을 celite 층을 통과시켜서 얻은 여과액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 진공건조하여 얻은 진공건조하여 얻은 고체의 일부(0.10 g, 0.37 mmol)와 DIEA (0.13 mL, 2.0 당량)를 CH2Cl2 3 mL에 녹인 용액에 pentafluorobenzoyl chloride (52 μL, 1.0 당량)을 첨가한 후 2시간 교반한다. 혼합물을 CH2Cl2로 희석한 후 NaHCO3 수용액과 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 8을 얻는다(0.12 g, 73%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.33 (br, 1H), 6.28 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.10 내지 4.15 (m, 2H), 3.58-3.61 (m, 2H), 3.49-3.53 (m, 2H), 2.70 내지 2.75 (m, 2H), 2.25 (tt, J = 11.6 Hz, J = 3.7 Hz, 1H), 1.77-1.80 (m, 2H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.45 (s, 9H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.8 (2F), -150.6 (1F), -159.9 (2F).
화합물 9
화합물 8(0.12 g, 0.27 mmol)을 HCl 용액(4 M, dioxane) 2 mL에 녹인 후 상온에서 2시간 교반한다. 감압증류하여 용매를 제거한 후 남은 화합물과 cyanoacetic acid (24 mg, 1.0 당량), HOBt (56 mg, 1.3 당량), EDCI (70 mg, 1.3 당량), DIEA (73 μL, 1.5 당량)를 DMF 2 mL에 녹인 용액을 상온에서 17시간 교반한다. 혼합물을 CH2Cl2로 희석한 후 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 9를 얻는다(44 mg, 37%).
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 8.94 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.91 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.24-4.28 (m, 1H), 3.97-4.09 (m, 2H), 3.63-3.67 (m, 1H), 3.30 내지 3.34 (m, 2H), 3.18-3.21 (m, 2H), 3.00 내지 3.05 (m, 1H), 2.64-2.69 (m, 1H), 2.31-2.38 (m, 1H), 1.68-1.72 (m, 2H), 1.51-1.59 (m, 1H), 1.34-1.43 (m, 1H). 19F NMR (470 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = -141.9 (2F), -153.0 (1F), -161.4 (2F).
ER-FresH C
화합물 9 (44 mg, 0.10 mmol)와 10-oxo-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H,10H-11-oxa-3a-azabenzo[de]-anthracene-9-carbaldehyde (30 mg, 1.1 당량)을 DMF 1 mL에 녹인 용액에 chlorotrimethylsilane (TMSCl; 39 μL, 3.0 당량)을 첨가한 후 130℃에서 5시간 교반한다. 상온으로 냉각한 혼합물을 CH2Cl2로 희석한 후 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 ER-FT C를 얻는다(33 mg, 48%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-이형태체) 8.61 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.48 (br, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.62 (br, 1H), 4.29 (br, 2H), 3.97-4.09 (m, 2H), 3.57-3.61 (m, 2H), 3.48-3.52 (m, 2H), 3.33-3.39 (m, 4H), 3.03 (br, 2H), 2.73-2.86 (m, 4H), 2.40 내지 2.47 (m, 1H), 1.89-2.04 (m, 6H), 1.72-1.80 (m, 2H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.7 (2F), -150.8 (1F), -159.9 (2F).
ER-FresH D (화학식 Ⅶ) 합성
화합물 10
N-(tert-butoxycarbonyl)-4,7,10 내지 trioxa-1,13-tridecanediamine (0.10 g, 0.31 mmol)과 DIEA (0.1 mL, 2.0 당량)를 CH2Cl2 3 mL에 녹인 용액에 pentafluorobenzoyl chloride (44 μL, 1.0 당량)을 첨가한 후 2시간 교반한다. 혼합물을 CH2Cl2로 희석한 후 NaHCO3 수용액과 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 10을 얻는다(0.15 g, 94%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.18 (br, 1H), 4.88 (br, 1H), 3.65 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.58-3.61 (m, 6H), 3.46-3.52 (m, 6H), 3.17-3.21 (m, 2H), 1.88-1.92 (m, 2H), 1.70 내지 1.75 (m, 2H), 1.41 (s, 9H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.7 (2F), -151.8 (1F), -160.6 (2F).
화합물 11
화합물 10(0.15 g, 0.29 mmol)을 HCl 용액(4 M, dioxane) 2 mL에 녹인 후 상온에서 2시간 교반한다. 감압증류하여 용매를 제거한 후 남은 화합물과 1-(tert-butoxycarbonyl)-4-piperidinecarboxylic acid (69 mg, 1.0 당량), HOBt (59 mg, 1.3 당량), EDCI (73 mg, 1.3 당량), DIEA (76 μL, 1.5 당량)를 DMF 3 mL에 녹인 용액을 상온에서 16시간 교반한다. 혼합물을 EtOAc로 희석한 후 NaHCO3 수용액과 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 11을 얻는다(0.17 g, 93%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.31 (br, 1H), 6.24 (br, 1H), 4.07-4.12 (m, 2H), 3.53-3.63 (m, 12H), 3.49-3.52 (m, 2H), 3.33-3.37 (m, 2H), 2.70 내지 2.75 (m, 2H), 2.18 (tt, J = 11.6 Hz, J = 3.6 Hz, 1H), 1.88-1.92 (m, 2H), 1.73-1.81 (m, 4H), 1.52-1.60(m, 2H), 1.43 (s, 9H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.7 (2F), -151.8 (1F), -160.6 (2F).
화합물 12
화합물 11(0.17 g, 0.27 mmol)을 HCl 용액(4 M, dioxane) 2 mL에 녹인 후 상온에서 1시간 교반한다. 감압증류하여 용매를 제거한 후 남은 화합물과 cyanoacetic acid (23 mg, 1.0 당량), HOBt (54 mg, 1.3 당량), EDCI (67 mg, 1.3 당량), DIEA (70 μL, 1.5 당량)를 DMF 2 mL에 녹인 용액을 상온에서 18시간 교반한다. 혼합물을 CH2Cl2로 희석한 후 NaHCO3 수용액과 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 화합물 12를 얻는다(0.11 g, 69%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.16 (br, 1H), 6.39 (br, 1H), 4.41-4.46 (m, 1H), 3.73-3.77 (m, 1H), 3.53-3.63 (m, 12H), 3.50 내지 3.52 (m, 4H), 3.33-3.37 (m, 2H), 3.17-3.23 (m, 1H), 2.81-2.86 (m, 1H), 2.35 (tt, J = 10.8 Hz, J = 4.0 Hz, 1H), 1.87-1.96 (m, 4H), 1.71-1.78 (m, 3H), 1.60 내지 1.68 (m, 1H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.7 (2F), -151.6 (1F), -160.5 (2F).
ER-FresH D
화합물 12(57 mg, 96 μmol)와 10-oxo-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H,10H-11-oxa-3a-azabenzo[de]-anthracene-9-carbaldehyde (28 mg, 1.1 당량)을 DMF 1 mL에 녹인 용액에 TMSCl (16 μL, 1.3 당량)을 첨가한 후 130℃에서 14시간 교반한다. 상온으로 냉각한 혼합물을 CH2Cl2로 희석한 후 NaCl 포화수용액으로 씻는다. 유기층을 분리한 후 Na2SO4를 첨가하여 건조한 후, 이를 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 용매를 제거한다. 남은 혼합물을 SiO2 관크로마토그래피로 정제하여 ER-FT D를 얻는다(31 mg, 38%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-이형태체) 8.61 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.35 (br, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.44 (br, 1H), 4.26 (br, 2H), 3.51-3.63 (m, 14H), 3.33-3.39 (m, 6H), 3.07 (br, 2H), 2.82-2.87 (m, 2H), 2.73-2.78 (m, 2H), 2.31-2.40 (m, 1H), 1.87-2.04 (m, 8H), 1.68-1.79 (m, 4H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.6 (2F), -151.8 (1F), -160.5 (2F).
상기 제조예에서 R3에 따른 ER-FresH A/B/C/D의 구분은 하기 표 1과 같다.
| R3 | 화합물 |
| -(CH2)m-R4 | 화학식 Ⅳ (ER-FresH A) |
| -(CH2)n-(CH20CH2)p-(CH2)q-R4 | 화학식 V (ER-FresH B) |
| -(CH2)m-R5 | 화학식 Ⅵ (ER-FresH C) |
| -(CH2)n-(CH20CH2)p-(CH2)q-R5 | 화학식 Ⅶ (ER-FresH D) |
[실험예] 실험 방법
1. ER-FT(Endoplasmic Reticulum Fluorescent Real-time SH group-Tracer) 파생 화합물(이하에서, 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ 중 어느 하나)의 티올 화합물과의 in vitro 반응
도 5는 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT가 UC-MSC 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
(1) 공초점 접시(confocal dish)에 제대 중간엽 줄기세포(UC-MSC)세포 및 Hella 세포 시딩(UC-MSC: 5X104, HeLa cell: 2X105) 후 24시간 배양한다. (2) 10~20μM 농도의 ER-FT(화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ)를 각 세포 배지마다 2ml씩 준비한다. (3) 접시에 ER-FT 투여하여 염색 후, 37℃에서 30분 동안 인큐베이터에서 배양한다. (4) 1mM ER tracer Red 를 2μl씩 넣어주고 잘 섞어준 후, 30분 배양한다. (5) 배지 석션 후 HBSS 2ml를 첨가한다.
공초점 현미경을 통해 세포를 촬영하였고, 그 결과는 도 5 와 같다.
2. 세포 독성 시험
도 6는 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT의 IC50을 나타낸 독성실험 결과이다.
(1) UC-MSC 세포 (4 x 103 cells/well)를 96 well dish에 24 시간 동안 배양하였다. (2) 5, 10, 20, 40μM 농도의 ER-FT 파생 화합물(화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ) 2ml를 준비하여 처리한 후, 37℃ 24 시간 동안 배양하였다. (3) 10X EZ-cytox 각 well당 10μl씩 첨가하여, 3시간동안 배양하였다. (4) 플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다(기준 파장 600~650nm).
세포 독성 시험 결과 도 6 및 하기 표 2와 같이 화학식 Ⅳ(ER-FreSH A)가 독성이 가장 낮은 것이 확인되었다.
| 화학식 Ⅳ | 화학식 Ⅴ | 화학식 Ⅵ | 화학식 Ⅶ | |
| IC50 (νM) | 43.4 | 36.39 | 33.44 | 13.28 |
3. ER-FT 파생 화합물 별 세포내 보유 시간 측정
도 7은 화학식 Ⅳ 내지 Ⅵ로 나타내어지는 ER-FT의 UC-MSC 보유 시간에 대해 510nm 파장의 강도, 580nm 파장의 강도, 510nm, 580nm 파장의 강도 및 양 파장 강도 비로 측정한 실험 결과이다.
도 8은 화학식 Ⅳ, Ⅵ 및 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT의 UC-MSC 세포 보유 시간에 대해 510nm 파장의 강도, 580nm 파장의 강도, 510nm, 580nm 파장의 강도 및 양 파장 강도 비로 측정한 실험 결과이다.
(1) 96well plate에 UC-MSC 4,000개/well 시딩 후, 24시간 배양한다. (2) 10, 15, 20μM 농도의 ER-FT(화학식 ₃내지 Ⅵ)를 포함한 세포 배지를 준비한다. (3) 배지 석션 후 ER-FT 염색을 실시하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이터에서 배양한다. (4) 배지 석션 후 well 당 HBSS를 100μl씩 첨가한다.
오페레타 이미징(Operetta imaging) 결과 도 7 및 도 8과 같이 UC-MSC에서 화학식Ⅳ, Ⅴ이 일정한 형광세기(intensity)를 보인다. 화학식 Ⅵ, Ⅶ의 경우에는 초기 형광세기가 높지만 초기 20분 동안 형광세기가 점점 감소하여 다른 ER-FT와 비슷한 강도를 나타내었다.
도 7 및 도 8과 같이, 모든 결과를 종합해봤을 때 화학식 μ및 Ⅶ은 세포 내 오래 머물러 있어 세척(wash)되기까지 시간이 소요된다. 또한, 모두 세척이 된 이후에 형광세기는 비슷한 수준을 보였다.
4. ER-FT 파생 화합물 별 반응성 측정
도 9은 화학식 Ⅳ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 추가하여 UC-MSC 세포에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 10는 화학식 Ⅳ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 및 DTT을 추가하여 UC-MSC 세포에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 11은 화학식 Ⅴ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 추가하여 UC-MSC 세포 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 12은 화학식 Ⅴ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 및 DTT을 추가하여 UC-MSC 세포 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 13은 화학식 Ⅵ으로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 추가하여 UC-MSC 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 14는 화학식 Ⅵ으로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 및 DTT을 추가하여 UC-MSC 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 15은 화학식 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 추가하여 UC-MSC 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
도 16은 화학식 Ⅶ로 나타내어지는 ER-FT 처리 후 Diamide 및 DTT을 추가하여 UC-MSC 소포체에서 관찰된 것을 공초점 현미경으로 촬영한 것이다.
(1) 공초점 접시(Confocal dish)에 세포(UC-MSC: 5X104)를 시딩한 후, 24시간 배양한다. (2) 10~20μM 농도의 ER-FT(화학식 ₃내지 Ⅵ)를 포함한 각 세포 배지를2ml씩 준비한다. (3) 접시에서 배지 석션후 ER-FT 염색을 실시하고 37℃인큐베이터에서 30분동안 배양한다. (4) 1mM ER tracer Red 2μl씩 넣어주고 잘 섞어준 후, 30분 동안 배양한다. (5) 배지 석션 후 HBSS 2ml를 첨가한다. (6) ER 타게팅 실험 후 세포에 100mM Diamide 10μl를 레이저가 닿는 부분에 피펫으로 넣어준다. (7) 공초점 이미징을 통해 세포 변화를 관찰한다. (8) 위와 같은 방법으로 1M DTT 20ul를 넣어준다. (9) 공초점 이미징을 통해 세포 변화를 관찰한다.
도 9 내지 도 16와 같이, 4 종류의 ER-FT(화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ 모두 Diamide를 처리하면 510nm의 형광세기가 감소하고 580nm의 형광세기가 증가하며, DTT를 처리하면 510nm의 형광세기가 증가하고 580nm의 형광세기가 감소한다.
본 발명에 따른 화합물 또는 조성물을 사용하여, 살아있는 세포(living cell) 내 소기관인 소포체(ER) 및 골지체의 항산화능을 측정할 수 있다. 이를 줄기세포에 적용하여, 줄기세포에서의 항산화능 측정 결과에 따라 고활성의 줄기 세포를 선별하여 세포 치료제의 효율성을 증대시킬 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 참조 문헌, 기사, 공보 및 특허 및 특허 출원이 온전히 본 명세서에 참조로 병합되어 있다. 따라서, 하기 청구의 범위의 진의 및 범주는 상기한 바람직한 실시 형태의 설명에 제한되어서는 안 된다.
본 발명은 소포체(ER) 내 글루타치온 측정용 실시간 형광 이미징 센서 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 소포체(ER) 내 글루타치온 측정용 신규 화합물 및 상기 신규 화합물을 이용한 소포체(ER) 내 글루타치온 측정 방법에 관한 것이다.
Claims (29)
- 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:[화학식 I]
상기 화학식 I에서 R1은 하나 이상의 N을 포함하는 3-7원 고리인 헤테로사이클로알킬이고, 상기 헤테로사이클로알킬은 R2 치환기가 결합되어 있으며; 상기 R2는 아마이드기이다. - 제 1항에 있어서,상기 R2는 -(C(=O)NH)-R3이고;상기 R3는 -(CH2)m-R4, -(CH2)m-R5, -(CH2)n-(CH20CH2)p-(CH2)q-R4 또는 -(CH2)n-(CH20CH2)p-(CH2)q-R5이며;여기서, 상기 m은 1-6의 정수이고, 상기 n, p 및 q는 각각 독립적으로 1-4의 정수이며;상기 R4는 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 치환기이고;상기 R5는 다음 화학식 Ⅲ 로 표시되는 치환기인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:[화학식 Ⅱ]
[화학식 Ⅲ]
- 제 2항에 있어서,상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 하기 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ 중 어느 하나로 표시되는 것인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:[화학식 Ⅳ]
[화학식 Ⅴ]
[화학식 Ⅵ]
[화학식 Ⅶ]
- 제 1항에 있어서,상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물은 프리(free) 상태에서 550 내지 680 nm에서 최대방출파장을 나타내고 티올과 결합된 상태에서 430 내지 550 nm에서 최대방출파장을 나타내는 것인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
- 제 4항에 있어서,상기 방출파장의 형광세기는 430 nm 내지 680 nm의 범위에서 증감하는 것인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 생세포(living cell)에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 6항에 있어서,상기 항산화능 측정은 생세포에서의 티올 수준 측정인 것인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 티올 수준 측정은 생세포의 세포 소기관에서의 티올 수준 측정인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 8항에 있어서,상기 세포 소기관은 소포체(ER)인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 9항에 있어서,상기 소포체(ER)에서의 항산화능 측정은 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ 중 어느 하나의 화합물을 사용하는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 티올 수준 측정에서 티올이 증가함에 따라 550 내지 680 nm에서의 형광세기가 감소하고 430 내지 550 nm에서의 형광세기는 증가하는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 티올 수준 측정은 430 내지 550 nm에서의 형광세기 및 550 내지 680 nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 수득하여(obtaining) 실시하는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 12항에 있어서,상기 비율은 상기 430 내지 550 nm에서의 형광세기 및 550 내지 680 nm에서의 형광세기의 관계(relationship)인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 13항에 있어서,상기 관계는 상기 430 내지 550 nm에서의 형광세기 및 550 내지 680 nm에서의 형광세기의 수학적 비율관계이고 상기 수학적 비율관계는 소포체(ER)에서 티올의 양에 따라 비율계량적(ratiometrically)으로 가역적으로 증감하여 세포 내 소기관에서의 티올 양을 실시간으로 나타내는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 티올 수준 측정은 소포체(ER) 내 티올의 정성 또는 정량적 검출인 것인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 티올 수준 측정은 실시간 정량적 측정인 것인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 티올 수준 측정은 세포의 산화적 스트레스 또는 산화도를 나타내는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 티올 수준 측정은 세포의 노화도를 나타내는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 제 7항에 있어서,상기 티올은 글루타치온(glutathione, GSH), 호모 시스테인(homocysteine, Hcy), 시스테인(cysteine, Cys) 또는 단백질의 시스테인 잔기에 있는 티올인, 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
- 다음의 단계를 포함하는 생세포 내 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법:(a) 제 6항에 따른 조성물 및 후보물질을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 생세포에 투여하는 단계;(b) 430 내지 550 nm에서의 형광세기 및 550 내지 680 nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 수득하여 표준데이터와 비교하는 단계;(c) 상기 시험물질을 티올 증가제 또는 억제제로 결정하는 단계: 및(d) 430 내지 550 nm에서의 형광세기의 550 내지 680 nm에서의 형광세기에 대한 비율이 감소하는 경우 티올 억제제로 결정하고, 형광세기의 비율이 증가하는 경우 티올 증가제로 결정하는 단계.
- 제 20항에 있어서,상기 (d) 단계는 510 nm에서의 형광세기의580 nm에서의 형광세기에 대한 비율(510/580 ratio)이 감소하는 경우 티올 억제제로 결정하고, 510 nm에서의 형광세기의580 nm에서의 형광세기에 대한 비율(510/580 ratio)이 증가하는 경우 티올 증가제로 결정하는 것인, 생세포 내 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법.
- 제 20항에 있어서,상기 형광 비율 측정은 소포체(ER)에 대하여 측정하는 것인, 생세포 내 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염을 포함하는 산화 스트레스 유발 질환 진단 키트.
- 다음의 단계를 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법:(a) 생세포에서의 430 내지 550nm에서의 형광세기 및 550 내지 680nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 실시간으로 측정하는 단계;(b) 제 6항에 따른 조성물을 생세포에 투여하는 단계;(c) 산화제를 단계 (b)의 세포에 투여하는 단계; 및(d) 상기 형광세기의 비율 값의 변화를 관찰하는 단계.
- 제 24항에 있어서,상기 (a) 단계는 510 nm에서의 형광세기의580 nm에서의 형광세기에 대한 비율(510/580 ratio)을 실시간으로 측정하는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정 방법.
- 제 24항에 있어서,상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시간을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하고, 상기 시간이 짧을수록 항산화능이 높은 것으로 판단하는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정 방법.
- 제 24항에 있어서,상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값과 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값의 차이의 산화제 투여 시점부터 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시점까지의 적분값을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하고, 상기 적분값이 작을수록 항산화능이 높은 것으로 판단하는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정 방법.
- 제 24항에 있어서,상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값이 감소하기 시작하는 상기 산화제의 최소 농도를 적정하는 단계를 추가적으로 포함하고, 상기 최소 농도가 높을수록 항산화능이 높은 것으로 판단하는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정 방법.
- 제 24항에 있어서,상기 측정 방법은 생세포 내 소기관인 소포체(ER)에 대하여 측정하는 것인, 생세포에서의 항산화능 측정 방법.
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