WO2014181960A2 - 타이로신 인산화효소를 감지하는 형광 프로브 및 이의 용도 - Google Patents

타이로신 인산화효소를 감지하는 형광 프로브 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to fluorescent probes for selectively detecting tyrosine kinase, and uses thereof.
  • Protein kinase enzyme is the most important enzyme that regulates the signal transduction system in vivo. Protein kinase enzymes are responsible for signal transduction in vivo by delivering ⁇ -phosphate groups of ATP (adenosine 5'-triphosphate) to specific substrate proteins. Protein kinase is divided into tyrosine kinase and serine / threonine kinase, and more than 500 kinase have been found (G. Manning et al, Science 2002, 298, 1912). .
  • ATP adenosine 5'-triphosphate
  • Tyrosine kinase phosphorylates the hydroxyl (-OH) group of tyrosine residues and is responsible for signaling system in vivo.
  • various diseases cancer, diabetes, inflammation, brain regeneration, etc.
  • the cell signaling system must be smoothly turned on and off, and due to the excessive activity of a specific protein kinase, uncontrolled signaling causes disease such as cancer (PB Jensen). and T. Hunter, Nature 2001, 411, 355.). Therefore, molecular probes that can effectively detect the activity of specific kinase are very important because they can be used for the diagnosis of diseases including cancer.
  • these molecular probes occupy a very important position in the development of new drugs because they are used in drug discovery with a mechanism of action that inhibits the activity of specific protein kinase that is overactivated.
  • kinase fluorescence probes are very complex in structure.
  • the fluorophore is introduced into a peptide chain recognized by the kinase.
  • the problem is that the fluorophore is selected and spatially arranged so that the fluorescence changes when the enzyme interacts with the chain. Is a very difficult task.
  • Fluorescent probes capable of measuring the activity of protein kinases reported to date have peptide chains with tyrosine residues that the enzyme can recognize, as mentioned above, and in many cases lanthanide metal complexes or complex organic fluorophores (Chen. C. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 124, 3840; Zondlo. SC et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 5619; Agnes. RS et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 6075; Rhee. H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 4919; Vaasa.A.
  • conventional fluorescent probes that detect tyrosine kinase not only include peptide substrates that recognize enzymes, but also include complex luminophores to give fluorescence signals when enzymes are recognized. This complex, and above all, the detection of phosphatase in cells or tissues is concerned about the stability and interference by other compounds, so there is practical limitation in its use.
  • the present inventors have developed a breakthrough fluorescent probe that is relatively easy to synthesize, has a high stability and low cytotoxicity in vivo, and interacts with tyrosine kinase in cells to fluoresce.
  • the fluorescence probe also has several advantages (deep tissue permeability, fluorescence interference from low tissue itself, high resolution, low cell damage, etc.) because it is also capable of two-photon excitation.
  • the developed fluorescence probe was confirmed to be able to bind to specific kinase present in cancer cells and to fluoresce as well as to selectively bind to cancer tissue to fluoresce.
  • the present invention was completed by revealing that the fluorescent probe of the present invention can be used for imaging of cells or tissues overexpressing tyrosine kinase, and imaging of cancer cells or tissues.
  • An object of the present invention is a fluorescent probe for detecting tyrosine kinase using a compound containing an ortho-hydroxy-benzaldehyde structure, a method for detecting a tyrosine kinase inhibitor using the same, tyrosine kinase activity It provides a measuring method and a one-photon or two-photon cell imaging method.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for screening a drug that inhibits overexpression of tyrosine kinase containing the fluorescent probe.
  • another object of the present invention is to provide a composition capable of imaging a tyrosine kinase overexpressing cell or tissue comprising the fluorescent probe, and an imaging method.
  • the present invention provides a fluorescent probe for the detection of tyrosine kinase (tyrosine kinase) using a compound of formula (1) or analogs thereof:
  • the compound is characterized in that it comprises an ortho (hydroxy)-benzaldehyde (benzaldehyde) structure.
  • the compound is characterized by fluorescence when intra-molecular hydrogen-bonding of ortho-hydroxy-benzaldehyde is broken by binding to tyrosine kinase.
  • the tyrosine kinase is selected from the group consisting of ABL1 (T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2 and Src.
  • the present invention also provides a method for searching for a tyrosine kinase inhibitor using the fluorescent probe of the present invention.
  • the present invention also provides a method for measuring tyrosine kinase activity using the fluorescent probe of the present invention.
  • the present invention also provides a method for imaging a one-photon or two-photon cell using the fluorescent probe of the present invention.
  • the present invention also provides a composition for screening a drug that inhibits overexpression of tyrosine kinase, comprising the fluorescent probe of the present invention.
  • the present invention also provides a composition for imaging a tyrosine kinase overexpressing cell or tissue, comprising the fluorescent probe of the present invention.
  • the tyrosine kinase overexpressing cells or tissues is characterized in that the cancer cells or cancer tissue.
  • the present invention also provides a method of imaging a tyrosine kinase overexpressing cell or tissue comprising measuring fluorescence in a cell or tissue using the fluorescent probe of the present invention.
  • the tyrosine kinase overexpressing cells or tissues is characterized in that the cancer cells or cancer tissue.
  • the step of measuring the fluorescence is any one selected from the group consisting of confocal fluorescence microscope, two-photon fluorescence microscope, optical coherence tomography, and two-photon fluorescence microscope and optical coherence tomography. Characterized in that performed using the device.
  • the fluorescent probe of the present invention has two photon excitation characteristics. That is, deep cell permeability, low excitation due to the excitation of the excited state using energy (or twice the wavelength) of half the wavelength of one-photon fluorescent probe Not only are they less affected by cell disruption, quenching by hemoglobin in vivo, etc., but also excite only the focal region, which has the advantage of achieving very high resolution.
  • FIG. 4 is a result of measuring activity inhibitory ability of Compound 1 to confirm the binding selectivity with Compound 1 to the six selected phosphatase.
  • 6 is a graph showing the influence of the concentration of the specific phosphatase binding compound 1 in fluorescence intensity.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of co-factor magnesium (Mg) and adenosine triphosphate (ATP) on the binding of compound 1 and specific phosphatase in fluorescence intensity.
  • Mg co-factor magnesium
  • ATP adenosine triphosphate
  • FIG. 9 is a graph showing the influence of a kinase inhibitor on phosphatase binding of Compound 1 by fluorescence intensity.
  • FIG. 12 shows the results of fluorescence emission wavelengths using optical fibers in CT-26 cancer cells treated with Compound 1.
  • FIG. 13 shows the results of photographing skin cancer tissues transplanted into mice through two-photon fluorescence microscopy after treatment with Compound 1.
  • FIG. 14 is a graph showing the fluorescence intensity of the two-photon fluorescence microscope image taken in FIG. 12.
  • FIG. 15 is a result of photographing skin cancer tissues before and after treating Compound 1 through optical coherence tomography (OCT).
  • OCT optical coherence tomography
  • FIG. 16 shows the results of 3D imaging of skin cancer tissues and general tissues treated with Compound 1 at the same time using two-photon electron microscopy and optical coherence tomography.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop fluorescent molecular probes that can easily detect tyrosine kinase in cells or tissues, and in view of the participation of aryl hydroxyl groups in the tyrosine kinase reaction, the hydroxyl group binds to the enzyme. That is, by devising a molecular probe that can bring about a change in the optical properties when hydrogen bonding, and the fluorescent probe of the present invention was developed in light of the fact that the molecular probe can be combined with a specific phosphatase to cause a fluorescence change.
  • the present invention provides a fluorescent probe for the detection of tyrosin kinase (tyrosin kinase) using a compound of formula (1) or analogs thereof:
  • the compound is characterized in that it comprises an ortho (hydroxy)-benzaldehyde (benzaldehyde) structure.
  • the compound is preferably fluorescence when the intra-molecular hydrogen-bonding of the ortho-hydroxy-benzaldehyde is broken by binding to tyrosine kinase.
  • tyrosine kinase is preferably selected from the group consisting of ABL1 (T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2 and Src, but is not limited thereto.
  • the 3-position hydroxy (-OH) functional group forms an intermolecular hydrogen bonding with the 2-position aldehyde (-CHO) functional group, in this state fluorescence
  • the intramolecular hydrogen bonds are broken, and hydrogen molecules are intermolecularly bonded to functional groups of neighboring enzymes to emit light.
  • the two-photon fluorescent probe of the present invention binds to six kinase (ABL1 (T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2 and Src) to increase the fluorescence, whether the probe is present and active It can be seen that can be easily confirmed (see Figs. 2 to 7). This property could be realized by introducing intramolecular hydrogen bonds into the properties of the fluorophore of the electron donor-electron acceptor structure.
  • the present invention also provides a method for searching for a tyrosine kinase inhibitor using the fluorescent probe of the present invention.
  • the present invention also provides a method for measuring tyrosine kinase activity using the fluorescent probe of the present invention.
  • the present invention also provides a method for imaging a one-photon or two-photon cell using the fluorescent probe of the present invention.
  • the fluorescent probe of the present invention when using the compound of Formula 1 developed in the present invention as a fluorescent probe, binding affinity for kinases and inhibitory properties for kinases activity (inhibition property for kinases) is Through this, the fluorescent probe of the present invention binds to phosphatase (ABL1 (T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2 and Src) to increase the fluorescence, thereby confirming the presence and activity of kinase It can be seen that it can be usefully used in the method, inhibitor search method, and cell imaging method (see FIGS. 2 to 11).
  • the present invention also provides a composition for screening a drug that inhibits overexpression of tyrosine kinase comprising the fluorescent probe of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a drug that inhibits overexpression of tyrosine kinase, comprising the following steps:
  • step 2 2) detecting fluorescence in step 1);
  • the drug candidate of the present invention when the fluorescence degree when the fluorescent probe and the drug candidate of the present invention are reacted with the tyrosine kinase is reduced compared to the fluorescence when the fluorescent probe is treated alone, the drug candidate is determined as the tyrosine kinase. It can be judged as a drug that suppresses overexpression.
  • Detecting the fluorescence may be performed using any one device selected from the group consisting of confocal fluorescence microscope, two-photon fluorescence microscope, optical coherence tomography device, and two-photon fluorescence microscope and optical coherence tomography device. It is not limited to this.
  • the drug candidate may be various compounds, proteins, and nucleic acids, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a composition for imaging tyrosine kinase overexpressing cells or tissues comprising the fluorescent probe of the present invention.
  • the present invention provides a method of imaging a tyrosine kinase overexpressing cell or tissue comprising measuring fluorescence in a cell or tissue using the fluorescent probe of the present invention.
  • the tyrosine kinase overexpressing cells or tissues may be cancer cells or cancer tissues, but is not limited thereto.
  • Measuring the fluorescence may be performed using any one device selected from the group consisting of confocal fluorescence microscope, two-photon fluorescence microscope, optical coherence tomography device, and two-photon fluorescence microscope and optical coherence tomography device. It is not limited to this.
  • the compound of Formula 1 developed in the present invention as a fluorescent probe (photophysical properties), binding affinity for kinases, kinase activity inhibitory ability ( inhibition property for kinases, NMR studies, one-photon confocal microscopy imaging for cancer cell lines, two-photon microscopy imaging for cancer cell lines, two-photon microscopy And in vivo two-photon microscopy and OCT imaing for mouse tumor model using an optical coherence tomography microscope, through which the fluorescent probe of the present invention overexpresses tyrosine kinase. It was confirmed that the fluorescence turn-on phenomenon (fluorescence turn-on) is selectively shown in the cancer tissue (see FIGS. 1 to 16).
  • the fluorescent probe of the present invention can be usefully used in compositions for imaging tyrosine kinase overexpressing cells or tissues, and imaging methods.
  • the content of the fluorescent probe as an active ingredient in the composition for imaging can be appropriately adjusted according to the use form and purpose, patient condition, etc., 1 to 20 mg / kg, preferably 5 to 10 mg / kg, most preferably 10 mg / kg, but is not limited thereto.
  • the imaging composition may be administered to a mammal including a human by various routes.
  • the mode of administration can be any of the routinely used forms and can be administered, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the compositions of the present invention can be used in the form of oral dosage forms, such as powders, tablets, capsules, suspensions, emulsions, and parenteral formulations in the form of transdermal, suppository, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • the vessel was opened and dichloromethane (100 mL), water (100 mL) and saturated brine (30 mL) were added, and the organic layer was extracted using a separatory funnel. .
  • the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate (Na 2 SO 4 , 5 g), and concentrated using an aspirator (25 ° C., 20 to 500 mmHg).
  • the pale brown solid compound thus obtained was separated by column chromatography (silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh) (column chromatograph, diameter 6 cm, height 15 cm) (developing solution: 20% EtOAc / Hexane) afforded a white solid compound 5 (2.10 g, 60%).
  • the inventors performed the synthesis of 7- (methoxymethoxy) -N, N-dimethylnaphthalen-2-amine (7- (methoxymethoxy) -N, N-dimethylnaphthalen-2-amine).
  • chloromethyl methyl ether (0.4 mL, 5.34 mmol) was slowly added dropwise for about 5 minutes.
  • the temperature was changed to room temperature (25 ° C.), and stirred for 6 hours.
  • water 100 mL was added, and extraction was performed using ethyl acetate (EtOAc, 200 mL).
  • EtOAc ethyl acetate
  • the extracted organic layer was dried with anhydrous sodium sulfate (10 g) and water present in the organic layer.
  • the dried ethyl acetate organic layer was concentrated using an inhaler.
  • the pale brown liquid compound thus obtained was separated by column chromatography using silica gel (diameter 6 cm, height 15 cm) (developing solution: 5% EtOAc / Hexane), and a white solid compound 6 (988 mg, 80 %) Was obtained.
  • the light yellow solid compound thus obtained was separated by column chromatography using silica gel (6 cm in diameter and 15 cm in height), and then separated (developing solution: 20% EtOAc / Hexane) to give light yellow solid 7 (1.27 g, 50%).
  • Compound 5 is shown as a comparative material with Compound 1 in FIG. 1, wherein Compound 5 is a comparative material in which an intramolecular hydrogen bond is removed by introducing alkyl into -OH of Compound 1.
  • Graphs (a) and (b) show absorption and fluorescence graphs of Compound 5 and Compound 1, respectively, under pH 7.5 10 mM HEPES buffer solvent conditions, and absorption spectra (a) under HEPES buffer solvent conditions at 390 nm. Had the highest absorption value. However, in the fluorescence spectrum (b), Compound 5 emits a strong fluorescence at 550 nm, while Compound 1 does not show fluorescence.
  • the inventors confirmed the protein binding selectivity of Compound 1 through fluorescence changes, and the results are shown in FIG. 2.
  • the solvent used in the experiment was a buffer solution (100mM HEPES buffer, pH 7.4), and the kinase was used as a product of Carna Biosciences, and each kinase was a solvent provided by the manufacturer (50 mM Tris-HCl, 150 mM). NaCl, 0.1% CHAPS, 1 mM DTT, 10% Glycerol, pH 7.5) and stored at -80 °C.
  • ATP and MgCl 2 used were manufactured by Sigma, and Gleevec, a kinase inhibitor, was used by Selleck Chemicals.
  • the plate used for fluorescence observation was a 96-well fluorescence assay plate (SPL Life Science Co., Ltd.), and the observation equipment was a VCITOR 3 multilabel counter (Perkin Elmer-Wellesley Co., Ltd.).
  • the 355 nm filter was used as the excitation wavelength of the observation equipment and the 535 nm filter was used as the emission wavelength.
  • Incubation was used with NB-205Q model (N-BIOTEK) and proceeded with shaking at 170 rpm for 24 hours at 37 °C.
  • Compound 1 was dissolved in DMSO solution at 1 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, and the amount of DMSO was controlled to be the same (less than 1%) in each container under the solvent conditions used. Mg 2+ and ATP used were each 1 mM condition.
  • the horizontal axis represents the type of protein
  • the vertical axis represents the intensity of fluorescence for each type of protein.
  • Each experimental value was based on the average of three experiments conducted through the same experimental preparation process, the concentration of Compound 1 used was 100 ⁇ M and the amount of protein was 0.2 ⁇ g / mL.
  • the types of proteins indicated on the horizontal axis are as follows, wherein compound 1 is represented as Probe 1 in the table of FIG. 2:
  • Compound 1 showed the largest fluorescence intensity value (N) in the presence of PDGFRa kinase and the carriers Mg and ATP, and therefore Compound 1 has a significant binding affinity to PDGFRa It can be seen that it has.
  • the present inventors confirmed the degree of binding of Compound 1 to 96 kinase in order to confirm the selectivity of the kinase of Compound 1, the results are shown in FIG.
  • DiscoveRX (U.S.A)
  • U.S.A DiscoveRX
  • the company will keep all the information about the sample you ordered confidential and analyze it for euros.
  • Compound 1 was provided to the company, and the company provided the result after performing the KINOMEscan experiment (DiscoveRX corp.).
  • KINOMEscan is an experiment to determine how much of a competing substance binds to the active site of kinase after compound 1 and its competing substance (substances with strong binding for each kinase) are simultaneously treated with kinase.
  • the experimental values are given as percentile values, and the lower the percentile value, the stronger the binding to kinase.
  • Compound 1 has a selectivity for the five kinase, Compound 1 has a strong binding to PDGFRa kinase compared with the results of Example 4, it can be seen that the increase in fluorescence is induced Can be.
  • the present inventors confirmed the activity inhibiting ability of the compound 1 to the phosphatase derived in Example 4, the results are shown in FIG.
  • Example 3 kinase activity inhibition screening for Src kinase showing fluorescence increase in Example 3 together with the five kinase showing low percentile values in Example 4 was performed.
  • the experiment was performed by Reaction Biology Corp. (RBC, USA). The company also analyzes the euros, keeping all information about the samples it receives confidential.
  • IC 50 inhibitor concentration for 50% enzyme activity, measured by the concentration of the substrate 50% lower enzyme activity
  • IC 50 value for each kinase is given in Figure 4, according to the concentration of compound 1
  • the decrease in activity of the enzyme is given in the bottom graph of FIG. 4.
  • the horizontal axis of the graph is the log value of the compound 1 concentration, and the vertical axis represents the enzyme activity.
  • the IC 50 value was not given to the BRAF and PDGFRa enzymes in the table of FIG. 4, but this did not correspond to the data value in the graph formula (Reaction Biology Corp.) for obtaining the IC 50 value in the graph of FIG. 4. It does not mean that there is no activity inhibitory ability, the right reference value in the table represents the IC 50 value of the well-known kinase inhibitors [a] Staurosporine and [b] GW5074.
  • the present inventors confirmed under fluorescent light whether the compound 1 binds to the phosphatase under fluorescence, and the results are shown in FIG. 5.
  • the UV excitation device was WISE-UV WUV-L10 model, the solvent used and the experimental conditions were carried out in the same manner as in Example 3, the emission under the UV excitation (UV region excitation, 350 nm ⁇ 430 nm) device Fluorescence emission (fluorescence emission) was confirmed by photographing.
  • the present inventors confirmed the effect of increasing the fluorescence of the compound 1 according to the phosphorylase concentration, the results are shown in FIG.
  • Compound 1 showed stronger fluorescence signal intensity values at high concentrations of Src and PDGFRa.
  • the present inventors confirmed the effects of magnesium (Mg) and adenosine triphosphate (ATP), which are cofactors in compound 1 and phosphatase binding, and the results are shown in FIG. 7.
  • Mg magnesium
  • ATP adenosine triphosphate
  • the present inventors confirmed the degree of binding with a specific phosphatase according to the concentration of compound 1 by fluorescence intensity, and the results are shown in FIG. 8.
  • the concentration of kinase was fixed at 0.2 ⁇ g / mL, and the fluorescence intensity according to the concentration of Compound 1 was measured in the presence of Mg (1 mM) and ATP (1 mM), and solvent and other conditions were It proceeded similarly to Example 3.
  • the concentration of Compound 1 used in the experiment is 0 ⁇ M, 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M, 200 ⁇ M
  • Figure 10 (a) is the result for Src kinase
  • the present inventors treated well known kinase inhibitors with compound 1 to confirm the effect of the inhibitor on the kinase binding of compound 1, and the results are shown in FIG. 9.
  • six kinase is as follows; (A) ABL, (B) BRAF, (C) PDGFRa, (D) RSK2, (E) Src, (F) TYK2.
  • ABL ABL
  • BRAF BRAF
  • C PDGFRa
  • D PDGFRa
  • D RSK2
  • E Src
  • F TYK2.
  • the experiment was performed under a total of three conditions, and the solvent and basic conditions used in the experiment were performed in the same manner as in Example 3.
  • the leftmost black graph is the fluorescence intensity when only Compound 1 is present in the solvent, and the left graphs of Compounds A (100 ⁇ M) and phosphatase (0.2 ⁇ g / ml) in each of A to F are shown.
  • the middle graph is the fluorescence intensity including compound 1 (100 ⁇ M), kinase (0.2 ⁇ g / ml), Mg (1 mM) and ATP (1 mM), and the right graph is the inhibitor (Gleevec). , 100 ⁇ M) is further included.
  • FIG. 9 (b) shows A to F as shown in (a), in which case Compound 1 (100 ⁇ M) and ATP (1 mM) were used. ), Mg (1 mM) and phosphatase (0.2 ⁇ g / ml) were stirred for 24 hours (37 ° C.) followed by treatment with inhibitor (100 ⁇ M). After 24 hours of inhibitor treatment, the solution was further stirred (37 ° C), and in each of the A to F graphs, the left graph shows the fluorescence intensity before the inhibitor treatment, and the right graph shows the fluorescence intensity after the inhibitor treatment.
  • the compound 1 of the present invention can be used, the inhibitor having a strong binding force to the kinase to push the compound 1 and participate in the binding, which is the fluorescence intensity Since it appears to decrease, using Compound 1 can provide a criterion to easily determine the binding force between the kinase inhibitor and the kinase.
  • the present inventors confirmed the cytotoxicity of Compound 1 in B16F10 cells (rat skin melanoma cells) by CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo laboratories, Kumamoto, Japan) method, the results are shown in FIG.
  • B16F10 cells were incubated in 96-well plates at 96 cells / well density for 24 hours (37 ° C.) in air at 5% CO 2 conditions.
  • Compound 1 was treated with cells in 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M, 200 ⁇ M conditions in DMSO solvent, incubated for 1 hour, then treated with 10 ⁇ L of CCK-8 solution and incubated for 2 hours. Then, the presence of cytotoxicity was confirmed by observing absorption using a wavelength of 450 nm in a microplate reader (Multiskan EX, Thermo Eletron).
  • Compound 1 showed a cell viability of 90% or more for the concentration of 0 ⁇ 200 ⁇ M, through which the low cytotoxicity of Compound 1 was confirmed.
  • Example 12 Treatment of Compound 1 with Various Cancer Cells, and Identification of Fluorescence On
  • the present inventors injected Compound 1 into various cancer cells and confirmed the fluorescence on phenomenon using a one-photon and two-photon fluorescence microscope, and the results are shown in FIG. 11.
  • Each cell is Hyclone's Minimum Essential Medium with Earle's Balanced Salts (MEM / EBSS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (PS), phosphate Buffered saline (PBS), Trypsin-EDTA culture was incubated at 37 °C. The cultured cells were incubated at 37 ° C. for 24 hours to generate a cell number of about 1 ⁇ 10 5 again in a 12 mm glass coverslip.
  • MEM Minimum Essential Medium with Earle's Balanced Salts
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute medium
  • FBS fetal bovine serum
  • PS penicillin-streptomycin
  • PBS phosphate Buffered saline
  • Trypsin-EDTA culture was incubated at 37 °C. The cultured cells were incuba
  • the upper row of FIG. 11 is a bright field image
  • the middle row is the result of the photon fluorescence microscopy of the cells
  • the lower row is the result of the two-photon fluorescence microscope of the cells.
  • the horizontal and vertical lengths of the image are 170 ⁇ m, respectively, and the scale bar is 35 ⁇ m.
  • the present inventors treated Compound 1 with CT-26 cancer cells and confirmed the fluorescence emission wavelength using an optical fiber, and the results are shown in FIG. 12.
  • the fluorescence emission wavelength was confirmed by using an optical fiber.
  • the optical fiber was connected to a fluorescence microscope (Spectrofluorometer, FL1039, HORIBA), the excitation wavelength and emission wavelength range was the same as in Example 12, and the results of the fluorescence emission wavelength was confirmed.
  • the present inventors observed two-photon microscopy images before and after treatment with Compound 1 in the ears of skin cancer-implanted mice, and the results are shown in FIGS. 13 and 14.
  • B16F10 murine melanoma skin cancer
  • Compound 1 skin cancer
  • Mice were SPF / VAF immunodeficent treated with hairless Nude-mouse (BALB / c-nude mice, OrientBio corp.)
  • B16F10 cancer cells were prepared as in Example 12, using a centrifuge solution. The concentrated cancer cells were removed and injected into one ear of the rat using a syringe.
  • Compound 1 10 mM was injected after confirmation of the development of cancerous tissue in the rat's ear, and Compound 1 was also applied to the other ear (the normal tissue without cancerous tissue) without the cancer cells. Injected. After 30 minutes, the rats were respiratory anesthesia with 2.5% avertin (respiratory anesthesia), and cancer tissues and normal tissues were photographed using a two-photon fluorescence microscope. The excitation wavelength was 880 nm and 100 mW laser power was used.
  • each figure is 300 ⁇ m ⁇ 300 ⁇ m in size, and the scale bar shows 50 ⁇ m.
  • the bar graph on the right shows the intensity of the fluorescence signal.
  • (a, b, c) is a normal site where cancer cells are not injected, and (d, e, f) is a cancer tissue site where cancer cells are injected.
  • (a, d) is the result of two-photon fluorescence imaging without any injection
  • (b, e) is the result of 10 ⁇ L injection of PBS buffer solution containing no compound 1
  • (c, f) is the compound This is the result of injecting 10 ⁇ L of the solution containing 1.
  • Figure 14 is a graph showing the fluorescence intensity of the two-photon fluorescence microscope image taken in Figure 13, (A) normal tissue (a ⁇ c), cancer cells are not injected cancer cells (B) cancer tissue injected cancer cells This is the result at (d ⁇ f), and the vertical axis shows the fluorescence intensity.
  • the present inventors performed optical coherence tomography before and after the treatment of Compound 1 in the ear of a mouse transplanted with cancer, and the results are shown in FIG. 15.
  • Optical coherence tomography is a useful way of providing information about the thickness of tissue as the imaging is done on the side of the tissue, and tends to be thicker than those where cancer tissue is produced.
  • optical coherence tomography was performed on the site where the cancer was transplanted and the site where the cancer was not transplanted.
  • OCT optical coherence tomography
  • the OCT uses a custom-built wavelength swept source based on a polygonal wavelength filter and a semiconductor optical amplifier (BOA-5785, Covega).
  • the center wavelength is 1310 nm
  • the wavelength is 105 nm
  • the spectral resolution is 0.17. nm.
  • Images were obtained at 750 ⁇ m ⁇ 750 ⁇ m size.
  • A represents the upper epidermis of the ear
  • B represents the cartilage
  • C represents the lower epidermis of the rat
  • the scale bar bar represents 100 ⁇ m.
  • the sample does not have cancer tissue and has a thickness of about 180 ⁇ m
  • the sample in which the cancer exists has a thickness of about 250 ⁇ m. It was confirmed that thicker than normal tissue was formed.
  • the OCT result has an advantage in that it provides a background image capable of mixing data with the two-photon fluorescence microscope image performed in Example 14.
  • the inventors performed two-photon microscopy and optical coherence tomography before and after treatment with Compound 1 in the ear of a mouse transplanted with cancer, and the results are shown in FIG. 16.
  • a to f shown in FIG. 16 are the same experimental conditions as those in Example 14, and the two-photon fluorescence microscopy images described in Examples 14 and 15 are imaged in 3D with an optical coherence tomography result.
  • the scale bar bar represents 50 ⁇ m.
  • the fluorescent probe of the present invention can emit a fluorescent signal when combined with a tyrosine kinase as a small organic molecule, thereby overcoming the problems of the fluorescent probe having a complicated structure for detecting a conventional kinase, as well as cancer cells and the like. If the kinase involved in signaling is overexpressed compared to normal cells, the fluorescence is much brighter in cancer cells than normal cells, and thus can be effectively utilized for selective imaging of cancer cells or tissues in cells or tissues.

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Abstract

본 발명은 오쏘(ortho)-히드록시(hydroxy)-벤즈알데하이드(benzaldehyde) 구조를 포함하는 화합물을 이용한 타이로신 인산화효소(tyrosin kinase) 감지를 위한 형광 프로브 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 상기 화합물 또는 이의 유사체를 포함하는 타이로신 인산화효소 감지를 위한 형광 프로브, 및 이를 이용한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의한 형광 프로브는 간편하게 합성할 수 있고, 이광자 여기가 가능하며, 생체 내에서 안정성 및 낮은 세포 독성을 갖는 작은 분자(small molecule) 프로브로서, 타이로신 인산화효소와 결합하여 형광 변화를 나타낼 수 있어, 타이로신 인산화효소를 과발현하는 세포 또는 조직을 영상화할 수 있으므로, 이러한 조직의 영상화용 조성물 및 영상화 방법에 유용하게 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 타이로신 인산화효소를 과발현하는 암 세포 또는 조직에 결합하여 형광을 나타낼 수 있어, 암 세포 또는 조직의 영상화에도 유용하게 이용될 수 있다.

Description

타이로신 인산화효소를 감지하는 형광 프로브 및 이의 용도
본 발명은 타이로신 인산화효소를 선택적으로 감지하는 형광 프로브, 및 이의 용도에 관한 것이다.
인산화효소(Kinase enzyme)는 생체 내 신호 전달 체계를 조절하는 가장 중요한 효소이다. 단백질 인산화효소(protein kinase enzyme)는 ATP(adenosine 5'-triphosphate)의 γ-인산기를 특정 기질 단백질에 전달해 줌으로서 생체 내 신호 전달을 담당하고 있다. 단백질 인산화효소는 타이로신 인산화효소(tyrosine kinase)와 세린/트레오닌 인산화효소(serine/threonine kinase)로 구분되는데, 현재 500개 이상의 인산화 효소가 발견되었다(G. Manning et al, Science 2002, 298, 1912).
타이로신 인산화효소는 타이로신(tyrosine) 잔기의 수산화(-OH)기를 인산화시키고, 생체 내 신호전달 체계를 전담하는 역할을 한다. 이러한 인산화효소가 과발현 또는 돌연변이에 의해 과다활성화가 되면, 다양한 질환(암, 당뇨, 염증, 뇌질활 등)이 유발된다. 생체는 항상성을 유지하기 위하여 세포 신호전달체계의 켜짐과 꺼짐이 원활하게 반복되어야 하는데, 특정한 단백질 인산화효소의 과다 활성에 기인하여 신호전달이 조절되지 않고 계속되면 암과 같은 질환을 유발 한다(P. B. Jensen and T. Hunter, Nature 2001, 411, 355.). 따라서, 특정 인산화효소의 활성을 효과적으로 감지할 수 있는 분자 프로브는 암을 포함한 질병의 진단에 활용될 수 있기 때문에 매우 중요하다. 또한 이러한 분자 프로브는 과다 활성화된 특정 단백질 인산화효소의 활성을 억제하는 작용기전을 갖는 약물탐색에 활용되므로 신약개발에서 매우 중요한 위치를 차지한다.
이러한 단백질 인산화효소의 존재, 과발현 및 그 활성 여부를 측정하는 방법으로 일련의 계가 알려져 있으나, 그 분석 과정이 복잡할 뿐 아니라, 직접적으로 인산화 효소를 감지하는 것이 아닌 ATP와 같이 인산화 과정에 관여하는 화합물을 감지하는 간접적인 방법이다. 그 가운데서도 형광 분자 프로브(fluorescent molecular probe)는 간편하면서 높은 감도로 인산화효소의 활성을 감지할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
기존의 인산화효소 형광 프로브는 구조적으로 매우 복잡하다. 즉, 인산화효소가 인식할 수 있는 펩타이드(peptide) 사슬에 형광단을 도입한 구조인데, 문제는 효소가 이 사슬과 상호 작용할 때 형광 변화를 줄 수 있도록 적절한 형광단의 선택과 그것을 공간적으로 배치하는 것이 매우 어려운 과제이다.
현재까지 보고된 단백질 인산화 효소의 활성을 측정할 수 있는 형광 프로브는 언급하였듯이 효소가 인지할 수 있는 타이로신 잔기를 가지는 펩타이드 사슬을 가지고 있으며, 많은 경우에 란탄족 금속 착물 또는 복잡한 구조의 유기 형광단을 포함하고 있다(Chen. C. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 124, 3840; Zondlo. S. C. et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 5619; Agnes. R. S. et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 6075; Rhee. H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 4919; Vaasa. A. et al., Biochemistry and Biophysical Research Communication. 2010, 397, 750; Xu. X. et al., Anal. Chem. 2011, 83, 52; Appelblom. H. et al., Microchim. Acta. 2011, 172, 25; Herbst. K. J. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 5676; Seong. J. Nat. Comm. 2011, DOI:10.1038/ncomms1414; Lawrence. D. S. ChemBioChem. 2007, 8, 373; Tremblay. M. S. et al., Org. Lett. 2008, 10, 5; Sahoo. H. et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15927; Akiba. H. et al., Chem. Eur. J. 2010, 16, 5018; Shults. M. D. et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14248; Kikuchi. K. et al., Org. Lett. 2009, 11, 2732; Ojida. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 2454; Wang. Q. et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 7684; Sharma. V. et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 2742).
또한, 타이로신 인산화 효소를 감지하는 기존의 형광 프로브들은 효소를 인식하는 펩타이드 기질을 포함할 뿐 아니라, 효소를 인식할 때 형광 신호를 주기 위한 복잡한 구조의 발광단까지 포함하므로, 그 분자량이 크고 합성과정이 복잡하며 무엇보다도 세포 또는 조직 내의 인산화 효소를 감지할 경우에는 안정성 및 다른 화합물에 의한 간섭 등이 우려되므로 실질적으로 그 활용에는 한계를 가지고 있다.
작은 분자로서 특정 인산화효소와 만나 형광을 발하는 프로브는 그 중요성에도 불구하고 여전히 매우 도전적인 과제로 남아있으며, 현재까지 직접적으로 인산화 효소의 존재, 과발현 유무 또는 활성 여부를 감지할 수 있는 것은 현재까지 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 합성이 비교적 용이하고, 생체 내에서 높은 안정성 및 낮은 세포 독성을 갖는 작은 분자 프로브로서, 세포 내에서 타이로신 인산화 효소와 상호작용하여 형광을 발하는 획기적인 형광 프로브를 개발하였다. 이 형광 프로브는 이광자 여기(two-photon excitation)도 가능하기 때문에 여러 가지 장점(깊은 조직 투과도, 낮은 조직 자체로부터의 형광 간섭, 높은 해상도, 낮은 세포 손상 등)을 가진다. 개발된 형광 프로브는 암 세포에 존재하는 특정 인산화효소와 결합하여 형광 변화를 나타낼 뿐 아니라, 암 조직에 선택적으로 결합하여 형광을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 형광 프로브가 타이로신 인산화효소를 과발현하는 세포 또는 조직의 영상화, 및 암 세포 또는 조직의 영상화에 이용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 오쏘(ortho)-히드록시(hydroxy)-벤즈알데하이드(benzaldehyde) 구조를 포함하는 화합물을 이용한 타이로신 인산화효소 감지를 위한 형광 프로브, 이를 이용한 타이로신 인산화효소 저해제 탐색 방법, 타이로신 인산화효소 활성 측정 방법, 및 일광자 또는 이광자 세포 영상화 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형광 프로브를 포함하는 타이로신 인산화효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형광 프로브를 포함하는 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직을 영상화할 수 있는 조성물, 및 영상화 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 유사체(analogues)를 이용한 타이로신 인산화효소(tyrosine kinase) 감지를 위한 형광 프로브를 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2014001948-appb-I000001
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화합물은 오쏘(ortho)-히드록시(hydroxy)-벤즈알데하이드(benzaldehyde) 구조를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 화합물은 타이로신 인산화효소와 결합하여 오쏘-히드록시-벤즈알데하이드의 분자 내 수소결합(intra-molecular hydrogen-bonding)이 깨어질 때 형광을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 타이로신 인산화효소는 ABL1(T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2 및 Src로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 이용한 타이로신 인산화효소 저해제 탐색 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 이용한 타이로신 인산화효소 활성 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 이용한 일광자 또는 이광자 세포 영상화(imaging) 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 포함하는, 타이로신 인산화효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 포함하는, 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직의 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 이용하여 세포 또는 조직 내 형광을 측정하는 단계를 포함하는 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직의 영상화(imaging) 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 형광을 측정하는 단계는 공초점 형광 현미경, 이광자 형광 현미경, 광간섭성 단층 촬영기, 및 이광자 형광 현미경 및 광간섭성 단층 촬영기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 형광 프로브는 이광자 여기 특성을 가진다. 즉, 일광자(one-photon) 형광 프로브의 절반에 해당하는 파장의 에너지(또는 두 배에 해당하는 파장)를 이용해 들뜬 상태(excited state)로 여기(excitation) 시키는 특성으로 인하여 깊은 세포 투과성, 낮은 세포 파괴성, 생체 내 헤모글로빈 등에 의한 소광 등에 영향을 적게 받을 뿐 아니라, 초점 부위만 여기 시키므로 매우 높은 해상도를 구현할 수 있는 장점을 가진다.
도 1은 화합물 1의 흡수 및 형광 그래프를 나타낸 결과이다.
도 2는 화합물 1의 단백질 결합 선택성을 형광 세기를 측정하여 확인한 결과이다.
도 3은 화합물 1의 96개 인산화 효소와의 결합 선택성을 확인한 결과이다.
도 4는 화합물 1과 결합 선택성이 있음을 확인하여 최종 선택된 6개의 인산화 효소에 대한 화합물 1의 활성 저해 능력 측정 결과이다.
도 5는 화합물 1이 PDGFRa 인산화 효소와 결합하여 형광을 나타냄을 확인한 사진이다.
도 6은 화합물 1과 결합하는 특정 인산화 효소의 농도에 따른 영향을 형광 세기로 나타낸 그래프이다.
도 7은 화합물 1과 특정 인산화 효소의 결합에 있어, 보인자(co-factor)인 마그네슘(Mg)과 아데노신 삼인산(ATP)의 영향을 형광 세기로 나타낸 그래프이다.
도 8은 화합물 1의 농도에 따른 특정 인산화 효소와의 결합 정도를 형광 세기로 나타낸 그래프이다.
도 9는 화합물 1의 인산화 효소 결합에 대한 저해제(kinase inhibitor)의 영향을 형광 세기로 나타낸 그래프이다.
도 10은 화합물 1의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 11은 다양한 암세포에 화합물 1을 처리한 후의 형광 켜짐 현상을 일광자 및 이광자 형광 현미경을 이용하여 관찰한 결과이다.
도 12는 화합물 1을 처리한 CT-26 암세포에서 광섬유를 이용하여 형광 방출 파장을 확인한 결과이다.
도 13은 화합물 1을 처리한 후 이광자 형광 현미경을 통하여 쥐에 이식된 피부암 조직을 촬영한 결과이다.
도 14는 도 12에서 촬영된 이광자 형광 현미경 영상의 형광 세기를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15은 화합물 1을 처리하기 전과 후의 피부암 조직을 광간섭성 단층 촬영기(OCT, Optical Coherence Tomography)를 통하여 촬영한 결과이다.
도 16은 화합물 1을 처리한 후 피부암 조직과 일반 조직을 이광자 전자 현미경과 광간섭성 단층 촬영기를 이용하여 동시에 촬영하여 3D 영상으로 나타낸 결과이다.
본 발명자들은 타이로신 인산화 효소를 세포 내 또는 조직에서 간편하게 감지할 수 있는 형광 분자 프로브를 개발하고자 예의 노력하였으며, 타이로신 인산화 효소 반응에서 아릴 히드록실 기가 반응에 참여하는 것에 착안하여 히드록실 기가 효소와의 결합, 즉 수소결합을 할 때 광학적 성질에 변화를 가져올 수 있는 분자 프로브를 고안하고, 그 분자 프로브가 특정 인산화 효소와 결합하여 형광 변화를 유발할 수 있음에 착안하여 본 발명의 형광 프로브를 개발하게 되었다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 유사체(analogues)를 이용한 타이로신 인산화효소(tyrosin kinase) 감지를 위한 형광 프로브를 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2014001948-appb-I000002
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화합물은 오쏘(ortho)-히드록시(hydroxy)-벤즈알데하이드(benzaldehyde) 구조를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 화합물은 타이로신 인산화효소와 결합하여 오쏘-히드록시-벤즈알데하이드의 분자 내 수소결합(intra-molecular hydrogen-bonding)이 깨어질 때 형광을 나타내는 것이 바람직하다.
또한, 상기 타이로신 인산화효소는 ABL1(T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2 및 Src로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 개발된 상기 화학식 1의 화합물에서 3번 위치 하이드록시(-OH) 작용기는 2번 위치 알데하이드(-CHO) 작용기와 분자 내 수소결합 (intramolecular hydrogen bonding)을 형성하고 있는데, 이 상태에서는 형광을 내지 않지만, 특정 타이로신 인산화 효소와 결합을 할 때는 분자 내 수소결합이 깨어지고 인근 효소의 작용기와 분자 간 수소결합을 하여 발광을 하는 특이한 발광 특성을 나타내게 된다. 또한, 본 발명의 이광자 형광 프로브가 6개 인산화효소(ABL1(T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2 및 Src)에 결합하여 형광을 증가시킴을 확인함으로써, 상기 프로브가 인산화효소의 존재 및 활성 여부를 손쉽게 확인할 수 있음을 알 수 있다(도 2 내지 도 7 참조). 이러한 특성은 전자주게-전자받게 구조의 형광단의 특성에 분자 내 수소결합을 도입함으로써 구현될 수 있었다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 이용한 타이로신 인산화효소 저해제 탐색 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 이용한 타이로신 인산화효소 활성 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 이용한 일광자 또는 이광자 세포 영상화(imaging) 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에서 개발된 상기 화학식 1의 화합물을 형광 프로브로 이용하였을 때, 인산화효소 선택적 결합성(binding affinity for kinases) 및 인산화효소 활성 저해 능력(inhibition property for kinases)이 있음을 확인하였으며, 이를 통해, 본 발명의 형광 프로브가 인산화효소(ABL1(T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2 및 Src)에 결합하여 형광을 증가시킴으로써, 인산화효소의 존재 및 활성 여부를 확인하는 방법, 저해제 탐색 방법, 및 세포 영상화 방법에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다(도 2 내지 도 11 참조).
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 포함하는 타이로신 인산화효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 타이로신 인산화효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 상기 본 발명의 형광 프로브를 단독으로, 또는 상기 형광 프로브 및 약물 후보 물질을 함께 타이로신 인산화효소를 반응시키는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 형광을 검출하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 검출된 형광을 비교하여 약물 후보 물질과 타이로신 인산화효소의 결합력을 평가하는 단계.
이때, 본 발명의 형광 프로브와 약물 후보 물질을 타이로신 인산화효소와 함께 반응시킨 경우의 형광 정도가 형광 프로브를 단독으로 처리한 경우의 형광과 비교하여 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 타이로신 인산화효소의 과다발현을 억제하는 약물로서 판단할 수 있다.
상기 형광을 검출하는 단계는 공초점 형광 현미경, 이광자 형광 현미경, 광간섭성 단층 촬영 장치, 및 이광자 형광 현미경 및 광간섭성 단층 장치로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약물 후보 물질은 각종 화합물, 단백질, 및 핵산일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 포함하는 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직의 영상화용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 프로브를 이용하여 세포 또는 조직 내 형광을 측정하는 단계를 포함하는 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직의 영상화(imaging) 방법을 제공한다.
상기 타이로신 인산화 효소 과발현 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 형광을 측정하는 단계는 공초점 형광 현미경, 이광자 형광 현미경, 광간섭성 단층 촬영 장치, 및 이광자 형광 현미경 및 광간섭성 단층 장치로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에서 개발된 상기 화학식 1의 화합물을 형광 프로브로 이용하여 형광 특성 확인(photophysical properties), 인산화효소 선택적 결합성(binding affinity for kinases), 인산화효소 활성 저해능력(inhibition property for kinases), 양성자핵자기공명 연구(NMR study), 일광자 암세포 이미징(one-photon confocal microscopy imaging for cancer cell lines), 이광자 암세포 이미징(two-photon microscopy imaging for cancer cell lines), 이광자 현미경 및 오씨티(optical coherence tomography) 현미경을 이용한 인 비보 이광자 암 조직 이미징(in vivo two-photon microscopy and OCT imaing for mouse tumor model) 등을 수행하였으며, 이를 통해 본 발명의 형광 프로브가 타이로신 인산화효소를 과발현하는 암 조직에 선택적으로 형광 켜짐 현상(fluorescence turn-on)을 나타냄을 확인하였다(도 1 내지 도 16 참조).
따라서, 본 발명의 형광 프로브는 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직의 영상화를 위한 조성물, 및 영상화 방법에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 영상화용 조성물 내의 유효성분으로서 상기 형광 프로브의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태 등에 의하여 적절하게 조정할 수 있으며, 1 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 5 내지 10 mg/kg, 가장 바람직하게는 10 mg/kg일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 영상화용 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 화합물 1의 합성 및 구조 분석
본 발명자들은 타이로신 인산화 효소 반응에서 아릴 히드록실 기가 반응에 참여하는 것에 착안하여, 히드록실 기가 효소와의 결합, 즉 수소결합을 할 때 광학적 성질에 변화를 가져올 수 있는 분자 프로브를 개발하기 위하여, 하기 도식 1에 따라 화학식 1의 화합물을 합성하게 되었다:
[도식 1]
Figure PCTKR2014001948-appb-I000003
(1) 7-(다이메틸아미노)나프탈렌-2-올 (7-(dimethylamino)naphthalen-2-ol)(상기 도식 1에서 5번 화합물)의 합성
본 발명자들은 7-(다이메틸아미노)나프탈렌-2-올; 7-(dimethylamino) naphthalen-2-ol 의 합성을 수행하였다.
합성 출발 물질인 4번 화합물(3 g, 18.7 mmol, Sigma-aldrich, D116408)과 소디움 메타바이설파이트 (Na2S2O5, 7.11 g, 37.4 mmol)가 들어있는 밀폐용기(sealed-tube)에 물(H2O, 8 mL)과 다이메틸아민 수용액(dimethylamine solution, 40% in H2O, 10.5 mL, 93.5 mmol)을 첨가하고 용기를 막았다. 이 혼합물을 실리콘 오일 용기를 이용하여 150 ℃에서 8 시간 교반시켰다. 다음에 상온(25 ℃)으로 반응물의 온도를 낮춘 후 용기를 열어 다이클로로메탄(dichloromethane, 100 mL), 물(100 mL), 포화 소금물(30 mL)을 넣고 분별 깔때기를 이용하여 유기층을 추출했다. 유기층을 무수황산나트륨 (Na2SO4, 5 g)으로 건조하고, 흡기기(aspirator)를 이용(25 ℃, 20~500 mmHg)하여 농축했다. 이렇게 얻어지는 옅은 갈색의 고체 화합물은 실리카겔(silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 이용한 관 크로마토그래피(column chromatograph, 직경 6 cm, 높이 15 cm)를 이용하여 분리(전개 액: 20% EtOAc/Hexane)하여 흰색의 고체 화합물 5(2.10 g, 60%)를 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피(TLC, thin layer chromatography, silical gel 60F-254 glass plate, Merck)로 분석하면 Rf = 0.25(20% EtOAc/Hexane - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 7.66-7.59(m, 2H), 7.05-7.02(m, 1H), 6.96-6.95(d, 1H), 6.85-6.82(m, 1H), 6.78-6.77(d, 1H), 5.10(s, 1H), 3.05(s, 6H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ153.88, 149.17, 136.24, 129.39, 128.61, 122.44, 114.22, 113.80, 108.02, 105.32, 40.91. HRMS: m/z calcd. for C12H13NO 187.0997 found 187.0999.
(2) 7-(메톡시메톡시)-N,N-다이메틸나프탈렌-2-아민(7-(methoxymethoxy)-N,N-dimethylnaphthalen-2-amine)(상기 도식 1에서 6번 화합물)의 합성
본 발명자들은 7-(메톡시메톡시)-N,N-다이메틸나프탈렌-2-아민 (7- (methoxymethoxy)-N,N-dimethylnaphthalen-2-amine)의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 디엠에프 (DMF, N,N-dimethylformamide, 5 mL) 용매에 소디움 하이드라이드 (NaH, sodium hydride, 235 mg, 5.875 mmol)를 넣고 아르곤(argon) 풍선을 꽂아 준 후, 포화 소금물과 얼음을 이용하여 -15℃로 온도를 낮추어 주었다. 이 혼합 용액에 5번 화합물 (1 g, 5.34 mmol)를 DMF (5 mL)에 녹인 후, 온도를 유지한 상태에서 약 5분간 서서히 한 방울씩 넣어주었다. 이 과정에서 H2 gas가 발생하게 되는데, 이것은 실리콘오일 트랩 (silicon oil trap)을 거친 후 옥외로 배출시켰다. 동일한 온도에서 1시간 교반시킨 후, 트랩에서 방울(H2 gas)이 더 이상 발생하지 않는 것을 확인하였다. 이어서, 클로로메틸 메틸 에테르 (chloromethyl methyl ether, 0.4 mL, 5.34 mmol)를 약 5분간 서서히 한 방울씩 넣어주었다. 주입이 완료되면, 온도를 상온 (25 ℃)으로 바꾸어주고, 6시간을 교반시켰다. 6시간 후, 물(100 mL)를 넣어주고, 에틸아세테이트(EtOAc, 200 mL)를 이용하여 추출을 수행하였다. 추출된 유기층(EtOAc)은 무수황산나트륨(10 g)으로 유기층 내 존재하는 물을 건조하였다. 건조된 에틸아세테이트 유기층은 흡기기를 이용해 농축하였다. 이렇게 얻어진 옅은 갈색의 액체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피 (직경 6 cm, 높이 15 cm)방법을 통하여 분리(전개 액: 5% EtOAc/Hexane)하며, 흰색의 고체 6번 화합물(988 mg, 80%)을 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf = 0.45(20% EtOAc/Hexane - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 7.75(d, 1H), 7.72(d, 1H), 7.40-7.39(d, 1H), 7.15-7.08(m, 2H), 6.98-6.97(d, 1H), 5.39(s, 2H), 3.69(s, 3H), 3.11(s, 6H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ 155.75, 149.16, 136.23, 129.11, 128.55, 123.00, 114.99, 114.58, 108.69, 105.96, 94.62, 56.07, 40.83. HRMS: m/z calcd. for C14H17NO2 231.1259 found 231.1262.
(3) 6-(다이메틸아미노)-3-(메톡시메톡시)-2-나프트알데하이드 (6-(dimethylamino)-3-(methoxymethoxy)-2-naphthaldehyde) 의 합성
본 발명자들은 6-(다이메틸아미노)-3-(메톡시메톡시)-2-나프트알데하이드 (6-(dimethylamino)-3-(methoxymethoxy)-2-naphthaldehyde) (상기 도식 1에서 7번 화합물) 의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 100 mL 라운드 바텀 플라스크 (round-bottom flask)에 6번 화합물 (2.2606 g, 9.774 mmol)을 넣은 후, 아르곤 풍선을 꽂아주었다. 이어서 에틸 에테르(Et2O, 50 mL)을 넣어주고, 포화된 소금물과 얼음을 이용하여 온도를 -20 ℃로 낮추었다. 온도 확인 후, 3차 부틸리튬 (tert-BuLi, 8.6 mL, 14.66 mmol)을 약 30분에 걸쳐 서서히 한 방울씩 넣어주었다. 이때 색깔은 서서히 짙은 갈색으로 바뀌며, 주입이 완료되면 같은 온도에서 2시간을 교반시켰다. 2시간 교반 후, DMF (1.3 mL, 16.62 mmol)를 약 5분에 걸쳐 서서히 한 방울씩 넣어주었다. 주입이 완료되면 동일한 온도에서 1시간을 교반하며, 이때 색깔은 점차 밝은 노란색으로 변했다. 1시간 교반 후, 4N HCl (10 mL)와 1차 증류수(10 mL)를 넣어주고 10분간 교반했다. 10분 후, EtOAc (300 mL)와 포화 소금물(100 mL), 물(200 mL)를 이용하여 추출과정을 수행했다. 추출을 통해 얻어진 유기층(EtOAc)은 무수황산나트륨(15 g)으로 유기층 내 존재하는 물을 건조하고, 흡기기를 이용하여 농축했다. 이렇게 얻어지는 밝은 노란색의 고체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피 (직경 6 cm, 높이 15 cm)방법을 이용하여 분리(전개 액: 20% EtOAc/Hexane)하여 밝은 노란색의 고체 7번 화합물(1.27 g, 50%)을 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf = 0.25(20% EtOAc/Hexane - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 10.49(s, 1H), 8.25(s, 1H), 7.75-7.73(d, 1H), 7.29-7.24(d, 1H), 7.05-7.03(dd, 1H), 6.77-6.76(d, 1H), 5.40(s, 2H), 3.59(s, 3H), 3.12(s, 6H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ 189.61, 155.99, 150.71, 139.74, 131.16, 130.89, 122.26, 121.29, 114.76, 107.66, 104.30, 94.75, 56.39, 40.32. HRMS: m/z calcd. for C15H17NO3 259.1208 found 259.1211.
(4) 6-(다이메틸아미노)-3-하이드록시-2-나프트알데하이드 6-(dimethylamino)-3-hydroxy-2-naphthaldehyde(화학식 1의 화합물) 의 합성
본 발명자들은 6-(다이메틸아미노)-3-하이드록시-2-나프트알데하이드(6-(dimethylamino)-3-hydroxy-2-naphthaldehyde)의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 25 mL 라운드 바텀 플라스크에 7번 화합물 (195 mg, 0.75 mmol)와 아이소프로필 알콜(isopropyl alcohol, 10 mL), 5M HCl (5 mL)를 넣어준 후 60 ℃에서 3시간을 교반시켰다. 3시간 후, 상온으로 플라스크를 식힌 후 아이소프로필 알콜은 흡기기에서 제거하고, 에틸 아세테이트(100 mL)와 물(100 mL)를 이용하여 추출과정을 수행했다. 추출을 통해 얻어진 유기층(EtOAc)은 무수황산나트륨 (3 g)으로 유기층 내 존재하는 물을 건조하고, 흡기기를 이용하여 농축했다. 이렇게 얻어지는 노란색의 고체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피(직경 2 cm, 높이 15 cm)방법을 이용하여 분리(전개 액: 20% EtOAc/Hexane)하여 노란색의 화학식 2의 화합물(113 mg, 70%)을 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf = 0.35(20% EtOAc/Hexane - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K): δ 10.54(s, 1H), 9.89(s, 1H), 7.90(s, 1H), 7.70-7.67(d, 1H), 7.02-6.98(m, 2H), 6.66-6.65(d, 1H), 3.13(s, 6H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, 293K): δ 195.26, 156.83, 151.39, 140.62, 137.75, 130.87, 120.63, 119.03, 114.18, 108.73, 103.22, 40.26. HRMS: m/z calcd. for C13H13NO2 215.0946 found 259.0946.
이때, 본 발명에서 개발된 상기 화학식 1의 화합물을 화합물 1이라 명명하였다.
실시예 2. 화합물 1의 흡수 및 형광 특성 확인
본 발명자들은 다양한 용매 조건하에서 화합물 1의 흡수 및 형광 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
본 발명자들은 완충용액(pH 7.5 10 mM HEPES buffer)에서 화합물 1의 흡수 및 형광 그래프를 측정하였다. 흡수 스펙트럼(UV/Vis absorption spectra) 분석을 위해서는 HP 사의 UV/Vis spectrophotometer를 사용하였고, 형광 스펙트럼 (fluorescence spectra) 분석을 위해서는 PTI 사의 Photon Technical International Fluorescence System을 사용하였다. 사용되었다. 이때, 각 기기에 화합물 1을 넣어주는 cell은 1 cm 두께의 standard quartz cell을 이용하였다.
도 1에 화합물 1 과 함께 비교물질로 화합물 5를 나타내었으며, 이때 화합물 5는 화합물 1의 -OH에 알킬(alkyl)을 도입하여 분자내 수소결합을 제거한 비교 물질이다.
그래프 (a)와 (b)는 pH 7.5 10 mM HEPES buffer 용매 조건하에서 화합물 5와 화합물 1의 흡수 및 형광 그래프를 각각 나타낸 것으로, HEPES buffer 용매 조건하에서 흡수 스펙트럼(a)은 두 물질 모두 390 nm에서 최고 흡수 값을 가졌다. 하지만, 형광 스펙트럼(b)에서 살펴보면 화합물 5는 550nm에서 강한 형광을 방출하는 반면, 화합물 1은 형광을 보이지 않는다.
실시예 3. 화합물 1의 단백질 결합 선택성 확인
본 발명자들은 화합물 1의 단백질 결합 선택성을 형광 변화를 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
구체적으로, 화합물 1이 인산화효소에 선택적으로 결합하는지의 여부를 확인하기 위하여, 다양한 단백질(인산화효소 포함)을 이용하여 그 형광 변화 여부를 확인하였다. 실험에 사용된 용매로는 완충용액(100mM HEPES buffer, pH 7.4)을 사용하였고, 인산화효소는 Carna Biosciences 사의 제품을 사용하였으며, 각 인산화효소는 제조사에서 제공한 용매(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 % CHAPS, 1 mM DTT, 10% Glycerol, pH 7.5)와 함께 -80℃에서 보관하였다. 사용된 ATP 및 MgCl2는 Sigma 사의 제품이며, 글리벡(Gleevec, 인산화효소 저해제)은 Selleck Chemicals 사의 제품을 사용하였다. 형광 관측 시 사용된 플레이트(plate)는 96-well fluorescence assay plate (SPL life science 사)이며, 관측 장비는 VCITOR 3 multilabel counter (Perkin Elmer-Wellesley 사)를 이용하였다. 관측장비의 여기파장(excitation wavelength)으로는 355nm 필터가, 방출파장(emission wavelength)으로는 535nm 필터가 사용되었다. 교반(Incubation)은 NB-205Q model (N-BIOTEK 사)가 사용되었으며, 37℃에서 24 시간 동안 170 rpm의 진동(shaking)으로 진행되었다. 화합물 1은 1 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM으로 DMSO 용액에 녹여 사용되었으며, 최종 사용되는 용매 조건에서 DMSO의 양이 각 용기별 동일하도록 통제되었다(1% 미만). 사용된 Mg2+ 및 ATP는 각각 1 mM 조건이다.
도 2의 그래프에서 가로축은 단백질의 종류를 나타낸 것이며, 세로축은 각 단백질의 종류별 형광의 세기를 나타낸 것이다. 각 실험값은 동일한 실험 준비 과정을 통하여 실시된 3번의 실험 평균값을 기본으로 하였으며, 사용된 화합물 1의 농도는 100 μM이며, 단백질의 양은 0.2 μg/mL이다. 가로축에 표시한 단백질의 종류는 다음과 같으며, 이때, 화합물 1은 도 2의 표에서 Probe 1로 표시하였다:
(A) Probe 1;
(B) Probe 1 with Mg and ATP;
(C) Probe 1 with BSA;
(D) Probe 1 with TEV;
(E) Probe 1 with Lysozyme;
(F) Probe 1 with Creatine kinase;
(G) Probe 1 with ABL(E255K);
(H) Probe 1 with ABL(E255K), Mg and ATP;
(I) Probe 1 with ABL(T315I);
(J) Probe 1 with ABL(T315I), Mg and ATP;
(K) Probe 1 with BRAF;
(L) Probe 1 with BRAF, Mg and ATP;
(M) Probe 1 with PDGFRa;
(N) Probe 1 with PDGFRa, Mg and ATP;
(O) Probe 1 with RSK2;
(P) Probe 1 with RSK2, Mg and ATP;
(Q) Probe 1 with Src;
(R) Probe 1 with Src, Mg and ATP;
(S) Probe 1 with TYK2;
(T) Probe 1 with TYK2, Mg and ATP.
그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 화합물 1은 PDGFRa 인산화 효소와 보인자인 Mg과 ATP가 존재하는 (N)에서 가장 큰 형광 세기 값을 보였으며, 따라서 화합물 1은 PDGFRa에 상당한 결합력(binding affinity)을 가짐을 알 수 있다.
이 외에 Src 인산화효소에 보인자가 존재하는 (R)에서도 감응하였으며, 이를 통해 화합물 1이 암세포에 다량 존재하는 PDGFRa 및 Src 인산화효소에 선택적으로 결합하여 형광 세기가 증가함을 알 수 있다.
실시예 4. 화합물 1의 96개 인산화 효소에 대한 선택성 확인
본 발명자들은 화합물 1의 인산화 효소에 대한 선택성을 확인하기 위하여 96개 인산화 효소에 대한 화합물 1의 결합 정도를 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
구체적으로, 다양한 종류의 인산화효소에 대한 선택성을 확인하기 위하여 총 96개의 인산화효소에 대한 결합력을 확인할 수 있는 DiscoveRX 사(U.S.A)의 KINOMEscan 실험을 의뢰하여 수행하였다. 이 업체는 의뢰한 시료에 대한 일체의 정보를 비밀로 유지하며 유로 분석해 준다. 화합물 1을 업체에 제공하고, 업체에서는 KINOMEscan 실험을 수행 후 그 결과를 제공하였다 (DiscoveRX corp.)
KINOMEscan은 화합물 1과 그 경쟁이 되는 물질(인산화효소별 강한 결합을 가진 물질)을 동시에 인산화효소에 처리한 후 화합물 1 에 비하여 경쟁되는 물질이 얼마나 인산화효소의 활성부위에 결합하는지를 확인하는 실험으로, 실험값은 백분위 값으로 주어지고, 백분위 값이 낮을수록 인산화효소와의 강한 결합이 이루어지고 있음을 뜻한다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 총 96개 인산화효소 중 50개 이상의 인산화효소와 결합이 이루어지고 있음을 알 수 있었으며, 특히 ABL1(T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2에서 낮은 값을 보임을 확인하였다.
이를 통해, 화합물 1이 상기 5종의 인산화효소에 대한 선택성을 가짐을 알 수 있으며, 상기 실시예 4의 결과와 비교하여 화합물 1은 PDGFRa 인산화효소에 대해 강한 결합을 가지고, 형광 증가가 유발됨을 알 수 있다.
실시예 5. 화합물 1의 인산화 효소에 대한 활성 저해능력 확인
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 도출된 인산화 효소에 대한 화합물 1의 활성 저해 능력을 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
구체적으로, 상기 실시예 4에서 낮은 백분위 값을 보인 5종의 인산화효소와 더불어 상기 실시예 3에서 형광증가를 보인 Src 인산화효소에 대한 효소 활성 저해능력 실험 (kinase activity inhibition screening)을 수행하였으며, 본 실험은 Reaction Biology Corp.(RBC, U.S.A)에 의뢰하여 수행되었다. 이 업체도 의뢰한 시료에 대한 일체의 정보를 비밀로 유지하며 유로 분석을 해준다.
실험값은 IC50 (inhibition concentration for 50% enzyme activity, 효소의 활성이 50% 떨어지는 기질의 농도 측정) 값으로 주어지고, 각 인산화효소 별 IC50 값은 도 4에 주어졌으며, 화합물 1의 농도에 따른 효소의 활성 감소는 도 4의 하단 그래프에 주어졌다. 그래프의 가로축은 화합물 1 농도의 로그값이며, 세로축은 효소 활성을 나타낸다.
그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, IC50 실험을 통하여 화합물 1이 6종의 인산화효소의 활성부위에 결합하여 효소 활성을 감소시킴을 확인하였다.
이때, 도 4의 표에서 BRAF 및 PDGFRa 효소에 대해서는 IC50 값이 주어지지 않았지만, 이것은 도 4의 그래프에서 IC50 값을 얻기 위한 그래프 공식(Reaction Biology Corp.)에 데이터 값이 맞아 떨어지지 않았음을 뜻하지, 활성 저해 능력이 없음을 나타내는 것은 아니며, 표의 우측 reference 값은 잘 알려진 인산화효소 저해제 (kinase inhibitor)인 [a]Staurosporine과 [b]GW5074의 IC50 값을 나타낸 것이다.
실시예 6. 화합물 1과 인산화 효소 결합에 따른 형광 켜짐 촬영
본 발명자들은 화합물 1이 인산화 효소에 결합함에 따라 형광 켜짐 현상이 나타나는지 자외선 하에서 확인하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
구체적으로, 자외선 여기 장치는 WiseUV 사의 WUV-L10 모델을 이용하였고, 사용된 용매 및 실험 조건은 상기 실시예 3과 동일하게 진행하였으며, 자외선 여기 (UV region excitation, 350 nm ~ 430 nm) 장치 하에서 방출되는 형광 방출(fluorescence emission)을 사진촬영으로 확인하였다.
그 결과, 화합물 1만 존재하는 경우와 비교하여 화합물 1에 PDGFRa와 보인자인 ATP, Mg을 첨가하고 24시간 37℃에서 교반시킨 경우 강한 형광을 보임을 확인하였다.
실시예 7. 인산화 효소 농도에 따른 화합물 1의 형광 증가 영향 확인
본 발명자들은 인산화 효소 농도에 따른 화합물 1의 형광 증가 영향을 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
구체적으로, 화합물 1 (100 μM)와 인산화효소 Src, PDGFRa 가 각각 0.2 μg, 1 μg을 사용하였고, 사용된 용매 및 실험 조건은 실시예 3과 동일하게 진행하였으며, 인산화 효소의 농도를 변화시키며 화합물 1과의 결합 후 형광신호 세기 증가를 관찰하였다.
그 결과, 화합물 1은 Src 및 PDGFRa의 높은 농도에서 더욱 강한 형광 신호세기 값을 보임을 확인하였다.
실시예 8. 화합물 1과 인산화 효소 결합에 대한 보인자 영향 확인
본 발명자들은 화합물 1과 인산화 효소 결합에서 보인자인 마그네슘 (Mg)과 아데노신 삼인산 (ATP)의 영향을 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
구체적으로, 사용된 용매 및 실험 조건은 상기 실시예 3과 동일하게 진행하였으며, 도 7의 그래프에서 A는 화합물 1 (100 μM)만 존재, B는 화합물 1에 Mg(1 mM)을 첨가해 준 경우, C는 화합물 1에 ATP(1 mM)을 첨가해준 경우, D는 화합물 1에 Mg(1 mM)와 ATP(1 mM)를 동시에 처리해 준 경우를 나타낸다.
그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, Src와 PDGFRa 인산화효소는 보인자인 Mg와 ATP가 동시에 포함된 D의 경우에 가장 강한 형광 증가를 보였으며, 이를 통해 화합물 1의 결합에 보인자가 큰 영향을 미침을 알 수 있다.
실시예 9. 화합물 1 농도에 따른 인산화 효소와의 결합 확인
본 발명자들은 화합물 1의 농도에 따른 특정 인산화 효소와의 결합 정도를 형광 세기로 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
구체적으로, 인산화효소의 농도를 0.2 μg/mL로 고정하고, Mg (1 mM)와 ATP (1 mM)의 존재하에서, 화합물 1의 농도에 따른 형광 세기를 측정하였으며, 용매 조건 및 기타 조건은 상기 실시예 3과 동일하게 진행하였다. 이때, 실험에 사용된 화합물 1의 농도는 0 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM이며, 도 10의 (a)는 Src 인산화 효소에 대한 결과이고, (b)는 PDGFRa 인산화 효소에 대한 결과이다.
그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 두 인산화 효소가 각각 화합물 1에 대해 약 50 μM에서 50% 정도의 형광 세기 증가가 나타남을 확인하였으며, 이를 통해, 최소 50 μM 농도의 화합물 1이 존재하여야 최고치에서 50% 이상의 형광 증가가 발생됨을 알 수 있다.
실시예 10. 화합물 1의 인산화 효소 결합에 대한 저해제 영향 확인
본 발명자들은 잘 알려진 인산화 효소 저해제(kinase inhibitor)를 화합물 1과 동시에 처리하여 화합물 1의 인산화 효소 결합에 대한 저해제의 영향을 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
구체적으로, 총 6개 인산화 효소에 대한 저해제의 영향을 확인하고자 하였으며, 6개의 인산화 효소는 다음과 같다; (A) ABL, (B) BRAF, (C) PDGFRa, (D) RSK2, (E) Src, (F) TYK2. 실험은 총 3개의 조건에서 수행되었으며, 실험에 사용된 용매 및 기본적인 조건은 상기 실시예 3과 동일하게 진행되었다.
도 9의 (a) 그림에서 가장 좌측 검정색 그래프는 화합물 1만 용매에 존재할 경우의 형광 세기이고, 각각의 A ~ F에서 좌측 그래프는 화합물 1 (100 μM)과 인산화 효소 (0.2 μg/ml)가 용매에 포함된 경우이며, 중간 그래프는 화합물 1 (100 μM)과 인산화효소 (0.2 μg/ml), Mg(1 mM), ATP(1 mM)가 포함된 형광 세기이며, 우측 그래프는 저해제(Gleevec, 100 μM)가 추가로 포함된 경우의 형광 세기이다.
그 결과, 도 9의 (a)에서 보는 바와 같이, 저해제가 포함된 경우 화합물 1이 선택적으로 인산화효소에 결합하지 못하여 그 형광 세기가 충분히 증가하지 못함을 확인하였다.
이와 함께, 저해제를 차후에 처리해 준 후 형광 세기 변화를 관찰하였으며, 도 9의 (b) 그림은 A ~ F는 상기 (a)와 같으며, 이 경우에는 화합물 1 (100 μM)과 ATP (1 mM), Mg (1 mM), 인산화 효소 (0.2 μg/ml)를 24시간 교반시킨(37℃) 후 저해제 (100 μM)를 처리한 결과이다. 저해제 처리 후 24시간을 추가로 교반하여(37℃) 주었으며, 각각의 A ~ F에서 좌측 그래프는 저해제 처리 전의 형광 세기이며, 우측 그래프는 저해제 처리 후의 형광 세기를 나타낸다.
그 결과, 도 9의 (b)에서 보는 바와 같이, 저해제 처리 후 화합물 1의 형광 세기가 감소하였는데, 이는 저해제가 화합물 1을 밀어내고 인산화 효소에 결합했다는 것을 뜻한다.
이를 통해, 신규 인산화효소 저해 물질을 개발함에 있어, 본 발명의 화합물 1을 이용할 수 있음을 알 수 있으며, 인산화 효소에 강한 결합력을 가지는 저해제는 화합물 1을 밀어내고 결합에 참여하게 되고, 이는 형광 세기 감소로 나타나므로, 화합물 1을 이용하여 인산화효소 저해제와 인산화효소와의 결합력을 손쉽게 판단할 수 있는 기준을 제공해 줄 수 있다.
실시예 11. 화합물 1의 세포독성 확인
본 발명자들은 화합물 1의 세포독성을 CCK-8(Cell Counting Kit-8, Dojindo laboratories, Kumamoto, Japan) 방법으로 B16F10 세포 (쥐 피부 흑색종양 세포)에서 확인하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
구체적으로, B16F10 세포는 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 5000 cells/well 밀도로, 5% CO2 조건의 공기 중에서 24시간(37℃) 배양되었다. 화합물 1은 DMSO 용매에서 10 μM, 30 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM 조건으로 세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 다음, 10 μL의 CCK-8 용액을 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 이후, microplate reader(Multiskan EX, Thermo Eletron)에서 450nm의 파장을 이용하여 흡수를 관찰함으로서 세포 독성 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, 화합물 1은 0 ~ 200 μM 농도에 대해 90% 이상의 세포생존율을 보였으며, 이를 통해 화합물 1의 낮은 세포독성을 확인하였다.
실시예 12. 다양한 암세포에 화합물 1을 처리한 후, 형광 켜짐 현상 확인
본 발명자들은 다양한 암세포에 화합물 1을 주입하고, 일광자 및 이광자 형광현미경을 이용해 형광 켜짐 현상을 확인하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
구체적으로, 총 7종의 암세포 - (a) B16F10 쥐 피부암, (b) CT26 쥐 대장암, (c) SNU-475 사람 간암, (d) A431 사람 표피양암종양, (e) SKBR3 사람 유방암, (f) HeLa 사람 자궁암, (g) U87MG 사람 뇌종양 - 에 대하여 화합물 1을 처리하였으며, 이후 그 형광 영상을 일광자 형광 현미경(confocal fluorescence microscopy, FV1000 model, Olympus) 및 이광자 형광 현미경(two-photon fluorescence microscopy, Chameleon Ultra, Coherent, home-built version) 장비를 통해 관측하였다. 각 세포는 Hyclone사의 Minimum Essential Medium with Earle's Balanced Salts(MEM/EBSS), Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), Roswell Park Memorial Institute medium(RPMI), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin(PS), phosphate buffered saline(PBS), Trypsin-EDTA 배양액에서 배양되었으며, 배양은 37℃에서 진행되었다. 배양된 세포는 12 mm 글래스 커버슬립(glass coverslip)에서 다시 1 × 105 정도의 세포 개수가 생성되도록 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 이후 50 μM의 화합물 1을 처리한 후 추가로 1시간 더 배양한 다음, 세포에서 배양액을 제거하고, 4% 포름알데하이드 용액을 넣어주어 세포를 커버슬립(coverslip)에 고정시켰으며, 이 커버슬립을 슬라이드 글라스(slide glass)에 올린 후 안티 페딩 시약 (anti-fading agent, Biomeda사)을 이용하여 덮어주었다. 이렇게 준비가 완료되면 형광현미경을 이용하여 형광 영상을 얻었으며, 일광자 형광 현미경 영상은 405 nm의 여기 파장과 500-550 nm의 방출 파장을 통해 관찰되었으며, 이광자 형광 현미경 영상은 880 nm의 여기 파장과 500-550 nm의 방출파장, 15 mW의 레이저파워를 통해 관찰되었다.
도 11의 가장 윗줄은 밝은 세포 사진(bright field image)이며, 중간 줄은 세포의 일광자 형광현미경 결과이고, 하단 줄은 세포의 이광자 형광현미경 결과이다. 이때, 영상의 가로와 세로 길이는 각각 170 μm이며, 눈금 막대바는 35 μm의 길이를 뜻한다.
도 11에서 보는 바와 같이, 일광자 및 이광자 형광현미경 관측 결과, 화합물 1은 암세포 내에서 밝은 형광 영상을 제공하며, 따라서 화합물 1이 암세포 내에 존재하는 인산화효소와 직접적으로 결합하여 형광을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 13. 화합물 1을 처리한 암세포에서의 형광 방출 파장 확인
본 발명자들은 화합물 1을 CT-26 암세포에 처리하고, 광섬유를 이용하여 형광 방출 파장을 확인하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
구체적으로, 상기 실시예 12에서 수행된 연구와 동일한 방법을 이용하여, CT-26 암세포에 화합물 1을 처리한 후, 광섬유를 이용하여 형광 방출 파장을 확인하였다. 광섬유는 형광 현미경(Spectrofluorometer, FL1039, HORIBA)에 연결되었고, 여기 파장 및 방출 파장의 범위는 실시예 12와 동일하게 진행하였으며, 형광 방출 파장의 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, CT-26 암세포에 화합물 1을 처리하지 않은 경우(검정색 선), 형광 방출이 없는 반면, 화합물 1을 처리한 경우(빨간색 선) 550 nm 부근에서 강한 형광 방출을 보였다. 이를 통해, 화합물 1은 암세포 내의 인산화효소와 결합하여 분자 내 수소결합이 깨어진 형태로 존재한다는 것을 알 수 있다.
실시예 14. 화합물 1 처리 전, 후의 피부암 조직 및 정상조직에 대한 이광자 현미경 촬영 결과 확인
본 발명자들은 피부암이 이식된 쥐의 귀에 화합물 1을 처리하기 전, 후 이광자 현미경 영상을 관측하였으며, 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
구체적으로, 피부암(B16F10, 쥐 흑색종 피부암)을 쥐의 귀에 이식하고, 화합물 1을 처리함으로써 쥐가 살아있는 상태에서 암 부위에 선택적으로 형광이 관측되는지 이광자 현미경으로 관찰하였다. 쥐는 6개월 된 암컷으로 SPF/VAF immunodeficent 처리하여 털이 없는 Nude-mouse를 이용하였으며(BALB/c-nude mice, OrientBio corp.), B16F10 암세포는 상기 실시예 12와 같이 준비하였으며, 원심분리기를 사용해 용액을 제거한 농축된 암 세포를 쥐의 한쪽 귀에 주사기를 이용해 주입하였다. 4일 경과 후 쥐의 귀에서 암 조직이 발생하는 것을 확인한 후 화합물 1(10 mM)을 10 μL 주입하였으며, 암세포를 주입하지 않은 반대쪽 귀(암조직이 없는 정상조직)에 역시 화합물 1을 동일하게 주입하였다. 30분 경과 후, 2.5% avertin(호흡 마취제)을 통해 쥐를 호흡 마취시킨 후 이광자 형광 현미경을 이용하여 암 조직 및 정상조직을 촬영하였다. 여기 파장은 880 nm이며, 100 mW의 레이저파워를 사용하였다.
도 13에서 각 그림은 300 μm ×300 μm의 사이즈이며, 눈금 막대바는 50 μm을 나타낸다. 우측의 막대그래프는 형광신호의 세기를 나타낸다. (a, b, c)는 암세포가 주입되지 않은 정상부위이며, (d, e, f)는 암세포가 주입된 암 조직 부위이다. (a, d)는 아무것도 주입하지 않은 상태에서의 이광자 형광 영상 결과이고, (b, e)는 화합물 1이 포함되어 있지 않은 PBS 완충용액을 10 μL 주입한 결과이며, (c, f)는 화합물 1이 포함되어 있는 용액을 10 μL 주입한 결과이다.
도 13에서 보는 바와 같이, 화합물 1이 주입된 암 조직에서 밝은 형광 영상이 관측되었으며, 따라서 화합물 1은 암 조직 내에 인산화효소들과 결합하여 조직 내 머무는 시간이 길어짐에 따라 선택적으로 암 조직에서 형광이 강하게 관측됨을 알 수 있다.
이때, 도 14는 도 13에서 촬영된 이광자 형광 현미경 영상의 형광 세기를 그래프로 나타낸 것으로, (A)는 암세포가 주입되지 않은 정상조직(a ~ c), (B)는 암세포가 주입된 암 조직 (d ~ f) 에서의 결과이고, 세로축은 형광 세기를 나타낸 것이다.
실시예 15. 화합물 1 처리 전, 후의 피부암 조직 및 정상 조직에 대한 광간섭성 단층 촬영 결과 확인
본 발명자들은 암이 이식된 쥐의 귀에 화합물 1을 처리하기 전과 후에 광간섭성 단층 촬영을 하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
광간섭성 단층 촬영은 조직의 측면에서 촬영이 이루어짐에 따라 조직의 두께에 대한 정보를 제공하는 유용한 방법으로, 암 조직이 생성된 부위의 경우 그렇지 않은 부위보다 두꺼운 경향을 가지게 된다.
구체적으로, 본 발명에서는 암이 이식된 부위와 암이 이식되지 않은 부위에 대한 광간섭성 단층 촬영을 수행하였다. 광간섭성 단층 (OCT, Optical Coherence Tomography) 촬영은 이광자 형광 현미경 촬영과 동시에 진행되었으며, 모든 실험 준비과정은 상기 실시예 14와 동일하게 진행되었다. OCT는 polygonal wavelength filter와 semiconductor optical amplifier(BOA-5785, Covega)를 기반으로 한 custom-built wavelength swept source가 사용되었으며, 중심파장은 1310 nm이며, 파장의 폭은 105 nm이고, 스펙트럼의 분해능은 0.17 nm이다. 영상은 750 μm × 750 μm 크기로 얻었다.
도 15에서 A는 귀의 위쪽 표피를, B는 연골, C는 쥐의 아래쪽 표피를 나타낸 것이며, 눈금 막대 바는 100 μm을 나타낸다.
도 15에서 보는 바와 같이, (a)의 경우 암 조직이 존재하지 않는 샘플로서, 약 180 μm의 두께를 가지는 반면, (b)의 경우 암이 존재하는 샘플로 약 250 μm의 두께를 가져 암 조직이 정상 조직에 비하여 두껍게 형성됨을 확인하였다.
이와 함께, OCT 결과는 상기 실시예 14에서 수행된 이광자 형광 현미경 영상과 데이터를 혼성할 수 있는 바탕 영상을 제공해 준다는 점에서 장점을 가진다.
실시예 16. 화합물 1 처리 전, 후의 피부암 조직 및 정상 조직에 대한 3D 영상 결과 확인
본 발명자들은 암이 이식된 쥐의 귀에 화합물 1을 처리하기 전과 후에 이광자 현미경 및 광간섭성 단층촬영을 하고, 이를 병합하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
구체적으로, 도 16에 나타난 a ~ f는 실시예 14에서와 동일한 실험 조건이며, 상기 실시예 14 및 15에서 설명한 이광자 형광 현미경 영상에 광간섭성 단층 촬영 결과를 덧입혀 3D로 영상화한 것이다. 이때, 눈금 막대 바는 50 μm을 나타낸다.
도 16에서 보는 바와 같이, 3D 영상 결과에서도 암 조직에 화합물 1을 처리했을 경우 넓은 조직에 걸쳐 형광이 강하게 나오는 것을 확인할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 형광 프로브는 작은 유기 분자로서 타이로신 인산화효소와 결합할 때 형광 신호를 발할 수 있어, 기존의 인산화효소를 감지하기 위한 복잡한 구조를 갖는 형광 프로브의 문제점을 극복하였을 뿐만 아니라, 암 세포 등과 같이 신호전달에 관련된 인산화효소가 정상 세포에 비해 과발현되어 있는 경우, 정상 세포보다 암 세포에서 훨씬 밝은 형광을 나타내게 되어, 세포 내 또는 조직 내에서 암 세포 또는 조직의 선택적 영상화에 효과적으로 활용될 수 있다.
또한, 인산화효소를 억제하는 약물을 개발함에 있어, 개발된 약물과 프로브 간 경쟁 결합을 통한 결합력 평가를 통하여, 인산화효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝에도 중요하게 사용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 유사체(analogues)를 이용한 타이로신 인산화효소(tyrosine kinase) 감지를 위한 형광 프로브:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014001948-appb-I000004
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 오쏘(ortho)-히드록시(hydroxy)-벤즈알데하이드(benzaldehyde) 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 형광 프로브.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 타이로신 인산화효소와 결합하여 오쏘-히드록시-벤즈알데하이드의 분자 내 수소결합(intra-molecular hydrogen-bonding)이 깨어질 때 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는, 형광 프로브.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 타이로신 인산화효소는 ABL1(T315I), BRAF, PDGFRa, RSK2, TYK2 및 Src로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 형광 프로브.
  5. 제 1항의 형광 프로브를 이용한 타이로신 인산화효소 저해제 탐색 방법.
  6. 제 1항의 형광 프로브를 이용한 타이로신 인산화효소 활성 측정 방법.
  7. 제 1항의 형광 프로브를 이용한 일광자 또는 이광자 세포 영상화(imaging) 방법.
  8. 제 1항의 형광 프로브를 포함하는, 타이로신 인산화효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝용 조성물.
  9. 제 1항의 형광 프로브를 포함하는 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직의 영상화용 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제 1항의 형광 프로브를 이용하여 세포 또는 조직 내 형광을 측정하는 단계를 포함하는 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직의 영상화(imaging) 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 타이로신 인산화효소 과발현 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직인 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 형광을 측정하는 단계는 공초점 형광 현미경, 이광자 형광 현미경, 광간섭성 단층 촬영기, 및 이광자 형광 현미경 및 광간섭성 단층 촬영기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017010657A1 (ko) * 2015-07-13 2017-01-19 포항공과대학교 산학협력단 타이로신 인산화 효소를 감지하는 진보된 감지계 및 이의 용도
KR102267067B1 (ko) * 2020-01-16 2021-06-21 경희대학교 산학협력단 다이에틸싸이아노포스포네이트 검출용 형광 프로브 화합물 및 이의 용도
KR102294475B1 (ko) * 2020-01-23 2021-08-25 경희대학교 산학협력단 말로노나이트릴 검출용 형광 프로브 화합물 및 이의 용도
KR102551871B1 (ko) * 2020-07-07 2023-07-05 경희대학교 산학협력단 하이드라진 검출용 조성물 및 이를 이용한 하이드라진 검출방법
CN112255208B (zh) * 2020-10-09 2023-01-10 安阳工学院 一种检测酪氨酸酶的化合物及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007324868B2 (en) 2006-11-28 2014-03-20 Daiichi Sankyo Europe Gmbh Activated HER3 as a marker for predicting therapeutic efficacy
KR100963102B1 (ko) 2009-03-16 2010-06-14 호서대학교 산학협력단 표피성장인자 수용체 타이로신 키나제 저해제의 탐색방법, 및 그에 의해서 탐색된 저해제

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112679478A (zh) * 2020-12-09 2021-04-20 上海交通大学医学院附属新华医院 一种靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针及其制备方法和应用
CN112679478B (zh) * 2020-12-09 2021-09-24 上海交通大学医学院附属新华医院 一种靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针及其制备方法和应用

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