WO2015020281A1 - 황화수소 검출용 가변색 이광자 형광 프로브, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 생체 내 황화수소의 정량적 영상화 방법 - Google Patents

황화수소 검출용 가변색 이광자 형광 프로브, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 생체 내 황화수소의 정량적 영상화 방법 Download PDF

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    • C07D277/64—Benzothiazoles with only hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals attached in position 2
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    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the present invention relates to a variable color two-photon fluorescent probe that changes the fluorescent color in response to hydrogen sulfide (H 2 S) in vivo and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a method of quantitatively imaging hydrogen sulfide present in cells and living tissues using a two-photon microscope using the variable color two-photon fluorescent probe.
  • Hydrogen sulfide is a gas signaling material that is directly generated in vivo, participates in various physiological phenomena, and is known to play an important role in the cellular immune system. In particular, it acts as an opener of the K-ATP channel, contributing to the homeostasis of the cardiovascular system, and is known to be directly involved in the healing of damaged cardiovascular muscles and protection from oxidative stress of the nervous system. .
  • concentration of hydrogen sulfide in plasma of human blood is known to be 50-100 ⁇ M. Therefore, if the concentration level of hydrogen sulfide can be detected quantitatively, the diagnosis of down syndrome and Alzheimer's disease is It is possible.
  • the inventors of the present invention while searching for a quantitative imaging method of hydrogen sulfide (H 2 S) in vivo, prepared a variable color two-photon fluorescent probe that is selectively stained in the mitochondria or cytoplasm in vivo, and selectively reacts with hydrogen sulfide to show a strong fluorescence change It was confirmed that the prepared variable color two-photon fluorescent probe can quantitatively image the distribution and activity of hydrogen sulfide in the mitochondria or cytoplasm in cells and biological tissues, and completed the present invention.
  • H 2 S hydrogen sulfide
  • the present invention is to provide a variable color two-photon fluorescent probe that changes the fluorescent color in response to hydrogen sulfide (H 2 S) in vivo and a method of manufacturing the same.
  • the present invention is to provide a method for quantitatively imaging hydrogen sulfide present in cells and biological tissues using a two-photon microscope using the variable color two-photon fluorescent probe.
  • the present invention provides a variable color two-photon fluorescent probe that changes in fluorescent color in response to hydrogen sulfide (H 2 S) in vivo and a method for producing the same.
  • the present invention also provides a method of quantitatively imaging hydrogen sulfide present in cells and biological tissues using a two-photon microscope using the variable color two-photon fluorescent probe.
  • variable color two-photon fluorescent probe shows a strong fluorescence color change by being selectively stained in the mitochondria or cytoplasm and reacted with hydrogen sulfide (H 2 S), and due to its excellent solubility in water and small molecular weight, Hydrogen sulfide can be selectively detected in cells and biological tissues of 100-200 ⁇ m depth over 60 minutes, enabling quantitative imaging of the distribution and activity of hydrogen sulfide in the mitochondria or cytoplasm in cells and biological tissues. .
  • H 2 S hydrogen sulfide
  • FIG. 2 shows (a, b) SHS-M1, (c, d) SHS-M1-1 in 1,4-dioxane, DMF, EtOH, and HEPES buffer solution (pH 7.4). , (e, f) normalized absorption (a, c, e, g) and emission (b, d, f, h) spectra of SHS-M2 and (g, h) SHS-M2-2, and (d) Figure 2 shows two-photon excited fluorescence spectra ( ⁇ ) obtained from HeLa cells labeled with SHS-M1-1 and (h) SHS-M2-2.
  • Figure 3 shows the fluorescence response of the reaction of 1 ⁇ M of (a) SHS-M1 and (b) SHS-M2 with 100 ⁇ M Na 2 S in HEPES buffer solution (30 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7.4).
  • FIG. 5 shows 1 ⁇ M of (a) SHS-M1 and (b) SHS-M2 with active sulfur (RSS), nitrogen (RNS), and oxygen (ROS) species, amino acids, metals in HEPES buffer solution, pH 7.4.
  • RSS active sulfur
  • RNS nitrogen
  • ROS oxygen
  • the bars represent the emission intensity ratios of ⁇ fl at 0, 30, 60 and 90 minutes respectively after addition of the material.
  • excitation wavelengths of (a) 340 nm and (b) 373 nm were used.
  • FIG. 6 shows (a) SHS-M1 (in a universal buffer solution (0.1 M citric acid, 0.1 M KH 2 PO 4 , 0.1 M Na 2 B 4 O 7 , 0.1 M Tris, 0.1 M KCl)).
  • SHS-M2 ( ⁇ ) and SHS-M2-2 ( ⁇ ) are diagrams showing the fluorescence intensity ratio according to the change of pH.
  • FIG. 7 is a diagram showing images of HeLa cells labeled with (a) SHS-M2 and (b) MitoTracker Red FM.
  • Two-photon and single photon excitation wavelengths were 750 and 514 nm, respectively, and corresponding emissions were collected at 425-575 nm (SHS-M2) and 600-700 nm (Mitotracker Red FM). Scale bar is 30 ⁇ m.
  • FIG. 8 is a diagram measuring the viability of HeLa cells incubated for 2 hours with SHS-M2 in the presence of SHS-M2 with CCK-8 Kit.
  • FIG. 9 is a diagram showing a pseudocolored variable color two-photon image of HeLa cells cultured with 2 ⁇ m of (a) SHS-M2 or (d) SHS-M2-2, respectively.
  • (b, c) HeLa cells were pretreated with 100 ⁇ M of (b) GSH or (c) Cys for 30 minutes before labeling with SHS-M2.
  • (e) shows the average fluorescence intensity (F yellow / F blue ) of (ad). Images were obtained using 750 nm excitation, emission windows using blue (420-470 nm) and yellow (525-575 nm).
  • the scale bar in (d) is 20 ⁇ m.
  • FIG. 10 shows (a) the bright-field of the CA1-CA3 region of the hippocampal sections of rats, (b) not pretreated with Cys (1 mM) for 1 hour prior to labeling with SHS-M2.
  • fs femtosecond
  • FIG. 11 is a diagram showing a correlation between CBS expression level and hydrogen sulfide (H 2 S) production amount.
  • astrocytes from the brains of neonatal rats were pretreated with CBS-specific siRNA (20 nM) or untargeted (NT) siRNA for 5 days each.
  • CBS mRNA levels and (b) protein levels were analyzed and quantified using Q-PCR and Western blot, respectively.
  • NT siRNA RNA mRNA levels and protein levels were analyzed and quantified using Q-PCR and Western blot, respectively.
  • FIG. 11 shows a diagram showing a correlation between CBS expression level and hydrogen sulfide (H 2 S) production amount.
  • (a, b) astrocytes from the brains of neonatal rats were pretreated with CBS-specific siRNA (20 nM) or untargeted (NT) siRNA for 5 days each.
  • CBS mRNA levels and (b) protein levels were analyzed and quantified using Q-PCR and Western blot, respectively.
  • FIG. 12 is a diagram showing weakened hydrogen sulfide (H 2 S) generation and CBS expression in DJ-1-knockout (KO) astrocytes.
  • H 2 S weakened hydrogen sulfide
  • KO DJ-1-knockout
  • FIG. 12 shows weakened hydrogen sulfide (H 2 S) generation and CBS expression in DJ-1-knockout (KO) astrocytes.
  • WT wild-type
  • KO DJ-1-knockout
  • FIG. 12 is a diagram showing weakened hydrogen sulfide (H 2 S) generation and CBS expression in DJ-1-knockout (KO) astrocytes.
  • WT wild-type
  • KO DJ-1-knockout mice brains were stained with 20 ⁇ M SHS-M2 for 1 hour.
  • (a) Variable color two-photon fluorescence images of astrocytes show reduced hydrogen sulfide (H 2 S) production in KO astrocytes compared to WT cells.
  • (C) CBS mRNA and (d) protein levels in WT and KO astrocytes were determined using Q-PCR and Western blot, respectively.
  • the values in (b) are the mean ⁇ SD of three samples, and the values in (c) and (d) are the mean ⁇ SEM of three samples.
  • the scale bar in (a) is 20 ⁇ m.
  • FIG. 13 is a diagram showing the DJ-1- knock out (KO) The weakened hydrogen sulfide (H 2 S) and generating CBS expression in brain.
  • Brain sections were obtained from wild-type (WT) and DJ-1-knockout (KO) mice.
  • (ac) Hippocampal sections were prepared and used for (a) GFAP and CBS staining.
  • the right panel is a high magnification image of the boxed area of the left panel.
  • the shell sections were incubated for 7 days after slicing to stabilize the tissue from slicing stress, after which hydrogen sulfide production was measured.
  • the values in (c) and (e) are the mean ⁇ SD of the three samples (scale bars: (a) 30 ⁇ m, (b) left 75 ⁇ m, right 30 ⁇ m, (d) 75 ⁇ m).
  • the present invention provides a variable color two-photon fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide (H 2 S) in vivo selected from the compounds represented by the following formula (1) and (2):
  • ⁇ is O, S or Se.
  • ⁇ is O, S or Se
  • ⁇ is O, S or Se
  • variable color two-photon fluorescent probe for detecting hydrogen sulfide includes 6- (benzo [d] thiazol-2'-yl) -2- ( N, N- dimethylamino) naphthalene (BTDAN) as a two-photon phosphor, 4-azidobenzyl is introduced as a receptor in the form of carbamate.
  • variable color two-photon fluorescent probe according to the present invention.
  • Step (1) is to prepare compound B.
  • 4-nitrobenzenesulfonyl chloride is added to the suspension of known compound A in dried CH 2 Cl 2 and stirred to prepare the crude product by column chromatography.
  • compound B is prepared as a yellow solid compound.
  • Step (2) is to prepare a compound D, Compound B, 3.3'- disulfanediylbis (4-aminophenol) (Compound C) and p- TSA is dissolved in the dried DMF, and then filtered by The crude product obtained is purified by column chromatography to prepare compound D as a yellow solid compound.
  • Step (3) is a step of preparing Compound E.
  • the crude product obtained by adding and stirring methyl bromoacetate to a suspension of Compound D and K 2 CO 3 in dried CH 3 CN is subjected to silica gel column chromatography.
  • Compound E is prepared as a yellow solid compound by purification.
  • Step (4) is a step of preparing Compound F.
  • the crude product obtained by adding and stirring thiophenol to Compound E solution in DMF dried in the presence of K 2 CO 3 is a gray solid by purification by column chromatography.
  • Deprotected intermediates are prepared, and then the intermediates are dissolved in THF, treated and stirred with aqueous LiOH solution and acidified with diluted HCl (aq) to prepare Compound F as a dark brown solid compound.
  • Step (5) is a step of preparing compound I.
  • 1,3-dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole are added and stirred, followed by (2-amino
  • the crude product obtained by adding and stirring ethyl) triphenylphosphonylbromide is purified by column chromatography to prepare Compound I as a yellow solid compound.
  • Step (6) is a step of preparing compound H.
  • Na 2 CO 3 and triphosgene are dried and cooled under reduced pressure, THF is added thereto and stirred, and then compound G solution is added and stirred to prepare compound H. .
  • Step (7) is a step of preparing compound SHS-M1 (Formula 1), by adding a compound H solution to a solution of compound I and pyridine and then evaporating the solvent to obtain a crude product by silica gel column chromatography
  • the compound of formula 1 is prepared as a gray solid compound.
  • Step (1 ′) is a step of preparing Compound H, which is prepared by the same method as step (6).
  • Step (2 ′) is a step of preparing compound SHS-M2 (Formula 2), wherein the crude product obtained by adding and stirring pyridine to the solution of compound H and compound J is purified by silica gel column chromatography.
  • the compound of formula 2 is prepared as a solid compound.
  • the prepared variable color two-photon fluorescent probe showed 3.0 to 5.0 ⁇ M solubility in HEPES buffer solution, and reacted with hydrogen sulfide (H 2 S) to exhibit red shift and in vitro detection limits of 0.2 to 0.4 mM.
  • ⁇ is O, S or Se.
  • ⁇ is O, S or Se
  • n is an integer of 1 to 50.
  • the compounds represented by Formulas 1 and 2 introduced triphenylphosphonium salt (TPP) as a mitochondrial probe, and the compounds represented by Formulas 3 and 4 introduced polyethylene glycol as a cytoplasmic probe. It is characterized by one. That is, in step (a), the photon fluorescent probe may be selectively placed in the mitochondria or cytoplasm by injecting the photon fluorescent probe at a very low concentration for 30 minutes in vivo.
  • the excitation source of the two-photon microscope after injection in vivo uses near-infrared light corresponding to 750 nm, and simultaneously measures the intensity of fluorescence in two channels of 400 to 480 nm (F blue ) and 495 to 575 nm (F yellow ).
  • the ratio of the relative fluorescence intensity observed by the above (F yellow / F blue ) is variable according to the concentration change of hydrogen sulfide.
  • the fluorescence range varies from 400 to 480 nm before reacting with hydrogen sulfide to 495-575 nm after reacting with hydrogen sulfide, where the intensity of two-photon excitation fluorescence is increased by 40 times, resulting in high-resolution two-photon microscopy.
  • Two-photon microscopy which uses two near-infrared photons with low excitation energy as excitation sources, has a deeper transmission depth in the range of 90 to 180 ⁇ m compared to one-photon microscopy, so that in living cells and biological tissues of 100 to 200 ⁇ m deep Hydrogen sulfide can be detected.
  • the two-photon fluorescent probe of the present invention is capable of detecting hydrogen sulfide continuously for more than 60 minutes due to the light stability inside the cell, and more preferably, 30 minutes to 90 minutes.
  • the compounds represented by Formulas 1 and 2 are selectively stained in the mitochondria in the intracellular organelles, and the compounds represented by Formulas 3 and 4 are selectively stained in the cytoplasm, and hydrogen sulfide (H 2 Reaction with S) increases the ratio of relative fluorescence intensity (F yellow / F Fanglang ) at wavelengths of 400 to 480 nm (F blue ) and 495 to 575 nm (F yellow ), thus providing selectivity for hydrogen sulfide (H 2 S). And fluorescent probes for imaging activity.
  • the variable color two-photon fluorescent probe has a strong selectivity for hydrogen sulfide (H 2 S). According to one embodiment, it exhibits 5-8 times greater fluorescence intensity than glutathione (GSH), cysteine (cys) and 2-mercaptoethanol (2-ME), and biologically related RSS (lipoic acid, SO 3 2-, S 2 O 3 2- , SCN -), RNS (NO 2 -, NO), ROS (H 2 O 2, O 2 -, t-BuOOH, HOCl), thiol group (Ala, Glu) is Almost no fluorescence for amino, and metal ions (Ca 2+ , K + , Na + , Fe 3+ , Zn 2+ , Mg 2+ ).
  • variable color two-photon fluorescent probe is characterized in that pH-unreacted in the pH range associated with the living body.
  • ⁇ is O, S or Se
  • Compound 4-F was prepared by deprotecting the 4-nitrobenzenesulfonamide portion of Compound E, followed by base catalytic hydrolysis of the methylacetate portion. First, thiophenol (0.16 mL, 1.6 mmol) was added to a solution of Compound E (450 mg, 0.80 mmol) in DMF (6 mL) dried in the presence of K 2 CO 3 (276.4 mg, 2.0 mmol), The reaction mixture was stirred at rt for 3 h. The solvent was removed under reduced pressure, water was added and then extracted with CH 2 Cl 2 . The organic layer was dried over anhydrous Na 2 SO 4 .
  • ⁇ is O, S or Se
  • a small amount of the two-photon fluorescent probes (SHS-M1 and SHS-M2) of Example 1 according to the present invention was dissolved in DMSO to prepare a stock solution (1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 M).
  • the solution is then diluted to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 5 to 5.0 ⁇ 10 ⁇ 8 M and using a micro syringe, cuvette containing 2.0 mL of HEPES buffer solution (30 mM, 100 mM KCl, pH 7.4).
  • HEPES buffer solution 30 mM, 100 mM KCl, pH 7.4
  • the fluorescence intensity according to the concentration of the two-photon fluorescent probe is linear at low concentrations, but shows a curve falling downward toward higher concentrations.
  • the solubility of the two-photon fluorescent probe is determined to be the highest concentration exhibiting a linear pattern.
  • SHS-M1 and SHS-M2 in HEPES buffer solution showed ⁇ 3.0 and 5.0 ⁇ M solubility and showed very effective in cell staining.
  • Table 1 Category a ⁇ abs (10 -4 ⁇ ) b ⁇ fl c ⁇ d ⁇ max (2) e ⁇ max f SHS-M1 340 (1.9) 420 0.23 (0.41) 750 14 (32) SHS-M1-1 365 (1.8) 500 0.50 (1.00) 750 63 (76) SHS-M2 343 (1.4) 464 0.24 (1.00) 740 17 (60) SHS-M2-2 383 (1.5) 545 0.12 (1.00) 750 55 (177)
  • the numbers in parentheses were measured in EtOH.
  • the emission spectra of SHS-M1-1 and SHS-M2-2 showed greater red-shift than the emission spectra of SHS-M1 and SHS-M2.
  • the two-photon-excited fluorescence spectra of SHS-M1-1 and SHS-M2-2 measured in HeLa cells were similar to those measured in ethanol (EtOH), indicating that the ethanol It indicates that the polarity is properly represented.
  • the reaction of SHS-M1 with Na 2 S decreased the intensity of the wavelength of 420 nm, while gradually increasing the intensity of the wavelength of 500 nm.
  • the reaction of SHS-M2 with Na 2 S was shown to decrease the intensity of the wavelength of 464 nm while gradually increasing the intensity of the wavelength of 545 nm.
  • the in vitro detection limits for H 2 S of (a) SHS-M1 and (b) SHS-M2 were 0.2 and 0.4 ⁇ M, respectively.
  • SHS-M1 and SHS-M2 showed high selectivity for H 2 S compared to biologically related active sulfur (RSS), nitrogen (RNS), and oxygen (ROS) species.
  • both two-photon fluorescence probes had 5-8 times greater fluorescence intensity for H 2 S compared to 10 mM glutathione (GSH), 1 mM cysteine (cys) and 1 mM 2-mercaptoethanol (2-ME).
  • GSH glutathione
  • cys 1 mM cysteine
  • 2-ME 2-mercaptoethanol
  • RSS is associated to a different biological (lipoic acid, SO 3 2-, S 2 O 3 2-, SCN -), RNS (NO 2 -, NO), ROS (H 2 O 2, O 2 -, t-BuOOH, HOCl ), Amino without thiol groups (Ala, Glu), and metal ions (Ca 2+ , K + , Na + , Fe 3+ , Zn 2+ , Mg 2+ ) showed negligible fluorescence.
  • two-photon fluorescent probes SHS-M1 and SHS-M2 showed high fluorescence intensity in the biologically relevant pH range and were not affected by pH conditions.
  • the two-photon fluorescent probe according to the present invention is very useful for detecting sulfide in vivo, with little effect on other biologically related species and pH conditions.
  • FIG. 7 Images of HeLa cells labeled with (a) SHS-M2 and (b) MitoTracker Red FM are shown in FIG. 7 [(a) TPM, (b) OPM images, and (c) combined image of (a) and (b)].
  • FIG. 7 HeLa cells were conventionally known mitochondria to confirm that the strong green fluorescence images shown in FIG. 7 (a) stained with two-photon fluorescence probe (SHS-M2) image the actual mitochondria. After staining with mitotrackerred (Mito Tracker Red. Invitrogen), a single photon fluorescent marker for a single photon red fluorescence image was obtained (Fig. 7 (b)), the two obtained images were superimposed together (Fig. 7 (c)). ).
  • SHS-M2 two-photon fluorescence probe
  • the CCK-8 kit Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan
  • the viability of HeLa cells incubated with SHS-M2 for 2 hours in the presence of SHS-M2 was measured in CCK-8 Kit and shown in FIG. 8.
  • SHS-M2 exhibited low cytotoxicity and was found to be suitable for detecting hydrogen sulfide in living cells.
  • FIG. 9 A pseudocolored variable color two-photon image of HeLa cells incubated with 2 ⁇ m of either (a) SHS-M2 or (d) SHS-M2-2, respectively, is shown in FIG. 9.
  • (b, c) HeLa cells were pretreated with 100 ⁇ M of (b) GSH or (c) Cys for 30 minutes before labeling with SHS-M2, (e) the mean fluorescence intensity of (ad) (F yellow) / F blue ).
  • FIG. 10 (a) bright-field images of hippocampal sections of rats were obtained and shown in the CA1 and CA3 zones. Since the structure of the brain tissue is heterogeneous at all depths, 10 TPM images were obtained at a thickness of about 90-180 ⁇ m depth and combined to image the overall hydrogen sulfide distribution. The image confirmed that hydrogen sulfide was not evenly distributed in both CA1 and CA3 regions.
  • the level of hydrogen sulfide (H 2 S) in astrocytes generated at different levels of cystathionine ⁇ -synthase (CBS) is determined by two- photon fluorescent probe (SHS-M2).
  • CBS is a major enzyme that promotes the production of hydrogen sulfide (H 2 S)
  • astrocytes are known to produce hydrogen sulfide (H 2 S) in the brain by expressing CBS [J. Neurosci. 1996, 16, 1066., Neurobiol. Aging 2009, 30, 1523., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 293, 1485.].
  • CBS was knocked out from KO cells by using CBS siRNA (5′-CCC AAA AUU UUA CCA GAU AUU CUU U-3 ′).
  • CBS siRNA 5′-CCC AAA AUU UUA CCA GAU AUU CUU U-3 ′.
  • astrocytes pretreated with CBS siRNA were significantly reduced CBS mRNA and compared with cells pretreated with nontargeted (NT) siRNA (5'-CCU CGU GCC GUU CCA UCA GGU AGU U-3 ') and CBS protein levels are shown.
  • NT siRNA nontargeted siRNA
  • DJ-1 is a multifunctional PD (parkinson's disease) -related gene, known for its anti-inflammatory and antioxidant effects in astrocytes (FASEB J. 2009, 23, 2478., J. Neural Transm. 2010, 117, 599., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 9691. and J. Biol. Chem. 2011, 286, 35308.). Since hydrogen sulfide also has anti-inflammatory and antioxidant effects, it is interesting to see if DJ-1 can modulate hydrogen sulfide production. Attenuated hydrogen sulfide (H 2 S) production and CBS expression in DJ-1-knocked out (KO) astrocytes are shown in FIG. 12.
  • variable color two-photon fluorescence image of the astrocytes is hydrogen sulfide (H 2 S) production in knock-out (KO) cells compared to wild type (WT) cells
  • the F yellow / F blue ratio in DJ-1-knockout (KO) astrocytes decreased from 0.71 to 0.46 compared to wild type (WT) astrocytes.
  • the results show a parallel decrease in endogenous hydrogen sulfide levels.
  • the present invention also investigated the relationship between CBS expression and hydrogen sulfide production in wild-type (WT) and DJ-1-knockout (KO) brain sections. Sections were prepared from wild type (WT) and DJ-1-knockout (KO) brain hippocampus and stained twice with specific antibodies against GFAP (astrocytic marker) and CBS, respectively. Attenuated hydrogen sulfide (H 2 S) production and CBS expression in DJ-1-knocked out (KO) brains are shown in FIG.
  • CBS was detected in GFAP-positive astrocytes, and the expression of CBS was significantly reduced in DJ-1-knocked out (KO) astrocytes.
  • variable color fluorescence images of SHS-M2 labeled tissues show reduced hydrogen sulfide (H 2 S) levels in DJ-1-knockout (KO) enveloped sections. It was. The results indicate that variable color imaging with two-photon fluorescent probes (SHS-M2) is an effective tool for measuring different levels of hydrogen sulfide (H 2 S) generated from different levels of CBS expression.

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Abstract

본 발명은 생체 내 황화수소(H2S)와 반응하여 형광 색이 변화하는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 가변색 이광자 형광 프로브를 이용하여 세포 및 생체 조직 내에 존재하는 황화수소를 이광자 현미경을 통해 정량적으로 영상화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 가변색 이광자 형광 프로브는 미토콘드리아 또는 세포질에 선택적으로 염색됨과 동시에 황화수소(H2S)와 반응하여 강한 형광 색 변화를 나타내며, 물에 대한 우수한 용해도와 작은 분자량으로 인해 세포에 쉽게 로딩될 수 있고, 60분 이상에 걸쳐 세포 및 100~200 μm 깊이의 생체 조직에서 선택적으로 황화수소를 탐지할 수 있으므로, 세포 및 생체 조직에서 미토콘드리아 또는 세포질 내부의 황화수소의 분포 및 활성을 정량적으로 영상화 할 수 있다.

Description

황화수소 검출용 가변색 이광자 형광 프로브, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 생체 내 황화수소의 정량적 영상화 방법
본 발명은 생체 내 황화수소(H2S)와 반응하여 형광 색이 변화하는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 가변색 이광자 형광 프로브를 이용하여 세포 및 생체 조직 내에 존재하는 황화수소를 이광자 현미경을 통해 정량적으로 영상화하는 방법에 관한 것이다.
황화수소(H2S)는 생체 내에서 직접 생성되는 기체의 신호전달 물질로서 다양한 생리현상에 참여하고, 세포 면역 시스템에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 K-ATP 채널의 오프너(opener) 역할을 하여 심혈관 시스템의 항상성에 기여하며 손상된 심혈관 근육의 치유 및 신경계의 산화 스트레스로부터의 보호 역할 등에 직접 관여하는 것으로 알려져 있어, 여러 연구 분야에서 각광을 받고 있다. 또한 인간의 혈액 내 혈장(plasma)의 황화수소 농도는 50~100 μM 수준으로 알려져 있으므로, 황화수소의 농도 수준을 정량적으로 검출할 수 있다면 다운 증후군(down syndrome) 및 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease) 등의 진단이 가능하다. 또한 미토콘드리아 내부에는 전체 황화물의 30%가 저장되어 있고 황화수소 역시 미토콘드리아의 기능을 유지하는데 필요한 다양한 역할을 하고 있다. 그러나, 살아있는 세포 및 생체 조직 내에는 글루타티온(glutathione, GSH), 시스테인(cysteine, Cys) 등의 다량의 황화물이 존재하고 있고, 황화수소(H2S)만을 선택적이고 정량적으로 검출하는 방법은 알려져 있지 않다. 그러므로, 황화수소에 대해 선택적인 가변색 형광 프로브를 개발하면 살아있는 세포 및 조직의 깊은 곳에서 진행되는 생물학적인 현상을 실시간으로 관찰할 수 있게 해주고, 황화수소와 관련된 생명과학 연구와 질병의 조기 진단, 진단 시약 및 치료제의 개발 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
현재 수많은 단일광자 형광 프로브가 개발되어 왔으나, 대부분의 단일광자 프로브의 공통적인 문제점은 그들의 짧은 여기 파장(<500 ㎚) 사용에 있다. 짧은 여기 파장은 얕은 투과 깊이(<100 ㎛), 광표백(photo-bleaching) 및 세포 자가 형광(auto-fluorescence) 등의 문제를 야기함으로써 조직 영상화(imaging)에 대한 적용을 제한한다. 이러한 문제에 대한 해결책으로 제시된 것이 낮은 에너지의 2개의 근적외선 광자를 이용하는 이광자 현미경(TPM)을 사용하는 방법이다. 이광자 현미경을 사용하면, 손상되지 않은 100 ㎛ 깊이 이상의 생체 조직 내부를 관찰할 수 있고 장시간의 영상을 실시간으로 만들 수 있다. 그러나 생체 조직 내부에 존재하는 황화수소를 선택적으로 감지할 수 있는 이광자 가변색 형광 프로브는 전무한 상태이다.
따라서, 세포 및 생체 조직 내에 존재하는 황화수소를 선택적으로 탐지할 수 있는 이광자 가변색 형광 프로브의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 생체 내 황화수소(H2S)의 정량적 영상화 방법을 탐색하던 중, 생체 내 미토콘드리아 또는 세포질에 선택적으로 염색되고, 황화수소와 선택적으로 반응하여 강한 형광 변화를 나타내는 가변색 이광자 형광 프로브를 제조하였으며, 제조된 가변색 이광자 형광 프로브가 세포 및 생체 조직에서 미토콘드리아 또는 세포질 내부의 황화수소의 분포 및 활성을 정량적으로 영상화할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 생체 내 황화수소(H2S)와 반응하여 형광 색이 변화하는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 가변색 이광자 형광 프로브를 이용하여 세포 및 생체 조직 내에 존재하는 황화수소를 이광자 현미경을 통해 정량적으로 영상화하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 생체 내 황화수소(H2S)와 반응하여 형광 색이 변화하는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 가변색 이광자 형광 프로브를 이용하여 세포 및 생체 조직 내에 존재하는 황화수소를 이광자 현미경을 통해 정량적으로 영상화하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 가변색 이광자 형광 프로브는 미토콘드리아 또는 세포질에 선택적으로 염색됨과 동시에 황화수소(H2S)와 반응하여 강한 형광 색 변화를 나타내며, 물에 대한 우수한 용해도와 작은 분자량으로 인해 세포에 쉽게 로딩될 수 있고, 60분 이상에 걸쳐 세포 및 100~200 μm 깊이의 생체 조직에서 선택적으로 황화수소를 탐지할 수 있으므로, 세포 및 생체 조직에서 미토콘드리아 또는 세포질 내부의 황화수소의 분포 및 활성을 정량적으로 영상화 할 수 있다.
도 1은 이광자 형광 프로브(SHS-M1(a, b) 및 SHS-M2(c, d))에 대한 (a, c) 단일광자 형광 스펙트럼 및 (b, d) HPPES 완충 용액(30 mM, 100 mM KCl, pH 7.4)에서 이광자 형광 프로브 농도에 대한 형광강도를 나타내는 도이다(여기 파장은 SHS-M1 및 SHS-M2에 대해 각각 340 및 370 nm이다).
도 2는 1,4-디옥산(1,4-dioxane), DMF, EtOH, 및 HEPES 완충 용액 (pH 7.4)에서, (a,b) SHS-M1, (c,d) SHS-M1-1, (e,f) SHS-M2 및 (g,h) SHS-M2-2의 정규화된 흡수 (a,c,e,g) 및 방출 (b,d,f,h) 스펙트럼, 및 (d) SHS-M1-1 및 (h) SHS-M2-2로 표지된 헬라(HeLa) 세포로부터 얻은 이광자 여기 형광 스펙트럼 (■)을 나타내는 도이다.
도 3은 HEPES 완충 용액(30 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7.4)에서 1 μM 의 (a) SHS-M1 및 (b) SHS-M2와 100 μM의 Na2S 의 반응에 따른 형광 반응을 시간(0~60분)에 따라 나타낸 그래프이며, (c) SHS-M1의 kobs = 1.4 × 10-3 s-1 및 (d) SHS-M2의 kobs = 9.1 × 10-4 s-1는 각각 340 nm 및 373 nm 의 여기 파장을 이용하여 시간 대 ln[(Fmax - Ft)/Fmax] 의 플럿으로부터 계산된 기울기이며, (e) SHS-M1 및 (f) SHS-M2는 각각 Na2S 의 농도 대 kobs를 나타내는 도이다.
도 4는 HEPES 완충 용액 (30 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7.4)에서 [Na2S]의 농도에 따른 (a) SHS-M1 및 (b) SHS-M2의 형광 강도 비(fluorescence intensity ratio)를 나타내는 도이다. 여기서, 각 결과는 실온에서 Na2S 첨가 후 1시간 후에 얻어졌다.
도 5는 HEPES 완충 용액(pH 7.4)에서 1 μM 의 (a) SHS-M1 및 (b) SHS-M2와 활성 황(RSS), 질소(RNS), 및 산소(ROS) 종, 아미노 산, 금속 이온들 및 100 μM의 Na2S를 첨가한 경우 상대적인 형광 강도를 나타내는 도이다. 막대는 상기 물질을 첨가 후 각각 0, 30, 60 및 90분에서의 λfl의 방출 강도 비를 나타낸다. 여기서 (a) 340 nm 및 (b) 373 nm의 여기 파장을 이용하였다.
도 6은 보편적인 완충 용액(0.1 M 시트로산(citric acid), 0.1 M KH2PO4, 0.1 M Na2B4O7, 0.1 M Tris, 0.1 M KCl)에서 (a) SHS-M1 (●) 및 SHS-M1-1 (○), (b) SHS-M2 (●) 및 SHS-M2-2 (○)에 대한 pH 변화에 따른 형광 강도 비율를 나타내는 도이다.
도 7은 (a) SHS-M2 및 (b) 마이토트랙커 레드 FM(MitoTracker Red FM)으로 표지된 헬라(HeLa) 세포의 영상을 나타내는 도이다. [(a) TPM 및 (b) OPM 영상이고, (c)는 (a) 및 (b)를 합친 영상이다. 이광자 및 단일광자 여기 파장은 각각 750 및 514 nm이었고, 상응하는 방출(emission)은 425-575 nm (SHS-M2) 및 600-700 nm (마이토트랙커 레드 FM)에서 수집되었다. 스케일 바는 30 μm이다. 보여진 세포는 반복적인 실험(n=5)에 의한 대표 영상이다.]
도 8은 SHS-M2의 존재 하에 SHS-M2로 2시간 동안 배양된 HeLa 세포의 생존 능력을 CCK-8 Kit로 측정한 도이다.
도 9는 2μm 의 (a) SHS-M2 또는 (d) SHS-M2-2로 각각 배양된 HeLa 세포의 슈도 컬러(Pseudocolored) 가변색 이광자 영상을 나타내는 도이다. [(b, c) HeLa 세포는 SHS-M2로 표지하기 전에 30 분 동안 100 μM의 (b) GSH 또는 (c) Cys로 전처리하였다. (e)는 (a-d)의 평균 형광강도 (F노랑/F파랑)를 나타낸다. 영상은 750 nm 여기를 이용해 얻어졌으며, 방출 윈도우(emission windows)는 파랑(420-470 nm), 노랑(525-575 nm)을 이용하였다. (d)에서의 스케일 바는 20 μm이다. 보여진 세포는 반복적인 실험(n=5)에 의한 대표 영상이다.]
도 10은 (a) 쥐의 해마절편의 CA1-CA3 구역의 밝은-필드(bright-field) 를 나타내고, SHS-M2로 표지하기 전에 1시간 동안 Cys(1 mM)로 전처리되지 않은 (b) 및 전처리된 (c), 20 μM SHS-M2로 1 시간 동안 염색된 쥐의 해마절편 가변색 이광자 형광 영상을 나타내고, (d)는 20 μM 화합물 SHS-M2-2로 1시간 동안 염색된 쥐의 해마절편 영상이고, (e)는 (b-d)에서의 평균 형광강도 (F노랑/F파랑)를 나타내는 도이다. 여기서, TPM 영상은 120 μm 깊이에서 40 배 확대하였고, 이광자 형광 방출은 펨토초(fs) 펄스와 함께 750 nm 여기 파장에서 두 개의 채널(파랑 = 425-470 nm, 노랑 = 525-575 nm)을 통해 수집되었다(스케일 바: 300 μm(a) 및 75 μm(d)).
도 11은 CBS 발현 수준 및 황화수소(H2S) 생성량 사이의 상관 관계를 나타내는 도이다. 여기서, (a, b) 신생아 쥐의 뇌로부터 얻은 성상세포를 각각 5일 동안 CBS-특이 siRNA (20 nM) 또는 비표적화된(NT) siRNA로 전처리하였다. (a) CBS mRNA 수준 및 (b) 단백질 수준은 각각 Q-PCR 및 Western blot을 이용하여 분석하고 정량화하였다. (c) CBS-특이 또는 NT siRNA로 처리된 성상세포를 1시간 동안 2 μM SHS-M2로 염색하였고, 영상은 750 nm 여기를 이용해 얻어졌으며, 방출 윈도우(emission windows)는 파랑(425-470 nm) 및 노랑(525-575 nm)을 이용하였다. (d) 평균 강도 비(F노랑/F파랑)을 나타낸다. (a-b) 의 수치는 3가지 시료의 평균 ± 평균의 표준 오차(standard error of the mean, SEM)이고, (d)에서의 수치는 3가지 시료의 평균 ± 표준 편차(standard deviation, SD)이다. 여기서, (c)에서의 스케일 바는 20 μm이고, 세포는 반복적인 실험(n=3)에 의한 대표 영상이다.
도 12는 DJ-1-녹 아웃(KO)된 성상세포에서의 약해진 황화수소(H2S) 생성 및 CBS 발현을 나타내는 도이다. (a, b) 야생형(wild-type, WT) 및 DJ-1-녹 아웃(KO)된 쥐 뇌로부터 배양된 성상세포를 1시간 동안 20 μM SHS-M2로 염색하였다. (a) 성상세포의 가변색 이광자 형광 영상은 WT 세포에 비해 KO된 성상세포에서 황화수소(H2S) 생성이 감소되었음을 보여준다. (b) TPM 영상에서 평균 강도 비(F노랑/F파랑)를 나타낸다. WT 및KO된 성상세포에서의 (c) CBS mRNA 및 (d) 단백질 수준이 각각 Q-PCR 및 Western blot을 이용하여 결정되었다. (b) 의 수치는 3가지 시료의 평균 ± SD이고, (c) 및 (d)에서의 수치는 3가지 시료의 평균 ± SEM이다. (a)에서의 스케일 바는 20 μm이다.
도 13은 DJ-1-녹 아웃(KO)된 뇌에서의 약해진 황화수소(H2S) 생성 및 CBS 발현을 나타내는 도이다. 뇌 절편은 야생형(wild-type, WT) 및 DJ-1-녹 아웃(KO)된 쥐로부터 얻어졌다. (a-c) 해마절편을 준비하여 (a) GFAP 및 CBS 염색을 위해 이용하였다. (b)에서, 오른쪽 패널(panel)은 왼쪽 패널의 박스 영역(boxed area)의 고배율 영상이다. (d, e) 슬라이싱 스트레스(slicing stress)로부터 조직을 안정화시키기 위해 슬라이싱 후 외피 절편을 7일 동안 배양하였고, 그 후 황화수소 생성이 측정되었다. (c) 및 (e)의 수치는 3가지 시료의 평균 ± SD 이다 (스케일 바: (a) 30 μm, (b) 왼쪽 75 μm, 오른쪽 30 μm, (d) 75 μm).
본 발명은 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 생체 내의 황화수소(H2S) 검출을 위한 가변색 이광자 형광 프로브를 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000002
상기 화학식 1 및 2에서, Х는 O, S 또는 Se 이다.
또한, 본 발명은
(1) 6-(메틸아미노)-2-나프트알데하이드(화합물 A)와 4-니트로벤젠술포닐 클로라이드를 반응시켜 화합물 B를 제조하는 단계;
(2) 상기 화합물 B와 3.3'-디설페인디일비스(4-아미노페놀)(화합물 C)를 반응시켜 화합물 D를 제조하는 단계;
(3) 상기 화합물 D와 메틸브로모아세테이트를 반응시켜 화합물 E를 제조하는 단계;
(4) 상기 화합물 E에 티오페놀을 가하고 반응시킨 후, 수산화 리튬(LiOH) 수용액을 가하여 반응시켜 화합물 F를 제조하는 단계;
(5) 상기 화합물 F를 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)/ 1-히드록시벤조트리아졸 및 (2-아미노에틸) 트리페닐포스포니윰브로마이드와 반응시켜 화합물 I를 제조하는 단계;
(6) 화합물 G를 트리포스겐과 반응시켜 화합물 H를 제조하는 단계; 및
(7) 상기 화합물 I와 화합물 H를 반응시켜 화학식 1의 화합물(SHS-M1)을 제조하는 단계를 포함하며, 하기 반응식 1로 표시되는 화학식 1 의 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000003
상기 반응식 1에서, Х는 O, S 또는 Se이며, (a): 4-니트로벤젠술포닐클로라이드 (4-nitrobenzenesulfonylchloride), 피리딘 (pyridine), 디클로로메탄(CH2Cl2), 실온, 12 h, (b): p-TSA, DMF, 90 ℃, 14 h, (c): 메틸브로모아세테이트(methyl bromoacetate), K2CO3, CH3CN, 90 ℃, 18 h, (d): i): 티오페놀(thiophenol), K2CO3, DMF, 실온, 3 h. ii): LiOH, THF, 실온, 6 h, (e): (2-아미노에틸)트리페닐포스포니윰브로마이드((2-aminoethyl)triphenylphosphonium bromide), DCC, HOBt, CH2Cl2, N2, 실온, 10 h (f): 트리포스겐(triphosgene), Na2CO3, N2, 실온, 6 h이다.
또한, 본 발명은
(1') 화합물 G를 트리포스겐과 반응시켜 화합물 H를 제조하는 단계; 및
(2') 화합물 H를 화합물 J와 반응시켜 화학식 2의 화합물(SHS-M2)을 제조하는 단계를 포함하며, 하기 반응식 2로 표시되는 화학식 2 의 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법을 제공한다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000004
상기 반응식 2에서, Х는 O, S 또는 Se 이며, (f): 트리포스겐(triphosgene), Na2CO3, N2, 실온, 6 h, (g): 피리딘(pyridine), CH2Cl2, N2, 실온, 6 h이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 황화수소 검출용 가변색 이광자 형광 프로브는, 이광자 형광체로 6-(benzo[d]thiazol-2'-yl)-2-(N,N-dimethylamino)naphthalene (BTDAN) 을 포함하고, 황화수소 수용체로 4-아지도벤질(4-azidobenzyl)을 카르밤산염 (carbamate) 형태로 도입한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 반응식 1 및 2에서 화합물 A, C, G 및 J는 공지된 방법([1] J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 11132., [2] J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 4246. 및 [3] Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 1532.)에 의해 제조될 수 있다
상기 (1)단계는 화합물 B를 제조하는 단계로, 건조된 CH2Cl2에 있는 공지된 화합물 A의 현탁액에 4-니트로벤젠술포닐클로라이드을 가하고 교반하여 생성된 조생성물을, 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색의 고체 화합물로 화합물 B를 제조한다.
상기 (2)단계는 화합물 D를 제조하는 단계로, 화합물 B, 3.3'-디설페인디일비스(4-아미노페놀)(화합물 C) 및 p-TSA 를 건조된 DMF에 용해한 후, 이를 여과하여 얻은 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색의 고체 화합물로 화합물 D를 제조한다.
상기 (3)단계는 화합물 E를 제조하는 단계로, 건조된 CH3CN에 있는 화합물 D 및 K2CO3 의 현탁액에 메틸브로모아세테이트를 가하고 교반하여 얻은 조생성물을, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색의 고체 화합물로 화합물 E를 제조한다.
상기 (4)단계는 화합물 F를 제조하는 단계로, K2CO3의 존재 하에 건조된 DMF내 화합물 E용액에 티오페놀을 가하고 교반하여 얻은 조생성물을, 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 회색의 고체인 탈보호된 중간체를 제조한 다음, 상기 중간체를 THF에 용해한 후, LiOH 수용액으로 처리 및 교반하고, 희석된 HCl(aq)로 산성화함으로써, 짙은 갈색의 고체 화합물로 화합물 F를 제조한다.
상기 (5)단계는 화합물 I를 제조하는 단계로, 건조된 DCM 내 화합물 F 용액에 1,3-디사이클로헥실카보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸을 가하고 교반한 후, (2-아미노에틸)트리페닐포스포니윰브로마이드를 가하고 교반하여 얻은 조생성물을, 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색의 고체 화합물로 화합물 I를 제조한다.
상기 (6)단계는 화합물 H를 제조하는 단계로, Na2CO3 및 트리포스겐을 감압 하에 건조 및 냉각하고, 여기에 THF를 가하고 교반한 후, 화합물 G용액을 가하고 교반하여 화합물 H를 제조한다.
상기 (7)단계는 화합물 SHS-M1(화학식 1)를 제조하는 단계로, 화합물 I 및 피리딘의 용액에 화합물 H 용액을 가한 후 용매를 증발시켜 얻은 조생성물을, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 회색의 고체 화합물로 화학식 1의 화합물을 제조한다.
상기 (1')단계는 화합물 H를 제조하는 단계로, 상기 (6)단계와 동일한 방법으로 제조된다.
상기 (2')단계는 화합물 SHS-M2(화학식 2)를 제조하는 단계로, 상기 화합물 H 및 화합물 J의 용액에 피리딘을 가하고 교반하여 얻은 조생성물을, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색의 고체 화합물로 화학식 2의 화합물을 제조한다.
상기 제조된 가변색 이광자 형광 프로브는 HEPES 완충 용액에서 3.0 ~ 5.0 μM 용해도를 나타내었고, 황화수소(H2S)와 반응하여 적색 편이 현상 및 0.2 ~ 0.4 mM 의 생체 외 검출 한계를 나타내었다.
또한, 본 발명은
(a) 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물 중 어느 하나의 가변색 이광자 형광 프로브를 생체 내에 주입하는 단계;
(b) 상기 가변색 이광자 형광 프로브가 생체 내 황화수소와 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및
(c) 상기 형광을 가변색 이광자 현미경으로 관측하는 단계
를 포함하는, 가변색 이광자 형광 프로브를 이용한 황화수소의 영상화(imaging) 방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000005
[화학식 2]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000006
상기 화학식 1 및 2에서, Х는 O, S 또는 Se이다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000007
[화학식 4]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000008
상기 화학식 3 및 4에서, Х는 O, S 또는 Se이고, n은 1 내지 50의 정수이다.
상기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물은 미토콘드리아 탐침으로 트리페닐포스포니윰 염(triphenylphosphonium salt, TPP)을 도입하였고, 상기 화학식 3 및 4로 표시되는 화합물은 세포질 탐침으로 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 도입한 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 (a) 단계에서 이광자 형광 프로브를 매우 낮은 농도로 생체 내에 30 분 동안 주입시킴으로써 미토콘드리아 또는 세포질에 선택적으로 위치시킬 수 있다. 생체 내에 주입 후 이광자 현미경의 여기원은 750 nm에 해당하는 근적외선 빛을 사용하고, 400 ~ 480 nm(F파랑) 및 495 ~ 575 nm(F노랑) 두 채널에서 형광의 세기를 동시에 측정한다. 상기에 의해 관측되는 상대적 형광강도의 비율(F노랑/ F파랑)은 황화수소의 농도 변화에 따라 가변적인 특징을 나타낸다.
형광의 범위는 황화수소와 반응하기 전의 400 ~ 480 nm 범위에서 황화수소와 반응한 후의 495 - 575 nm으로 발색 범위가 달라지며, 이 때, 이광자 여기 형광의 세기가 40 배 정도 증가되어 고해상도의 이광자 현미경 영상을 얻는 효과를 나타낸다. 낮은 여기 에너지를 갖는 2 개의 근적외선 광자들을 여기원으로 사용하는 이광자 현미경(TPM)은 일광자 현미경에 비해서 90 ~ 180 ㎛ 범위의 깊은 투과 깊이를 가져, 생체 세포 및 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체 조직에서 황화수소를 탐지할 수 있다. 또한 본 발명의 이광자 형광 프로브는 세포 내부에서 광안정성의 특징으로 인해 60분 이상 지속적인 황화수소 탐지가 가능하며, 보다 바람직하게는 30 분 ~ 90 분 동안 탐지가 가능하다.
따라서, 상기 가변색 이광자 형광 프로브 중, 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물은 세포 내 소기관 중 미토콘드리아에 선택적으로 염색되고, 화학식 3 및 4로 표시되는 화합물은 세포질에 선택적으로 염색되며, 황화수소(H2S)와 반응하여 400 ~ 480 nm(F파랑) 및 495 ~ 575 nm(F노랑)의 파장에서 상대적 형광강도의 비율(F노랑/F팡랑)을 증가시키므로, 황화수소(H2S)에 대한 선택성 및 활동성을 영상화시키는 형광 프로브로서 이용될 수 있다.
상기 가변색 이광자 형광 프로브는 황화수소(H2S)에 대하여 강한 선택성을 가지는 것을 특징으로 한다. 일 실시예에 따르면, 글루타티온(GSH), 시스테인(cys) 및 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol, 2-ME)에 비해 5 ~ 8 배 더 큰 형광 강도를 나타내며, 생물학적으로 연관된 RSS (리포 산, SO3 2-, S2O3 2-, SCN-), RNS (NO2 -, NO), ROS (H2O2, O2 -, t-BuOOH, HOCl), 티올기(Ala, Glu)가 없는 아미노, 및 금속 이온들(Ca2+, K+, Na+, Fe3+, Zn2+, Mg2+)에 대해서는 거의 형광 반응을 나타내지 않는다.
상기 가변색 이광자 형광 프로브는 생체와 관련된 pH 범위에서 pH-미반응인 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 영상화 방법을 통해 미토콘드리아 또는 세포질 내에서 황화수소의 분포 및 활동성을 효과적으로 영상화할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공하는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 가변색 이광자 형광 프로브(SHS-M1 및 SHS-M2)의 제조
하기 반응식 1 및 2에서 화합물 A, C, G 및 J는 공지된 방법([1] J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 11132., [2] J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 4246. 및 [3] Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 1532.)에 의해 제조되었다.
1.1 SHS-M1 (화학식 1)의 제조
[반응식 1]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000009
상기 반응식 1에서, Х는 O, S 또는 Se이고, (a): 4-니트로벤젠술포닐클로라이드(4-nitrobenzenesulfonylchloride), 피리딘 (pyridine), 디클로로메탄(CH2Cl2), 실온, 12 h, (b): p-TSA, DMF, 90 ℃, 14 h, (c): 메틸브로모아세테이트(methyl bromoacetate), K2CO3, CH3CN, 90 ℃, 18 h, (d): i): 티오페놀(thiophenol), K2CO3, DMF, 실온, 3 h. ii): LiOH, THF, 실온, 6 h, (e): (2-아미노에틸)트리페닐포스포니윰브로마이드 ((2-aminoethyl)triphenylphosphonium bromide), DCC, HOBt, CH2Cl2, N2, 실온, 10 h (f): 트리포스겐(triphosgene), Na2CO3, N2, 실온, 6 h이다.
(1)화합물 B의 제조
피리딘(1.5 mL, 18.4 mmol) 존재 하에 건조된 CH2Cl2 (20 mL)에 있는 6-(메틸아미노)-2-나프트알데하이드(6-(methylamino)-2-naphthaldehyde)(화합물 A, 1.0 g, 5.4 mmol)의 현탁액에 CH2Cl2 내 4-니트로벤젠술포닐클로라이드(1.50 g, 6.8 mmol) 용액을 방울 방울 가한 후, 전체 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응을 종결한 후, 용매를 증발시키고, NaHCO3 수용액을 가한 다음, CH2Cl2로 희석하였다. 유기 층을 추출하여 무수 Na2SO4로 건조하였고, 감압 하에 농축하였다. 조생성물(crude product)을 용리제로서 CHCl3을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색 고체인 화합물 B를 얻었다 (수득량: 1.7 g (85 %); m.p. 178-180℃).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) = 7.98 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.59 (s, 1H), 7.41 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.35 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ (ppm) = 191.2, 149.7, 141.5, 140.4, 135.8, 134.2, 133.3, 130.9, 130.3, 128.6, 128.5, 125.1, 124.1, 123.7, 123.5, 38.1.
(2)화합물 D의 제조
화합물 B(1.6 g, 4.3 mmol), 3.3'-디설페인디일비스(4-아미노페놀) (3,3'-disulfanediylbis(4-aminophenol)(화합물 C, 1.24 g, 4.3 mmol) 및 p-TSA (74 mg, 0.43 mmol)를 10 mL 건조된 DMF에 용해하였다. 반응 혼합물을 90℃, 질소 분위기 하에서 14시간 동안 유지한 후, 50ml 냉각수에 부었다. 여과하여 얻은 고체 침전물을 물로 세척한 후 진공 하에 건조하였다. 조생성물을 EtOAc:헥산(3:2)을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색 고체인 화합물 D를 얻었다(수득량: 550 mg (26 %); m.p. 250-252℃).
1H NMR (d 6 -DMSO, 400 MHz): δ (ppm) = 9.1 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.21 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.1 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.46 (s, 1H), 7.27 (br s, 1H), 7.21 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.26 (s, 3H).
13C NMR NMR (d 6 -DMSO, 100 MHz): δ (ppm) = 163.6, 156.5, 150.6, 147.8, 141.7, 139.8, 136.8, 134.4, 132.3, 131.9, 130.3, 129.7, 129.6, 126.8, 126.3, 125.2, 125.1, 124.2, 117.0, 107.5, 38.9.
(3)화합물 E의 제조
건조된 CH3CN (12 mL)에 있는 화합물 D(500 mg, 1.02 mmol) 및 K2CO3 (423.0 mg, 3.0 mmol)의 현탁액에 메틸브로모아세테이트(0.14 mL, 1.3 mmol)를 가한 후, 반응 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 물을 가하고, CH2Cl2로 추출하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조하였고, 감압 하에 농축하였다. 조생성물을 용리제로서 EtOAc:헥산(2:3)을 이용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색 고체인 화합물 E를 얻었다(수득량: 510 mg (88 %); m.p. 195-197℃).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) = 8.49 (s, 1H), 8.3 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.2 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.39 (bs, 1H), 7.31 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.75 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.35 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ (ppm) = 169.2, 165.7, 156.1, 150.3, 149.5, 142.2, 139.4, 136.6, 134.3, 132.2, 132.0, 130.1, 129.1, 128.9, 126.9, 125.6 125.5, 124.8, 124.3, 124.2, 116.3, 105.9, 66.2, 52.8, 38.7.
(4)화합물 F의 제조
(i) 화합물 E의 4-니트로벤젠술폰아마이드(4-nitrobenzenesulfonamide) 부분을 탈보호(deprotection)한 다음, 메틸아세테이트(methylacetate) 부분을 염기 촉매 가수 분해하여 화합물 F를 제조하였다. 먼저, K2CO3 (276.4 mg, 2.0 mmol)의 존재 하에 건조된 DMF(6 mL) 내 화합물 E(450 mg, 0.80 mmol) 용액에 교반하면서 티오페놀(0.16 mL, 1.6 mmol)을 가하였고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 물을 가한 다음, CH2Cl2로 추출하고. 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조하였다. 조생성물을 용리제로서 EtOAc:헥산(1:1)을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 회색(off-white) 고체인 탈보호된 중간체를 얻었다(수득량: 245 mg (81 %); m.p. 138-140℃).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) = 8.32 (s, 1H), 8.02 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.36 (br s, 1H), 7.12 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.9 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.78 (br s, 1H), 4.72 (s, 2H), 4.1 (br s, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.97 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ (ppm) = 169.3, 167.3, 155.6, 149.7, 148.4, 136.9, 136.2, 129.9, 127.4, 127.1, 126.9, 126.7, 125.0, 123.6, 118.8, 115.7, 106.0, 103.5, 66.3, 52.7, 30.9.
(ii) 상기 중간체(250 mg, 0.66 mmol)를 5 mL THF에 용해한 후, 2 mL LiOH (0.1 g, 4.1 mmol) 수용액으로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후, 용매를 제거한 후, 냉각수 5mL 를 가하였고, pH = 4인 희석된 HCl (aq)로 산성화하였다. 여과하여 얻은 갈색의 침전물을 물 및 디에틸에테르로 세척한 후, 진공 하에 건조하여 짙은 갈색 고체인 화합물 F를 얻었다(수득량: 210 mg (87 %); m.p. 210-212℃).
1H NMR (d 6 -DMSO, 400 MHz): δ (ppm) = 8.31 (s, 1H), 7.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 6.36 (br s, 1H), 4.73 (s, 2H), 2.81 (s, 3H).
13C NMR (d 6 -DMSO, 100 MHz): δ (ppm) = 170.7, 166.2, 156.3, 149.7, 149.0, 137.3, 136.0, 130.1, 127.4, 126.8, 126.3, 126.1, 124.6, 123.5, 119.7, 116.4, 106.5, 102.1, 66.1, 30.3.
(5)화합물 I의 제조
건조된 DCM (10 mL) 내 화합물 F(200 mg, 0.55 mmol) 용액에 교반하면서 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide) (284 mg, 1.4 mmol), 및 1-히드록시벤조트리아졸 (1-hydroxybenzotriazole)을 가한 후, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 (2-아미노에틸)트리페닐포스포니윰브로마이드((2-aminoethyl)triphenylphosphonium bromide) (220 mg, 0.57 mmol)를 가하고, 10시간 동안 계속해서 교반하였다. 용매를 증발시키고, 조생성물을 CH3CN에 용해하였다. 침전물인 디사이클로헥실우레아 (dicyclohexylurea)을 여과하여 제거한 후, 여과액을 감압 하에 농축하였다. 조생성물을 용리제로서 CHCl3:CH3OH (9:1)을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색 고체인 화합물 I을 얻었다(수득량: 280 mg (70 %); m.p. 125-127℃).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) = 9.18 (br t, J = 5.6 Hz, 1H, amide-NH), 8.31 (s, 1H), 8.02 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.86-7.61 (m, 17 H), 7.49 (br s, 1H), 7.3 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.78 (s, 1H), 4.35 (s, 2H), 4.02-3.97 (m, 2H), 3.94-3.88 (m, 2H), 2.97 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ (ppm) = 168.9, 166.9, 155.3, 149.3, 148.7, 136.8, 135.9, 135.4, 133.3, 133.7, 133.6, 130.7, 130.5, 129.7, 127.2, 126.7, 126.6, 126.5, 124.7, 123.3, 119.1, 118.1, 117.2, 116.1, 106.2, 102.9, 67.4, 36.9, 33.3, 30.7, 23.0.
(6)화합물 H의 제조
Na2CO3 (2.5 g, 23 mmol) 및 트리포스겐 (994 mg, 3.4 mmol)을 둥근-바닥 플라스크에서 감압 하에 건조하였다. 플라스크를 얼음 욕조(ice bath)에서 냉각한 후, THF (15 mL)을 가하였다. 암실의 질소 분위기 하에서 0℃, 1시간 동안 교반한 후, 건조된 THF (15 mL)에 있는 화합물 G(1.0 g, 6.7 mmol) 용액을 방울 방울 가하고, 실온에서 6시간 동안 추가적으로 교반하였다. 반응이 종결된 후, 용매를 감압 하에 제거하고, 생성된 화합물 H을 추가적인 정제 없이 다음 단계에 이용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.26 (s, 2H)
(7)화합물 SHS-M1 (화학식 1)의 제조
건조된 CH2Cl2 (10 mL) 내 화합물 I(100 mg, 0.14 mmol) 및 피리딘(0.1 mL, 1.2 mmol)의 용액에 CH2Cl2 (10 mL) 내 화합물 H(29 mg, 0.14 mmol) 용액을 방울 방울 가하고, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온에서 6시간 동안 유지하였다. 용매를 증발시키고, 조생성물을 용리제로서 CHCl3 내 CH3OH (8%)을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 회색 고체인 최종 화합물 SHS-M1을 얻었다(수득량: 80 mg (65 %); m.p. 135-137℃).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) = 9.35 (br t, J = 5.8 Hz, 1H, amide-NH), 8.46 (s, 1H), 8.17 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.86-7.76 (m, 11H), 7.71-7.66 (m, 7H), 7.6 (br s, 1H), 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.38 (s, 2H), 4.06-3.99 (m, 2H), 3.96-3.90 (m, 2H), 3.43 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ (ppm) = 168.9, 165.8, 155.8, 155.4, 149.3, 142.0, 139.9, 136.3, 135.4, 134.6, 133.8, 133.7, 133.2, 131.3, 131.2, 130.7, 130.6, 129.7, 129.4, 128.6, 126.8, 124.9, 125.0, 123.8, 119.2, 118.2, 117.4, 116.5, 106.2, 67.3, 67.2, 38.1, 33.3, 31.9, 23.0.
HRMS (FAB+): (m/z, %) calculated for [C48H40N6O4PS]+ was 827.2569; found 827.2579.
1.2 SHS-M2 (화학식 2)의 제조
[반응식 2]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000010
상기 반응식 2에서, Х는 O, S 또는 Se이고, (f): 트리포스겐(triphosgene), Na2CO3, N2, 실온, 6 h, (g): 피리딘(pyridine), CH2Cl2, N2, 실온, 6 h이다.
15 mL 건조된 CH2Cl2 내 화합물 H(30 mg, 0.142 mmol) 및 화합물 J(100 mg, 0.142 mmol)의 용액에 교반하면서 건조된 피리딘 (0.15 mL, 1.86 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응이 종결된 후에, 용매를 증발시키고, 조생성물을 용리제로서 디에틸에테르에 있는 CH3OH (15%)을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 노란색 고체인 화합물 SHS-M2을 얻었다(수득량: 93 mg (81 %); m.p. 159-161℃).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 9.94 (br t, 1H, amide-NH), 8.71 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.23-8.19 (m, 2H), 8.08 (d, J = 8.4, 1H), 7.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.88-7.64 (m, 17H), 7.47 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.16 (s, 2H), 4.05-4.02 (m, 4H), 3.43 (s, 3H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 173.4, 169.9, 159.2, 158.3, 145.3, 138.2, 138.0, 137.9, 136.8, 136.7, 136.2, 134.3, 134.0, 133.6, 133.5, 133.2, 132.7, 132.6, 131.6, 130.5, 129.4, 128.2, 125.8, 125.2, 122.2, 121.5, 120.7, 70.2, 41.1, 37.2, 33.0.
HRMS (FAB+): (m/z, %): calculated for [C47H38N6O3PS]+ was 797.2464; found 797.2465.
실험예 1. HEPES 완충 용액에서의 용해도 측정
본 발명에 따른 실시예 1의 이광자 형광 프로브(SHS-M1 및 SHS-M2)의 소량을 DMSO에 용해하여 저장액 (1.0×10-2 M)을 준비하였다. 이후 상기 용액을 1.0×10-5 내지 5.0×10-8 M로 희석시키고, 마이크로 주사기를 이용하여, 2.0 mL 의 HEPES 완충 용액 (30 mM, 100 mM KCl, pH 7.4)을 함유하는 큐벳(cuvette)에 첨가하였다. 모든 경우, 물에서의 DMSO 농도는 0.2 %를 유지하였다.
이광자 형광 프로브(SHS-M1(a, b) 및 SHS-M2(c, d))에 대한 (a, c) 단일광자 형광 스펙트럼 및 (b, d) HPPES 완충 용액(30 mM, 100 mM KCl, pH 7.4)에서의 이광자 형광 프로브의 농도에 따른 형광 강도를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 이광자 형광 프로브의 농도에 따른 형광 강도는 저농도에서 선형을 나타내지만, 고농도로 갈수록 아래쪽으로 떨어지는 곡선을 나타내었다. 이 경우 이광자 형광 프로브의 용해도는 선형 패턴을 나타내는 최고 농도로 결정된다. HEPES 완충 용액에서 SHS-M1 및 SHS-M2는 ~ 3.0 및 5.0 μM 용해도를 나타내었고 세포 염색에 있어서 매우 효과적임을 보여주었다.
실험예 2. 광물리적 특성
[반응식 3]
Figure PCTKR2013011734-appb-I000011
상기 반응식 3에서, SHS-M1 및 SHS-M2로부터 아지드(azide) 그룹을 가진 티올레이트(thiolate)-동기화된 반응이 카바메이트(carbamate) 결합을 깨고 아미노 그룹을 방출하여 상기 화합물 SHS-M1-1 및 SHS-M2-2가 생성된다. 이광자 형광 프로브(SHS-M1 및 SHS-M2)와 상기 SHS-M1-1 및 SHS-M2-2의 광물리적 특성을 표 1에 나타내었다.
표 1
구분a λ abs (10-4ε)b λfl c Φd λmax (2) e Φδmaxf
SHS-M1 340 (1.9) 420 0.23 (0.41) 750 14 (32)
SHS-M1-1 365 (1.8) 500 0.50 (1.00) 750 63 (76)
SHS-M2 343 (1.4) 464 0.24 (1.00) 740 17 (60)
SHS-M2-2 383 (1.5) 545 0.12 (1.00) 750 55 (177)
[a] 모든 측정은 HEPES 완충 용액(30 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7.4)에서 실시하였다.
[b] 단일광자 흡수 스펙트럼의 λmax 값으로 단위는 nm이다. 괄호 안의 숫자는 몰 흡광 계수로 10-4 × M-1cm-1 단위이다.
[c] 단일광자 방출 스펙트럼의 λmax 값으로 단위는 nm이다
[d] 형광 양자 수율(fluorescence quantum yield), ±15 %. 괄호 안의 숫자는 EtOH에서 측정되었다.
[e] 이광자 여기 스펙트럼의 λmax 값으로 단위는 nm이다
[f] 광자당 피크 이광자 동작 단면적(two photon action cross-section))으로 GM의 단위를 가진다(1GM = 10-50 cm4 s photon-1), ±15 %. 괄호 안의 숫자는 EtOH에서 측정되었다.
표 1에 나타난 바와 같이, SHS-M1 및 SHS-M2의 λ abs 값은 거의 같으나, SHS-M2-2는 강한 전자를 끄는 기(electron-withdrawing group)를 가지므로, SHS-M1-1에 비해 약 18nm 적색-편이하였음을 알 수 있다. 또한, SHS-M2 및 SHS-M2-2는 전하-전달 자극 상태(charge-transfer excited state)의 더 큰 안정성으로 인해 SHS-M1 및 SHS-M1-1에 비해 더 큰 스토크스 이동(stokes shift)이 관찰된다.
1,4-디옥산(1,4-dioxane), DMF, EtOH, 및 HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서, (a,b) SHS-M1, (c,d) SHS-M1-1, (e,f) SHS-M2 및 (g,h) SHS-M2-2의 정규화된 흡수 (a,c,e,g) 및 방출 (b,d,f,h) 스펙트럼 및 (d)SHS-M1-1 및 (h)SHS-M2-2로 표지된 HeLa 세포로부터 얻은 이광자 여기 형광 스펙트럼 (■)을 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 용매 극성을 증가시킴에 따라, SHS-M1-1 및 SHS-M2-2의 방출 스펙트럼은 SHS-M1 및 SHS-M2의 방출 스펙트럼보다 더 큰 적색-편이를 나타내었다. 또한, 헬라 세포(HeLa cell)에서 측정된 SHS-M1-1 및 SHS-M2-2의 이광자-여기 형광 스펙트럼은 에탄올(EtOH)에서 측정된 것과 유사하였고, 이것은 에탄올이 세포 환경(cellar environment)의 극성을 적절히 대변함을 나타낸다.
HEPES 완충 용액(30 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7.4)에서 1 μM의 (a) SHS-M1 및 (b) SHS-M2와 100 μM의 Na2S 의 형광 반응을 시간(0~60분)에 따라 도 3에 나타내었다.
도 3(a)에 나타난 바와 같이, SHS-M1와 Na2S 의 반응은 420 nm의 파장의 강도를 감소시키는 반면, 500 nm의 파장의 강도를 점점 증가시기는 것으로 나타났다. 또한 유사하게, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, SHS-M2와 Na2S 의 반응은 464 nm의 파장의 강도을 감소시키는 반면, 545 nm의 파장의 강도를 점점 증가시키는 것으로 나타났다. 상기 반응은 SHS-M1 및 SHS-M2에 대해 각각 kobs = 1.4×10-3 s-1 및 kobs = 9.1×10-4 s-1 를 갖는 유사 1차 반응 속도론(pseudo-first order kinetics)을 따른다. 또한 [Na2S]의 농도 대 kobs 의 플럿은 선형의 기울기를 나타내었고, 상기 반응이 SHS-M1 및 SHS-M2에 대해 각각 k2=5.8 및 7.0 M-1s-1을 갖는 전체 2차(overall second order) 반응임을 나타내었다.
HEPES 완충 용액 (30 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7.4)에서 [Na2S]의 농도에 따른 (a) SHS-M1 및 (b) SHS-M2의 형광 강도 비율을 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, (a) SHS-M1 및 (b) SHS-M2 의 H2S에 대한 생체 외(in vitro) 검출 한계는 각각 0.2 및 0.4 μM인 것으로 나타났다.
실험예 3. 이광자 형광 프로브의 황화수소에 대한 선택성
HEPES 완충 용액(pH 7.4)에서 1 μM의 (a) SHS-M1 및 (b) SHS-M2와 활성 황(RSS), 질소(RNS), 및 산소(ROS) 종, 아미노 산, 금속 이온들 및 100 μM의 Na2S를 첨가한 경우의 상대적인 형광 강도를 도 5에 나타내었다. 막대는 상기 물질을 첨가 후 각각 0, 30, 60 및 90분에서의 λfl의 방출 강도의 비율을 나타낸다.
도 5에 나타난 바와 같이, SHS-M1 및 SHS-M2는 생물학적으로 연관된 활성 황(RSS), 질소(RNS), 및 산소(ROS) 종에 비해 H2S에 대한 높은 선택도를 나타내었다. 또한, 두 이광자 형광 프로브 모두, 10mM 글루타티온(GSH), 1 mM 시스테인(cys) 및 1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol, 2-ME)에 비해 H2S에 대해 5 ~ 8 배 더 큰 형광 강도를 나타내었다. 더욱이 두 이광자 형광 프로브 모두, GSH(10 mM) 또는 Cys(1 mM) 존재 하에 100 μM의 Na2S를 첨가한 경우도 강한 형광 반응을 나타내었고, GSH 및 Cys 에 대한 H2S의 높은 선택도를 보여주었다. 다른 생물학적으로 연관된 RSS (리포 산, SO3 2-, S2O3 2-, SCN-), RNS (NO2 -, NO), ROS (H2O2, O2 -, t-BuOOH, HOCl), 티올기(Ala, Glu)가 없는 아미노, 및 금속 이온들(Ca2+, K+, Na+, Fe3+, Zn2+, Mg2+)은 무시할 만한 형광 반응을 나타내었다. 보편적인 완충 용액(0.1 M 시트로산(citric acid), 0.1 M KH2PO4, 0.1 M Na2B4O7, 0.1 M Tris, 0.1 M KCl)에서 (a) SHS-M1 (●) 및 SHS-M1-1 (○), 및 (b) SHS-M2 (●) 및 SHS-M2-2 (○)에 대한 pH 변화에 따른 형광 변화를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 이광자 형광 프로브(SHS-M1 및 SHS-M2)는 생물학적으로 연관된 pH 범위에서 높은 형광 강도를 나타내며, pH 조건에 따라 영향 받지 않음을 나타내었다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 생물학적으로 연관된 다른 종 및 pH 조건에 거의 영향 받지 않고, 생체 내 황화물(sulfide)를 검출하는데 매우 유용하다는 것을 알 수 있다.
실험예 4. 이광자 형광 프로브(SHS-M2)의 미토콘드리아 선택성
본 발명의 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아에 특이한 선택성을 나타내는지 확인하기 위해, SHS-M2와 마이토트랙커레드(MTR)를 이용하여 동시국소화 (Co-localization) 실험을 실시하였다.
(a) SHS-M2 및 (b) 마이토트랙커 레드 FM(MitoTracker Red FM)으로 표지된 HeLa 세포의 영상을 도 7에 나타내었다 [(a) TPM, (b) OPM 영상이고, (c)는 (a)와 (b)의 합친 영상이다].
도 7에 나타난 바와 같이, 이광자 형광 프로브(SHS-M2)에 의해 염색된 도 7(a)에 나타난 강한 녹색 형광 영상이 실제 미토콘드리아를 영상화하는지를 확인하기 위하여, 헬라(HeLa) 세포를 종래의 알려진 미토콘드리아용 단일광자 형광 표지자인 마이토트랙커레드(Mito TrackerRed. Invitrogen 사 제품)로 염색하여 단일광자 적색 형광 영상을 얻은 후(도 7(b)), 얻어진 두 영상을 함께 중첩시켰다(도 7(c)). 도 7(c)에 나타난 바와 같이, 두 염료로 염색한 후 얻어진 영상, 도 7(a) 와 (b)는 서로 일치하는 것을 확인할 수 있으며, 또한 Autoquant X2 software에 의한 SHS-M2와 마이토트랙커의 피어슨의 동시국소화(Pearson's colocalization) 효율은 0.85로 나타나, SHS-M2가 미토콘드리아에 우세하게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 이광자 형광 프로브(SHS-M2)가 미토콘드리아를 정확하게 영상화하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 세포 독성 측정
본 발명의 이광자 형광 프로브가 세포에 독성을 나타내지 않는다는 사실을 확인하기 위하여, HeLa 세포에서 CCK-8 키트(Cell Counting Kit-8, Dojindo, 일본)를 사용하여, 매뉴얼의 프로토콜에 따라 측정하였다. SHS-M2의 존재 하에 SHS-M2로 2시간 동안 배양된 헬라(HeLa) 세포의 생존 능력을 CCK-8 Kit로 측정하여 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, SHS-M2는 낮은 세포 독성(cytotoxicity)을 나타내었고, 살아있는 세포 내의 황화수소를 감지하기 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 이광자 형광 프로브를 이용한 미토콘드리아 내 황화수소의 검출
살아있는 세포 및 조직에서 본 발명의 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아 내 황화수소의 변화를 탐지할 수 있는지를 확인하기 위해 시험하였다. 2μm 의 (a) SHS-M2 또는 (d) SHS-M2-2로 각각 배양된 HeLa 세포의 슈도 컬러(pseudocolored) 가변색 이광자 영상을 도 9에 나타내었다. 여기서, (b, c) HeLa 세포는 SHS-M2로 표지하기 전에 30 분 동안 100 μM의 (b) GSH 또는 (c) Cys로 전처리하였고, (e)는 (a-d)의 평균 형광강도 (F노랑/F파랑)를 나타낸다.
도 9(a), (d) 및 (e)에 나타난 바와 같이, 750 nm 이광자 여기(TP excitation) 상태에서, SHS-M2 및 SHS-M2-2로 표지된 HeLa 세포의 평균 방출비(emission ratio, F노랑/F파랑)는 각각 0.49 및 1.00을 나타내었다.
또한, 도 9(b), (c) 및 (e)에 나타난 바와 같이, H2S의 전구체(precursor)인 GSH 또는 Cys을 첨가한 경우, HeLa 세포의 평균 방출비(F노랑/F파랑)는 0.49로부터 0.76 또는 0.81로 증가하였다.
실험예 7. 이광자 형광 프로브 및 이광자 현미경을 통한 쥐의 해마절편 내부영상
쥐 해마절편에서 이광자 형광 프로브(SHS-M2)의 유용성을 시험하였다. 시스테인(Cys)으로 전처리한 후, SHS-M2로 염색한 쥐의 해마절편의 가변색 이광자 형광 영상을 도 10에 나타내었다.
도 10(a)에 나타난 바와 같이, 쥐의 해마절편에 대한 밝은-필드(bright-field) 영상을 얻었으며, 이를 CA1 및 CA3 구역에 나타내었다. 뇌 조직의 구조는 모든 깊이에서 불균질하므로, 약 90-180μm 깊이의 두께에서 10개의 TPM 영상을 얻었고, 이를 결합하여 전체적인 황화수소 분포를 영상화하였다. 상기 영상을 통해 황화수소는 CA1 및 CA3 영역 모두에서 고르게 분포되어 있지 않음을 확인하였다.
도 10(b) 및 (e)에 나타난 봐와 같이, 고배율 영상은 CA1 구역에 존재하는 각각의 세포에서 120μm 깊이에서 0.51의 평균 방출비를 가지는 황화수소의 분포를 명확하게 나타내었다.
도 10(c) 및 (e)에 나타난 바와 같이, 조직을 1 mM의 Cys으로 50 분간 처리하는 경우, 상기 비율이 0.80까지 증가하였다.
상기 결과는 본 발명의 이광자 형광 프로브(SHS-M2)가 살아있는 세포 및 100 μm 깊이 이상의 조직 내에서 황화수소를 탐지할 수 있음을 뒷받침해 준다.
실험예 8. 이광자 형광 프로브를 이용한 배양된 성상세포 내 황화수소의 검출
본 발명에서는 시스타티오닌 β-신타아제(cystathionine β-synthase, CBS)의 서로 다른 수준(level)에서 생성된 성상세포(astrocytes) 내 황화수소(H2S)의 수준을 이광자 형광 프로브(SHS-M2)로 측정하였다. CBS는 황화수소(H2S) 생성을 촉진시키는 주요 효소이고, 성상세포는 CBS를 발현하여 뇌에 황화수소(H2S)를 생성하는 것으로 알려져 있다[J. Neurosci. 1996, 16, 1066., Neurobiol. Aging 2009, 30, 1523., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 293, 1485.].
본 발명에서는 CBS siRNA (5'-CCC AAA AUU UUA CCA GAU AUU CUU U-3')를 이용하여 성상세포로부터 CBS를 녹아웃(knocked out, KO)시켰다. 5일 동안, CBS siRNA로 전처리된 성상세포는 비표적화된(nontargeted, NT) siRNA (5'-CCU CGU GCC GUU CCA UCA GGU AGU U-3')로 전처리된 세포에 비해 상당히 감소된 CBS mRNA 및 CBS 단백질 수준을 나타내었다. CBS 발현 수준 및 황화수소(H2S) 생성량 사이의 상관 관계를 도 11에 나타내었다.
도 11(c) 및 (d)에 나타난 바와 같이, NT-siRNA 및 CBS siRNA로 각각 전처리한 경우, SHS-M2로 표지된 성상세포의 F노랑/F파랑 비는 0.66으로부터 0.56까지 감소하였고, 이것은 황화수소(H2S) 수준의 평행한 감소를 나타낸다. 상기 결과는 이광자 형광프로브(SHS-M2)을 이용하여, 성상세포 내 CBS 발현 수준 및 황화수소(H2S) 수준 사이의 관계를 확인할 수 있음을 보여준다.
실험예 9. 이광자 형광 프로브를 이용한 DJ-1-부족한 성상세포 및 뇌 절편 내 황화수소의 검출
이광자 형광 프로브(SHS-M2)를 이용하여, DJ-1-부족한 성상세포 및 쥐의 뇌 절편에서 내성(endogenous) 황화수소(H2S)의 수준을 측정하였다. DJ-1은 여러 기능을 가진 PD(parkinson's disease)-관련 유전자로, 성상세포에서 항염증 및 항산화 효과가 있다고 알려져 있다(FASEB J. 2009, 23, 2478., J. Neural Transm. 2010, 117, 599., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005, 102, 9691. 및 J. Biol. Chem. 2011, 286, 35308.). 황화수소 또한, 항염증 및 항산화 효과를 가지고 있기 때문에, DJ-1이 황화수소 생성을 조절할 수 있는지를 확인하는 것은 흥미로운 일이다. DJ-1-녹 아웃(KO)된 성상세포에서의 약해진 황화수소(H2S) 생성 및 CBS 발현을 도 12에 나타내었다.
도 12(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, 성상세포의 가변색 이광자 형광 영상은 야생형(wild type, WT) 세포에 비해 녹 아웃(KO)된 성상세포에서 황화수소(H2S) 생성이 감소되었음을 나타내었고, DJ-1-녹 아웃(KO)된 성상세포내의 F노랑/F파랑 비는 야생형(WT) 성상세포에 비해 0.71로부터 0.46까지 감소하였다. 상기 결과는 내생 황화수소 수준의 평행한 감소를 나타낸다.
또한, 도 12(c) 및 (d)에 나타난 바와 같이, CBS mRNA 및 CBS 단백질 수준은 야생형(WT) 성상세포에 비해 DJ-1-녹 아웃(KO)된 성상세포에서 상당히 감소하였다. 상기 결과는 CBS 발현 수준 및 내생 황화수소 수준의 평행한 감소를 명확하게 나타낸다.
본 발명에서는 또한, 야생형(WT) 및 DJ-1-녹 아웃(KO)된 뇌 절편에서의 CBS 발현 및 황화수소 생성 사이의 관계를 조사하였다. 절편은 야생형(WT) 및 DJ-1-녹 아웃(KO)된 뇌 해마로부터 준비되었고, 각각 GFAP (성상세포 마커) 및 CBS에 대한 특정 항체를 가지고 두 번 염색하였다. DJ-1-녹 아웃(KO)된 뇌에서의 약해진 황화수소(H2S) 생성 및 CBS 발현을 도 13에 나타내었다.
도 13(a)에 나타난 바와 같이, CBS는 GFAP-양성 성상세포에서 검출되었고, CBS의 발현은 DJ-1-녹 아웃(KO)된 성상세포에서 상당히 감소하였다.
도 13(b) 및 (c)에 나타난 바와 같이, 황화수소는 또한 성상세포 형태(morphology)를 가지는 세포에서 검출되었고, 야생형(WT) 절편에 비해 DJ-1-녹 아웃(KO)된 절편에서 상당히 감소하였다. 본 시험에서는 슬라이싱 스트레스(slicing stress)로부터 조직을 안정화시키기 위해 절편(slicing)한지 7일 후의 외피 절편(cortical slices)에서 황화수소 생성을 분석하였다.
도 13(d) 및 (e)에 나타난 바와 같이, SHS-M2 표지된 조직의 가변색 형광 영상은 DJ-1-녹 아웃(KO)된 외피 절편에서 감소된 황화수소(H2S) 수준을 나타내었다. 상기 결과는 이광자 형광 프로브(SHS-M2)를 이용한 가변색 영상이 CBS 발현의 다른 수준으로부터 생성된 황화수소(H2S)의 다른 수준을 측정하는데 있어서 효과적인 도구임을 나타낸다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 생체 내의 황화수소(H2S) 검출을 위한 가변색 이광자 형광 프로브:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013011734-appb-I000012
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013011734-appb-I000013
    상기 화학식 1 및 2에서, Х는 O, S 또는 Se이다.
  2. (1) 6-(메틸아미노)-2-나프트알데하이드(화합물 A)와 4-니트로벤젠술포닐 클로라이드를 반응시켜 화합물 B를 제조하는 단계;
    (2) 상기 화합물 B와 3.3'-디설페인디일비스(4-아미노페놀)(화합물 C)를 반응시켜 화합물 D를 제조하는 단계;
    (3) 상기 화합물 D와 메틸브로모아세테이트를 반응시켜 화합물 E를 제조하는 단계;
    (4) 상기 화합물 E에 티오페놀을 가하고 반응시킨 후, 수산화 리튬(LiOH) 수용액을 가하여 반응시켜 화합물 F를 제조하는 단계;
    (5) 상기 화합물 F를 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)/ 1-히드록시벤조트리아졸 및 (2-아미노에틸) 트리페닐포스포니윰브로마이드와 반응시켜 화합물 I를 제조하는 단계;
    (6) 화합물 G를 트리포스겐과 반응시켜 화합물 H를 제조하는 단계; 및
    (7) 상기 화합물 I와 화합물 H를 반응시켜 화학식 1의 화합물(SHS-M1)을 제조하는 단계를 포함하며, 하기 반응식 1로 표시되는 화학식 1 의 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법:
    [반응식 1]
    Figure PCTKR2013011734-appb-I000014
    상기 반응식 1에서, Х는 O, S 또는 Se이고, (a): 4-니트로벤젠술포닐클로라이드(4-nitrobenzenesulfonylchloride), 피리딘 (pyridine), 디클로로메탄(CH2Cl2), 실온, 12 h, (b): p-TSA, DMF, 90 ℃, 14 h, (c): 메틸브로모아세테이트(methyl bromoacetate), K2CO3, CH3CN, 90 ℃, 18 h, (d): i): 티오페놀(thiophenol), K2CO3, DMF, 실온, 3 h. ii): LiOH, THF, 실온, 6 h, (e): (2-아미노에틸)트리페닐포스포니윰브로마이드 ((2-aminoethyl)triphenylphosphonium bromide), DCC, HOBt, CH2Cl2, N2, 실온, 10 h (f): 트리포스겐(triphosgene), Na2CO3, N2, 실온, 6 h이다.
  3. (1') 화합물 G를 트리포스겐과 반응시켜 화합물 H를 제조하는 단계; 및
    (2') 화합물 H를 화합물 J와 반응시켜 화학식 2의 화합물(SHS-M2)을 제조하는 단계를 포함하며, 하기 반응식 2로 표시되는 화학식 2 의 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법:
    [반응식 2]
    Figure PCTKR2013011734-appb-I000015
    상기 반응식 2에서, Х는 O, S 또는 Se이고, (f): 트리포스겐(triphosgene), Na2CO3, N2, 실온, 6 h, (g): 피리딘(pyridine), CH2Cl2, N2, 실온, 6 h이다.
  4. (a) 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물 중 어느 하나의 가변색 이광자 형광 프로브를 생체 내에 주입하는 단계;
    (b) 상기 가변색 이광자 형광 프로브가 생체 내 황화수소와 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및
    (c) 상기 형광을 가변색 이광자 현미경으로 관측하는 단계
    를 포함하는, 가변색 이광자 형광 프로브를 이용한 황화수소의 영상화(imaging) 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013011734-appb-I000016
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013011734-appb-I000017
    상기 화학식 1 및 2에서, Х는 O, S 또는 Se이다.
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2013011734-appb-I000018
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2013011734-appb-I000019
    상기 화학식 3 및 4에서, Х는 O, S 또는 Se이고, n은 1 내지 50의 정수이다.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 화학식 1 및 화학식 2로 표시된 화합물은 생체 내 미토콘드리아에 선택적으로 염색되는 것을 특징으로 하는, 황화수소의 영상화 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 화학식 3 및 화학식 4로 표시된 화합물은 생체 내 세포질에 선택적으로 염색되는 것을 특징으로 하는, 황화수소의 영상화 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 가변색 이광자 형광 프로브는 생체 내의 황화수소와 반응하여, 400 ~ 480 nm 범위로부터 495 ~ 575 nm 범위의 형광으로 가변하는 것을 특징으로 하는, 황화수소의 영상화 방법.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 황화수소는 생체 세포 또는 100 ~ 200 μm 깊이의 생체 조직에서 탐지되는 것을 특징으로 하는, 황화수소의 영상화 방법.
PCT/KR2013/011734 2013-08-06 2013-12-17 황화수소 검출용 가변색 이광자 형광 프로브, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 생체 내 황화수소의 정량적 영상화 방법 WO2015020281A1 (ko)

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