WO2019240236A1 - 細胞溶解装置、細胞溶解方法、および細胞成分含有液の製造方法 - Google Patents

細胞溶解装置、細胞溶解方法、および細胞成分含有液の製造方法 Download PDF

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WO2019240236A1
WO2019240236A1 PCT/JP2019/023567 JP2019023567W WO2019240236A1 WO 2019240236 A1 WO2019240236 A1 WO 2019240236A1 JP 2019023567 W JP2019023567 W JP 2019023567W WO 2019240236 A1 WO2019240236 A1 WO 2019240236A1
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WO
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filter
cell
liquid
region
flow path
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Application number
PCT/JP2019/023567
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English (en)
French (fr)
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得仁 菊原
清太 中村
隆文 塚原
大平 小田切
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日立化成株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler

Definitions

  • the present disclosure relates to a cell lysis device, a cell lysis method, and a method for producing a cell component-containing liquid.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-198595 discloses a cell capture device that can be used for capturing rare cells such as circulating cancer cells (Circulating Tumor Cell).
  • This cell trapping device has a housing in which a filter is accommodated.
  • the present disclosure has been made in view of the above, and provides a cell lysis device, a cell lysis method, and a method for producing a cell component-containing liquid capable of lysing captured cells and recovering liquid after cell lysis.
  • the purpose is to provide.
  • a cell lysis device includes a cell trapping device including a filter in which a plurality of through holes are formed in the thickness direction, and a test solution including cells to be trapped with respect to the cell trapping device
  • a test solution supply unit for supplying cells, a solution supply unit for supplying a solution for dissolving cells in the test solution to the cell capture device, and cells in the test solution from the cell capture device
  • a lysate recovery unit for recovering a lysate containing the components and a recovery unit for recovering the liquid discharged from the cell capture device, and the cell capture device is a space provided above the filter inside A first region, a second region which is a space provided below the filter, a first channel and a second channel connecting the first region and the outside of the device, a second region and the outside of the device
  • a third flow path connecting between the The lysate supply unit is connected to the first channel, the test solution supply unit and the lysate recovery unit are connected to the second channel, and the recovery unit is connected to the third channel.
  • the lysis solution when lysing the cells captured in the first region, the lysis solution is supplied from the lysis solution supply unit via the first channel and the lysis solution via the second channel. Is recovered in the solution recovery unit. Since each of the first flow path and the second flow path is a flow path connected to the first region of the cell trapping device, the lysis solution does not pass through the second region of the cell trapping device. It is recovered in the liquid recovery unit. Thus, in the cell lysis apparatus described above, it is possible to lyse the captured cells and recover the liquid after cell lysis. In addition, since the lysate after cell lysis is collected in the lysate collection unit without passing through the second region of the cell capture device, the lysate contains components of cells different from the cells to be captured. Can be prevented.
  • the filter has a filter region that can come into contact with the liquid introduced into the cell trapping device, and the total area in which the plurality of through holes are formed in the filter region is 10% or less with respect to the area of the filter region. It can be set as a certain aspect.
  • the above configuration prevents mixing of the solution introduced into the first region and the liquid staying in the second region opposite to the first region. Therefore, it is possible to prevent the lysate collected in the lysate collection unit from containing a cell component different from the cell to be captured.
  • the filter may have a filter region that can come into contact with the liquid introduced into the cell trapping device, and the average opening ratio of the through holes in the filter region may be 0.1% or more and 50% or less. .
  • the above configuration prevents mixing of the solution introduced into the first region and the liquid staying in the second region opposite to the first region. Therefore, it is possible to prevent the lysate collected in the lysate collection unit from containing a cell component different from the cell to be captured.
  • the filter can be a metal filter.
  • the plurality of through holes can be formed with high accuracy by electrocast plating using a photoresist, for example. Therefore, it is possible to appropriately capture cells to be captured.
  • the cell lysis apparatus further includes a processing liquid supply unit that supplies a processing liquid for processing cells in the test liquid to the cell trapping device, and the processing liquid supply unit is connected to the first flow path. It can be set as the mode currently performed.
  • cells in the test solution can be suitably processed using a processing solution such as a cleaning solution.
  • the cell lysis apparatus further includes a pretreatment unit on the upstream side of the cell trapping device, and the pretreatment unit is configured to remove at least one of bubbles and foreign substances from at least the lysis solution out of the liquid supplied to the cell trapping device. be able to.
  • the pretreatment unit may be configured to include a filter having a plurality of through holes formed in the thickness direction.
  • the cell lysis apparatus further includes a control unit that controls the movement of the liquid in the cell trapping device, and a liquid feeding unit for the liquid in the cell trapping device, and the control unit includes a first channel and a lysate supply unit. Control of the opening and closing of valves provided between the second flow path and the test liquid supply section and between the second flow path and the solution recovery section, and the operation of the liquid feeding section It can be set as the mode to do.
  • a cell lysis method is a cell lysis method using the cell lysis device described above, and the test solution from the test solution supply unit is passed through the second flow path of the cell capture device.
  • Supplying the lysate through the capture step of capturing the cells to be captured contained in the test solution on one surface of the filter by introducing the sample into the capture device and passing through the filter, and the first flow path of the cell capture device The lysate from the cell is introduced into the first region of the cell trapping device, the cell to be trapped captured by the filter is lysed by the lysate, and the cell traps via the second flow path of the cell trapping device.
  • a recovery step of recovering the lysate containing the components of the cells to be captured that stay in the first region of the device in the lysate recovery unit.
  • the lysis solution is supplied from the lysis solution supply unit via the first channel in the lysis step, and the lysis solution is supplied to the lysis solution recovery unit via the second channel in the recovery step. Collected. Since both the first channel and the second channel are channels connected to the first region of the cell capture device, the lysate does not pass through the second region of the cell capture device. It is collected in the collection unit. Thus, in the cell lysis method described above, it becomes possible to lyse the captured cells and recover the liquid after cell lysis. In addition, since the lysate after cell lysis is collected in the lysate collection part without passing through the second region of the cell capture device, the lysate should contain a cell component different from the target cell. Can be prevented.
  • the method for producing a cell component-containing liquid supplies a test liquid containing cells to be captured to one side of a filter in which a plurality of through holes are formed in the thickness direction.
  • the cells were captured on one side of the filter by passing at least a part of the test solution to the other side of the filter, and the lysate for lysing the cells was supplied to the one side of the filter and captured on the one side. Lysing the cells, and collecting the cell component-containing liquid obtained by lysis of the cells from one side of the filter.
  • the test solution and the lysate are both supplied to one side of the filter, and the lysate containing the lysed cells, that is, the cell component-containing liquid is supplied from the one side of the filter. to recover.
  • the method for producing a cell component-containing liquid it is possible to lyse the captured cells and recover the liquid after cell lysis. Since the cell component-containing liquid is collected without passing through the other side of the filter, it is possible to prevent the cell component-containing liquid from containing cell components different from the cells to be captured.
  • the filter has a filter region that can come into contact with the liquid introduced to the one surface side, and the average opening ratio of the through holes in the filter region may be 0.1% or more and 50% or less.
  • the filter can be a metal filter.
  • a plurality of through holes can be formed with high accuracy by electrocast plating using a photoresist, for example. Therefore, it is possible to appropriately capture cells to be captured.
  • the method for producing the cell component-containing liquid may further include supplying the treatment liquid from one side of the filter to the other side before supplying the test liquid to the filter.
  • cells in the test solution can be suitably processed using a processing solution such as a cleaning solution.
  • a cell lysis device a cell lysis method, and a method for producing a cell component-containing liquid that can lyse captured cells and recover the liquid after lysis.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the configuration of a cell lysis apparatus according to this embodiment.
  • the cell lysis device is a device that captures cells contained in a test solution by filtering the test solution with a filter.
  • This cell lysis device is a device for recovering the lysate after lysing the cells captured by the filter.
  • the test solution is blood and the cell to be captured is a circulating cancer cell (Circulating Tumor Cell: CTC) will be described, but this is not a limitation.
  • the test solution include blood, lymph and the like.
  • Specific cells to be captured include, for example, rare cells such as CTC and blood cells (red blood cells, white blood cells, platelets, etc.).
  • the cell lysis device 100 is provided with a filter for capturing cells therein, and a soft for supplying a treatment liquid (reagent) to the cell capture device 1.
  • a flow path 3 made of a tube and a flow path 4 made of a soft tube for supplying blood to the cell capture device 1 are provided.
  • a treatment liquid supply unit 5 that supplies a treatment liquid (reagent) to the cell capture device 1
  • a lysis solution supply unit 6 that supplies a lysis solution to the cell capture device 1, Is provided.
  • a pretreatment unit 7 is provided on the flow path 3.
  • a test solution supply unit 8 that supplies a test solution to the cell capture device 1, a lysate collection unit 9 that collects a lysate from the cell capture device 1, Is provided.
  • the processing liquid supplied from the processing liquid supply unit 5 provided upstream of the flow path 3 includes a cleaning liquid for cleaning cells and the like captured by the filter, but is not limited to the cleaning liquid.
  • the processing liquid supply unit 5 stores the processing liquids in different containers and can supply the cell capturing device 1 individually from each container. Thereby, a plurality of types of processing liquids can be used individually.
  • Examples of the lysis solution supplied from the lysis solution supply unit 6 provided upstream of the flow path 3 include a lysis solution that dissolves cells (capture target cells) captured by a filter.
  • the type of lysate is selected based on the type of cells to be captured.
  • a surfactant-based solution is used.
  • the treatment liquid supply unit 5 and the solution supply unit 6 are individually provided with flow paths 31 and 32, respectively.
  • the flow paths 31 and 32 are each connected to the flow path 3.
  • Valves V1, V2 are provided on the flow paths 31, 32, respectively. By controlling the opening and closing of the valves V1 and V2, the liquid supplied to the flow path 3 is selectively supplied.
  • the pretreatment unit 7 on the flow path 3 has a function of removing gas from the liquid flowing through the flow path 3 and removing foreign substances in the liquid.
  • the structure and function of the preprocessing unit 7 will be described later.
  • a test liquid supply unit 8 containing a test liquid is provided upstream of the flow path 4. Further, a lysate recovery unit 9 that recovers the lysate from the cell capture device 1 is provided upstream of the flow path 4.
  • the test solution supply unit 8 and the solution recovery unit 9 are individually provided with channels 41 and 42, respectively.
  • the flow paths 41 and 42 are each connected to the flow path 4.
  • valves V3 and V4 are provided on the flow paths 41 and 42, respectively. By controlling the opening and closing of the valves V3 and V4, the liquid supplied to the flow path 3 is selectively supplied.
  • the cell capture device 1 is configured to supply either the treatment solution, the lysis solution, and the blood, instead of supplying them simultaneously.
  • the supply of the liquid to the cell trapping device 1 is switched by opening and closing the valves V1 to V4. For example, when supplying the test solution to the cell capture device 1, the valve V3 is opened and the other valves V1, V2, and V4 are closed.
  • the valves V1 to V4 pinch valves that block a liquid flow by pressurizing and deforming a soft tube can be used.
  • a pump P liquid feeding unit
  • the liquid is supplied by sucking the target liquid by driving.
  • the pump P has a structure capable of changing the flow rate of the liquid in the flow path by changing the rotation speed.
  • a peristaltic pump peripheral pump
  • a liquid such as a processing liquid or blood flows in the direction toward the cell trapping device 1 through the flow path 3 or the flow path 4 and is supplied to the cell trapping device 1.
  • the liquid that has passed through the cell trapping device 1 flows into the recovery unit 11 via the flow path 10.
  • the recovery unit 11 is a container that recovers the liquid flowing from the cell trapping device 1 through the flow path 10.
  • Each unit described above is controlled by the control unit 15. Specifically, the valves V1 to V4 and the pump P are driven by an instruction from the control unit 15.
  • the control unit 15 also controls the valve or pump.
  • the control unit 15 is provided with a program input function for inputting a program that enables control such as driving and stopping for each of the above-described units.
  • the control unit 15 is provided with a drive mechanism for operating each device in order as described above according to the input program.
  • the control unit 15 selects a line through which the liquid flows, the control unit 15 instructs each unit to open / close the valve and drive the pump based on the selection result. (Cell capture device)
  • FIG. 2A is a top view of the cell trapping device 1
  • FIG. 2B is a view taken along arrow IIB-IIB in FIG. 2A.
  • the cell trapping device 1 is configured such that a filter 61 having a plurality of through holes 62 is sandwiched between a lid member 51 and a storage member 52.
  • the filter 61 is disposed in a space formed inside the lid member 51 and the storage member 52 when they are combined.
  • the filter 61 is a metal filter, for example.
  • a plurality of through holes 62 are formed in the thickness direction of the filter 61.
  • the length of one side of the lid member 51 in a plan view can be set to 10 mm to 100 mm, further 15 mm to 70 mm, and particularly 20 mm to 30 mm.
  • the thickness may be 2 mm to 20 mm, further 3 mm to 15 mm, and particularly 5 mm to 10 mm.
  • the metal material used for the filter 61 examples include, but are not limited to, gold, silver, copper, aluminum, tungsten, nickel, chromium, and alloys of these metals.
  • the metal may be used alone, or two or more different materials may be used in combination.
  • the metal may be an alloy with another metal or an oxide of the metal to impart functionality. From the viewpoint of price or availability, it is preferable to use nickel, copper, gold, and a metal containing these as a main component, and it is particularly preferable to use a metal containing nickel as a main component.
  • the main component refers to a component occupying 50% by weight or more of the material forming the filter 61.
  • the filter 61 is formed of a material mainly composed of nickel, the surface of nickel may be plated with gold.
  • the filter 61 may be subjected to a surface treatment using a biocompatible polymer or the like.
  • the polymer used for this purpose include 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC).
  • the thickness of the filter 61 can be, for example, 3 ⁇ m to 100 ⁇ m, 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, or 5 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the size of the region in which the through hole 62 of the filter is provided can be set to 25 mm 2 to 1000 mm 2 .
  • the size of the region can be set to 25 mm 2 to 225 mm 2, and further can be set to 25 mm 2 to 100 mm 2 .
  • the processing time can be shortened by setting the size of the region to 25 mm 2 or more.
  • the lid member 51 of the cell trapping device 1 includes a flow path 3A (first flow path) connected to the flow path 3 formed of a soft tube and a flow path 4A (second flow path) connected to the flow path 4. ) And are formed.
  • the lid member 51 is provided with a first region 55 formed above the filter 61 so as to communicate with the flow paths 3A and 4A.
  • a second region 56 is provided in the storage member 52 of the cell trapping device 1.
  • the second region 56 is a space through which the liquid that has passed through the through hole 62 of the filter 61 passes.
  • the second region 56 is formed below the filter 61 so that the depth of the central portion is deeper than the peripheral portion.
  • the storage member 52 is provided with a flow channel 10A (third flow channel) that communicates with the second region 56 and is connected to the flow channel 10 and discharges the liquid in the second region 56 to the outside. ing.
  • the through hole 62 provided in the filter 61 sandwiched between the lid member 51 and the storage member 52 has such a size that the cell 60 to be captured cannot pass through.
  • a region facing the first region 55 and the second region 56 that is, a region that can come into contact with the liquid introduced into the cell trapping device 1 is a filter region. 63.
  • the total area in which the plurality of through holes 62 are formed in the filter region 63 is, for example, 50% or less, 30% or less, or 20% or less with respect to the area of the filter region 63. Or 10% or less.
  • the average aperture ratio of the through holes 62 in the filter region 63 may be, for example, 0.1% or more and 50% or less, 1% or more and 30% or less, or 1% or more and 20% or less.
  • the first region 55 and the second region 56 are disposed to face each other with the filter 61 interposed therebetween. Therefore, the area of the filter region 63 corresponds to the area of the region facing the first region 55 or the second region 56.
  • the total area where the through holes 62 are formed is the total area (cross-sectional area) of the through holes 62 arranged in the filter region 63. The area corresponds to a value obtained by subtracting the area of the filter region 63 where the through hole 62 is not formed (the region where the surface of the filter 61 is present) from the area of the filter region 63.
  • the total area in which the plurality of through holes 62 are formed in the filter region 63 is 50% or less, 30% or less, 20% or less, or 10% or less with respect to the area of the filter region 63, so that the cell trapping device 1 can efficiently lyse cells to be captured and recover the lysate. This point will be described later.
  • the attachment positions of the flow path 3, the flow path 4, and the flow path 10 in the cell trapping device 1 are not limited to the positions shown in FIG. That is, the flow path 3 and the flow path 4 do not need to be arranged to face each other. For example, it is good also as a structure by which the two flow paths 3 and 4 are connected in one of the four side surfaces which comprise the cell capture device 1. FIG. Moreover, it can also be set as the structure by which the flow paths 3 and 4 are connected to the upper surface of the cell capture device 1. FIG. Similarly, the attachment position of the flow path 10 can be changed as appropriate. The attachment positions of the flow paths 3 and 4 and the flow path 10 are changed according to the arrangement of the flow paths 3A, 4A, and 9A of the cell trapping device 1. Therefore, the arrangement of the flow paths 3A, 4A, 9A of the cell capture device 1 can be changed as appropriate. Further, the number of flow paths can be changed as appropriate. (Pre-processing section)
  • FIG. 3A is a top view of the pre-processing unit 7, and FIG. 3B is a view taken along the arrow IIIB-IIIB in FIG. 3A.
  • the inside of the pre-processing unit 7 includes a first region 24 and a second region 26 with a foreign matter removing filter 21 interposed therebetween.
  • the upstream channel of the channel 3 is connected to the first region 24 on the upper side of the pretreatment unit 7, and the downstream channel of the channel 3 is the lower part of the pretreatment unit 7. 2 is connected to the area 26.
  • the pretreatment unit 7 is introduced with a liquid supplied from the upstream processing solution supply unit 5 or the solution supply unit 6.
  • the pretreatment unit 7 has a function of removing bubbles and foreign matters in the liquid before the introduced liquid is discharged to the outside.
  • the length of one side of the lid member 51 in plan view can be set to 10 mm to 100 mm, further 15 mm to 70 mm, and particularly 20 mm to 30 mm. be able to.
  • the thickness may be 2 mm to 20 mm, further 3 mm to 15 mm, and particularly 5 mm to 10 mm.
  • the pretreatment unit 7 removes not only bubbles but also foreign matters in the processing liquid by adopting a configuration in which the foreign matter removing filter 21 having a plurality of through holes 22 is sandwiched between the lid member 28 and the storage member 29. Can do.
  • the planar shape of the lid member 28 and the storage member 29 may be rectangular or circular as in the cell trapping device 1, and is not particularly limited.
  • the foreign matter removing filter 21 is disposed in a space formed inside the lid member 28 and the storage member 29 when they are combined.
  • a plurality of through holes 22 are formed in the thickness direction of the foreign matter removing filter 21.
  • the through-hole 22 provided in the foreign matter removing filter 21 may have a size that allows a plurality of types of treatment liquid and solution to pass therethrough. It is preferable that the through hole 22 has a size that allows any kind of liquid to pass through easily, that is, does not apply a load during passage. Since the treatment liquid or the solution flows through the foreign matter removing filter 21, the size of the through hole 22 can be the same as or smaller than the through hole 62 of the filter 61 of the cell trapping device 1. By setting it as such a structure, when a foreign material is mixed in a process liquid or a solution, a foreign material can be reliably removed by the pre-processing part 7 of the front
  • Examples of the metal material used for the foreign matter removing filter 21 include, but are not limited to, gold, silver, copper, aluminum, tungsten, nickel, chromium, and alloys of these metals.
  • the metal may be used alone, or two or more different materials may be used in combination.
  • the metal may be an alloy with another metal or an oxide of the metal to impart functionality. From the viewpoint of price or availability, it is preferable to use nickel, copper, gold, and a metal containing these as a main component, and it is particularly preferable to use a metal containing nickel as a main component.
  • the main component refers to a component occupying 50% by weight or more of the material forming the foreign matter removing filter 21.
  • the foreign matter removing filter 21 is formed of a material mainly composed of nickel, it is preferable that the nickel surface be plated with gold. Since the oxidation of the filter surface can be prevented by the gold plating, the foreign matter removal performance can be maintained high. It is also preferable to coat the filter surface with a polymer that is harmless to cells. Examples of the polymer used for this purpose include 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC).
  • MPC 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine
  • the thickness of the foreign matter removing filter 21 may be, for example, 3 ⁇ m to 100 ⁇ m, 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, or 5 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the filter is easy to handle and suitable for precision processing.
  • the size of the region in which the through hole 22 is provided can be 25 mm 2 to 1500 mm 2 .
  • the size of the region can be 25 mm 2 to 750 mm 2, and can be 25 mm 2 to 225 mm 2 .
  • the processing time can be shortened by setting the size to 25 mm 2 or more.
  • the foreign matter removing filter 21 has a filter region 23 that can come into contact with the introduced liquid.
  • the total area in which the plurality of through holes 22 are formed is, for example, 50% or less, 30% or less, 20% with respect to the area of the filter region 23. Or less than 10%.
  • the average aperture ratio of the through holes 22 in the filter region 23 may be, for example, 0.1% or more and 50% or less, 1% or more and 30% or less, or 1% or more and 20% or less. It may be 1% or more and 10% or less.
  • a flow path 31A connected to the upstream flow path 3 is formed in the lid member 28 of the pretreatment unit 7.
  • the lid member 28 is provided with a first region 24.
  • the first region 24 is a space for guiding the processing liquid to the through hole 22 of the foreign matter removing filter 21.
  • the first area 24 communicates with the flow path 31A and is formed above the foreign matter removing filter 21.
  • a second region 26 is provided in the storage member 29 of the preprocessing unit 7.
  • the second region 26 is a space for discharging the liquid that has passed through the through hole 22 of the foreign matter removing filter 21 to the outside.
  • the second region 26 is formed below the foreign matter removing filter 21 so that the depth of the central portion is deeper than the peripheral portion.
  • a flow path 31B for discharging the liquid in the second region 26 to the outside is provided in the center of the second region 26, a flow path 31B for discharging the liquid in the second region 26 to the outside.
  • the channel 31 ⁇ / b> B communicates with the second region 26 and is connected to the downstream channel 3.
  • the bottom of the second region 26 is gradually recessed from the end toward the center, and a flow path 31B is provided in the center which is the deepest part. Thereby, the treatment liquid is suitably discharged from the flow path 31B.
  • the space formed by the first region 24 and the second region 26 functions as a bubble retention region having a diameter larger than the diameter of the flow path 3 through which the treatment liquid flows.
  • the diameter of the flow path in the entire cell lysis apparatus 100 is basically the bubble retention region (the space formed by the first region 24 and the second region 26) of the pretreatment unit 7 and the cell trapping device 1. It is preferable that the sizes are the same except for the space inside (the space formed by the first region 55 and the second region 56).
  • the diameter of the bubble retention region means the diameter of the cross section with respect to the moving direction of the treatment liquid in the bubble retention region.
  • the cell capturing device 1 shown in FIG. 2 has a configuration in which the flow path 3A, 4A is provided in the lid member 51 on the upstream side and can be connected to two different flow paths.
  • one flow path 31 ⁇ / b> A is provided in the upstream lid member 28.
  • the end of the one side channel for example, the channel 3 ⁇ / b> A
  • the configuration can be changed to the same configuration as that of the pretreatment unit 7 shown in FIG.
  • the pretreatment unit 7 can be manufactured by using the lid member 28 and the storage member 29 having the same shape as the lid member 51 and the storage member 52 of the cell trapping device 1. Thereby, manufacturing cost can be reduced compared with the case where the pre-processing part 7 which has a shape different from the cell capture device 1, for example is manufactured.
  • the pretreatment unit 7 is provided in the cell lysis device 100 such that the lid member 28 is on the upper side of the storage member 29 in the height direction. Therefore, the end portion 301 on the first region 24 side of the flow channel 31A serving as the inlet for the processing liquid into the internal space (the first region 24 and the second region 26) is the second of the flow channel 32A serving as the discharge port. Above the end portion 302 on the region 26 side. As a result, the processing liquid that passes through the bubble retention region composed of the first region 24 and the second region 26 is introduced from the upper inlet to the first region 24, and the lower outlet of the second region 26. Is discharged to the outside.
  • the bubbles dissolved in the liquid are separated and easily retained as bubbles in the bubble retention region, and the effect of removing bubbles from the treatment liquid can be enhanced.
  • the bubbles separated from the processing liquid stay on the upper side of the first region 24.
  • the lower end of the end portion 301 on the inlet side can be higher than the upper end of the end portion 302 on the outlet side.
  • the lower end of the end portion 301 on the introduction port side can be 0.1 mm to 5 mm above the upper end of the end portion 302 on the discharge port side, and 0.1 mm to 2.5 mm above.
  • the lower end of the end portion 301 on the inlet side can be 0.1 mm to 1.5 mm above the upper end of the end portion 302 on the outlet side.
  • the pretreatment unit 7 By providing the pretreatment unit 7 on the flow path 3, even if bubbles are included in the liquid (treatment liquid or solution), bubbles are generated in the first region 24 in the pretreatment unit 7. Since it can be retained, bubbles can be removed from the liquid while moving the first region 24 and the second region 26. Further, since the foreign matter removing filter 21 is provided, at least a part of the foreign matter contained in the liquid (foreign matter that cannot pass through the through-hole 22) can be captured. It can be supplied to the cell capture device 1.
  • the pretreatment unit 7 may be configured integrally with the cell trapping device 1. That is, in the cell lysis device 100, a device that also functions as the pretreatment unit 7, a channel that connects the pretreatment unit 7 and the cell capture device 1, and a function as the cell capture device 1 may be used.
  • the cell lysis device 100 does not necessarily include the treatment liquid supply unit 5.
  • the pretreatment unit 7 can be arranged at an arbitrary position on the upstream side of the cell capturing device 1. In this case, bubbles of various liquids supplied to the cell trapping device 1 can be removed by the pretreatment unit 7.
  • the pretreatment unit 7 may be located between the cell capture device 1 and the lysate supply unit 6. In this case, at least bubbles in the lysate supplied to the cell trapping device 1 from the lysate supply unit 6 can be removed. (Cell lysis method)
  • the target cells are captured on the filter 61 using the cell capturing device 1 (S01: capturing step).
  • the test solution is supplied from the test solution supply unit 8 to the cell capturing device 1 through the flow path 4.
  • the test liquid passes through the through-hole 62 of the filter 61 from the first region 55 side in the cell trapping device 1, It is discharged from the second region 56 side to the external flow path 10.
  • the cells to be captured do not pass through the through hole 62 of the filter 61 and remain on the filter 61 (the surface of the filter 61 on the first region 55 side).
  • the cells that could not pass through the through hole 62 of the filter 61 remain on the filter 61.
  • the test solution only needs to pass through at least the filter 61, and the drive of the pump P may be stopped before all the test solution is discharged to the flow path 10 in order to prevent air from entering the device.
  • processing related to the captured cells is performed (S02: processing step).
  • the processing liquid is supplied from the processing liquid supply unit 5 to the cell trapping device 1 via the flow path 3.
  • the treatment liquid passes through the through hole 62 of the filter 61 from the first region 55 side in the cell trapping device 1, and the second The gas is discharged from the region 56 side to the external flow path 10.
  • the processing liquid is a cleaning liquid
  • the test liquid staying inside the cell trapping device 1 is discharged to the outside together with the processing liquid through this processing step.
  • a desired process is performed by introduce
  • the processing liquid (the processing liquid supplied last) is supplied to the first region 55, the second region 56, and the flow path of the cell trapping device 1.
  • the drive of the pump P is stopped in a state where 3A, 4A, and 9A are satisfied.
  • target cells remaining on the filter 61 of the cell capture device 1 are lysed (S03: lysis step), and the lysed liquid is recovered (S04: recovery step).
  • the lysis solution is supplied from the lysis solution supply unit 6 to the cell capturing device 1 through the flow path 3 under the control of the control unit 15.
  • the lysing solution is introduced into the device by driving the pump P to the extent that the first region 55 of the cell trapping device 1 is filled.
  • the cells staying in the first region 55 are lysed.
  • the solution is kept waiting in the first region 55 for a predetermined time (for example, several minutes to several tens of minutes).
  • the lysate flows into the lysate recovery unit 9 via the flow path 4.
  • Various methods may be used as the control related to the recovery of the dissolved solution by the control unit 15.
  • a method is used in which the solution from the solution supply unit 6 is introduced into the first region 55 using a pump (not shown) with the valves V1 and V3 closed and the valves V2 and V4 opened. Can do.
  • the liquid (dissolved solution after dissolution) in the first region 55 only needs to be moved to the dissolved solution recovery unit 9, either the treatment solution or the dissolved solution can be used for recovering the dissolved solution.
  • a part of the flow path for example, the flow path 3 between the pretreatment unit 7 and the cell trapping device 1 is opened and air is introduced into the first region 55 without flowing the liquid. it can.
  • FIG. 5 shows the moving direction of the solution in the dissolution step (S03) and the recovery step (S04).
  • the lysate introduced from the flow path 3 and the flow path 3 ⁇ / b> A into the first region 55 of the cell trapping device 1 contacts the cell 60 in the first region 55 and lyses the cell. Thereafter, a lysate containing dissolved cell components is discharged to the channel 4 through the channel 4A.
  • the lysing solution does not pass through the second region 56 to the flow path 10 but passes only through the first region 55 side of the cell trapping device 1.
  • the processing step (S02) is performed before the dissolving step (S03). For this reason, before the lysis solution is introduced into the cell capturing device 1, the device is filled with the treatment solution. Therefore, at the stage where the solution is introduced into the first region 55, the processing solution stays in the second region 56. Since the filter 61 having the through hole 62 is provided between the first region 55 and the second region 56, the solution on the first region 55 side and the second region 56 side are provided via the through hole 62. It is considered that a part of the treatment liquid is mixed (replaced). However, since only a part of the liquid around the through hole 62 is replaced, for example, when there are cells remaining in the second region 56, the cells can be prevented from being lysed by the lysis solution.
  • the lysis solution is moved from the flow path 4 on the first region 55 side to the lysis solution collection unit 9, the lysis solution containing the target cell component is prevented from moving in the second region 56. Accordingly, it is possible to prevent the cell component remaining in the second region 56 from being included in the solution recovered by the solution recovery unit 9.
  • the processing step (S02) may not be performed. Thereby, air can be prevented from entering the device. In addition, it is possible to quickly capture cells.
  • the flow path 3A that is the first flow path is used.
  • the solution is supplied from the solution supply unit 6, and the solution is recovered by the solution recovery unit 9 through the channel 4 ⁇ / b> A that is the second channel. Since the flow paths 3A and 4A are both flow paths connected to the first region 55 of the cell trapping device 1, the lysed solution does not pass through the second region 56 of the cell trapping device 1. It is recovered in the solution recovery unit 9.
  • the cell lysis device 100 it becomes possible to lyse the captured cells and collect the liquid after cell lysis.
  • the lysate after cell lysis contains lysed cell components.
  • the liquid or lysate after cell lysis may be referred to as a cell component-containing liquid.
  • the cell component contained in the cell component-containing liquid varies depending on the type of lysate used, the type of captured cells, and the like. Examples of such cell components include intracellular organelles derived from captured cells; constituent components of intracellular organelles; nucleic acids such as DNA and RNA; proteins, peptides; and exosomes.
  • the control unit 15 includes a valve V1 between the flow path 3A and the 5 treatment liquid supply unit, a valve V2 between the flow path 3A and the lysis liquid supply unit 6, the flow path 4A, The valve V3 between the test solution supply section 8 and the valve V4 between the flow path 4A and the solution recovery section 9 are controlled, and the operation of the pump P functioning as a liquid supply section is controlled.
  • the control unit 15 can control the test solution, the processing solution, and the lysis solution to be appropriately supplied to the cell capturing device 1 and discharged to the outside. Become.
  • a series of operations can be executed under the control of the control unit 15.
  • the total area in which the plurality of through holes 62 are formed in the filter region 63 of the filter 61 is 10% or less with respect to the area of the filter region 63.
  • the average aperture ratio of the through holes 62 is 0.1% or more and 50% or less.
  • the filter 61 can be a metal filter.
  • the plurality of through holes 62 can be formed with high accuracy by, for example, electroforming plating using a photoresist. Therefore, it is possible to appropriately capture cells to be captured.
  • the treatment liquid supply unit 5 is connected to the flow path 3 ⁇ / b> A of the cell trapping device 1 together with the lysis solution supply unit 6.
  • process liquids such as a washing
  • a processing unit 7 is provided. As a result, it is possible to supply the cell capture device 1 with the lysate and the treatment liquid from which bubbles and foreign substances have been removed.
  • the pretreatment unit 7 includes a foreign matter removing filter 21 in which a plurality of through holes 22 are formed in the thickness direction. Thereby, it is possible to more reliably perform the removal of bubbles and foreign matters from the solution or the processing solution.
  • the embodiments of the present disclosure have been described.
  • the cell lysis device and the cell lysis method according to the present disclosure are not limited to the above, and various modifications can be made.
  • the configuration in which the pretreatment unit 7 is provided on the flow path 3 has been described, but the configuration in which the pretreatment unit 7 is omitted may be employed.
  • the structure of the channel outside the cell trapping device 1 can be changed as appropriate.
  • the arrangement of the valves V1 to V4, the arrangement of the pump P, and the like can be changed as appropriate.
  • a cell component-containing solution containing components of cells to be captured is obtained. That is, according to another embodiment of the present disclosure, a method for producing a cell component-containing liquid obtained by cell lysis is provided.
  • the method for producing a cell component-containing liquid according to the present disclosure is a method for producing a cell component-containing liquid by the cell lysis device 100, and passes through the flow path 4 of the cell capturing device 1 and the test liquid from the test liquid supply unit 8. Is introduced into the cell trapping device 1 and allowed to pass through the filter 61, so that the trapping process of trapping the target cells contained in the test solution on one surface of the filter 61 and the flow path 3 of the cell trapping device 1 are performed.
  • a lysis step in which the lysis solution from the lysis solution supply unit 6 is introduced into the first region 55 of the cell capture device 1 and the cells to be captured captured by the filter 61 are lysed by the lysis solution, and the cell capture device 1
  • the said manufacturing method contains another process as needed.
  • the method for producing a cell component-containing liquid according to the present disclosure all matters described for the cell lysis method described above can be used as they are, including the effects.
  • the cell lysis method and the method for producing a cell component-containing solution according to the present disclosure are not limited to the cell lysis device according to the present disclosure as long as the cells to be captured can be lysed.
  • a test solution containing cells to be captured is supplied to one side of a filter having a plurality of through holes formed in the thickness direction, and at least a part of the test solution is supplied.
  • Capturing cells on one side of the filter by passing it to the other side of the filter (capturing step), supplying a lysing solution that dissolves the cells to one side of the filter, and trapping the cells captured on the one side Lysing (lysis step), and recovering the cell component-containing liquid obtained by cell lysis from one side of the filter (recovery step).
  • the cell lysis method includes other steps as necessary.
  • a test liquid containing cells to be captured is supplied to one side of the filter in which a plurality of through holes are formed in the thickness direction, and at least a part of the test liquid is passed through the other side of the filter. As a result, cells are trapped on one side of the filter.
  • the filter used in the capturing step is a cell capturing filter, and the material, the diameter of the through hole, the aperture ratio, and the like can be changed depending on the type of cells to be captured.
  • the filter may be a metal filter.
  • the metal used for the filter include gold, silver, copper, aluminum, tungsten, nickel, chromium, and alloys of these metals, and examples include nickel, copper, gold, and metals containing these as main components. Or a metal based on nickel.
  • the main component refers to a component occupying 50% by weight or more of the material forming the filter. Thereby, a plurality of through-holes can be formed with high accuracy by, for example, electroforming plating using a photoresist.
  • the filter By forming a plurality of through holes with high accuracy, it is possible to appropriately capture the cells to be captured.
  • the filter is formed from a material mainly composed of nickel, the surface of nickel may be plated with gold. Gold plating can prevent oxidation of the filter surface. For this reason, the adherence to specific cells (for example, CTC) to be captured becomes uniform, and the reproducibility of data can be improved.
  • the filter may be subjected to a surface treatment using a biocompatible polymer or the like.
  • the thickness of the filter can be, for example, 3 ⁇ m to 100 ⁇ m, 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, or 5 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the size of the region in which the through hole of the filter is provided can be, for example, 25 mm 2 to 1000 mm 2 , can be 25 mm 2 to 225 mm 2, and can be 25 mm 2 to 100 mm 2. .
  • the processing time can be shortened by setting the size of the region to 25 mm 2 or more.
  • the filter is provided with a region that can come into contact with the liquid introduced to one side of the filter, that is, a filter region.
  • the total area where the plurality of through holes are formed is, for example, 50% or less, 30% or less, 20% or less, or 10% with respect to the area of the filter region. It can be as follows.
  • the average aperture ratio of the through holes in the filter region may be 0.1% or more and 50% or less, 1% or more and 30% or less, or 1% or more and 20% or less. % Or more and 10% or less.
  • the filter 61 described above in this specification can be used as the cell trapping filter in the cell lysis method of the present disclosure.
  • test solution from one side (cell capture surface) side of the filter to the other side of the filter (surface opposite to the cell capture surface)
  • mechanical operation such as driving by a pump, centrifugation, or the like
  • a manual operation such as extrusion or suction with a syringe, addition with a pipette, or the like can be used.
  • a lysis solution for lysing cells is supplied to one side of the filter. Thereby, lysis of the cells captured on one side of the filter is performed. Examples of the solution include the solution described above in the present specification.
  • the cell is lysed on one side of the filter where the cells are captured.
  • the cell component-containing liquid obtained by cell lysis is collected from one side of the filter.
  • the cells captured by the filter are lysed by lysis treatment on the filter, and the cell component-containing liquid obtained by lysis stays on one side of the filter without passing through the filter.
  • the recovery step the cell component-containing liquid staying on one side of the filter is recovered from the one side of the filter. For this reason, in the cell lysis method of the present disclosure, the cell component-containing liquid can be collected from the one surface side of the filter without being mixed with the liquid staying on the other surface side of the filter.
  • the cell lysis method and the method for producing a cell component-containing liquid according to the present disclosure include a processing step of supplying a processing solution from one side of the filter to the other side before the capturing step of supplying the test solution to the filter. Can do. Thereby, a desired process can be performed with respect to the cell in a test liquid, for example using process liquids, such as a washing
  • the supplied processing liquid can be removed from one side of the filter.
  • the cell lysis method and the method for producing a cell component-containing solution of the present disclosure can include a treatment step for performing a predetermined treatment on the cells after the capture step and before the lysis step.
  • a predetermined amount of the treatment liquid is supplied to one side of the filter.
  • the supply amount of the treatment liquid can be an amount that fills at least the space region on the other surface side of the filter.
  • the dissolving solution can be added to the processing solution staying on one side of the filter. Further, the treatment liquid staying on one side of the filter may be replaced with a solution. Thereby, even if the cells remain on the other surface side of the filter, the cells can be prevented from being lysed by the lysis solution. Further, by collecting the lysate from one side of the filter, it is possible to prevent the lysate containing the components of the target cells from being collected together with the liquid on the other side of the filter. Therefore, it is possible to prevent the cell components remaining on the other surface side of the filter from being mixed into the lysate collected after the lysis treatment.
  • the cell lysis method or the method for producing a cell component-containing solution of the present disclosure can include a washing step for washing the filter or the like with a washing solution before or after the capturing step. Thereby, the cell used as capture
  • the cells to be captured in the test solution are efficiently captured and lysed, and the cell components derived from the cells to be captured are collected.
  • a cell component-containing solution containing a high concentration can be obtained.
  • the cell component-containing liquid can contain, for example, components of cells to be captured captured at a capture rate of 20% or more, or 30% or more.
  • the cell component-containing liquid can be a liquid concentrated to 1/5 or more, or 1/10 or more, for example, as a volume comparison with the test liquid.

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Abstract

複数の貫通孔（６２）が形成されたフィルタ（６１）を内部に備える細胞捕捉デバイス（１）と、被検液を供給する被検液供給部（８）と、溶解液を供給する溶解液供給部（６）と、溶解液を回収する溶解液回収部（９）と、液体を回収する回収部（１１）と、を備え、細胞捕捉デバイス（１）は、内部に、フィルタ（６１）の上側に設けられた空間である第１領域（５５）と、フィルタ（６１）の下側に設けられた空間である第２領域（５６）と、第１領域とデバイス外部との間を接続する第１流路（３Ａ）および第２流路（４Ａ）と、第２領域とデバイス外部との間を接続する第３流路（１０Ａ）と、を有し、処理液供給部および溶解液供給部は、第１流路に接続され、被検液供給部および溶解液回収部は、第２流路に接続され、回収部は、第３流路に接続されている。

Description

細胞溶解装置、細胞溶解方法、および細胞成分含有液の製造方法
　本開示は、細胞溶解装置、細胞溶解方法、および細胞成分含有液の製造方法に関する。
　 目的である特定の細胞を血液等の被検液等から分離する方法として、細胞のサイズ及び変形能の差を利用し、フィルタにより細胞を捕捉する方法がある。例えば、特開２０１５－１９８５９５号公報では、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）等の希少細胞の捕捉に使用可能な細胞捕捉デバイスが示されている。この細胞捕捉デバイスは、フィルタが内部に収容された筐体を有する。
　近年、細胞捕捉デバイスを用いて捕捉した細胞を溶解した後、溶解した細胞を含む液体を回収して当該細胞に係る各種分析等を行いたいというニーズが生じている。しかしながら、従来の細胞捕捉デバイスおよび当該細胞捕捉デバイスを使用する装置では、捕捉した細胞の溶解および細胞溶解後の液体の回収を行うための構成は検討されていなかった。
　本開示は上記を鑑みてなされたものであり、捕捉した細胞の溶解および細胞溶解後の液体の回収を行うためことが可能な細胞溶解装置、細胞溶解方法、および細胞成分含有液の製造方法を提供することを目的とする。
　本開示の一形態に係る細胞溶解装置は、複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタを内部に備える細胞捕捉デバイスと、細胞捕捉デバイスに対して、捕捉対象である細胞を含む被検液を供給する被検液供給部と、細胞捕捉デバイスに対して、被検液中の細胞を溶解するための溶解液を供給する溶解液供給部と、細胞捕捉デバイスからの被検液中の細胞の成分を含む溶解液を回収する溶解液回収部と、細胞捕捉デバイスから排出される液体を回収する回収部を備え、細胞捕捉デバイスは、その内部に、フィルタの上側に設けられた空間である第１領域と、フィルタの下側に設けられた空間である第２領域と、第１領域とデバイス外部との間を接続する第１流路および第２流路と、第２領域とデバイス外部との間を接続する第３流路と、を有し、溶解液供給部は、第１流路に対して接続され、被検液供給部および溶解液回収部は、第２流路に対して接続され、回収部は、第３流路に対して接続されている。
　上記の細胞溶解装置では、第１領域において捕捉された細胞を溶解する際に、第１流路を介して溶解液供給部から溶解液が供給されると共に、第２流路を介して溶解液が溶解液回収部に回収される。第１流路および第２流路は、いずれも、細胞捕捉デバイスの第１領域に接続されている流路であるため、溶解液は、細胞捕捉デバイスの第２領域を通過することなく、溶解液回収部に回収される。このように、上記の細胞溶解装置では、捕捉した細胞の溶解および細胞溶解後の液体の回収を行うことが可能となる。また、細胞溶解後の溶解液は、細胞捕捉デバイスの第２領域を通過することなく、溶解液回収部に回収されるため、捕捉対象となる細胞とは異なる細胞の成分が溶解液に含まれることを防ぐことができる。
　フィルタは、細胞捕捉デバイス内に導入される液体と接触し得るフィルタ領域を有し、フィルタ領域において、複数の貫通孔が形成された面積の合計は、フィルタ領域の面積に対して１０％以下である態様とすることができる。
　上記の構成とすることで、第１領域に導入された溶解液と、第１領域と逆側の第２領域に滞留する液体との混合が防がれる。したがって、溶解液回収部に回収される溶解液において、捕捉対象となる細胞とは異なる細胞の成分が含まれることを防ぐことができる。
　フィルタは、細胞捕捉デバイス内に導入される液体と接触し得るフィルタ領域を有し、フィルタ領域において、貫通孔の平均開口率は、０．１％以上５０％以下である態様とすることができる。
　上記の構成とすることで、第１領域に導入された溶解液と、第１領域と逆側の第２領域に滞留する液体との混合が防がれる。したがって、溶解液回収部に回収される溶解液において、捕捉対象となる細胞とは異なる細胞の成分が含まれることを防ぐことができる。
　フィルタは、金属フィルタとすることができる。この場合、複数の貫通孔を例えばフォトレジストを用いた電気鋳造めっきなどにより高い精度で形成できる。したがって、捕捉対象の細胞を適切に捕捉することができる。
　細胞溶解装置は、細胞捕捉デバイスに対して、被検液中の細胞を処理するための処理液を供給する処理液供給部を更に備え、処理液供給部は、第１流路に対して接続されている態様とすることができる。
　上記の構成とすることで、例えば洗浄液等の処理液を用いて被検液中の細胞を好適に処理することができる。
　細胞溶解装置は、細胞捕捉デバイスの上流側に前処理部を更に備え、前処理部は、細胞捕捉デバイスに供給される液のうち少なくとも溶解液から気泡及び異物の少なくとも一方を除去する態様とすることができる。
　上記の構成とすることで、気泡及び異物の少なくとも一方が除去された液を細胞捕捉デバイスに対して供給することができる。
　前処理部は、複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタを内部に備える態様とすることができる。
　上記の構成とすることで、液からの気泡及び異物の少なくとも一方の除去をより確実に実行することができる。
　細胞溶解装置は、細胞捕捉デバイス内の液体の移動を制御する制御部と、細胞捕捉デバイス内の液体の送液部と、をさらに備え、制御部は、第１流路と溶解液供給部との間、第２流路と被検液供給部との間、および、第２流路と溶解液回収部との間、に設けられるバルブの開閉を制御すると共に、送液部の動作を制御する態様とすることができる。
　上記の構成とすることで、制御部の制御によって、被検液および溶解液を細胞捕捉デバイスに対して適切に供給すると共に、外部に排出する制御を行うことが可能となる。また、一連の動作を制御部による制御により実行することが可能となる。
　また、本開示の一形態に係る細胞溶解方法は、上記の細胞溶解装置による細胞溶解方法であって、細胞捕捉デバイスの第２流路を経て、被検液供給部からの被検液を細胞捕捉デバイス内に導入してフィルタを通過させることで、被検液に含まれる捕捉対象の細胞をフィルタの一方面に捕捉する捕捉工程と、細胞捕捉デバイスの第１流路を経て、溶解液供給部からの溶解液を細胞捕捉デバイスの第１領域内に導入し、フィルタに捕捉された捕捉対象の細胞を溶解液により溶解する溶解工程と、細胞捕捉デバイスの第２流路を経て、細胞捕捉デバイスの第１領域内に滞留する捕捉対象の細胞の成分を含む溶解液を溶解液回収部に回収する回収工程と、を有する。
　上記の細胞溶解方法では、溶解工程において、第１流路を介して溶解液供給部から溶解液が供給されると共に、回収工程において、第２流路を介して溶解液が溶解液回収部に回収される。第１流路および第２流路は、いずれも細胞捕捉デバイスの第１領域に接続されている流路であるため、溶解液は、細胞捕捉デバイスの第２領域を通過することなく、溶解液回収部に回収される。このように、上記の細胞溶解方法では、捕捉した細胞の溶解および細胞溶解後の液体の回収を行うことが可能となる。また、細胞溶解後の溶解液は、細胞捕捉デバイスの第２領域を通過することなく、溶解液回収部に回収されるため、対象となる細胞とは異なる細胞の成分が溶解液に含まれることを防ぐことができる。
　また、本開示の一形態に係る細胞成分含有液の製造方法は、複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタの一方面側に捕捉対象である細胞を含む被検液を供給し、被検液の少なくとも一部をフィルタの他方面側に通過させることによってフィルタの一方面に細胞を捕捉すること、フィルタの一方面側に細胞を溶解する溶解液を供給して一方面に捕捉された細胞を溶解すること、細胞の溶解によって得られる細胞成分含有液をフィルタの一方面側から回収すること、を含む。
　上記の細胞成分含有液の製造方法では、被検液および溶解液をいずれもフィルタの一方面側に供給し、溶解した細胞を含む溶解液、すなわち、細胞成分含有液をフィルタの一方面側から回収する。このように、上記の細胞成分含有液の製造方法では、捕捉した細胞の溶解および細胞溶解後の液体の回収を行うことが可能となる。細胞成分含有液は、フィルタの他方面側を通過することなく回収されるため、捕捉対象となる細胞とは異なる細胞の成分が細胞成分含有液に含まれることを防ぐことができる。
　フィルタは、一方面側に導入される液体と接触し得るフィルタ領域を有し、フィルタ領域において、貫通孔の平均開口率は、０．１％以上５０％以下である態様とすることができる。
　上記の構成とすることで、フィルタの一方面側に供給された溶解液がフィルタの他方面側を通過することを好適に防止できる。したがって、細胞溶解後の溶解液において、捕捉対象となる細胞とは異なる細胞の成分が含まれることを一層確実に防ぐことができる。
　フィルタは、金属フィルタとすることができる。
　この場合、複数の貫通孔を例えばフォトレジストを用いた電気鋳造めっきなどにより高い精度で形成できる。したがって、捕捉対象の細胞を適切に捕捉することができる。
　細胞成分含有液の製造方法は、フィルタへの被検液の供給の前に、フィルタの一方面側から他方面側に処理液を供給すること、を更に含む態様とすることができる。
　この場合、例えば洗浄液等の処理液を用いて被検液中の細胞を好適に処理することができる。
　本開示によれば、捕捉した細胞の溶解および溶解後の液体の回収を行うことが可能な細胞溶解装置、細胞溶解方法、および細胞成分含有液の製造方法が提供される。
本発明の実施形態に係る細胞溶解装置の構成を説明する図である。 細胞溶解装置を構成する細胞捕捉デバイスの構成を説明する図である。 細胞溶解装置を構成する前処理部の構成を説明する図である。 細胞溶解方法を説明するフロー図である。 細胞捕捉デバイスにおける溶解液の移動を説明する図である。
　以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
（細胞捕捉装置）
　図１は本実施形態に係る細胞溶解装置の構成を説明する図である。細胞溶解装置は、被検液をフィルタによってろ過することで被検液中に含まれる細胞を捕捉する装置である。この細胞溶解装置は、フィルタにより捕捉された細胞を溶解した後に、その溶解液を回収する装置である。以下の実施形態では、被検液が血液であり、捕捉対象となる細胞が血中循環がん細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）である場合について説明するが、この点については限定されない。被検液としては、例えば、血液、リンパ液等が挙げられる。捕捉対象となる特定の細胞としては、例えば、ＣＴＣを始めとする希少細胞、血液中の細胞（赤血球、白血球、血小板等）が挙げられる。
　図１に示すように、細胞溶解装置１００には、細胞を捕捉するためのフィルタが内部に設けられた細胞捕捉デバイス１、細胞捕捉デバイス１に対して処理液（試薬）を供給するための軟質チューブからなる流路３、細胞捕捉デバイス１に対して血液を供給するための軟質チューブからなる流路４が設けられている。流路３の上流側には、細胞捕捉デバイス１に対して処理液（試薬）を供給する処理液供給部５と、細胞捕捉デバイス１に対して溶解液を供給する溶解液供給部６と、が設けられる。流路３上には、前処理部７が設けられている。一方、流路４の上流側には、細胞捕捉デバイス１に対して被検液を供給する被検液供給部８と、細胞捕捉デバイス１からの溶解液を回収する溶解液回収部９と、が設けられている。
　流路３の上流に設けられる処理液供給部５から供給される処理液としては、フィルタに捕捉された細胞等を洗浄するための洗浄液が挙げられるが、洗浄液に限定されるものではない。複数種類の処理液を使用する場合には、処理液供給部５において互いに異なる容器のそれぞれに処理液を収容し、各容器から細胞捕捉デバイス１に対して個別を供給可能な構成とする。これにより、複数種類の処理液を個別に使用することができる。複数種類の処理液を使用する場合、各容器に対して個別の流路を設けると共に、個別の流路のうち流路３に接続する流路を選択バルブによって切り替える構成とすることができる。
　流路３の上流に設けられる溶解液供給部６から供給される溶解液としては、フィルタに捕捉された細胞（捕捉対象の細胞）を溶解する溶解液が挙げられる。溶解液の種類は、捕捉対象の細胞の種類等に基づいて選択される。ここでは、例えば、界面活性剤ベースの溶解液が用いられる。
　処理液供給部５および溶解液供給部６には、それぞれに対して個別に流路３１，３２が設けられている。流路３１，３２は、それぞれ流路３に接続されている。流路３１，３２上には、それぞれバルブＶ１，Ｖ２が設けられている。バルブＶ１，Ｖ２の開閉を制御することで、流路３に供給する液体が選択的に供給される。
　流路３上の前処理部７は、流路３を流れる液体からの気体の除去、および、液体中の異物の除去等を行う機能を有する。前処理部７の構造および機能については後述する。
　流路４の上流には、被検液を収容した被検液供給部８が設けられている。また、流路４の上流には、細胞捕捉デバイス１からの溶解液を回収する溶解液回収部９が設けられている。
　被検液供給部８および溶解液回収部９には、それぞれに対して個別に流路４１，４２が設けられている。流路４１，４２は、それぞれ流路４に接続されている。また、流路４１，４２上には、それぞれバルブＶ３，Ｖ４が設けられている。バルブＶ３，Ｖ４の開閉を制御することで、流路３に供給する液体が選択的に供給される。
　細胞捕捉デバイス１に対しては、処理液、溶解液、および、血液を同時に供給するのではなく、いずれかを供給する構成となっている。細胞捕捉デバイス１に対する液体の供給は、バルブＶ１～Ｖ４の開閉によって切り替えられる。例えば、被検液を細胞捕捉デバイス１に対して供給する場合は、バルブＶ３を開とし、その他のバルブＶ１，Ｖ２，Ｖ４を閉とする。バルブＶ１～Ｖ４としては、軟質チューブを加圧変形させて液体の流れを遮断するピンチバルブを用いることができる。
　細胞捕捉デバイス１に対して処理液及び血液のうちのいずれかの液体を供給する場合、細胞捕捉デバイス１の下流側の軟質チューブからなる流路１０上に設けられたポンプＰ（送液部）の駆動によって目的の液体を吸引することで液体の供給が行われる。ポンプＰは、回転数変化により流路中の液体の流速を変えることが可能な構造となっている。ポンプＰとしては、例えば軟質チューブに対する加圧による蠕動点を順次移動させる蠕動ポンプ（ペリスタルティックポンプ）を用いることができる。ポンプＰの駆動により、処理液、血液等の液体は、流路３又は流路４の内部を細胞捕捉デバイス１に向かう方向に流れ、細胞捕捉デバイス１に供給される。細胞捕捉デバイス１を通過した液体は、流路１０を経て回収部１１に流れ込む。回収部１１は、流路１０を経て細胞捕捉デバイス１から流れる液体を回収する容器である。
　上記の各部は、制御部１５によって制御される。具体的には、バルブＶ１～Ｖ４およびポンプＰの駆動は、制御部１５からの指示によって行われる。細胞溶解装置１００に不図示のバルブまたはポンプが更に設けられている場合、制御部１５は、当該バルブまたはポンプの制御も行う。制御部１５には、上記の各部についての駆動、停止等の制御を可能とするプログラムを入力するためのプログラム入力機能が備えられている。制御部１５には、入力されたプログラムによって上記したように各機器を順に動作させる駆動機構が付加されている。制御部１５によって液体を流すラインが選択されると、その選択結果に基づいて、制御部１５から各部に対して上記のバルブの開閉及びポンプの駆動に係る指示が行われる。
（細胞捕捉デバイス）
　次に、細胞捕捉デバイス１について、図２を用いて説明する。図２（Ａ）は、細胞捕捉デバイス１の上面図、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）のIIB－IIB矢視図である。
　細胞捕捉デバイス１は、複数の貫通孔６２を有するフィルタ６１を蓋部材５１と収納部材５２とで挟み込んだ構成とされている。フィルタ６１は、蓋部材５１及び収納部材５２を組み合わせた際にその内部に形成された空間に配置されている。フィルタ６１は、例えば金属フィルタである。フィルタ６１の厚み方向には、貫通孔６２が複数形成されている。
　細胞捕捉デバイス１では、平面視における蓋部材５１の一辺の長さを１０ｍｍ～１００ｍｍとすることができ、さらに１５ｍｍ～７０ｍｍとすることができ、特に２０ｍｍ～３０ｍｍとすることができる。また、厚みに関しては、２ｍｍ～２０ｍｍとすることができ、さらに３ｍｍ～１５ｍｍとすることができ、特に５ｍｍ～１０ｍｍとすることができる。
　フィルタ６１に用いられる金属の材質は、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、ニッケル、クロム及びこれらの金属の合金が例示できるが、これらに限定するものではない。金属は、単体で用いてもよく、異なる２種以上の材料を併用してもよい。金属は、機能性を付与するために他の金属との合金又は金属の酸化物であってもよい。価格又は入手の容易さの観点から、ニッケル、銅、金及びこれらを主成分とする金属を用いることが好ましく、特にニッケルを主成分とする金属を用いることが好ましい。主成分とは、フィルタ６１を形成する材料のうち５０重量％以上を占める成分をいう。フィルタ６１がニッケルを主成分とする材料から形成される場合、ニッケルの表面に金めっきがされていてもよい。金めっきによって、フィルタ表面の酸化を防止できる。このため、捕捉対象の特定の細胞（例えばＣＴＣ等）に対する付着性が一様となり、データの再現性を高めることができる。フィルタ６１は、生体適合性ポリマー等を使用した表面処理が行われていてもよい。この用途に用いられるポリマーとしては、例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が挙げられる。
　フィルタ６１の厚みは、例えば、３μｍ～１００μｍ、５μｍ～５０μｍ、または５μｍ～３０μｍとすることができる。フィルタ６１の膜厚を上記の範囲とした場合、フィルタの取り扱いが容易であり、精密加工にも適している。また、フィルタの貫通孔６２が設けられた領域の大きさは２５ｍｍ２～１０００ｍｍ２とすることができる。また、当該領域の大きさを２５ｍｍ２～２２５ｍｍ２とすることができ、さらに、２５ｍｍ２～１００ｍｍ２とすることができる。当該領域の大きさを１０００ｍｍ２以下とすることで、デッドスペースを抑えることができる。また、当該領域の大きさを２５ｍｍ２以上とすることで、処理時間を短縮することができる。
　細胞捕捉デバイス１の蓋部材５１には、軟質チューブで形成された流路３に接続される流路３Ａ（第１流路）と、流路４に接続される流路４Ａ（第２流路）とが形成されている。蓋部材５１には、流路３Ａ、４Ａと連通してフィルタ６１の上方に形成された第１領域５５が設けられている。
　細胞捕捉デバイス１の収納部材５２には、第２領域５６が設けられている。第２領域５６は、フィルタ６１の貫通孔６２を通過した液体が通過する空間である。第２領域５６は、中央部の深さが周縁部よりも深くなるように、フィルタ６１の下方に形成されている。収納部材５２には、第２領域５６に対して連通すると共に流路１０に対して接続され、第２領域５６の液体を外部に排出するための流路１０Ａ（第３流路）が設けられている。蓋部材５１と収納部材５２とにより挟み込まれるフィルタ６１に設けられた貫通孔６２は、捕捉対象となる細胞６０が通過できない程度の大きさとなっている。
　蓋部材５１と収納部材５２とにより挟み込まれるフィルタ６１のうち、第１領域５５および第２領域５６に対向する領域、すなわち、細胞捕捉デバイス１内に導入される液体と接触し得る領域をフィルタ領域６３と称す。フィルタ領域６３において複数の貫通孔６２が形成された面積（複数の貫通孔６２の断面積）の合計は、フィルタ領域６３の面積に対して、例えば、５０％以下、３０％以下、２０％以下、または１０％以下となっている。フィルタ領域６３における貫通孔６２の平均開口率は、例えば、０．１％以上５０％以下であってもよく、１％以上３０％以下であってもよく、１％以上２０％以下であってもよく、１％以上１０％以下であってもよい。第１領域５５および第２領域５６は、図２に示すように、フィルタ６１を挟んで対向配置されている。したがって、フィルタ領域６３の面積は、第１領域５５または第２領域５６と対向する領域の面積に相当する。一方、貫通孔６２が形成された面積の合計は、フィルタ領域６３内に配置される貫通孔６２の面積（断面積）の合計となる。当該面積は、フィルタ領域６３の面積から、フィルタ領域６３のうち貫通孔６２が形成されていない領域（フィルタ６１の表面が存在する領域）の面積を差し引いた値に相当する。フィルタ領域６３において複数の貫通孔６２が形成された面積の合計がフィルタ領域６３の面積に対して５０％以下、３０％以下、２０％以下、または１０％以下とされることで、細胞捕捉デバイス１を利用した捕捉対象の細胞の溶解および溶解液の回収を効率よく行うことができる。この点については後述する。
　細胞捕捉デバイス１における流路３、流路４および流路１０の取付け位置は、図２に示す位置に制限されない。すなわち、流路３および流路４は、互いに対向して配置される必要はない。例えば、細胞捕捉デバイス１を構成する４つの側面のうちの１つにおいて２つの流路３，４が接続される構成としてもよい。また、細胞捕捉デバイス１の上面に流路３，４が接続される構成とすることもできる。同様に、流路１０の取付け位置を適宜変更することもできる。流路３，４および流路１０の取付け位置は、細胞捕捉デバイス１の流路３Ａ，４Ａ，９Ａの配置に応じて変更される。そのため、細胞捕捉デバイス１の流路３Ａ，４Ａ，９Ａの配置についても適宜変更することができる。また、流路の数についても適宜変更することができる。
（前処理部）
　次に、前処理部について、図３を用いて説明する。図３（Ａ）は、前処理部７の上面図、図３（Ｂ）は、図３（Ａ）のIIIB－IIIB矢視図である。前処理部７の内部は、異物除去用フィルタ２１を挟んで第１領域２４と第２領域２６とで構成されている。流路３のうち上流側の流路は、前処理部７の上側の第１領域２４と接続されており、流路３のうち下流側の流路は、前処理部７の下部になる第２領域２６に接続されている。前処理部７には、上流側の処理液供給部５または溶解液供給部６から供給される液体が導入される。前処理部７は、導入された液体を外部に排出するまでの間に、液体中の気泡及び異物を除去する機能を有する。
　前処理部７では、作業性等の観点から、平面視における蓋部材５１の一辺の長さを１０ｍｍ～１００ｍｍとすることができ、さらに１５ｍｍ～７０ｍｍとすることができ、特に２０ｍｍ～３０ｍｍとすることができる。また、厚みに関しては、２ｍｍ～２０ｍｍとすることができ、さらに３ｍｍ～１５ｍｍとすることができ、特に５ｍｍ～１０ｍｍとすることができる。
　前処理部７は、複数の貫通孔２２を有する異物除去用フィルタ２１を蓋部材２８と収納部材２９とで挟み込んだ構成とすることによって、気泡だけでなく処理液中の異物をも除去することができる。蓋部材２８及び収納部材２９の平面形状は、細胞捕捉デバイス１と同様に矩形であってもよいし、円形状であってもよく、特に限定されない。
　異物除去用フィルタ２１は、蓋部材２８及び収納部材２９を組み合わせた際にその内部に形成された空間に配置されている。異物除去用フィルタ２１の厚み方向には、複数の貫通孔２２が形成されている。異物除去用フィルタ２１に設けられた貫通孔２２は、複数種類の処理液および溶解液が通過可能な大きさであればよい。当該貫通孔２２は、どの種類の液体であっても容易に通過可能な、すなわち通過時に負荷がかからない程度の大きさであることが好ましい。異物除去用フィルタ２１には、処理液または溶解液が流れるため、貫通孔２２の大きさは、細胞捕捉デバイス１のフィルタ６１の貫通孔６２よりも同じか小さくすることができる。このような構成とすることで、処理液または溶解液内に異物が混じっている場合に、細胞捕捉デバイス１よりも前段の前処理部７で異物を確実に除去することができる。
　異物除去用フィルタ２１に用いられる金属の材質は、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、ニッケル、クロム及びこれらの金属の合金が例示できるが、これらに限定するものではない。金属は、単体で用いてもよく、異なる２種以上の材料を併用してもよい。金属は、機能性を付与するために他の金属との合金又は金属の酸化物であってもよい。価格又は入手の容易さの観点から、ニッケル、銅、金及びこれらを主成分とする金属を用いることが好ましく、特にニッケルを主成分とする金属を用いることが好ましい。主成分とは、異物除去用フィルタ２１を形成する材料のうち５０重量％以上を占める成分をいう。異物除去用フィルタ２１がニッケルを主成分とする材料から形成される場合、ニッケルの表面に金めっきがされていることが好ましい。金めっきによって、フィルタ表面の酸化を防止できるため、異物除去性能を高く維持することができる。また、細胞に対して無害なポリマーなどでフィルタ表面を被覆することが好ましい。この用途に用いられるポリマーとしては、例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が挙げられる。
　異物除去用フィルタ２１の厚みは、例えば、３μｍ～１００μｍ、５μｍ～５０μｍ、または５μｍ～３０μｍであってもよい。膜厚を上記の範囲とした場合、フィルタの取り扱いが容易であり、精密加工にも適している。また、異物除去用フィルタ２１において、貫通孔２２が設けられた領域の大きさは、２５ｍｍ２～１５００ｍｍ２とすることができる。また、当該領域の大きさは、２５ｍｍ２～７５０ｍｍ２とすることができ、さらに、２５ｍｍ２～２２５ｍｍ２とすることができる。大きさを１５００ｍｍ２以下とすることで、デッドスペースを抑えることができる。また、大きさを２５ｍｍ２以上とすることで、処理時間を短縮することができる。異物除去用フィルタ２１も、フィルタ６１と同様に、導入される液体と接触し得るフィルタ領域２３を有している。フィルタ領域２３において、複数の貫通孔２２が形成された面積（複数の貫通孔２２の断面積）の合計は、フィルタ領域２３の面積に対して、例えば、５０％以下、３０％以下、２０％以下、または１０％以下となっている。フィルタ領域２３における貫通孔２２の平均開口率は、例えば、０．１％以上５０％以下であってもよく、１％以上３０％以下であってもよく、１％以上２０％以下であってもよく、１％以上１０％以下であってもよい。
　前処理部７の蓋部材２８には、上流側の流路３に接続される流路３１Ａが形成されている。また、蓋部材２８には、第１領域２４が設けられている。第１領域２４は、処理液を異物除去用フィルタ２１の貫通孔２２に対して誘導するための空間である。第１領域２４は、流路３１Ａと連通して異物除去用フィルタ２１の上方に形成されている。
　前処理部７の収納部材２９には、第２領域２６が設けられている。第２領域２６は、異物除去用フィルタ２１の貫通孔２２を通過した液体を外部に排出するための空間である。第２領域２６は、中央部の深さが周縁部よりも深くなるように、異物除去用フィルタ２１の下方に形成されている。第２領域２６の中央には、第２領域２６の液体を外部に排出するための流路３１Ｂが設けられている。流路３１Ｂは、第２領域２６に対して連通すると共に、下流側の流路３に対して接続されている。第２領域２６の底部は、端部から中央に向けて徐々に凹んでおり、最深部となる中央に流路３１Ｂが設けられている。これにより、流路３１Ｂからの処理液の排出が好適に行われる。前処理部７では、上記の第１領域２４及び第２領域２６により形成される空間は、処理液が流通する流路３の径よりも大径の気泡滞留領域として機能する。細胞溶解装置１００全体における流路の径は、再現性の観点から、基本的に前処理部７の気泡滞留領域（第１領域２４及び第２領域２６により形成される空間）及び細胞捕捉デバイス１の内部の空間（第１領域５５及び第２領域５６により形成される空間）を除いて、同程度のサイズであることが好ましい。ここで、気泡滞留領域の径とは、気泡滞留領域の処理液の移動方向に対する断面の径を意味する。
　上記の前処理部７として、図２で示す細胞捕捉デバイス１を利用することができる。図２に示す細胞捕捉デバイス１は、上流側となる蓋部材５１に流路３Ａ、４Ａが設けられ、互いに異なる２つの流路に対して接続可能な構成を備えている。これに対して、図３に示す前処理部７では、上流側の蓋部材２８に１つの流路３１Ａが設けられている。図２に示す細胞捕捉デバイス１において、一方側の流路（例えば流路３Ａ）の外部の流路（流路３）と接続する側の端部を塞ぎ、細胞捕捉デバイス１を蓋部材５１において外部と接続可能な流路を１つとすることで、図３に示す前処理部７と同様の構成に変更することができる。このように、前処理部７は、細胞捕捉デバイス１の蓋部材５１及び収納部材５２と同一形状の蓋部材２８及び収納部材２９を利用して製造することができる。これにより、例えば細胞捕捉デバイス１とは異なる形状を有する前処理部７を製造する場合と比較して、製造コストを低減することができる。
　上記の前処理部７は、蓋部材２８が収納部材２９よりも高さ方向で上側となるように細胞溶解装置１００に設けられている。したがって、内部の空間（第１領域２４及び第２領域２６）への処理液の導入口となる流路３１Ａの第１領域２４側の端部３０１が、排出口となる流路３２Ａの第２領域２６側の端部３０２よりも上方となる。これにより、第１領域２４及び第２領域２６から構成される気泡滞留領域を通過する処理液は、上方の導入口から第１領域２４へ導入されると共に、第２領域２６の下方の排出口から外部へ排出される。気泡滞留領域に到達した処理液の内圧は一気に下がるため、液内に溶けていた気泡が分離して気泡として気泡滞留領域に滞留しやすくなり、処理液からの気泡除去効果を高めることができる。処理液から分離された気泡は、第１領域２４の上方側に滞留する。
　異物除去用フィルタ２１の貫通孔２２を処理液が通過することにより、貫通孔２２を通過することができない異物は、異物除去用フィルタ２１により捕捉される。これにより、気泡及び異物が除去された処理液は、第２領域２６から流路３１Ｂを経て後段の流路３に対して排出される。導入口側の端部３０１の下端は、排出口側の端部３０２の上端よりも上方とすることができる。具体的には、導入口側の端部３０１の下端は、排出口側の端部３０２の上端よりも０．１ｍｍ～５ｍｍ上方とすることができ、０．１ｍｍ～２．５ｍｍ上方とすることができる。導入口側の端部３０１の下端は、排出口側の端部３０２の上端よりも０．１ｍｍ～１．５ｍｍ上方とすることができる。上記の構成とすることで、気泡と異物を適切に除去することが可能となる。
　流路３上に前処理部７が設けられることで、液体（処理液または溶解液）内に気泡が含まれている場合であっても、前処理部７内の第１領域２４に気泡を滞留させることができるため、第１領域２４及び第２領域２６を移動する間に液体から気泡を除去できる。また、異物除去用フィルタ２１が設けられていることで、液体に含まれる異物の少なくとも一部（貫通孔２２を通過できない異物）を捕捉することができるため、異物が除去された液体を後段の細胞捕捉デバイス１に対して供給することができる。
　なお、前処理部７は、細胞捕捉デバイス１と一体的に構成されていてもよい。すなわち、細胞溶解装置１００では、前処理部７、前処理部７と細胞捕捉デバイス１との間を接続する流路、および、細胞捕捉デバイス１としての機能を兼ねたデバイスを用いてもよい。
　細胞溶解装置１００は、必ずしも処理液供給部５を備えていなくてもよい。この場合、前処理部７は、細胞捕捉デバイス１の上流側の任意の位置に配置可能である。この場合、前処理部７により、細胞捕捉デバイス１に供給される各種液の気泡を除去することができる。前処理部７は、細胞捕捉デバイス１と溶解液供給部６との間に位置していてもよい。この場合、少なくとも溶解液供給部６から細胞捕捉デバイス１に供給される溶解液中の気泡を除去することができる。
（細胞溶解方法）
　次に、図４を参照しながら、細胞溶解装置１００による細胞溶解方法について説明する。
　まず、細胞捕捉デバイス１を使用して、対象の細胞をフィルタ６１上に捕捉する（Ｓ０１：捕捉工程）。制御部１５の制御により、細胞捕捉デバイス１に対して被検液供給部８から流路４を介して被検液を供給する。ポンプＰを駆動して、流路１０側から流路１０内の液体を吸引することで、被検液が細胞捕捉デバイス１内の第１領域５５側からフィルタ６１の貫通孔６２を通過し、第２領域５６側から外部の流路１０へ排出される。このとき、捕捉対象の細胞は、フィルタ６１の貫通孔６２を通過せず、フィルタ６１上（第１領域５５側のフィルタ６１表面）に残留する。また、捕捉対象の細胞以外でも、フィルタ６１の貫通孔６２を通過できなかった細胞等は、フィルタ６１上に残留する。被検液は、少なくともフィルタ６１を通過すればよく、デバイス内部に空気が入ることを防ぐために全ての被検液が流路１０へ排出される前にポンプＰの駆動を停止してもよい。
　なお、上記の捕捉工程（Ｓ０１）を行う前に、細胞捕捉デバイス１および細胞溶解装置１００の流路内を洗浄液等で満たしておいてもよい。
　次に、捕捉した細胞に係る処理を行う（Ｓ０２：処理工程）。制御部１５の制御により、細胞捕捉デバイス１に対して処理液供給部５から流路３を介して処理液を供給する。ポンプＰを駆動して流路１０側から流路１０内の液体を吸引することで、処理液が細胞捕捉デバイス１内の第１領域５５側からフィルタ６１の貫通孔６２を通過し、第２領域５６側から外部の流路１０へ排出される。処理液が洗浄液である場合には、この処理工程を経ることで、細胞捕捉デバイス１内部に滞留する被検液が処理液と共に外部に排出される。なお、複数種類の処理液を使用して細胞に対する処理を行う場合には、複数種類の処理液を予め定められた順序で細胞捕捉デバイス１内へ導入していくことで、所望の処理を行うことができる。処理工程（Ｓ０２）の終了時には、デバイス内部に空気が入ることを防ぐために、処理液（最後に供給された処理液）が細胞捕捉デバイス１の第１領域５５、第２領域５６、および流路３Ａ，４Ａ，９Ａを満たした状態で、ポンプＰの駆動が停止される。
　次に、細胞捕捉デバイス１のフィルタ６１上に残留する対象の細胞を溶解し（Ｓ０３：溶解工程）、溶解後の液体を回収する（Ｓ０４：回収工程）。
　溶解工程（Ｓ０３）では、制御部１５の制御により、細胞捕捉デバイス１に対して溶解液供給部６から流路３を介して溶解液を供給する。ここで、溶解液は、細胞捕捉デバイス１の第１領域５５を満たす程度まで、ポンプＰの駆動によりデバイス内に導入される。溶解液が第１領域５５に導入されることで、第１領域５５に滞留する細胞の溶解が行われる。溶解に時間がかかる場合には、溶解液を第１領域５５に滞留させた状態で所定の時間（例えば、数分～数十分程度）待機する。
　その後、第１領域５５に滞留した溶解液を溶解液回収部９へ回収する（Ｓ０４：回収工程）。溶解液は、流路４を経て溶解液回収部９に流入させる。制御部１５による溶解液の回収に係る制御としては、種々の方法が挙げられる。例えば、バルブＶ１，Ｖ３を閉とし、バルブＶ２，Ｖ４を開とした状態で、図示しないポンプ等を利用して溶解液供給部６からの溶解液を第１領域５５へ導入する方法を用いることができる。また、バルブＶ２，Ｖ３を閉とし、バルブＶ１，Ｖ４を開とした状態で、図示しないポンプ等を利用して処理液供給部５からの処理液を第１領域５５へ導入する方法を用いることもできる。第１領域５５内の液体（溶解後の溶解液）を溶解液回収部９へ移動させることができればよいので、溶解液の回収には、処理液および溶解液のいずれも使用することができる。また、流路の一部（例えば、前処理部７と細胞捕捉デバイス１との間の流路３）を開放し、液を流さずに空気を第１領域５５へ導入する方法を用いることもできる。
　溶解工程（Ｓ０３）および回収工程（Ｓ０４）における溶解液の移動方向を図５に示す。図５に示すように、流路３および流路３Ａから細胞捕捉デバイス１の第１領域５５に導入された溶解液は、第１領域５５内で細胞６０と接触して当該細胞を溶解する。その後、溶解された細胞の成分を含む溶解液が流路４Ａを経て流路４へ排出される。このように、溶解液は、第２領域５６を経て流路１０へ排出されるのではなく、細胞捕捉デバイス１の第１領域５５側のみを通過する。
　上述したように、溶解工程（Ｓ０３）の前には、処理工程（Ｓ０２）が行われる。このため、細胞捕捉デバイス１内に溶解液が導入される前には、デバイス内に処理液が満たされた状態となる。したがって、溶解液が第１領域５５内に導入された段階では、第２領域５６には処理液が滞留している。第１領域５５と第２領域５６との間には、貫通孔６２を有するフィルタ６１が設けられているので、貫通孔６２を介して、第１領域５５側の溶解液と第２領域５６側の処理液との一部は混合（置換）されると考えられる。しかしながら、貫通孔６２の周囲の一部の液体のみが置換されるため、例えば、第２領域５６に残存した細胞がある場合に当該細胞が溶解液によって溶解されることを防ぐことができる。また、第１領域５５側の流路４から溶解液回収部９に対して溶解液を移動させるため、対象の細胞の成分を含む溶解液が第２領域５６を移動することが防がれる。したがって、溶解液回収部９に回収される溶解液に、第２領域５６に残存した細胞の成分が含まれることが防がれる。
　なお、捕捉工程（Ｓ０１）の前に細胞捕捉デバイス１および細胞溶解装置１００の流路が洗浄液等で満たされている場合、処理工程（Ｓ０２）を行わなくてもよい。これにより、デバイス内部に空気が入ることを防ぐことができる。また、迅速に細胞の捕捉を行うことができる。
　以上のように、本実施形態に係る細胞溶解装置１００および細胞溶解装置１００による細胞溶解方法では、第１領域５５において捕捉された細胞を溶解する際に、第１流路である流路３Ａを介して溶解液供給部６から溶解液が供給されると共に、第２流路である流路４Ａを介して溶解液が溶解液回収部９に回収される。流路３Ａ，４Ａは、いずれも細胞捕捉デバイス１の第１領域５５に接続されている流路であるため、溶解後の溶解液は、細胞捕捉デバイス１の第２領域５６を通過することなく溶解液回収部９に回収される。このように、細胞溶解装置１００では、捕捉した細胞の溶解および細胞溶解後の液体の回収を行うことが可能となる。また、細胞溶解後の溶解液は、細胞捕捉デバイス１の第２領域５６を通過することなく、溶解液回収部９に回収されるため、捕捉対象となる細胞とは異なる細胞の成分が溶解液に含まれることを防ぐことができる。
　細胞溶解後の溶解液は、溶解した細胞の成分を含む。本明細書では、細胞溶解後の液体又は溶解液を細胞成分含有液と称する場合がある。細胞成分含有液に含まれる細胞成分は、用いる溶解液の種類、捕捉された細胞の種類等によって異なる。このような細胞成分としては、例えば、捕捉された細胞に由来する細胞内オルガネラ；細胞内オルガネラの構成成分；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；タンパク質、ペプチド；エクソソームなどが挙げられる。
　また、細胞溶解装置１００では、制御部１５が、流路３Ａと５処理液供給部との間のバルブＶ１、流路３Ａと溶解液供給部６との間のバルブＶ２、流路４Ａと被検液供給部８との間のバルブＶ３、および、流路４Ａと溶解液回収部９との間のバルブＶ４の開閉を制御すると共に、送液部として機能するポンプＰの動作を制御する。このような構成とすることで、制御部１５の制御によって、被検液、処理液および溶解液を細胞捕捉デバイス１に対して適切に供給すると共に、外部に排出する制御を行うことが可能となる。また、一連の動作を制御部１５による制御により実行することが可能となる。
　また、細胞溶解装置１００では、フィルタ６１のフィルタ領域６３において、複数の貫通孔６２が形成された面積の合計が、フィルタ領域６３の面積に対して１０％以下となっている。フィルタ領域６３において、貫通孔６２の平均開口率は、０．１％以上５０％以下となっている。このような構成とすることで、第１領域５５に導入された溶解液について、第１領域５５と逆側の第２領域５６に滞留する液体との混合が防がれる。したがって、溶解液回収部９に回収される溶解液において、捕捉対象となる細胞とは異なる細胞の成分が含まれることを防ぐことができる。なお、複数の貫通孔６２が形成された面積の合計は、フィルタ領域６３の面積に対して１０％よりも大きくなっていてもよい。この場合には、細胞捕捉デバイス１の振動を防ぐこと等により、第１領域５５に導入された溶解液と、逆側の第２領域５６に滞留する液体との混合を抑制することができる。
　また、細胞溶解装置１００では、フィルタ６１を金属フィルタとすることができる。この場合、複数の貫通孔６２を例えばフォトレジストを用いた電気鋳造めっきなどにより高い精度で形成できる。したがって、捕捉対象の細胞を適切に捕捉することができる。
　また、細胞溶解装置１００では、処理液供給部５が溶解液供給部６と共に細胞捕捉デバイス１の流路３Ａに対して接続されている。これにより、洗浄液等の処理液を用いて被検液中の細胞を好適に処理することができる。
　また、細胞溶解装置１００では、溶解液供給部６から細胞捕捉デバイス１に供給される溶解液、および処理液供給部５から細胞捕捉デバイス１に供給される処理液から気泡及び異物を除去する前処理部７が設けられている。これにより、気泡及び異物が除去された溶解液および処理液を細胞捕捉デバイス１に対して供給することができる。この前処理部７は、複数の貫通孔２２が厚み方向に形成された異物除去用フィルタ２１を内部に備えて構成されている。これにより、溶解液或いは処理液からの気泡及び異物の除去をより確実に実行することができる。
　以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示に係る細胞溶解装置および細胞溶解方法は上記に限定されず、種々の変更を行うことができる。例えば、上記実施形態では、流路３上に前処理部７を設ける構成について説明したが、前処理部７を省略した構成としてもよい。また、細胞捕捉デバイス１の外部の流路の構成は適宜変更することができる。バルブＶ１～Ｖ４の配置、ポンプＰの配置等も適宜変更することができる。
　本開示に係る細胞溶解方法では、捕捉対象の細胞の成分を含む細胞成分含有液が得られる。すなわち、本開示の他の実施形態によれば、細胞の溶解によって得られる細胞成分含有液を製造する方法が提供される。
　本開示の細胞成分含有液の製造方法は、細胞溶解装置１００による細胞成分含有液の製造方法であって、細胞捕捉デバイス１の流路４を経て、被検液供給部８からの被検液を細胞捕捉デバイス１内に導入してフィルタ６１を通過させることで、被検液に含まれる捕捉対象の細胞をフィルタ６１の一方面に捕捉する捕捉工程と、細胞捕捉デバイス１の流路３を経て、溶解液供給部６からの溶解液を細胞捕捉デバイス１の第１領域５５内に導入し、フィルタ６１に捕捉された捕捉対象の細胞を溶解液により溶解する溶解工程と、細胞捕捉デバイス１の流路１０を経て、細胞捕捉デバイス１の第１領域５５内に滞留する捕捉対象の細胞の成分を含む溶解液を回収部１１に回収する回収工程と、を含む。また、当該製造方法は、必要に応じて他の工程を含む。
　本開示にかかる細胞成分含有液の製造方法には、上述した細胞溶解方法について記述したすべての事項を、作用効果を含めてそのまま援用することができる。本開示にかかる細胞溶解方法および細胞成分含有液の製造方法は、捕捉対象とする細胞を溶解することができれば、本開示にかかる細胞溶解装置に拘束されるものではない。
　本開示にかかる他の細胞溶解方法は、複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタの一方面側に捕捉対象である細胞を含む被検液を供給し、被検液の少なくとも一部をフィルタの他方面側に通過させることによってフィルタの一方面に細胞を捕捉すること（捕捉工程）、フィルタの一方面側に細胞を溶解する溶解液を供給して当該一方面に捕捉された細胞を溶解すること（溶解工程）、細胞の溶解によって得られる細胞成分含有液をフィルタの一方面側から回収すること（回収工程）、を含む。当該細胞溶解方法は、必要に応じて、他の工程を含む。
　以下、本開示にかかる細胞溶解装置に拘束されない細胞溶解方法および細胞成分含有液の製造方法について説明する。以下の事項は、特記しない限り、細胞溶解方法及び細胞成分含有液製造方法の双方に適用される。
　捕捉工程では、複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタの一方面側に捕捉対象である細胞を含む被検液が供給され、少なくとも一部の被検液をフィルタの他方面に通過させることによって、フィルタの一方面に細胞が捕捉される。
　捕捉工程で用いられるフィルタは、細胞捕捉用のフィルタであり、捕捉対象となる細胞の種類によって、材質、貫通孔の口径、開口率等を変えることができる。フィルタは、金属フィルタであってもよい。フィルタに用いられる金属としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、ニッケル、クロム及びこれらの金属の合金を挙げることができ、ニッケル、銅、金及びこれらを主成分とする金属を挙げることができ、または、ニッケルを主成分とする金属を挙げることができる。主成分とは、当該フィルタを形成する材料のうち５０重量％以上を占める成分をいう。これにより、例えばフォトレジストを用いた電気鋳造めっきなどによって、複数の貫通孔を高い精度で形成できる。高い精度で複数の貫通孔を形成することにより、捕捉対象の細胞を適切に捕捉することができる。フィルタがニッケルを主成分とする材料から形成される場合、ニッケルの表面に金めっきがされていてもよい。金めっきによって、フィルタ表面の酸化を防止できる。このため、捕捉対象の特定の細胞（例えばＣＴＣ等）に対する付着性が一様となり、データの再現性を高めることができる。フィルタには、生体適合性ポリマー等を使用した表面処理が行われていてもよい。
　フィルタの厚みは、例えば、３μｍ～１００μｍ、５μｍ～５０μｍ、または５μｍ～３０μｍとすることができる。フィルタの膜厚を上記の範囲とした場合、フィルタの取り扱いが容易であり、精密加工にも適している。また、フィルタの貫通孔が設けられた領域の大きさは、例えば、２５ｍｍ２～１０００ｍｍ２とすることができ、２５ｍｍ２～２２５ｍｍ２とすることができ、２５ｍｍ２～１００ｍｍ２とすることができる。当該領域の大きさを１０００ｍｍ２以下とすることで、デッドスペースを抑えることができる。また、当該領域の大きさを２５ｍｍ２以上とすることで、処理時間を短縮することができる。
　フィルタには、フィルタの一方面側に導入される液体と接触し得る領域、すなわちフィルタ領域が備えられている。フィルタ領域において、複数の貫通孔が形成された面積（複数の貫通孔の断面積）の合計は、フィルタ領域の面積に対して例えば、５０％以下、３０％以下、２０％以下、または１０％以下とすることができる。フィルタ領域における貫通孔の平均開口率は、０．１％以上５０％以下であってもよく、１％以上３０％以下であってもよく、１％以上２０％以下であってもよく、１％以上１０％以下であってもよい。本開示の細胞溶解方法における細胞捕捉用フィルタとしては、例えば、本明細書において上述したフィルタ６１を用いることができる。
　被検液をフィルタの一方面（細胞捕捉面）側からフィルタの他方面（細胞捕捉面と反対側の面）に通過させるには、例えば、ポンプによる駆動、遠心分離等の機械的操作、または、シリンジによる押出し若しくは吸引、ピペットでの添加等の手技的操作などを用いることができる。被検液の少なくとも一部をフィルタの他方面側に通過させることによって、捕捉対象となる細胞がフィルタの一方面に捕捉される。
　溶解工程では、フィルタの一方面側に細胞を溶解する溶解液が供給される。これにより、フィルタの一方面に捕捉された細胞の溶解が行われる。溶解液としては、本明細書において上述した溶解液を挙げることができる。溶解工程によって、細胞が捕捉されたフィルタの一方面側で細胞の溶解処理が行われる。
　回収工程では、細胞の溶解によって得られる細胞成分含有液がフィルタの一方面側から回収される。フィルタに捕捉された細胞は、フィルタ上で溶解処理を受けて溶解し、溶解によって得られた細胞成分含有液は、フィルタを通過することなく、フィルタの一方面側に滞留する。回収工程では、このフィルタの一方面側に滞留している細胞成分含有液がフィルタの一方面側から回収される。このため、本開示の細胞溶解方法では、フィルタの他方面側に滞留する液体と混合することなく、細胞成分含有液をフィルタの一方面側から回収することができる。
　本開示の細胞溶解方法及び細胞成分含有液の製造方法は、被検液をフィルタに供給する捕捉工程の前に、フィルタの一方面側から他方面側に処理液を供給する処理工程を含むことができる。これにより、例えば洗浄液等の処理液を用いて被検液中の細胞に対して所望の処理を行うことができる。供給された処理液は、フィルタの一方面側から除去することができる。
　本開示の細胞溶解方法及び細胞成分含有液の製造方法は、捕捉工程の後であって溶解工程の前に、細胞に対して所定の処理を行うための処理工程を含むことができる。溶解工程の前に処理工程を行う場合、フィルタの一方面側に所定量の処理液が供給される。このとき、供給された処理液の一部がフィルタの一方面側から他方面側に通過し、フィルタの他方面側に処理液が滞留する。処理液の供給量は、少なくともフィルタの他方面側の空間領域を満たす量とすることができる。これにより、溶解工程で溶解液をフィルタの一方面側に供給する際、溶解液がフィルタの他方面側に浸入することを回避することができる。
　その後の溶解工程では、フィルタの一方面側に滞留する処理液に溶解液を添加することができる。また、フィルタの一方面側に滞留する処理液を溶解液に置換してもよい。これにより、フィルタの他方面側に細胞が残存する場合であっても、当該細胞が溶解液によって溶解されることを防ぐことができる。また、溶解液を、フィルタの一方面側から回収することによって、フィルタの他方面側の液体と共に対象の細胞の成分を含む溶解液が回収されてしまうことを防ぐことができる。したがって、フィルタの他方面側に残存した細胞の成分が溶解処理後に回収される溶解液に混入することを防ぐことができる。
　本開示の細胞溶解方法又は細胞成分含有液の製造方法は、捕捉工程の前又は後に、フィルタ等を洗浄液で洗浄するための洗浄工程を含むことができる。これにより、捕捉対象となる細胞をより精度よくフィルタに捕捉することができる。
　本開示にかかる細胞溶解方法及び細胞成分含有液の製造方法によれば、捕捉工程において、被検液中の捕捉対象の細胞を効率よく捕捉および溶解し、捕捉対象の細胞に由来する細胞成分を高濃度に含有する細胞成分含有液を得ることができる。細胞成分含有液は、例えば、捕捉率２０％以上、又は３０％以上で捕捉された捕捉対象の細胞の成分を含むことができる。また、細胞成分含有液は、被検液との容量比較として、例えば、１／５以上、又は１／１０以上に濃縮した液体とすることができる。
　１…細胞捕捉デバイス、３，３Ａ，４，４Ａ，１０，１０Ａ…流路、５…処理液供給部、６…溶解液供給部、７…前処理部、８…被検液供給部、９…溶解液回収部、１５…制御部、５５…第１領域、５６…第２領域、６１…フィルタ、６２…貫通孔、６３…フィルタ領域、１００…細胞溶解装置、Ｐ…ポンプ（送液部）。
 

Claims (13)

  1. 　複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタを内部に備える細胞捕捉デバイスと、
    　前記細胞捕捉デバイスに対して、捕捉対象である細胞を含む被検液を供給する被検液供給部と、
    　前記細胞捕捉デバイスに対して、前記被検液中の細胞を溶解するための溶解液を供給する溶解液供給部と、
    　前記細胞捕捉デバイスからの前記被検液中の細胞の成分を含む溶解液を回収する溶解液回収部と、
    　前記細胞捕捉デバイスから排出される液体を回収する回収部と、を備え、
    　前記細胞捕捉デバイスは、その内部に、前記フィルタの上側に設けられた空間である第１領域と、前記フィルタの下側に設けられた空間である第２領域と、前記第１領域とデバイス外部との間を接続する第１流路および第２流路と、前記第２領域とデバイス外部との間を接続する第３流路と、を有し、
    　前記溶解液供給部は、前記第１流路に対して接続され、
    　前記被検液供給部および前記溶解液回収部は、前記第２流路に対して接続され、
    　前記回収部は、前記第３流路に対して接続されている、細胞溶解装置。
  2. 　前記フィルタは、前記細胞捕捉デバイス内に導入される液体と接触し得るフィルタ領域を有し、
    　前記フィルタ領域において、前記複数の貫通孔が形成された面積の合計は、前記フィルタ領域の面積に対して１０％以下である、請求項１記載の細胞溶解装置。
  3. 　前記フィルタは、前記細胞捕捉デバイス内に導入される液体と接触し得るフィルタ領域を有し、
    　前記フィルタ領域において、前記貫通孔の平均開口率は、０．１％以上５０％以下である、請求項１記載の細胞溶解装置。
  4. 　前記フィルタは、金属フィルタである、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞溶解装置。
  5. 　前記細胞捕捉デバイスに対して、前記被検液中の細胞を処理するための処理液を供給する処理液供給部を更に備え、
    　前記処理液供給部は、前記第１流路に対して接続されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞溶解装置。
  6. 　前記細胞捕捉デバイスの上流側に前処理部を更に備え、
    　前記前処理部は、前記細胞捕捉デバイスに供給される液のうち少なくとも前記溶解液から気泡及び異物の少なくとも一方を除去する、請求項５に記載の細胞溶解装置。
  7. 　前記前処理部は、複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタを内部に備える、請求項６に記載の細胞溶解装置。
  8. 　前記細胞捕捉デバイス内の液体の移動を制御する制御部と、
    　前記細胞捕捉デバイス内の液体の送液部と、をさらに備え、
    　前記制御部は、前記第１流路と前記溶解液供給部との間、前記第２流路と前記被検液供給部との間、および、前記第２流路と前記溶解液回収部との間、に設けられるバルブの開閉を制御すると共に、前記送液部の動作を制御する、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞溶解装置。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞溶解装置による細胞溶解方法であって、
    　前記細胞捕捉デバイスの前記第２流路を経て、前記被検液供給部からの前記被検液を前記細胞捕捉デバイス内に導入して前記フィルタを通過させることで、前記被検液に含まれる前記捕捉対象の細胞を前記フィルタの一方面に捕捉する捕捉工程と、
    　前記細胞捕捉デバイスの前記第１流路を経て、前記溶解液供給部からの前記溶解液を前記細胞捕捉デバイスの前記第１領域内に導入し、前記フィルタに捕捉された前記捕捉対象の細胞を前記溶解液により溶解する溶解工程と、
    　前記細胞捕捉デバイスの前記第２流路を経て、前記細胞捕捉デバイスの前記第１領域内に滞留する前記捕捉対象の細胞の成分を含む前記溶解液を前記溶解液回収部に回収する回収工程と、を有する、細胞溶解方法。
  10. 　複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタの一方面側に捕捉対象である細胞を含む被検液を供給し、前記被検液の少なくとも一部を前記フィルタの他方面側に通過させることによって前記フィルタの前記一方面に前記細胞を捕捉すること、
    　前記フィルタの前記一方面側に前記細胞を溶解する溶解液を供給して前記一方面に捕捉された前記細胞を溶解すること、
    　前記細胞の溶解によって得られる細胞成分含有液を前記フィルタの前記一方面側から回収すること、を含む、細胞成分含有液の製造方法。
  11. 　前記フィルタは、前記一方面側に導入される液体と接触し得るフィルタ領域を有し、
    　前記フィルタ領域において、前記貫通孔の平均開口率は、０．１％以上５０％以下である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 　前記フィルタは、金属フィルタである、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記フィルタへの前記被検液の供給の前に、前記フィルタの前記一方面側から他方面側に処理液を供給すること、を更に含む、請求項９または１０に記載の方法。
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