CN108841713B - 理化处理单个细胞的微流控芯片、微流控装置及使用其理化处理单个细胞的方法 - Google Patents

理化处理单个细胞的微流控芯片、微流控装置及使用其理化处理单个细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种用于理化处理单个细胞的微流控芯片，其本体包括液路层、气路层和夹在中间的弹性薄膜；所述液路层包括：折返式单个细胞处理回收通道、第一试剂流入通道、第二试剂流入通道、试剂混合通道、第三试剂流入通道、反冲通道、以及负压与废液共用通道；所述气路层包括气动微阀组，其用于控制液路层各个通道的开和关；其中第一试剂流入通道、第二试剂流入通道分别与试剂混合通道的入口连通；所述试剂混合通道、第三试剂流入通道、反冲通道、负压与废液共用通道分别与折返式单个细胞处理回收通道连通，其中第三试剂流入通道和反冲通道是各自独立的通道或共用通道。本申请还涉及包括微流控芯片的微流控装置以及使用它们理化处理单个细胞的方法。

Description

理化处理单个细胞的微流控芯片、微流控装置及使用其理化 处理单个细胞的方法
技术领域
本发明涉及微流控领域，具体涉及一种理化处理单个细胞的微流控芯片、微流控装置以及使用它们理化处理单个细胞的方法。
背景技术
随着生物技术的发展以及生物医学、人类辅助生殖和畜牧业保种育种等方面的需求，细胞冻融技术经过60多年的发展，已经成为一项确实可行的细胞及生物组织保存方法。
其中人类***的冷冻保存最受关注，且应用前景最广。中国的***不育率由1992年的3％提高到现在的约20％，而解决***不育的主要医学途径是试管婴儿。我国2009年共有138家试管婴儿机构，截止2012年全国共有356家批准开展人类辅助生殖技术机构，17家***库。虽然短短3年，机构数量增加1倍，但一线城市试管婴儿手术平均需排队半年以上，处于严重供不应求状态。造成这种状态的一个主要原因是目前细胞冷冻处理技术效率低。
生殖细胞的常用冷冻保护剂包括渗透性保护剂，如甘油、丙二醇、二甲亚矾等，均为低分子中性物质，在溶液中发生水合作用，使溶液粘性增加和弱化水分子结晶过程。冷冻保护剂还包括非渗透性保护剂，如蔗糖、乙二醇、白蛋白等，这类物质使溶液呈过冷状态，在特定温度下降低溶质浓度而起保护作用。
随着近几年细胞产业的蓬勃发展，以及市场需求的高速增长，传统的细胞冷冻手工操作的局限性日益凸显。一些行业巨头推出了细胞工厂和冷冻设备，但这些设备的操作过程仍然基于传统手工操作流程，不具备对细胞进行精细操作的可能。
目前市场上已有一些微流控芯片实现了细胞冷冻的自动化操作，但此类微流控芯片对细胞进行精细操作的处理能力不足：不仅缺少可靠的细胞捕获结构，单个细胞有其是高价值的***存在丢失风险，而且液流速度调控的精密度不足，进而影响自动化程序处理的效果；由于缺少微阀***，各个液路之间无法实现可靠的截止。
发明内容
本申请实施方案提供一种理化处理单个细胞的微流控芯片、微流控装置以及使用所述微流控芯片或装置理化处理单个细胞的方法。
第一方面，本申请实施方案提供了一种用于理化处理单个细胞的微流控芯片，所述微流控芯片的本体可以包括液路层、气路层和夹在中间的弹性薄膜。所述液路层可以包括折返式单个细胞处理回收通道、第一试剂流入通道、第二试剂流入通道、试剂混合通道、第三试剂流入通道、反冲通道、以及负压与废液共用通道；所述气路层可以包括气动微阀组，其用于控制液路层各个通道的开和关；其中第一试剂流入通道、第二试剂流入通道可以分别与试剂混合通道的入口连通，所述试剂混合通道、第三试剂流入通道、反冲通道、负压与废液共用通道可以分别与折返式单个细胞处理回收通道连通，其中第三试剂流入通道和反冲通道可以是各自独立的通道或共用通道。
在一个实施方案中，折返式单个细胞处理回收通道可以包括细胞载入通道、细胞处理区、以及细胞回收通道，其中细胞载入通道和细胞回收通道可以在细胞处理区上游的同一处与细胞处理区连通，由此单个细胞在载入、处理和回收的过程中可以沿通道折返移动。
在另一实施方案中，细胞载入通道可以连接细胞接入口，也即外部对芯片(world-to-chip)接口，用于与外部的细胞载入器相连通；细胞回收通道可以连通细胞回收孔，也即芯片对外部(chip-to-world)接口，用于回收细胞。
在一实施方案中，细胞载入器可以由上盖、瓶身及下盖组成。瓶身较宽的上半部分用于盛放含有细胞的液体，较窄的下半部分用于连接微流控芯片并输送含有细胞的液流。含有细胞的液体可以在负压驱动下被吸入液路层。
在一实施方案中，细胞回收孔可以包括设置于细胞回收通道末端的微井，其中微井可以是圆形微孔，其垂直深度比细胞回收通道略深例如深30至100微米或与其一致。优选地，细胞回收孔还包括环绕微井的环形微柱阵列。
在又一实施方案中，试剂混合通道、第三试剂流入通道、反冲通道、负压与废液共用通道各自与折返式单个细胞处理回收通道的连通之处可以均设置有微柱阵列。优选地，细胞处理区与负压与废液共用通道的连通处可以设置有弧形微柱阵列。
在又一实施方案中，负压与废液共用通道可以在细胞载入过程中与外接负压源连通，而在细胞处理和回收过程中与废液池连通。
在又一实施方案中，气动微阀组可以包括6个气动微阀，其中第一试剂流入通道、第二试剂流入通道和试剂混合通道可以共用一个气动微阀(V1)，负压与废液共用通道、细胞载入通道和细胞回收通道可以各自由一个气动微阀控制(V5、V3、V4)；当第三试剂流入通道和反冲通道是各自独立的通道时，它们可以各自由一个气动微阀控制(V2、V6)；当第三试剂流入通道和反冲通道是共用通道时，一个气动微阀(V2)控制第三试剂的流入，通过另一个气动微阀(V6)实现对细胞处理区冲入和反冲的切换。
第二方面，本申请实施方案提供了一种用于理化处理单个细胞的自动化微流控装置，可以包括根据以上第一方面所述的微流控芯片、气压发生调控模块、逻辑控制电路和光纤传感模块。
在一个实施方案中，光纤传感模块用于监测细胞的位置，逻辑控制电路通过实时读取细胞传感信号来判断细胞是否到达指定位置进而判断是否执行下一步操作。
第三方面，本申请实施方案提供了一种使用第一方面所述的微流控芯片或第二方面所述的微流控装置理化处理单个细胞的方法，可以包括：
(1)将单个细胞滴入细胞载入器并开启负压将单个细胞吸入芯片；
(2)当细胞处理区捕获到所述细胞时，光纤传感模块检测到细胞传感信号，即开启理化处理过程：通过控制气动微阀组，依次用不同比例的第一试剂和第二试剂以及高速的第三试剂对所述细胞进行理化处理；
(3)处理完毕后，使用第三试剂将所述细胞反冲入细胞回收通道，至细胞回收孔的微井处被捕获；继续排出多余的第三试剂至残留体积不超过1微升时，打开细胞回收孔塞，用专用细胞提取工具将所述细胞吸出，完成回收。
在一个实施方案中，对细胞进行理化处理过程中，第一试剂与第二试剂的用量比例可以由100:0逐渐梯度变化为0:100，第三试剂的流量可以是第一试剂或第二试剂平均流量的4～20倍。
附图说明
图1是本发明折返式单个细胞处理芯片的三层结构示意图，包括三层结构上方的细胞载入器和细胞回收孔塞。
图2A是根据本发明一种实施方案的折返式单个细胞处理芯片的俯视示意图。
图2B是根据本发明另一实施方案的折返式单个细胞处理芯片的俯视示意图。
图3示出了细胞处理区分别与第三试剂流入通道、负压与废液共用通道的连通处设置有微柱阵列的情形。
图4是细胞回收孔的放大示意图，包括微井和环形微柱阵列。
其中1为液路层；2为弹性薄膜；3为气路层；4为细胞载入器；101为第一试剂流入通道；102为第二试剂流入通道；103为试剂混合通道；1041为第三试剂流入通道；1042为反冲通道；105为负压与废液共用通道；106为细胞载入通道；107为细胞处理区；108为细胞回收通道；109为废液池；110为负压泵；111为细胞回收孔；V1-6为芯片内置气动微阀；SV1-4为转换阀；CH1-6为压力泵通道。
具体实施方式
本发明的微流控芯片用于对单个细胞，尤其是单个生殖细胞进行理化处理。由于生殖细胞本身的稀缺性，所以整个处理过程必须保证细胞的完好无损，这也就使得对处理这类生殖细胞的微流控芯片的要求根本性不同于那些处理大批量无差别细胞的微流控芯片。
具体而言，本发明的微流控芯片在更好地控制细胞冷冻前的处理过程，实现全过程自动化控制的基础上，能够保证细胞不受到任何损坏。如图1所示，本发明微流控芯片的本体可以包括液路层1、气路层3和夹在中间的弹性薄膜2。当向气路层3中的气动控制通道内注入高压气体，气动控制通道下的弹性薄膜2向下发生弯曲，挤压弹性薄膜下方的液流通道；当撤去高压气体时，弹性薄膜2回复，从而实现气动微阀控制。这种控制方法是微流控领域公知的。气路层3可以包括气动微阀组，用于控制液路层1上的各个通道的开和关。
图2A是微流控芯片本体的示意图。如图2A所示，液路层1可以包括折返式单个细胞处理回收通道、第一试剂流入通道101、第二试剂流入通道102、试剂混合通道103、第三试剂流入通道1041、反冲通道1042、以及负压与废液共用通道105。第一试剂流入通道101、第二试剂流入通道102可以分别与试剂混合通道103的入口连通，而试剂混合通道103、第三试剂流入通道1041、反冲通道1042、负压与废液共用通道105可以分别与折返式单个细胞处理回收通道连通。优选地，试剂混合通道103、第三试剂流入通道1041、反冲通道1042、负压与废液共用通道105各自出口的内径可以均小于细胞的外径，这样可以防止细胞从这些通道出口流出。在图2A中，第三试剂流入通道1041和反冲通道1042是各自独立的通道。此时，反冲用的试剂可以是不同于第三试剂的其它试剂，但优选使用第三试剂。
折返式单个细胞处理回收通道可以包括细胞载入通道106、细胞处理区107、以及细胞回收通道108，这些通道的内径应大于细胞的外径，以免细胞受到损坏。细胞载入通道106和细胞回收通道108可以在细胞处理区107上游的同一处(见图中的阴影部分)与细胞处理区107连通，由此单个细胞在载入、处理和回收的过程中可以沿通道折返移动。本发明的这种折返式通道设计能够减少压力通道和气动微阀的数量，从而节约芯片的制造和处理成本，完全不同于现有技术中采用的仅仅以捕获细胞为目的的循环通道设计。
细胞载入通道106可以连接细胞接入口，也即外部对芯片接口；通过该细胞接入口，可以将微流控芯片与外部的细胞载入器4连接起来。如图1所示，细胞载入器4是本发明特殊设计的用于适配本发明微流控芯片的专用设备，由上盖、瓶身及下盖组成，用于盛装含有细胞的液体。瓶身的上半部分较宽，含有细胞的液体基本都储存在该部分；瓶身的下半部分较窄，用于连接微流控芯片并输送含有细胞的液流。当需要加载细胞时，将细胞载入器4安装到微流控芯片上的细胞接入口处，取开上盖，含有细胞的液体可以在负压气泵110的驱动下进入液路层1中并流动。本发明这种独特的外部对芯片接口设计，配合负压吸入方式，使得常规实验室的细胞操作和微流控芯片操作能够实现无缝连接。不仅如此，本发明的这种外部对芯片接口可以实现微升级溶液直接滴加吸入，细胞现取现用，而常规的细胞载入方法往往是使用正压将含有大量细胞的溶液经由外接管道送入芯片。
细胞回收通道108可以连接细胞回收孔111，也即芯片对外部接口。细胞回收孔111可以包括设置于细胞回收通道108末端的微井。如图4所示，微井可以是圆形微孔，其垂直深度比细胞回收通道108略深或与其一致。当处理细胞较重或在溶剂中的浓度较低时，细胞存在沉降的可能性，此时优选微井的垂直深度比细胞回收通道108深30至100微米。这一具体范围取决于被处理细胞的尺寸，细胞越大，微井的垂直深度越深。单个细胞被捕获之后仍需要痕量试剂，例如不超过1微升的第三试剂残余，以保证细胞能被专用细胞提取工具提取出芯片。在一个优选方案中，细胞回收孔111还可以包括环绕微井的环形微柱阵列。细胞回收孔111与自液路层1向上穿过弹性薄膜2和气路层3的孔道的一端相连通，孔道的另一端可以装配细胞回收孔塞5。本发明这种独特的芯片对外部接口设计，一方面能将细胞与处理液高效分离，另一方面也实现了与常规实验室后续细胞操作的无缝连接。这与常规细胞处理的微流控芯片存在根本性区别，前者往往是为了实现细胞分选、计数、培养或者观察等目的，细胞在进行相关处理后被丢弃，而本发明的微流控芯片针对的是获取困难、不可丢弃的高价值细胞，对其进行处理后必须完好回收。
气路层3中的气动微阀组可以包括6个气动微阀，在图2中具体表现为：第一试剂流入通道101、第二试剂流入通道102和试剂混合通道103共用一个气动微阀V1，第三试剂流入通道1041、反冲通道1042、负压与废液共用通道105、细胞载入通道106和细胞回收通道108各自由一个气动微阀(分别对应为V2、V6、V5、V3、V4)控制。
图2B示出了微流控芯片本体的另一种布局。相比图2A，唯一不同之处在于第三试剂流入通道1041和反冲通道1042是共用通道，具体而言是局部共用通道，即第三试剂流入通道1041经过气动微阀V2处后，仍继续延伸至反冲通道1042与其相连通。此时，气动微阀V2仍用于控制第三试剂的流入，而另一个气动微阀V6用来实现对细胞处理区冲入和反冲的切换。据此，图2A中第三试剂反冲液池(Reg3-BF)以及独立的一段反冲通道1042均可以省略。
根据本发明，试剂混合通道103、第三试剂流入通道1041、反冲通道1042、以及负压与废液共用通道105各自与折返式单个细胞处理回收通道的连通之处均可以设置有微柱阵列，用以防止细胞离开细胞处理区107。例如，图3示出了折返式单个细胞处理回收通道的细胞处理区107分别与第三试剂流入通道、负压与废液共用通道的连通处设置有微柱阵列的情形，其中优选地，细胞处理区107与负压与废液共用通道105的连通处可以设置有弧形微柱阵列。
本发明中，微柱的形状可以选自圆柱体、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构等中的任一种或其组合。微柱阵列包括至少两个微柱，相邻的微柱之间形成有能够阻滞单个细胞但液体又能通过的间隙。微柱阵列所排列成的形状可以为直线、弧形、环形等，这取决于阻滞细胞的效果、损坏细胞的可能性、加工难易程度等。微柱之间的间距可以根据所处理细胞的具体尺寸确定，在保证能卡住细胞的同时要使得液流阻力尽量小。总之，微柱尺寸、个数和微柱间距因通道总宽度而异，主要根据细胞的体积和直径来具体确定。
根据本发明，负压与废液共用通道105可以在细胞载入过程中与外接负压源110连通，而在细胞处理和回收过程中与废液池109连通。这一设计有效地减少了芯片中的通道总数，方便芯片的加工。
本发明的微流控芯片可以与气压发生调控模块、逻辑控制电路和光纤传感模块一起相互作业，组成微流控装置，从而实现对单个细胞的全自动化理化处理。气压发生调控模块可以包括气源、负压泵110、调压阀、转向阀SV1-4、以及流量计。光纤传感模块可以包括光纤头、光纤放大器。逻辑控制电路可以通过运行程序指令自动控制给气压强和转向阀档位，进而控制微流控芯片中的液流流速和气动微阀的开闭；通过实时读取流量值并反馈调节给气压强来保证液流速度稳定；通过实时读取光纤传感信号来判断细胞是否到达指定位置，进而判断是否执行下一步操作，由此实现对单个细胞进行自动化处理。本发明的微流控装置通过采用光纤传感，不仅灵敏度高，而且不用内置到芯片内部；相比其它常规传感方法如电阻抗传感等，这种非入侵式的传感方式对细胞造成的损伤几乎没有。
下面描述使用本发明的微流控芯片或微流控装置对单个细胞进行理化处理的过程。具体而言，本发明的处理方法可以包括如下步骤：
(1)在气动微阀V3和V5打开且V4关闭的情况下，将单个细胞滴入细胞载入器4并开启负压将单个细胞吸入芯片。
(2)当细胞处理区107捕获到所述细胞时，光纤传感模块检测到细胞传感信号，即开启理化处理过程：在气动微阀V3和V4关闭且V5打开的情况下，通过控制气动微阀V1和V2，依次用不同比例的第一试剂Reg1和第二试剂Reg2以及高速的第三试剂Reg3对所述细胞进行理化处理；
(3)处理完毕后，在气动微阀V4打开且V5关闭的情况下，使用第三试剂Reg3将所述细胞反冲入细胞回收通道108，至细胞回收孔的微井处被捕获；继续排出多余的第三试剂至极少残留时，打开细胞回收孔塞，用专用细胞提取工具将所述细胞吸出，完成回收。其中，如果第三试剂流入通道1041和反冲通道1042是各自独立的通道时，在气动微阀V6打开且V2关闭的情况下，驱动第三试剂Reg3进行细胞反冲(如图2A所示)；如果第三试剂流入通道1041和反冲通道1042局部共用时(如图2B所示)，在气动微阀V6关闭且V2打开的情况下，驱动第三试剂Reg3进行细胞反冲。
在步骤(1)载入单个细胞之前，可以对微流控芯片进行预处理，也即使用第一试剂Reg1冲洗芯片。
在步骤(2)中，理化处理过程具体可以是：I、打开气动微阀V1，驱动第一试剂Reg1进入芯片；II、驱动第二试剂Reg2进入芯片；III、逐步改变Reg1和Reg2的流量配比，完成混合后对细胞进行冲洗，其中Reg1和Reg2的用量比例可以由100:0逐渐梯度变化为0:100；IV、关闭气动微阀V1并打开V2，驱动第三试剂Reg3对细胞进行冲洗，其中第三试剂的流量可以是第一试剂或第二试剂平均流量的4～20倍，例如120～600微升/分钟，这取决于具体待处理的细胞。
这三种试剂对细胞进行理化处理的本质是实现与细胞内物质的置换，这主要通过渗透压来驱动。根据本发明，第一试剂Reg1和第二试剂Reg2对细胞进行缓慢处理，与细胞缓慢发生反应，其中Reg1的用量可以由100％逐渐梯度减少到0，相反Reg2的用量可以由0逐渐梯度增加到100％。第一、第二试剂流量的这种梯度变化有利于保证细胞内外的渗透压变化是缓慢进行的。如后面的实施例所示，对于总长15分钟的处理，Reg1和Reg2的流量可以如下表进行梯度控制：
Figure GDA0002631360430000101
第三试剂Reg3的主要作用是渗入细胞，以置换出细胞内的水分。由于Reg3处理的时间较短，所以需要以更高的流量例如120至600微升/分进行处理，即高速处理。
根据本发明，作为例子，第一试剂Reg1的主要成分可以是M199缓冲液和人血白蛋白等；第二试剂Reg2的主要成分可以是M199缓冲液、乙二醇、二甲基亚砜等；第三试剂Reg3的主要成分可以是M199缓冲液、乙二醇、二甲基亚砜、糖等。
本发明的微流控芯片、微流控装置以及处理单个细胞的方法可以配合生殖细胞的冷冻设备实现全自动一体化操作，稳定性高，而且能够精准控制，从而满足日益增长的产业需求。不仅如此，本发明能够保证细胞完好无损的情况下，实现100％的捕获率，这对稀缺珍贵的生殖细胞尤为意义重大，也有助于提高和稳定细胞冷冻复苏成活率。
实施例
以下通过实施例来更详细地说明本发明。
本实施例的微流控芯片用于处理细胞尺寸为120-150微米的人卵子、牛卵子或者牛胚胎细胞，其中各通道的内径均约为200微米。细胞回收通道108末端的内径由200微米逐渐过渡到300微米，再过渡到内径约为650微米的细胞回收孔。微柱是长宽高为100微米X100微米X200微米的长方体，微柱间距设置为约50微米。
实施例1使用该微流控芯片处理一个牛胚胎细胞，如图2A所示，详细操作过程如下：
第一步：使用第一试剂Reg1冲洗芯片
在第三试剂流入通道1041入口的液池(Reg3)以及反冲通道1042入口的液池(Reg3-BF)内放置第一试剂Reg1。随后将气体转向阀SV1、SV2、SV3、SV4的气体给压方向调向液路方向(图2黑线所示)，同时负压装置保持关闭。
向气路通道CH2增压并将转换阀SV2转至V1位置，关闭芯片内置气动微阀V1；向气路通道CH4增压，关闭芯片内置气动微阀V3；向气路通道CH1和CH6增压，驱动Reg1进行芯片内部液路管道冲洗，最后通过负压与废液共用通道105排出到芯片外的废液池109内。
第二步：准备细胞处理试剂
准备第一试剂流入通道101、第二试剂流入通道102、第三试剂流入通道1041和反冲通道1042各入口的液池内的试剂，使各液池中的试剂与液池编号对应。向气路通道CH1增压并将转换阀SV1转至V2位置，关闭芯片内置气动微阀V2；向气路通道CH6增压并将转换阀SV4转至V6位置，关闭芯片内置气动微阀V6；向气路通道CH5增压关闭芯片内置气动微阀V4。
第三步：载入待处理的单个细胞
将细胞载入器4***芯片的细胞接入口。将待处理的单个细胞从培养皿中取出，连同附带的培养液一起注入细胞载入器4中。停止向CH4增压，打开芯片内置气动微阀V3，启动负压泵110，细胞在负压作用下被吸入芯片的细胞处理区107。当细胞到达处理区内的指定位置时，光纤传感模块检测到细胞并向逻辑控制电路发出信号，后者随即停止负压泵工作。随后向气路通道CH4增压，关闭芯片内置气动微阀V3。
第四步：细胞处理
将转换阀SV2转至Reg1液池方向，打开芯片内置气动微阀V1，调节气路通道CH2的压强，驱动Reg1进入芯片；将转换阀SV3转至Reg2液池方向，调节气路通道CH3的压强，驱动第二试剂Reg2进入芯片；按下表逐步改变Reg1和Reg2的流量配比，完成混合后对细胞进行冲洗。
Figure GDA0002631360430000121
将转换阀SV2转至V1位置，关闭芯片内置气动微阀V1；将转换阀SV1转至第三试剂Reg3液池方向，打开芯片内置气动微阀V2，调节气路通道CH1的压强，驱动Reg3对细胞进行冲洗，Reg3的流量约为300微升/分。
试剂Reg1-3都是分别按预定设计，有序、梯度地注入芯片，并在细胞处理区107内和细胞反应，达到预定的细胞处理要求。
在细胞处理过程中，操作者还可以根据对细胞形态学的观察结果随时暂停并修改处理参数。
第五步：细胞回收
将转换阀SV1转至V2位置，关闭芯片内置气动微阀V2；停止向气路通道CH5增压，打开芯片内置气动微阀V4。将转换阀SV3转至V5位置，关闭芯片内置气动微阀V5。将转换阀SV4转至Reg3-BF位置，打开芯片内置气动微阀V6，调节气路通道CH6的压强，驱动第三试剂Reg3沿反冲通道1042行进，此时Reg3的流向由第四步的从左至右流经细胞处理区107变为从右至左流经细胞处理区，并进一步将细胞推送至细胞回收孔。
随后停止Reg3的输入，并利用后续气流将细胞周围的试剂液体去除干净。待试剂排净后，打开细胞回收孔塞，使用麦管提取出处理完成的细胞。
实施例2
使用该微流控芯片处理一个人卵子，如图2B所示，详细操作过程如下：
第一步：使用第一试剂Reg1冲洗芯片
在第三试剂流入通道1041入口的液池内放置第一试剂Reg1。随后将气体转向阀SV1、SV2、SV3的气体给压方向调向液路方向(图2黑线所示)，同时负压装置保持关闭。
向气路通道CH2增压并将转换阀SV2转至V1位置，关闭芯片内置气动微阀V1；向气路通道CH4增压，关闭芯片内置气动微阀V3；向气路通道CH1增压，驱动Reg1进行芯片内部液路管道冲洗，最后通过负压与废液共用通道105排出到芯片外的废液池109内。
第二步：准备细胞处理试剂
准备第一试剂流入通道101、第二试剂流入通道102和第三试剂流入通道1041各入口的液池内的试剂，使各液池中的试剂与液池编号对应。向气路通道CH1增压并将转换阀SV1转至V2位置，关闭芯片内置气动微阀V2；向气路通道CH5增压并将转换阀SV4转至V4位置，关闭芯片内置气动微阀V4。
第三步：载入待处理的单个细胞
将细胞载入器4***芯片的细胞接入口。将待处理的单个细胞从培养皿中取出，连同附带的培养液一起注入细胞载入器4中。打开芯片内置气动微阀V3，启动负压泵110，细胞在负压作用下被吸入芯片的细胞处理区107。当细胞到达处理区内的指定位置时，光纤传感模块检测到细胞并向逻辑控制电路发出信号，后者随即停止负压泵工作。随后向气路通道CH4增压，关闭芯片内置气动微阀V3。
第四步：细胞处理
将转换阀SV2转至Reg1液池方向，打开芯片内置气动微阀V1，调节气路通道CH2的压强，驱动Reg1进入芯片；将转换阀SV3转至Reg2液池方向，调节气路通道CH3的压强，驱动第二试剂Reg2进入芯片；逐步改变Reg1和Reg2的流量配比，完成混合后对细胞进行冲洗。
将转换阀SV2转至V1位置，关闭芯片内置气动微阀V1；将转换阀SV1转至第三试剂Reg3液池方向，打开芯片内置气动微阀V2，调节气路通道CH1的压强，驱动Reg3对细胞进行冲洗。
试剂Reg1-3都是分别按预定设计，有序、梯度地注入芯片，并在细胞处理区107内和细胞反应，达到预定的细胞处理要求。试剂Reg1-3的流量控制与实施例1中的相同。
在细胞处理过程中，操作者还可以根据对细胞形态学的观察结果随时暂停并修改处理参数。
第五步：细胞回收
将转换阀SV4转至V6位置，关闭芯片内置气动微阀V6，同时也就打开芯片内置气动微阀V4。将转换阀SV3转至V5位置，关闭芯片内置气动微阀V5。调节气路通道CH1的压强，驱动第三试剂Reg3沿第三试剂流入通道1041和反冲通道1042行进，此时Reg3的流向由第四步的从左至右流经细胞处理区107变为从右至左流经细胞处理区，并进一步将细胞推送至细胞回收孔。
随后停止Reg3的输入，并利用后续气流将细胞周围的试剂液体去除干净。待试剂排净后，打开细胞回收孔塞，使用麦管提取出处理完成的细胞。
在本文中，所有的通道、阀门、转向阀和试剂的编号并不影响微流控芯片本身运行的逻辑，文中的编号主要用于方便表达。

Claims (11)

1.一种用于理化处理单个细胞的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的本体包括液路层、气路层和夹在中间的弹性薄膜；
所述液路层包括：折返式单个细胞处理回收通道、第一试剂流入通道、第二试剂流入通道、试剂混合通道、第三试剂流入通道、反冲通道、以及负压与废液共用通道；
所述气路层包括气动微阀组，其用于控制液路层各个通道的开和关；
其中第一试剂流入通道、第二试剂流入通道分别与试剂混合通道的入口连通；所述试剂混合通道、第三试剂流入通道、反冲通道、负压与废液共用通道分别与折返式单个细胞处理回收通道连通，其中第三试剂流入通道和反冲通道是各自独立的通道或共用通道。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于折返式单个细胞处理回收通道包括细胞载入通道、细胞处理区、以及细胞回收通道，其中细胞载入通道和细胞回收通道在细胞处理区上游的同一处与细胞处理区连通，由此单个细胞在载入、处理和回收的过程中沿通道折返移动。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于细胞载入通道连接细胞接入口，用于与外部的细胞载入器相连通；细胞回收通道连接细胞回收孔，用于回收细胞。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于所述细胞回收孔包括设置于细胞回收通道末端的微井，其中微井是圆形微孔，其垂直深度比细胞回收通道深或与其一致。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于细胞回收孔还包括环绕微井的环形微柱阵列。
6.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于所述试剂混合通道、第三试剂流入通道、反冲通道、负压与废液共用通道各自与折返式单个细胞处理回收通道的连通之处均设置有微柱阵列。
7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于细胞处理区与负压与废液共用通道的连通处设置有弧形微柱阵列。
8.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于负压与废液共用通道在细胞载入过程中与外接负压源连通，而在细胞处理和回收过程中与废液池连通。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的微流控芯片，其特征在于气动微阀组包括6个气动微阀，其中第一试剂流入通道、第二试剂流入通道和试剂混合通道共用一个气动微阀V1，负压与废液共用通道、细胞载入通道和细胞回收通道各自由气动微阀V5、V3、V4控制；当第三试剂流入通道和反冲通道是各自独立的通道时，它们各自由气动微阀V2、V6控制；当第三试剂流入通道和反冲通道是共用通道时，气动微阀V2控制第三试剂的流入，通过另一气动微阀V6实现对细胞处理区冲入和反冲的切换。
10.一种用于理化处理单个细胞的自动化微流控装置，其特征在于所述装置包括：根据权利要求1至9中任一项所述的微流控芯片、气压发生调控模块、逻辑控制电路和光纤传感模块；
其中气压发生调控模块包括气源、负压泵(110)、调压阀、转向阀(SVl—4)、以及流量计；
光纤传感模块包括光纤头、光纤放大器，用于监测细胞的位置；
逻辑控制电路通过运行程序指令自动控制给气压强和转向阀档位，进而控制微流控芯片中的液流流速和气动微阀的开闭；通过实时读取流量值并反馈调节给气压强来保证液流速度稳定；通过实时读取光纤传感信号来判断细胞是否到达指定位置，进而判断是否执行下一步操作，由此实现对单个细胞进行自动化处理。
11.一种使用根据权利要求1至9中任一项所述的微流控芯片或根据权利要求10所述的微流控装置理化处理单个细胞的方法，包括：
(1)将单个细胞滴入细胞载入器并开启负压将单个细胞吸入芯片；
(2)当细胞处理区捕获到所述细胞时，光纤传感模块检测到细胞传感信号，即开启理化处理过程：通过控制气动微阀组，依次用不同比例的第一试剂和第二试剂以及第三试剂对所述细胞进行理化处理；
(3)处理完毕后，使用第三试剂将所述细胞反冲入细胞回收通道，至细胞回收孔处被捕获；继续排出多余的第三试剂至残留体积不超过1微升时，打开细胞回收孔塞，用专用细胞提取工具将所述细胞吸出，完成回收。
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