JP2003530854A - 限外濾過を使用するプラスミド回収の方法及び装置 - Google Patents
限外濾過を使用するプラスミド回収の方法及び装置Info
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Abstract
(57)【要約】
細胞破片及びその他の大きい細胞成分を除去するための第一濾過段階とプラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の表面で捕獲して回収する限外濾過段階とを使用して細胞からプラスミドまたはその他のＤＮＡを回収する方法、及び、該方法の実施装置が開示されている。装置は、上段の精密濾過膜または粗濾過膜と下段の限外濾過膜とを含む。双方のフィルターは同じ力で駆動されても異なる力で駆動されてもよく、順次に駆動されても同時に駆動されてもよい。
Description
【０００１】
本発明はプラスミド回収方法及び該方法の実施装置に関する。より特定的には
本発明は、プラスミド調製方法及び該方法の実施装置に関する。
本発明は、プラスミド調製方法及び該方法の実施装置に関する。
【０００２】
（発明の背景）
アルカリ溶菌後の細菌溶解液からプラスミドを回収する慣用の方法は、結合、
洗浄及び溶出から成る方法として公知である。この方法では、ヨウ化カリウムの
ようなカオトロピック試薬の存在下でガラス繊維フィルターに結合させることに
よってプラスミドを清澄化溶菌液から回収する。このカオトロピック試薬はプラ
スミドをガラス繊維に結合させるが、その他の細胞成分の殆どを通過させる。次
にガラス繊維フィルターをエタノール（７０重量％以上の濃度）で洗浄してカオ
トロピック試薬を除去する。余剰のエタノールは吸取り、遠心または十分な真空
乾燥によってフィルタープレートの下面から除去される。次に水または低塩バッ
ファを使用してガラス繊維からプラスミドを溶出させる。
洗浄及び溶出から成る方法として公知である。この方法では、ヨウ化カリウムの
ようなカオトロピック試薬の存在下でガラス繊維フィルターに結合させることに
よってプラスミドを清澄化溶菌液から回収する。このカオトロピック試薬はプラ
スミドをガラス繊維に結合させるが、その他の細胞成分の殆どを通過させる。次
にガラス繊維フィルターをエタノール（７０重量％以上の濃度）で洗浄してカオ
トロピック試薬を除去する。余剰のエタノールは吸取り、遠心または十分な真空
乾燥によってフィルタープレートの下面から除去される。次に水または低塩バッ
ファを使用してガラス繊維からプラスミドを溶出させる。
【０００３】
この方法には多くの欠点がある。第一に、系に汚染物質（エタノール）を導入
し、その完全な除去が難しい。残留エタノールはプラスミドに対してまたはプラ
スミドに行う試験に対して好ましくない影響を及ぼす。加えて、この方法には時
間がかかり、また、方法が多くの順次段階を要する。更に、ガラス繊維のプラス
ミド結合容量が小さいので結合効率がよくない。また、ガラスからの溶出が完全
でない。ある種のプラスミドはガラスに不可逆的に結合することが知見された。
総体的に、プラスミドの回収率は有効なプラスミドのしばしば８０％未満であり
、ときには７０％未満である。
し、その完全な除去が難しい。残留エタノールはプラスミドに対してまたはプラ
スミドに行う試験に対して好ましくない影響を及ぼす。加えて、この方法には時
間がかかり、また、方法が多くの順次段階を要する。更に、ガラス繊維のプラス
ミド結合容量が小さいので結合効率がよくない。また、ガラスからの溶出が完全
でない。ある種のプラスミドはガラスに不可逆的に結合することが知見された。
総体的に、プラスミドの回収率は有効なプラスミドのしばしば８０％未満であり
、ときには７０％未満である。
【０００４】
本発明は、新しい汚染物質の導入を排除し、より高い純度のプラスミドを従来
の方法よりもはるかに高い回収速度で回収できるように改良されたプラスミドま
たはその他の環状ＤＮＡの回収方法及び装置を提供する。
の方法よりもはるかに高い回収速度で回収できるように改良されたプラスミドま
たはその他の環状ＤＮＡの回収方法及び装置を提供する。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、細胞を破壊し、破壊された細胞を次に１つまたは複数の精密濾過（
ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＭＦ）膜または粗濾過（ｃｏａｒｓｅ ｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎ）膜で濾過する方法を提供する。殆どの細胞破片を上記の（１
つまたは複数の）膜によって除去し、次いで残りを限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌ
ｔｒａｔｉｏｎ；ＵＦ）膜によって濾過し、プラスミドまたはその他のＤＮＡを
ＵＦ膜の上面に残留させ、この上面から回収する。
ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＭＦ）膜または粗濾過（ｃｏａｒｓｅ ｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎ）膜で濾過する方法を提供する。殆どの細胞破片を上記の（１
つまたは複数の）膜によって除去し、次いで残りを限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌ
ｔｒａｔｉｏｎ；ＵＦ）膜によって濾過し、プラスミドまたはその他のＤＮＡを
ＵＦ膜の上面に残留させ、この上面から回収する。
【０００６】
方法は、ＭＦ濾過段階または粗濾過段階とＵＦ濾過段階との双方を行うために
遠心また定常差圧（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉａｌ）（正または負）を使用する。方法が双方の段階に定常差圧を使用するの
が好ましく、双方の段階に負の定常差圧（真空）を使用するのが特に好ましい。
遠心また定常差圧（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉａｌ）（正または負）を使用する。方法が双方の段階に定常差圧を使用するの
が好ましく、双方の段階に負の定常差圧（真空）を使用するのが特に好ましい。
【０００７】
更に、この方法を実施する装置が開示されている。装置は、１つまたは複数の
ウェルを含む上段フィルタープレートを備えており、（１つまたは複数の）ウェ
ルの各々の内部に、好ましくは（１つまたは複数の）ウェルの底部近傍にＭＦ濾
過膜または粗濾過膜が配置されている。上段プレートは定常差圧の供給源との接
続手段を備えている。１つまたは複数のウェルを有する下段プレートが配備され
ており、下段プレートの（１つまたは複数の）ウェルの各々の内部に、好ましく
はウェルの底部近傍にＵＦ膜が配置されている。下段プレートは負の定常差圧の
供給源との接続手段を備えている。下段プレートの下方に廃液コレクタまたはド
レンが配備されている。
ウェルを含む上段フィルタープレートを備えており、（１つまたは複数の）ウェ
ルの各々の内部に、好ましくは（１つまたは複数の）ウェルの底部近傍にＭＦ濾
過膜または粗濾過膜が配置されている。上段プレートは定常差圧の供給源との接
続手段を備えている。１つまたは複数のウェルを有する下段プレートが配備され
ており、下段プレートの（１つまたは複数の）ウェルの各々の内部に、好ましく
はウェルの底部近傍にＵＦ膜が配置されている。下段プレートは負の定常差圧の
供給源との接続手段を備えている。下段プレートの下方に廃液コレクタまたはド
レンが配備されている。
【０００８】
本発明の１つの目的は、
（ａ）細胞成分、特にプラスミド及びその他のＤＮＡを遊離させるために細胞
壁を十分に破壊する段階と、 （ｂ）１つまたは複数の精密濾過膜または粗濾過膜または両濾過膜の組合せに
よって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段階と、 （ｃ）１つまたは複数の限外濾過膜によって（ｂ）の濾液を濾過して、プラス
ミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数の限外濾過膜の上面に不通過物（ｒ
ｅｔｅｎｔａｔｅ）として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
壁を十分に破壊する段階と、 （ｂ）１つまたは複数の精密濾過膜または粗濾過膜または両濾過膜の組合せに
よって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段階と、 （ｃ）１つまたは複数の限外濾過膜によって（ｂ）の濾液を濾過して、プラス
ミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数の限外濾過膜の上面に不通過物（ｒ
ｅｔｅｎｔａｔｅ）として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、
（ａ）細胞壁を十分に破壊して細胞成分、特にプラスミドまたはその他のＤＮ
Ａを遊離させる段階と、 （ｂ）濾過を推進するために正圧を使用し１つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 （ｃ）濾過を推進するために負圧を使用し１つまたは複数の限外濾過膜によっ
て（ｂ）の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数
の限外濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
Ａを遊離させる段階と、 （ｂ）濾過を推進するために正圧を使用し１つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 （ｃ）濾過を推進するために負圧を使用し１つまたは複数の限外濾過膜によっ
て（ｂ）の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数
の限外濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、
（ａ）細胞壁を十分に破壊して細胞成分、特にプラスミドまたはその他のＤＮ
Ａを遊離させる段階と、 （ｂ）濾過を推進するために正圧を使用し１つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 （ｃ）濾過を推進するために正圧を使用し１つまたは複数の限外濾過膜で（ｂ
）の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数の限外
濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
Ａを遊離させる段階と、 （ｂ）濾過を推進するために正圧を使用し１つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 （ｃ）濾過を推進するために正圧を使用し１つまたは複数の限外濾過膜で（ｂ
）の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数の限外
濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、
（ａ）細胞壁を十分に破壊して細胞成分、特にプラスミドまたはその他のＤＮ
Ａを遊離させる段階と、 （ｂ）濾過を推進するために負圧を使用し１つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 （ｃ）濾過を推進するために正圧を使用し１つまたは複数の限外濾過膜で（ｂ
）の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数の限外
濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
Ａを遊離させる段階と、 （ｂ）濾過を推進するために負圧を使用し１つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 （ｃ）濾過を推進するために正圧を使用し１つまたは複数の限外濾過膜で（ｂ
）の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数の限外
濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、
（ａ）細胞壁を十分に破壊して細胞成分、特にプラスミドまたはその他のＤＮ
Ａを遊離させる段階と、 （ｂ）濾過を推進するために負圧を使用し１つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 （ｃ）濾過を推進するために負圧を使用し１つまたは複数の限外濾過膜で（ｂ
）の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数の限外
濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
Ａを遊離させる段階と、 （ｂ）濾過を推進するために負圧を使用し１つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 （ｃ）濾過を推進するために負圧を使用し１つまたは複数の限外濾過膜で（ｂ
）の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のＤＮＡを１つまたは複数の限外
濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 （ｄ）プラスミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡの回収方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、１つまたは複数の精密濾過膜または粗濾過膜を有する上
段フィルタープレートと１つまたは複数の限外濾過膜を有する下段フィルタープ
レートとを含み、上段フィルタープレートが下段フィルタープレートの上方に下
段フィルタープレートに近接して配置されている、プラスミドまたはその他のＤ
ＮＡの回収装置を提供することである。
段フィルタープレートと１つまたは複数の限外濾過膜を有する下段フィルタープ
レートとを含み、上段フィルタープレートが下段フィルタープレートの上方に下
段フィルタープレートに近接して配置されている、プラスミドまたはその他のＤ
ＮＡの回収装置を提供することである。
【００１４】
本発明のこれらの目的及びその他の目的は発明の詳細な説明及び特許請求の範
囲から明らかにされるであろう。
囲から明らかにされるであろう。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図１は、本発明の第一の好ましい方法のブロック図である。
図２は、本発明の第二の好ましい方法のブロック図である。
図３は、本発明の第三の方法のブロック図である。
図４は、本発明の第四の方法のブロック図である。
図５は、本発明の１つの方法のブロック図である。
図６は、本発明方法を実施する１つの装置の断面図である。
図７は、本発明方法を実施する第二の装置の断面図である。
【００１６】
（詳細な説明）
図１は本発明方法の第一の実施態様を示す。第一段階１０は、回収すべきプラ
スミドまたはその他のＤＮＡ物質を遊離させるために対象となる細胞を破壊する
段階である。この段階は多様な方法で行うことができる。最も常用される方法は
、アルカリ性物質と水酸化ナトリウム及びＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の
ような水性流体を含有する界面活性剤とを細胞の再浮遊溶液に導入して細胞の溶
解を惹起するアルカリ溶解手順を使用する方法である。
スミドまたはその他のＤＮＡ物質を遊離させるために対象となる細胞を破壊する
段階である。この段階は多様な方法で行うことができる。最も常用される方法は
、アルカリ性物質と水酸化ナトリウム及びＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の
ような水性流体を含有する界面活性剤とを細胞の再浮遊溶液に導入して細胞の溶
解を惹起するアルカリ溶解手順を使用する方法である。
【００１７】
次に段階１１で、溶解した細胞を１つまたは複数の微孔質濾過膜または粗濾過
膜によって濾過して、細胞壁、変性タンパク質及び染色体ＤＮＡのような細胞破
片とその他の大きい細胞成分とを除去する。
膜によって濾過して、細胞壁、変性タンパク質及び染色体ＤＮＡのような細胞破
片とその他の大きい細胞成分とを除去する。
【００１８】
次いで濾液を収集する。方法が順次方法であるときは濾液を限外濾過膜の上部
に収集し、段階が個別段階であるときは濾液を適当な容器に収集する。
に収集し、段階が個別段階であるときは濾液を適当な容器に収集する。
【００１９】
次に濾過段階１２で、 濾液を１つまたは複数の限外濾過膜で濾過して、プラ
スミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上部に収集する。次いで段階１３で
、使用すべきプラスミドまたはその他のＤＮＡを回収する。
スミドまたはその他のＤＮＡを限外濾過膜の上部に収集する。次いで段階１３で
、使用すべきプラスミドまたはその他のＤＮＡを回収する。
【００２０】
１つまたは複数の精密濾過膜または粗濾過材を使用し得る。典型的には１つの
膜を使用するが、特に細胞破片の量が多いときまたは第一膜が早期に目詰まりし
易いときは細胞破片を完全に除去するために２つ以上の膜のシリーズを使用して
もよい。多数の膜を使用する場合、これらの膜を個別的に使用してもよく、また
は互いに連続的に配置してもよい。連続的に配置するときは、連続する膜の各層
の表示細孔径が同じであるかまたは次第に小さくなるのが好ましい。この実施態
様では、１つの粗フィルターを使用し、次いで１つの微孔質フィルター、２つの
粗フィルターまたは２つの微孔質フィルターを使用する。
膜を使用するが、特に細胞破片の量が多いときまたは第一膜が早期に目詰まりし
易いときは細胞破片を完全に除去するために２つ以上の膜のシリーズを使用して
もよい。多数の膜を使用する場合、これらの膜を個別的に使用してもよく、また
は互いに連続的に配置してもよい。連続的に配置するときは、連続する膜の各層
の表示細孔径が同じであるかまたは次第に小さくなるのが好ましい。この実施態
様では、１つの粗フィルターを使用し、次いで１つの微孔質フィルター、２つの
粗フィルターまたは２つの微孔質フィルターを使用する。
【００２１】
典型的には、この用途に使用されるこれらの１つまたは複数の微晶質膜の表示
細孔径は約０．０１ミクロンから約１００ミクロンの範囲、好ましくは約０．０
５ミクロンから約７５ミクロンの範囲、より好ましくは約０．１ミクロンから約
５０ミクロンの範囲である。
細孔径は約０．０１ミクロンから約１００ミクロンの範囲、好ましくは約０．０
５ミクロンから約７５ミクロンの範囲、より好ましくは約０．１ミクロンから約
５０ミクロンの範囲である。
【００２２】
典型的には、粗フィルターの表示細孔径は約１００ミクロンから約１，０００
ミクロンの範囲、好ましくは約１００ミクロンから約５００ミクロンの範囲、よ
り好ましくは約１００ミクロンから約２５０ミクロンの範囲である。
ミクロンの範囲、好ましくは約１００ミクロンから約５００ミクロンの範囲、よ
り好ましくは約１００ミクロンから約２５０ミクロンの範囲である。
【００２３】
精密濾過膜及び／または粗濾過膜は天然または合成のポリマー、紙、セラミッ
クス、または、ステンレススチールもしくはニッケルのような金属から形成され
得る。膜の製造に使用できる好ましいポリマーとして、ニトロセルロース、再生
セルロース、酢酸セルロース、並びに、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、
ポリフェニルスルホン及びポリアリールスルホンのようなポリスルホン類、ポリ
フッ化ビニリデン、並びに、超高分子量ポリエチレン、低密度ポリエチレン及び
ポリプロピレンのようなポリオレフィン類、ナイロンとその他のポリアミド類、
ＰＴＦＥ、並びに、ポリ（ＴＦＥ−ｃｏ−ＰＦＡＶＥ）のような熱可塑性フッ化
ポリマー、ポリカーボネート類、または、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅ
ｓｏｔａの３Ｍから入手可能なＥＭＰＯＲＥＲＴＭ膜のような粒子充填膜が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。膜は多孔質流延膜、製織もしくは
不織材料、または、トラックエッチングのような別の慣用の膜製造法によって形
成された多孔質材料でよい。これらの膜はすべて当業界で周知であり、Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈ
ｕｓｅｔｔｓのような多くの供給業者から市販されている。
クス、または、ステンレススチールもしくはニッケルのような金属から形成され
得る。膜の製造に使用できる好ましいポリマーとして、ニトロセルロース、再生
セルロース、酢酸セルロース、並びに、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、
ポリフェニルスルホン及びポリアリールスルホンのようなポリスルホン類、ポリ
フッ化ビニリデン、並びに、超高分子量ポリエチレン、低密度ポリエチレン及び
ポリプロピレンのようなポリオレフィン類、ナイロンとその他のポリアミド類、
ＰＴＦＥ、並びに、ポリ（ＴＦＥ−ｃｏ−ＰＦＡＶＥ）のような熱可塑性フッ化
ポリマー、ポリカーボネート類、または、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅ
ｓｏｔａの３Ｍから入手可能なＥＭＰＯＲＥＲＴＭ膜のような粒子充填膜が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。膜は多孔質流延膜、製織もしくは
不織材料、または、トラックエッチングのような別の慣用の膜製造法によって形
成された多孔質材料でよい。これらの膜はすべて当業界で周知であり、Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈ
ｕｓｅｔｔｓのような多くの供給業者から市販されている。
【００２４】
所望の場合には、これらの膜が親水性になるように処理し得る。このような技
術は公知であり、その例として、グラフト化、架橋、または、親水性材料の単な
る重合、または、膜の表面コーティングなどが挙げられるが、これらに限定され
るものではない。
術は公知であり、その例として、グラフト化、架橋、または、親水性材料の単な
る重合、または、膜の表面コーティングなどが挙げられるが、これらに限定され
るものではない。
【００２５】
精密濾過段階または粗濾過段階は、１９９９年５月５日出願のＵＳＳＮ ６０
／１３２，３６９及び２０００年２月１４日出願のＵＳＳＮ ６０／１８２，３
５７に教示されている遠心力、重力または定常差圧（例えば正圧または真空）の
ような慣用の任意の処理によって開始し得る。これらの特許の教示はその全体が
参照によって本発明に含まれるものとする。
／１３２，３６９及び２０００年２月１４日出願のＵＳＳＮ ６０／１８２，３
５７に教示されている遠心力、重力または定常差圧（例えば正圧または真空）の
ような慣用の任意の処理によって開始し得る。これらの特許の教示はその全体が
参照によって本発明に含まれるものとする。
【００２６】
“定常差圧”という用語は、正圧または負圧（または真空）を意味する。液体
の水面の高さ（ｈｅａｄ ｈｅｉｇｈｔ）の低下が原因で時間の経過に伴って圧
力が絶えず減少していく遠心法の圧力と違って、定常差圧法では液体に作用する
圧力が濾過サイクルを通じて一定に維持され得る。更に、圧力は該圧力の作用を
受ける液体の水面の高さから独立しているので、濾過処理をその完了まで推進す
るために圧力を時間の経過に伴って増加させることもできる。所望の場合には圧
力の経時的な減少もこの定義に包含される。しかしながら遠心と違って、この減
少は管理されており、液体の水面の高さから独立しているので予定外の流束の減
衰は抑制または抑止される。
の水面の高さ（ｈｅａｄ ｈｅｉｇｈｔ）の低下が原因で時間の経過に伴って圧
力が絶えず減少していく遠心法の圧力と違って、定常差圧法では液体に作用する
圧力が濾過サイクルを通じて一定に維持され得る。更に、圧力は該圧力の作用を
受ける液体の水面の高さから独立しているので、濾過処理をその完了まで推進す
るために圧力を時間の経過に伴って増加させることもできる。所望の場合には圧
力の経時的な減少もこの定義に包含される。しかしながら遠心と違って、この減
少は管理されており、液体の水面の高さから独立しているので予定外の流束の減
衰は抑制または抑止される。
【００２７】
この方法では定常差圧の力がデバイス内の液体に作用し、従来の遠心のような
重力により及ぶ力でなく定常差圧が濾過処理の駆動力になる。正の差圧（正圧）
を使用するとき、該圧力が典型的には液体の頂部に加えられて液体の膜通過を促
進する。負の差圧または真空を使用するとき、該圧力が典型的には膜の下流側に
加えられて液体の底部に作用し、膜を通して液体を吸引する。
重力により及ぶ力でなく定常差圧が濾過処理の駆動力になる。正の差圧（正圧）
を使用するとき、該圧力が典型的には液体の頂部に加えられて液体の膜通過を促
進する。負の差圧または真空を使用するとき、該圧力が典型的には膜の下流側に
加えられて液体の底部に作用し、膜を通して液体を吸引する。
【００２８】
加えられる力（正または負）のレベルは複数の要因に左右される。これらの要
因としては、濾過すべきサンプルの量、使用される膜の種類（膜の細孔径または
排除限界分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｕｔｏｆｆ）、膜の強度及び膜厚）、
膜の実効濾過面積、濾過を生じさせるための速度、及び、サンプルの分極レベル
がある。
因としては、濾過すべきサンプルの量、使用される膜の種類（膜の細孔径または
排除限界分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｕｔｏｆｆ）、膜の強度及び膜厚）、
膜の実効濾過面積、濾過を生じさせるための速度、及び、サンプルの分極レベル
がある。
【００２９】
遠心濾過と違って定常差圧濾過は、水面の高さを成立させて維持する能力から
完全に独立している。これは、方法が典型的には溶質の非分極性濃度で流束減衰
を全く蒙らないことを意味する。典型的には少量の場合、定常差圧によって推進
される限外濾過で得られる濃縮倍率は同じ長さの時間内に遠心によって得られる
濃縮倍率に比べてはるかに高いという結果が得られる。
完全に独立している。これは、方法が典型的には溶質の非分極性濃度で流束減衰
を全く蒙らないことを意味する。典型的には少量の場合、定常差圧によって推進
される限外濾過で得られる濃縮倍率は同じ長さの時間内に遠心によって得られる
濃縮倍率に比べてはるかに高いという結果が得られる。
【００３０】
標準的にはこの方法は様々な量の液体を処理することができ、上限値は約２ミ
リリットルである。より典型的には、方法が１ミリリットル未満、好ましくは０
．５ミリリットル（５００マイクロリットル）未満の量を処理できる。十分な水
面の高さがあるので、遠心が定常差圧法と全く同様に速いという上限は存在する
（正確なレベルは特に、使用される流体並びに使用される定常差圧及び遠心のレ
ベルに依存する）。しかしながら、透析濾過に関して後述するように、遠心のほ
うが明らかに速いという速度であるときにも、遠心よりも本発明方法が好ましく
使用される正当な別の理由が存在する。例えば、本発明方法は透析濾過の必要性
を削除または軽減する。
リリットルである。より典型的には、方法が１ミリリットル未満、好ましくは０
．５ミリリットル（５００マイクロリットル）未満の量を処理できる。十分な水
面の高さがあるので、遠心が定常差圧法と全く同様に速いという上限は存在する
（正確なレベルは特に、使用される流体並びに使用される定常差圧及び遠心のレ
ベルに依存する）。しかしながら、透析濾過に関して後述するように、遠心のほ
うが明らかに速いという速度であるときにも、遠心よりも本発明方法が好ましく
使用される正当な別の理由が存在する。例えば、本発明方法は透析濾過の必要性
を削除または軽減する。
【００３１】
しかしながらもっと少ない量の場合、定常差圧の使用が遠心の使用よりも明ら
かに速いことは明白である。定常差圧法が遠心よりも速くなる点を以後の記載で
“突破点（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｉｎｔ）”と呼ぶ。約０．３００ミ
リリットルという少ない量を使用するとき、本発明方法は遠心よりも約６０％速
い。
かに速いことは明白である。定常差圧法が遠心よりも速くなる点を以後の記載で
“突破点（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｉｎｔ）”と呼ぶ。約０．３００ミ
リリットルという少ない量を使用するとき、本発明方法は遠心よりも約６０％速
い。
【００３２】
定常差圧のレベルを変更することによって方法の効果を変更し得る。例えば、
定常差圧を正常に加える圧力（１×）の３．５倍（３．５×）に増加させると、
濾過速度はほぼ６倍（６×）に増加する。更に、増加した（３．５×）差圧を用
いるとほぼ１分で突破点が生じる。これに比較して、不変化の（１×）圧力によ
る定常差圧を用いると突破点は７分で生じる。
定常差圧を正常に加える圧力（１×）の３．５倍（３．５×）に増加させると、
濾過速度はほぼ６倍（６×）に増加する。更に、増加した（３．５×）差圧を用
いるとほぼ１分で突破点が生じる。これに比較して、不変化の（１×）圧力によ
る定常差圧を用いると突破点は７分で生じる。
【００３３】
高いレベルの分極特性を有する濾材中では流束減衰が生じ得る。そのような場
合、本発明方法による濾過中にもある程度の流束減衰（ｆｌｕｘ ｄｅｃａｙ）
が観察されるかもしれないが、これは、水面の高さとは無関係であり、濾過され
ている物質の固有特性に関係があると考えなければならない。これは、使用され
るサンプルの初期量が少ないほど、このような分極性材料の存在下であっても高
いレベルの限外濾過及び回収が十分な速度で得られることを意味する。このよう
な結果を遠心法で得ることは必ずしも可能ではない。
合、本発明方法による濾過中にもある程度の流束減衰（ｆｌｕｘ ｄｅｃａｙ）
が観察されるかもしれないが、これは、水面の高さとは無関係であり、濾過され
ている物質の固有特性に関係があると考えなければならない。これは、使用され
るサンプルの初期量が少ないほど、このような分極性材料の存在下であっても高
いレベルの限外濾過及び回収が十分な速度で得られることを意味する。このよう
な結果を遠心法で得ることは必ずしも可能ではない。
【００３４】
定常差圧は負圧例えば減圧（例えば大気圧未満または真空）でもよくまたは正
圧（例えば大気圧以上）でもよい。
圧（例えば大気圧以上）でもよい。
【００３５】
負の定常差圧または真空としては典型的には約５インチＨｇから約２７インチ
Ｈｇ（１６９−９１４ミリバール）の力を使用し得る。より好ましくは、約１０
インチから約２７インチ（３３８−９１４ミリバール）を使用し得る。真空の力
のレベルは、システムの所望パラメーター、所望の限外濾過速度及び使用される
サンプルに適合するように使用者が容易に変更できる。
Ｈｇ（１６９−９１４ミリバール）の力を使用し得る。より好ましくは、約１０
インチから約２７インチ（３３８−９１４ミリバール）を使用し得る。真空の力
のレベルは、システムの所望パラメーター、所望の限外濾過速度及び使用される
サンプルに適合するように使用者が容易に変更できる。
【００３６】
正の定常差圧として典型的には約５ｐｓｉから約８０ｐｓｉの範囲の圧力を使
用し得る。より高い圧力に耐える強度をもつ装置を用いるならばより高い圧力の
使用も可能であろう。より好ましくは、約４０ｐｓｉから約６０ｐｓｉの範囲の
圧力を使用し得る。正圧のレベルは、システムの所望パラメーター、所望の限外
濾過速度及び使用されるサンプルに適合するように使用者が容易に変更できる。
用し得る。より高い圧力に耐える強度をもつ装置を用いるならばより高い圧力の
使用も可能であろう。より好ましくは、約４０ｐｓｉから約６０ｐｓｉの範囲の
圧力を使用し得る。正圧のレベルは、システムの所望パラメーター、所望の限外
濾過速度及び使用されるサンプルに適合するように使用者が容易に変更できる。
【００３７】
濾過すべき出発流体の量は広範囲に変更できる。しかしながらこの方法は、適
当な水面の高さを形成し維持することが通常はできない少量の液体に対して特に
有用であることが知見された。このような量は一般に約１，０００マイクロリッ
トル未満、好ましくは約５００マイクロリットル未満であり、１マイクロリット
ル未満であってもよい。
当な水面の高さを形成し維持することが通常はできない少量の液体に対して特に
有用であることが知見された。このような量は一般に約１，０００マイクロリッ
トル未満、好ましくは約５００マイクロリットル未満であり、１マイクロリット
ル未満であってもよい。
【００３８】
方法の別の利点は、透析濾過（超純水または溶媒中で希釈を繰返すことによっ
て塩または汚染物質を減らし、次いで遠心濾過によって溶媒和した不純物及び塩
を除去する）の必要性が軽減または削除されることである。従ってこの方法は、
このような透析濾過段階に時間がかかりまた透析濾過段階が完全でないときには
得られる結果が歪められるような生物研究の分野で特に有利である。
て塩または汚染物質を減らし、次いで遠心濾過によって溶媒和した不純物及び塩
を除去する）の必要性が軽減または削除されることである。従ってこの方法は、
このような透析濾過段階に時間がかかりまた透析濾過段階が完全でないときには
得られる結果が歪められるような生物研究の分野で特に有利である。
【００３９】
一回の通過遠心法が生物サンプルから塩及びその他の不純物を完全には除去し
ないことは公知である。従って、標準的なプロトコルではこれらの不純物を十分
に除去するために超純水または溶媒中で不通過物を希釈し、得られた物質を１回
または複数回再遠心する。
ないことは公知である。従って、標準的なプロトコルではこれらの不純物を十分
に除去するために超純水または溶媒中で不通過物を希釈し、得られた物質を１回
または複数回再遠心する。
【００４０】
標準的な遠心では、膜上の液体量があるレベル以下になったとき、典型的には
１マイクロリットルよりも少ない量になったとき、液体が限外濾過でなく主とし
て蒸発という現象によって除去されることは知見されている。何故ならば、水面
の高さが小さいので残留液体に圧力が殆ど作用せず、従って濾過が殆ど生じない
からである。このため、不純物は透析濾過フィルターの表面で脱水されるだけで
ある。不通過物に復元用液体を加えると、これらの物質は復元用液体に容易に溶
解し、不通過物と共に残留する。このため複数の透析濾過段階が必要になる。
１マイクロリットルよりも少ない量になったとき、液体が限外濾過でなく主とし
て蒸発という現象によって除去されることは知見されている。何故ならば、水面
の高さが小さいので残留液体に圧力が殆ど作用せず、従って濾過が殆ど生じない
からである。このため、不純物は透析濾過フィルターの表面で脱水されるだけで
ある。不通過物に復元用液体を加えると、これらの物質は復元用液体に容易に溶
解し、不通過物と共に残留する。このため複数の透析濾過段階が必要になる。
【００４１】
定常差圧法を使用するときは、（濾過が水面の高さから独立して機能するので
）濾過はこれらの不純物を除去する主要手段という機能を維持しており、従って
不純物は膜を通過し、遠心によって達成できるよりもはるかに高度に不通過物か
ら除去される。本発明方法では１回の通過で本質的に全部の不純物が除去される
が、従来の遠心法では１回の通過で除去される量はしばしば不純物全量の９０％
未満である。従って本発明方法では、濾過後の透析濾過段階の必要性が軽減また
は削除され、以後に使用するためのより純粋な物質が得られる。
）濾過はこれらの不純物を除去する主要手段という機能を維持しており、従って
不純物は膜を通過し、遠心によって達成できるよりもはるかに高度に不通過物か
ら除去される。本発明方法では１回の通過で本質的に全部の不純物が除去される
が、従来の遠心法では１回の通過で除去される量はしばしば不純物全量の９０％
未満である。従って本発明方法では、濾過後の透析濾過段階の必要性が軽減また
は削除され、以後に使用するためのより純粋な物質が得られる。
【００４２】
上述のように、本発明方法は出発物質の容量が少ないときには遠心法よりも迅
速な処理が行われるので特に有用である。また、生物サンプルから不純物を除去
することを目的とするときにはもっと多い量の出発サンプルに対して使用でき、
遠心法よりも長い濾過時間を要するかもしれないが、透析濾過段階が殆ど不要で
あり、しかも、より純粋な不通過物が得られる。総処理時間（濾過と透析濾過）
が短縮されるので見掛け濾過時間の延長は障害にならない。
速な処理が行われるので特に有用である。また、生物サンプルから不純物を除去
することを目的とするときにはもっと多い量の出発サンプルに対して使用でき、
遠心法よりも長い濾過時間を要するかもしれないが、透析濾過段階が殆ど不要で
あり、しかも、より純粋な不通過物が得られる。総処理時間（濾過と透析濾過）
が短縮されるので見掛け濾過時間の延長は障害にならない。
【００４３】
精密濾過段階から得られた濾液は、プラスミド、その他の細胞成分及び細胞液
と、溶解段階または精密濾過段階で使用された溶解材料または水性流体とを含有
している。
と、溶解段階または精密濾過段階で使用された溶解材料または水性流体とを含有
している。
【００４４】
次に濾液を限外濾過で処理する。この処理では、（１つまたは複数の）限外濾
過膜の表面にプラスミドを残留させて濾液のその他の成分を実質的に完全に除去
する。プラスミドは後で使用するために限外濾過膜の表面で収集される。限外濾
過には遠心、正圧または負圧などのいかなる方法を使用してもよいが、好ましく
は正または負の定常差圧またはその双方の組合せを使用する。
過膜の表面にプラスミドを残留させて濾液のその他の成分を実質的に完全に除去
する。プラスミドは後で使用するために限外濾過膜の表面で収集される。限外濾
過には遠心、正圧または負圧などのいかなる方法を使用してもよいが、好ましく
は正または負の定常差圧またはその双方の組合せを使用する。
【００４５】
１つまたは複数の限外濾過膜を使用し得るが、典型的には１つの限外濾過膜で
十分である。
十分である。
【００４６】
（１つまたは複数の）限外濾過膜が有するべき排除限界分子量（排除限界分子
量よりも大きい物質は主として膜の上流に残留し、排除限界分子量よりも小さい
物質は膜を通過するか膜中に移行する）の表示値は、回収を所望するプラスミド
またはその他のＤＮＡのサイズ次第で、約３，０００ダルトンから約３００キロ
ダルトンの範囲でなければならない。
量よりも大きい物質は主として膜の上流に残留し、排除限界分子量よりも小さい
物質は膜を通過するか膜中に移行する）の表示値は、回収を所望するプラスミド
またはその他のＤＮＡのサイズ次第で、約３，０００ダルトンから約３００キロ
ダルトンの範囲でなければならない。
【００４７】
この方法に使用され得る限外濾過（ＵＦ）膜は、ポリスルホン、ポリエーテル
スルホン、ポリフェニルスルホン及びポリアリールスルホンのようなポリスルホ
ン類、ポリフッ化ビニリデン、並びに、ニトロセルロース及び再生セルロースの
ようなセルロース及びセルロース誘導体を非限定例とするグループから形成でき
る。これらの膜は典型的には、一般に高度な多孔質構造から形成される支持層を
有している。これらの支持層の典型的な材料は、紡糸接着（ｓｐｕｎ ｂｏｕｎ
ｄｅｄ）ポリエチレンまたはポリプロピレンのような種々の不織材料、紙または
ガラス、あるいは、膜自体と同じかまたは異なるポリマーから形成された微孔質
材料である。このような膜は当業界で公知であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのよう
な種々の供給業者から市販されている。
スルホン、ポリフェニルスルホン及びポリアリールスルホンのようなポリスルホ
ン類、ポリフッ化ビニリデン、並びに、ニトロセルロース及び再生セルロースの
ようなセルロース及びセルロース誘導体を非限定例とするグループから形成でき
る。これらの膜は典型的には、一般に高度な多孔質構造から形成される支持層を
有している。これらの支持層の典型的な材料は、紡糸接着（ｓｐｕｎ ｂｏｕｎ
ｄｅｄ）ポリエチレンまたはポリプロピレンのような種々の不織材料、紙または
ガラス、あるいは、膜自体と同じかまたは異なるポリマーから形成された微孔質
材料である。このような膜は当業界で公知であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのよう
な種々の供給業者から市販されている。
【００４８】
好ましいＵＦ膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから市販されているＹＭＴＭまたは
ＢｉｏｍａｘＴＭのような再生セルロース膜またはポリスルホン膜である。
ｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから市販されているＹＭＴＭまたは
ＢｉｏｍａｘＴＭのような再生セルロース膜またはポリスルホン膜である。
【００４９】
精密濾過膜及び限外濾過膜の双方は、１つの膜の形態で使用されてもよくまた
は同時に作動できる複数の膜の形態で使用されてもよい。例えば、単一の膜をＭ
ｉｌｌｉｐｏｒｅのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ Ｓｔｅｅｌ
Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｏｌｄｅｒ，Ｃａｔａｌｏｇ ＃ｘｘ３０ ０１２ ４０のよ
うなフィルターホルダーまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｉｃｒｏｃｏｎＲＴＭデ
バイスに保持し得る。複数の膜を含むデバイスは、複数のＭｉｃｒｏｃｏｎＲＴ
Ｍデバイス、または、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手できるＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥ
ＮＴＭプレートのようなマルチウェルプレートを使用する。マルチウェルプレー
トのウェル数には複数の種類があり、典型的には１プレートあたり９６ウェルま
たは３８４ウェルである。別のマルチウェル膜デバイスは１プレートあたり２ウ
ェルから１５３６以上のウェルを有するように設計され得る。単一デバイスまた
は多重デバイスの選択及び多重デバイス中の膜の数は用途及び回収すべきプラス
ミドの量に依存する。概して、必要量の総量はかなり少なく、ＭＩＣＲＯＣＯＮＲＴＭ デバイスのような小さい単一フィルターデバイスまたはＭＵＬＴＩＳＣＲ
ＥＥＮＲＴＭプレートのような９６ウェルもしくは３８４ウェルのマルチウェル
デバイスが好ましい。
は同時に作動できる複数の膜の形態で使用されてもよい。例えば、単一の膜をＭ
ｉｌｌｉｐｏｒｅのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ Ｓｔｅｅｌ
Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｏｌｄｅｒ，Ｃａｔａｌｏｇ ＃ｘｘ３０ ０１２ ４０のよ
うなフィルターホルダーまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｉｃｒｏｃｏｎＲＴＭデ
バイスに保持し得る。複数の膜を含むデバイスは、複数のＭｉｃｒｏｃｏｎＲＴ
Ｍデバイス、または、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手できるＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥ
ＮＴＭプレートのようなマルチウェルプレートを使用する。マルチウェルプレー
トのウェル数には複数の種類があり、典型的には１プレートあたり９６ウェルま
たは３８４ウェルである。別のマルチウェル膜デバイスは１プレートあたり２ウ
ェルから１５３６以上のウェルを有するように設計され得る。単一デバイスまた
は多重デバイスの選択及び多重デバイス中の膜の数は用途及び回収すべきプラス
ミドの量に依存する。概して、必要量の総量はかなり少なく、ＭＩＣＲＯＣＯＮＲＴＭ デバイスのような小さい単一フィルターデバイスまたはＭＵＬＴＩＳＣＲ
ＥＥＮＲＴＭプレートのような９６ウェルもしくは３８４ウェルのマルチウェル
デバイスが好ましい。
【００５０】
１つまたは複数の精密濾過膜及び１つまたは複数の限外濾過膜はフィルターの
深さ方向で対称または非対称の細孔形状（形態）を有し得る。対称という用語は
、細孔径が膜の一方の表面から他方の表面まで殆ど変化しないことを意味する。
非対称という用語は、細孔径が一方の側から他方の側まである程度変化すること
を意味する。非対称膜は多様な形態及び配置を有しているが、一般には、対称、
非対称、等方性部分と非対称部分との連続、膜の最も小さい細孔が構造の深部に
存在するような発散性非対称部分（diverging asymmetric portions）、最も小
さい細孔が１つの表面に存在し且つ２つの非対称層の境界近傍の細孔の寸法が隣
接する非対称層のいずれの細孔よりも小さい収束性非対称部分、から成るグルー
プから選択された形態を有している。製織（ｗｏｖｅｎ）形態または不織形態で
あるとき、膜は、広範囲の様々な細孔径を有することができ、対称または非対称
の定義で分類されない。膜はしばしば深部フィルター（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅ
ｒ）として分類される。
深さ方向で対称または非対称の細孔形状（形態）を有し得る。対称という用語は
、細孔径が膜の一方の表面から他方の表面まで殆ど変化しないことを意味する。
非対称という用語は、細孔径が一方の側から他方の側まである程度変化すること
を意味する。非対称膜は多様な形態及び配置を有しているが、一般には、対称、
非対称、等方性部分と非対称部分との連続、膜の最も小さい細孔が構造の深部に
存在するような発散性非対称部分（diverging asymmetric portions）、最も小
さい細孔が１つの表面に存在し且つ２つの非対称層の境界近傍の細孔の寸法が隣
接する非対称層のいずれの細孔よりも小さい収束性非対称部分、から成るグルー
プから選択された形態を有している。製織（ｗｏｖｅｎ）形態または不織形態で
あるとき、膜は、広範囲の様々な細孔径を有することができ、対称または非対称
の定義で分類されない。膜はしばしば深部フィルター（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅ
ｒ）として分類される。
【００５１】
図２は本発明の第二の好ましい方法を示す。この方法では、段階２０で図１の
方法の説明と同様にして細胞を破壊し、段階２１で１つまたは複数のＭＦ濾過膜
及び／または粗濾過膜で順次濾過し、次いで段階２２で１つまたは複数のＵＦ膜
で正の定常差圧によって濾過する。これらの膜が図５に示す後述のデバイスに配
置されているとき、正圧は（１つまたは複数の）ＭＦ濾過膜及び／または粗濾過
膜だけに加えられ、その圧力がＵＦ膜にも作用するであろう。あるいは、正圧が
各段階に個別に加えられてもよい。次いでＵＦ濾過段階２３の表面からプラスミ
ドを回収する。
方法の説明と同様にして細胞を破壊し、段階２１で１つまたは複数のＭＦ濾過膜
及び／または粗濾過膜で順次濾過し、次いで段階２２で１つまたは複数のＵＦ膜
で正の定常差圧によって濾過する。これらの膜が図５に示す後述のデバイスに配
置されているとき、正圧は（１つまたは複数の）ＭＦ濾過膜及び／または粗濾過
膜だけに加えられ、その圧力がＵＦ膜にも作用するであろう。あるいは、正圧が
各段階に個別に加えられてもよい。次いでＵＦ濾過段階２３の表面からプラスミ
ドを回収する。
【００５２】
方法の実施に適した圧力は、典型的には約０．１バールから約６．９バールの
範囲、好ましくは約０．１７バールから約０．８５バールの範囲である。２つの
濾過段階２１及び２２で圧力を個別に加える場合には、一方の段階で加える圧力
を他方の段階で加える圧力と同じにする必要はない。
範囲、好ましくは約０．１７バールから約０．８５バールの範囲である。２つの
濾過段階２１及び２２で圧力を個別に加える場合には、一方の段階で加える圧力
を他方の段階で加える圧力と同じにする必要はない。
【００５３】
図３は本発明方法の別の実施態様を示す。この実施態様で、細胞破壊段階３０
は図１の実施態様の細胞破壊段階に等しい。精密濾過段階３１及び限外濾過段階
３２はいずれも各膜の下流側に負の定常差圧（ＣＰＤ）を使用することによって
行う。しかしながら、図２の実施態様と違って、段階３１及び３２の各々に負圧
を個別に加えることが必要である。その理由は、現在入手可能なＵＦ膜の特性で
は、ＭＦ濾過膜及び／または粗濾過膜に力を供給するだけでＵＦ膜を十分に通過
できるような力を生じさせることができないからである。しかしながら、このよ
うな力を生じさせ得る特性をもつＵＦ膜が開発されれば、そのようなＵＦ膜を特
許請求の範囲に記載の本発明方法の範囲に包含することも本出願の目的である。
プラスミドまたはその他のＤＮＡは段階３３で回収される。
は図１の実施態様の細胞破壊段階に等しい。精密濾過段階３１及び限外濾過段階
３２はいずれも各膜の下流側に負の定常差圧（ＣＰＤ）を使用することによって
行う。しかしながら、図２の実施態様と違って、段階３１及び３２の各々に負圧
を個別に加えることが必要である。その理由は、現在入手可能なＵＦ膜の特性で
は、ＭＦ濾過膜及び／または粗濾過膜に力を供給するだけでＵＦ膜を十分に通過
できるような力を生じさせることができないからである。しかしながら、このよ
うな力を生じさせ得る特性をもつＵＦ膜が開発されれば、そのようなＵＦ膜を特
許請求の範囲に記載の本発明方法の範囲に包含することも本出願の目的である。
プラスミドまたはその他のＤＮＡは段階３３で回収される。
【００５４】
図４は本発明の別の好ましい方法を示す。この方法で、細胞破壊段階４０は図
１の実施態様の教示と同様に行われ、精密濾過段階４１は正圧によって行われ、
限外濾過段階４２は負の定常差圧によって行われる。次いでプラスミドまたはそ
の他のＤＮＡを段階４３で回収する。
１の実施態様の教示と同様に行われ、精密濾過段階４１は正圧によって行われ、
限外濾過段階４２は負の定常差圧によって行われる。次いでプラスミドまたはそ
の他のＤＮＡを段階４３で回収する。
【００５５】
図５は別の好ましい方法を示す。この方法で、細胞破壊５０は図１の実施態様
の教示と同様に行われ、精密濾過段階５１は負の定常差圧によって行われ、限外
濾過段階５２は正の定常差圧によって行われる。プラスミドまたはその他のＤＮ
Ａは段階５３で回収される。
の教示と同様に行われ、精密濾過段階５１は負の定常差圧によって行われ、限外
濾過段階５２は正の定常差圧によって行われる。プラスミドまたはその他のＤＮ
Ａは段階５３で回収される。
【００５６】
遠心のような別の処理駆動力を上記段階のいずれかに使用してもよい。
【００５７】
図６は図１〜５の処理を実施するための適当な装置を示す。この図で、第一プ
レート６０と第二プレート６１とは、プレート６０がプレート６１の上方に存在
しプレート６１に着脱自在にシールされるように配置されている。上段プレート
６０はカバー６２を有しており、圧縮空気のような圧力源（図示せず）から正の
定常差圧を加えるポート６３がカバー６２に接続されている。ポートは、ポート
６３に近接して図示されたバルブ６４などによって正の定常差圧源に対して選択
的に開閉される。しかしながら、バルブをカバーと差圧源との間の別の位置に配
置できること、または、圧力源とポートとの接続を変更または遮断する別の公知
手段を使用できることは理解されよう。
レート６０と第二プレート６１とは、プレート６０がプレート６１の上方に存在
しプレート６１に着脱自在にシールされるように配置されている。上段プレート
６０はカバー６２を有しており、圧縮空気のような圧力源（図示せず）から正の
定常差圧を加えるポート６３がカバー６２に接続されている。ポートは、ポート
６３に近接して図示されたバルブ６４などによって正の定常差圧源に対して選択
的に開閉される。しかしながら、バルブをカバーと差圧源との間の別の位置に配
置できること、または、圧力源とポートとの接続を変更または遮断する別の公知
手段を使用できることは理解されよう。
【００５８】
上段プレート６０は１つまたは複数の膜を含む。この実施例では、粗濾過膜及
び精密濾過膜または双方の組合せから選択された１つの膜６５が使用されている
。
び精密濾過膜または双方の組合せから選択された１つの膜６５が使用されている
。
【００５９】
下段プレート６１は１つまたは複数の限外濾過膜６６を含む。ゴムガスケット
６７がプレート間の着脱自在なシールを形成しているが、当業界で公知の別のシ
ール手段も使用できる。図では下段プレート６１に取り付けられているが、上段
プレート６０に取り付けられてもよくまたはプレート６０または６１の双方から
独立していてもよい。
６７がプレート間の着脱自在なシールを形成しているが、当業界で公知の別のシ
ール手段も使用できる。図では下段プレート６１に取り付けられているが、上段
プレート６０に取り付けられてもよくまたはプレート６０または６１の双方から
独立していてもよい。
【００６０】
下段プレートから濾液を捕獲する廃液受容器６８が下段プレートの下方に配置
されている。受容器はドレン（図示せず）に直結されてもよくまたは濾液を通過
させその後に個別に廃棄する単なる液溜めであってもよい。
されている。受容器はドレン（図示せず）に直結されてもよくまたは濾液を通過
させその後に個別に廃棄する単なる液溜めであってもよい。
【００６１】
また、所望ならば使用中に２つのプレートを相互保持するためのクランプ、ネ
ジまたはその他の保持素子を使用してもよい。
ジまたはその他の保持素子を使用してもよい。
【００６２】
図示のプレート６０及び６１の双方は単一ウェルをもつように設計されている
。これに代替して、各ウェルに１つの膜を備えた多数のウェルを有するプレート
も使用できることは理解されよう。８、１２、９６、３８４、１５３６個または
それ以上のウェルを有するプレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎなどのような供給業者から市販されており、公知である。
。これに代替して、各ウェルに１つの膜を備えた多数のウェルを有するプレート
も使用できることは理解されよう。８、１２、９６、３８４、１５３６個または
それ以上のウェルを有するプレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎなどのような供給業者から市販されており、公知である。
【００６３】
デバイスは以下のように使用される。対象とする細胞を上段プレート中で溶解
させるか、または、単独で溶解させてから上段プレートに移す。上段プレートは
ゴムガスケットなどを使用して下段プレートにシール的に接続されており、下段
プレートは液溜めまたはドレンに接続されている。カバーを取り付け、ポートを
圧縮空気源のような正の定常差圧源に接続する。液体成分及び微粒成分の全部が
上段プレートの膜を通過して下段プレートの膜の表面に到達するように圧力を作
用させる。次いで液体成分は同じこの圧力によってＵＦ膜を通過し、プラスミド
またはその他のＤＮＡはＵＦ膜の上面に残留する。圧力を遮断し、カバー及び上
段プレートを取り外して廃棄する。次に以後の処理及び分析を行うために、例え
ばプラスミドまたはその他のＤＮＡを再水和させ膜表面からピペットで吸い上げ
ることによって下段プレートの膜の上面からプラスミドまたはその他のＤＮＡを
回収する。
させるか、または、単独で溶解させてから上段プレートに移す。上段プレートは
ゴムガスケットなどを使用して下段プレートにシール的に接続されており、下段
プレートは液溜めまたはドレンに接続されている。カバーを取り付け、ポートを
圧縮空気源のような正の定常差圧源に接続する。液体成分及び微粒成分の全部が
上段プレートの膜を通過して下段プレートの膜の表面に到達するように圧力を作
用させる。次いで液体成分は同じこの圧力によってＵＦ膜を通過し、プラスミド
またはその他のＤＮＡはＵＦ膜の上面に残留する。圧力を遮断し、カバー及び上
段プレートを取り外して廃棄する。次に以後の処理及び分析を行うために、例え
ばプラスミドまたはその他のＤＮＡを再水和させ膜表面からピペットで吸い上げ
ることによって下段プレートの膜の上面からプラスミドまたはその他のＤＮＡを
回収する。
【００６４】
上記の構造は、定常差圧、遠心またはその他の処理に正圧を使用するときに有
効に作動する。負圧だけを使用する方法では該構造を使用できない。その理由は
、下段プレートのＵＦ膜及び上段プレートの双方に通過流を生じさせるために必
要な負圧力は余りにも大きいのでＵＦ膜が破壊されるからである。また、駆動力
を供給するポートが１つしかないので、正の圧力及び負の圧力を混用する方法で
も使用できない。
効に作動する。負圧だけを使用する方法では該構造を使用できない。その理由は
、下段プレートのＵＦ膜及び上段プレートの双方に通過流を生じさせるために必
要な負圧力は余りにも大きいのでＵＦ膜が破壊されるからである。また、駆動力
を供給するポートが１つしかないので、正の圧力及び負の圧力を混用する方法で
も使用できない。
【００６５】
図７は、双方の濾過段階で真空のような負の圧力を使用するかまたは一方の段
階で正の圧力及び他方の段階で負の圧力を混用するときに図１〜５の方法を実施
するのに適した第二の装置を示す。この図で、第一プレート８０及び第二プレー
ト８１は、プレート８０がプレート８１の上方に存在してプレート８１に着脱自
在にシールされるように配置されている。但し、着脱自在にシールされることは
必須ではない。上段プレート８０はカバー８２を有しており、圧縮空気または真
空のような供給源（図示せず）から定常差圧を作用させる第一ポート８３がカバ
ー８２に接続されている。第一ポート８３は該ポート８３に近接して図示された
バルブ８４などによって正の定常差圧源に選択的に開閉される。但し、バルブが
カバーと差圧源との間の別の位置に配置できること、または、差圧源とポートと
の接続を変更または遮断する別の公知手段を使用できることは理解されよう。
階で正の圧力及び他方の段階で負の圧力を混用するときに図１〜５の方法を実施
するのに適した第二の装置を示す。この図で、第一プレート８０及び第二プレー
ト８１は、プレート８０がプレート８１の上方に存在してプレート８１に着脱自
在にシールされるように配置されている。但し、着脱自在にシールされることは
必須ではない。上段プレート８０はカバー８２を有しており、圧縮空気または真
空のような供給源（図示せず）から定常差圧を作用させる第一ポート８３がカバ
ー８２に接続されている。第一ポート８３は該ポート８３に近接して図示された
バルブ８４などによって正の定常差圧源に選択的に開閉される。但し、バルブが
カバーと差圧源との間の別の位置に配置できること、または、差圧源とポートと
の接続を変更または遮断する別の公知手段を使用できることは理解されよう。
【００６６】
上段プレート８０は１つまたは複数の膜を含む。この実施例では上段プレート
８０は粗濾過膜及び精密濾過膜または両者の組合せから選択された１つの膜８５
を含む。
８０は粗濾過膜及び精密濾過膜または両者の組合せから選択された１つの膜８５
を含む。
【００６７】
下段プレート８１は１つまたは複数の限外濾過膜８６を含む。ゴムガスケット
８７がプレート間の着脱自在なシールを形成している。但し、当業界で公知の別
のシール手段も使用できる。図では下段プレート８１に取り付けられているが、
上段プレート８０に取り付けられてもよく、または、プレート８０もしくは８１
の双方から分離していてもよい。
８７がプレート間の着脱自在なシールを形成している。但し、当業界で公知の別
のシール手段も使用できる。図では下段プレート８１に取り付けられているが、
上段プレート８０に取り付けられてもよく、または、プレート８０もしくは８１
の双方から分離していてもよい。
【００６８】
下段プレートから濾液を捕獲する廃液受容器８８が下段プレートの下方に配置
されている。受容器はドレン（図示せず）に直結しているかまたは濾液を通過さ
せ、その後に分離して廃棄する単なる液溜めであってもよい。
されている。受容器はドレン（図示せず）に直結しているかまたは濾液を通過さ
せ、その後に分離して廃棄する単なる液溜めであってもよい。
【００６９】
第二ポート８９が下段プレート８１に接続されており、下段プレートに濾過駆
動力を供給するために使用される。第二ポート８９は、ポート８９に近接して図
示されたバルブ９０などによって正の定常差圧源に選択的に開閉される。但し、
バルブがカバーと差圧源との間の別の位置に配置できること、または、差圧源と
ポート８９との接続を変更または遮断する別の公知手段を使用できることは理解
されよう。
動力を供給するために使用される。第二ポート８９は、ポート８９に近接して図
示されたバルブ９０などによって正の定常差圧源に選択的に開閉される。但し、
バルブがカバーと差圧源との間の別の位置に配置できること、または、差圧源と
ポート８９との接続を変更または遮断する別の公知手段を使用できることは理解
されよう。
【００７０】
２つのポートは同じ力または異なる力（例えば双方が正、または双方が負、ま
たは一方が正で他方が負）によって同時に使用されてもよくまたは順次に（第一
ポートの次に第二ポートの順で）使用されてもよい。
たは一方が正で他方が負）によって同時に使用されてもよくまたは順次に（第一
ポートの次に第二ポートの順で）使用されてもよい。
【００７１】
また、所望ならば使用中の２つのプレートを相互保持するためのクランプ、ネ
ジまたはその他の保持素子を使用してもよい。
ジまたはその他の保持素子を使用してもよい。
【００７２】
図示のプレート８０及び８１の双方は単一ウェルをもつように設計されている
。これに代替して、各ウェルに１つの膜を備えた多数ウェルを有するプレートも
使用できることは理解されよう。８、１２、９６、３８４、１５３６個またはそ
れ以上のウェルを有するプレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎなどのような供給業者から市販されており、公知である。
。これに代替して、各ウェルに１つの膜を備えた多数ウェルを有するプレートも
使用できることは理解されよう。８、１２、９６、３８４、１５３６個またはそ
れ以上のウェルを有するプレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎなどのような供給業者から市販されており、公知である。
【００７３】
デバイスは以下のように使用される。対象とする細胞を上段プレート中で溶解
させるか、または、単独に溶解させてから上段プレートに注入する。上段プレー
トはゴムガスケットなどを使用して既に下段プレートにシール的に接続されてお
り、下段プレートは液溜めまたはドレンに接続されている。カバーを取り付け、
ポートを圧縮空気源または真空のような正または負の定常差圧源に接続する。液
体成分及び微粒成分の全部が上段プレートの膜を通過して下段プレートのＵＦ膜
の表面に到達するように圧力を作用させる。次いで液体成分は第二ポートから送
出された濾過駆動力によってＵＦ膜を通過するが、駆動力は上段プレートで使用
された力と同じ種類の力（例えば双方が負の定常差圧であるかまたは双方が正の
定常差圧である）であるか、または、異なる種類の力（例えば、一方が負の定常
差圧であり他方が正の定常差圧である）であろう。力が最初に上段プレートに加
えられ次いで下段プレートに加えられるか（順次的）、または、力が同時に加え
られる（同時的）。プラスミドまたはその他のＤＮＡはＵＦ膜の上面に残留する
。駆動力または駆動圧力を、順次処理のときは下段プレートから遮断し、同時処
理のときは双方のプレートから遮断し、カバーと上段プレートとを取り外して廃
棄する。次に以後の処理及び分析を行うために、例えばプラスミドまたはその他
のＤＮＡを再水和させ膜表面からピペットで吸い上げることによって下段プレー
トの膜の上面からプラスミドまたはその他のＤＮＡを回収する。
させるか、または、単独に溶解させてから上段プレートに注入する。上段プレー
トはゴムガスケットなどを使用して既に下段プレートにシール的に接続されてお
り、下段プレートは液溜めまたはドレンに接続されている。カバーを取り付け、
ポートを圧縮空気源または真空のような正または負の定常差圧源に接続する。液
体成分及び微粒成分の全部が上段プレートの膜を通過して下段プレートのＵＦ膜
の表面に到達するように圧力を作用させる。次いで液体成分は第二ポートから送
出された濾過駆動力によってＵＦ膜を通過するが、駆動力は上段プレートで使用
された力と同じ種類の力（例えば双方が負の定常差圧であるかまたは双方が正の
定常差圧である）であるか、または、異なる種類の力（例えば、一方が負の定常
差圧であり他方が正の定常差圧である）であろう。力が最初に上段プレートに加
えられ次いで下段プレートに加えられるか（順次的）、または、力が同時に加え
られる（同時的）。プラスミドまたはその他のＤＮＡはＵＦ膜の上面に残留する
。駆動力または駆動圧力を、順次処理のときは下段プレートから遮断し、同時処
理のときは双方のプレートから遮断し、カバーと上段プレートとを取り外して廃
棄する。次に以後の処理及び分析を行うために、例えばプラスミドまたはその他
のＤＮＡを再水和させ膜表面からピペットで吸い上げることによって下段プレー
トの膜の上面からプラスミドまたはその他のＤＮＡを回収する。
【００７４】
実施例１
定常差圧法
ｐＵＣ１９を含んでいる大腸菌ＪＭ１０９を無菌の９６ディープウェルブロッ
ク（２ｍｌ容量）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃ
Ａ）中の適当な抗生物質を加えた２×ＬＢの１ミリリットルのアリコートに接種
した。プレートをカバーで覆い、インキュベーターに固定した。これらを３７℃
、３２０ｒ．ｐ．ｍ．で２０時間インキュベートした。
ク（２ｍｌ容量）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃ
Ａ）中の適当な抗生物質を加えた２×ＬＢの１ミリリットルのアリコートに接種
した。プレートをカバーで覆い、インキュベーターに固定した。これらを３７℃
、３２０ｒ．ｐ．ｍ．で２０時間インキュベートした。
【００７５】
ディープウェルブロック培養物を透明なプレートテープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
：ＭＡＴＡ０９６００）で覆い、１５００×ｇで５分間遠心した。遠心後、培養
上清を適当な処理用容器に直ちに傾瀉した。プレートを転倒させ、作業台に載せ
た数枚重ねの紙タオルの上でしっかりと叩いて、残留培養上清を除去した。
：ＭＡＴＡ０９６００）で覆い、１５００×ｇで５分間遠心した。遠心後、培養
上清を適当な処理用容器に直ちに傾瀉した。プレートを転倒させ、作業台に載せ
た数枚重ねの紙タオルの上でしっかりと叩いて、残留培養上清を除去した。
【００７６】
ペレットを８０μｌの溶液Ｉ（３０ｍＭのグルコース；１５ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ８；３０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ；６０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼ
Ａ、いずれもＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏから入手可能）に再懸濁させ
た。次に、溶液ＩＩ（０．２ＮのＮａＯＨ；１％のＳＤＳ、Ｓｉｇｍａから入手
可能）を加えて直ちにプレートシェーカーで１分間激しく（最大速度）混合して
、細胞を溶解させた。このミックスを室温で更に２分間インキュベートした。８
０μｌの溶液ＩＩＩ（３．６Ｍのカリウム；６Ｍの酢酸塩，ｐＨ５以下、Ｓｉｇ
ｍａから入手可能）を加えて直ちにプレートシェーカーで２分間激しく（最大速
度）混合して、細胞を溶解させた。
Ｃｌ，ｐＨ８；３０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ；６０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼ
Ａ、いずれもＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏから入手可能）に再懸濁させ
た。次に、溶液ＩＩ（０．２ＮのＮａＯＨ；１％のＳＤＳ、Ｓｉｇｍａから入手
可能）を加えて直ちにプレートシェーカーで１分間激しく（最大速度）混合して
、細胞を溶解させた。このミックスを室温で更に２分間インキュベートした。８
０μｌの溶液ＩＩＩ（３．６Ｍのカリウム；６Ｍの酢酸塩，ｐＨ５以下、Ｓｉｇ
ｍａから入手可能）を加えて直ちにプレートシェーカーで２分間激しく（最大速
度）混合して、細胞を溶解させた。
【００７７】
ＵＦプレートを真空マニホルド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＡＶＭ０９６ＯＲま
たは等価のデバイス）の底部に配置した。ディープウェルの側面に沿ってピペッ
トの先端を溶解液中に下ろして底部に到達させることによって溶解液を取り出し
た。流体中でピペットで３回上下させた。各ディープウェルの底部から１８０μ
ｌの溶解液を取り出して、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＴＭ−ＮＡ溶解液清澄化プレ
ート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＡＮＡＮＬＹ５０）の対応ウェルに吐出した。
たは等価のデバイス）の底部に配置した。ディープウェルの側面に沿ってピペッ
トの先端を溶解液中に下ろして底部に到達させることによって溶解液を取り出し
た。流体中でピペットで３回上下させた。各ディープウェルの底部から１８０μ
ｌの溶解液を取り出して、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＴＭ−ＮＡ溶解液清澄化プレ
ート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＡＮＡＮＬＹ５０）の対応ウェルに吐出した。
【００７８】
同じウェルにピペットを２回目に導入し、残留溶解液をディープウェルプレー
トから取り出し、溶解液清澄化プレートの対応ウェルに移した。プレートをマニ
ホルドの頂部に載せ、真空を８インチＨｇ（０．２７バール−２０３トル）に調
整した。真空を３分間作用させ、溶解液をプレートからＵＦプレートに引き出し
た。第一プレートを廃棄した。
トから取り出し、溶解液清澄化プレートの対応ウェルに移した。プレートをマニ
ホルドの頂部に載せ、真空を８インチＨｇ（０．２７バール−２０３トル）に調
整した。真空を３分間作用させ、溶解液をプレートからＵＦプレートに引き出し
た。第一プレートを廃棄した。
【００７９】
ＵＦプレートをマニホルドに内部から取り出して空のマニホルドの頂部に載せ
、完全真空（２４インチＨｇ）を８分間作用させた。濾液は廃棄物行きにした。
、完全真空（２４インチＨｇ）を８分間作用させた。濾液は廃棄物行きにした。
【００８０】
プレートの各ウェルに２００μｌのＭｉｌｌｉＱＲＴＭを添加した。完全真空
を４分間作用させ、濾液は廃棄物行きにした。プラスミドを溶解するために、Ｕ
Ｆプレートの各ウェルに５０μｌのＴＥバッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，
ｐＨ８；１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａから入手可能）を添加した。プラ
スミドを回収するために、液体ハンドラーでピペットで１０回上下させることに
よって再懸濁させ、ｖ形底部をもつマイクロプレートに移した。
を４分間作用させ、濾液は廃棄物行きにした。プラスミドを溶解するために、Ｕ
Ｆプレートの各ウェルに５０μｌのＴＥバッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，
ｐＨ８；１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａから入手可能）を添加した。プラ
スミドを回収するために、液体ハンドラーでピペットで１０回上下させることに
よって再懸濁させ、ｖ形底部をもつマイクロプレートに移した。
【００８１】
プラスミドまたはその他のＤＮＡの相対収率を蛍光測定アッセイによって定量
した。配列決定の相対品質をＥＴ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＭｅｇａＢ
ＡＣＥＲＴＭ１０００配列決定システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上の毛管電気泳動を順次行うことによって決定した。
した。配列決定の相対品質をＥＴ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＭｅｇａＢ
ＡＣＥＲＴＭ１０００配列決定システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上の毛管電気泳動を順次行うことによって決定した。
【００８２】
実施例２
ｐＵＣ１９を含んでいる大腸菌ＪＭ１０９を無菌の９６ディープウェルブロッ
ク（２ｍｌ容量）中の適当な抗生物質を加えた２×ＬＢの１ミリリットルのアリ
コートに接種した。プレートをカバーで覆い、インキュベーターに固定し、３７
℃、３２０ｒ．ｐ．ｍ．で２０時間インキュベートした。
ク（２ｍｌ容量）中の適当な抗生物質を加えた２×ＬＢの１ミリリットルのアリ
コートに接種した。プレートをカバーで覆い、インキュベーターに固定し、３７
℃、３２０ｒ．ｐ．ｍ．で２０時間インキュベートした。
【００８３】
ディープウェルブロック培養物を透明なプレートテープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
：ＭＡＴＡ０９６００）で覆い、１５００×ｇで５分間遠心した。遠心後、培養
上清を適当な処理用容器に直ちに傾瀉した。プレートを転倒させ、作業台に載せ
た数枚重ねの紙タオルの上でしっかりと叩いて、残留培養上清を除去した。
：ＭＡＴＡ０９６００）で覆い、１５００×ｇで５分間遠心した。遠心後、培養
上清を適当な処理用容器に直ちに傾瀉した。プレートを転倒させ、作業台に載せ
た数枚重ねの紙タオルの上でしっかりと叩いて、残留培養上清を除去した。
【００８４】
ペレットを８０μｌの溶液Ｉに先ずプレートシェーカーまたは渦流を使用し次
いでピペットで撹拌することによって再懸濁させた。８０μｌの溶液ＩＩを加え
て直ちにプレートシェーカーで１分間激しく（最大速度）混合した。次に室温で
更に２分間インキュベートした。８０μｌの溶液ＩＩＩを加えて直ちにプレート
シェーカーで２分間激しく（最大速度）混合した。
いでピペットで撹拌することによって再懸濁させた。８０μｌの溶液ＩＩを加え
て直ちにプレートシェーカーで１分間激しく（最大速度）混合した。次に室温で
更に２分間インキュベートした。８０μｌの溶液ＩＩＩを加えて直ちにプレート
シェーカーで２分間激しく（最大速度）混合した。
【００８５】
別個に、１５０μｌの結合溶液をＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＴＭプレート（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＡＦＢ Ｎ０Ｂ ５０）の各ウェルに加えた。ＦＢプレート
を真空マニホルド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＭＡＶＭ ０９６ ０Ｒまたは等価デ
バイス）の底部に配置した。
ｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＡＦＢ Ｎ０Ｂ ５０）の各ウェルに加えた。ＦＢプレート
を真空マニホルド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＭＡＶＭ ０９６ ０Ｒまたは等価デ
バイス）の底部に配置した。
【００８６】
溶解液を除去するために、ディープウェルの側面に沿ってピペットの先端を溶
解液中に下ろして底部に到達させピペットを３回上下させた。各ディープウェル
の底部から１８０μｌの溶解液を取り出して、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＴＭ−Ｎ
Ａ溶解液清澄化プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＡＮＡＮＬＹ５０）の対応ウ
ェルに吐出した。
解液中に下ろして底部に到達させピペットを３回上下させた。各ディープウェル
の底部から１８０μｌの溶解液を取り出して、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＴＭ−Ｎ
Ａ溶解液清澄化プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＡＮＡＮＬＹ５０）の対応ウ
ェルに吐出した。
【００８７】
ＮＡプレートをマニホルドの頂部に載せ、真空を８インチＨｇ（０．２７バー
ル−２０３トル）に調整した。真空を３分間作用させ、溶解液をＮＡプレートか
ら結合溶液を予め充填したＵＦプレートに引き出した。ＮＡプレートを廃棄した
。
ル−２０３トル）に調整した。真空を３分間作用させ、溶解液をＮＡプレートか
ら結合溶液を予め充填したＵＦプレートに引き出した。ＮＡプレートを廃棄した
。
【００８８】
ＦＢプレートをマニホルドの内部から取り出して空のマニホルドの頂部に載せ
、ピペットを数回上下させることによって清澄化溶解液を結合溶液と十分に混合
させた。ＦＢプレートを再度、空のマニホルドの頂部に載せ、完全真空を１分間
作用させた。濾液は廃棄物行きにした。この時点でプラスミドＤＮＡはＦＢブレ
ートに結合した。
、ピペットを数回上下させることによって清澄化溶解液を結合溶液と十分に混合
させた。ＦＢプレートを再度、空のマニホルドの頂部に載せ、完全真空を１分間
作用させた。濾液は廃棄物行きにした。この時点でプラスミドＤＮＡはＦＢブレ
ートに結合した。
【００８９】
ＦＢプレートの各ウェルに２００μｌの８０％エタノール（試薬銘柄）を添加
し、完全真空を１分間作用させた。濾液は廃棄物行きにした。真空を３分間作用
させながらこの段階を繰り返した。
し、完全真空を１分間作用させた。濾液は廃棄物行きにした。真空を３分間作用
させながらこの段階を繰り返した。
【００９０】
ＦＢプレートをマニホルドから取り外した。綿屑のでない清潔な吸収材でプレ
ートの底部を清拭した。ＦＢプレートを遠心機位置合せフレームの付いた標準マ
イクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＡＣＦ０９６０４）の頂部に
載せ、１０００×ｇで１０分間遠心して乾燥させた。プラスミドを溶解するため
に、ＦＢプレートの各ウェルに７０μｌのＴＥバッファを添加した。ＴＥは各ウ
ェルの中央の近傍に送出した。１０００×ｇで５分間遠心することによってプラ
スミドを溶出させた（溶出液量は典型的には４５μｌである）。
ートの底部を清拭した。ＦＢプレートを遠心機位置合せフレームの付いた標準マ
イクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＡＣＦ０９６０４）の頂部に
載せ、１０００×ｇで１０分間遠心して乾燥させた。プラスミドを溶解するため
に、ＦＢプレートの各ウェルに７０μｌのＴＥバッファを添加した。ＴＥは各ウ
ェルの中央の近傍に送出した。１０００×ｇで５分間遠心することによってプラ
スミドを溶出させた（溶出液量は典型的には４５μｌである）。
【００９１】
結果：
実施例１ 実施例２
プラスミドの相対収率 ２× １×
配列決定の相対結果 同等 同等
全処理時間 ３３分 ５０分
【００９２】
本発明は従来技術を凌駕する多くの利点を有している。第一に、プラスミドま
たはその他のＤＮＡの回収に必要な処理段階の数が削減され処理時間が短縮され
る。第二に、エタノールのような汚染物質を導入しないで処理できる。加えて、
プラスミドまたはその他のＤＮＡを従来技術よりも実質的に大量に、典型的には
平均で２０％から３０％の増量で回収できる。更に、ＵＦ段階で定常差圧を駆動
力として使用するとき、回収されたプラスミドは従来の方法で得られたプラスミ
ドよりも純粋であり、しばしば塩またはその他の不純物を全く含有せず、従って
、複数の透析濾過段階が不要である。限外濾過プレートの頂部からプラスミド及
びその他のＤＮＡを回収すること及び遠心が削除されることによって本発明方法
は全自動化に好適である。最後に、ガラス繊維上に形成される活性部位の量によ
って限定された容量をもつ従来の結合／溶出方法と違って、本発明は本質的に無
限の容量を有しており、フェムトグラムからミリグラムの範囲の量のプラスミド
またはその他のＤＮＡを回収するようにシールできる。
たはその他のＤＮＡの回収に必要な処理段階の数が削減され処理時間が短縮され
る。第二に、エタノールのような汚染物質を導入しないで処理できる。加えて、
プラスミドまたはその他のＤＮＡを従来技術よりも実質的に大量に、典型的には
平均で２０％から３０％の増量で回収できる。更に、ＵＦ段階で定常差圧を駆動
力として使用するとき、回収されたプラスミドは従来の方法で得られたプラスミ
ドよりも純粋であり、しばしば塩またはその他の不純物を全く含有せず、従って
、複数の透析濾過段階が不要である。限外濾過プレートの頂部からプラスミド及
びその他のＤＮＡを回収すること及び遠心が削除されることによって本発明方法
は全自動化に好適である。最後に、ガラス繊維上に形成される活性部位の量によ
って限定された容量をもつ従来の結合／溶出方法と違って、本発明は本質的に無
限の容量を有しており、フェムトグラムからミリグラムの範囲の量のプラスミド
またはその他のＤＮＡを回収するようにシールできる。
【図１】
本発明の第一の好ましい方法のブロック図である。
【図２】
本発明の第二の好ましい方法のブロック図である。
【図３】
本発明の第三の方法のブロック図である。
【図４】
本発明の第四の方法のブロック図である。
【図５】
本発明の１つの方法のブロック図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１１月２０日（２００２．１１．２０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図６】
本発明方法を実施する１つの装置の断面図である。
【図７】
本発明方法を実施する第二の装置の断面図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図６】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図７】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１２月１７日（２００２．１２．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
【手続補正書】
【提出日】平成１５年３月１１日（２００３．３．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図６】
本発明方法を実施する１つの装置の断面図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図７
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図７】
本発明方法を実施する第二の装置の断面図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図６】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図７】
Claims (24)
- 【請求項１】 （ａ）細胞壁を破壊して、プラスミドまたはその他のＤＮＡ
を含む細胞成分を遊離させる段階と、（ｂ）精密濾過膜、粗濾過膜及びその組合
せから成るグループから選択された１つまたは複数の膜で細胞成分を濾過し、濾
液を収集する段階と、（ｃ）１つまたは複数の限外濾過膜で（ｂ）の濾液を濾過
して、１つまたは複数の限外濾過膜の上面にプラスミドまたはその他のＤＮＡを
不通過物として残留させる段階と、（ｄ）限外濾過膜の上面からプラスミドまた
はその他のＤＮＡを回収する段階と、から成るプラスミドまたはその他のＤＮＡ
の回収方法。 - 【請求項２】 細胞壁をアルカリ溶解プロセスによって破壊し、約０．１ミ
クロンから約５０ミクロンの範囲の表示細孔径をもつ１つまたは複数の膜で濾過
すること、及び、１つまたは複数の限外濾過膜が表示値で約３，０００ダルトン
から約３００キロダルトンの範囲の排除限界分子量を有していることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 濾過段階（ｂ）及び（ｃ）を、遠心、定常差圧及びその組合
せから成るグループから選択された処理によって行うことを特徴とする請求項１
に記載の方法。 - 【請求項４】 段階（ｂ）及び（ｃ）を、正の定常差圧によって行うことを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 段階（ｂ）及び（ｃ）を、負の定常差圧によって行うことを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 段階（ｂ）が遠心及び正の定常差圧から成るグループから選
択された処理によって行われ、段階（ｃ）が負の定常差圧によって行われること
を特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 １つまたは複数の精密濾過膜が、天然または合成のポリマー
、セラミックス及び金属から成るグループから選択された材料から形成され、（
１つまたは複数の）限外濾過膜がポリスルホン類、ポリエーテルスルホン類、ポ
リフェニルスルホン類、ポリアリールスルホン類、ポリフッ化ビニリデン、セル
ロース及びセルロース誘導体から成るグループから選択された材料から形成され
ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 １つまたは複数の精密濾過膜及び１つまたは複数の限外濾過
膜が有している細孔の形態が、一方の表面から他方の表面に向かって、対称、非
対称、等方性部分と非対称部分との連続、膜の最も小さい細孔が膜構造の深部に
存在するような発散性非対称部分、最も小さい細孔が１つの表面に存在し且つ２
つの非対称層の境界近傍の細孔の寸法が隣接する非対称層のいずれの細孔よりも
小さい収束性非対称部分、から成るグループから選択されることを特徴とする請
求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 濾過段階（ｂ）及び（ｃ）が正の定常差圧を使用することを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 濾過段階（ｂ）が正の定常差圧を使用し、段階（ｃ）が負
の定常差圧を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 濾過段階（ｂ）が負の定常差圧を使用し、段階（ｃ）が正
の定常差圧を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 濾過段階（ｂ）及び（ｃ）が負の定常差圧を使用すること
を特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 濾過段階（ｂ）及び（ｃ）が順次に行われることを特徴と
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 濾過段階（ｂ）及び（ｃ）が同時に行われることを特徴と
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 精密濾過膜及び粗濾過膜から成るグループから選択される
１つまたは複数の膜を有する上段フィルターと１つまたは複数の限外濾過膜を有
する下段フィルターとを含み、上段フィルターが下段フィルターの上方に下段フ
ィルターに近接して配置されており、更に、上段フィルター及び下段フィルター
に濾過を実行させる駆動力を供給する１つまたは複数の手段を含むプラスミド回
収装置。 - 【請求項１６】 フィルターが互いに液密的にシールされていることを特徴
とする請求項１５に記載の装置。 - 【請求項１７】 駆動力を供給する１つまたは複数の手段が定常差圧である
ことを特徴とする請求項１５に記載の装置。 - 【請求項１８】 駆動力を供給する１つまたは複数の手段が正の圧力である
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１９】 駆動力を供給する１つまたは複数の手段が負の圧力である
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２０】 駆動力を供給する１つまたは複数の手段が正の定常差圧で
あることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２１】 駆動力を供給する１つまたは複数の手段が負の定常差圧で
あることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２２】 駆動力を供給する１つまたは複数の手段が上段フィルター
に加えられた正の力及び下段フィルターに加えられた負の力であることを特徴と
する請求項１５に記載の装置。 - 【請求項２３】 駆動力を供給する１つまたは複数の手段が上段フィルター
次いで下段フィルターに順次に作用することを特徴とする請求項１５に記載の装
置。 - 【請求項２４】 駆動力を供給する１つまたは複数の手段が上段フィルター
及び下段フィルターに同時に作用することを特徴とする請求項１５に記載の装置
。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| PCT/US2001/010316 WO2001079486A2 (en) | 2000-04-13 | 2001-03-29 | Method and apparatus for plasmid recovery involving ultrafiltration |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=22727950
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2001
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-
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