WO2019163781A1 - エンテロウイルスワクチン - Google Patents

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WO2019163781A1
WO2019163781A1 PCT/JP2019/006116 JP2019006116W WO2019163781A1 WO 2019163781 A1 WO2019163781 A1 WO 2019163781A1 JP 2019006116 W JP2019006116 W JP 2019006116W WO 2019163781 A1 WO2019163781 A1 WO 2019163781A1
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WO
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enterovirus
polypeptide
present
coxsackievirus
protease
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PCT/JP2019/006116
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English (en)
French (fr)
Inventor
朋史 中村
落合　晋
智 小池
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一般財団法人阪大微生物病研究会
公益財団法人東京都医学総合研究所
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine against enterovirus.
  • Enteroviruses are single-stranded RNA viruses belonging to the Picornaviridae family, and examples of infecting humans include the group of enteroviruses AD.
  • Enteroviruses include poliovirus, coxsackievirus group A, coxsackievirus group B, echoviruses and other enteroviruses.
  • Group A enteroviruses include Coxsackieviruses A2-8, 10, 12, 14, 16 and enterovirus 71 (hereinafter EV71).
  • Enterovirus B group includes Coxsackievirus A9, Coxsackievirus B1-6, Echovirus 1-33, and Enterovirus 69.
  • Enterovirus C group includes poliovirus, Coxsackievirus A1, 11, 13, 15, 17-22 and 24.
  • Enterovirus group D includes enteroviruses 68 and 70. It is well known that enterovirus causes various diseases, and typical examples of such diseases include hand-foot-mouth disease, herpangina, aseptic meningitis and the like. Among enteroviruses, EV71 and Coxsackievirus A group are known as the main causative viruses of hand, foot and mouth disease. Among enteroviruses, Coxsackievirus group A, EV71, Coxsackievirus group B and echovirus are known as the main causative viruses of herpangina. Aseptic meningitis is caused by a wide range of pathogens such as Echovirus, Coxsackievirus Group A, Group B and Enteroviruses such as EV71, as well as parasites.
  • pathogens such as Echovirus, Coxsackievirus Group A, Group B and Enteroviruses such as EV71, as well as parasites.
  • Coxsackievirus group A includes, for example, types A1 to 22 and type 24, which can cause different diseases and symptoms.
  • Coxsackievirus group B includes, for example, types 1-6.
  • Echo viruses include Echo types 1-7, 9, 11-27, and 29-31.
  • Other enteroviruses include enterovirus types 68-71.
  • Each genotype further includes a sub-genotype.
  • EV71 is known to be A type, B1 to B5 type, and C1 to C5 type consisting of only BrCr which is a prototype strain.
  • Hand-foot-mouth disease is generally known as a mild disease in which blistering rash appears on the hands, feet, mouth, etc., and children often develop around summer.
  • the main routes of infection for hand-foot-and-mouth disease are droplet infection and fecal mouth infection.
  • a large-scale epidemic of hand-foot-and-mouth disease has been reported mainly in East Asia. For example, about 2 million people have been reported in China in 2016 and about 500,000 cases in Japan in 2015.
  • Most patients with hand, foot, and mouth disease have a good prognosis, but rarely develop central nervous system complications such as aseptic meningitis, acute encephalitis, or pulmonary edema, and become severe or die. Such complications are often caused by hand-foot-and-mouth disease caused by EV71.
  • hand-foot-and-mouth disease of adults as well as children has been reported, and in adults, it often becomes severe.
  • a treatment method for hand-foot-and-mouth disease has not yet been established, and prevention by vaccine is being investigated or implemented mainly in East Asian countries.
  • Japan the hand-foot-and-mouth disease epidemic is regarded as a public health problem, and a vaccine effective in preventing and preventing its transmission is designated as one of the vaccines with high development priority by the Council of Health and Welfare.
  • Herpangina is generally known as acute viral pharyngitis characterized by fever and a blistering rash appearing on the oral mucosa, and is often prevalent in summer, especially in infants.
  • the main infection routes of herpangina are droplet infection and fecal infection.
  • a treatment method for herpangina has not yet been established, and prevention by a vaccine or the like is expected.
  • Aseptic meningitis has three main signs of fever, headache, and vomiting, and there are signs of meningeal irritation such as posterior stiffness and Kernig's sign. It is a syndrome that is diagnosed by not detecting bacteria by liquid smearing or bacterial culture. Although it is known that aseptic meningitis is caused by various viruses other than enteroviruses, the main causes are enteroviruses, particularly echoviruses and coxsackieviruses. The route of infection and epidemiological properties depend on the pathogen, but in the case of aseptic meningitis caused by enterovirus, as in hand-foot-and-mouth disease, it is caused by droplet infection and faecal infection mainly in children. It is prevalent. An effective treatment method for aseptic meningitis has not yet been established, and prevention by a vaccine or the like is expected.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 report vaccines in which enteroviruses are inactivated with formalin.
  • Patent Document 1 reports a VLP containing enteroviruses VP0 to VP4.
  • Patent Document 2 reports an enterovirus particle and a method for producing the same.
  • Patent Document 3 reports a method for producing VLPs of various viruses including enteroviruses.
  • Non-Patent Document 3 reports the immunogenicity of EV71 F particles.
  • Non-Patent Document 4 reports cross-ability between EV71 genotypes and subgenotypes after EV71 inactivated vaccine administration.
  • Non-Patent Document 5 reports a VLP containing EV71 VP1 to 3 as a vaccine against EV71.
  • Sliveva Inlive is cited as a vaccine against EV71 that has already been put into practical use.
  • EV71 has a structure in which a single-stranded RNA of about 7.4 kb is encapsulated inside a viral capsid having a diameter of 20 to 30 nm, and the capsid has 60 copies of four different structural proteins (VP1 to 4). Consists of. Four structural proteins assemble to form a protomer, five protomers assemble to form a pentamer, and twelve pentamers and the viral genome constitute a mature virion.
  • the subgenotype of EV71 is mainly defined by mutations in VP1 (Non-patent Document 6).
  • the present invention relates to a vaccine against enterovirus.
  • the present invention relates to a polypeptide showing immunogenicity against enterovirus, a method for producing the polypeptide, a vaccine against enterovirus containing the polypeptide, and a method for preventing enterovirus-related diseases using the polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus.
  • Vaccine effectiveness is generally assessed by immunogenicity.
  • enteroviruses such as hand-foot-and-mouth disease
  • vaccines showing higher immunogenicity against enteroviruses are required.
  • it is more desirable that a high infection prevention effect is shown in animal experiments using a mouse model or the like.
  • the present inventors have manufactured a vaccine having high immunogenicity against enteroviruses. Specifically, focusing on the structure of the enterovirus, particularly that VP0 cleaves into VP2 and VP4, the present inventors have found that the cleaving affects immunogenicity. That is, it was considered that designing a vaccine containing a large amount of VP2 and VP4 as a polypeptide exhibiting immunogenicity leads to the provision of a vaccine exhibiting high immunogenicity. A polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus was produced, and it was confirmed that this polypeptide had a high effect as an immunogen against enterovirus, and the present invention was made.
  • the present invention provides a polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence recognized by a protease at the binding site of VP2 and VP4.
  • a peptide is provided.
  • the enterovirus includes poliovirus, coxsackievirus group A, coxsackievirus group B, echo virus and other enteroviruses.
  • the subject is a group A to group D enterovirus, particularly group A enterovirus.
  • the present invention is particularly directed to viruses that are responsible for enterovirus-related diseases such as hand-foot-and-mouth disease, herpangina, and aseptic meningitis, such as coxsackievirus group A, coxsackievirus group B, echovirus and group A enteroviruses. More specifically, the present invention relates to enteroviruses that cause hand-foot-and-mouth disease, such as group A enteroviruses, in particular EV71, especially Coxsackieviruses A6, 10 and 16.
  • the invention further relates to enteroviruses that cause herpangina, such as Coxsackievirus A group, EV71, Coxsackievirus group B and echoviruses, in particular Coxsackievirus A group, such as Coxsackievirus A2, 3, 4, 5, 6 and 10.
  • enteroviruses that cause herpangina such as Coxsackievirus A group, EV71, Coxsackievirus group B and echoviruses, in particular Coxsackievirus A group, such as Coxsackievirus A2, 3, 4, 5, 6 and 10.
  • the enterovirus genomic RNA has a region encoding a viral structural protein called P1 and a region encoding viral nonstructural proteins called P2 and P3.
  • P1 corresponds to a viral capsid, and this region is cleaved into viral structural proteins of VP0 to VP4 by being processed by a viral protease that is a nonstructural protein.
  • Enterovirus capsids may be formed from structural proteins of VP0, 1 and 3 called procapsids, or VP0 may be cleaved into VP2 and 4 and formed from structural proteins of VP1-4.
  • the former is referred to as an incomplete particle-shaped virus, and the latter is referred to as a complete particle-shaped virus. *
  • enteroviruses VP0, VP1, VP2, VP3 and VP4 and the base sequences encoding them are known, DNA Data Bank of Japan (DDBJ), EMBL-Bank / EBI, GenBank / National Center for Biotechnology (hereinafter referred to as “Biotechnology”). , NCBI) and the like.
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan
  • EBI EMBL-Bank / EBI
  • GenBank GenBank / National Center for Biotechnology
  • NCBI NCBI
  • EVCr BrCr sequence information is available from NCBI registration number U22521.
  • the term “derived from” means that the object has immunological homology with the original virus, or has a certain homology with the amino acid sequence of the original virus, It should be understood that it is not tied to.
  • Immunological homology means that an immune response against the original virus is similarly elicited against the object.
  • the method for confirming immunological homology may be any means available to those skilled in the art and is not limited to a specific method. Generally, it can be confirmed by measuring whether the antibody in which the target induces expression can neutralize the original virus, that is, by measuring the neutralizing antibody in which the target induces expression.
  • the description of “derived from” an enterovirus indicates that an immune response against the enterovirus is similarly elicited by an object, or a degree of homology with the amino acid sequence of the enterovirus, for example, microbiologically understood as an enterovirus It means that it has the homology of.
  • a certain degree of homology with the amino acid sequence is typically 80% or more, preferably 90% or more, such as 95% or more, preferably 96% or more, more preferably 97% or more, and even more preferably 98% or more. Means 99% or more homology. Any assay method commonly available to those skilled in the art can be used for homology testing, for example BLAST can be used with default parameters.
  • the amino acid sequence of the polypeptide in question is the amino acid sequence of VP1 of any enterovirus obtained from NCBI and the initial setting parameters.
  • a protein in which one amino acid is replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still has a similar biological function eg, a protein that is equivalent in enzyme activity; hereinafter, “biological equivalent”
  • biological equivalent a protein that is equivalent in enzyme activity
  • the hydrophobicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5. It is understood in the art that such amino acid substitutions based on hydrophobicity are efficient.
  • Hydrophilic indicators are also considered in the production of biological equivalents. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+3.
  • the hydrophilicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • the polypeptide may be conservatively substituted.
  • a conservative substitution refers to a substitution in which the hydrophilicity index and / or hydrophobicity index of the original amino acid and the substituted amino acid are similar as described above.
  • Examples of conservative substitutions are well known to those skilled in the art, for example, substitutions within the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; valine, leucine, and isoleucine, etc. However, it is not limited to these. Such conservative substitutions are also included within the scope of the term “derived from” in the present invention.
  • a protease means any enzyme that degrades peptide bonds between amino acids, regardless of whether the target is a protein, a high molecular peptide, or a low molecular peptide.
  • a protease having high substrate specificity such as cysteine protease, 3C protease, Examples include 3CD protease.
  • the protease does not randomly break the peptide bond, but specifically recognizes a specific amino acid sequence and cleaves the peptide bond specifically. Therefore, if one type of protease is selected, the amino acid sequence that can be recognized by the protease can be uniquely determined. What kind of amino acid sequence a certain protease recognizes is described in various documents, for example, instructions of a business operator who sells proteases. In the case of 3C protease or 3CD protease, the recognized amino acid sequence is XX-Gln-Gly-X, and cleavage occurs between Gln and Gly.
  • HRV3C protease it can be understood from the instructions provided by Funakoshi that the recognized amino acid sequence is Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, and that cleavage occurs between Gln and Gly. It is. X represents any amino acid.
  • the inventors have found that immunogenicity is improved by cleaving VP0 into VP2 and VP4. Furthermore, it has been found that in the production of VLPs using a cell expression system, when the polypeptide of the present invention is produced from a known base sequence, the above cleavage is unlikely to occur.
  • the method for causing cleavage is not particularly limited, but for example, a method using a polypeptide containing an amino acid sequence recognized by a protease is preferable.
  • the amino acid sequence recognized by the protease is determined depending on the protease. Since the genomic RNA of enterovirus contains a base sequence encoding 3C protease or 3CD protease, in the polypeptide of the present invention, glutamine called XX-Gln-Gly-X is used as the amino acid sequence recognized by the protease. And a sequence in which glycine is continuous is preferred. Furthermore, the present inventors have found that the binding site between VP2 and VP4 is preferably an amino acid sequence recognized by the protease.
  • the binding site of VP2 and VP4 is cleaved in a substrate-specific manner with 3C protease or 3CD protease, resulting in glycine at the N-terminus of VP2 and glutamine at the C-terminus of VP4.
  • the amino acid sequence recognized by such protease may have any substitution, insertion, deletion, or addition mutation when compared with the wild-type amino acid sequence.
  • the present invention relates to a polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from an enterovirus, such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus, wherein the protease is present at the binding site of VP2 and VP4.
  • an enterovirus such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus, wherein the protease is present at the binding site of VP2 and VP4.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence recognized by is provided.
  • the present invention relates to a polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from an enterovirus, such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus, wherein 3C protease is present at the binding site of VP2 and VP4.
  • an enterovirus such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus
  • 3C protease is present at the binding site of VP2 and VP4.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence recognized by 3CD protease is provided.
  • the present invention provides a polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from an enterovirus, such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus, wherein the VP2 and VP4 are glutamine and glycine.
  • an enterovirus such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus, wherein the VP2 and VP4 are glutamine and glycine.
  • an enterovirus such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus
  • the present invention provides a polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 from an enterovirus, such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus, wherein glutamine is present at the C-terminus of the VP4,
  • an enterovirus such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus, wherein glutamine is present at the C-terminus of the VP4
  • glutamine is present at the C-terminus of the VP4
  • the present invention provides a polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus, wherein the polypeptide is substantially free of enterovirus VP0.
  • VP0 is a polypeptide of about 36 kDa and includes about 28 kDa VP2 and about 8 kDa VP4.
  • the term “substantially free” means that the content thereof is 30% or less, 20% or less, 10% or less, preferably 5% or less compared to the main component when measured quantitatively. More preferably, it means 3% or less, most preferably 1% or less.
  • the “main component” here simply means the main component quantitatively and is not intended to be main in nature.
  • the means that can be used for quantitative measurement may be any method that can be normally selected by those skilled in the art, and the content is grasped by using a normal quantitative unit provided by the measurement method.
  • the intensity of the VP0 band detected using the SDS-PAGE method is 30% or less, 20% or less, 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 3% compared to the intensity of the VP2 band.
  • VP0 is understood to be “substantially free” when it is less than or equal to%, and most preferably less than or equal to 1%.
  • the SDS-PAGE method is a method in which a protein mixture added to a gel is separated according to molecular weight by electrophoresis, and band intensity is analyzed after staining and decolorization. Those skilled in the art can use gels, reagents, membranes, standards, and apparatuses used. Can be appropriately selected.
  • the present invention is a polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 from an enterovirus, such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus, characterized in that it is substantially free of enterovirus VP0.
  • an enterovirus such as a group AD enterovirus, preferably a group A enterovirus, characterized in that it is substantially free of enterovirus VP0.
  • polypeptide of the present invention can be produced using any of peptide, polypeptide and protein production methods that are usually available to those skilled in the art. Such methods include, but are not limited to, chemical synthesis, virus inactivation and cell expression systems. A specific manufacturing method and reagents, conditions, and apparatuses used therein can be easily selected by those skilled in the art. For example, a commercially available protein expression kit can be used according to the instructions attached to the kit.
  • a preferred method for producing the polypeptide of the present invention is a method using a virus inactivation or cell expression system.
  • examples of cells that can proliferate enterovirus include Vero cells, RD cells (Rhabdomysarcoma cells), RD-A cells, and RD-18S cells.
  • Virus inactivation can be performed by any method such as formalin treatment usually used in vaccines.
  • Group A enteroviruses have problems in proliferation during virus culture using cells, production of VLPs by a cell expression system is more preferable from the viewpoint of quantity and cost.
  • usable expression vectors and cells are not particularly limited. For example, commercially available vectors and cells can be used according to the instructions attached to the product.
  • Such vectors include, but are not limited to, for example, HaloTag vectors, pHEK293 vectors, BacPAK vectors, pRI101 DNA vectors, baculovirus vectors, pcDNA vectors, and the like, and are appropriately selected according to the cells to be used.
  • Available cells include, but are not limited to, CHO cells, HEK293 cells, HeLa cells, Vero cells, MDCK cells, E. coli cells, silkworm cells, tobacco leaf cells, and the like.
  • Examples of the polypeptide produced by the cell expression system include VLP.
  • the polypeptide of the present invention is intended to be administered to humans, it is preferably produced in an expression system using mammalian cells.
  • mammalian cells are preferably used from the viewpoint of post-translational modification.
  • Suitable mammalian cells for producing the polypeptides of the present invention include, for example, CHO cells.
  • the expression system using the cells may be any means available to those skilled in the art, and is not limited to these, but includes, for example, a transient expression system by transfection of a plasmid.
  • a virus inactivation method when using a virus inactivation method to produce a polypeptide of the invention, it can be produced according to the following steps: ⁇ Proliferation of enterovirus in cell culture ⁇ Process of filtering virus solution ⁇ Process of obtaining virus fraction corresponding to complete particle shape by sucrose density gradient centrifugation after virus treatment ⁇ Virus fraction A method comprising the step of obtaining a polypeptide of interest by inactivating is provided.
  • a cell expression system when using a cell expression system to produce a polypeptide of the invention, it can be produced according to the following steps: ⁇ A step of extracting RNA from enterovirus or designing DNA by artificial synthesis ⁇ A step of synthesizing and amplifying a DNA fragment from the extracted RNA by RT-PCR and ligating it into an expression plasmid, or an artificial synthesis in the previous step A step of ligating the obtained DNA fragment directly or after amplification into a plasmid for expression; a step of transfecting the obtained plasmid into cells; a step of growing the transfected cells; a step of recovering the polypeptide of the present invention from the grown cells .
  • any step of the above manufacturing method those skilled in the art can easily select reagents, conditions, devices, and the like.
  • a step for confirming whether the intended result is obtained can be appropriately inserted.
  • the confirmation step for example, the sequence of the extracted RNA is confirmed by an appropriate sequencing method such as a cycle sequencing method or a pyro sequencing method, and the obtained polypeptide is confirmed by Western blotting (WB) or the like. It is included.
  • the means for cleaving VP0 into VP2 and VP4 is not particularly limited, but mutations can be introduced so that the base sequence encodes the amino acid sequence recognized by the protease.
  • the original base sequence may be substituted, inserted, deleted, or added, but is not limited thereto.
  • mutagenesis may be performed at the time of ligation. It may be done before or after.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence recognized by the protease to be inserted or substituted can be easily determined using a codon table.
  • mutagenesis may be any means available to those skilled in the art and include, but are not limited to, for example, an inverse PCR method and a complementary primer method.
  • a commercially available mutagenesis kit can be used according to the instructions attached to the kit.
  • the present invention is a method for producing a polypeptide of the present invention using a cell expression system, ⁇ Step of extracting RNA from enterovirus ⁇ Step of synthesizing and amplifying a DNA fragment from the extracted RNA by RT-PCR and ligating it into an expression plasmid ⁇ Amino acid sequence recognized by protease in the relevant portion of the ligated expression plasmid
  • a method comprising a step of mutating a nucleotide sequence coding for a gene, a step of transfecting the obtained plasmid into a cell, a step of growing the transfected cell, and a step of recovering the polypeptide of the present invention from the grown cell.
  • the present invention provides a method for producing the polypeptide of the present invention using a cell expression system, -A step of designing DNA in which a base sequence encoding an amino acid sequence recognized by a protease is introduced by artificial synthesis-A step of ligating an artificially synthesized DNA in the previous step directly or after amplification to an expression plasmid-The resulting plasmid
  • a method comprising the step of transfecting a cell with the cell, the step of growing the transfected cell, and the step of recovering the polypeptide of the present invention from the grown cell are provided.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide of the present invention using a cell expression system, ⁇ Step of extracting RNA from enterovirus ⁇ Step of synthesizing and amplifying a DNA fragment containing a nucleotide sequence encoding VP1 to 4 from RT using the extracted RNA and ligating it to an expression plasmid ⁇ On the ligated expression plasmid A step of mutating a base sequence encoding an amino acid sequence recognized by a protease between a base sequence encoding VP4 and VP2 present in the cell; a step of transfecting the resulting plasmid into a cell; a transfected cell A method comprising the step of proliferating the polypeptide and the step of recovering the polypeptide of the present invention from the expanded expression cells is provided.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide of the present invention using a cell expression system, -Artificial synthesis of DNA containing a base sequence encoding enterovirus-derived VP1 to 4 and containing a base sequence encoding an amino acid sequence recognized by a protease between VP4 and a base sequence encoding VP2.
  • the step of growing the transfected cell. The proliferated expression cell. From which the polypeptide of the present invention is recovered.
  • polypeptide of the present invention thus produced can be modified such as phosphorylation and glycosylation. Such modified polypeptides are still included in the polypeptides of the present invention. Modifications include, for example, post-translational modifications of expressed cells.
  • the polypeptide of the present invention can take any tertiary or quaternary structure by various interactions.
  • the VP1 to 4 subunits are folded by ionic bonds, hydrogen bonds, disulfide bonds, etc. in the polypeptide of the present invention to form tertiary structures, and then the VP1 to 4 subunits are assembled, Quaternary structures can be formed.
  • Such higher-order structures generally exhibit higher immunogenicity as the structure approximates that of natural virus particles. In the present invention, it has been found that the closer the structure is to a perfect particle shape, the higher the immunogenicity.
  • the polypeptide of the invention is a full particle shape-like VLP or a full particle shape inactivated virus.
  • an expression cassette for producing the polypeptide of the present invention.
  • An expression cassette is a combination of a target gene and a promoter operably linked to initiate transcription of the target gene, and is used after being introduced into a vector.
  • an expression cassette comprising an enterovirus, for example, VP1 to 4, derived from group A to D enterovirus, preferably a group A enterovirus, a nucleic acid encoding a protease and an amino acid sequence recognized by the protease, and a promoter that initiates transcription of the nucleic acid. Is also intended.
  • the present inventors have found that the polypeptide of the present invention has high immunogenicity against enteroviruses. Furthermore, the polypeptide of the present invention can also be expected to have cross-reactivity between genotypes and subgenotypes. Accordingly, the present invention provides a vaccine against enteroviruses, such as group AD enteroviruses, preferably group A enteroviruses, more preferably EV71, coxsackievirus A6, coxsackievirus A10 or coxsackievirus A16, more preferably EV71, coxsackievirus A6, coxsackievirus A10 and coxsackievirus A16.
  • a vaccine comprising the polypeptide of the present invention as an antigen is provided.
  • the EV71 genotype may be a B-type vaccine
  • the sub-genotype may be a B5-type vaccine.
  • the term “vaccine” means a pharmaceutical preparation containing an antigen capable of enhancing immunity against a specific pathogen, such as a virus or a bacterium. Whether it is a prophylactic vaccine or a therapeutic vaccine, in the present invention, a prophylactic vaccine is specifically contemplated. Prophylactic vaccines prevent infection and aggravation of a pathogen by administering the vaccine to an unaffected subject and eliciting an immune response against the specific pathogen in the body to increase immunity against the pathogen For pharmaceutical preparations.
  • the route of administration of the vaccine is not limited to these, and examples include subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, nasal administration, transdermal administration, and oral administration.
  • the disease refers to an enterovirus-related disease, such as an enterovirus group A to D-related disease, typically a group A enterovirus-related disease, specifically, for example, hand-foot-and-mouth disease, herpangina and aseptic meningitis, Among them are hand, foot and mouth disease and herpangina.
  • enterovirus-related disease such as an enterovirus group A to D-related disease
  • group A enterovirus-related disease specifically, for example, hand-foot-and-mouth disease, herpangina and aseptic meningitis, Among them are hand, foot and mouth disease and herpangina.
  • the vaccine of the present invention may contain additives commonly used in vaccines in addition to the antigen.
  • additives include carriers, preservatives, adjuvants and the like.
  • the carrier includes water or saline.
  • preservatives include phenol, benzethonium chloride, 2-phenoxyethanol, thimerosal, and the like.
  • adjuvants include aluminum salts, aluminum phosphate, aluminum chloride, aluminum hydroxide, aluminum sulfate, calcium phosphate, Toll-like receptor (TLR) ligand molecules, dsRNA, IL-12, and the like.
  • TLR Toll-like receptor
  • the subject of the vaccine of the present invention includes animals that can be infected with enterovirus, such as mammals such as humans, monkeys, cows, horses, pigs, sheep, and the like.
  • enterovirus such as mammals such as humans, monkeys, cows, horses, pigs, sheep, and the like.
  • a typical subject is a human, particularly but not limited to a human under 5 years who is prone to enterovirus infection.
  • the present invention provides the following aspects: (Aspect 1) A polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus, wherein the VP2 and VP4 are obtained by cleavage of VP0; (Aspect 2) The polypeptide according to Aspect 1, wherein the polypeptide includes VP1, VP2, VP3, and VP4 derived from enterovirus, and the amino acid sequence recognized by a protease at the binding site of VP2 and VP4; (Aspect 3) The polypeptide according to Aspect 2, wherein the protease is 3C or 3CD protease; (Aspect 4) The polypeptide according to Aspect 3, wherein the amino acid sequence recognized by the protease is a sequence in which glutamine and glycine are continuous; (Aspect 5) The polypeptide according to any one of Aspects 1 to 4, wherein the polypeptide includes VP1, VP2, VP3, and VP4 derived from enterovirus, wherein the polypeptide
  • the polypeptide of the present invention not only has high immunogenicity against enteroviruses, but also shows high infection prevention effects in animal tests.
  • the present inventors produced a polypeptide containing VP1 to 4 as an antigen protein, immunized the animal, and measured the neutralizing antibody titer.
  • the polypeptide which contains VP0, 1 and 3 as an antigen protein as a comparison object was manufactured, and the neutralizing antibody titer was measured similarly.
  • a mouse challenge test was performed to confirm the infection prevention effect against enterovirus.
  • the polypeptide of the present invention can also be expected to have cross-reactivity between genotypes and subgenotypes.
  • the polypeptide of the present invention that is, the polypeptide containing VP1 to 4
  • FIG. 6 shows a VLP expression cassette for EV71 comprising EV71 VP1-4, 2A self-cleaving sequence, 3CD protease and CMV promoter. The results of SDS-PAGE and WB of purified VLP are shown.
  • FIG. 6 shows a TEM image of a VLP containing EV71 VP1-4 produced using a CHO cell expression system. The neutralizing antibody titers of complete particle shape-like VLPs containing EV71 VP1-4 and incomplete particle shape-like VLPs containing EV71 VP0, 1 and 3 are shown.
  • Example 1 Production and evaluation of inactivated virus of EV71 Preparation of EV71 Complete Particle Shape and Incomplete Particle Shape Inactivated Virus EV71B5 type (clinical isolate) was cultured using RD-A cells (cell stack, 10 chamber, Corning). Cells in the culture broth were disrupted to obtain a virus solution. The virus solution was centrifuged and filtered (0.45 ⁇ m ⁇ 0.22 ⁇ m) to remove cell debris. The filtrate was ultrafiltered and concentrated using AKTA flux s (molecular weight cut-off value 500 kDa) manufactured by GE Healthcare. Viral particle pellets were prepared using a Hitachi ultracentrifuge CP80wx. The pellet was resuspended overnight in PBS.
  • RD-A cells cell stack, 10 chamber, Corning
  • the suspension was then fractionated using sucrose density gradient centrifugation (10-40%) with an ultracentrifuge CP80wx.
  • the complete particle fraction and the incomplete particle fraction were confirmed by SDS-PAGE and WB. The results are shown in FIG.
  • the complete particle fraction converged to a sucrose density gradient of around 35% (about 1.15 g / mL) and the incomplete particle fraction around 25% (about 1.11 g / mL).
  • the complete particle fraction and the incomplete particle fraction were concentrated using Amicon Ultra from Merck Millipore.
  • Virus was inactivated using formalin, the inactivated virus solution was infected with RD-A cells, and the presence or absence of CPE was measured to confirm the inactivation.
  • Mouse serum was diluted 2-fold to prepare dilution series of 1 / 2-1 / 4096, and after adding EV71 virus solution prepared to 5 ⁇ 10 3 PFU / mL to each dilution series, 37 ° C., 5%
  • the reaction was neutralized with CO 2 for 4 hours. Those without mouse serum were used as negative controls.
  • the neutralization reaction solution was added to the RD-A cells (6-well plate) seeded on the previous day, and the plate was shaken at 37 ° C. for 1 hour every 15 minutes to infect the cells with the virus. After removing the virus solution by suction, methylcellulose was added and overlaid. After culturing at 37 ° C.
  • RNA was extracted from EV71B5 type (clinical isolate) using Roche's High Pure Viral RNA Kit according to the attached instructions.
  • the P1 region and the protease region of the obtained RNA were amplified by RT-PCR according to TaKaRa's PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit according to the attached instructions.
  • the obtained amplified DNA fragment was ligated to the expression plasmid pcDNA3.4. E. TaKaRa. After the produced plasmid was transformed into E. coli JM109 Competent Cells according to the attached instruction, the cells were seeded in a medium to grow.
  • FIG. 5 shows a VLP expression cassette of EV71 in the obtained plasmid.
  • the VLP expression cassette includes EV71 P1,2A self-cleaving sequence, 3CD protease and CMV promoter.
  • a VLP was produced by transient expression using ThermoCHO's ExpiCHO Expression System. Specifically, ExpiCHO-S cells were cultured with ExpiCHO Expression Medium until a predetermined cell density was reached. Expifectamine CHO Reagent diluted with OptiPRO SFM Complexation Medium and VLP expression plasmid were added to the cultured ExpiCHO-S cells and transfected. The transfected cells were cultured in ExpiCHO Expression Medium, ExpiCHO Feed and Expifectamine CHO Enhancer were added, and the culture was further continued. During the culture period, the cell viability was confirmed, and the culture was stopped and collected 8 days after transfection.
  • the obtained culture broth was centrifuged to separate cells and supernatant, and the supernatant was collected and filtered (0.22 ⁇ m).
  • the obtained supernatant was concentrated by ultrafiltration using GE Healthcare's AKTA fluxs with a molecular weight cut-off value of 500 kDa.
  • VLP pellets were prepared using a Hitachi ultracentrifuge CP80wx.
  • VLP pellet was resuspended in PBS overnight. Further, the suspension was subjected to fractionation by sucrose density gradient centrifugation (10 to 40%) using an ultracentrifuge CP80wx, and each fraction was subjected to SDS-PAGE and WB to confirm the VLP fraction. The results are shown in Lanes 2 and 4 of FIG. From this, it was found that the VLP fraction contains a large amount of VP0 before cleavage.
  • Example 2 Preparation and evaluation of EV71 VLP (with mutation) 1.
  • Preparation and confirmation of VLP of EV71 by cell expression system In the plasmid, a Gln-Gly mutation was inserted between VP4-VP2 in the P1 (virtual capsid) region by an inverse PCR method. Specifically, based on the gene sequence information of EV71, a primer for inserting a mutation at the location was designed. Using TaKaRa BIO's PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit, reverse transcription and PCR reactions were performed according to the attached instructions. The PCR reaction was repeated 30 cycles of 98 ° C. (10 sec) ⁇ 60 ° C. (15 sec) ⁇ 68 ° C. (7.5 min).
  • a VLP was prepared in the same manner as described above.
  • the prepared VLP fraction was concentrated using Amicon Ultra of Merck Millipore.
  • the particle structure of VLP was confirmed with a transmission electron microscope (FIG. 7).
  • Comparative Example 1 1. Confirmation by SDS-PAGE and WB was performed in the same manner as above. The results are shown in Lanes 1 and 3 in FIG. From FIG. 6, it was found that the cleavage from VP0 to VP2 and VP4 was promoted by inserting the Gln-Gly mutation.

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Abstract

本発明は、エンテロウイルスに対するワクチンを提供する。エンテロウイルスの構造、特にＶＰ０がＶＰ２とＶＰ４に開裂することに着目し、当該開裂が免疫原性に影響を与えることを見出した。すなわち、免疫原性を示すポリペプチドとしてＶＰ２とＶＰ４を多く含むワクチンを設計することが、高い免疫原性を示すワクチンの提供につながると考えた。エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドを製造し、このポリペプチドがエンテロウイルスに対する免疫原として高い効果を有することを確認した。

Description

エンテロウイルスワクチン
　本発明は、エンテロウイルスに対するワクチンに関するものである。
　エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科に属する一本鎖ＲＮＡウイルスであり、人に感染するものとしてエンテロウイルスＡ～Ｄの群が挙げられる。エンテロウイルスにはポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、エコーウイルス及びその他のエンテロウイルスが含まれる。
Ａ群エンテロウイルスにはコクサッキーウイルスＡ２～８、１０、１２、１４、１６及びエンテロウイルス７１（以下、ＥＶ７１）が含まれる。エンテロウイルスＢ群にはコクサッキーウイルスＡ９、コクサッキーウイルスＢ１～６、エコーウイルス１～３３及びエンテロウイルス６９が含まれる。エンテロウイルスＣ群にはポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ１、１１、１３、１５、１７～２２及び２４が含まれる。エンテロウイルスＤ群にはエンテロウイルス６８及び７０が含まれる。
エンテロウイルスが様々な疾患を引き起こすことはよく知られており、かかる疾患の代表的なものとしては手足口病、ヘルパンギーナ、無菌性髄膜炎などが挙げられる。エンテロウイルスの中でもとりわけＥＶ７１及びコクサッキーウイルスＡ群は、手足口病の主要な原因ウイルスとして知られている。また、エンテロウイルスの中でもとりわけコクサッキーウイルスＡ群、ＥＶ７１、コクサッキーウイルスＢ群及びエコーウイルスは、ヘルパンギーナの主要な原因ウイルスとして知られている。無菌性髄膜炎は、エコーウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、Ｂ群及びＥＶ７１などのエンテロウイルスのほか、寄生虫など幅広い病原体によって引き起こされる。
　コクサッキーウイルスＡ群には例えばＡ１～２２型及び２４型が含まれており、それぞれ異なる疾患及び症状を引き起こしうる。コクサッキーウイルスＢ群には例えば１～６型が含まれる。エコーウイルスにはエコー１～７型、９型、１１～２７型、２９～３１型が含まれる。その他のエンテロウイルスにはエンテロウイルス６８～７１型が含まれる。それぞれの遺伝子型にはさらにサブ遺伝子型が含まれ、例えばＥＶ７１にはプロトタイプ株であるＢｒＣｒのみからなるＡ型、Ｂ１～Ｂ５型及びＣ１～Ｃ５型が知られている。
　手足口病は、一般的には、手、足、口などに水疱性の発疹があらわれる軽症疾患として知られており、小児が夏頃に発症することが多い。手足口病の主な感染経路は、飛沫感染及び糞口感染である。手足口病の大規模な流行は東アジアを中心に報告されており、例えば、中国では２０１６年に約２００万人、日本では２０１５年に約５０万人の患者が報告されている。ほとんどの手足口病患者の予後は良好であるが、まれに中枢神経合併症、例えば無菌性髄膜炎、急性脳炎又は肺水腫などを発症し、重症化又は死亡する例もみられる。このような合併症が生じるのは、ＥＶ７１によって引き起こされた手足口病である場合が多い。また、小児だけでなく成人の手足口病も報告されており、成人の場合には重症化することが多い。しかしながら、手足口病に対する治療方法はいまだ確立されておらず、ワクチンによる予防が東アジア各国を中心に検討又は実施されている。日本でも、手足口病の流行は公衆衛生上の問題とされており、その予防および伝播の抑止に有効なワクチンは厚生科学審議会で開発優先度の高いワクチンの一つとして指定されている。
　ヘルパンギーナは、一般的には、発熱と口腔粘膜にあらわれる水疱性の発疹を特徴とした急性のウイルス性咽頭炎として知られており、乳幼児を中心に夏季に流行することが多い。ヘルパンギーナの主な感染経路は、飛沫感染及び糞口感染である。ヘルパンギーナに対する治療方法もいまだ確立されておらず、ワクチンなどによる予防が期待されている。
　無菌性髄膜炎は、発熱、頭痛、嘔吐のいわゆる３主徴をみとめ、後部硬直、Ｋｅｒｎｉｇ徴候などの髄膜刺激徴候が存在すること、髄液一般検査で定型的な所見を得ること、髄液の塗抹、細菌培養で細菌を検出しないことにより診断がなされる症候群である。エンテロウイルス以外の様々なウイルスなどによっても無菌性髄膜炎が引き起こされることが知られているものの、主たる原因は、エンテロウイルス、特にエコーウイルス及びコクサッキーウイルスである。感染経路や疫学的性質は病原体に依存するが、エンテロウイルスに起因する無菌性髄膜炎の場合には、手足口病などと同様に、夏頃に小児を中心に、飛沫感染及び糞口感染により流行する。無菌性髄膜炎に対する有効な治療方法はいまだ確立されておらず、ワクチンなどによる予防が期待されている。
　ウイルス性疾患に対する予防法としてのワクチンの有効性は、ポリオウイルスに対するワクチンなどの前例から、広く認められている。ワクチン抗原の候補としては、一般的には、弱毒化株、全粒子を初めとする不活化ウイルス、ウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ　Ｌｉｋｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下「ＶＬＰ」）、組換えタンパク質、組換えベクター及びペプチドなどが知られている。エンテロウイルスに対するワクチンについても、すでに様々な研究及び報告がなされている。例えば、非特許文献１及び非特許文献２にはエンテロウイルスをホルマリンで不活化したワクチンが報告されている。特許文献１にはエンテロウイルスのＶＰ０～４を含むＶＬＰが報告されている。特許文献２にはエンテロウイルス粒子及びその製造法が報告されている。特許文献３にはエンテロウイルスを含む多様なウイルスのＶＬＰの製造法が報告されている。非特許文献３にはＥＶ７１のＦ粒子の免疫原性が報告されている。非特許文献４にはＥＶ７１不活化ワクチン投与後の、ＥＶ７１遺伝子型間およびサブ遺伝子型の交差性が報告されている。非特許文献５にはＥＶ７１のＶＰ１～３を含むＶＬＰがＥＶ７１に対するワクチンとして報告されている。また、すでに実用化されているＥＶ７１に対するワクチンとして、例えばＳｉｎｏｖａｃ社のＩｎｌｉｖｅが挙げられる。
　ＥＶ７１は、直径２０～３０ｎｍのウイルスカプシドの内部に約７．４ｋｂの一本鎖ＲＮＡが封入された構造を有しており、該カプシドは４つの異なる構造タンパク質（ＶＰ１～４）のコピー６０個からなる。４つの構造タンパク質がアセンブルしてプロトマーを形成し、５つのプロトマーがアセンブルしてペンタマーを形成し、１２個のペンタマーとウイルスゲノムが成熟したビリオンを構成する。ＥＶ７１のサブ遺伝子型は、主にＶＰ１における変異などによって規定されている（非特許文献６）。
特表２０１４－５３２６９１号公報 特表２０１７－５１７５７１号公報 特表２０１５－５２８２８５号公報
Ｌｅｅ　ＭＳ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｘｐｅｒｔ　Ｒｅｖ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　９：　１４９－１５６，　２０１０ Ｘｕ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｖａｃｃｉｎｅ　２８：　３５１６－３５２１，　２０１０ Ｃｈｉａ－Ｃｈｙｉ　Ｌｉｕ，　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬＯＳ　ｏｎｅ，　Ｖｏｌ６，　Ｉｓｓｕｅ　５，　Ｍａｙ　２０１１ Ｌｏｎｇｄｉｎｇ　Ｌｉｕ，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＭＣ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　２０１５，　１３：２２６ Ｘｉａｏｌｉ　Ｗａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１３３０－１７，　２０１７ Ｅｕｎ－Ｊｅ　Ｙｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｒｅｓ　２０１７；６：４－１４
　本発明は、エンテロウイルスに対するワクチンに関する。具体的には、本発明は、エンテロウイルスに対して免疫原性を示すポリペプチド、当該ポリペプチドの製造方法、当該ポリペプチドを含むエンテロウイルスに対するワクチン及び当該ポリペプチドを用いたエンテロウイルス関連疾患の予防方法を提供する。より具体的には、本発明のポリペプチドは、エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドである。
　ワクチンの有効性は、一般に、免疫原性によって評価される。手足口病を初めとするエンテロウイルスによって引き起こされる疾患の流行状況を鑑みると、エンテロウイルスに対してより高い免疫原性を示すワクチンが求められている。加えて、実用的なワクチンとしては、マウスモデルなどを用いた動物実験で高い感染予防効果が示されることがより望ましい。
　本発明者らは、上記の課題に鑑みて、エンテロウイルスに対して高い免疫原性を有するワクチンを製造した。具体的には、エンテロウイルスの構造、特にＶＰ０がＶＰ２とＶＰ４に開裂することに着目し、当該開裂が免疫原性に影響を与えることを見出した。すなわち、免疫原性を示すポリペプチドとしてＶＰ２とＶＰ４を多く含むワクチンを設計することが、高い免疫原性を示すワクチンの提供につながると考えた。エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドを製造し、このポリペプチドがエンテロウイルスに対する免疫原として高い効果を有することを確認して、本発明をなした。
　以下に本発明の詳細な説明をするが、本明細書において用いられる用語は、微生物学、生化学、分子生物学、医学及び薬学分野における一般的な定義に従って理解される。ただし、本明細書において特に説明又は定義されている用語については、本明細書における説明又は定義が優先する。また、本明細書中に引用されている文献については、参照により本明細書の一部とする。
　第一の態様において、本発明は、エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。
　エンテロウイルスには、ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、エコーウイルス及びその他のエンテロウイルスが含まれるが、とりわけ本発明においては、エンテロウイルスであるＡ～Ｄ群エンテロウイルス、特にＡ群エンテロウイルスを主題とする。本発明は、特に手足口病、ヘルパンギーナ及び無菌性髄膜炎などのエンテロウイルス関連疾患の原因であるウイルス、例えば、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、エコーウイルス及びＡ群エンテロウイルスを主題としている。より具体的には、本発明は、手足口病の原因であるエンテロウイルス、例えばＡ群エンテロウイルス、特にＥＶ７１、とりわけコクサッキーウイルスＡ６、１０及び１６に関する。さらに本発明は、ヘルパンギーナの原因であるエンテロウイルス、例えばコクサッキーウイルスＡ群、ＥＶ７１、コクサッキーウイルスＢ群及びエコーウイルス、特にコクサッキーウイルスＡ群、例えばコクサッキーウイルスＡ２、３、４、５、６及び１０に関する。
　エンテロウイルスのゲノムＲＮＡには、図１に示すようにＰ１と呼ばれるウイルス構造タンパク質をコードする領域とＰ２及びＰ３と呼ばれるウイルス非構造タンパク質をコードする領域が存在する。Ｐ１はウイルスカプシドに該当し、当該領域は非構造タンパク質であるウイルスプロテアーゼによるプロセシングを受けることで、ＶＰ０～４のウイルス構造タンパク質に開裂する。エンテロウイルスのカプシドは、プロカプシドと呼ばれるＶＰ０、１及び３の構造タンパク質から形成される場合やＶＰ０がＶＰ２と４に開裂し、ＶＰ１～４の構造タンパク質から形成される場合がある。本明細書において、前者を不完全粒子形状のウイルス、後者を完全粒子形状のウイルスと呼ぶ。　
　エンテロウイルスのＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４のアミノ酸配列及びそれらをコードする塩基配列は既知であり、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ－Ｂａｎｋ／ＥＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ／Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、ＮＣＢＩ）などのデータベースから容易に入手可能である。例えばＥＶ７１のＢｒＣｒの配列情報は、ＮＣＢＩ登録番号Ｕ２２５２１から入手可能である。
　本発明において、用語「由来の」とは、対象物が元のウイルスと免疫学的な相同性を有すること、又は元のウイルスのアミノ酸配列と一定の相同性を有することを意味し、製造方法に縛られるものではないと理解すべきである。免疫学的な相同性とは、元のウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されることを意味する。免疫学的な相同性を確認する方法は、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、特定の方法に限定されない。一般的には、対象物が発現を誘導する抗体が元のウイルスを中和しうるかどうか、すなわち対象物が発現を誘導する中和抗体を測定することで確認することができる。例えばエンテロウイルス「由来の」との記載は、エンテロウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されること、又はエンテロウイルスのアミノ酸配列と一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味する。アミノ酸配列と一定の相同性とは、典型的には８０％以上、好ましくは９０％以上、例えば９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最適には９９％以上の相同性を有することを意味する。相同性の検定には当業者が通常利用可能なあらゆる検定方法を利用可能であるが、例えばＢＬＡＳＴを初期設定のパラメーターで用いることができる。
　一例をあげると、エンテロウイルス由来のＶＰ１であるといえるためには、まず、問題となっているポリペプチドのアミノ酸配列が、ＮＣＢＩから取得したいずれかのエンテロウイルスのＶＰ１のアミノ酸配列と初期設定パラメーターを用いたＢＬＡＳＴで一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味し、典型的には８０％以上、好ましくは９０％以上、例えば９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最適には９９％以上の相同性を有することを意味する。
　あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質。以下、「生物学的等価体」）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、生物学的等価体の作製において考慮される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、±０．５以内であることがさらにより好ましい。
　したがって、本発明において、ポリペプチドは保存的置換されていてもよい。保存的置換とは、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；バリン、ロイシン、及びイソロイシン、などが挙げられるが、これらに限定されない。かかる保存的置換もまた、本発明において、「由来の」なる用語の範囲に含まれる。
　本発明において、プロテアーゼは、アミノ酸間のペプチド結合を分解するあらゆる酵素を意味し、その対象がタンパク質、高分子ペプチド又は低分子ペプチドのいずれであるかを問わない。本発明において好ましいプロテアーゼとしては、ＶＰ２とＶＰ４の結合部位を特異的に認識可能であって他のペプチド結合に影響しないことが望ましいことから、基質特異性の高いもの、例えばシステインプロテアーゼ、３Ｃプロテアーゼ、３ＣＤプロテアーゼなどが挙げられる。
　本発明において、プロテアーゼは、無作為にペプチド結合を分解するものではなく、それぞれ特定のアミノ酸配列を認識して特異的にペプチド結合を切断する。したがって、１種のプロテアーゼを選択すれば、そのプロテアーゼが認識可能なアミノ酸配列は一意に決定できる。あるプロテアーゼがどのようなアミノ酸配列を認識するかは、各種文献、例えばプロテアーゼを販売する事業者の説明書などに記載されている。３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼの場合、認識するアミノ酸配列はＸ－Ｘ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｘであり、Ｇｌｎ－Ｇｌｙ間で切断が生じる。例えばＨＲＶ３Ｃプロテアーゼの場合、フナコシ社の提供する説明書から、認識するアミノ酸配列がＬｅｕ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏであり、Ｇｌｎ－Ｇｌｙ間で切断が生じることが理解可能である。なお、Ｘは任意のアミノ酸を示す。
　本発明において発明者らは、ＶＰ０がＶＰ２とＶＰ４に開裂することで免疫原性が向上することを見出した。更に、細胞発現系によるＶＬＰの作製などにおいて、既知の塩基配列より本発明のポリペプチドを製造した場合、上記開裂が起こりにくいことを見出した。開裂を起こす手法は特に限定されないが、たとえばプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いる手法が好ましい。
　本発明において、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列は、プロテアーゼに依存して決定されるものである。エンテロウイルスのゲノムＲＮＡには３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼをコードする塩基配列が含まれていることから、本発明のポリペプチドにおいて、当該プロテアーゼが認識するアミノ酸配列としてＸ－Ｘ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｘというグルタミン及びグリシンが連続した配列が好ましい。更に本発明者らは、ＶＰ２とＶＰ４の結合部位が、当該プロテアーゼが認識するアミノ酸配列であることが好ましいことを見出した。例えば、本発明のポリペプチドにおいて、３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼでＶＰ２とＶＰ４の結合部位が基質特異的に切断された結果、ＶＰ２のＮ末端はグリシンが、ＶＰ４のＣ末端はグルタミンとなる。かかるプロテアーゼが認識するアミノ酸配列は、野生型のアミノ酸配列と比較したときに置換、挿入、欠失、又は付加のいずれの変異があってもよい。
　したがって、好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ～Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。　
　より好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ～Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位に３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。
　より好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ～Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４とがグルタミン及びグリシンが連続した配列を介して連結していることを特徴とするポリペプチドを提供する。
　別の好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ～Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ４のＣ末端にグルタミンを、当該ＶＰ２のＮ末端にグリシンを含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。
　さらに本発明者らは、天然のエンテロウイルスには完全粒子形状と不完全粒子形状のウイルスが混在していることを鑑み、エンテロウイルスから完全粒子形状のウイルスを抽出することで、不完全粒子形状のウイルスよりも高い免疫原性を有する抗原を調整しうることを見出した。したがって、さらなる態様において、本発明は、エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まないことを特徴とするポリペプチドを提供する。ＶＰ０は、約３６ｋＤａのポリペプチドであり、約２８ｋＤａのＶＰ２と約８ｋＤａのＶＰ４を含む。
　本発明において、用語「実質的に含まない」とは、定量的に測定した場合にその含有量が主成分と比較して３０％以下、２０％以下、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、最も好ましくは１％以下であることを意味する。ここでの「主成分」は単に量的に主たる成分を意味し、性質的に主であることを意図するものではない。定量的測定に利用可能な手段は当業者が通常選択可能ないずれかの方法であってよく、含有量はその測定方法が提供する通常の定量単位を用いて把握される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法を用いて検出したＶＰ０のバンドの強度が、ＶＰ２のバンドの強度と比較して、３０％以下、２０％以下、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、最も好ましくは１％以下である場合に、ＶＰ０を「実質的に含まない」ものと理解される。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法はゲルに添加したタンパク質混合物を電気泳動によって分子量に従って分離し、染色及び脱色後にバンド強度を分析するものであり、使用するゲル、試薬、メンブレン、スタンダード及び装置などは当業者であれば適宜選択できる。
　好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ～Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まないことを特徴とするポリペプチドを提供する。
　本発明のポリペプチドは、当業者が通常利用可能なペプチド、ポリペプチド及びタンパク質製造方法のいずれかを用いて製造することができる。かかる方法は、これらに限定されるものではないが、化学合成、ウイルス不活化及び細胞発現系を含む。具体的な製造方法やそこで使用される試薬、条件及び装置等は、当業者であれば、容易に選択することができる。例えば市販のタンパク質発現キットを、当該キットに添付の説明書に従って、利用することができる。
　好ましい本発明のポリペプチドの製造方法は、ウイルス不活化又は細胞発現系を用いた方法である。エンテロウイルスを増殖しうる細胞として、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞（Ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ細胞）、ＲＤ－Ａ細胞、ＲＤ－１８Ｓ細胞などが挙げられる。ウイルス不活化はワクチンにおいて通常使用されるホルマリン処理等のあらゆる方法によって行うことができる。一方でＡ群エンテロウイルスは、細胞を用いたウイルス培養時の増殖において課題があるため、量及びコストの観点より、細胞発現系によるＶＬＰの作製がより好ましい。
細胞発現系を用いた方法としては、利用可能な発現ベクター及び細胞には特に制限はないが、例えば、市販のベクター及び細胞を、当該製品に添付の説明書に従って、利用することができる。かかるベクターには、これらに限定されないが、例えば、ＨａｌｏＴａｇベクター、ｐＨＥＫ２９３ベクター、ＢａｃＰＡＫベクター、ｐＲＩ１０１ＤＮＡベクター、バキュロウイルスベクター、ｐｃＤＮＡベクター等が含まれ、使用する細胞に応じて適宜選択される。利用可能な細胞としては、これらに限定されないが、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、大腸菌細胞、カイコ細胞、タバコ葉細胞等が含まれる。当該細胞発現系によって作製されるポリペプチドとして、例えばＶＬＰが挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、ヒトに投与することが意図されていることから、哺乳類細胞を用いた発現系で製造することが好ましい。他の細胞、例えば大腸菌、植物及び昆虫細胞を用いた発現系でも本発明のポリペプチドを製造することは可能であるが、翻訳後修飾の観点から、哺乳類細胞を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドを製造するのに好適な哺乳類細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞が挙げられる。当該細胞を用いた発現系としては、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されないが、例えば、プラスミドのトランスフェクションによる一過性発現系が挙げられる。
　一例として、本発明のポリペプチドを製造するためにウイルス不活化方法を用いる場合、次の工程に従って製造できる：
・細胞培養にてエンテロウイルスを増殖させる工程
・ウイルス液をろ過処理する工程
・処理後ウイルス液をショ糖密度勾配遠心法にて完全粒子形状に該当するウイルス画分を取得する工程
・当該ウイルス画分を不活化することで、目的のポリペプチドを取得する工程
を含む方法を提供する。
　一例として、本発明のポリペプチドを製造するために細胞発現系を用いる場合、次の工程に従って製造できる：
・エンテロウイルスからＲＮＡを抽出するか、又は人工合成によりＤＮＡをデザインする工程
・抽出したＲＮＡよりＲＴ－ＰＣＲにてＤＮＡ断片を合成及び増幅し発現用プラスミドにライゲーションする工程、又は前工程にて人工合成したＤＮＡ断片を直接もしくは増幅後に発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションした細胞を増殖させる工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程。
　上記製造方法のいずれの工程においても、当業者であれば、試薬、条件、装置等について、容易に選択可能である。また、各工程において、意図した結果が得られているかを確認するための工程を適宜挿入することができる。かかる確認工程としては、例えば、抽出したＲＮＡの配列を適当なシークエンス法、例えばサイクルシークエンス法やパイロシークエンス法等で確認することや、得られたポリペプチドをウェスタンブロット法（ＷＢ）等によって確認することが含まれる。
　ＶＰ０をＶＰ２とＶＰ４に開裂する手段は特に限定されないが、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列となるように変異を導入することができる。変異を導入するために元の塩基配列を置換、挿入、欠失、又は付加してもよいが、これらに限定されない。エンテロウイルスからＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅させ、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程において、変異導入は、ライゲーション時に行ってもよいし、ライゲーションの前又は後に行ってもよい。挿入又は置換されるプロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列は、コドン表を用いて容易に決定することができる。例えば、３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼを用いる場合には、当該プロテアーゼが認識するＧｌｎ－Ｇｌｙをコードする塩基配列、例えばＣＡＡＧＧＵが用いられる。変異導入の具体的方法は、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されないが、例えば、インバースＰＣＲ法、相補的プライマー法等を含む。例えば、市販の変異導入キットを当該キットに添付の説明書に従って使用することができる。
　したがって、ある態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを細胞発現系を用いて製造する方法であって、
・エンテロウイルスからＲＮＡを抽出する工程
・抽出したＲＮＡよりＲＴ－ＰＣＲにてＤＮＡ断片を合成及び増幅し発現用プラスミドにライゲーションする工程
・ライゲーションした発現用プラスミド上の当該部分に、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異導入する工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。
　また、別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを細胞発現系を用いて製造する方法であって、
・人工合成により、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を導入したＤＮＡをデザインする工程
・前工程にて人工合成したＤＮＡを直接もしくは増幅後に発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。
　さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを細胞発現系を用いて製造する方法であって、
・エンテロウイルスからＲＮＡを抽出する工程
・抽出したＲＮＡより、ＲＴ－ＰＣＲにてＶＰ１～４をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を合成及び増幅し発現用プラスミドにライゲーションする工程
・ライゲーションした発現用プラスミド上に存在するＶＰ４とＶＰ２をコードする塩基配列との間に、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異導入する工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程
・増殖した発現細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。　
 
　さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを細胞発現系を用いて製造する方法であって、
・エンテロウイルス由来のＶＰ１～４をコードする塩基配列を含むＤＮＡであって、ＶＰ４とＶＰ２をコードする塩基配列との間に、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを人工合成する工程
・前工程にて人工合成したＤＮＡ断片を直接もしくは増幅後に発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程
・増殖した発現細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。　
　このようにして製造された本発明のポリペプチドは、リン酸化やグリコシル化等の修飾を受けうる。かかる修飾を受けたポリペプチドもなお、本発明のポリペプチドに含まれる。修飾には、例えば、発現細胞の翻訳後修飾が含まれる。　
 
また、本発明のポリペプチドは、様々な相互作用によって、いずれかの三次又は四次構造をとりうる。例えば、本発明のポリペプチド内のイオン結合、水素結合、ジスルフィド結合等によってＶＰ１～４の各サブユニットの折り畳みが生じて三次構造を形成し、次いでＶＰ１～４の各サブユニットがアセンブルして、四次構造を形成しうる。かかる高次構造は、一般的に、天然のウイルス粒子に構造上近似しているほど、高い免疫原性を示す。本発明においては、更に完全粒子形状に構造上近似しているほど、高い免疫原性を有することを見出した。したがって、好ましい態様において本発明のポリペプチドは、完全粒子形状様のＶＬＰ又は完全粒子形状の不活化ウイルスである。
　さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを製造するための発現カセットを提供する。発現カセットは、目的遺伝子と当該目的遺伝子の転写を開始するために操作可能に結合したプロモーターの組み合わせであり、ベクターに導入して使用する。本発明において、エンテロウイルス、例えばＡ～Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１～４、プロテアーゼ及び当該プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする核酸及び当該核酸の転写を開始するプロモーターを含む発現カセットもまた、意図される。
　本発明者らは、本発明のポリペプチドがエンテロウイルスに対する高い免疫原性を有することを見出した。更に本発明のポリペプチドは、遺伝子型間およびサブ遺伝子型間の免疫反応の交差性も期待できる。したがって、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ～Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス、より好ましくはＥＶ７１、コクサッキーウイルスＡ６、コクサッキーウイルスＡ１０又はコクサッキーウイルスＡ１６、さらに好ましくはＥＶ７１、コクサッキーウイルスＡ６、コクサッキーウイルスＡ１０及びコクサッキーウイルスＡ１６に対するワクチンであって、本発明のポリペプチドを抗原として含むことを特徴とする、ワクチンを提供する。さらにＥＶ７１の遺伝子型はＢ型、さらにサブ遺伝子型はＢ５型に対するワクチンであってもよい。
　本発明において、用語「ワクチン」は、特定の病原体、例えばウイルス、細菌等に対する免疫力を高めることができる抗原を含む医薬製剤を意味する。予防ワクチンと治療ワクチンのいずれであるかを問わないが、本発明においては、とりわけ予防ワクチンが意図される。予防ワクチンは、いまだ罹患していない対象にワクチンを投与して、特定の病原体に対する免疫応答を体内で誘発させて、病原体に対する免疫力を高めることによって、その病原体への感染や重症化を予防するための医薬製剤である。ワクチンの投与経路は、これらに限定されないが、例えば、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、経皮投与、経口投与などがありうる。
本発明において、疾患は、エンテロウイルス関連疾患、例えばエンテロウイルスＡ～Ｄ群関連疾患、典型的にはＡ群エンテロウイルス関連疾患を指し、具体的には、例えば手足口病、ヘルパンギーナ及び無菌性髄膜炎、とりわけ手足口病及びヘルパンギーナである。
　本発明のワクチンは、抗原の他に、ワクチンで通常使用される添加物を含んでいてよい。かかる添加物には、担体、防腐剤及びアジュバント等が含まれる。例えば、担体には、水又は生理食塩水が含まれる。例えば、防腐剤には、フェノール、塩化ベンゼトニウム、２－フェノキシエタノール、チメロサール等が含まれる。例えば、アジュバントには、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、リン酸カルシウム、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンド分子、ｄｓＲＮＡ、ＩＬ－１２等が含まれる。これらの添加物は、当業者であれば、投与経路等の様々な要因を考慮して、適宜選択可能である。
　本発明のワクチンの対象は、エンテロウイルスに感染しうる動物、例えば哺乳類、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が含まれる。典型的な対象は、ヒトであり、とりわけエンテロウイルスに感染しやすい５歳未満のヒトであるが、これに限定されない。
　かくして、本発明は、以下の態様を提供する：
　・（態様１）エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４がＶＰ０の開裂によって得られたものであることを特徴とするポリペプチド；
　・（態様２）エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含む、態様１に記載のポリペプチド；
・（態様３）前記プロテアーゼが３Ｃ又は３ＣＤプロテアーゼである、態様２に記載のポリペプチド；
・（態様４）前記プロテアーゼが認識するアミノ酸配列が、グルタミン及びグリシンが連続した配列である、態様３に記載のポリペプチド；
・（態様５）エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、ＶＰ２のＮ末端にグリシン及びＶＰ４のＣ末端にグルタミンを含む、態様１～４のいずれかに記載のポリペプチド；
・（態様６）ウイルス様粒子である、態様１～５のいずれかに記載のポリペプチド；
・（態様７）エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含み、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まない、ポリペプチド；
・（態様８）不活化全粒子である、態様７に記載のポリペプチド；
・（態様９）エンテロウイルスがＡ～Ｄ群のいずれかのエンテロウイルスである、態様１～８のいずれかに記載のポリペプチド；
・（態様１０）エンテロウイルスがＡ群エンテロウイルスである、態様９に記載のポリペプチド；
・（態様１１）Ａ群エンテロウイルスが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）又はコクサッキーウイルスＡ６又はコクサッキーウイルスＡ１０又はコクサッキーウイルスＡ１６である、態様１０に記載のポリペプチド；
・（態様１２）Ａ群エンテロウイルスが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）及びコクサッキーウイルスＡ６及びコクサッキーウイルスＡ１０及びコクサッキーウイルスＡ１６である、態様１０に記載のポリペプチド；
・（態様１３）ＥＶ７１の遺伝子型がＢ型である、態様１２に記載のポリペプチド；
・（態様１４）ＥＶ７１のサブ遺伝子型がＢ５型である、態様１２に記載のポリペプチド；
・（態様１５）エンテロウイルスに対するワクチンであって、態様１～１４のいずれかに記載のポリペプチドを抗原として含むワクチン；
・（態様１６）Ａ群エンテロウイルスに対するワクチンである、態様１５に記載のワクチン；
・（態様１７）Ａ群エンテロウイルスが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）又はコクサッキーウイルスＡ６又はコクサッキーウイルスＡ１０又はコクサッキーウイルスＡ１６である、態様１５に記載のワクチン。
　本発明のポリペプチドは、エンテロウイルスに対する高い免疫原性を有するのみならず、動物試験において高い感染予防効果が示される。本発明のポリペプチドの免疫原性を確認するために、本発明者らは、抗原タンパク質としてＶＰ１～４を含むポリペプチドを製造し、動物への免疫を行い、中和抗体価を測定した。また、比較対象として抗原タンパク質としてＶＰ０、１及び３を含むポリペプチドを製造し、同様に中和抗体価を測定した。さらに、マウスチャレンジ試験を行い、エンテロウイルスに対する感染予防効果を確認した。更に本発明のポリペプチドは、遺伝子型間およびサブ遺伝子型間の免疫反応の交差性も期待できる。
　詳細な手法及び結果は実施例に譲るが、本発明のポリペプチド、すなわちＶＰ１～４を含むポリペプチドは、ＶＰ０、１及び３を含むポリペプチドと比較して、高い中和抗体誘導能を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、エンテロウイルスに対する高い免疫原性を有し、エンテロウイルスに対するワクチンの抗原として有用である。なお、臨床症状や病原性が類似するウイルスにおいては、同様の効果が期待できる。
エンテロウイルスの遺伝子構造を示す。 不活化ワクチンのショ糖密度勾配遠心（１０～４０％）画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷＢの結果を示す。 不活化ワクチンの中和抗体価を示す。 不活化ワクチンのチャレンジ試験マウス生存率を示す。 ＥＶ７１のＶＰ１～４、２Ａ自己開裂配列、３ＣＤプロテアーゼ及びＣＭＶプロモーターを含む、ＥＶ７１のＶＬＰ発現カセットを示す。 精製済みＶＬＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びWBの結果を示す。 ＣＨＯ細胞発現系を用いて製造したＥＶ７１のＶＰ１～４を含むＶＬＰのＴＥＭイメージを示す。 ＥＶ７１のＶＰ１～４を含む完全粒子形状様ＶＬＰ及びＥＶ７１のＶＰ０、１及び３を含む不完全粒子形状様ＶＬＰの中和抗体価を示す。
（実施例１）ＥＶ７１の不活化ウイルスの作製及び評価
１．ＥＶ７１の完全粒子形状及び不完全粒子形状の不活化ウイルスの作製
ＲＤ－Ａ細胞を用いてＥＶ７１Ｂ５型（臨床分離株）を培養した（セルスタック、１０チャンバー、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）。培養液中の細胞を破砕して、ウイルス液を取得した。ウイルス液を遠心分離し、濾過（０．４５μｍ→０．２２μｍ）して細胞残渣を除去した。濾液をＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ　ｆｌｕｘ　ｓ（分子量カットオフ値５００ｋDa）を用いて、限外濾過濃縮した。Ｈｉｔａｃｈｉ社の超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘを用いてウイルス粒子のペレットを作製した。ペレットをＰＢＳ中に一晩懸濁させて再浮遊させた。次いで、懸濁液を超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘによるショ糖密度勾配遠心法（１０～４０％）を用いて画分を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷＢによって、完全粒子画分及び不完全粒子画分を確認した。結果を図２に示す。完全粒子画分は３５％前後（約１．１５ｇ／ｍＬ）の、不完全粒子画分は２５％前後（約１．１１ｇ／ｍＬ）のショ糖密度勾配に収束した。完全粒子画分及び不完全粒子画分をＭｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａを用いて濃縮した。ホルマリンを用いてウイルスの不活化を行い、不活化したウイルス液をＲＤ－Ａ細胞に感染させ、ＣＰＥの有無を測定することで不活化の確認を行った。
２．ＥＶ７１の完全粒子形状及び不完全粒子形状の不活化ウイルスの評価
２－１．　免疫原性の評価
　ＥＶ７１の完全粒子形状の不活化ウイルス又は不完全粒子形状の不活化ウイルスでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、血清を採取して中和抗体価を測定した。具体的には、４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに完全粒子形状の不活化ウイルス又は不完全粒子形状の不活化ウイルスを０．１μｇ注射してそれぞれ免疫し、６週齢及び８週齢でそれぞれ同量追加免疫した。１０週齢で全採血を行い、約０．８ｍＬの血清を得た。マウス血清を２倍段階希釈して１／２～１／４０９６の希釈系列を作製し、各希釈系列に５×１０３ＰＦＵ／ｍＬに調製したＥＶ７１ウイルス液を添加した後、３７℃、５％ＣＯ２で４時間反応させてウイルスを中和した。マウス血清を含まないものをネガティブコントロールとした。前日に播種しておいたＲＤ－Ａ細胞（６ウェルプレート）に中和反応液を添加し、３７℃で、１時間、１５分おきにプレートを振盪して、ウイルスを細胞に感染させた。ウイルス液を吸引除去した後、メチルセルロースを添加して重層した。３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養し、メチルセルロースを吸引除去した後、１０倍希釈したホルムアルデヒド液で細胞を固定した。クリスタルバイオレットで細胞を染色して、プラーク数をカウントした。ネガティブコントロールのプラーク数を１００％として、中和反応液を添加したウェルのプラーク数が２０％以下となった最大希釈率を抗体価として算出した。結果を図３に示す。図３より、完全粒子形状の不活化ウイルスを抗原として用いることで、不完全粒子形状の不活化ウイルスよりも高い中和抗体誘導能を示すことがわかった。
２－２．　チャレンジ試験マウス生存率の評価
　ＥＶ７１の完全粒子形状の不活化ウイルス及び不完全粒子形状の不活化ウイルスでｈＳＣＡＲＢ２発現Ｔｇ－マウスを免疫した後、ＥＶ７１Ｂ５型（臨床分離株）を接種し、マウスの生存率を測定した。上記ｈＳＣＡＲＢ２発現Ｔｇ－マウスは、Ｋｅｎ　Ｆｕｊｉｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　２０１３　Ｓｅｐ　３；１１０（３６）：１４７５３－８に記載の手法で取得した。４週齢のｈＳＣＡＲＢ２発現Ｔｇ－マウスに完全粒子形状の不活化ウイルス及び不完全粒子形状の不活化ウイルスを０．１μｇ注射してそれぞれ免疫し、６週齢及び８週齢でそれぞれ同量追加免疫した。１０週齢で１０６　ＣＣＩＤ５０　のウイルスをマウス腹腔内に接種した。腹腔内接種から２週間後のマウスの生存率を図４に示す。図４より、完全粒子形状の不活化ウイルスを抗原として用いることで、不完全粒子形状の不活化ウイルスよりも高い生存率を示すことがわかった。
（比較例１）ＥＶ７１のＶＬＰの作製及び評価（変異なし）
１．細胞発現系によるＥＶ７１のＶＬＰの作製と確認
　Ｒｏｃｈｅ社のＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　Ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ　Ｋｉｔを添付の説明書に従って、ＥＶ７１Ｂ５型（臨床分離株）からＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡのＰ１領域及びプロテアーゼ領域を、ＴａＫａＲａ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔを添付の説明書に従って、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅した。得られた増幅ＤＮＡ断片を発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３．４にライゲーションした。ＴａＫａＲａ社のＥ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓに、添付の説明書に従って、作製したプラスミドをトランスフォーメーションした後、細胞を培地に播種して増殖させた。得られた大腸菌細胞から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　Ｍｉｄｉｐｒｅｐ　ｋｉｔを添付の説明書に従って、ＶＬＰ発現用プラスミドを抽出した。得られたプラスミド中のＥＶ７１のＶＬＰ発現カセットを図５に示す。ＶＬＰ発現カセットには、ＥＶ７１のＰ１、２Ａ自己開裂配列、３ＣＤプロテアーゼ及びＣＭＶプロモーターが含まれる。
　Ｔｈｅｒｍｏ社のＥｘｐｉＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍを使用して、一過性発現でＶＬＰを作製した。具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞をＥｘｐｉＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍで所定の細胞密度に達するまで培養した。培養したＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞にＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭ　Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍで希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ　ＣＨＯ　Ｒｅａｇｅｎｔ及びＶＬＰ発現用プラスミドを加えて、トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をＥｘｐｉＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍで培養し、ＥｘｐｉＣＨＯ　Ｆｅｅｄ及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ　ＣＨＯ　Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加し、さらに培養を続けた。培養期間中、細胞生存率を確認し、トランスフェクションから８日後に、培養を停止し、回収した。得られた培養液を遠心分離して細胞と上清を分離し、上清を回収して、フィルター濾過した（０．２２μｍ）。得られた上清を、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ　ｆｌｕｘ　ｓを分子量カットオフ値５００ｋDaで用いて、限外濾過濃縮した。Ｈｉｔａｃｈｉ社の超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘを用いてＶＬＰのペレットを作製した。
　ＶＬＰのペレットをＰＢＳ中に一晩懸濁させて再浮遊させた。さらに、懸濁液を超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘによるショ糖密度勾配遠心（１０～４０％）にかけて分画を行い、各画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷＢにかけて、ＶＬＰ画分を確認した。結果を図６のＬａｎｅ２と４に示す。これより、当該ＶＬＰ画分には、開裂前のＶＰ０を多く含むことがわかった。
２．細胞発現系によるＥＶ７１のＶＬＰの免疫原性の評価
　作製したＶＬＰを用いて、実施例１の２－１．と同様の手法にて中和抗体価を測定した。結果を図８の不完全粒子形状様ＶＬＰに示す。図３と比較すると、作製したＶＬＰは不完全粒子形状の不活化ウイルスと同等程度の中和抗体価を示し、完全粒子形状の不活化ウイルスよりも低い中和抗体価を示すことがわかった。
（実施例２）ＥＶ７１のＶＬＰの作製及び評価（変異あり）
１．細胞発現系によるＥＶ７１のＶＬＰの作製と確認
　インバースＰＣＲ法によって、プラスミドにおいて、Ｐ１（ｖｉｒａｌ　ｃａｐｓｉｄ）ｒｅｇｉｏｎ内のＶＰ４－ＶＰ２間にＧｌｎ－Ｇｌｙ変異を挿入した。具体的には、EV７１の遺伝子配列情報を元に、当該箇所に変異を挿入するためのプライマーを設計した。ＴａＫａＲａ　ＢＩＯ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔを使用して、添付の説明書に従って逆転写反応及びＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は９８℃（１０ｓｅｃ）→６０℃（１５ｓｅｃ）→６８℃（７．５ｍｉｎ）を３０サイクル繰り返した。変異未導入のプラスミドをDｐｎIを用いて分解した後、ＴａＫａＲａ　ＢＩＯ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、添付の説明書に従ってＰＣＲ産物を処理した（５０℃、１５ｍｉｎ）。その後、大腸菌へのトランスフォーメーションを行った。上記以外は比較例１の１．と同様の手法にて、ＶＬＰを作製した。
　作製したＶＬＰ画分をＭｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａを用いて濃縮した。透過電子顕微鏡でＶＬＰの粒子構造を確認した（図７）。また、比較例１の１．と同様の手法で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びWBによる確認を行った。結果を図６のＬａｎｅ１と３に示す。図６より、Ｇｌｎ－Ｇｌｙ変異を挿入することでＶＰ０からＶＰ２とＶＰ４への開裂が促進されることを見出した。
２．細胞発現系によるＥＶ７１のＶＬＰの免疫原性の評価
　作製したＶＬＰを用いて、実施例１の２－１．と同様の手法にて中和抗体価を測定した。結果を図８の完全粒子形状様ＶＬＰに示す。これより、変異を導入しＶＰ０をＶＰ２とＶＰ４へ開裂することで高い中和抗体価が誘導されることを見出した。
 

 

Claims (17)

  1. エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４がＶＰ０の開裂によって得られたものであることを特徴とするポリペプチド。
  2. エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記プロテアーゼが３Ｃ又は３ＣＤプロテアーゼである、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. 前記プロテアーゼが認識するアミノ酸配列が、グルタミン及びグリシンが連続した配列である、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、ＶＰ２のＮ末端にグリシン及びＶＰ４のＣ末端にグルタミンを含む、請求項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
  6. ウイルス様粒子である、請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
  7. エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含み、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まない、ポリペプチド。
  8. 　不活化全粒子である、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 　エンテロウイルスがＡ～Ｄ群のいずれかのエンテロウイルスである、請求項１～８のいずれかに記載のポリペプチド。
  10. エンテロウイルスがＡ群エンテロウイルスである、請求項９に記載のポリペプチド。
  11. Ａ群エンテロウイルスが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）又はコクサッキーウイルスＡ６又はコクサッキーウイルスＡ１０又はコクサッキーウイルスＡ１６である、請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. Ａ群エンテロウイルスが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）及びコクサッキーウイルスＡ６及びコクサッキーウイルスＡ１０及びコクサッキーウイルスＡ１６である、請求項１０に記載のポリペプチド。
  13. ＥＶ７１の遺伝子型がＢ型である、請求項１２に記載のポリペプチド。
  14. 　ＥＶ７１のサブ遺伝子型がＢ５型である、請求項１２に記載のポリペプチド。
  15. 　エンテロウイルスに対するワクチンであって、請求項１～１４のいずれかに記載のポリペプチドを抗原として含むワクチン。
  16. 　Ａ群エンテロウイルスに対するワクチンである、請求項１５に記載のワクチン。
  17. 　Ａ群エンテロウイルスが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）又はコクサッキーウイルスＡ６又はコクサッキーウイルスＡ１０又はコクサッキーウイルスＡ１６である、請求項１５に記載のワクチン。
     
     

     
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020067027A1 (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 一般財団法人阪大微生物病研究会 Ｖｌｐ発現ｃｈｏ細胞株の構築
CN114540315A (zh) * 2021-10-18 2022-05-27 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株
CN117106102A (zh) * 2023-10-23 2023-11-24 中国医学科学院医学生物学研究所 肠道病毒多抗原表位融合蛋白、基因、疫苗及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150044257A1 (en) * 2012-03-23 2015-02-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Baculovirus-based enterovirus 71 vlp as a vaccine

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150044257A1 (en) * 2012-03-23 2015-02-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Baculovirus-based enterovirus 71 vlp as a vaccine

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARTHUR HUANG K.-Y . ET AL.: "Epitope-associated and specificity-focused features of EV71- neutralizing antibody repertoires from plasmablasts of infected children", NAT. COMMUN., vol. 8, no. 1, October 2017 (2017-10-01), pages 1 - 14, XP055631296 *
LIU, C.-C. ET AL.: "Purification and Characterization of Enterovirus 71 Viral Particles Produced from Vero Cells Grown in a Serum-Free Microcarrier Bioreactor System", PLOS ONE, vol. 6, no. 5, May 2011 (2011-05-01), pages 1 - 9, XP055257364 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020067027A1 (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 一般財団法人阪大微生物病研究会 Ｖｌｐ発現ｃｈｏ細胞株の構築
JPWO2020067027A1 (ja) * 2018-09-28 2021-08-30 一般財団法人阪大微生物病研究会 Ｖｌｐ発現ｃｈｏ細胞株の構築
CN114540315A (zh) * 2021-10-18 2022-05-27 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株
CN114540315B (zh) * 2021-10-18 2023-05-16 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株
CN117106102A (zh) * 2023-10-23 2023-11-24 中国医学科学院医学生物学研究所 肠道病毒多抗原表位融合蛋白、基因、疫苗及其制备方法
CN117106102B (zh) * 2023-10-23 2024-02-06 中国医学科学院医学生物学研究所 肠道病毒多抗原表位融合蛋白、基因、疫苗及其制备方法

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