JP7085531B2 - 強毒性エンテロウイルス71の安定的生産およびその利用 - Google Patents
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Description
CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集により、ヘパラン硫酸(HS)を発現しないRD細胞を作製した。EXT1遺伝子(Genbankアクセッション番号NM_000127)およびEXT2遺伝子(Genbankアクセッション番号NM_000401、NM_207122、NM_1178083)のそれぞれを標的とするガイドRNA(sgRNA)の配列を設計し、sgRNAをコードする以下のDNA断片をpSpCas9(BB)-2A-GFPプラスミド(addgene社製)のBbsI切断部位に挿入した。
上記1で得られたRD-ΔEXT1およびRD-ΔEXT2について、以下の手順によりヒトSCARB2遺伝子(Genbankアクセッション番号NM_001204255、NM_005506)を導入し、ヒトSCARB2を過剰発現するHS欠失RD細胞(RD-ΔEXT1-SCARB2およびRD-ΔEXT2-SCARB2)を作製した。ヒトSCARB2遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクター(pQCXIP-hSCARB2)とpVSV-Gを、GP2-293パッケージング細胞にトランスフェクションし、2日後に上清を回収し、ヒトSCARB2発現レトロウイルスを得た。得られたレトロウイルスをRD-ΔEXT1およびRD-ΔEXT2に感染させた後、1μg/mlのピューロマイシン存在下で選択培養し、RD-ΔEXT1-SCARB2およびRD-ΔEXT2-SCARB2を得た。また、同様の手順により、野生型RD細胞にSCARB2遺伝子を過剰発現させた細胞(RD-SCARB2)を作製した。
最初に、以下の手順により、継代回数P0のEV71を調製した。EV71 Isehara株(国立感染症研究所より入手)からゲノムRNAを抽出し、SuperScript(登録商標)III逆転写酵素(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて、cDNAを調製した。以下のプライマーセットを用いたPCRにより、全長ゲノムRNAに対するcDNA(配列番号7)を増幅した。
2716-Yamagata-03株(山形県衛生研究所より入手)をRD-SCARB2細胞で1代継代増殖したものを継代回数P0のEV71とした以外は、上記3と同様の手順により、上記1および2で得られた各細胞を用いて連続継代することにより継代回数P1~P3のEV71を調製し、それらの病原性を以下の手順により解析した。ヒトSCARB2発現トランスジェニックマウスとしてhSCARB2-Tg10(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 110, No. 36, pp. 14753-14758)を用いた。106TCID50/mlの上記各種EV71を0.5ml、6~7週齢のhSCARB2-Tg10(各10匹)に腹腔内投与した。投与後、2週間にわたり毎日、生死状態、麻痺症状、および体重変化を観察した。麻痺率は、2日以上にわたり四肢のいずれかに完全あるいは不完全麻痺の症状が確認されたマウスの割合を示す。体重変化率は、投与前の体重を100%として算出した。
宿主細胞として、RD-SCARB2に代えてRD-ΔEXT1-SCARB2を用いた以外は、上記3と同様の手順により、全長ゲノムRNAを細胞にトランスフェクションし、増殖したウイルスを回収した。回収したウイルスを1代継代増殖して得られたウイルス(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1))と、上記3でRD-SCARB2を用いて調製した継代回数P0のEV71(RD-SCARB2(P2))を、それぞれ10週齢のhSCARB2-Tg10(各10匹)に静脈内投与し、投与2週間後における生存率を比較した。
SK-EV006(VP1-145G)株(国立感染症研究所より入手)をEV71の生ワクチンとして、ホルマリン固定した同株を不活化ワクチンとして用い、それぞれ以下の手順によりhSCARB2-Tg10トランスジェニックマウスを免疫した。
4週齢のhSCARB2-Tg10トランスジェニックマウスに、106TCID50のSK-EV006(VP-145G)株を腹腔内投与した(初回免疫)。その後、8週齢時にも同様の投与を行った(追加免疫)。対照群には、PBSを投与した。
100μlのホルマリン固定SK-EV006(VP-145G)を、等量のAlhydrogel(登録商標)(Invivogen社製)と混合し、不活化ワクチン調製物とした。0.3μgの不活化ワクチン調製物を、4週齢のhSCARB2-Tg10トランスジェニックマウスに皮下投与した(初回免疫)。その後、8週齢時にも同様の投与を行った(追加免疫)。対照群には、同量のAlhydrogel/PBSを投与した。
上記6と同様にして、不活化ワクチンによりhSCARB2-Tg10トランスジェニックマウスを免疫した。各マウスの21週齢時に採血した以外は、上記6と同様の手順によりプラークアッセイを行った。上記採血の翌日に、攻撃ウイルスとして、上記3で調製したRD-ΔEXT1-SCARB2(P1)(LD50=103.5)を用いた以外は、上記6と同様の手順により攻撃感染を行い、死亡率および麻痺率を算出した。
上記Isehara株(C2型)に加え、遺伝子型の異なる強毒性EV71(Y90-3896株(C1型)(仙台医療センターウイルスセンターより入手)、N772株(C4型)(仙台医療センターウイルスセンターより入手)、C7/Osaka株(B4型)(国立感染症研究所より入手)、および2716-Yamagata-03株(B5型)(山形県衛生研究所より入手))を、ワクチン検定のための攻撃ウイルスとして調製した。上記の強毒性EV71の全長cDNA配列と、cDNAの増幅のために使用したプライマーセットを以下に示す。
攻撃ウイルスとして上記8で調製したN772株(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)、106TCID50)を用いた以外は、上記6と同様の手順により、成体hSCARB2-Tg10マウスを免疫および攻撃し、血清の中和抗体価、体重変化、死亡率および麻痺率を算出し、不活化ワクチンの有効性を評価した。
Claims (9)
- 強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に増殖させるための宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ヘパラン硫酸を発現しておらず、かつ、霊長類のスカベンジャー受容体クラスBメンバー2(SCARB2)を過剰発現している、宿主細胞。
- 前記強毒性の手足口病病因ウイルスが、ヒトエンテロウイルスA群に分類されるウイルスである、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記強毒性の手足口病病因ウイルスが、エンテロウイルス71、コクサッキーウイルスA16、コクサッキーウイルスA14またはコクサッキーウイルスA7である、請求項1または2に記載の宿主細胞。
- EXT1遺伝子および/またはEXT2遺伝子を発現していない、請求項1~3のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記霊長類のSCARB2がヒトSCARB2である、請求項1~4のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がRD細胞である、請求項1~5のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- (1)強毒性の手足口病病因ウイルスを産生する細胞を得るために、請求項1~6のいずれか1項に記載の宿主細胞に、強毒性の手足口病病因ウイルスのゲノムRNAを導入するステップと、
(2)強毒性の手足口病病因ウイルスを増殖させるために、前記ステップ(1)により得られた細胞を培養するステップと、
(3)前記ステップ(2)により増殖させた強毒性の手足口病病因ウイルスを回収するステップと
を含む、強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に生産する方法。 - 前記強毒性の手足口病病因ウイルスが、ヒトエンテロウイルスA群に分類されるウイルスである、請求項7に記載の方法。
- 前記強毒性の手足口病病因ウイルスが、エンテロウイルス71、コクサッキーウイルスA16、コクサッキーウイルスA14またはコクサッキーウイルスA7である、請求項7または8に記載の方法。
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