CN117106102B - 肠道病毒多抗原表位融合蛋白、基因、疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及肠道病毒多抗原表位融合蛋白、基因、疫苗及其制备方法。本发明提供了一种肠道病毒多抗原表位融合蛋白，所述肠道病毒多抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明疫苗采用基因工程蛋白疫苗的制备方式，制备的疫苗特异性更强，经过蛋白纯化后，杂蛋白较少，特异性抗原蛋白更多，提高了联合疫苗的有效性和安全性。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及肠道病毒多抗原表位融合蛋白、基因、疫苗及其制备方法。
背景技术
手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是由肠道病毒引起的一种常见于5岁以下儿童的传染性疾病，患儿表现出轻微的临床症状，流涕、咳嗽、发热、手足及口部皮疹等，在重症患者出现中枢神经******症状，主要包括脑炎、脑膜炎、脑脊髓炎、神经炎性肺水肿等。现已知HFMD的主要病原体为肠道病毒A组，在这其中引起手足口病的主要病原体包括EV-A71、CV-A16、CV-A10和CV-A6。目前尚无关于治疗HFMD的特异性药物，已有上市的EV-A71灭活疫苗。然而，研究发现EV-A71灭活疫苗不能有效预防引起手足口病的其他病原体的感染，包括CV-A10、CV-A6、CV-A16病毒等。因此，研制EV71-CA16-CA10-CA6的联合疫苗对于同时有效抑制EV-A71、CV-A16、CV-A10、CV-A6病原具有重要的作用。
近年来，通过表位串联进行纳米颗粒疫苗设计已经在流感病毒疫苗中广泛应用，并且具有良好的免疫原性。这种以抗原-抗体相互作用为基础的疫苗设计方式也被应用到包括RSV、Ebola等多种病原体中。根据肠道病毒结构解析的研究发现，这些肠道病毒的主要结构蛋白VP1、VP2、VP3等的BC、DE、GH和EF loop等区域已被证实包含了肠道病毒的中和位点。因此，将这些包括关键中和表位的结构域串联到一起进行反向疫苗学设计将为肠道病毒新型联合疫苗的开发提供思路。
表位串联的疫苗通常存在免疫原性弱的问题。因此，研究中通常使用纳米颗粒载体连接目的蛋白基因片段，进行蛋白疫苗的制备，从而增加免疫原的表达数量和频率，以提高抗原片段的免疫原性。近年来，Ferritin纳米颗粒载体已经广泛应用基因工程蛋白疫苗的制备中，以该纳米颗粒载体为基础构建的表达载体表达的Ferritin蛋白单体在细胞内可以自组装成球体结构，并且融合表达目的蛋白，将其展示在球体表面，该纳米颗粒疫苗可以有效呈递蛋白抗原并诱导较强的免疫应答反应。上述技术中，以Ferritin为载体的纳米颗粒疫苗技术已经成功开发了包括新冠疫苗、流感疫苗在内的亚单位疫苗。因此，肠道病毒表位疫苗采取Ferritin纳米颗粒来展示不同关键蛋白区域的抗原表位将有效提高表位展示的频率和密度，以提供疫苗的免疫原性。
发明内容
本发明进行的EV71、CA16、CA10和CA6关键抗原表位串联的Ferritin纳米颗粒疫苗的制备对于肠道病毒联合疫苗的开发具有创新性和必要性。本发明提供了一种手足口病EV71-CA16-CA10-CA6串联多表位疫苗的设计及制备方法可以有效抵御这四种肠道病毒的感染，以预防手足口病的发生。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种肠道病毒多抗原表位融合蛋白，所述肠道病毒多抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述肠道病毒多抗原表位融合蛋白包括肠道病毒的EV71的VP1、VP2、VP3的抗原表位；CA16的VP1、VP2、VP3的抗原表位；CA10的VP1、VP2、VP3的抗原表位和CA6的VP1、VP2、VP3的抗原表位。
优选的，所述肠道病毒多抗原表位融合蛋白由顺序串联EV71 VP1蛋白的EF loop、GH loop区域、EV71 VP2蛋白的EF loop区域、EV71 VP3蛋白的GH loop区域；CA16 VP1蛋白的EF loop、GH loop区域、CA16 VP2蛋白的EF loop区域、CA16 VP3蛋白GH loop区域；CA6VP1蛋白的BC loop、DE loop、EF loop、GH loop、HI loop区域、CA6 VP2蛋白的EF loop区域、CA6 VP3蛋白的GH loop区域；CA10 VP1蛋白的EF loop、GH loop、CA10 VP2蛋白EF loop区域、CA10 VP3蛋白GH loop区域构成。
优选的，所述肠道病毒多抗原表位融合蛋白各区域之间通过间隔序列连接；所述间隔序列为GGSSGG、SGG或EAAAK。
本发明提供了编码所述的肠道病毒多抗原表位融合蛋白的基因。
本发明提供了含有所述基因的表达盒、重组载体或细胞。
优选的，所述细胞为293T细胞或CHO细胞。
优选的，所述重组载体包括不限于pcDNA3.1+等。
优选的，所述表达盒连接有用于调控上述目的核酸基因序列表达的调控序列，包括不限于启动子、增强子、信号肽编码序列、终止子、组氨酸标签等。
本发明提供了一种肠道病毒多抗原表位联合疫苗，其包含所述的肠道病毒多抗原表位融合蛋白、Ferritin蛋白（所述Ferritin蛋白的核苷酸序列为序列SEQ ID NO：1中第1～501位碱基）和佐剂。
优选的，所述佐剂为氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂或硫酸铝佐剂。
优选的，所述佐剂的铝含量终浓度以铝离子Al3+含量计算为0.1~0.4mg/mL。
本发明还提供了一种转铁蛋白Ferritin为载体的纳米颗粒四价肠道病毒多表位疫苗的制备方法，具体包括：将所述肠道病毒多抗原表位融合蛋白与Ferritin蛋白融合后，得到Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10；将Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10转化成核苷酸序列，构建pcDNA3.1+-Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10表达载体，表达、分离、纯化后获得多表位疫苗蛋白，使用佐剂吸附后，得到串联抗原表位疫苗。
优选的，将上述表达质粒通过阳离子脂质体，例如lip2000， PEI或FuGENE，转染进入哺乳动物细胞中的表达。然后对上述表达的重组蛋白进行蛋白提取和纯化。蛋白纯化的目的是为了获得预期大小的目的蛋白。
优选的，纯化方式包括但不限于亲和层析法、离子交换法等。
肠道病毒颗粒是大小为30nm左右的单股正链RNA病毒。当病毒感染人体细胞进入胞浆后，将利用自身的病毒RNA转录成为一个大的单体的多聚蛋白前体，通过病毒的非结构蛋白2Apro、3Cpro、3CDpro将该多聚蛋白前体蛋白酶解成多种成熟的蛋白，包括衣壳蛋白VP0、VP1、VP3以及与病毒复制有关的蛋白2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D。随后，RNA诱导VP0加工成VP2和VP4产生成熟病毒颗粒（Nat Rev Microbiol 16，368–381(2018).）。肠道病毒粒子表面主要由VP1、VP2和VP3的亚基组成，它们亚基结构都采用典型的八股反平行β-桶状折叠的状态，使每种肠道病毒具有独特的抗原性（Infectious Diseases of the Fetus andNewborn(Seventh Edition)，2011）。病毒衣壳蛋白表面有几个高度可变的环（loop），宿主免疫***很容易进入这些环，这也是肠道病毒具有高度抗原多样性的原因。因此，EV71、CA16、CA10、CA6病毒VP1、VP2、VP3结构蛋白包含了诱导肠道病毒中和抗体产生的抗原表位区域，以及细胞受体结合位点。
本发明基于上述病毒本身的蛋白结构特点，以及诱导机体中和抗体产生的区域的结构特征。本发明选择CA16 VP1蛋白的EF loop、GH loop区域、CA16 VP2蛋白的EF loop区域、CA16 VP3蛋白的GH loop区域；CA6 VP1蛋白的BC loop、DE loop、EF loop、GH loop、HIloop区域、CA6 VP2蛋白的EF loop区域、CA6 VP3蛋白的GH loop区域；CA10 VP1蛋白的EFloop、GH loop、CA10 VP2蛋白EF loop区域、CA10 VP3蛋白GH loop区域；EV71 VP1蛋白的EFloop、GH loop区域、EV71 VP2蛋白的EF loop区域、EV71 VP3蛋白的GH loop区域。本发明前期通过肠道病毒特异性单克隆抗体对上述肠道病毒抗原表位进行筛选，并结合生物信息学软件对EV71、CA16、CA10、CA6抗原表位、区段之间的连接顺序、间隔氨基酸序列进行预测和分析，设计出一种包含四种肠道病毒关键抗原表位序列的串联多表位肠道病毒蛋白疫苗。
上述的表位疫苗，由于各个loop区域的分子量较小，因此可能导致针对每个抗原表位区域机体内诱导的免疫原性不足的问题。为了解决该问题，本发明将这些表位进行串联，并且将其与Ferritin纳米颗粒蛋白融合表达，形成纳米颗粒多价肠道病毒EV71-CA16-CA10-CA6表位疫苗。
本发明根据上述病毒株主要结构蛋白VP1、VP2、VP3的氨基酸序列，设计的串联肽段的氨基酸构成特征如下：本发明按照Ferritin、EV71(VP1-GH loop)、EV71(VP1-GHloop)、EV71(VP2-EF loop)、EV71(VP3-GH loop)、CA16(VP1-EF loop)、CA16(VP1-GHloop)、CA16(VP2-EF loop)、CA16(VP3-GH loop)、CA6(VP1-BC loop)、CA6(VP1-DE loop)、CA6(VP1-EF loop)、CA6(VP1 GH loop)、CA6(VP1-HI loop)、CA6(VP2-EF loop)、CA6(VP3-GH loop)、CA10(VP1-EF loop)、CA10(VP1-GH loop)、CA10(VP2-EF loop)、CA10(VP3-GHloop)、EV71(VP1-EF loop)氨基酸顺序构成。
本发明将转铁蛋白Ferritin亚基与多肽抗原表位融合表达，可以获得Ferritin为载体的纳米颗粒四价肠道病毒多表位疫苗。经过Western Blot可以鉴定该蛋白的表达情况。通过微量中和实验检测本发明的肠道病毒多联表位疫苗免疫动物后，免疫的动物血清对于肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6的中和效果。以及对免疫后的成年小鼠所生乳鼠进行攻毒实验，观察乳鼠生存率，从而观察疫苗对于乳鼠的保护效果。结果表明，该肠道病毒EV71-CA16-CA10-CA6多价表位疫苗能够激发小鼠产生针对VP1、VP2、VP3等蛋白的细胞免疫应答和特异性血清中和抗体，具有良好的免疫原性和抗原特异性。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过筛选出的EV71 VP1蛋白的EF loop、GH loop区域、EV71 VP2蛋白的EFloop区域、EV71 VP3蛋白的GH loop区域；CA16 VP1蛋白的EF loop、GH loop区域、CA16 VP2蛋白的EF loop区域、CA16 VP3蛋白GH loop区域；CA6 VP1蛋白的BC loop、DE loop、EFloop、GH loop、HI loop区域、CA6 VP2蛋白的EF loop区域、CA6 VP3蛋白的GH loop区域；CA10 VP1蛋白的EF loop、GH loop、CA10 VP2蛋白EF loop区域、CA10 VP3蛋白GH loop区域；。将上述结构域串联设计出了一种肠道病毒EV71-CA16-CA6-CA10多表位蛋白。该蛋白与铝佐剂吸附后，制备成肠道病毒多价表位联合疫苗。
本发明的联合疫苗通过四种肠道病毒病原主要结构蛋白的关键抗原表位进行串联，并通过与Ferritin蛋白的融合表达，自组装成为多聚体纳米颗粒蛋白疫苗，有效地增加了小片段多肽的表达浓度，解决了表位疫苗免疫原性较低的缺陷。
本发明的联合疫苗包含有手足口病主要结构蛋白VP1、VP2、VP3关键抗原表位，在乳鼠体内证实能够有效预防EV71、CA16、CA10、CA6病毒引起的手足口病的发生。本发明研究表明，上述各种抗原在免疫后都可以诱导良好地免疫效果，具有较好免疫原性和保护性。
本发明提供的多表位联合疫苗可以同时预防多种肠道病毒病原体。该联合疫苗的使用可以简化疫苗接种程序。该疫苗采用基因工程蛋白疫苗的制备方式，制备的疫苗特异性更强，经过蛋白纯化后，杂蛋白较少，特异性抗原蛋白更多，可以提高联合疫苗的有效性和安全性。
附图说明
图1：实施例2的Western-Blot鉴定多价疫苗重组蛋白的真核表达图；
图2：实施例3的SDS-PAGE分析重组蛋白的纯化情况图；
图3：实施例5的多价疫苗二次免疫小鼠后针对四种病毒的中和抗体水平的分析图；
图4：实施例6的多价疫苗二次免疫小鼠后针对四种肠道病毒的攻毒保护效果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例对肠道病毒EV71-CA16-CA6-CA10四联多表位疫苗的表达质粒进行构建。
按顺序串联EV71 VP1蛋白的EF loop、GH loop区域、EV71 VP2蛋白的EF loop区域、EV71 VP3蛋白的GH loop区域； CA16 VP1蛋白的EF loop、GH loop区域、CA16 VP2蛋白的EF loop区域、CA16 VP3蛋白GH loop区域；CA6 VP1蛋白的BC loop、DE loop、EF loop、GHloop、HI loop区域、CA6 VP2蛋白的EF loop区域、CA6 VP3蛋白的GH loop区域；CA10 VP1蛋白的EF loop、GH loop、CA10 VP2蛋白EF loop区域、CA10 VP3蛋白GH loop区域；，所述串联抗原表位各抗原表位之间通过间隔序列GGSSGG连接（含有间隔序列的串联抗原表位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示）；
随后构建肠道病毒Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10四联多表位疫苗的表达质粒载体，其中EV71-CA16-CA6-CA10核苷酸序列在Ferritin蛋白核苷酸序列的下游。
将前期设计的多表位疫苗的Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10的氨基酸序列（如SEQID NO：2所示），转化成核苷酸序列（如SEQ ID NO：1所示），并进行碱基优化，委托华大生物科技有限公司进行基因合成，以及构建pcDNA3.1+-Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10表达载体（目的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示），通过测序证明其表达载体目的基因***位置正确，无基因突变。
实施例2
本实施例进行重组蛋白pcDNA3.1+-Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10的真核表达。
将构建成功的表达载体pcDNA3.1+-Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10瞬时转染进293T细胞中，具体的方法如下：
1）使用15cm直径的细胞培养皿进行转染实验，待293T细胞的细胞融合度达到80%时，开始进行转染；
2）转染前将含10%血清的完全培养基换成无血清培养基；
3）配制lipofectamine2000 Reagent混悬液，将lipofectamine2000 Reagent混悬液加入至1.5ml Opti-MEM Medium；
4）pcDNA3.1+-Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10表达质粒(该质粒按照与lipofectamine 2000混悬液质量体积比1µg: 3µL的比例进行计算表达质粒需要加入的量)加入至1.5ml Opti-MEM Medium中；
5）将上述3）与4）的溶液等体积混合，轻轻混匀后25℃静置5分钟，待形成DNA-lipid复合物；
6）将DNA-lipid复合物混合均匀(总体积不超过全部培养基体积的10%)后滴加入293T培养细胞中（不含抗生素）；
7）转染后5小时，补加青霉素-链霉素联合抗生素，置于37℃温箱培养72小时；
8）收获表达蛋白进行Western-Blot（WB）检测；WB检测结果表明，与只加转染试剂的空白细胞相比，pcDNA3.1+-Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10在约57.5KD处出现目的蛋白条带，与预期重组蛋白大小符合（图1）。
实施例3
本实施例对上述实施例中的重组蛋白进行纯化。
使用5ml重力柱进行纯化实施例4得到的表达蛋白，将装填好的Ni Smart Beads6FF重力柱使用5倍体积的样本缓冲液进行室温平衡，反复平衡3次。随后进行样品结合，将样品缓慢加入至柱平衡的重力柱中，保证样本和介质充分结合，并且收集流出液，反复上样3次，以增加样本与介质的结合效率。进一步使用，15倍柱体积的洗涤缓冲液（20mM NaH2PO4，500mM NaCL，5mM咪唑，PH=8.0）进行杂蛋白清洗。使洗脱液（20mM NaH2PO4，500mM NaCL，250mM咪唑，PH=8.0）进行目的蛋白洗脱，收集流出液。将上述收集的目标蛋白流出液样本加入到透析袋中，使用PBS（PH=7.4）进行透析过夜。最后进行SDS-PAGE染色，结果表明得到单一条带的纯度较高的目的蛋白、Western-Blot检测结果表明得到大小正确的目的条带(图2)。综上表明，经过Ni-离子亲和层析纯化后，可以获得纯度较高的肠道病毒多表位重组蛋白疫苗。
实施例4
铝吸附多联重组蛋白疫苗的配制。
单价铝吸附疫苗的制备：用2mM的PBS将铝佐剂稀释3mg/mL(以Al(OH)3计)，用2mMPBS将实施例5得到的pcDNA3.1+-Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10重组表达蛋白稀释成1mg/mL，室温下将稀释后的铝佐剂与稀释后的重组蛋白进行等体积混合，并使用磁力搅拌器进行搅拌，25℃吸附1小时，制备成为铝吸附手足口病联合疫苗。通过BCA蛋白检测分析表明，抗原蛋白吸附效率达到90%以上。随后，将上述氢氧化铝佐剂吸附的重组蛋白疫苗稀释成为高、中、低三个剂量组，重组蛋白浓度分别为50µg/mL、100µg/mL和200µg/mL。
实施例5
多表位联合疫苗免疫原性测定
采用上述实施例4中的三种剂量的四价联合疫苗按照0、21天的程序免疫小鼠（100µL/dose），检测血清中和抗体滴度（表1）。使用vero细胞进行微量中和实验，并检测中和抗体效价。全程免疫完成后28天分离血清，按照倍比稀释的血清与100CCID50的攻击病毒中和2小时后加入细胞中，并将细胞在37℃培养7天，逐日记录观察细胞病变效应。两针免疫完成后，抗体阳转率达到100%(表2、图3)。其中，中剂量、高剂量组抗体水平GMT值明显高于低剂量组，低剂量组抗体水平显示当抗原蛋白含量在10µg/只注射小鼠时，即能诱导良好的免疫效果。
a：分别针对不同肠道病毒的中和抗体阳转率
实施例6
多表位联合疫苗保护效果评价
采用上述实施例5中的三组四价联合疫苗（肠道病毒多抗原表位联合疫苗）按0、21天的程序免疫小鼠。在全程免疫完成后28天，将疫苗免疫雌鼠与正常雄鼠进行交配，在雌鼠怀孕生下乳鼠后，对8窝2日龄的乳鼠进行病毒攻击。分别使用EV-A71、CV-A16、CV-A10、CV-A6病毒进行病毒攻击，每种病毒攻击2窝乳鼠（乳鼠数量保证在10只及以上）。结果显示，与空白对照组相比，实验组乳鼠能够有效抵御4种肠道病毒分别的攻击，其中EV71、CA16、CA10保护效率达到100%，CA6保护效率达到90%（图4）。
实施例7
多表位联合疫苗安全性评价
在评估该四价联合疫苗的过程中，所有小鼠均健康存活，临床表现无异常。对上述实验性四价联合疫苗进行动物安全性评价，包括异常毒性实验和急性毒性实验。在小鼠异常毒性实验中，取5只SPF级C57BL/6小鼠，小鼠体重为18~22g，在每只小鼠腹腔注射0.5ml四联疫苗，连续观察7天。观察期间，小鼠全部健康存活，无异常反应，且体重持续增加。因此，该实验性疫苗符合规定。在小鼠急性毒性实验中，将EV71-CA16-CA6-CA10联合疫苗采用最大给药量法（80µg/只），给药动物未出现异常临床表现和死亡。
综上，本发明提供了肠道病毒多价抗原表位疫苗能够诱发机体产生针对EV71、CA16、CA10、CA6病毒的特异性中和抗体，除免疫原性以外，通过小鼠异常毒性和急性毒性实验证明其具备安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.编码权利要求1所述的重组蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体或细胞，其特征在于，所述重组载体为pcDNA3.1+；所述细胞为293T细胞。
4.一种重组蛋白联合疫苗，其特征在于，其包含权利要求1所述的重组蛋白和佐剂。
5.根据权利要求4所述的重组蛋白联合疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂或硫酸铝佐剂。
6.一种权利要求4或5所述重组蛋白联合疫苗的制备方法，其特征在于，将肠道病毒多抗原表位融合蛋白与Ferritin蛋白融合后，得到权利要求1所述重组蛋白；将重组蛋白的氨基酸序列转化成核苷酸序列，构建pcDNA3.1+-Ferritin-EV71-CA16-CA6-CA10表达载体，表达、分离、纯化后获得多表位疫苗蛋白，使用佐剂吸附后，得到重组蛋白联合疫苗。
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