JP2021070629A - エンテロウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】エンテロウイルスに対するワクチンを提供する。【解決手段】エンテロウイルスの構造、特にＶＰ０がＶＰ２とＶＰ４に開裂することに着目し、当該開裂が免疫原性に影響を与えることを見出した。すなわち、免疫原性を示すポリペプチドとしてＶＰ２とＶＰ４を多く含むワクチンを設計することが、高い免疫原性を示すワクチンの提供につながると考えた。エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドを製造し、このポリペプチドがエンテロウイルスに対する免疫原として高い効果を有することを確認した。【選択図】図３

Description

本発明は、エンテロウイルスに対するワクチンに関するものである。

エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科に属する一本鎖ＲＮＡウイルスであり、人に感染するものとしてエンテロウイルスＡ〜Ｄの群が挙げられる。エンテロウイルスにはポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、エコーウイルスおよびその他のエンテロウイルスが含まれる。エンテロウイルスＡ群にはコクサッキーウイルスＡ２〜８、１０、１２、１４および１６ならびにエンテロウイルス７１が含まれる。エンテロウイルスＢ群にはコクサッキーウイルスＡ９、コクサッキーウイルスＢ１〜６、エコーウイルス１〜３３およびエンテロウイルス６９が含まれる。エンテロウイルスＣ群にはポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ１、１１、１３、１５、１７〜２２および２４が含まれる。エンテロウイルスＤ群にはエンテロウイルス６８および７０が含まれる。エンテロウイルスが様々な疾患を引き起こすことはよく知られており、かかる疾患の代表的なものとしては手足口病、無菌性髄膜炎、ヘルパンギーナなどがあげられる。エンテロウイルスの中でもとりわけエンテロウイルス７１（以下、ＥＶ７１）ならびにコクサッキーウイルスＡ群は、手足口病の主要な原因ウイルスとして知られている。また、エンテロウイルスの中でもとりわけコクサッキーウイルスＡ群、ＥＶ７１、コクサッキーウイルスＢ群およびエコーウイルスは、ヘルパンギーナの主要な原因ウイルスとして知られている。無菌性髄膜炎は、エコーウイルス、コクサッキーウイルスＡ群およびＢ群ならびにＥＶ７１などのエンテロウイルスのほか、寄生虫など幅広い病原体によって引き起こされる。

コクサッキーウイルスＡ群には例えばＡ１〜２２型および２４型が含まれており、それぞれ異なる疾患及び症状を引き起こしうる。コクサッキーウイルスＢ群には例えば１〜６型が含まれる。エコーウイルスにはエコー１〜７型、９型、１１〜２７型、２９〜３１型が含まれる。その他のエンテロウイルスにはエンテロウイルス６８〜７１型が含まれる。それぞれの遺伝子型にはさらにサブ遺伝子型が含まれ、例えばエンテロウイルス７１にはプロトタイプ株であるＢｒＣｒのみからなるＡ型、Ｃ１〜Ｃ５型ならびにＢ１〜Ｂ５型が知られている。

手足口病は、一般的には、手、足、口などに水疱性の発疹があらわれる軽症疾患として知られており、小児が夏頃に発症することが多い。手足口病の主な感染経路は、飛沫感染および糞口感染である。手足口病は東アジアを中心に報告されており、例えば、中国では２０１６年に約２００万人、日本では２０１５年に約５０万人の患者が報告されている。ほとんどの手足口病患者の予後は良好であるが、まれに中枢神経合併症、例えば無菌性髄膜炎、急性脳炎または肺水腫などが生じて、重症化または死亡する例もみられる。このような合併症が生じるのは、エンテロウイルス７１によって引き起こされた手足口病である場合が多い。また、小児だけでなく成人の手足口病も報告されており、成人の場合には重症化することが多い。しかしながら、手足口病に対する治療方法はいまだ確立されておらず、ワクチンによる予防が東アジア各国を中心に検討または実施されている。日本でも、手足口病の予防に有効なワクチンは、公衆衛生上の問題として厚生科学審議会で開発優先度の高いワクチンの一つとして指定されている。

ヘルパンギーナは、一般的には、発熱と口腔粘膜にあらわれる水疱性の発疹を特徴とした急性のウイルス性咽頭炎として知られており、乳幼児を中心に夏季に流行することが多い。ヘルパンギーナの主な感染経路は、飛沫感染および糞口感染である。ヘルパンギーナに対する治療方法もいまだ確立されておらず、ワクチンなどによる予防が期待されている。

無菌性髄膜炎は、発熱、頭痛、嘔吐のいわゆる３主徴をみとめ、後部硬直、Ｋｅｒｎｉｇ徴候などの髄膜刺激徴候が存在すること、髄液一般検査で定型的な所見を得ること、髄液の塗抹、細菌培養で細菌を検出しないことにより診断がなされる症候群である。エンテロウイルス以外の様々なウイルスなどによっても無菌性髄膜炎が引き起こされることが知られているものの、主たる原因は、エンテロウイルス、特にエコーウイルスおよびコクサッキーウイルスである。感染経路や疫学的性質は病原体に依存するが、エンテロウイルスに起因する無菌性髄膜炎の場合には、手足口病などと同様に、夏頃に小児を中心に、飛沫感染および糞口感染により流行する。無菌性髄膜炎に対する有効な治療方法はいまだ確立されておらず、ワクチンなどによる予防が期待されている。

ウイルス性疾患に対する予防法としてのワクチンの有効性は、ポリオウイルスに対するワクチンなどの前例から、広く認められている。ワクチンの候補としては、一般的には、弱毒化株、全粒子を初めとする不活化ウイルス、ウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下「ＶＬＰ」と称する）、組換えタンパク質、組換えベクターおよびペプチドなどが知られている。エンテロウイルスに対するワクチンについても、すでに様々な研究および報告がなされており、例えば非特許文献１および非特許文献２にはエンテロウイルスをホルマリンで不活化したワクチンが報告されている。特許文献１にはエンテロウイルスのＶＰ０〜４を含むＶＬＰが報告されている。特許文献２にはエンテロウイルス粒子およびその製造法が報告されている。特許文献３にはエンテロウイルスを含む多様なウイルスのＶＬＰの製造法が報告されている。非特許文献３にはＥＶ７１のＦ粒子の免疫原性が報告されている。非特許文献４にはＥＶ７１不活化ワクチン投与後の、ＥＶ７１遺伝子型間の交差性が報告されている。非特許文献５にはＥＶ７１のＶＰ１〜３を含むＶＬＰがエンテロウイルスに対するワクチンとして報告されている。

また、エンテロウイルスそのものに関する研究もすでに多数なされており、例えば、非特許文献６には、ＥＶ７１に関する概説が示されている。Ｅｕｎ−Ｊｅ Ｙｉらによれば、ＥＶ７１は、直径２０〜３０ｎｍの非エンベロープウイルスカプシドの内部に約７．４ｋｂの一本鎖ＲＮＡが封入された構造を有しており、該カプシドは４つの異なる構造タンパク質（ＶＰ１〜４）のコピー６０個からなる。４つの構造タンパク質がアセンブルしてプロトマーを形成し、５つのプロトマーがアセンブルしてペンタマーを形成し、１２個のペンタマーとウイルスゲノムがビリオンを構成する。ＥＶ７１のサブ遺伝子型は、主にＶＰ１における変異などによって定められている。

特表２０１４−５３２６９１号公報 特表２０１７−５１７５７１号公報 特表２０１５−５２８２８５号公報

Ｌｅｅ ＭＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９： １４９−１５６， ２０１０ Ｘｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ ２８： ３５１６−３５２１， ２０１０ Ｃｈｉａ−Ｃｈｙｉ Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬＯＳ ｏｎｅ， Ｖｏｌ６， Ｉｓｓｕｅ ５， Ｍａｙ ２０１１ Ｌｏｎｇｄｉｎｇ Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１５， １３：２２６ Ｘｉａｏｌｉ Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１３３０−１７， ２０１７ Ｅｕｎ−Ｊｅ Ｙｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓ ２０１７；６：４−１４

本発明は、エンテロウイルスに対するワクチンに関する。具体的には、本発明は、エンテロウイルスに対して免疫原性を示すポリペプチド、当該ポリペプチドの製造方法、当該ポリペプチドを含むエンテロウイルスに対するワクチンおよび当該ポリペプチドを用いたエンテロウイルス関連疾患の予防方法を提供する。より具体的には、本発明のポリペプチドは、エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドである。

ワクチンの有効性は、一般に、免疫原性によって評価される。本発明がエンテロウイルスに対するワクチンを提供するものである以上、本発明のポリペプチドは、エンテロウイルスに対して高い免疫原性を示すことが求められる。すでに実用化されているＥＶ７１に対するワクチンとして、たとえばＳｉｎｏｖａｃ社のＩｎｌｉｖｅが挙げられる。しかしながら手足口病を初めとするエンテロウイルスによって引き起こされる疾患の流行状況を鑑みると、ワクチンの更なる改良や十分な供給体制が望まれる。

本願の発明者らは、上記の課題に鑑みて、高い免疫原性を有するワクチンを製造した。具体的には、エンテロウイルスの構造、特にＶＰ０がＶＰ２とＶＰ４に開裂することに着目し、当該開裂が免疫原性に影響を与えることを見出した。すなわち、免疫原性を示すポリペプチドとしてＶＰ２とＶＰ４を多く含むワクチンを設計することが、高い免疫原性を示すワクチンの提供につながると考えた。エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドを製造し、このポリペプチドがエンテロウイルスに対する免疫原として高い効果を有することを確認して、本発明をなした。

以下に本発明の詳細な説明をするが、本明細書において用いられる用語は、微生物学、生化学、分子生物学、医学および薬学分野における一般的な定義に従って理解される。ただし、本明細書において特に説明または定義されている用語については、本明細書における説明または定義が優先する。また、本明細書中に引用されている文献については、参照により本明細書の一部とする。

第一の態様において、本発明は、エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。

エンテロウイルスには、ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、エコーウイルスおよびその他のエンテロウイルスが含まれるが、とりわけ本発明においては、エンテロウイルスであるＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、特にＡ群エンテロウイルスを主題としている。本発明は、特に手足口病、ヘルパンギーナおよび無菌性髄膜炎などのエンテロウイルス関連疾患の原因であるウイルス、例えば、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、エコーウイルスおよびＥＶ７１を主題としている。より具体的には、本発明は、手足口病の原因であるエンテロウイルス、例えばコクサッキーウイルスＡ群およびＥＶ７１、とりわけコクサッキーウイルスＡ６、１０および１６ならびにＥＶ７１に関係する。さらに本発明は、ヘルパンギーナの原因であるエンテロウイルス、例えばコクサッキーウイルスＡ群、ＥＶ７１、コクサッキーウイルスＢ群ならびにエコーウイルス、特にコクサッキーウイルスＡ群、例えばコクサッキーウイルスＡ２、３、４、５、６および１０に関係する。とりわけ本発明において、近年日本において手足口病の主たる原因となっているＥＶ７１Ｂ型、例えばＥＶ７１Ｂ５型は、興味深い対象である。

エンテロウイルスのカプシドは、プロカプシドと呼ばれるＶＰ０、１及び３の構造タンパク質から形成される場合や、ＶＰ０がＶＰ２と４に開裂し、ＶＰ１〜４の４つ異なる構造タンパク質から形成される場合がある。本明細書において、前者を不完全粒子形状のウイルス、後者を完全粒子形状のウイルスと呼ぶ。

エンテロウイルスのＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４のアミノ酸配列およびそれらをコードする塩基配列は既知であり、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ／ＥＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、ＮＣＢＩ）などのデータベースから容易に入手可能である。たとえばエンテロウイルス７１のＢｒＣｒの配列情報は、ＮＣＢＩ登録番号Ｕ２２５２１から入手可能である。

本発明において、用語「由来の」とは、対象物が元のウイルスと免疫学的な相同性を有すること、または元のウイルスのアミノ酸配列と一定の相同性を示すことを意味し、製造方法に縛られるものではないと理解すべきである。免疫学的な相同性とは、元のウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されることを示す。免疫学的な相同性を確認する方法は、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されないが、一般的には、対象物が発現を誘導する抗体が元のウイルスを中和しうるかどうか、すなわち対象物が発現を誘導する中和抗体を測定することで確認することができる。例えばエンテロウイルス「由来の」との記載は、エンテロウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されること、またはエンテロウイルスのアミノ酸配列と一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味する。アミノ酸配列と一定の相同性とは、典型的には８０％以上、好ましくは９０％以上、例えば９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最適には９９％以上の相同性を有することを意味する。相同性の検定には当業者が通常利用可能なあらゆる検定方法を利用可能であるが、例えばＢＬＡＳＴを初期設定のパラメーターで用いることができる。

一例をあげると、エンテロウイルス由来のＶＰ１であるといえるためには、まず、問題となっているポリペプチドのアミノ酸配列が、ＮＣＢＩから取得したいずれかのエンテロウイルスのＶＰ１のアミノ酸配列とデフォルトパラメーターを用いたＢＬＡＳＴで一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味し、典型的には８０％以上、好ましくは９０％以上、例えば９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最適には９９％以上の相同性を有することを意味する。

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、改変体作製において考慮される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。

したがって、本発明において、ポリペプチドは保存的置換されていてもよい。保存的置換とは、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン、などが挙げられるが、これらに限定されない。かかる保存的置換もまた、本発明において、「由来の」なる用語の範囲に含まれる。

本発明において、プロテアーゼは、アミノ酸間のペプチド結合を分解するあらゆる酵素を意味し、その対象がタンパク質、高分子ペプチドあるいは低分子ペプチドのいずれであるかを問わない。本発明において好ましいプロテアーゼとしては、ＶＰ２とＶＰ４の結合部位を特異的に認識可能であって他のペプチド結合に影響しないことが望ましいことから、基質特異性の高いもの、例えばシステインプロテアーゼ、３Ｃプロテアーゼ、３ＣＤプロテアーゼなどがあげられる。

基質特異性の高いプロテアーゼは、無作為にペプチド結合を分解するものではなく、それぞれ特定のアミノ酸配列を認識して特異的にペプチド結合を切断する。したがって、１種のプロテアーゼを選択すれば、そのプロテアーゼが認識可能なアミノ酸配列は一意に決定できる。あるプロテアーゼがどのようなアミノ酸配列を認識するかは、各種文献、例えばプロテアーゼを販売する事業者の説明書などに記載されている。３Ｃプロテアーゼまたは３ＣＤプロテアーゼの場合、認識するアミノ酸配列はＸ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘであり、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ間で切断が生じる。例えばＨＲＶ３Ｃプロテアーゼの場合、フナコシ社の提供する説明書から、認識するアミノ酸配列がＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏであり、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ間で切断が生じることが理解可能である。

本発明において、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列は、プロテアーゼに依存して決定されるものである。エンテロウイルスのＲＮＡには３Ｃプロテアーゼまたは３ＣＤプロテアーゼをコードする塩基配列が含まれていることから、本発明のポリペプチドにおいて、当該プロテアーゼが認識するアミノ酸配列としてＸ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘというグルタミン及びグリシンが連続した配列が好ましい。例えば、本発明のポリペプチドにおいて、３Ｃプロテアーゼまたは３ＣＤプロテアーゼでＶＰ２とＶＰ４の結合部位が基質特異的に切断される結果、ＶＰ２のＮ末端にはグリシンが、ＶＰ４のＣ末端にはグルタミンが現れる。かかるプロテアーゼが認識するアミノ酸配列は、野生型のアミノ酸配列と比較したときに置換、挿入、欠失または付加のいずれの変異であってもよい。

したがって、好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。

別の好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にシステインプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。

より好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位に３Ｃまたは３ＣＤプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。

より好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４とがグルタミン及びグリシンが連続した配列を介して連結していることを特徴とするポリペプチドを提供する。

別の好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２のＮ末端にグリシンを、当該ＶＰ４のＣ末端にグルタミンを含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。

更に本発明者らは、天然のエンテロウイルスには完全粒子形状と不完全粒子形状のウイルスが混在していることを鑑み、エンテロウイルスから完全粒子形状のウイルスを抽出することで、不完全粒子形状のウイルスよりも高い免疫原性を有する抗原を設計しうることを見出した。したがって、さらなる態様において、本発明は、エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まないことを特徴とするポリペプチドを提供する。ＶＰ０は、約３６ｋＤａのポリペプチドであり、約２８ｋＤａのＶＰ２と約８ｋＤａのＶＰ４を含む。

本発明において、用語「実質的に含まない」とは、定量的に測定した場合にその含有量が主成分と比較して３０％以下、例えば２０％以下、例えば１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは１％以下であることを意味する。ここでは主成分は単に量的に主たる成分を意味し、性質的に主であることを意図するものではない。定量的測定に利用可能な手段は当業者が通常選択可能ないずれかの方法であってよく、含有量はその測定方法が提供する通常の定量単位を用いて把握される。例えば、ウェスタンブロット法を用いてＶＰ０を検出して、ＶＰ０と結びついた発光色素の発光強度が、ＶＰ２と結びついた発光色素の発光強度と比較して、３０％以下、例えば２０％以下、例えば１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは１％以下である場合に、ＶＰ０を「実質的に含まない」ものと理解される。ウェスタンブロット法はゲルに添加したタンパク質混合物を電気泳動によって分子量に従って分離し、メンブレンに転写して、当該メンブレンを化学発光で分析するものであり、使用するゲル、試薬、メンブレン、スタンダードおよび装置などは当業者であれば適宜選択できる。

具体的には、例えば、ウェスタンブロット法を実行して、ＶＰ０を実質的に含まないことを確認することができる。

したがって、好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まないことを特徴とするポリペプチドを提供する。

本発明のポリペプチドは、当業者が通常利用可能なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質製造方法のいずれかを用いて製造することができる。かかる方法は、これらに限定されるものではないが、化学合成、ウイルス不活化および細胞発現系を含む。具体的な製造方法やそこで使用される試薬、条件および装置等は、当業者であれば、容易に選択することができる。例えば市販のタンパク質発現キットを、当該キットに添付の説明書に従って、利用することができる。

好ましい本発明のポリペプチドの製造方法は、量およびコストの観点から、ウイルス不活化または細胞発現系を用いた方法である。ウイルス不活化はワクチンにおいて通常使用されるホルマリン処理等のあらゆる方法によって行うことができる。細胞発現系を用いた方法としては、利用可能な発現ベクターおよび細胞には特に制限はないが、例えば、市販のベクターおよび細胞を、当該製品に添付の説明書に従って、利用することができる。かかるベクターには、これらに限定されないが、例えば、ＨａｌｏＴａｇベクター、ｐＨＥＫ２９３ベクター、ＢａｃＰＡＫベクター、ｐＲＩ１０１ＤＮＡベクター、バキュロウイルスベクター、ｐｃＤＮＡベクター、ｐＣＨＯ１．０ベクター等が含まれ、使用する細胞に応じて適宜選択される。利用可能な細胞としては、これらに限定されないが、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、大腸菌細胞、カイコ細胞、タバコ葉細胞等が含まれる。

本発明のポリペプチドは、ヒトに投与することが意図されていることから、哺乳類細胞を用いた発現系が好ましい。他の細胞、例えば大腸菌、植物および昆虫細胞を用いた発現系でも本発明のポリペプチドを製造することは可能であるが、翻訳後修飾の観点から、哺乳類細胞を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドを製造するのに好適な哺乳類細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞が挙げられる。当該細胞を用いた発現系としては、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されないが、例えば、プラスミドのトランスフェクションによる一過性発現系でもよく、安定的に目的のポリペプチドを発現する宿主細胞（以下、安定発現細胞）を構築してもよい。

一例として、本発明のポリペプチドを製造するためにウイルス不活化方法を用いる場合、次の工程に従って製造できる：
・細胞培養にてエンテロウイルスを増殖させる工程
・ウイルス液をろ過処理する工程
・処理後ウイルス液をショ糖密度勾配遠心法にて完全粒子に該当するウイルス分画を取得する工程
・当該ウイルス分画を不活化することで、目的のポリペプチドを取得する工程。

一例として、本発明のポリペプチドを製造するために細胞発現系を用いる場合、次の工程に従って製造できる：
・エンテロウイルスからＲＮＡを抽出するか、または人工合成によりＲＮＡをデザインする工程
・ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅し、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションした細胞を増殖させる工程、または安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程。

上記製造方法のいずれの工程においても、当業者であれば、試薬、条件、装置等について、容易に選択可能である。また、各工程において、意図した結果が得られているかを確認するための工程を適宜挿入することができる。かかる確認工程としては、例えば、抽出したＲＮＡの配列を適当なシークエンス法、例えばサイクルシークエンス法やパイロシークエンス法等で確認することや、得られたポリペプチドをウェスタンブロット法等によって確認することが含まれる。

ＶＰ０をプロテアーゼによって開裂させてＶＰ２とＶＰ４とするために、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列となるように変異を導入することができる。変異を導入するために元の塩基配列を置換、挿入、欠失または付加してもよいが、これらに限定されない。エンテロウイルスからＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅させ、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程において、変異導入は、ライゲーション時に行ってもよいし、ライゲーションの前または後に行ってもよい。挿入または置換されるプロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列は、コドン表を用いて容易に決定することができる。例えば、３Ｃプロテアーゼまたは３ＣＤプロテアーゼを用いる場合には、当該プロテアーゼが認識するＧｌｎ−Ｇｌｙをコードする塩基配列、例えばＣＡＡＧＧＵが用いられる。変異導入の具体的方法は、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されないが、例えば、インバースＰＣＲ法、相補的プライマー法等を含む。例えば、市販の変異導入キットを当該キットに添付の説明書に従って使用することができる。

したがって、ある態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
・エンテロウイルスからＲＮＡを抽出する工程
・ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅し、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・ライゲーションした発現用プラスミドに、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異導入する工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程、または安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。

また、別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
・エンテロウイルスからＲＮＡを抽出する工程
・抽出したＲＮＡに、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異導入する工程
・ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅し、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程、または安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
・エンテロウイルス由来のＶＰ１〜４をコードする塩基配列を含むＲＮＡであって、ＶＰ４をコードする塩基配列とＶＰ２をコードする塩基配列との間に、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＲＮＡを合成する工程
・ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅し、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程、または安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した発現細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。

このようにして製造された本発明のポリペプチドは、リン酸化やグリコシル化等の修飾を受けうる。かかる修飾を受けたポリペプチドもなお、本発明のポリペプチドに含まれる。修飾には、例えば、発現細胞の翻訳後修飾が含まれる。

また、本発明のポリペプチドは、様々な相互作用によって、いずれかの三次または四次構造をとりうる。例えば、本発明のポリペプチド内のイオン結合、水素結合、ジスルフィド結合等によってＶＰ１〜４の各サブユニットの折り畳みが生じて三次構造を形成し、次いでＶＰ１〜４の各サブユニットがアセンブルして、四次構造を形成しうる。かかる高次構造は、一般的に、天然のウイルス粒子に構造上近似しているほど、高い免疫原性を示す。本発明においては、更に完全粒子形状に構造上近似しているほど、高い免疫原性を示す。したがって、好ましい態様において本発明のポリペプチドは、完全粒子形状のＶＬＰまたは不活化ウイルスである。

さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを製造するための発現カセットを提供する。発現カセットは、目的遺伝子と当該目的遺伝子の転写を開始するために操作可能に結合したプロモーターの組み合わせであり、ベクターに導入して使用する。本発明において、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１〜４、プロテアーゼならびに当該プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする核酸ならびに当該核酸の転写を開始するプロモーターを含む発現カセットもまた、意図される。

本発明者らは、本発明のポリペプチドがエンテロウイルスに対する高い免疫原性を有することを見出した。したがって、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス、より好ましくはエンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスＡ６、コクサッキーウイルスＡ１０またはコクサッキーウイルスＡ１６、さらに好ましくはエンテロウイルス７１Ｂ型、例えばエンテロウイルス７１Ｂ５型に対するワクチンであって、本発明のポリペプチドを抗原として含むことを特徴とする、ワクチンを提供する。

本発明において、用語「ワクチン」は、特定の病原体、例えばウイルス、細菌等に対する免疫力を高めることができる、抗原を含む医薬製剤を意味する。予防ワクチンと治療ワクチンのいずれであるかを問わないが、本発明においては、とりわけ予防ワクチンが意図される。予防ワクチンは、いまだ罹患していない対象にワクチンを投与して、特定の病原体に対する免疫応答を体内で誘発させて、病原体に対する免疫力を高めることによって、その病原体への感染や重症化を予防するための医薬製剤である。ワクチンの投与経路は、これらに限定されないが、例えば、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、経皮投与、経口投与などがありうる。

本発明において、疾患は、エンテロウイルス関連疾患、例えばエンテロウイルスＡ〜Ｄ群関連疾患、典型的にはＡ群エンテロウイルス関連疾患を指し、具体的には、例えば手足口病、ヘルパンギーナおよび無菌性髄膜炎、とりわけ手足口病およびヘルパンギーナである。

本発明のワクチンは、抗原の他に、ワクチンで通常使用される添加物を含んでいてよい。かかる添加物には、担体、防腐剤およびアジュバント等が含まれる。例えば、担体には、水または生理食塩水が含まれる。例えば、防腐剤には、フェノール、塩化ベンゼトニウム、２−フェノキシエタノール、チメロサール等が含まれる。例えば、アジュバントには、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、リン酸カルシウム、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンド分子、ｄｓＲＮＡ、ＩＬ−１２等が含まれる。これらの添加物は、当業者であれば、投与経路等の様々な要因を考慮して、適宜選択可能である。

本発明のワクチンの対象は、エンテロウイルスに感染しうる動物、例えば哺乳類、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が含まれる。典型的な対象は、ヒトであり、とりわけエンテロウイルスに感染しやすい５歳未満のヒトであるが、これに限定されない。

本発明のポリペプチドは、エンテロウイルスに対する高い免疫原性を有する。本発明のポリペプチドの免疫原性を確認するために、本発明者らは、抗原たん白質としてＶＰ１〜４を含むポリペプチドを製造し、動物への免疫を行い、中和抗体価を測定した。一方で、比較対象として抗原たん白質としてＶＰ０、１及び３を含むポリペプチドを製造し、同様に中和抗体価を測定した。

詳細な手法および結果は実施例に譲るが、本発明のポリペプチド、すなわちＶＰ１〜４を含むポリペプチドは、ＶＰ０、１及び３を含むポリペプチドと比較して、高い中和抗体誘導能を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、エンテロウイルスに対する高い免疫原性を有し、エンテロウイルスに対するワクチンの抗原として利用可能である。

不活化ワクチンのショ糖密度勾配遠心（１０〜４０％）分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットの結果を示す。 不活化ワクチンの中和抗体価を示す。 ＥＶ７１のＶＰ１〜４、２Ａ自己開裂配列、３ＣＤプロテアーゼおよびＣＭＶプロモーターを含む、ＥＶ７１のＶＬＰ発現カセットを示す。 精製済みＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットの結果を示す。 ＣＨＯ細胞発現系を用いて製造したＥＶ７１のＶＰ１〜４を含むＶＬＰのＴＥＭイメージを示す。 ＥＶ７１のＶＰ１〜４を含むＶＬＰならびにＥＶ７１のＶＰ０、１および３を含む不完全粒子の中和抗体価を示す。

不活化ウイルスによるＥＶ７１のＶＰ１〜４を含む完全粒子の作成
ＲＤ−Ａ細胞を用いてＥＶ７１を培養した（セルスタック、１０チャンバー、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）。−８０℃で保存しておき、使用前に融解して細胞を破砕して、ウイルス液を得た。ウイルス液を遠心分離し、濾過（０．４５μｍ→０．２２μｍ）して細胞残渣を除去した。濾液をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ ｆｌｕｘ ｓ（分子量カットオフ値５００ｋ）を用いて、限外濾過濃縮した。Ｈｉｔａｃｈｉ社の超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘを用いてウイルス粒子のペレットを作成した。ペレットをＰＢＳ中に一晩懸濁させて再浮遊させた。次いで、懸濁液を超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘによるショ糖密度勾配遠心法（１０〜４０％）を用いて分画を得て、各分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング（ＷＢ）によって、完全粒子および不完全粒子画分を確認した。結果を図１に示す。完全粒子は３５％前後（約１．１５ｇ／ｍＬ）の、不完全粒子は２５％前後（約１．１１ｇ／ｍＬ）のショ糖密度勾配に収束した。完全粒子および不完全粒子画分をＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａを用いて濃縮した。ホルマリンを用いてウイルスの不活化を行い、不活化したウイルス液をＲＤ−Ａ細胞に接触することで不活化の確認を行った。

ＥＶ７１の完全粒子構造を含む不活化ウイルスおよび不完全粒子構造を含む不活化ウイルスでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、血清を採取して中和抗体価を測定した。まず、４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに完全粒子構造を含む不活化ウイルスおよび不完全粒子構造を含む不活化ウイルスを０．１μｇ注射してそれぞれ免疫し、６週齢および８週齢でそれぞれ同量追加免疫した。１０週齢で全採血を行い、約０．８ｍＬの血清を得た。マウス血清を２倍段階希釈して１／２〜１／４０９６の希釈系列を作成し、各希釈系列に５×１０^３ＰＦＵ／ｍＬに調製したＥＶ７１ウイルス液を添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間反応させてウイルスを中和した。マウス血清を含まないものをネガティブコントロールとした。前日に播種しておいたＲＤ−Ａ細胞（６ウェルプレート）に中和反応液を添加し、３７℃で、１時間、１５分おきにプレートを振盪して、ウイルスを細胞に感染させた。ウイルス液を吸引除去した後、メチルセルロースを添加して重層した。３７℃、５％ＣＯ_２で５日間培養し、メチルセルロースを吸引除去した後、１０倍希釈したホルムアルデヒド液で細胞を固定した。クリスタルバイオレットで細胞を染色して、プラーク数をカウントした。ネガティブコントロールのプラーク数を１００％として、中和反応液を添加したウェルのプラーク数が２０％以下となった最大希釈率を抗体価として算出した。結果を図２に示す。

細胞発現系によるＥＶ７１のＶＰ１〜４を含むＶＬＰの作成
Ｒｏｃｈｅ社のＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔを添付の説明書に従って使用して、ＥＶ７１
からＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡのＶＰ１〜４領域およびプロテアーゼ領域を、ＴａＫａＲａ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを添付の説明書に従って使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。得られた増幅ＤＮＡ断片を発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３．４にライゲーションし、当該プラスミドにインバースＰＣＲ法によってＧｌｎ−Ｇｌｙ変異を挿入した。ＴａＫａＲａ社のＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓに、添付の説明書に従って、変異導入したプラスミドをトランスフォーメーションした後、細胞を培地に播種して増殖させた。得られた大腸菌細胞から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ ｋｉｔを添付の説明書に従って使用して、ＶＬＰ発現用プラスミドを抽出した。得られたプラスミド中のＥＶ７１のＶＬＰ発現カセットを図３に示す。ＶＬＰ発現カセットには、ＥＶ７１のＶＰ１〜４、２Ａ自己開裂配列、３ＣＤプロテアーゼおよびＣＭＶプロモーターが含まれている。

Ｔｈｅｒｍｏ社のＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを添付の説明書に従って用いて、ＶＬＰ発現用プラスミドからＶＰ１〜４を含むＶＬＰを製造した。まず、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞をＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍで所定の細胞密度に達するまで培養した。培養したＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞にＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ で希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ ＲｅａｇｅｎｔおよびＶＬＰ発現用プラスミドを加えて、トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍで培養し、ＥｘｐｉＣＨＯ ＦｅｅｄおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加し、さらに培養を続けた。培養期間中、細胞生存率を確認し、トランスフェクションから８日後に、培養を停止し、収穫した。得られた培養液を遠心分離して細胞と上清を分離し、上清を回収して、フィルター濾過した（０．２２μｍ）。得られた上清を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ ｆｌｕｘ ｓを分子量カットオフ値５００ｋで用いて、限外濾過濃縮した。Ｈｉｔａｃｈｉ社の超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘを用いてＶＬＰのペレットを作成した。

ＥＶ７１のＶＰ１〜４を含むＶＬＰの確認
ＶＬＰのペレットをＰＢＳ中に一晩懸濁させて再浮遊させた。さらに、懸濁液を超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘによるショ糖密度勾配遠心（１０〜４０％）にかけて分画を得て、各分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング（ＷＢ）にかけて、ＶＬＰ画分を確認した。結果を図４に示す。これより、ＥＶ７１のＶＰ０が開裂されＶＰ２画分量が増加したＶＬＰの作出を確認した。ＶＬＰ分画をＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａを用いて濃縮した。透過電子顕微鏡でＶＬＰの粒子構造を確認した（図５）。

中和試験による免疫原性の評価
Ｇｌｎ−Ｇｌｙ変異を挿入する以外は同様にして、比較例としてＥＶ７１のＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３を含む不完全粒子構造のＶＬＰを作成した。結果を図４に示す。不活化ウイルスを用いたときと同様に、中和試験による免疫原性の評価を行った。結果を図６に示す。

Claims (17)

1. エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ４とＶＰ２の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。
2. 前記プロテアーゼが３Ｃまたは３ＣＤプロテアーゼであることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記プロテアーゼが認識するアミノ酸配列が、グルタミン及びグリシンが連続した配列であることであることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
4. エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むポリペプチドであって、ＶＰ２のＮ末端にグリシン及びＶＰ４のＣ末端にグルタミンを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
5. ウイルス様粒子であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
6. エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含み、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まないことを特徴とする、ポリペプチド。
7. 不活化全粒子であることを特徴とする、請求項６のいずれかに記載のポリペプチド。
8. エンテロウイルスがＡ〜Ｄ群のいずれかのエンテロウイルスであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
9. エンテロウイルスがＡ群エンテロウイルスであることを特徴とする、請求項８に記載のポリペプチド。
10. Ａ群エンテロウイルスが、エンテロウイルス７１またはコクサッキーウイルスＡ６またはコクサッキーウイルスＡ１０またはコクサッキーウイルスＡ１６であることを特徴とする、請求項９に記載のポリペプチド。
11. エンテロウイルス７１が、エンテロウイルスＢ型であることを特徴とする、請求項１０に記載のポリペプチド。
12. エンテロウイルス７１Ｂ型が、エンテロウイルス７１Ｂ５型であることを特徴とする、請求項１１に記載のポリペプチド。
13. エンテロウイルスに対するワクチンであって、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドを抗原として含むことを特徴とする、ワクチン。
14. Ａ群エンテロウイルスに対するワクチンであることを特徴とする、請求項１３に記載のワクチン。
15. エンテロウイルス７１に対するワクチンであることを特徴とする、請求項１３に記載のワクチン。
16. エンテロウイルス７１Ｂ型に対するワクチンであることを特徴とする、請求項１３に記載のワクチン。
17. エンテロウイルス７１Ｂ５型に対するワクチンであることを特徴とする、請求項１３に記載のワクチン。
    

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