CN114540315B - 一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株 - Google Patents

一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株 Download PDF

Info

Publication number
CN114540315B
CN114540315B CN202111209995.9A CN202111209995A CN114540315B CN 114540315 B CN114540315 B CN 114540315B CN 202111209995 A CN202111209995 A CN 202111209995A CN 114540315 B CN114540315 B CN 114540315B
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ala
val
ser
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111209995.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114540315A (zh
Inventor
申硕
禹玉婷
吕诗韵
刘睿伦
胡岗
卢佳
郭靖
孟胜利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Original Assignee
WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD filed Critical WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority to CN202111209995.9A priority Critical patent/CN114540315B/zh
Publication of CN114540315A publication Critical patent/CN114540315A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114540315B publication Critical patent/CN114540315B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32051—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种热稳定的柯萨奇病毒A组2型病毒株。所述的柯萨奇病毒CV‑A2的热稳定株能够耐受60℃以下的高热处理；其蛋白质组中，包含如下突变位点：(1)VP2蛋白第160位氨基酸为丙氨酸(A)；(2)VP3蛋白第42位氨基酸为丝氨酸(S)；第62位氨基酸位甲硫氨酸(M)；第203位氨基酸为亮氨酸(L)；第206位氨基酸为异亮氨酸(I)；(3)VP1蛋白第12位氨基酸为缬氨酸(V)；第110位氨基酸为缬氨酸(V)；第284位氨基酸为组氨酸(H)；第291位氨基酸为丙氨酸(A)；(4)3C蛋白区第42位氨基酸为组氨酸(H)；(5)3D蛋白区第74位氨基酸为异亮氨酸(I)；第134位氨基酸为苏氨酸(T)；第190位氨基酸为丙氨酸(A)；第363位氨基酸为半胱氨酸(C)；第380位氨基酸为亮氨酸(L)；第442位氨基酸为异亮氨酸(I)。

Description

一种热稳定的柯萨奇病毒A组2型病毒株
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体的，涉及一种热稳定的柯萨奇病毒A组2型病毒株。
背景技术
手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)是主要在夏秋季节流行的传染性疾病，由多种肠道病毒感染引起，曾经在全世界范围内多次暴发。患者主要为5岁以下幼儿，为主要发病人群。临床症状主要表现为手、足和口腔黏膜等处疱疹，部分患者伴随着发热，少数患者出现心肌炎、无菌性脑炎、心脏衰竭、肺炎、肺水肿和弛缓性麻痹等严重并发症,甚至导致死亡。1957年HFMD首次出现在新西兰的报道中，随即，1958年，Robinson第一次分离得到柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)。1959年英国伯明翰报道了相似病症，并且从患者的疱疹液中分离得到了CV-A16，再次证明此类肠道病毒与HFMD的联系，从而根据疾病的临床特征提出HFMD的命名。
二十一世纪以来，HFMD已成为世界性严重的公共卫生问题之一，特别是在西太平洋等中低纬度地区。目前，我国***已经将HFMD纳入国家法定传染病监测***。
中国疾病预防控制中心对HFMD实验室诊断病例进行血清分型鉴定，结果显示，肠道病毒EV-A71和柯萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16，CV-A16)是引起HFMD的主要病原体，但是非EV-A71、非CV-A16引起的普通病例、重症病例逐年升高。而非EV-A71、非CV-A16肠道病毒引起HFMD的比例升高，其中包括CV-A2，病原谱发生改变。
关于肠道病毒的热稳定性研究，脊髓灰质炎病毒和EV-A71有文献报道。在肠道病毒VP1结构蛋白中，存在一个称为疏水口袋的结构，它带有一种称为“口袋因子”的疏水脂质，“口袋因子”对于维持病毒衣壳的稳定起着重要的作用。当“口袋因子”丢失，疏水口袋构象发生改变，衣壳蛋白稳定性降低，病毒遇热易降解，从而免疫原性降低。Adeyemi等找到了脊髓灰质炎病毒VP1疏水口袋上与热稳定相关的位点，验证了这些位点在衣壳稳定性中发挥作用。Kelly等找到了涉及热稳定性的位点，确定了在VP1上的位置，并且证明了病毒与“口袋因子”的相互作用方式。有证据显示，热稳定株的免疫原性较热不稳定株强，能刺激动物产生更高水平的中和抗体。
参考文献
[1]PRAGER P,NOLAN M,ANDREWS IP,et al.Neurogenic pulmonary edema inenterovirus 71 encephalitis is not uniformly fatal but causes severemorbidity in survivors[J].Pediatric Critical Care Medicine,2003,4(3):377-381.
[2]TSUNETSUGU Y,MORIKAWA Y,ISOGAI M,et al.Yeast-derived humanimmunodeficiency virus type 1p55(gag)virus-like particles activate dendriticcells(DCs)and induce perforin expression in Gag-specific CD8(+)T cells bycross-presentation of DCs[J].Journal of Virology,2003,77(19):10250-10259.
[3]FLEWETT TH,WARIN RP,CLARKE SK.'Hand,foot,and mouth disease'associated with Coxsackie A5 virus[J].Journal of Clinical Pathology,1963,16:53-55.
[4]SOLOMON T,LEWTHWAITE P,PERERA D,et al.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71[J].Lancet Infectious Diseases,2010,10(11):778-790.
[5]MCMINN PC.An overview of the evolution of enterovirus 71and itsclinical and public health significance[J].FEMS Microbiology Reviews,2002,26(1):91-107.
[6]KIM H,KANG B,HWANG S,et al.Clinical and enterovirus findingsassociated with acute flaccid paralysis in the republic of Korea during therecent decade[J].Journal of Medical Virology,2014,86(9):1584-1589.
[7]CISTERNAD M,PALACIOS G,RIVERO K,et al.Epidemiology of enterovirusassociated with neurologic diseases[J].Medicina,2007,67(2):113-119.
[8]KUMAR A,SHUKLA D,KUMAR R,et al.Molecular identification ofenteroviruses associated with aseptic meningitis in children from India[J].Archives of Virology,2013,158(1):211-215.
[9]YEN TY,HUANG YP,HSU YL,et al.A case of recombinant coxsackievirusa2 infection with neurological complications in Taiwan[J].Journal ofMicrobiology Immunology and Infection,2016,50(6):928-930.
[10]YAMASHITA T,ITO M,TANIGUCHI A,et al.Prevalence of coxsackievirusA5,A6,and A10 in patients with herpangina in Aichi Prefecture,2005[J].Japanese Journal of Infectious,2005,58(6):390-391.
[11]PARK K,LEE BH,BAEK KA,et al.Enteroviruses isolated fromherpangina and hand-foot-and-mouth disease in Korean children[J].VirologyJournal,2012,9(1):205.
[12]DAVIA JL,BEL PH,NINET VZ,et al.Onychomadesis outbreak inValencia,Spain associated with hand,foot,and mouth disease caused byenteroviruses[J].Pediatric Dermatology,2011,28(1):1-5.
[13]ADEYEMI OO,NICOL C,STONEHOUSE JN,et al.Increasing type1poliovirus capsidstability by thermal selection[J].Journal of Virology,2017,91(4):e01586-01516.
[14]KELLY JT.The enterovirus 71particle:An evolutionary approach toinvestigate structure and function with implications for drug and vaccinedevelopment[D].United Kingdom:The University of Leeds,2015.
发明内容
本发明首先涉及一种柯萨奇病毒CV-A2热稳定株，其特征在于，所述的柯萨奇病毒CV-A2的热稳定株能够耐受60℃以下的高热处理；其蛋白质组中，包含如下突变位点：
(1)VP2蛋白第160位氨基酸为丙氨酸(A)；
(2)VP3蛋白第42位氨基酸为丝氨酸(S)；VP3蛋白第62位氨基酸位甲硫氨酸(M)；VP3蛋白第203位氨基酸为亮氨酸(L)；VP3蛋白第206位氨基酸为异亮氨酸(I)；
(3)VP1蛋白第12位氨基酸为缬氨酸(V)；VP1蛋白第110位氨基酸为缬氨酸(V)；VP1蛋白第284位氨基酸为组氨酸(H)；VP1蛋白第291位氨基酸为丙氨酸(A)；
(4)3C蛋白区第42位氨基酸为组氨酸(H)；
(5)3D蛋白区第74位氨基酸为异亮氨酸(I)；3D蛋白区第134位氨基酸为苏氨酸(T)；3D蛋白区第190位氨基酸为丙氨酸(A)；3D蛋白区第363位氨基酸为半胱氨酸(C)；3D蛋白区第380位氨基酸为亮氨酸(L)；3D蛋白区第442位氨基酸为异亮氨酸(I)。
优选的，所述的柯萨奇病毒CV-A2热稳定株为CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株，其能够在52℃以下的高热环境中增殖，CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株蛋白质组的全序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，基因组编码结构蛋白为VP4，VP2，VP3，VP1及非结构蛋白2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D
VP4蛋白为第1-69位氨基酸序列；
VP2蛋白为第70-324位氨基酸序列；
VP3蛋白为第325-564位氨基酸序列；
VP1蛋白为第565-859位氨基酸序列；
2A蛋白为第860-1009位氨基酸序列；
2B蛋白为第1010-1108位氨基酸序列；
2C蛋白为第1109-1437位氨基酸序列；
3A蛋白为第1438-1523位氨基酸序列；
3B蛋白为第1524-1545位氨基酸序列；
3C蛋白为第1546-1728位氨基酸序列；
3D蛋白为第1729-2191位氨基酸序列。
本发明还涉及编码所述柯萨奇病毒CV-A2热稳定株的核苷酸片段，优选的，所述的编码核酸片段的序列相比与野生型柯萨奇病毒CV-A2的基因组(SEQ ID NO.1所示序列)具有如下突变，
该热稳定株编码区同义核苷酸突变及位置分别为：VP2-T963C；VP2-C1125T；VP2-A1173G；VP2-T1215C；VP2-G1326A；VP2-A1408G；VP2-C1503T；VP2-G1515A；VP2-G1587A；VP2-G1677A；VP3-C1773T；VP3-A1820G；VP3-A1824G；VP3-G1879A；VP3-T1894C；VP3-C1947T；VP3-T2121C；VP3-C2214T；VP3-C2303T；VP3-C2312T；VP3-T2319C；VP3-T2332C；VP3-A2355G；VP1-C2418T；VP1-T2436C；VP1-A2449G；VP1-T2592C；VP1-T2715C；VP1-G2744T；VP1-G2823A；VP1-G2979A；VP1-T2991C；VP1-T3057C；VP1-A3264T；VP1-C3266A；VP1-A3286G；2A-C3312T；2A-C3366T；2A-T3396C；2A-C3513T；2A-C3624T；2A-C3699T；2A-C3720T；2B-T3759C；2B-C3879T；2B-G3987C；2C-G4347A；2C-C4464T；2C-C4512T；2C-T4542C；2C-T4578C；2C-C4641T；2C-T4785C；3A-T5058C；3A-G5241A；3A-T5289C；3B-A5316G；3C-T5370C；3C-T5412C；3C-A5484C；3C-C5542T；3C-C5598T；3C-T5619C；3C-C5662T；3C-A5688T；3C-G5808A；3C-G5862A；3D-G5910A；3D-C6048T；3D-C6084T；3D-G6127A；3D-T6308C；3D-C6393T；3D-A6475G；3D-T6568C；3D-T6666C；3D-G6723A；3D-T6726C；3D-G6732A；3D-C6747T；3D-T6753C；3D-T6801C；3D-T6813C；3D-C6819T；3D-G6828A；3D-C6861T；3D-G6870A；3D-T6873C；3D-C6876T；3D-C6885T；3D-T6888C；3D-G6891A；3D-C6894T；3D-C6912T；3D-T6930C；3D-A6948G；3D-A6957G；3D-C6963T；3D-T6984C；3D-C6994T；3D-A6995G；3D-C6999T；3D-T7008C；3D-C7029T；3D-G7032C；3D-A7035G；3D-T7044C；3D-A7045T；3D-C7053T；3D-A7059G；3D-C7062T；3D-T7083C；3D-C7101T；3D-C7140T；3D-G7167A；3D-G7200A；3D-T7218C；3D-A7221G；3D-G7231A；3D-G7263A；3D-C7275T；
编码区错义突变的核苷酸和氨基酸及位置分别为：VP2-A1408G/T160A；VP3-A1820G/N42S；VP3-G1879A/V62M；VP3-C2303T/P203L；VP3-C2312T/T206I；VP1-A2449G/M12V；VP1-G2744T/G110V；VP1-C3266A/P284H；VP1-A3286C/T291A；3C-A5484C/Q42H；3D-G6127A/V74I；3D-T6308C/I134T；3D-A6475G/T190A；3D-C6994T/H363C；3D-A7045T/M380L；3D-G7231A/V442I。
本发明还涉及所述的CV-A2热稳定毒株的培养方法，其特征在于，使用RD或Vero作为分离、传代和适应培养所述CV-A2毒株宿主细胞。
本发明还涉及所述的CV-A2热稳定毒株在制备疫苗中的应用，优选的，所述的疫苗为针对手足口病的疫苗。
本发明的有益效果在于，通过细胞培养病毒技术，获得CV-A2热稳定株(CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017)，通过对病毒株进行全基因组的序列测定和比对，发现影响CV-A2毒株在52℃下增殖的相关核苷酸及氨基酸位点。此毒株为CV-A2相关细胞嗜性，细胞生长特性，致病机理研究及疫苗研发中动物模型建立，免疫原性研究以及抗病毒药物的筛选提供了基础。
(1)本发明获得了CV-A2热稳定株，可根据热稳定株相关突变位点对毒株进行定位改造，获得稳定性强、免疫原性强的灭活疫苗株。
(2)根据本发明获得的热稳定株序列构建表达VLP，可以突破肠道病毒VLP疫苗免疫原性差的技术瓶颈。
附图说明
图1、反复热处理传代后热处理株的滴度测定。
图2、CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株接种RD细胞的细胞病变状态，用CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017感染RD细胞，镜下见细胞核皱缩，变圆，脱落，透光度下降等病变现象。
图3、3a：间接免疫荧光检测CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株的热处理后感染RD细胞，细胞的病变状态；3b：间接免疫荧光检测CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株的热处理后感染RD细胞，细胞的病变状态。
图4：CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株耐热处理能力比较。
具体实施方式
实施例1：热稳定株的筛选
(1)对病毒样品CV-A2-2703R3/CHN XY/2017(该毒株为申请人自行保存，分离自患者临床样本)进行滴度测定。
(2)将病毒样品在52℃处理30min，立即4℃保存。
(3)对处理后的样品进行滴度测定。
(4)将滴度下降99.99％的样品，置5％CO2孵箱中，37℃培养至病变。
(5)收获病毒液后，1,500g离心10min，弃沉淀，收获上清，测定滴度。
(6)病毒样品在人横纹肌瘤细胞(RD细胞)继续传代。
(7)重复(2)-(6)，直至滴度上升至与未处理样品一致。
(8)收获病毒液，1,500g离心10min，弃沉淀，收获上清，EP管-20℃冰箱保存。
筛选9轮后，病毒滴度上升至与CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株一致，获得CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株。9轮筛选过程中，CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株反复热处理传代后热处理株的滴度测定结果如图1所示。
实施例2：间接免疫荧光检测毒株的热稳定特性
(1)待RD细胞长至对数生长期，加入细胞培养基调整细胞密度，以密度为5×105cells/mL为宜，然后再将细胞悬液加入6孔板，每孔2-3mL，吸附1～2h。
(2)CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株52℃处理30min，立即4℃保存。
(3)吸出培养基，分别按MOI＝0.5加入相应量的热处理后的CV-A2-2703R3-52/CHNXY/2017株和CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株病毒液，5％CO2孵箱中，37℃培养36h。
(4)吸附完后，取出6孔板，用PBS溶液清洗6孔板3次，每次5min。
(5)加入4％多聚甲醛固定液，室温(RT)固定15min，然后用PBS溶液至少清洗3次，每次5min。
(6)透化并封闭：加入5％BSA+0.5％TritonX-100+PBS，室温放置1h。PBS溶液至少清洗3次，每次5min。
(7)加一抗：抗CV-A2 VLP兔多抗(1:500)，37℃孵育1h或4℃过夜。PBS溶液至少清洗3次，每次5min。
(8)加二抗：Invitrogen羊抗兔Alexa-488(1:1000)，37℃孵育1h。PBS溶液至少清洗3次，每次5min。
(9)荧光显微镜下观察。
检测结果如图3所示，CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株52℃处理30min后接种RD细胞，培养72h后进行了免疫荧光检测。CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株与抗CV-A2 VLPs多抗反应，在荧光显微镜下可见明显绿色荧光，而CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株绿色荧光不明显。
实施例3：CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株耐热处理能力比较
(1)CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株分别在39.5～65℃范围内，热处理30min，立即4℃保存。
(2)待细胞培养瓶中的RD细胞长至80％，弃去MEM细胞生长液，PBS洗涤三次。
(3)加入少量病毒维持液(覆盖培养瓶表面即可)，按照合适的感染复数(MOI)分别加入CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株病毒液，放入37℃，5％CO2培养箱中吸附1h。
(4)补加病毒维持液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
(5)细胞出现80％细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)时收集样品，进行滴定。
(6)绘制耐热处理曲线，进行耐热处理能力的比较分析。
(7)统计分析：Wilcoxon matched-pairs signed rank test。
结果如图4所示，CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株分别在39.5℃、42℃、45℃、48℃、52℃、55℃、58℃、62℃和65℃范围内，热处理30min，立即4℃保存。感染RD细胞病变结果显示，CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株的耐热处理能力强于CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株。
实施例4：CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株的全基因组序列测定
1、病毒RNA提取
使用生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式病毒RNA抽提纯化试剂盒(货号：B518667)抽提纯化病毒RNA。
2、逆转录合成cDNA
逆转录合成cDNA反应体系如表2及表3所示
表2 RT-PCR反应体系1
Figure GDA0003609902230000051
65℃保温5min后，4℃冷却。(处理可使模板RNA变性)
在上述Microtube中配制下列反转录反应液：
表3 RT-PCR反应体系2
Figure GDA0003609902230000052
(1)在PCR管中如表6加入试剂，混合均匀后置于PCR仪中，65℃反应5min，然后迅速放在冰上骤冷。
(2)往上述反应液中如表7加入以下试剂，混合均匀后置于PCR仪，30℃，15min；42℃，60min；70℃，15min。
3、PCR扩增
(1)扩增引物：CV-A2全序列测定引物见表4。
表4 CV-A2全基因组序列测定引物
Figure GDA0003609902230000061
(2)采用Toyobo公司生产的KOD-Plus-Neo(Code No.KOD-401)进行PCR扩增，98℃10min，98℃30sec，57℃3min 30sec，68℃(延伸速度30sec./kb)，循环数30-35cycles。
4、琼脂糖凝胶电泳
待反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR扩增条带。PCR产物鉴定正确后，将剩余扩增产物送至生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将测序各片段拼接得到全基因组序列。
测序结果显示，
CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株的全基因组序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例5：影响热稳定的CV-A2病毒在52℃增殖的关键氨基酸位点分析
CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株的全基因组序列比对。
将CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株和CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株的全基因组序列用SnapGene软件进行序列比对。CV-A2-2703R3/CHN XY/2017株VP2蛋白第160位氨基酸为苏氨酸(T)；VP3蛋白第42位氨基酸为天冬酰胺(N)；VP3蛋白第62位氨基酸位缬氨酸(V)；VP3蛋白第203位氨基酸为脯氨酸(P)；VP3蛋白第206位氨基酸为苏氨酸(T)；VP1蛋白第12位氨基酸为甲硫氨酸(M)；VP1蛋白第110位氨基酸为甘氨酸(G)；VP1蛋白第284位氨基酸为脯氨酸(P)；VP1蛋白第291位氨基酸为苏氨酸(T)；3C蛋白区第42位氨基酸为谷氨酰胺(Q)；3D蛋白区第74位氨基酸为缬氨酸(V)；3D蛋白区第134位氨基酸为异亮氨酸(I)；3D蛋白区第190位氨基酸为苏氨酸(T)；3D蛋白区第363位氨基酸为组氨酸(H)；3D蛋白区第380位氨基酸为甲硫氨酸(M)；3D蛋白区第442位氨基酸为缬氨酸(V)。
CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株VP2蛋白第160位氨基酸为丙氨酸(A)；VP3蛋白第42位氨基酸为丝氨酸(S)；VP3蛋白第62位氨基酸位甲硫氨酸(M)；VP3蛋白第203位氨基酸为亮氨酸(L)；VP3蛋白第206位氨基酸为异亮氨酸(I)；VP1蛋白第12位氨基酸为缬氨酸(V)；VP1蛋白第110位氨基酸为缬氨酸(V)；VP1蛋白第284位氨基酸为组氨酸(H)；VP1蛋白第291位氨基酸为丙氨酸(A)；3C蛋白区第42位氨基酸为组氨酸(H)；3D蛋白区第74位氨基酸为异亮氨酸(I)；3D蛋白区第134位氨基酸为苏氨酸(T)；3D蛋白区第190位氨基酸为丙氨酸(A)；3D蛋白区第363位氨基酸为半胱氨酸(C)；3D蛋白区第380位氨基酸为亮氨酸(L)；3D蛋白区第442位氨基酸为异亮氨酸(I)。
以上引起氨基酸改变的核苷酸变异及基因组中无义核苷酸的变异，见表1。所列的全部核苷酸和氨基酸的变异，均与两株病毒对热处理环境下的生长能力相关。
表1、影响毒株在Vero细胞中增殖的关键位点
Figure GDA0003609902230000071
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉生物制品研究所有限责任公司
<120> 一种热稳定的柯萨奇病毒A组2型病毒株
<130> CP121021037C
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7401
<212> DNA
<213> Coxsackie virus
<400> 1
gcccccaggg gaccccttgt ggcgttagca cactgattct acggaatctt tgtgcgcctg 60
ttttatatcc ctcccctaaa atagtaactt agaagttgaa catttacacg accaatagtg 120
ggcgtggcgc accagtcacg tcttggtcaa gcactcctgt ttccccggac cgagtatcaa 180
taggctgctc acgtggctga aggagaaagt gttcgttatc cggctaacta cttcgggaaa 240
cccagtaaca ccatgaaagt tgcagagtgt ttcgttcagc acttcccccg tgtagatcag 300
gctgatgagt cactgcaaac cccacgggcg accgtggcag tggctgcgtt ggcggcctgc 360
ctatgggtaa cccataggac gctctaatac agacatggtg cgaagagtct actgagctag 420
ttagtattcc tccggcccct gaatgcggct aatcctaact gcggagcaca tgccctcaat 480
ccagagggtg gtgtgtcgta atgggcaact ctgcagcgga accgactact ttgggtgtcc 540
gtgtttcctt ttattcttat actggctgct tatggtgaca attgaaaagt tgttaccata 600
tagctattgg attggccatc cggtgaataa cagagctttg gtttatcagt tcattgggtt 660
cgtgccctta tcatctacag cttacacaac tttggtgtac ttgttatatc ttaatagtaa 720
gaaatggggg cgcagttttc aactcagcgc tcaggttccc acgagacgag caatgtagct 780
cgtgatggat caaccattaa cttcacgaac atcaactact ataaggactc ttacgcggcc 840
tctgcagcta aacatgactt cactcaagat cctggcaagt tcacacaacc tgtgctggat 900
gctctacgcg aagcggtgcc accattacag tcaccgagtg ctgaggcatg tggttacagt 960
gacagagtgg cgcagttgac agttggcaac tcgactatca ccactcaaga agctgccaat 1020
ataatagtgt cttatgctga gtggccagaa tattgtccag acacggacgc cactgcagtc 1080
gacaaaccaa cccgcccaga tgtgtcagtg aacagattct acactatgcc agcaactttg 1140
tgggagacag aatcgaaagg atggtattgg aagtttcctg atttactcaa tgagataggc 1200
gttttcggac agaacgccca atttcactat ttatatagat cagggttttg cattcacgtg 1260
cagtgtaacg ccagtaagtt ccatcaaggg gctctgcttg tagcggtaat tcctgagttt 1320
gttgtagccg agcaggacgc cacccagaag cccaatacag caaagcaccc ttcgttggaa 1380
gccacgcaac ccggcaagaa aggtaaggcg ttcagacacc cttacgtcct tgattgtggc 1440
gtgccattaa gccaagccct tgtcttcccc catcagtgga tcaacttacg cactaacaac 1500
tgtgctacca tagtagtccc atatattaat gccttacctt ttgattctgc aataaaccat 1560
tccaatttct cactggcagt gataccagtt tgcccattga aatacaacac aggtgccacc 1620
ccttcaatac ccatcacgat tacagttgca cccttgtgct cggagtttgc cgggctacgc 1680
caagcagtca agcaaggagt cccggtagag atgaaacctg gaacaaacca atttttaaca 1740
actgatgatg ggacctcagc accaatacta cctggctttc accccacacc aaccatacac 1800
atccccggtg aagtccatag tttgttagag ttgtgtcaga ttgagactat gcttgaggtg 1860
aacaatacat ctaaggcaat ggagctcgac cggctgagga tacctgtgtc tgcacagagc 1920
gccgtagaca ccctgtgcgc ggcttttaga gtggaccccg gtagggacgg tccctggcag 1980
tccactatgg taggacaact atgcaggtac tacacccagt ggtcaggctc cctaaagatt 2040
acattcatgt tcactggctc atttatggcc actgggaaga tgctggtcgc ctacacaccg 2100
ccgggaggcg cgcaacctgc cacacgggag ctagctatgt tgggcacaca tgtaatctgg 2160
gattttggcc tgcagtcgtc ggttacacta gtggtcccat ggataagcaa cactcactat 2220
agggctgtgg agactggggg tgtgtttgat tactacacca ctggcgtggt gaccatatgg 2280
taccagacta actttgtagt gcttcctgac attcctacca gcgcttacat cctagcattt 2340
ggagccggtc aaaagaactt cactctcaag ctgtgcaaag acacggatga aattacccag 2400
caagcaacac tgcagggtga tggtatagaa gatgccataa ccaacacagt gaatgctacg 2460
atagacaggg tgttgagtcg gccagtgtct cattcaccaa cagctgctaa cacccaggtg 2520
agtcagcact ccattgagac tgggcgtgta cctgcactac aagctgctga aacaggtgct 2580
acttccaatg ccactgatga aaacctgata gaaacaagat gtgtggttaa caaaaatagt 2640
gtggaagagg ctagtataaa ccacttcttc tcccgagcag ctttggttgg taaggtggag 2700
ttaaatgaca caggcacgag tgccacaggg tttaccaact gggttataga tataatgggg 2760
tatgctcaac tgcgtaggaa actagagatg ttcacctaca tgcgcttcaa tgctgagttt 2820
acatttgtgg ctaccaccag agctggaaag gtaccatcta gagtgctcca gtacatgtat 2880
gtcccacctg gagcacccaa accggacggc agggaagctt ttcaatggca atcctcgact 2940
aacccatcag tgttcagcaa aatgacggac cctccaccac aggtctcagt cccattcatg 3000
tcgcctgcta gtgcgtacca atggttctat gacggatacc ccacctttgg agagcacagt 3060
ggcgaagata gcctgcgcta cggtcaatgc cccaacaacg cattgggcac cttttcagtg 3120
agattcgtta gtgaagagat aactaacgag cgaatcacca tcaggatata tatgaggctt 3180
aaacacgtgc gggcttgggt cccgcgccca ctcaggtctg agccttatgt attgaagaat 3240
ttcccaaatt atactgcagt gactcacgtc accgccaacc gtcccgccat tacaaacaca 3300
ggcaagtttg gtcagcaatc gggtgccatt tacgtgggga attttagagt ggtgaatcgt 3360
catcttgcca ctcacaacga ttgggcgaac cttgtctggg aaaacagcac ccgggatctg 3420
cttgtgtcgt ccaccaccgc acaaggctgt gacacgatcg cccgttgcaa ctgtcagaca 3480
ggagtatact actgtaactc ccgaaggaag cattaccccg ttagcttttc aaagcccagc 3540
cttgtcttcg tggaagccag tgaatactac cctgctaggt atcaatccca tctcatgctt 3600
gcagtaggcc actccgaacc aggtgattgc gggggcattc taaggtgcca gcacggtgtt 3660
gttggaatcg tgtctactgg gggcaacgga cttgttggtt ttgcagatgt cagagacctt 3720
ctgtggctag atgaagaagc aatggagcag ggagtctccg attacatcaa agggctcggt 3780
gacgcattcg ggactggttt caccgatgcg gtctccaggg aagtggaagc tctcaagaac 3840
tatcttattg gatctgaagg agccgttgaa aagatcctta agaacttaat caaattgatc 3900
tctgccctgg tcatcgtgat taggagtgat tacgacatgg tcaccctcac agcaacttta 3960
gctttgattg ggtgtcacgg tagcccctgg gcatggatca aagcaaagac agcatctatt 4020
ctgggcattc ctatcgctca aaaacagagc gcatcctggc tcaagaagtt caatgacatg 4080
gccaacgctg ctaagggatt agaatgggtt tccaataaga tcagcaaatt catcgattgg 4140
cttaaggaga aaattatacc agcagctagg gagaaggttg aattcctgaa caatttgaaa 4200
caattgccac tactggagaa tcagatctca aacttggaac agtccgccgc ctcacaggaa 4260
gaccttgaag ccatgttcgg gaatgtgtcg tacctggccc atttctgtcg caaataccaa 4320
ccactgtatg ctactgaagc caagagagtc tacgccctgg agaagaggat gaacaattac 4380
atgcagttca agagcaaaca ccgtattgaa cctgtatgtc tcatcatcag aggctcgccg 4440
ggcaccggga agtctttagc aactggcatt attgctcgag caatagctga caagtaccac 4500
tccagtgtct attcactccc gccagaccca gatcactttg acgggtataa acagcaggtg 4560
gttacagtta tggatgactt atgtcagaac cctgacggta aggacatgtc tttgttctgc 4620
caaatggtat ccactgtaga tttcatccct ccaatggctt cccttgagga gaaaggggtg 4680
tctttcactt caaaatttgt catcgcatcc actaacgcca gcaatatcat agtaccaaca 4740
gtgtcagatt ccgacgccat ccgccgcaga ttctatatgg attgcgacat tgaggtgacg 4800
gactcatata aaacagacct gggcagattg gatgccggtc gggccgctaa gctgtgttct 4860
gaaaataaca ctgccaactt taaacgctgc agccctctgg tgtgcgggaa agctattcag 4920
ctcagagaca ggaaatctaa ggttaggtat agcgtggaca cagtggtgtc tgagcttatt 4980
agggagtaca acaataggtc tgccattgga aatacaattg aagccctatt tcagggccca 5040
cccaagttta gaccaatcag gattagcctt gaggagaaac cagctccaga tgctattagc 5100
gatcttcttg ccagcgtgga tagcgaagag gtgcgccagt attgcagaga ccagggttgg 5160
attatcccag aggctcccac aaatgttgaa cgacacctca acagagctgt gctgattatg 5220
caatccatcg ccacagtagt agcagttgtc tccttggtgt atgttatcta caagctcttt 5280
gctggattcc agggtgctta ttctggtgcc cctaagcagg cgctcaagaa acctatcctc 5340
cgcacggcaa cagtgcaggg cccgagtctc gactttgctt tatcactact gagaagaaat 5400
gtcaggcaag tccaaacaga ccaagggcac tttaccatgc tgggagtcag agaccgctta 5460
gctgtccttc cacgacactc acaccctggg aagacaatct ggatagagca caaactcgtg 5520
aacgtcctgg acgctgtcga attagtggat gaacaagggg tcaatttgga gttaacctta 5580
gtcacactag acaccaatga aaagttcagg gatattacca aattcattcc agaaagtatc 5640
agcgccgcta gtgacgctac tttagtgatc aacacagagc atatgccttc aatgtttgtg 5700
ccagtaggtg acgtcgtgca gtatggcttt ctaaatctca gtggaaagcc aactcaccgc 5760
actatgatgt acaattttcc cactaaggca ggtcagtgtg gaggggtagt cacatcagtt 5820
gggaaggtca ttggcattca catagggggt aatggcaggc aaggcttttg tgcgggactc 5880
aagagaagct attttgctag tgaacaagga gagatccagt gggtcaaacc taataaagaa 5940
acaggaaggc taaacattaa tgggccaact cgcactaaac tcgagcccag tgtgttccat 6000
gacgtcttta agggcaacaa agagccagca gtcttacaca gtaaagatcc ccgcctcgag 6060
gtggactttg agcaggcatt gttttctaag tacgtgggaa acacgctaca tgagcctgat 6120
gagtacatca gagaggcagc tcttcactat gcgaatcagt tgaagcagct agacatagac 6180
accacccaga tgagcatgga ggaagcatgc tacggcacgg acaaccttga ggccattgac 6240
ctccacacta gcgcaggcta cccctacagt gctctgggaa taaaaaagag agatatccta 6300
gaccctacca ctagagacgt gagcaagatg aagttttaca tggataagta tggccttgac 6360
ctcccttact ccacctatgt caaagatgag cttcgctcga tagacaagat caagaagggg 6420
aaatctcgac tgattgaagc cagtagttta aatgactcag tctacctcag aatggccttt 6480
gggcacctct atgaaacctt ccatgcaaat cctggaactg tgactggttc agctgtgggg 6540
tgcaacccag atacattttg gagtaagcta ccaatcttgc tccctggctc cctctttgcc 6600
tttgactact caggttatga tgctagtctc agcccagttt ggttcagggc actggagcta 6660
gttctcaggg agataggcta tagtgaggag gcggtttcgc ttatcgaagg aatcaaccac 6720
acacaccatg tataccgcaa caagacttat tgcgtgcttg gtgggatgcc ctcgggttgc 6780
tcaggaacat ccatctttaa ctcaatgatc aacaacatta tcatcagaac actccttatt 6840
aagacattca agggtattga tttggatgaa ctcaatatgg ttgcttacgg agatgatgtg 6900
ctcgccagtt atcctttccc aattgactgc ctagaactag caagaacggg taaggagtat 6960
ggtctaacca tgacccctgc tgacaagtcc ccttgcttta atgaagtcaa ttgggaaaat 7020
gcaacctttc tcaagagggg cttcttgccc gatgatcagt ttccattctt gatccaccct 7080
accatgccaa tgaaggagat tcatgaatcc attcgatgga ccaaggatgc acgcaatact 7140
caagatcacg tgcgatcctt atgcctattg gcatggcaca acggcaagca agaatatgaa 7200
gaatttgtga gcacaatcag gtctgtccca ataggaaaag cattggcaat tcccaattat 7260
gaaaatctga gacgtaattg gctcgaatta ttttagaggt tagatacacc tcaaccccac 7320
cagaaatctg gtcgtgaata tgactggtgg gggtaaattt gttataacca gaataacaaa 7380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 7401
<210> 2
<211> 2190
<212> PRT
<213> Coxsackie virus
<400> 2
Met Gly Ala Gln Phe Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Thr Ser
1               5                   10                  15
Asn Val Ala Arg Asp Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr
            20                  25                  30
Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Ala Lys His Asp Phe Thr Gln
        35                  40                  45
Asp Pro Gly Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ala Leu Arg Glu Ala
    50                  55                  60
Val Pro Pro Leu Gln Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65                  70                  75                  80
Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
                85                  90                  95
Ala Ala Asn Ile Ile Val Ser Tyr Ala Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro
            100                 105                 110
Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser
        115                 120                 125
Val Asn Arg Phe Tyr Thr Met Pro Ala Thr Leu Trp Glu Thr Glu Ser
    130                 135                 140
Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Leu Leu Asn Glu Ile Gly Val
145                 150                 155                 160
Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys
                165                 170                 175
Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu
            180                 185                 190
Val Ala Val Ile Pro Glu Phe Val Val Ala Glu Gln Asp Ala Thr Gln
        195                 200                 205
Lys Pro Asn Thr Ala Lys His Pro Ser Leu Glu Ala Thr Gln Pro Gly
    210                 215                 220
Lys Lys Gly Lys Thr Phe Arg His Pro Tyr Val Leu Asp Cys Gly Val
225                 230                 235                 240
Pro Leu Ser Gln Ala Leu Val Phe Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg
                245                 250                 255
Thr Asn Asn Cys Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Ile Asn Ala Leu Pro
            260                 265                 270
Phe Asp Ser Ala Ile Asn His Ser Asn Phe Ser Leu Ala Val Ile Pro
        275                 280                 285
Val Cys Pro Leu Lys Tyr Asn Thr Gly Ala Thr Pro Ser Ile Pro Ile
    290                 295                 300
Thr Ile Thr Val Ala Pro Leu Cys Ser Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln
305                 310                 315                 320
Ala Val Lys Gln Gly Val Pro Val Glu Met Lys Pro Gly Thr Asn Gln
                325                 330                 335
Phe Leu Thr Thr Asp Asp Gly Thr Ser Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe
            340                 345                 350
His Pro Thr Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Asn Leu Leu
        355                 360                 365
Glu Leu Cys Gln Ile Glu Thr Met Leu Glu Val Asn Asn Thr Ser Lys
    370                 375                 380
Ala Val Glu Leu Asp Arg Leu Arg Ile Pro Val Ser Ala Gln Ser Ala
385                 390                 395                 400
Val Asp Thr Leu Cys Ala Ala Phe Arg Val Asp Pro Gly Arg Asp Gly
                405                 410                 415
Pro Trp Gln Ser Thr Met Val Gly Gln Leu Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln
            420                 425                 430
Trp Ser Gly Ser Leu Lys Ile Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met
        435                 440                 445
Ala Thr Gly Lys Met Leu Val Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Ala Gln
    450                 455                 460
Pro Ala Thr Arg Glu Leu Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp
465                 470                 475                 480
Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Val Pro Trp Ile Ser Asn
                485                 490                 495
Thr His Tyr Arg Ala Val Glu Thr Gly Gly Val Phe Asp Tyr Tyr Thr
            500                 505                 510
Thr Gly Val Val Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Phe Val Val Pro Pro
        515                 520                 525
Asp Thr Pro Thr Ser Ala Tyr Ile Leu Ala Phe Gly Ala Gly Gln Lys
    530                 535                 540
Asn Phe Thr Leu Lys Leu Cys Lys Asp Thr Asp Glu Ile Thr Gln Gln
545                 550                 555                 560
Ala Thr Leu Gln Gly Asp Gly Ile Glu Asp Ala Ile Thr Asn Thr Met
                565                 570                 575
Asn Ala Thr Ile Asp Arg Val Leu Ser Arg Pro Val Ser His Ser Pro
            580                 585                 590
Thr Ala Ala Asn Thr Gln Val Ser Gln His Ser Ile Glu Thr Gly Arg
        595                 600                 605
Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr
    610                 615                 620
Asp Glu Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Lys Asn Ser Val
625                 630                 635                 640
Glu Glu Ala Ser Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ala Ala Leu Val Gly
                645                 650                 655
Lys Val Glu Leu Asn Asp Thr Gly Thr Ser Ala Thr Gly Phe Thr Asn
            660                 665                 670
Trp Gly Ile Asp Ile Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu
        675                 680                 685
Met Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Thr
    690                 695                 700
Thr Arg Ala Gly Arg Lys Pro Ser Arg Val Leu Gln Tyr Met Tyr Val
705                 710                 715                 720
Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Gly Arg Glu Ala Phe Gln Trp Gln
                725                 730                 735
Ser Ser Thr Asn Pro Ser Val Phe Ser Lys Met Thr Asp Pro Pro Pro
            740                 745                 750
Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe
        755                 760                 765
Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Ser Gly Glu Asp Ser Leu
    770                 775                 780
Arg Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Ala Leu Gly Thr Phe Ser Val Arg
785                 790                 795                 800
Phe Val Ser Glu Glu Ile Thr Asn Glu Arg Ile Thr Ile Arg Ile Tyr
                805                 810                 815
Met Arg Leu Lys His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Leu Arg Ser
            820                 825                 830
Glu Pro Tyr Val Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Thr Ala Val Thr Pro
        835                 840                 845
Val Thr Ala Asn Arg Pro Thr Ile Thr Asn Thr Gly Lys Phe Gly Gln
    850                 855                 860
Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Phe Arg Val Val Asn Arg His
865                 870                 875                 880
Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val Trp Glu Asn Ser Thr
                885                 890                 895
Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln Gly Cys Asp Thr Ile
            900                 905                 910
Ala Arg Cys Asn Cys Gln Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Arg
        915                 920                 925
Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Ser Lys Pro Ser Leu Val Phe Val Glu
    930                 935                 940
Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser His Leu Met Leu Ala
945                 950                 955                 960
Val Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly Ile Leu Arg Cys Gln
                965                 970                 975
His Gly Val Val Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly Asn Gly Leu Val Gly
            980                 985                 990
Phe Ala Asp Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp Glu Glu Ala Met Glu
        995                 1000                1005
Gln Gly Val Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp Ala Phe Gly
    1010                1015                1020
Thr Gly Phe Thr Asp Ala Val Ser Arg Glu Val Glu Ala Leu Lys
    1025                1030                1035
Asn Tyr Leu Ile Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys Ile Leu Lys
    1040                1045                1050
Asn Leu Ile Lys Leu Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Ile Arg Ser
    1055                1060                1065
Asp Tyr Asp Met Val Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala Leu Ile Gly
    1070                1075                1080
Cys His Gly Ser Pro Trp Ala Trp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser
    1085                1090                1095
Ile Leu Gly Ile Pro Ile Ala Gln Lys Gln Ser Ala Ser Trp Leu
    1100                1105                1110
Lys Lys Phe Asn Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys Gly Leu Glu Trp
    1115                1120                1125
Val Ser Asn Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu Lys Glu Lys
    1130                1135                1140
Ile Ile Pro Ala Ala Arg Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn Asn Leu
    1145                1150                1155
Lys Gln Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Ser Asn Leu Glu Gln
    1160                1165                1170
Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Ala Met Phe Gly Asn Val
    1175                1180                1185
Ser Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Tyr Gln Pro Leu Tyr Ala
    1190                1195                1200
Thr Glu Ala Lys Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg Met Asn Asn
    1205                1210                1215
Tyr Met Gln Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu
    1220                1225                1230
Ile Ile Arg Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly
    1235                1240                1245
Ile Ile Ala Arg Ala Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser Ser Val Tyr
    1250                1255                1260
Ser Leu Pro Pro Asp Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln
    1265                1270                1275
Val Val Thr Val Met Asp Asp Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys
    1280                1285                1290
Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile
    1295                1300                1305
Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu Lys Gly Val Ser Phe Thr Ser
    1310                1315                1320
Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala Ser Asn Ile Ile Val Pro
    1325                1330                1335
Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg Arg Phe Tyr Met Asp
    1340                1345                1350
Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr Asp Leu Gly Arg
    1355                1360                1365
Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Ser Glu Asn Asn Thr
    1370                1375                1380
Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys Ala Ile
    1385                1390                1395
Gln Leu Arg Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Val Asp Thr
    1400                1405                1410
Val Val Ser Glu Leu Ile Arg Glu Tyr Asn Asn Arg Ser Ala Ile
    1415                1420                1425
Gly Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Pro Lys Phe Arg
    1430                1435                1440
Pro Ile Arg Ile Ser Leu Glu Glu Lys Pro Ala Pro Asp Ala Ile
    1445                1450                1455
Ser Asp Leu Leu Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu Val Arg Gln Tyr
    1460                1465                1470
Cys Arg Asp Gln Gly Trp Ile Ile Pro Glu Ala Pro Thr Asn Val
    1475                1480                1485
Glu Arg His Leu Asn Arg Ala Val Leu Ile Met Gln Ser Ile Ala
    1490                1495                1500
Thr Val Val Ala Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile Tyr Lys Leu
    1505                1510                1515
Phe Ala Gly Phe Gln Gly Ala Tyr Ser Gly Ala Pro Lys Gln Ala
    1520                1525                1530
Leu Lys Lys Pro Ile Leu Arg Thr Ala Thr Val Gln Gly Pro Ser
    1535                1540                1545
Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Val Arg Gln Val
    1550                1555                1560
Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp Arg
    1565                1570                1575
Leu Ala Val Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp
    1580                1585                1590
Ile Glu His Lys Leu Val Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val
    1595                1600                1605
Asp Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Val Thr Leu Asp
    1610                1615                1620
Thr Asn Glu Lys Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile Pro Glu Ser
    1625                1630                1635
Ile Ser Ala Ala Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His
    1640                1645                1650
Met Pro Ser Met Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly
    1655                1660                1665
Phe Leu Asn Leu Ser Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr
    1670                1675                1680
Asn Phe Pro Thr Lys Ala Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser
    1685                1690                1695
Val Gly Lys Val Ile Gly Ile His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln
    1700                1705                1710
Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln
    1715                1720                1725
Gly Glu Ile Gln Trp Val Lys Pro Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu
    1730                1735                1740
Asn Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro Ser Val Phe
    1745                1750                1755
His Asp Val Phe Lys Gly Asn Lys Glu Pro Ala Val Leu His Ser
    1760                1765                1770
Lys Asp Pro Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala Leu Phe Ser
    1775                1780                1785
Lys Tyr Val Gly Asn Thr Leu His Glu Pro Asp Glu Tyr Val Arg
    1790                1795                1800
Glu Ala Ala Leu His Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu Asp Ile
    1805                1810                1815
Asp Thr Thr Gln Met Ser Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr Asp
    1820                1825                1830
Asn Leu Glu Ala Ile Asp Leu His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr
    1835                1840                1845
Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg Asp Ile Leu Asp Pro Ile Thr
    1850                1855                1860
Arg Asp Val Ser Lys Met Lys Phe Tyr Met Asp Lys Tyr Gly Leu
    1865                1870                1875
Asp Leu Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Ile
    1880                1885                1890
Asp Lys Ile Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser
    1895                1900                1905
Leu Asn Asp Ser Val Tyr Leu Arg Met Thr Phe Gly His Leu Tyr
    1910                1915                1920
Glu Thr Phe His Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser Ala Val
    1925                1930                1935
Gly Cys Asn Pro Asp Thr Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu Leu
    1940                1945                1950
Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser
    1955                1960                1965
Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu Glu Leu Val Leu Arg Glu
    1970                1975                1980
Ile Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Val Ser Leu Ile Glu Gly Ile Asn
    1985                1990                1995
His Thr His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr Cys Val Leu Gly
    2000                2005                2010
Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Ser Met
    2015                2020                2025
Ile Asn Asn Ile Ile Ile Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Phe Lys
    2030                2035                2040
Gly Ile Asp Leu Asp Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp Asp
    2045                2050                2055
Val Leu Ala Ser Tyr Pro Phe Pro Ile Asp Cys Leu Glu Leu Ala
    2060                2065                2070
Arg Thr Gly Lys Glu Tyr Gly Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys
    2075                2080                2085
Ser Pro His Phe Asn Glu Val Asn Trp Glu Asn Ala Thr Phe Leu
    2090                2095                2100
Lys Arg Gly Phe Met Pro Asp Asp Gln Phe Pro Phe Leu Ile His
    2105                2110                2115
Pro Thr Met Pro Met Lys Glu Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr
    2120                2125                2130
Lys Asp Ala Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu
    2135                2140                2145
Leu Ala Trp His Asn Gly Lys Gln Glu Tyr Glu Glu Phe Val Ser
    2150                2155                2160
Thr Ile Arg Ser Val Pro Val Gly Lys Ala Leu Ala Ile Pro Asn
    2165                2170                2175
Tyr Glu Asn Leu Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe
    2180                2185                2190
<210> 3
<211> 2190
<212> PRT
<213> Coxsackie virus
<400> 3
Met Gly Ala Gln Phe Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Thr Ser
1               5                   10                  15
Asn Val Ala Arg Asp Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr
            20                  25                  30
Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Ala Lys His Asp Phe Thr Gln
        35                  40                  45
Asp Pro Gly Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ala Leu Arg Glu Ala
    50                  55                  60
Val Pro Pro Leu Gln Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65                  70                  75                  80
Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
                85                  90                  95
Ala Ala Asn Ile Ile Val Ser Tyr Ala Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro
            100                 105                 110
Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser
        115                 120                 125
Val Asn Arg Phe Tyr Thr Met Pro Ala Thr Leu Trp Glu Thr Glu Ser
    130                 135                 140
Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Leu Leu Asn Glu Ile Gly Val
145                 150                 155                 160
Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys
                165                 170                 175
Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu
            180                 185                 190
Val Ala Val Ile Pro Glu Phe Val Val Ala Glu Gln Asp Ala Thr Gln
        195                 200                 205
Lys Pro Asn Thr Ala Lys His Pro Ser Leu Glu Ala Thr Gln Pro Gly
    210                 215                 220
Lys Lys Gly Lys Ala Phe Arg His Pro Tyr Val Leu Asp Cys Gly Val
225                 230                 235                 240
Pro Leu Ser Gln Ala Leu Val Phe Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg
                245                 250                 255
Thr Asn Asn Cys Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Ile Asn Ala Leu Pro
            260                 265                 270
Phe Asp Ser Ala Ile Asn His Ser Asn Phe Ser Leu Ala Val Ile Pro
        275                 280                 285
Val Cys Pro Leu Lys Tyr Asn Thr Gly Ala Thr Pro Ser Ile Pro Ile
    290                 295                 300
Thr Ile Thr Val Ala Pro Leu Cys Ser Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln
305                 310                 315                 320
Ala Val Lys Gln Gly Val Pro Val Glu Met Lys Pro Gly Thr Asn Gln
                325                 330                 335
Phe Leu Thr Thr Asp Asp Gly Thr Ser Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe
            340                 345                 350
His Pro Thr Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu
        355                 360                 365
Glu Leu Cys Gln Ile Glu Thr Met Leu Glu Val Asn Asn Thr Ser Lys
    370                 375                 380
Ala Met Glu Leu Asp Arg Leu Arg Ile Pro Val Ser Ala Gln Ser Ala
385                 390                 395                 400
Val Asp Thr Leu Cys Ala Ala Phe Arg Val Asp Pro Gly Arg Asp Gly
                405                 410                 415
Pro Trp Gln Ser Thr Met Val Gly Gln Leu Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln
            420                 425                 430
Trp Ser Gly Ser Leu Lys Ile Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met
        435                 440                 445
Ala Thr Gly Lys Met Leu Val Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Ala Gln
    450                 455                 460
Pro Ala Thr Arg Glu Leu Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp
465                 470                 475                 480
Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Val Pro Trp Ile Ser Asn
                485                 490                 495
Thr His Tyr Arg Ala Val Glu Thr Gly Gly Val Phe Asp Tyr Tyr Thr
            500                 505                 510
Thr Gly Val Val Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Phe Val Val Leu Pro
        515                 520                 525
Asp Ile Pro Thr Ser Ala Tyr Ile Leu Ala Phe Gly Ala Gly Gln Lys
    530                 535                 540
Asn Phe Thr Leu Lys Leu Cys Lys Asp Thr Asp Glu Ile Thr Gln Gln
545                 550                 555                 560
Ala Thr Leu Gln Gly Asp Gly Ile Glu Asp Ala Ile Thr Asn Thr Val
                565                 570                 575
Asn Ala Thr Ile Asp Arg Val Leu Ser Arg Pro Val Ser His Ser Pro
            580                 585                 590
Thr Ala Ala Asn Thr Gln Val Ser Gln His Ser Ile Glu Thr Gly Arg
        595                 600                 605
Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr
    610                 615                 620
Asp Glu Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Lys Asn Ser Val
625                 630                 635                 640
Glu Glu Ala Ser Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ala Ala Leu Val Gly
                645                 650                 655
Lys Val Glu Leu Asn Asp Thr Gly Thr Ser Ala Thr Gly Phe Thr Asn
            660                 665                 670
Trp Val Ile Asp Ile Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu
        675                 680                 685
Met Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Thr
    690                 695                 700
Thr Arg Ala Gly Lys Val Pro Ser Arg Val Leu Gln Tyr Met Tyr Val
705                 710                 715                 720
Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Gly Arg Glu Ala Phe Gln Trp Gln
                725                 730                 735
Ser Ser Thr Asn Pro Ser Val Phe Ser Lys Met Thr Asp Pro Pro Pro
            740                 745                 750
Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe
        755                 760                 765
Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Ser Gly Glu Asp Ser Leu
    770                 775                 780
Arg Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Ala Leu Gly Thr Phe Ser Val Arg
785                 790                 795                 800
Phe Val Ser Glu Glu Ile Thr Asn Glu Arg Ile Thr Ile Arg Ile Tyr
                805                 810                 815
Met Arg Leu Lys His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Leu Arg Ser
            820                 825                 830
Glu Pro Tyr Val Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Thr Ala Val Thr His
        835                 840                 845
Val Thr Ala Asn Arg Pro Ala Ile Thr Asn Thr Gly Lys Phe Gly Gln
    850                 855                 860
Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Phe Arg Val Val Asn Arg His
865                 870                 875                 880
Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val Trp Glu Asn Ser Thr
                885                 890                 895
Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln Gly Cys Asp Thr Ile
            900                 905                 910
Ala Arg Cys Asn Cys Gln Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Arg
        915                 920                 925
Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Ser Lys Pro Ser Leu Val Phe Val Glu
    930                 935                 940
Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser His Leu Met Leu Ala
945                 950                 955                 960
Val Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly Ile Leu Arg Cys Gln
                965                 970                 975
His Gly Val Val Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly Asn Gly Leu Val Gly
            980                 985                 990
Phe Ala Asp Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp Glu Glu Ala Met Glu
        995                 1000                1005
Gln Gly Val Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp Ala Phe Gly
    1010                1015                1020
Thr Gly Phe Thr Asp Ala Val Ser Arg Glu Val Glu Ala Leu Lys
    1025                1030                1035
Asn Tyr Leu Ile Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys Ile Leu Lys
    1040                1045                1050
Asn Leu Ile Lys Leu Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Ile Arg Ser
    1055                1060                1065
Asp Tyr Asp Met Val Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala Leu Ile Gly
    1070                1075                1080
Cys His Gly Ser Pro Trp Ala Trp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser
    1085                1090                1095
Ile Leu Gly Ile Pro Ile Ala Gln Lys Gln Ser Ala Ser Trp Leu
    1100                1105                1110
Lys Lys Phe Asn Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys Gly Leu Glu Trp
    1115                1120                1125
Val Ser Asn Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu Lys Glu Lys
    1130                1135                1140
Ile Ile Pro Ala Ala Arg Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn Asn Leu
    1145                1150                1155
Lys Gln Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Ser Asn Leu Glu Gln
    1160                1165                1170
Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Ala Met Phe Gly Asn Val
    1175                1180                1185
Ser Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Tyr Gln Pro Leu Tyr Ala
    1190                1195                1200
Thr Glu Ala Lys Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg Met Asn Asn
    1205                1210                1215
Tyr Met Gln Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu
    1220                1225                1230
Ile Ile Arg Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly
    1235                1240                1245
Ile Ile Ala Arg Ala Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser Ser Val Tyr
    1250                1255                1260
Ser Leu Pro Pro Asp Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln
    1265                1270                1275
Val Val Thr Val Met Asp Asp Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys
    1280                1285                1290
Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile
    1295                1300                1305
Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu Lys Gly Val Ser Phe Thr Ser
    1310                1315                1320
Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala Ser Asn Ile Ile Val Pro
    1325                1330                1335
Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg Arg Phe Tyr Met Asp
    1340                1345                1350
Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr Asp Leu Gly Arg
    1355                1360                1365
Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Ser Glu Asn Asn Thr
    1370                1375                1380
Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys Ala Ile
    1385                1390                1395
Gln Leu Arg Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Val Asp Thr
    1400                1405                1410
Val Val Ser Glu Leu Ile Arg Glu Tyr Asn Asn Arg Ser Ala Ile
    1415                1420                1425
Gly Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Pro Lys Phe Arg
    1430                1435                1440
Pro Ile Arg Ile Ser Leu Glu Glu Lys Pro Ala Pro Asp Ala Ile
    1445                1450                1455
Ser Asp Leu Leu Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu Val Arg Gln Tyr
    1460                1465                1470
Cys Arg Asp Gln Gly Trp Ile Ile Pro Glu Ala Pro Thr Asn Val
    1475                1480                1485
Glu Arg His Leu Asn Arg Ala Val Leu Ile Met Gln Ser Ile Ala
    1490                1495                1500
Thr Val Val Ala Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile Tyr Lys Leu
    1505                1510                1515
Phe Ala Gly Phe Gln Gly Ala Tyr Ser Gly Ala Pro Lys Gln Ala
    1520                1525                1530
Leu Lys Lys Pro Ile Leu Arg Thr Ala Thr Val Gln Gly Pro Ser
    1535                1540                1545
Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Val Arg Gln Val
    1550                1555                1560
Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp Arg
    1565                1570                1575
Leu Ala Val Leu Pro Arg His Ser His Pro Gly Lys Thr Ile Trp
    1580                1585                1590
Ile Glu His Lys Leu Val Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val
    1595                1600                1605
Asp Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Val Thr Leu Asp
    1610                1615                1620
Thr Asn Glu Lys Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile Pro Glu Ser
    1625                1630                1635
Ile Ser Ala Ala Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His
    1640                1645                1650
Met Pro Ser Met Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly
    1655                1660                1665
Phe Leu Asn Leu Ser Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr
    1670                1675                1680
Asn Phe Pro Thr Lys Ala Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser
    1685                1690                1695
Val Gly Lys Val Ile Gly Ile His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln
    1700                1705                1710
Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln
    1715                1720                1725
Gly Glu Ile Gln Trp Val Lys Pro Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu
    1730                1735                1740
Asn Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro Ser Val Phe
    1745                1750                1755
His Asp Val Phe Lys Gly Asn Lys Glu Pro Ala Val Leu His Ser
    1760                1765                1770
Lys Asp Pro Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala Leu Phe Ser
    1775                1780                1785
Lys Tyr Val Gly Asn Thr Leu His Glu Pro Asp Glu Tyr Ile Arg
    1790                1795                1800
Glu Ala Ala Leu His Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu Asp Ile
    1805                1810                1815
Asp Thr Thr Gln Met Ser Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr Asp
    1820                1825                1830
Asn Leu Glu Ala Ile Asp Leu His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr
    1835                1840                1845
Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg Asp Ile Leu Asp Pro Thr Thr
    1850                1855                1860
Arg Asp Val Ser Lys Met Lys Phe Tyr Met Asp Lys Tyr Gly Leu
    1865                1870                1875
Asp Leu Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Ile
    1880                1885                1890
Asp Lys Ile Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser
    1895                1900                1905
Leu Asn Asp Ser Val Tyr Leu Arg Met Ala Phe Gly His Leu Tyr
    1910                1915                1920
Glu Thr Phe His Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser Ala Val
    1925                1930                1935
Gly Cys Asn Pro Asp Thr Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu Leu
    1940                1945                1950
Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser
    1955                1960                1965
Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu Glu Leu Val Leu Arg Glu
    1970                1975                1980
Ile Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Val Ser Leu Ile Glu Gly Ile Asn
    1985                1990                1995
His Thr His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr Cys Val Leu Gly
    2000                2005                2010
Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Ser Met
    2015                2020                2025
Ile Asn Asn Ile Ile Ile Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Phe Lys
    2030                2035                2040
Gly Ile Asp Leu Asp Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp Asp
    2045                2050                2055
Val Leu Ala Ser Tyr Pro Phe Pro Ile Asp Cys Leu Glu Leu Ala
    2060                2065                2070
Arg Thr Gly Lys Glu Tyr Gly Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys
    2075                2080                2085
Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Asn Trp Glu Asn Ala Thr Phe Leu
    2090                2095                2100
Lys Arg Gly Phe Leu Pro Asp Asp Gln Phe Pro Phe Leu Ile His
    2105                2110                2115
Pro Thr Met Pro Met Lys Glu Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr
    2120                2125                2130
Lys Asp Ala Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu
    2135                2140                2145
Leu Ala Trp His Asn Gly Lys Gln Glu Tyr Glu Glu Phe Val Ser
    2150                2155                2160
Thr Ile Arg Ser Val Pro Ile Gly Lys Ala Leu Ala Ile Pro Asn
    2165                2170                2175
Tyr Glu Asn Leu Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe
    2180                2185                2190

Claims (5)

1.一种柯萨奇病毒CV-A2热稳定株，其特征在于，所述的柯萨奇病毒CV-A2的热稳定株能够耐受60℃以下的高热处理；其蛋白质组中，包含如下突变位点：
(1)VP2蛋白第160位氨基酸为丙氨酸(A)；
(2)VP3蛋白第42位氨基酸为丝氨酸(S)；VP3蛋白第62位氨基酸位甲硫氨酸(M)；VP3蛋白第203位氨基酸为亮氨酸(L)；VP3蛋白第206位氨基酸为异亮氨酸(I)；
(3)VP1蛋白第12位氨基酸为缬氨酸(V)；VP1蛋白第110位氨基酸为缬氨酸(V)；VP1蛋白第284位氨基酸为组氨酸(H)；VP1蛋白第291位氨基酸为丙氨酸(A)；
(4)3C蛋白区第42位氨基酸为组氨酸(H)；
(5)3D蛋白区第74位氨基酸为异亮氨酸(I)；3D蛋白区第134位氨基酸为苏氨酸(T)；3D蛋白区第190位氨基酸为丙氨酸(A)；3D蛋白区第363位氨基酸为半胱氨酸(C)；3D蛋白区第380位氨基酸为亮氨酸(L)；3D蛋白区第442位氨基酸为异亮氨酸(I)；
所述的柯萨奇病毒CV-A2热稳定株为CV-A2-2703R3-52/CHN XY/2017株，其蛋白质组的全序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒CV-A2热稳定株，其特征在于，所述的柯萨奇病毒CV-A2热稳定株基因组中，结构蛋白为VP4，VP2，VP3，VP1；非结构蛋白为2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D，具体的，
VP4蛋白为第1-69位氨基酸序列编码的蛋白；
VP2蛋白为第70-324位氨基酸序列编码的蛋白；
VP3蛋白为第325-564位氨基酸序列编码的蛋白；
VP1蛋白为第565-859位氨基酸序列编码的蛋白；
2A蛋白为第860-1009位氨基酸序列编码的蛋白；
2B蛋白为第1010-1108位氨基酸序列编码的蛋白；
2C蛋白为第1109-1437位氨基酸序列编码的蛋白；
3A蛋白为第1438-1523位氨基酸序列编码的蛋白；
3B蛋白为第1524-1545位氨基酸序列编码的蛋白；
3C蛋白为第1546-1728位氨基酸序列编码的蛋白；
3D蛋白为第1729-2191位氨基酸序列编码的蛋白。
3.编码权利要求1或2所述的柯萨奇病毒CV-A2热稳定株的核苷酸片段。
4.权利要求1或2所述的柯萨奇病毒CV-A2热稳定株的培养方法，其特征在于，使用RD或Vero作为分离、传代和适应培养所述CV-A2毒株宿主细胞。
5.权利要求1或2所述的柯萨奇病毒CV-A2热稳定株在制备疫苗中的应用，所述的疫苗为针对手足口病的疫苗。
CN202111209995.9A 2021-10-18 2021-10-18 一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株 Active CN114540315B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111209995.9A CN114540315B (zh) 2021-10-18 2021-10-18 一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111209995.9A CN114540315B (zh) 2021-10-18 2021-10-18 一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114540315A CN114540315A (zh) 2022-05-27
CN114540315B true CN114540315B (zh) 2023-05-16

Family

ID=81668818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111209995.9A Active CN114540315B (zh) 2021-10-18 2021-10-18 一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114540315B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234241A (zh) * 2018-08-22 2019-01-18 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种柯萨奇病毒cva16型强毒株cva16-b6-714及其应用
WO2019163781A1 (ja) * 2018-02-20 2019-08-29 一般財団法人阪大微生物病研究会 エンテロウイルスワクチン
CN112480215A (zh) * 2020-12-04 2021-03-12 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒
CN112626034A (zh) * 2020-11-12 2021-04-09 武汉生物制品研究所有限责任公司 柯萨奇a组4型病毒突变株及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019163781A1 (ja) * 2018-02-20 2019-08-29 一般財団法人阪大微生物病研究会 エンテロウイルスワクチン
CN109234241A (zh) * 2018-08-22 2019-01-18 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种柯萨奇病毒cva16型强毒株cva16-b6-714及其应用
CN112626034A (zh) * 2020-11-12 2021-04-09 武汉生物制品研究所有限责任公司 柯萨奇a组4型病毒突变株及其应用
CN112480215A (zh) * 2020-12-04 2021-03-12 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank:QKK82695.1;Li，J.等;《GenBank》;序列 *
分离自手足口病和疱疹性咽峡炎患者的柯萨奇病毒A组10型病毒的基因特征及差异分析;饶清;赵跃丽;李仁秋;蒋鸿超;孙强明;张桢;;中国生物制品学杂志(第08期);摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114540315A (zh) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fujimoto et al. Outbreak of central nervous system disease associated with hand, foot, and mouth disease in Japan during the summer of 2000: detection and molecular epidemiology of enterovirus 71
Zhang et al. A new subgenotype 2.1 d isolates of classical swine fever virus in China, 2014
CN113564131B (zh) 柯萨奇病毒a6型毒株及其应用
CN110747175B (zh) 一株猪δ冠状病毒及其应用
CN113564130B (zh) 柯萨奇病毒a10型毒株及其应用
CN109868262B (zh) 一种犬瘟热弱毒株及其应用
WO2023246639A1 (zh) 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用
CN111411086B (zh) 一种能够有效感染大日龄幼鼠的柯萨奇a组5型病毒株
WO2023045426A1 (zh) 柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用
Elkady et al. Isolation and whole protein characterization of species A and B bovine rotaviruses from Chinese calves
CN114774372A (zh) 柯萨奇病毒a10型毒株及其疫苗和应用
CN112522211B (zh) 一组柯萨奇a组6型病毒突变株及其应用
CN111073862B (zh) 一种牛病毒性腹泻2型减毒毒株及应用
CN114540315B (zh) 一种热稳定的柯萨奇病毒a组2型病毒株
Seah et al. Variation in ORF3 of genogroup 2 Norwalk-like viruses
CN109536464B (zh) 一种缺失衣壳蛋白基因的基孔肯雅病毒感染性克隆及构建方法和在制备减毒疫苗中的应用
Le et al. Multiple genotypes of avian infectious bronchitis virus circulating in Vietnam
CN113564132B (zh) 柯萨奇病毒a16型毒株及其应用
CN108055827B (zh) 高成长肠病毒71型病毒株及其疫苗
KR20170002393A (ko) 비자연적으로 발생하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 및 사용방법
CN112626034B (zh) 柯萨奇a组4型病毒突变株及其应用
CN112375746B (zh) 一株柯萨奇a组2型病毒突变株及其应用
CN116024180A (zh) 柯萨奇病毒A组6型Vero细胞适应株及其应用
CN109602899B (zh) 一种增强病毒抗原免疫原性的皮内注射技术及其在手足口病疫苗研究中的应用
Donato et al. Characterisation of a G9P [8] rotavirus strain identified during a gastroenteritis outbreak in Alice Springs, Australia post Rotarix™ vaccine introduction

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant