WO2019142717A1 - 変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、その遺伝子および形質転換体、並びに、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents

変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、その遺伝子および形質転換体、並びに、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 Download PDF

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mutation
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新吾 小林
吉田　慎一
俊輔 佐藤
直明 田岡
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株式会社カネカ
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a mutant polyhydroxyalkanoate synthetase, a gene encoding the enzyme, a transformant containing the gene, and a method for producing polyhydroxyalkanoate using the transformant.
  • PHA Polyhydroxyalkanoate
  • PHA polyhydroxybutyrate
  • 3HB 3-hydroxybutyrate
  • PHBH a copolyester polyester Poly (3HB-co-3HH) (hereinafter referred to as, 3HB and 3-hydroxyhexanoate (hereinafter referred to as "3HH") "PHBH” has been reported.
  • PHBH is a copolymer having lower physical properties than PHB and having soft physical properties due to having 3HH as a monomer unit.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 a method of introducing a mutation into a PHA synthetase is examined in order to increase the 3HH ratio in PHBH.
  • Non-Patent Document 1 A.I. The activity of PHA synthetase and a substrate for 3HH-CoA by introducing a mutation of asparagine at position 149 into serine or substitution of asparagine at position 171 with glycine for the caviae-derived PHA synthetase It has been reported that specificity can be improved to produce PHBH with up to 18 mole% 3HH ratios.
  • Non-Patent Document 2 reports that PHBH having a higher 3HH ratio can be produced by a PHA synthetase (hereinafter abbreviated as "NSDG”) in which these two mutations are duplicated.
  • NDG PHA synthetase
  • the 3HH ratio of PHA copolymers that can be produced by culturing transformants is limited. Further, in order to produce PHA having preferable physical properties, the higher the 3HH ratio is, the higher the lower the better. Therefore, a technique for freely adjusting the 3HH ratio to high or low is necessary. For this reason, construction of a PHA synthetase library capable of producing a PHA copolymer having a higher or lower 3HH ratio is desired.
  • the present invention provides a mutant PHA synthetase that realizes production of a PHA copolymer having a high or low 3HH ratio while maintaining PHA productivity, a gene encoding the enzyme, and a transformant having the gene It is an object of the present invention to provide a method for producing PHA using the transformant.
  • the present invention has a sequence identity of 85% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a mutation having an amino acid sequence comprising any one or more mutation of the following (a) to (c) Type polyhydroxyalkanoate synthetase.
  • Mutation (a) mutation in which the 389th serine from the N terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than serine
  • Mutation (b) 436 from the N terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Mutation in which leucine is substituted with an amino acid other than leucine.
  • Mutation (c) mutation in which 11 or more and 19 or less amino acid residues are deleted from the C terminus of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1.
  • mutation (a) is a mutation in which the 389th serine from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with cysteine, isoleucine, threonine or valine. Also preferably, the mutation (a) is a mutation in which the 389th serine from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid, glutamic acid, glycine, histidine, lysine, asparagine, proline, arginine or tryptophan. It is.
  • mutation (b) is a mutation in which leucine at position 436 from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with valine.
  • mutation (b) is a mutation in which leucine at position 436 from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine, cysteine, phenylalanine, asparagine, threonine, tryptophan or tyrosine.
  • mutation (c) is a mutation in which 12 or more and 19 or less amino acid residues are deleted from the C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the mutant polyhydroxyalkanoate synthetase of the present invention preferably has an amino acid sequence further comprising a mutation in which asparagine at position 149 from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with serine. It is preferable to have an amino acid sequence further including a mutation in which aspartate at position 171 from the N-terminus of the amino acid sequence shown in 1 is substituted with glycine.
  • the present invention also relates to a gene encoding the mutant polyhydroxyalkanoate synthetase.
  • the present invention also relates to a transformant having the above gene, preferably the host is a eubacteria, more preferably the eubacteria are bacteria belonging to the genus Capriabidus, still more preferably Capriabidas necatol, still more preferably Is the Capri Abidas Nekator H16.
  • the present invention also relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid, which comprises the step of culturing the transformant.
  • the polyhydroxyalkanoic acid contains 3-hydroxyhexanoic acid as monomer unit. More preferably, the polyhydroxyalkanoic acid is a copolymer of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid.
  • a mutant PHA synthetase that realizes production of a PHA copolymer having a high or low 3HH ratio while maintaining PHA productivity, a gene encoding the enzyme, and transformation containing the gene Can provide a body.
  • culturing the transformant it becomes possible to fermentatively produce a PHA copolymer having a high or low 3HH ratio without reducing the PHA productivity.
  • mutant PHA synthetase exhibits 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and contains one or more of the mutations (a) to (c) below: It has an arrangement.
  • the present invention also provides a gene encoding the mutant PHA synthetase (hereinafter abbreviated as "mutant PHA synthetase gene").
  • the mutant PHA synthetase of the present invention realizes production of a PHA copolymer having a high or low 3HH ratio while maintaining the productivity of PHA, but it is produced by the mutant PHA synthetase of the present invention
  • the 3HH ratio of the PHA copolymer is high or low, under the same conditions as the PHA synthetase having the same amino acid sequence as the mutant PHA synthetase of the present invention except that the mutation characterized by the present invention is not introduced. It means that it is relatively high or low as compared to the 3HH ratio of the PHA copolymer which can be produced in
  • the mutant PHA synthetase of the present invention is an enzyme having PHA synthesis activity and has an amino acid sequence having a sequence identity of 85% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of PHA synthetase PhaC Ac derived from Aeromonas caviae.
  • the mutant PHA synthetase of the present invention may have a mutation other than the following mutations (a) to (c) within the range satisfying the above sequence identity.
  • the mutant PHA synthetase of the present invention may be linked to a heterologous protein having different functions to form a fusion protein.
  • the amino acid sequence of the heterologous protein is not considered when calculating the above sequence identity.
  • the sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 97 % Or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the sequence identity of the base sequence is not limited as long as it is a base sequence encoding the amino acid sequence constituting the mutant PHA synthetase of the present invention.
  • the origin of the mutant PHA synthetase and the mutant PHA synthetase gene of the present invention is not particularly limited, but is preferably derived from the genus Aeromonas, and more preferably derived from Aeromonas caviae.
  • mutant PAH synthetase of the present invention may contain any one of mutations (a) to (c), or may contain two or more of these mutations.
  • the amino acid after substitution can be selected in consideration of PHA productivity and 3HH ratio of PHA to be produced.
  • the 389th serine is aspartic acid, glutamic acid, glycine, histidine, lysine, asparagine, proline, arginine
  • a mutation substituted for tryptophan is preferred, and a mutation substituted for aspartic acid, glutamic acid, glycine, histidine, lysine, proline, arginine or tryptophan is more preferred, aspartic acid, glutamic acid, lysine, proline or Further preferred is a mutation substituted for arginine.
  • leucine at position 436 from the N-terminus is substituted with an amino acid other than leucine.
  • the amino acid after substitution can be selected in consideration of PHA productivity and 3HH ratio of PHA to be produced.
  • leucine at position 436 is alanine, cysteine, phenylalanine, asparagine, threonine, tryptophan, or tyrosine.
  • the mutation substituted is preferable, the mutation substituted by alanine, cysteine, phenylalanine or threonine is more preferable, and the mutation substituted by alanine or threonine is more preferable.
  • a mutation in which leucine at position 436 is substituted by valine is preferable.
  • the upper limit of the number of amino acid residues to be deleted is preferably 19 amino acid residues from the C-terminus, more preferably 18 amino acid residues, still more preferably 17 amino acid residues, and 16 amino acid residues remaining Groups are particularly preferred, and 15 amino acid residues are most preferred.
  • the lower limit of the number of amino acid residues to be deleted is preferably 11 amino acid residues from the C-terminus, more preferably 12 amino acid residues, and still more preferably 13 amino acid residues.
  • the amino acid sequence of the mutant PHA synthetase of the present invention further comprises a mutation in which asparagine at position 149 from the N-terminus is substituted with serine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 to enhance PHA productivity. It is preferable to further include a mutation in which aspartic acid at position 171 from the N-terminus is substituted with glycine.
  • the transformant of the present invention is a transformant having a gene encoding the mutant PHA synthetase of the present invention, and is produced by introducing the gene into a host microorganism.
  • the host of the transformant of the present invention is not particularly limited, and any microorganism such as fungus (mold, fungus, yeast and the like), eubacteria (bacteria) and archaea can be used, but eubacteria are preferable.
  • eubacteria include, for example, Ralstonia genera, Cupriavidus genera, Wautersia genera, Aeromonas genera, Aeromonas genera, Escherichia genera, Alcaligenes genera, Pseudomonas genera.
  • the bacteria belonging to are mentioned as a preferred example.
  • bacteria belonging to the genus Lalstonia, Capriabidas, Aeromonas or Wautersia still more preferably bacteria belonging to the genus Capriabidus or Aeromonas, still more preferably Capribidas It is a bacterium belonging to the genus, particularly preferably Capriavidus necator (Cupriavidus necator), and most preferably Capriavidus necator H16 strain.
  • any method can be used as a method of introducing the mutant PHA synthetase gene of the present invention into a host microorganism.
  • the mutant PHA synthetase gene of the present invention may be introduced onto a chromosome, a plasmid, a DNA such as a megaplasmid carried by a microorganism serving as a host using known genetic recombination techniques, or A plasmid vector or artificial chromosome into which the gene has been introduced may be introduced into the host microorganism.
  • a method of introducing the gene onto a chromosome or megaplasmid carried by a microorganism is preferable, and a method of introducing the gene onto a chromosome held by a microorganism is more preferable.
  • a method of site-specific substitution or insertion of an arbitrary base sequence on DNA possessed by a microorganism, or a method of deleting an arbitrary nucleotide sequence in DNA possessed by a microorganism is widely known to those skilled in the art. It can be used in producing the transformant of the present invention. Although not particularly limited, as a representative method, a method using transposon and the mechanism of homologous recombination (Ohman et al., J. Bacteriol., Vol. 162: p.
  • the method for introducing the vector into the microorganism is not particularly limited, and examples thereof include the calcium chloride method, the electroporation method, the polyethylene glycol method, the spheroplast method and the like.
  • the gene can be linked to any expression regulatory sequence.
  • an expression control sequence is described as a sequence composed of a promoter and a Shine-Dalgarno sequence.
  • an expression regulatory sequence for example, the expression regulatory sequence (SEQ ID NO: 2) of the phaC1 gene of Capriavidas nekator or the expression regulatory sequence (SEQ ID NO: 3) of the phaP1 gene can be used.
  • lac promoter SEQ ID NO: 4
  • trp promoter SEQ ID NO: 5
  • lacUV 5 promoter SEQ ID NO: 6
  • trc promoter SEQ ID NO: 7
  • tic promoter SEQ ID NO: 6
  • the tac promoter SEQ ID NO: 9
  • lacN17 promoter SEQ ID NO: 10
  • the like can also be used as an expression regulatory sequence by linking it with the SD sequence (SEQ ID NO: 11) derived from Capriavidas nekator H16 strain.
  • PHA By culturing the transformant of the present invention, PHA can be produced by the transformant and PHA can be produced by recovering the obtained PHA.
  • the transformant is preferably cultured in a medium containing a carbon source, a nitrogen source which is a nutrient source other than the carbon source, inorganic salts, and other organic nutrient sources.
  • the carbon source is not particularly limited as long as it is a carbon source containing fats and oils and / or fatty acids that can be assimilated by the transformant of the present invention, and any carbon source can be used.
  • oils and fats such as palm oil, palm kernel oil, corn oil, coconut oil, olive oil, soybean oil, rapeseed oil, jatropha oil and their fractionated oils; lauric acid, oleic acid, stearic acid, palmitic acid, Examples thereof include fatty acids such as myristin acid and derivatives thereof.
  • nitrogen source examples include ammonia; ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate; peptone, meat extract, yeast extract and the like.
  • inorganic salts examples include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • organic nutrient sources include, for example, amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine and proline; and vitamins such as vitamin B1, vitamin B12 and vitamin C.
  • conditions such as culture temperature, culture time, pH at the time of culture, and the like are the host microorganism, for example, Ralstonia, Capriabidas, Wautersia, Aeromonas, Escherichia, Alcaligenes.
  • the conditions may be those commonly used in the culture of microorganisms such as Pseudomonas, and are not particularly limited.
  • the type of PHA produced in the present invention is not particularly limited as long as it is a PHA copolymer containing 3HH as a monomer unit.
  • PHA obtained by polymerizing 3HH with one or more monomers selected from 2-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms, 3-hydroxyalkanoic acid (except 3HH) and 4-hydroxyalkanoic acid Copolymers are preferred, and P (3HB-co-3HH), which is a copolymer of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid, is most preferred.
  • the type of PHA to be produced is the type of PHA synthetase gene carried by the microorganism used or introduced separately, the type of metabolic gene involved in PHA synthesis, the carbon source used for culture, and the like It can be appropriately selected depending on culture conditions and the like.
  • recovery of PHA from the cells is not particularly limited, and can be carried out by a known method.
  • PHA can be recovered by the following method. After completion of the culture, cells are separated from the culture solution by a centrifuge or the like, and the cells are washed with distilled water, methanol or the like and dried. PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform. The cell components are removed from the organic solvent solution containing PHA by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate PHA. Furthermore, the supernatant is removed by filtration or centrifugation and dried to recover PHA.
  • the analysis of the monomer unit composition (mol%) such as 3HH unit contained in the obtained PHA can be carried out, for example, by gas chromatography, nuclear magnetic resonance method or the like.
  • the genetic manipulation described below can be performed with reference to the description of Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • enzymes used for gene manipulation, cloning hosts and the like can be purchased from market suppliers and used according to the description.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can be used for genetic manipulation.
  • a plasmid for phaC1 gene disruption was prepared.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 12) having a nucleotide sequence upstream and downstream of the phaC1 gene was obtained by PCR using synthetic oligo DNA.
  • the resulting DNA fragment was digested with restriction enzyme SwaI.
  • This DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP2007-259708, which was also digested with SwaI, to prepare a plasmid vector pNS2X-sacB-phaC1UL for gene disruption having a nucleotide sequence upstream and downstream from phaC1. did.
  • ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 strain was prepared using pNS2X-sacB-phaC1UL.
  • pNS2X-sacB-phaC1UL was introduced into E. coli strain S17-1 (ATCC 47055).
  • the resulting transformants were mixed and cultured on KNK 005 trc-pha J4b ⁇ pha Z1, 2, 6 (see WO 2015/115619) and Nutrient Agar medium (Difco) to conduct junctional transfer.
  • the resulting culture solution was collected on a Simmons agar medium containing 250 mg / L kanamycin (2 g / L sodium citrate, 5 g / L sodium chloride, 0.2 g / L magnesium sulfate heptahydrate, 1 g ammonium dihydrogenphosphate / l Inoculate L, 1 g / L of dipotassium hydrogen phosphate, agar 15 g / L, pH 6.8), and obtain a strain in which pNS2X-sacB-phaC1UL has been integrated on the chromosome of KNK005 trc-pha J4b ⁇ pha Z1, 2, 6 strain did.
  • This strain was cultured for two generations in Nutrient Broth medium (manufactured by Difco), diluted and applied onto Nutrient Agar medium containing 15% sucrose to obtain a strain from which the plasmid was detached. From the resulting transformants, one strain of which strain from the start codon to the stop codon of the phaC1 gene on the chromosome was deleted was isolated by PCR and DNA sequencer analysis. This gene-disrupted strain was designated as H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6.
  • the obtained H16 ⁇ pha C1 Ptrc-pha J4 b dZ1,2,6 is deleted from the start codon to the stop codon of the phaZ1 gene and phaZ6 gene on the chromosome of the Capribidas nekator H16 strain, and further from the 16th codon of the phaZ2 gene
  • This strain is a strain in which deletion to the stop codon has been carried out, expression of the R-body specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome has been enhanced, and furthermore, the start codon to the stop codon of the phaC1 gene has been deleted.
  • the resulting pCUP2-Ptrp-NSDG is a plasmid that expresses NSDG under the trp promoter.
  • NSDG is a mutant PHA synthetase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, wherein substitution of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with serine at asparagine 149 from the N-terminus, and 171 Two types of mutations have been introduced: substitution of aspartic acid with glycine.
  • Preparation Example 3 Preparation of pCUP2-Ptrp-NSDG-S389X PCR was performed using pCUP2-Ptrp-NSDG prepared in Preparation Example 2 as a template and the DNAs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 as primer pairs. Similarly, PCR was performed using the DNAs shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 as primer pairs. Using the two types of DNA fragments obtained by the above PCR as templates and the DNAs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 18 as primer pairs, PCR was performed under the same conditions to obtain DNA fragments.
  • This DNA fragment was ligated with a DNA fragment obtained by digesting pCUP2 vector with MunI and SpeI using In-fusion HD Cloning Kit, and introduced into E. coli JM109 competent cells (Takara Bio).
  • the plasmid was recovered from each E. coli colony and the DNA sequence was confirmed to obtain pCUP2-Ptrp-NSDG-S389X.
  • X represents amino acids A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, or Y.
  • the obtained pCUP2-Ptrp-NSDG-S389X is a plasmid that expresses NSDG having a mutation in which the 389th serine from the N-terminus is substituted with X under the trp promoter.
  • PCR was performed using pCUP2-Ptrp-NSDG prepared in Preparation Example 2 as a template and the DNAs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 19 as primer pairs. Similarly, PCR was performed using the DNAs shown in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 18 as primer pairs. Using the two types of DNA fragments obtained by the above PCR as templates and the DNAs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 18 as primer pairs, PCR was performed under the same conditions to obtain DNA fragments.
  • This DNA fragment was ligated with a DNA fragment obtained by digesting pCUP2 vector with MunI and SpeI using In-fusion HD Cloning Kit, and introduced into E. coli JM109 competent cells (Takara Bio).
  • the plasmid was recovered from each E. coli colony, and the DNA sequence was confirmed to obtain pCUP2-Ptrp-NSDG-L436X.
  • X represents amino acids A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, or Y.
  • the obtained pCUP2-Ptrp-NSDG-L436X is a plasmid that expresses NSDG having a mutation in which leucine at position 436 from the N-terminus is substituted with X under the trp promoter.
  • Preparation Example 5 Preparation of pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT5 PCR was performed using pCUP2-Ptrp-NSDG prepared in Preparation Example 2 as a template and the DNAs represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 21 as primer pairs.
  • the obtained DNA fragment was ligated with a DNA fragment obtained by digesting pCUP2 vector with MunI and SpeI using In-fusion HD Cloning Kit to obtain pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT5.
  • the obtained pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT5 is a plasmid that expresses NSDG having a mutation in which 5 amino acid residues are deleted from the C-terminus under the trp promoter.
  • Preparation Example 6 Preparation of pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT10 PCR was carried out using pCUP2-Ptrp-NSDG prepared in Preparation Example 2 as a template and the DNAs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 22 as primer pairs.
  • the obtained DNA fragment was ligated with a DNA fragment prepared by digesting pCUP2 vector with MunI and SpeI using In-fusion HD Cloning Kit to obtain pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT10.
  • the obtained pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT10 is a plasmid that expresses NSDG having a mutation in which 10 amino acid residues are deleted from the C-terminus under the trp promoter.
  • Preparation Example 7 Preparation of pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT13 PCR was carried out using pCUP2-Ptrp-NSDG prepared in Preparation Example 2 as a template and the DNAs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 23 as primer pairs.
  • the obtained DNA fragment was ligated with a DNA fragment prepared by digesting pCUP2 vector with MunI and SpeI using In-fusion HD Cloning Kit to obtain pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT13.
  • the obtained pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT13 is a plasmid that expresses NSDG having a mutation in which 13 amino acid residues are deleted from the C-terminus under the trp promoter.
  • Preparation Example 8 Preparation of pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT15 PCR was carried out using pCUP2-Ptrp-NSDG prepared in Preparation Example 2 as a template and the DNAs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 24 as primer pairs.
  • the obtained DNA fragment was ligated with a DNA fragment obtained by digesting pCUP2 vector with MunI and SpeI using In-fusion HD Cloning Kit to obtain pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT15.
  • the obtained pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT15 is a plasmid that expresses NSDG having a mutation in which 15 amino acid residues are deleted from the C-terminus under the trp promoter.
  • pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT20 PCR was performed using the pCUP2-Ptrp-NSDG prepared in Preparation Example 2 as a template and the DNAs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 25 as primer pairs.
  • the obtained DNA fragment was ligated with a DNA fragment prepared by digesting pCUP2 vector with MunI and SpeI using In-fusion HD Cloning Kit to obtain pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT20.
  • the obtained pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT20 is a plasmid that expresses NSDG having a mutation in which 20 amino acid residues are deleted from the C-terminus under the trp promoter.
  • the bacterial fluid was mixed with the pCUP2-Ptrp-NSDG plasmid solution prepared in Preparation Example 2 and injected into a cuvette for electroporation. Electroporation was performed using a MicroPulser electroporator (Bio-Rad) under conditions of a voltage of 1.5 kV, a resistance of 800 ⁇ , and a current of 25 ⁇ F. After electroporation, the cell solution was collected, 5 mL of Nutrient Broth medium was added, and the cells were cultured at 30 ° C. for 3 hours. The obtained culture solution was applied to Nutrient Agar medium containing 100 mg / L kanamycin sulfate. After culturing at 30 ° C.
  • a strain into which the plasmid had been introduced was obtained from the obtained colonies.
  • the obtained strain was designated as H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 / pCUP2-Ptrp-NSDG strain.
  • Production Example 15 Preparation of H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 / pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT13 Strain
  • PCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT13 prepared in Production Example 7 was introduced as a parent strain.
  • the obtained strain was designated as H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 / pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT13 strain.
  • Production Example 16 Preparation of H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 / pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT15 Strain
  • PCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT15 prepared in Production Example 8 was introduced as a parent strain.
  • the obtained strain was designated as H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 / pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT15 strain.
  • Production Example 17 Preparation of H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 / pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT20 Strain
  • PCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT20 prepared in Production Example 9 was introduced as a parent strain.
  • the obtained strain was designated as H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 / pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ CT20 strain.
  • the gas chromatograph used was GC-17A manufactured by Shimadzu Corporation, and the capillary column used was NEUTRA BOND-1 (column length 25 m, column inner diameter 0.25 mm, liquid film thickness 0.4 ⁇ m) manufactured by GL Science Inc. He was used as a carrier gas, the column inlet pressure was 100 kPa, and 1 ⁇ L of the sample was injected. The temperature was raised at a rate of 8 ° C./min from the initial temperature of 50 ° C. to 200 ° C., and further raised at a rate of 30 ° C./min from 200 ° C. to 290 ° C.
  • composition of the seed culture medium is 10 g / L meat extract, 10 g / L bacto tryptone, 2 g / L yeast extract , 9 g / L sodium dihydrogen phosphate 12 hydrate, 1.5 g / L dipotassium hydrogen phosphate.
  • the composition of the PHA production medium is 11 g / L disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, 1.9 g / L dipotassium hydrogen phosphate, 1.3 g / L ammonium sulfate, 5 mL / L magnesium solution, 1 mL / L trace metal salt It was a solution.
  • the magnesium solution was prepared by dissolving 200 g / L magnesium sulfate heptahydrate in water.
  • the trace metal salt solution is 0.1N hydrochloric acid, 0.218 g / L cobalt chloride hexahydrate, 16.2 g / L iron (III) chloride hexahydrate, 10.3 g / L calcium chloride dihydrate It was prepared by dissolving 0.118 g / L nickel chloride hexahydrate, 0.156 g / L copper sulfate pentahydrate.
  • PHA production cultures were performed in flasks. 50 mL of PHA production medium was placed in a 500 mL shake flask. Immediately before inoculation, 250 ⁇ L of a magnesium solution, 50 ⁇ L of a trace metal solution, and 1 g of palm kernel oil were added. After preparation of the medium, 500 ⁇ L of the preculture liquid was inoculated into a shake flask, and shake culture was performed at 30 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, the cells were recovered from 10 mL of the culture solution, washed with ethanol, and then vacuum dried at 60 ° C. to obtain dry cells containing PHA, and the dry cell weight was measured. The results of dry cell weight and 3HH ratio are shown in Table 1.
  • the serine at position 389 of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), glycine (G), histidine (H), lysine (K), asparagine N), 9 kinds of variants (Examples 1 to 9) substituted with proline (P), arginine (R) or tryptophan (W) show a decrease in 3HH ratio compared to Comparative Example 1
  • an increase in 3HH ratio was observed in four variants (Examples 10 to 13) in which the 389th serine was substituted with cysteine (C), isoleucine (I), threonine (T), or valine (V).
  • PHA synthetase having a mutation in which serine at position 389 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid, glutamic acid, glycine, histidine, lysine, asparagine, proline, arginine or tryptophan is A PHA synthetase which is useful for producing PHA having a low 3HH ratio while maintaining polymer productivity, and which has a mutation in which serine at position 389 of the amino acid sequence is replaced with cysteine, isoleucine, threonine or valine Is found to be useful for producing PHA having a high 3HH ratio while maintaining polymer productivity.
  • leucine at position 436 of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), glycine (G), histidine (H), lysine (K), proline (P)
  • mutants Comparative examples 8 to 11, 13, 15 to 18 substituted with glutamine (Q), arginine (R), or serine (S)
  • dry cells compared to comparative example 1 The weight is greatly reduced, and it is considered that the polymer productivity is reduced.
  • the 436th leucine is substituted with alanine (A), cysteine (C), phenylalanine (F), asparagine (N), threonine (T), tryptophan (W) or tyrosine (Y)
  • A alanine
  • C cysteine
  • F phenylalanine
  • N asparagine
  • T threonine
  • W tryptophan
  • Y tyrosine
  • PHA synthetase having a mutation in which leucine at position 436 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine, cysteine, phenylalanine, asparagine, threonine, tryptophan or tyrosine maintains polymer productivity. It is useful to produce PHA with low 3HH ratio as it is, and a PHA synthetase having a mutation in which leucine at position 436 of the amino acid sequence is substituted by valine has high 3HH ratio while maintaining polymer productivity. It proves to be useful for producing PHA.
  • H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 / pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ C5, ⁇ C10, ⁇ C13, ⁇ C15, or ⁇ C20 strain for PHA production Prepared in Production Examples 13 to 17 H16 ⁇ phaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6 / pCUP2-Ptrp-NSDG ⁇ C5, ⁇ C10, ⁇ C13, ⁇ C15, or ⁇ C20 was cultured in the same manner as in Comparative Example 1, and the dry cell weight and 3HH ratio were determined. analyzed. The results are shown in Table 3.
  • PHA synthetase having a mutation in which an appropriate number of amino acid residues are deleted from the C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 produces PHA with a low 3HH ratio while maintaining polymer productivity. It is found to be useful for

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Abstract

ＰＨＡの生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高い又は低いＰＨＡ共重合体の製造を実現する変異型ＰＨＡ合成酵素の提供。配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつ、下記（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の変異を含むアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。　変異（ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンが、セリン以外のアミノ酸に置換された変異　変異（ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から４３６番目のロイシンが、ロイシン以外のアミノ酸に置換された変異　変異（ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端から１１個以上１９個以下のアミノ酸残基が欠失された変異

Description

変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、その遺伝子および形質転換体、並びに、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
　本発明は、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を有する形質転換体、及び該形質転換体を用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
　ポリヒドロキシアルカン酸（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ；以下、「ＰＨＡ」と略す）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー貯蔵物質として生産、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって様々な天然の炭素源から生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解される環境調和型のプラスチックである。
　ＰＨＡとして、３－ヒドロキシ酪酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「３ＨＢ」と略す）のホモポリマーであるポリヒドロキシブチレート（Ｐｏｌｙ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「ＰＨＢ」と略す）が知られているが、ＰＨＢは高結晶性であり、結晶化度が高いため硬くて脆く、また、溶融加工性が低いという問題点を有している。
　ＰＨＢの脆性や溶融加工性が改善されたＰＨＡとしては、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ；以下、「３ＨＨ」と略す）の共重合ポリエステルＰｏｌｙ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（以下、「ＰＨＢＨ」と略す）が報告されている。ＰＨＢＨは、３ＨＨをモノマーユニットとして有することで、ＰＨＢと比べて結晶化度が低くなり、しやなかで柔らかい物性を有する共重合体である。
　ＰＨＢＨの製造方法としては、土壌細菌カプリアヴィダス　ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）を宿主としてアエロモナス　キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）由来のＰＨＡ合成酵素を導入した形質転換体を用いた発酵生産によるものが報告されているが、ＰＨＢＨの柔軟性を高めるため、ＰＨＢＨにおける３ＨＨ比率を高める検討が行なわれている。
　非特許文献１及び２では、ＰＨＢＨにおける３ＨＨ比率を高めるために、ＰＨＡ合成酵素に変異を導入する方法が検討されている。具体的には、非特許文献１では、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素に対し、１４９番目のアスパラギンのセリンへの置換、または、１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換という変異を導入することによって、ＰＨＡ合成酵素の活性と３ＨＨ－ＣｏＡに対する基質特異性が向上して、最大１８モル％の３ＨＨ比率を有するＰＨＢＨを製造できることが報告されている。
　さらに非特許文献２では、この二つの変異を重複させたＰＨＡ合成酵素（以下、「ＮＳＤＧ」と略す）によって、さらに３ＨＨ比率の高いＰＨＢＨを生産できることが報告されている。
Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ，Ｓ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８，ｐｐ．２４１１－２４１９（２００２） Ｔ．Ｔｓｕｇｅ，Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｄ．Ｓｈｉｍａｄａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｔａｇｕｃｈｉ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２７７，ｐｐ．２１７－２２２（２００７）
　現在、形質転換体の培養によって生産できるＰＨＡ共重合体の３ＨＨ比率は限定的である。また好ましい物性を有するＰＨＡを製造するためには、３ＨＨ比率は高いほど良いとは限らないため、３ＨＨ比率を高位又は低位に自在に調節する技術が必要である。このため、３ＨＨ比率がより高い又は低いＰＨＡ共重合体を製造できるＰＨＡ合成酵素ライブラリーの構築が望まれている。
　そこで、本発明は、ＰＨＡの生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高い又は低いＰＨＡ共重合体の製造を実現する変異型ＰＨＡ合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を有する形質転換体、及び、該形質転換体を用いたＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＨＡ合成酵素の３８９番目のセリンに対する変異導入、４３６番目のロイシンに対する変異導入、又は、Ｃ末端領域の欠失によって、ＰＨＡの生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が異なるＰＨＡ共重合体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつ、下記（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の変異を含むアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素である。
　変異（ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンが、セリン以外のアミノ酸に置換された変異
　変異（ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から４３６番目のロイシンが、ロイシン以外のアミノ酸に置換された変異
　変異（ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端から１１個以上１９個以下のアミノ酸残基が欠失された変異。
　好ましくは、変異（ａ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンがシステイン、イソロイシン、トレオニン又はバリンに置換された変異である。また、好ましくは、変異（ａ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンがアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、プロリン、アルギニン又はトリプトファンに置換された変異である。
　好ましくは、変異（ｂ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から４３６番目のロイシンがバリンに置換された変異である。また、好ましくは、変異（ｂ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から４３６番目のロイシンがアラニン、システイン、フェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、トリプトファン又はチロシンに置換された変異である。
　好ましくは、変異（ｃ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＣ末端から１２個以上１９個以下のアミノ酸残基が欠失された変異である。
　本発明の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１４９番目のアスパラギンがセリンに置換された変異をさらに含むアミノ酸配列を有することが好ましく、また、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異をさらに含むアミノ酸配列を有することが好ましい。
　本発明はまた、前記変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子にも関する。
　さらに本発明は、前記遺伝子を有する形質転換体にも関し、好ましくは宿主が真正細菌であり、より好ましくは真正細菌がカプリアビダス属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス　ネカトールであり、よりさらに好ましくはカプリアビダス　ネカトールＨ１６である。
　さらにまた、本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法にも関する。好ましくは、ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する。より好ましくは、ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である。
　本発明によれば、ＰＨＡの生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高い又は低いＰＨＡ共重合体の製造を実現する変異型ＰＨＡ合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、及び該遺伝子を有する形質転換体を提供することができる。また、該形質転換体を培養することにより、ＰＨＡの生産性を低下させることなく、３ＨＨ比率が高い又は低いＰＨＡ共重合体を発酵生産することが可能となる。
　以下に本発明を詳細に説明する。
　（変異型ＰＨＡ合成酵素）
　本発明に係る変異型ＰＨＡ合成酵素は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつ、下記（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の変異を含むアミノ酸配列を有するものである。また、本発明は、該変異型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（以下、「変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子」と略す）も提供する。
　本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素は、ＰＨＡの生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高い又は低いＰＨＡ共重合体の製造を実現するものであるが、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素により製造されるＰＨＡ共重合体の３ＨＨ比率が高い又は低いとは、本発明の特徴たる変異を導入していないこと以外は本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素と同じアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素が同じ条件下で製造し得るＰＨＡ共重合体の３ＨＨ比率と比較して、相対的に高い又は低いことを意味する。
　本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素は、ＰＨＡ合成活性を有する酵素であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣＡｃのアミノ酸配列である。本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素は、上記配列同一性を満足する範囲において、下記（ａ）～（ｃ）の変異以外の変異を有するものであってよい。
　本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素は、異なる機能を有する異種タンパク質と結合して融合タンパク質を形成したものであってもよい。この場合、異種タンパク質のアミノ酸配列は、上記配列同一性を算出する際に考慮しない。
　本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素において、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性は、８５％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
　また、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子の塩基配列については、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素を構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列である限り、塩基配列の配列同一性は限定されない。
　本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素および変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子の由来については、特に限定されないが、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来であることが好ましく、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ由来であることがより好ましい。
　次に、本発明の変異型ＰＡＨ合成酵素が含む変異（ａ）～（ｃ）について説明する。本発明の変異型ＰＡＨ合成酵素は、変異（ａ）～（ｃ）のうちいずれか１つを含むものであってもよいし、これら変異の２以上を含むものであってもよい。
　変異（ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から３８９番目のセリンが、セリン以外のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ－ＣｏＡ特異性を低下させ、３ＨＨ比率が低いＰＨＡを生産するには、３８９番目のセリンが、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、又は、トリプトファンに置換された変異が好ましく、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、アルギニン、又は、トリプトファンに置換された変異がより好ましく、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、プロリン、又は、アルギニンに置換された変異がさらに好ましい。一方、ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ－ＣｏＡ特異性を上昇させ、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、３８９番目のセリンが、システイン、イソロイシン、トレオニン、又は、バリンに置換された変異が好ましく、システイン、トレオニン、又は、バリンに置換された変異がより好ましい。
　変異（ｂ）:配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から４３６番目のロイシンが、ロイシン以外のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ－ＣｏＡ特異性を低下させ、３ＨＨ比率が低いＰＨＡを生産するには、４３６番目のロイシンが、アラニン、システイン、フェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、トリプトファン、又は、チロシンに置換された変異が好ましく、アラニン、システイン、フェニルアラニン、又は、トレオニンに置換された変異がより好ましく、アラニン又はトレオニンに置換された変異がさらに好ましい。一方、ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ－ＣｏＡ特異性を上昇させ、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、４３６番目のロイシンが、バリンに置換された変異が好ましい。
　変異（ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｃ末端領域のアミノ酸配列が欠失される。これにより、ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ－ＣｏＡ特異性を低下させ、３ＨＨ比率が低いＰＨＡを生産することができる。欠失させるアミノ酸残基の個数の上限としては、Ｃ末端から１９個のアミノ酸残基が好ましく、１８個のアミノ酸残基がより好ましく、１７個のアミノ酸残基がさらに好ましく、１６個のアミノ酸残基が特に好ましく、１５個のアミノ酸残基が最も好ましい。欠失させるアミノ酸残基の個数の下限としては、Ｃ末端から１１個のアミノ酸残基が好ましく、１２個のアミノ酸残基がより好ましく、１３個のアミノ酸残基がさらに好ましい。
　本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列は、ＰＨＡ生産性を高めるため、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から１４９番目のアスパラギンがセリンに置換された変異をさらに含むこと、及び／又は、Ｎ末端から１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異をさらに含むことが好ましい。
　（３ＨＨ単位含有共重合ＰＨＡを生産する形質転換体）
　本発明の形質転換体は、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体であり、該遺伝子を宿主の微生物に導入することにより製造される。
　本発明の形質転換体の宿主としては特に限定はなく、真菌（カビ、きのこ、酵母など）、真正細菌（バクテリア）、古細菌など任意の微生物を利用できるが、真正細菌が好ましい。当該真正細菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌が好ましい例として挙げられる。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、又は、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する細菌であり、特に好ましくはカプリアビダス　ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）であり、最も好ましくはカプリアビダス　ネカトールＨ１６株である。
　本発明の形質転換体を製造するにあたって、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子を宿主の微生物に導入する方法としては、任意の方法を利用することができる。一例として、公知の遺伝子組換え技術を用いて、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子を、宿主となる微生物が保有する染色体、プラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に導入してもよいし、また、該遺伝子を導入したプラスミドベクターまたは人工染色体を宿主の微生物に導入してもよい。しかし、導入された遺伝子の保持という観点から、微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に該遺伝子を導入する方法が好ましく、微生物が保有する染色体上に該遺伝子を導入する方法がより好ましい。
　微生物が保有するＤＮＡ上に任意の塩基配列を部位特異的に置換又は挿入する方法、または、微生物が保有するＤＮＡ中の任意の塩基配列を欠失させる方法は当業者に広く知られており、本発明の形質転換体を製造する際に使用できる。特に限定されないが、代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６２：ｐ．１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐ．１９７（１９８７））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ．１１９５（１９９２）；Ｌｅｎｚ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７６，ｐ．４３８５（１９９４））等が挙げられる。また、微生物へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
　なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９又は２００１）などに記載される技術を利用することができる。
　本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入するにあたっては、該遺伝子を任意の発現調節配列に連結することができる。本明細書において、発現調節配列は、プロモーターとシャイン・ダルガノ配列から構成される配列として記載する。このような発現調節配列としては、例えばカプリアビダス　ネカトールのｐｈａＣ１遺伝子の発現調節配列（配列番号２）やｐｈａＰ１遺伝子の発現調節配列（配列番号３）が使用できる。または、大腸菌に由来するｌａｃプロモーター（配列番号４）やｔｒｐプロモーター（配列番号５）、あるいは人工的に作製されたｌａｃＵＶ５プロモーター（配列番号６）、ｔｒｃプロモーター（配列番号７）、ｔｉｃプロモーター（配列番号８）、ｔａｃプロモーター（配列番号９）、ｌａｃＮ１７プロモーター（配列番号１０）等を、カプリアヴィダス　ネカトールＨ１６株由来のＳＤ配列（配列番号１１）と連結し、発現調節配列として使用することもできる。
　（ＰＨＡの製造方法）
　本発明の形質転換体を培養することで、該形質転換体にＰＨＡを生産させ、得られたＰＨＡを回収することでＰＨＡを製造することができる。
　本発明によるＰＨＡの生産においては、炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地において、前記形質転換体を培養することが好ましい。
　炭素源としては、本発明の形質転換体が資化可能な、油脂および／または脂肪酸などを含む炭素源であれば特に限定されず、どのような炭素源でも使用可能である。具体的には、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
　無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
　そのほかの有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
　本発明の形質転換体を培養する際の、培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、宿主の微生物、例えばラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等の微生物の培養で通常使用されるような条件であってよく、特に限定されない。
　本発明において生産されるＰＨＡの種類としては、３ＨＨをモノマーユニットとして含有するＰＨＡ共重合体であれば特に限定されない。なかでも、炭素数４～１６の２－ヒドロキシアルカン酸、３－ヒドロキシアルカン酸（３ＨＨを除く）および４－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種以上のモノマーと３ＨＨとを重合して得られるＰＨＡ共重合体が好ましく、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体であるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）が最も好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、使用する微生物の保有する又は別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、ＰＨＡ合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養に使用する炭素源、その他の培養条件などによって適宜選択しうる。
　本発明において、形質転換体を培養した後、菌体からのＰＨＡの回収は、特に限定されず、公知の方法によって実施することができる。一例として、次のような方法によってＰＨＡを回収することができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
　得られたＰＨＡに含まれる３ＨＨ単位等のモノマー単位組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により実施することができる。
　以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　以下で説明する遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））の記載を参照して実施することができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、前記酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
　（製造例１）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株の作製
　まず、ｐｈａＣ１遺伝子破壊用プラスミドを作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｐｈａＣ１遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１２）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩで消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢと連結し、ｐｈａＣ１より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ｐｈａＣ１ＵＬを作製した。
　次に、ｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ｐｈａＣ１ＵＬを用いてΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株を作製した。ｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ｐｈａＣ１ＵＬを大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）に導入した。得られた形質転換体を、ＫＮＫ００５　ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ΔｐｈａＺ１,２,６株（国際公開第２０１５／１１５６１９号参照）とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。
　得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、ｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ｐｈａＣ１ＵＬがＫＮＫ００５　ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ΔｐｈａＺ１,２,６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のショ糖を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、プラスミドが脱落した株を取得した。得られた形質転換体から、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のｐｈａＣ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株と命名した。
　得られたＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株は、カプリアビダス　ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子及びｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、さらにｐｈａＣ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。
　（製造例２）ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧの作製
　合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号１３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。取得したＤＮＡ断片を、特開２００７－２５９７０８号公報記載のｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）にて連結し、ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧを得た。
　得られたｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧを発現するプラスミドである。
　ＮＳＤＧとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＨＡ合成酵素であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１４９番目のアスパラギンのセリンへの置換、及び、１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換という２種類の変異が導入されたものである。
　（製造例３）ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｓ３８９Ｘの作製
　製造例２で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧを鋳型とし、配列番号１５および配列番号１６で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。同様に配列番号１７および配列番号１８で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１５および配列番号１８で示したＤＮＡをプライマーペアとして、同様の条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔにて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）に導入した。各大腸菌コロニーからプラスミドを回収し、ＤＮＡ配列を確認することにより、ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｓ３８９Ｘを取得した。ここで、Ｘは、アミノ酸Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，又は、Ｙを表す。得られたｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｓ３８９Ｘは、ｔｒｐプロモーター下で、Ｎ末端から３８９番目のセリンがＸに置換された変異を有するＮＳＤＧを発現するプラスミドである。
　（製造例４）ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｌ４３６Ｘの作製
　製造例２で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧを鋳型とし、配列番号１５および配列番号１９で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。同様に配列番号２０および配列番号１８で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１５および配列番号１８で示したＤＮＡをプライマーペアとして、同様の条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔにて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）に導入した。各大腸菌コロニーからプラスミドを回収し、ＤＮＡ配列を確認することにより、ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｌ４３６Ｘを取得した。ここで、Ｘは、アミノ酸Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，又は、Ｙを表す。得られたｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｌ４３６Ｘは、ｔｒｐプロモーター下で、Ｎ末端から４３６番目のロイシンがＸに置換された変異を有するＮＳＤＧを発現するプラスミドである。
　（製造例５）ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ５の作製
　製造例２で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧを鋳型とし、配列番号１５および配列番号２１で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔにて連結し、ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ５を取得した。得られたｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ５は、ｔｒｐプロモーター下で、Ｃ末端から５個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するＮＳＤＧを発現するプラスミドである。
　（製造例６）ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１０の作製
　製造例２で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧを鋳型とし、配列番号１５および配列番号２２で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔにて連結し、ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１０を取得した。得られたｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１０は、ｔｒｐプロモーター下で、Ｃ末端から１０個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するＮＳＤＧを発現するプラスミドである。
　（製造例７）ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１３の作製
　製造例２で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧを鋳型とし、配列番号１５および配列番号２３で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔにて連結し、ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１３を取得した。得られたｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１３は、ｔｒｐプロモーター下で、Ｃ末端から１３個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するＮＳＤＧを発現するプラスミドである。
　（製造例８）ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１５の作製
　製造例２で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧを鋳型とし、配列番号１５および配列番号２４で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔにて連結し、ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１５を取得した。得られたｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１５は、ｔｒｐプロモーター下で、Ｃ末端から１５個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するＮＳＤＧを発現するプラスミドである。
　（製造例９）ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ２０の作製
　製造例２で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧを鋳型とし、配列番号１５および配列番号２５で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔにて連結し、ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ２０を取得した。得られたｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ２０は、ｔｒｐプロモーター下で、Ｃ末端から２０個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するＮＳＤＧを発現するプラスミドである。
　（製造例１０）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ株の作製
　まず、製造例１で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ）で一晩培養した。得られた培養液０．５ｍＬをＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地１００ｍＬに接種し、３０℃で３時間培養した。得られた培養液を氷上で速やかに冷却し、菌体を回収して氷冷した蒸留水で良く洗浄した後、得られた菌体を２ｍＬの蒸留水に懸濁した。菌体液を、製造例２で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧプラスミド溶液と混合し、キュベットに注入してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（バイオ・ラッド）を使用し、電圧１.５ｋＶ、抵抗８００Ω、電流２５μＦの条件で行った。エレクトロポレーション後、菌体溶液を回収して５ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地を添加し、３０℃で３時間培養した。得られた培養液を、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地に塗布した。３０℃で３日間培養し、得られたコロニーからプラスミドが導入された菌株を取得した。得られた菌株をＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ株と命名した。
　（製造例１１）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｓ３８９Ｘ株の作製
　製造例１０と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株を親株とし、製造例３で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｓ３８９Ｘを導入した。得られた菌株をＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｓ３８９Ｘ株と命名した。
　（製造例１２）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｌ４３６Ｘ株の作製
　製造例１０と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株を親株とし、製造例４で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｌ４３６Ｘを導入した。得られた菌株をＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｌ４３６Ｘ株と命名した。
　（製造例１３）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ５株の作製
　製造例１０と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株を親株とし、製造例５で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ５を導入した。得られた菌株をＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ５株と命名した。
　（製造例１４）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１０株の作製
　製造例１０と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株を親株とし、製造例６で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１０を導入した。得られた菌株をＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１０株と命名した。
　（製造例１５）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１３株の作製
　製造例１０と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株を親株とし、製造例７で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１３を導入した。得られた菌株をＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１３株と命名した。
　（製造例１６）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１５株の作製
　製造例１０と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株を親株とし、製造例８で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１５を導入した。得られた菌株をＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ１５株と命名した。
　（製造例１７）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ２０株の作製
　製造例１０と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６株を親株とし、製造例９で作製したｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ２０を導入した。得られた菌株をＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣＴ２０株と命名した。
　（ＰＨＡにおける３ＨＨ比率の分析方法）
　ＰＨＡを含む乾燥菌体約２０ｍｇに１ｍＬの硫酸－メタノール混液（１５：８５）と１ｍＬのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに０．５ｍＬの脱イオン水を加えてよく混合した後、水層と有機層が分離するまで放置した。その後、分取した有機層中のＰＨＡ分解物のモノマー単位組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。得られたピーク面積から、３ＨＨ比率を算出した。
　ガスクロマトグラフは島津製作所製ＧＣ－１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ　ＢＯＮＤ－１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μＬを注入した。温度条件は、初発温度５０℃から２００℃までは８℃／分の速度で昇温し、さらに２００℃から２９０℃までは３０℃／分の速度で昇温した。
　（比較例１）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ株によるＰＨＡ生産
　種母培地の組成は、１０ｇ／Ｌ　肉エキス、１０ｇ／Ｌ　バクトトリプトン、２ｇ／Ｌ　酵母エキス、９ｇ／Ｌ　リン酸二水素ナトリウム１２水和物、１．５ｇ／Ｌ　リン酸水素二カリウムとした。
　ＰＨＡ生産培地の組成は、１１ｇ／Ｌ　リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．９ｇ／Ｌ　リン酸水素二カリウム、１．３ｇ／Ｌ　硫酸アンモニウム、５ｍＬ／Ｌ　マグネシウム溶液、１ｍＬ／Ｌ　微量金属塩溶液とした。マグネシウム溶液は、水に２００ｇ／Ｌ　硫酸マグネシウム七水和物を溶かして調製した。微量金属塩溶液は、０．１Ｎ塩酸に、０．２１８ｇ／Ｌ　塩化コバルト六水和物、１６．２ｇ／Ｌ　塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、１０．３ｇ／Ｌ　塩化カルシウム二水和物、０．１１８ｇ／Ｌ　塩化ニッケル六水和物、０．１５６ｇ／Ｌ　硫酸銅五水和物を溶かして調製した。
　製造例１０で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ株のグリセロールストック溶液５０μＬを種母培地１０ｍＬに接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を前培養液とした。
　ＰＨＡ生産培養は、フラスコで行った。５００ｍＬ容量の振盪フラスコにＰＨＡ生産培地５０ｍＬを入れた。植菌直前に、マグネシウム溶液を２５０μＬ、微量金属溶液を５０μＬ、パーム核油を１ｇ添加した。培地調製後、振盪フラスコに前培養液を５００μＬ接種し、３０℃で７２時間振盪培養を行った。培養終了後、培養液１０ｍＬから菌体を回収、エタノールで洗浄後、６０℃で真空乾燥し、ＰＨＡを含む乾燥菌体を取得し、乾燥菌体重量を測定した。乾燥菌体重量、および３ＨＨ比率の結果を表１に示した。
　（実施例１～１３、比較例２～７）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｓ３８９Ｘ株によるＰＨＡ生産
　製造例１１で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｓ３８９Ｘ株を用いて、比較例１と同様の方法で培養を行い、乾燥菌体重量および３ＨＨ比率を分析した。結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜考察＞
　表１の結果から、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の３８９番目のセリンをいずれのアミノ酸に置換しても、乾燥菌体重量に大きな変化はないことが分かる。このことから、ポリマー生産量にも劇的な変化は無いと考えられる。
　ＰＨＡの３ＨＨ比率を比較すると、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の３８９番目のセリンをアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、又は、トリプトファン（Ｗ）に置換した９種類の変異体（実施例１～９）では、比較例１と比較して３ＨＨ比率の低下が認められた。一方、３８９番目のセリンをシステイン（Ｃ）、イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、又は、バリン（Ｖ）に置換した４種類の変異体（実施例１０～１３）では３ＨＨ比率の上昇が認められた。しかし、３８９番目のセリンをアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、又は、チロシン（Ｙ）に置換した６種類の変異体（比較例２～７）では３ＨＨ比率には大きな変化は認められなかった。
　以上の結果から、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３８９番目のセリンをアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、又は、トリプトファンに置換した変異を有するＰＨＡ合成酵素は、ポリマー生産性を維持したまま３ＨＨ比率が低いＰＨＡを製造するのに有用であり、また、前記アミノ酸配列の３８９番目のセリンをシステイン、イソロイシン、トレオニン、又は、バリンに置換した変異を有するＰＨＡ合成酵素は、ポリマー生産性を維持したまま３ＨＨ比率が高いＰＨＡを製造するのに有用であることが分かる。
　（実施例１４～２１、比較例８～１８）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｌ４３６Ｘ株によるＰＨＡ生産
　製造例１２で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧ－Ｌ４３６Ｘ株を用いて、比較例１と同様の方法で培養を行い、乾燥菌体重量および３ＨＨ比率を分析した。結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜考察＞
　表２の結果から、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の４３６番目のロイシンをアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、又は、セリン（Ｓ）に置換した９種類の変異体（比較例８～１１、１３、１５～１８）では、比較例１と比較して乾燥菌体重量が大きく低下しており、ポリマー生産性が低下したと考えられる。また、４３６番目のロイシンをイソロイシン（Ｉ）、又は、メチオニン（Ｍ）に置換した変異体（比較例１２、１４）では、比較例１と比較して乾燥菌体重量および３ＨＨ比率のいずれにも変化は認められなかった。
　一方、４３６番目のロイシンをアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、又は、チロシン（Ｙ）に置換した変異体（実施例１４～２０）では、比較例１と比較して乾燥菌体重量に大きな変化がなく、かつ、３ＨＨ比率の低下が認められた。また、４３６番目のロイシンをバリン（Ｖ）に置換した変異体（実施例２１）では、比較例１と比較して乾燥菌体重量に大きな変化がなく、かつ、３ＨＨ比率の上昇が認められた。
　以上の結果から、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４３６番目のロイシンをアラニン、システイン、フェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、トリプトファン、又は、チロシンに置換した変異を有するＰＨＡ合成酵素は、ポリマー生産性を維持したまま３ＨＨ比率が低いＰＨＡを製造するのに有用であり、また、前記アミノ酸配列の４３６番目のロイシンをバリンに置換した変異を有するＰＨＡ合成酵素は、ポリマー生産性を維持したまま３ＨＨ比率が高いＰＨＡを製造するのに有用であることが分かる。
　（実施例２３，２４、比較例１９～２１）Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣ５，ΔＣ１０，ΔＣ１３，ΔＣ１５，又はΔＣ２０株によるＰＨＡ生産
　製造例１３～１７で作製したＨ１６　ΔｐｈａＣ１　Ｐｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ　ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２－Ｐｔｒｐ－ＮＳＤＧΔＣ５，ΔＣ１０，ΔＣ１３，ΔＣ１５，又はΔＣ２０株を用いて、比較例１と同様の方法で培養を行い、乾燥菌体重量および３ＨＨ比率を分析した。結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜考察＞
　表３の結果から、配列番号１４で示されるアミノ酸配列のＣ末端から５個のアミノ酸残基が欠失した変異体（比較例１９）および前記Ｃ末端から１０個のアミノ酸残基が欠失した変異体（比較例２０）では、比較例１と比較して乾燥菌体重量および３ＨＨ比率のいずれにも変化は認められず、前記Ｃ末端から２０個のアミノ酸残基が欠失した変異体（比較例２１）では、乾燥菌体重量が大きく低下した。しかし、前記Ｃ末端から１３個のアミノ酸残基が欠失した変異体（実施例２２）および前記Ｃ末端から１５個のアミノ酸残基が欠失した変異体（実施例２３）では、乾燥菌体重量に大きな変化がなく、かつ、３ＨＨ比率の低下が認められた。
　以上の結果から、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端から適切な個数のアミノ酸残基が欠失した変異を有するＰＨＡ合成酵素は、ポリマー生産性を維持したまま３ＨＨ比率が低いＰＨＡを製造するのに有用であることが分かる。

Claims (17)

  1. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつ、下記（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の変異を含むアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
    　変異（ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンが、セリン以外のアミノ酸に置換された変異
    　変異（ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から４３６番目のロイシンが、ロイシン以外のアミノ酸に置換された変異
    　変異（ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端から１１個以上１９個以下のアミノ酸残基が欠失された変異
  2. 　変異（ａ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンがシステイン、イソロイシン、トレオニン又はバリンに置換された変異である、請求項１に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
  3. 　変異（ａ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンがアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、プロリン、アルギニン又はトリプトファンに置換された変異である、請求項１に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
  4. 　変異（ｂ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から４３６番目のロイシンがバリンに置換された変異である、請求項１～３のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
  5. 　変異（ｂ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から４３６番目のロイシンがアラニン、システイン、フェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、トリプトファン又はチロシンに置換された変異である、請求項１～３のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
  6. 　変異（ｃ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＣ末端から１２個以上１９個以下のアミノ酸残基が欠失された変異である、請求項１～５のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
  7. 　配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１４９番目のアスパラギンがセリンに置換された変異をさらに含むアミノ酸配列を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
  8. 　配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異をさらに含むアミノ酸配列を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子。
  10. 　請求項９に記載の遺伝子を有する形質転換体。
  11. 　宿主が真正細菌である請求項１０に記載の形質転換体。
  12. 　真正細菌がカプリアビダス属に属する細菌である請求項１１に記載の形質転換体。
  13. 　真正細菌がカプリアビダス　ネカトールである請求項１１に記載の形質転換体。
  14. 　真正細菌がカプリアビダス　ネカトールＨ１６である請求項１１に記載の形質転換体。
  15. 　請求項１０～１４のいずれか１項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  16. 　ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する、請求項１５に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  17. 　ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、請求項１５に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
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