JP2015077103A - 微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物に資化性を有するカプリアビダス(Cupriavidus)属、ラルストニア(Ralstonia)属又はアルカリゲネス(Alcaligenes)属に属する微生物を、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を炭素源として含有する培地にて培養し、該微生物菌体からポリヒドロキシアルカン酸を回収することを含む、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、このような観点から鋭意研究を行い、完成されたものである。
(1) リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物に資化性を有する、カプリアビダス(Cupriavidus)属、ラルストニア(Ralstonia)属又はアルカリゲネス(Alcaligenes)属に属する微生物を、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を炭素源として含有する培地にて培養し、該微生物菌体からポリヒドロキシアルカン酸を回収することを含む、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法。
(2) 前記リグニン誘導体が、p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸又はその塩である、(1)に記載の方法。
(3) 前記ポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物が、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、3,4-ジヒドロキシ安息香酸、3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、シリング酸、又はその塩である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記微生物が、単離微生物、寄託微生物、変異微生物又は組換え微生物である、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5) 前記カプリアビダス属微生物が、カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、20万〜200万の分子量を有する、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシ酪酸モノマー単位を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸)である、(7)に記載の方法。
本発明は、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法に関するものであり、以下の特徴を有する。
(2)培地中の炭素源として、図4に記載されるような、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を含有する。
上記微生物は、上記(1)に示した性質をすべて満たすものであれば、本発明の方法で使用できる。微生物は、カプリアビダス(Cupriavidus)属、ラルストニア(Ralstonia)属又はアルカリゲネス(Alcaligenes)属に属する細菌であり、リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物を炭素源として含有する培地にて増殖性を示し、また、PHAを生成することを確認できる。好ましい微生物は、カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)又はアルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)であり、後者の2つの菌種は、前者の菌種の旧分類の菌種名であるので、これらの3つの菌種は実質的に同一である。従って、本明細書においてカプリアビダス・ネカトールに言及する場合は、これらの旧分類の菌種も包含される。さらに具体的には、微生物は、例えば、Cupriavidus necator (ATCC 17699 / H16 / DSM 428 / Stanier 337)、Cupriavidus necator (ATCC 43291 / DSM 13513 / N-1)、Cupriavidus necator (NBRC 102504)などである。
上記微生物は、単離微生物、寄託微生物、変異微生物又は組換え微生物のいずれであってもよい。
上記(2)の性質は、培地中の炭素源が、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を含有することである。
上記の微生物を、上記炭素源を含む上記培地にて培養する。培養は、好気的条件で行い、通気撹拌可能な発酵槽を使用することができる。培養規模に応じて発酵槽のサイズを、1KL〜5KL又はそれ以上とすることができる。連続的に又は間欠的に炭素源や他の栄養源を供給しながら培養を行うこともできる。培地中の炭素源濃度は、非限定的に、約0.5g/L〜約2.0g/Lの範囲に維持することが好ましい。温度、pH、炭素源濃度、通気量、撹拌速度などの条件を制御しながら、培養を行う。
培地中の炭素源濃度は、約0.5g/L〜約2.0g/Lの範囲に維持することが好ましい。
通気量は、例えば、1 L/分〜3L/分、好ましくは1.5 L/分〜2.5L/分である。
撹拌速度は、例えば300rpm〜700rpmである。
培養日数は、1日〜7日であるが、この範囲に限定されない。
微生物菌体に蓄積されたPHAは、公知の方法によって回収することができる(特開2013-9627号公報)。例えば、培養液から遠心分離機等の分離手段を用いて菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてPHAを抽出する。このPHAを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノール、ヘキサン等の貧溶媒を加えてPHAを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてPHAを回収することができる。
後述の実施例で使用した微生物からは、3-ヒドロキシ酪酸モノマー単位を含むPHAが生産されうる。
<微生物の選択>
PHA蓄積性微生物、すなわちRalstonia eutropha H16 (現命名、Cupriavidus necator, JCM 20644, ATCC 17699)、Delftia acidovorans DS-17 (JCM 10181)、Pseudomonas putida (JCM 13063T)、Pseudomonas aeruginosa (JCM 14847T)、Sphingomonas paucimobilis (JCM 7516T)、Bacillus megaterium (JCM 2506T)、Ralstonia eutropha PHB-4(DSM 541;H16のPHA陰性変異株)、Ralstonia eutropha PHB-4phaCAc(PHB-4の形質転換体;J-A Chuah et al., Polymer Degradation and Stability 98(1): 331-338 (2013))、Ralstonia eutropha PHB-4E11/S12、Ralstonia eutropha 11599(Techno Suruga Labotaroty Co., Ltd. (静岡、日本)から恵与された。) 、Pseudomonas putida GPo1(旧命名:Pseudomonas oleovorans GPo1)(ATCC 29347)及びVibrio sp. KN01(Hizushi Beach(沖縄、日本)の海水から単離された。)を、単一炭素源として10gのリグニン誘導体(p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸及びシナピン酸)及びポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物(バニリン酸、シナピン酸、シリング酸、4-HBA、2,5-DHBA、3,4-DHBA及び3,4,5-THBA)、それらの類似化合物(サリチル酸、3-HBA、2,3-DHBA、2,4-DHBA、2,6-DHBA、3,5-DHBA、2,3,4-THBA及び2,4,6-THBA)、その他の炭素源(グルコン酸、オクタン酸、テレフタル酸)(それぞれ、1g / 100 mL)、PHAの蓄積を判別する0.5mgの染色試薬ナイルレッド (200 mg / L)、9gのNa2HPO4・12H2O、1.5gのKH2PO4、0.5gのNH4Cl、0.2gのMgSO4・7H2O、1mLの微量元素養液(9.7gのFeCl3、7.8gのCaCl2、0.218gのCoCl2・6H2O、0.156gのCuSO4・5H2O、0.118gのNiCl3・6H2O及び0.105gのCrCl3・6H2Oを1Lの0.1M HClに溶解した溶液)、及び1.5gのアガーを1Lの蒸留水中に含むMineral-salt (MS) 寒天培地に植菌した。72時間後、コロニーのサイズ(直径)を測定することにより微生物の増殖を評価した。その結果、Ralstonia eutropha H16株(ATCC 17699)とPseudomonas putida 13063株(JCM 13063)が増殖性を示した(図1)。
<PHAの生産>
プレートアッセイで良好な増殖を示したRalstonia eutropha H16株(ATCC 17699)とPseudomonas putida 13063株(JCM 13063)について、100 mLスケールで培養した。微生物の増殖は乾燥菌体重量にて評価し、PHAの蓄積量はクロロホルムとメタノールを用いて抽出したPHAの質量により評価した。PHAの分子量と構造はゲルサイズ排除クロマトグラフィー (SEC)(RI-2031, PU-2086, AS-2055, CO-2056; JASCO,日本)、核磁気共鳴法 (1H-NMR)(JNM-Excalibur 270; JEOL, Ltd.,日本) を用いて解析した。分子量は、ポリスチレン分子量標準(1.32x103, 3.25x103, 1.01x104, 2.85x104, 6.60x104, 1.56x105, 4.60x105, 1.07x106, 3.15x106)と比較して推定した。
Claims (8)
- リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物に資化性を有する、カプリアビダス(Cupriavidus)属、ラルストニア(Ralstonia)属又はアルカリゲネス(Alcaligenes)属に属する微生物を、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を炭素源として含有する培地にて培養し、該微生物菌体からポリヒドロキシアルカン酸を回収することを含む、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法。
- 前記リグニン誘導体が、p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸又はその塩である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物が、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、3,4-ジヒドロキシ安息香酸、3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、シリング酸、又はその塩である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記微生物が、単離微生物、寄託微生物、変異微生物又は組換え微生物である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カプリアビダス属微生物が、カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、20万〜200万の分子量を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシ酪酸モノマー単位を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸)である、請求項7に記載の方法。
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