JP7382315B2 - 変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、その遺伝子および形質転換体、並びに、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
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Description
変異(A):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から27番目から33番目のアミノ酸のうち、少なくとも1つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異
変異(B):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から39番目、56番目、106番目、129番目、144番目、165番目、及び170番目のアミノ酸のうち、少なくとも1つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異
変異(C):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から172番目から187番目のアミノ酸のうち、少なくとも1つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異。
変異(a):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から27番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(b):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から29番目のグルタミン酸が、他のアミノ酸に置換された変異
変異(c):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から30番目のアルギニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(d):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から31番目のトレオニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(e):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から33番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(f):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から39番目のアスパラギンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(g):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から56番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(h):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から106番目のプロリンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(i):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から129番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(j):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から144番目のトレオニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(k):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から165番目のリシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(l):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から170番目のセリンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(m):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から176番目のバリンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(n):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から179番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(o):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から180番目のアラニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(p):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から181番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異(q):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から187番目のグルタミン酸が、他のアミノ酸に置換された変異。
(変異型PHA合成酵素)
本発明に係る変異型PHA合成酵素は、配列番号1で示されるアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を示し、かつ、下記(A)~(C)のいずれか1以上の変異を含むアミノ酸配列を有するものである。また、本発明は、該変異型PHA合成酵素をコードする遺伝子(以下、「変異型PHA合成酵素遺伝子」と略す)も提供する。
変異(B):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から39番目、56番目、106番目、129番目、144番目、165番目、及び170番目のアミノ酸のうち、少なくとも1つ以上のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換される。なかでも、39番目のアミノ酸が最も好ましい。置換後のアミノ酸は、PHA生産性及び、生産されるPHAの3HH比率を考慮して選択することができる。
変異(C):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から172番目から187番目のアミノ酸配列のうち、少なくとも1つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換される。置換されるアミノ酸は、配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から172番目、173番目、174番目、175番目、176番目、177番目、178番目、179番目、180番目、181番目、182番目、183番目、184番目、185番目、186番目、又は187番目のアミノ酸のいずれかである。好ましくは、176番目から187番目のアミノ酸のいずれかであり、より好ましくは、176番目、179番目、180番目、181番目、又は187番目のアミノ酸のいずれかである。置換後のアミノ酸は、PHA生産性及び、生産されるPHAの3HH比率を考慮して選択することができる。
本発明の形質転換体は、本発明の変異型PHA合成酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体であり、該遺伝子を宿主の微生物に導入することにより製造される。
本発明の形質転換体を培養することで、該形質転換体にPHAを生産させ、得られたPHAを回収することでPHAを製造することができる。
まず、phaC1遺伝子破壊用プラスミドを作製した。合成オリゴDNAを用いたPCRにより、phaC1遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するDNA断片(配列番号12)を得た。得られたDNA断片を制限酵素SwaIで消化した。このDNA断片を、同じくSwaIで消化した特開2007-259708号公報に記載のベクターpNS2X-sacBと連結し、phaC1より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターpNS2X-sacB-phaC1ULを作製した。
合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号13で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。取得したDNA断片を、特開2007-259708号公報記載のpCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ)にて連結し、pCUP2-Ptrp-NSDGを得た。 pCUP2-Ptrp-NSDGは、trpプロモーター下でNSDGを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号15で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-Q27Sを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q27Sは、trpプロモーター下でNSDG-Q27Sを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号16で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29Nを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29Nは、trpプロモーター下でNSDG-E29Nを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号17で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29Sを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29Sは、trpプロモーター下でNSDG-E29Sを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号18で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-R30Gを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-R30Gは、trpプロモーター下でNSDG-R30Gを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号19で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-R30Pを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-R30Pは、trpプロモーター下でNSDG-R30Pを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号20で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-T31Pを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-T31Pは、trpプロモーター下でNSDG-T31Pを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号21で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33Iを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33Iは、trpプロモーター下でNSDG-Q33Iを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号22で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33Lを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33Lは、trpプロモーター下でNSDG-Q33Lを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号23で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33Vを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33Vは、trpプロモーター下でNSDG-Q33Vを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号24で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Aを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Aは、trpプロモーター下でNSDG-N39Aを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号25で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Cを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Cは、trpプロモーター下でNSDG-N39Cを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号26で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Fを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Fは、trpプロモーター下でNSDG-N39Fを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号27で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Hを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Hは、trpプロモーター下でNSDG-N39Hを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号28で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Iを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Iは、trpプロモーター下でNSDG-N39Iを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号29で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Mを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Mは、trpプロモーター下でNSDG-N39Mを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号30で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Qを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Qは、trpプロモーター下でNSDG-N39Qを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号31で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Wを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Wは、trpプロモーター下でNSDG-N39Wを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号32で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-Q56Pを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q56Pは、trpプロモーター下でNSDG-Q56Pを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号33で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-P106Aを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-P106Aは、trpプロモーター下でNSDG-P106Aを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号34で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-L129Qを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-L129Qは、trpプロモーター下でNSDG-L129Qを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号35で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-T144Lを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-T144Lは、trpプロモーター下でNSDG-T144Lを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号36で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-K165Vを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-K165Vは、trpプロモーター下でNSDG-K165Vを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号37で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-S170Qを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-S170Qは、trpプロモーター下でNSDG-S170Qを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号38で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-V176Wを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-V176Wは、trpプロモーター下でNSDG-V176Wを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号39で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Qを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Qは、trpプロモーター下でNSDG-L179Qを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号40で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Rを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Rは、trpプロモーター下でNSDG-L179Rを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号41で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-A180Gを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-A180Gは、trpプロモーター下でNSDG-A180Gを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号42で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-A180Kを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-A180Kは、trpプロモーター下でNSDG-A180Kを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号43で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-A180Rを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-A180Rは、trpプロモーター下でNSDG-A180Rを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号44で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-L181Yを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-L181Yは、trpプロモーター下でNSDG-L181Yを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号45で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E187Vを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E187Vは、trpプロモーター下でNSDG-E187Vを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号46で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180Kを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180Kは、trpプロモーター下でNSDG-E29N-A180Kを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号47で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180Rを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180Rは、trpプロモーター下でNSDG-E29N-A180Rを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号48で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180Kを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180Kは、trpプロモーター下でNSDG-E29S-A180Kを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号49で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180Rを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180Rは、trpプロモーター下でNSDG-E29S-A180Rを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号50で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K-S389Tを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K-S389Tは、trpプロモーター下でNSDG-E29N-A180K-S389Tを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号51で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R-S389Tを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R-S389Tは、trpプロモーター下でNSDG-E29N-A180R-S389Tを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号52で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K-S389Tを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K-S389Tは、trpプロモーター下でNSDG-E29S-A180K-S389Tを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号53で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。これを製造例2と同様の方法でpCUP2ベクターにクローニングし、pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R-S389Tを得た。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R-S389Tは、trpプロモーター下でNSDG-E29S-A180R-S389Tを発現するプラスミドである。
まず、製造例1で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株をNutrient Broth培地(DIFCO)で一晩培養した。得られた培養液0.5mLをNutrient Broth培地100mLに接種し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を氷上で速やかに冷却し、菌体を回収して氷冷した蒸留水で良く洗浄した後、得られた菌体を2mLの蒸留水に懸濁した。菌体液を、製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGプラスミド溶液と混合し、キュベットに注入してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、MicroPulserエレクトロポレーター(バイオ・ラッド)を使用し、電圧1.5kV、抵抗800Ω、電流25μFの条件で行った。エレクトロポレーション後、菌体溶液を回収して5mLのNutrient Broth培地を添加し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を、100mg/Lのカナマイシン硫酸塩を含むNutrient Agar培地に塗布した。30℃で3日間培養し、得られたコロニーからプラスミドが導入された菌株を取得した。得られた菌株をH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG株と命名した。
PHAを含む乾燥菌体約20mgに1mLの硫酸-メタノール混液(15:85)と1mLのクロロホルムを添加して密栓し、100℃で140分間加熱することでPHA分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに0.5mLの脱イオン水を加えてよく混合した後、水層と有機層が分離するまで放置した。その後、分取した有機層中のPHA分解物のモノマー単位組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。得られたピーク面積から、3HH比率を算出した。
種母培地の組成は、10g/L 肉エキス、10g/L バクトトリプトン、2g/L 酵母エキス、9g/L リン酸二水素ナトリウム12水和物、1.5g/L リン酸水素二カリウム、100μg/L カナマイシン硫酸塩とした。
乾燥菌体重量、および3HH比率の結果を表1及び表2に示した。
製造例42で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q27S株(実施例1)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N株(実施例2)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S株(実施例3)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-R30G株(実施例4)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-R30P株(実施例5)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-T31P株(実施例6)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33I株(実施例7)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33L株(実施例8)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33V株(実施例9)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39A株(実施例10)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39C株(実施例11)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39F株(実施例12)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39H株(実施例13)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39I株(実施例14)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39M株(実施例15)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Q株(実施例16)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39W株(実施例17)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q56P株(実施例18)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-P106A株(実施例19)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L129Q株(実施例20)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-T144L株(実施例21)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-K165V株(実施例22)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-S170Q株(実施例23)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-V176W株(実施例24)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Q株(実施例25)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-179R株(実施例26)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-A180G株(実施例27)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-A180K株(実施例28)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-A180R株(実施例29)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L181Y株(実施例30)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E187V株(実施例31)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K株(実施例32)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R株(実施例33)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K株(実施例34)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R株(実施例35)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K-S389T株(実施例36)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R-S389T株(実施例37)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K-S389T株(実施例38)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R-S389T株(実施例39)を用いて、比較例1と同様の方法で培養を行い、乾燥菌体重量および3HH比率を分析した。結果を表1及び表2に示した。
表1の結果から、Q27S,E29N,E29S,R30G,R30P,T31P,Q33I,Q33L,Q33V,N39A,N39C,N39F,N39H,N39I,N39M,N39Q,N39W,Q56P,P106A,L129Q,T144L,K165V,S170Q,V176W,L179Q,L179R,A180G,A180K,A180R,L181Y,又はE187Vの変異を有する実施例1~31のPHA合成酵素では、3HH比率の上昇が認められた。また、いずれの実施例においても乾燥菌体重量は比較例1と同程度であったことからPHA生産性に変化は無いと考えられた。以上の結果から、これら変異を有するPHA合成酵素は、ポリマー生産性を維持したまま、3HH比率が高いPHAを製造するのに有用であることが分かる。
Claims (11)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を示し、かつ、下記(a)~(q)のいずれか1以上の変異を含み、前記アミノ酸配列のN末端から149番目のアスパラギンがセリンに置換された変異、及び、前記アミノ酸配列のN末端から171番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異をさらに含むアミノ酸配列を含む、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素であって、
配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素が生産するポリヒドロキシアルカン酸共重合体と比較して3-ヒドロキシヘキサン酸比率が高いポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造を実現する変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
変異(a):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から27番目のグルタミンがセリンに置換された変異
変異(b):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から29番目のグルタミン酸がアスパラギン又はセリンに置換された変異
変異(c):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から30番目のアルギニンがグリシン又はプロリンに置換された変異
変異(d):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から31番目のトレオニンがプロリンに置換された変異
変異(e):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から33番目のグルタミンがイソロイシン、ロイシン、又はバリンに置換された変異
変異(f):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から39番目のアスパラギンがアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、又はトリプトファンに置換された変異
変異(g):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から56番目のグルタミンがプロリンに置換された変異
変異(h):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から106番目のプロリンがアラニンに置換された変異
変異(i):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から129番目のロイシンがグルタミンに置換された変異
変異(j):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から144番目のトレオニンがロイシンに置換された変異
変異(k):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から165番目のリシンがバリンに置換された変異
変異(l):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から170番目のセリンがグルタミンに置換された変異
変異(m):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から176番目のバリンがトリプトファンに置換された変異
変異(n):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から179番目のロイシンがアルギニン又はグルタミンに置換された変異
変異(o):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から180番目のアラニンがグリシン、リシン、又はアルギニンに置換された変異
変異(p):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から181番目のロイシンがチロシンに置換された変異
変異(q):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から187番目のグルタミン酸がバリンに置換された変異 - 前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列のN末端から389番目のセリンがシステイン、イソロイシン、トレオニン、又はバリンに置換された変異をさらに含む、請求項1に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
- 請求項1又は2に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン合成酵素をコードする遺伝子。
- 請求項3に記載の遺伝子を有する形質転換体。
- 宿主が真正細菌である請求項4に記載の形質転換体。
- 真正細菌がカプリアビダス属に属する細菌である請求項5に記載の形質転換体。
- 真正細菌がカプリアビダス ネカトールである請求項5に記載の形質転換体。
- 真正細菌がカプリアビダス ネカトールH16である請求項5に記載の形質転換体。
- 請求項4~8のいずれか1項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する、請求項9に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシ酪酸と3-ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、請求項10に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
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