JPWO2015115619A1 - R体特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子の発現が調節された微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.ゲノムDNA上にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子を有し、かつ、該遺伝子の発現が調節された微生物
本発明は、ゲノムDNA上にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子を有する微生物であって、該R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入及び/又は付加からなる改変を含み、それにより、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子の発現が調節されることを特徴とする微生物を提供する。
本発明はまた、上記微生物を培養し、該微生物からポリヒドロキシアルカノエート(PHA)共重合体を回収することを含むことを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート共重合体の生産方法を提供する。
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
まず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
先ず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
まず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
まず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドベクターpNS2X−sacB+phaJ4bU−REP−phaJ4bで大腸菌S17−1株(ATCC47055)を形質転換し、製造例1で作製したKNK005ΔphaZ1,2,6株とNutrient Agar培地(Difco社製)上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を250mg/Lのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地(クエン酸ナトリウム2g/L、塩化ナトリウム5g/L、硫酸マグネシウム・7水塩0.2g/L、リン酸二水素アンモニウム1g/L、リン酸水素二カリウム1g/L、寒天15g/L、pH6.8)に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがKNK005ΔphaZ1,2,6株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をNutrient Broth培地(Difco社製)で2世代培養した後、15%のシュークロースを含むNutrient Agar培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにPCRによる解析により染色体上のphaJ4b構造遺伝子の上流に、配列番号37で示される、phaC1プロモーター及びphaC1SD配列を有するDNA断片が挿入された菌株1株を単離した。
まず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドベクターpNS2X−sacB+phaJ4bU−REPSDM11−phaJ4bで大腸菌S17−1株(ATCC47055)を形質転換し、製造例1で作製したKNK005ΔphaZ1,2,6株とNutrient Agar培地(Difco社製)上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を250mg/Lのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地(クエン酸ナトリウム2g/L、塩化ナトリウム5g/L、硫酸マグネシウム・7水塩0.2g/L、リン酸二水素アンモニウム1g/L、リン酸水素二カリウム1g/L、寒天15g/L、pH6.8)に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがKNK005ΔphaZ1,2,6株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をNutrient Broth培地(Difco社製)で2世代培養した後、15%のシュークロースを含むNutrient Agar培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにPCRによる解析により染色体上のphaJ4b構造遺伝子の上流に、配列番号41で示される、phaC1プロモーター及びphaC1SD配列改変体を有するDNA断片が挿入された菌株1株を単離した。
先ず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
まず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
まず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
まず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
先ず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
まず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
まず、プロモーター及びSD配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
種母培地の組成は1w/v%Meat−extract、1w/v%Bacto−Trypton、0.2w/v%Yeast−extract、0.9w/v%Na2HPO4・12H2O、0.15w/v%KH2PO4とした。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例3で作製したKNK005 lacUV5−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例4で作製したKNK005 trp−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例5で作製したKNK005 REP−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例6で作製したKNK005 REPSDM11−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例7で作製したKNK005 REPN17SDM11−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例8で作製したKNK005 trcSDM11−phaJ4a/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例9で作製したKNK005 lacUV5−phaJ4a/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例10で作製したKNK005 lacUV5SDM11−phaJ4a/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例11で作製したKNK005 trp−phaJ4a/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例12で作製したKNK005 trpSDM11−phaJ4a/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例13で作製したKNK005 REP−phaJ4a/ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。
KNK005 trc−phaJ4b/ΔphaZ1,2,6株に代えて製造例1で作製したKNK005ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び3HH組成比率を測定した。結果を上記の表1に示した。
(13−1)プラスミドベクターpCUP2−REP−phaJ4bの作製
C. necator H16株のphaC1の野生型のプロモーター(REP)及びSD配列と、phaJ4b遺伝子を含む塩基配列からなるDNAを挿入したプラスミドベクターpCUP2−REP−phaJ4bを次のように作製した。 C. necator H16株の染色体DNAをテンプレートとして配列番号72及び配列番号23で示されるプライマーを用いてPCRを行った。PCRは(1)98℃で2分、(2)98℃で15秒、60℃で30秒、68℃で60秒を25サイクル繰り返し、ポリメラーゼはKOD−plus−(TOYOBO製)を用いた。PCRで得たDNA断片をREPとした。次に、C. necator H16株の染色体DNAをテンプレートとして配列番号70及び配列番号71で示されるプライマーを用いて同様の条件でPCRを行った。PCRで得られたDNA断片を(ReSD)−phaJ4bとした。次に、REP及び(ReSD)−phaJ4bをテンプレートとして配列番号72及び配列番号71で示されるプライマーを用いて同様の条件でPCRを行った。PCRで得られたDNA断片をEcoRIで消化した。このDNA断片をREP−phaJ4b(EcoRI)とした。このREP−phaJ4b(EcoRI)を、国際公開公報WO/2007/049716号公報に記載のプラスミドベクターpCUP2をMunIで切断したものと連結した。REP−phaJ4b(EcoRI)とpCUP2をMunIで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、APPLIED BIOSYSTEMS社製のDNAシークエンサー3130xl Genetic Analyzerを用いて塩基配列を決定し、鋳型としたDNAの塩基配列と同一であることを確認するとともに、phaJ4b遺伝子がpCUP2上のparP遺伝子とは逆向きに挿入されたものを取得した。取得したプラスミドベクターをpCUP2−REP−phaJ4bとした。
上記(13−1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−REP−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1Cのプロモーターに配列番号73で示した変異を導入したpCUP2−REPP3M14−phaJ4bを次のように作製した。
上記(13−1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−REP−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1のプロモーターに配列番号76で示した変異を導入したpCUP2−REPN17−phaJ4bを次のように作製した。
上記(13−1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−REP−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1のSD配列を塩基配列TGTGTGA(配列番号63)に改変したpCUP2−REPSDM4−phaJ4bを次のように作製した。
上記(13−1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−REP−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1のSD配列を塩基配列TCTCTCT(配列番号52)に改変したpCUP2−REPSDM11−phaJ4bを次のように作製した。
(1)配列番号47で示されるtrcプロモーターと、C. necator H16株のphaC1のSD配列、phaJ4b遺伝子を含む塩基配列からなるDNAを挿入したプラスミドベクターpCUP2−trc−phaJ4bを次のように作製した。
上記(13−6)の(1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−trc−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1のSD配列を塩基配列AGTGAGA(配列番号62)に改変したpCUP2−trcSDM3−phaJ4bを次のように作製した。
上記(13−6)の(1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−trc−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1のSD配列を塩基配列TGTGTGA(配列番号63)に改変したpCUP2−trcSDM4−phaJ4bを次のように作製した。
上記(13−6)の(1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−trc−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1のSD配列を塩基配列TGAGTGA(配列番号64)に改変したpCUP2−trcSDM5−phaJ4bを次のように作製した。
上記(13−6)の(1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−trc−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1のSD配列を塩基配列ATATAGA(配列番号61)に改変したpCUP2−trcSDM2−phaJ4bを次のように作製した。
上記(13−6)の(1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−trc−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1のSD配列を塩基配列AGAGATA(配列番号65)に改変したpCUP2−trcSDM6−phaJ4bを次のように作製した。
上記(13−6)の(1)で作製したプラスミドベクターpCUP2−trc−phaJ4bに対して、phaJ4bの発現調節を行うC. necator H16株のphaC1のSD配列を塩基配列AGATAGA(配列番号66)に改変したpCUP2−trcSDM7−phaJ4bを次のように作製した。
種母培地の組成は1w/v%Meat−extract、1w/v%Bacto−Trypton、0.2w/v%Yeast−extract、0.9w/v%Na2HPO4・12H2O、0.15w/v%KH2PO4とした。
配列番号38〜40、43〜45:発現調節DNA
配列番号60〜66:SD配列
配列番号76、55〜59:プロモーター
Claims (22)
- ゲノムDNA上にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子を有する微生物であって、該R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入及び/又は付加からなる改変を含み、それにより、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子の発現が調節されることを特徴とする微生物。
- 前記改変が、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子の発現を調節可能にする、プロモーター配列、シャインダルガルノ(SD)配列、又はそれらの両方の塩基配列に1若しくは複数の塩基の置換又は挿入を含む、請求項1記載の微生物。
- 前記R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、置換又は挿入によって導入されたプロモーター配列を含む、請求項1又は2記載の微生物。
- 前記置換又は挿入の位置が、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子の上流1万塩基以内である、請求項1〜3のいずれか1項記載の微生物。
- さらにポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を有する、請求項1〜4のいずれか1項記載の微生物。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ(Aeromonas caviae)由来の遺伝子である、請求項5記載の微生物。
- カプリアビダス(Cupriavidus)属である、請求項1〜6のいずれか1項記載の微生物。
- カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)である、請求項7記載の微生物。
- アエロモナス(Aeromonas)属である、請求項1〜6のいずれか1項記載の微生物。
- アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)である、請求項9記載の微生物。
- 前記R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、置換又は挿入によって導入された、大腸菌由来プロモーター、phaC1遺伝子プロモーター及びphaC1遺伝子改変プロモーターからなる群から選択される1つ以上のプロモーターを含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の微生物。
- 前記プロモーター配列の下流に置換又は挿入によって導入されたSD配列をさらに含む、請求項2〜11のいずれか1項記載の微生物。
- 前記SD配列が、配列番号51又は52で示されるSD配列である、請求項12記載の微生物。
- 前記R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子が他の遺伝子とオペロンを形成している、請求項1〜13のいずれか1項記載の微生物。
- モノマー組成比の制御されたポリヒドロキシアルカノエート共重合体を産生することができる、請求項5〜14のいずれか1項記載の微生物。
- カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)由来のphaC1遺伝子の改変プロモーターを含む30bp〜900bpの発現調節DNAであって、該改変プロモーターが配列番号55〜59の塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含む、発現調節DNA。
- 前記phaC1遺伝子のシャインダルガルノ(SD)配列又はその改変SD配列をさらに含む、ただし該SD配列又は改変SD配列が、配列番号51、52、60〜66のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項16記載の発現調節DNA。
- 配列番号47〜50で示される塩基配列からなるプロモーターのいずれか1つと、配列番号51、52、60〜66のいずれかで示される塩基配列を含む、発現調節DNA。
- 請求項16〜18のいずれか1項に記載の発現調節DNAを含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の微生物。
- 請求項5〜15及び19のいずれか1項に記載の微生物を培養し、該微生物からポリヒドロキシアルカノエート共重合体を回収することを含むことを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート共重合体の生産方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエート共重合体が、構成単位として3−ヒドロキシヘキサン酸(3HH)モノマーを含有する共重合体である、請求項20記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエート共重合体が、P(3HB−co−3HH)である、請求項21記載の方法。
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