JP7425783B2 - 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
また本発明は、前記形質転換微生物を、炭素源の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法にも関する。炭素源は、油脂あるいは脂肪酸を含有してもよく、また、糖を含有してもよく、二酸化炭素を含有してもよい。ポリヒドロキシアルカン酸は、2種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体であることが好ましく、3-ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体であることがより好ましく、3-ヒドロキシ酪酸と3-ヒドロキシヘキサン酸との共重合体であることがさらに好ましい。
本発明に係る形質転換微生物は、PHA合成酵素遺伝子を有し、A2365遺伝子の発現が強化された、形質転換微生物である。
本発明に係る形質転換微生物は、PHA合成酵素遺伝子を有し、かつ、A2365遺伝子の発現が強化されるように形質転換された微生物である(以下、A2365遺伝子発現強化株ともいう)。本発明に係る形質転換微生物の宿主は、PHA合成酵素遺伝子を有する微生物であれば特に限定されない。当該細菌としては、例えば、ラルストニア(Ralstonia)属、カプリアビダス(Cupriavidus)属、ワウテルシア(Wautersia)属、アエロモナス(Aeromonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、シュードモナス(Pseudomonas)属等に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及びPHA生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する微生物であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)である。
PHA合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、ラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アルカリゲネス属、アエロモナス属、シュードモナス属、ノルカディア属、クロモバクテリウム属に類する生物に由来するPHA合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体としては、1以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたPHA合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。例えば、配列番号2~6のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、該アミノ酸配列に対して85%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、かつPHA合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。上記配列相同性としては好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上である。
本発明のA2365遺伝子発現強化株が生産するPHAの種類としては、微生物が生産し得るPHAである限り特に限定されないが、炭素数4~16の3-ヒドロキシアルカン酸から選択される1種のモノマーの単独重合体、炭素数4~16の3-ヒドロキシアルカン酸から選択される1種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸(例えば、炭素数4~16の2-ヒドロキシアルカン酸、4-ヒドロキシアルカン酸、5-ヒドロキシアルカン酸、6-ヒドロキシアルカン酸など)の共重合体、及び、炭素数4~16の3-ヒドロキシアルカン酸から選択される2種以上のモノマーの共重合体が好ましい。例えば、3-ヒドロキシ酪酸(略称:3HB)のホモポリマーであるP(3HB)、3HBと3-ヒドロキシ吉草酸(略称:3HV)の共重合体P(3HB-co-3HV)、3HBと3-ヒドロキシヘキサン酸(略称:3HH)の共重合体P(3HB-co-3HH)(略称:PHBH)、3HBと4-ヒドロキシ酪酸(略称:4HB)の共重合体P(3HB-co-4HB)、乳酸(略称:LA)を構成成分として含むPHA、例えば3HBとLAの共重合体P(LA-co-3HB)などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、PHBHが好ましい。なお、生産されるPHAの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたPHA合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
本発明で発現が強化されるA2365遺伝子は、配列番号1に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド(UniProtKB ID Q0K961)、及び、該アミノ酸配列に対して85%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子である。上記配列相同性としては好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上である。なお、A2365遺伝子が有する機能は未だ報告されていない。
本発明における遺伝子発現の強化とは、対象遺伝子の発現が強化されていない菌株と比較して、対象遺伝子の転写量または対象遺伝子のコードするポリペプチドの発現量が増加している状態を指す。その増加量は特に限定されないが、対象遺伝子の発現が強化されていない菌株と比較して1倍超であればよく、好ましくは1.1倍以上、より好ましくは1.2倍以上、さらに好ましくは1.5倍以上、さらにより好ましくは2倍以上の増加である。
まず、A2365遺伝子発現用プラスミドpCUP2-trc-A2365の作製を行った。作製は以下のように行った。
下記の条件でKNK-005株を用いた培養検討を行なった。
種母培地の組成は1w/v% Meat-extract、1w/v% Bacto-Tryptone、0.2w/v% Yeast-extract、0.9w/v% Na2HPO4・12H2O 、0.15w/v% KH2PO4、(pH6.8)とした。
PHA蓄積量の割合は次のように測定した。遠心分離によって培養液から菌体を回収、エタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を取得し、重量を測定した。得られた乾燥菌体1gに100mlのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のPHAを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が30mlになるまで濃縮後、90mlのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、1時間放置した。析出したPHAをろ別後、50℃で3時間真空乾燥した。乾燥PHAの重量を測定し、乾燥菌体量に対してPHA蓄積量が占める割合を算出した。
PHA粒子径は次のように測定した。培養後の培養液を65℃で60分間処理し、菌体細胞不活化を行った後、3.3w/v% ドデシル硫酸ナトリウム水溶液により150倍に希釈し、超音波破砕によりPHA抽出液を得た。超音波破砕にはSMT社製超音波分散機UH?600を用い、最大出力で40秒、4回の処理を行った。得られたPHA抽出液をレーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置(Microtrac MT3300EXII)により解析し、PHA粒子の体積平均径(MV)を測定した。測定は標準的な設定(粒子透過性:透過、粒子屈折率:1.81、粒子形状:非球形、溶媒屈折率:1.333)で行った。
PHA生産培養は次のように行った。まず、KNK-005株のグリセロールストック(50μl)を種母培地(10ml)に接種して24時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を、1.8Lの前培養培地を入れた3Lジャーファーメンター(丸菱バイオエンジ製MDL-300型)に1.0v/v%接種した。運転条件は、培養温度33℃、攪拌速度500rpm、通気量1.8L/minとし、pHは6.7~6.8の間でコントロールしながら28時間培養し、前培養を行なった。pHコントロールには14%水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
比較例と同様の条件でA2365遺伝子発現強化株を用いた培養検討を行なった。PHA蓄積量の割合およびPHA粒子径の測定結果を表1に示す。
Claims (8)
- ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、A2365遺伝子の発現が強化された、カプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物。
- 請求項1に記載の形質転換微生物を、炭素源の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 炭素源が、油脂あるいは脂肪酸を含有する、請求項2に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 炭素源が、糖を含有する、請求項2に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 炭素源が、二酸化炭素を含有する、請求項2に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸が、2種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、請求項2~5のいずれか1項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、請求項6に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシ酪酸と3-ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、請求項7に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
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2020
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Non-Patent Citations (2)
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UniProtKB, Accession No. Q0K961,H16-A2365 gene,[online],Last modified: October 3,2006,[retrieved on 2020.03.23],<URL: https://www.uniprot.org/uniprot/Q0K961> |
佐藤 俊輔ほか,微生物による生分解性ポリマーPHBH製造法の開発,生物工学会誌,2019年02月25日,Vol. 97,No. 2,pp. 66-74 |
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