JP2007125004A - ポリヒドロキシアルカン酸の製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の配列で示されるアミノ酸配列の477番のセリンが、システィン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ロイシン、アルギニン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列をコードする、Pseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子;ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素;組換えベクター;形質転換体;並びに、油脂類の存在下、当該形質転換体を培養し、得られる培養物から(R)-3-ヒドロキシブタン酸と3-ヒドロキシアルカン酸とからなるポリヒドロキシアルカン共重合体を採取することを特徴とする、ポリアルカン酸共重合体の製造法。
【選択図】なし
Description
従って、本発明は、油脂類を炭素源として、柔軟性等の機械的物性に優れたP(3HB-co-3HA)を高い生産性で製造する方法を提供することを目的とする。
各アミノ酸に対応する遺伝暗号は、当該アミノ酸に対応する他の遺伝暗号に変更してもよいが、導入する遺伝子の翻訳効率の点から、各アミノ酸について、使用頻度の高い上記括弧内の遺伝暗号を使用することが好ましい。
導入する変異は、477番のセリン(agt)に関しては、システィン(tgc)、アスパラギン酸(gac)、グルタミン酸(gaa)、リシン(aag)、ロイシン(ctg)、トレオニン(acc)、バリン(gtc)、トリプトファン(tgg)又はチロシン(tac)である。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、プロリン等のアミノ酸類;ビタミン B1、ビタミン B12、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンC等のビタミン類などが挙げられる。
(1)微生物
a) Escherichia coli(エスチェリシア・コリ) DH5α株(カタラバイオより入手)
b) Escherichia coli S17-1株(H. G. Schlegel (Georg-August-Universitat、ドイツより入手)
c) Ralstonia eutropha(ラルストニア・ユートロファ) PHB-4(R. eutropha H16のポリヒドロキシアルカン酸蓄積能欠損株 DSM541、ドイツDSMより入手)
a) Luria-Bertani(LB)培地
Bacto trypton 10 g、酵母エキス 5g、NaCl 10 gを脱イオン水1Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブして作製した。また、寒天培地は、上記成分に寒天 1.5〜2 %(vol/vol)となるよう加えオートクレーブして作製した。抗生物質(カナマイシン:終濃度 50μg/mL、アンピシリン:終濃度100μg/mL)は、液体培地、寒天培地ともにオートクレーブ後に添加した。
b) Nutrient-rich(NR)培地
Bacto trypton 10 g、酵母エキス 2g、肉エキス 10 gを脱イオン水1Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブして作製した。抗生物質(カナマイシン:終濃度50μg/mL)はオートクレーブ後の液体培地に添加した。
c) シモンズクエン酸培地
クエン酸ナトリウム 2g、NaCl 5g、NH4H2PO4 1g、K2HPO4 1g、MgSO4 0.2 gを脱イオン水1Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブした後、アガー 15gを加えて作製した。寒天培地は、まず液体培地をpH 6.9に調整し、渇変を防ぐため当該液体培地と寒天成分とを別々に121℃で20分間オートクレーブした後にこれらを混合した。更に、200 g/Lに調整したMgSO4・7H2Oをフィルター滅菌し、培地全量に対し1/1000量及び抗生物質(カナマイシン:終濃度50μg/mL)を加え、滅菌シャーレに分注してプレートを作製した。
d) MS培地
d-1) 微量金属塩培地(0.1N HCl):CoCl2・6H20 0.218 g、FeCl3 9.7 g、CaCl2 7.8 g、NiCl3・6H2O 0.118 g、CrCl3・6H2O 0.105 g、CuSO4・5H2O 0.156 gを脱イオン水1Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブして作製した。
d-2) ミネラル培地(pH 7):K2HPO4 1.5 g、Na2HPO4・12H2O 9.0 g、NH4Cl 0.5 g、微量金属塩培地 1mlを脱イオン水1Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブした後、MgSO4・7H2O 0.2 gを加えて作製した。
図1にプラスミドの構築法を示す。
a) 野生型pGEM"C1PsABRe
pGEM"C1PsABReは、pGEM-Tベクター(プロメガより入手)に、配列番号2で示されるPseudomonas 61-3株由来のPHA合成酵素遺伝子phaC1Psと、R. eutropha属由来のモノマー供給遺伝子phaABReとを挿入して作製した。
上記野生型のプラスミドpGEM"C1PsABReを鋳型としたPCR法により、PHA合成酵素遺伝子phaC1Psの1429〜1431番のコドンagt(Ser)(配列番号2の塩基配列中の下線部)が、コドンtgc(Cys)、gac(Asp)、gaa(Glu)、aag(Lys)、ctg(Leu)、acc(Thr)、gtc(Val)、tgg(Trp)、tac(Tyr)、gcc(Ala)、ttc(Phe)、ggc(Gly)、cac(His)、atc(Ile)、atg(Met)、aac(Asn)、ccg(Pro)、cag(Gln)又はcgc(Arg)にそれぞれ置換された塩基配列を有するDNA断片を、当該変異が挿入されたフォワードプライマー(配列番号3)及び変異が挿入されていないリバースプライマー(配列番号4)によりプラスミド全体を増幅させ、これを自己ライゲーションすることにより、当該変異を挿入した。配列番号3の「X」は、Ser以外の19種類のアミノ酸残基を示す。PCRの条件は、96℃で1分、58℃で30秒、68℃で8分を1サイクルとして、これを30回繰り返した。
野生型pGEM"C1PsABRe及び変異導入pGEM"C1PsABReプラスミドをE. coli DH5α株に形質転換し、抗生物質含有LB寒天培地で37℃、12時間培養した。プレート上に形成された単一コロニーを拾い、抗生物質含有LB培地1.7 mLに植菌し、37℃、160/分で12時間振盪培養した。当該培養液からE. coli DH5α株を回収し、75μLのTE溶液(10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)を用い、Rapid Plasmid Miniprep System(MARLIGEN BIOSCIENCE社製)によりプラスミドを抽出した。
まず、挿入DNA断片を作製した。上記c)の抽出プラスミドをBamHIによって消化し、0.8 %アガロースゲル(TaKaRa社製)を用いて電気泳動を行った。その後、分離した目的のDNA断片のゲルを切り出し、Rapid Gel Extraction System(MARLIGEN BIOSCIENCE社製)を用いて精製した。その際、50μLのTE溶液を用いて溶出した。更に、このDNA断片をエタノール沈殿によって濃縮し、10μLのTE溶液に溶解した。
このようにして得られた濃縮挿入DNA断片4μLとpBBR1MCS-2ベクター(M. E. K. Kovach, Louisiana State University,米国より入手)1μLとを混合し、DNA Ligation kit ver.2(TaKaRa社製)を5μL加えた後、16℃で約2〜3時間反応させた。次いで、上記c)の方法によって、プラスミド抽出を行い、挿入断片の有無及び挿入方向を確認し、pGEM"C1PsABReのBamHI断片(phaC1PsとphaABReとを含む)を挿入したプラスミドpBBR1"C1PsABReを作製した。
a) リコンビナントR. eutropha PHB-4株の作製
R. eutropha PHB-4株への遺伝子伝達を目的として接合伝達を行った。プラスミドpBBR1"C1PsABReをE. coli S17-1株へ形質転換し、抗生物質入りのプレートで37℃、12時間培養を行った。プレート上に形成された単一コロニーを拾い、抗生物質を入れた1.7 mLのLB培地に植菌し37℃、160/分で12時間振盪培養した。培養後、培養液を1.5 mLチューブに移し、12,000 rpm(12,500×g)で1分間遠心した。ここで、抗生物質含有LB培地は上清を完全に取り除き、新たにLB培地を500μL加えて懸濁し、再度12,000 rpmで1分間遠心した。次いで、LB培地の上清を残りが約50μLとなるよう取り除き懸濁させた。
リコンビナントR. eutropha株の培養にはMS培地を用いた。シモンズクエン酸培地上で単離した単一コロニーを白金耳を用いて1.7 mLのNR培地に植菌し、30℃で12時間振盪培養した(前培養)。この培養液1mLを、大豆油(5 g/L)及び抗生物質を含む100 mLのMS培地に植菌し、30℃、130/分で72時間振盪培養を行った(本培養)。
以上の方法で培養後、250 mL遠心管に培養液を移し、4℃、6,000 rpm(4,050×g)で10分間遠心し集菌した。ここで、大豆油を除去するために、培養液に20 mLのヘキサンを加え、よく振盪することにより残存していた油脂分を取り除いた。菌を遠心分離後、約20 mLの水に菌体を懸濁させ、再度4℃、6,000 rpmで10分間遠心し集菌し、上清を取り除いた。集菌した菌のペレットを2〜3mLの超純水に懸濁させ、5mLのポリプロピレン容器に移し、風穴を開けたパラフィルムを貼り付け、-80℃で凍結乾燥し、72時間真空乾燥させることにより乾燥菌体を得た。
a) PHAの精製
PHAを蓄積させた乾燥菌体を100 mLの蓋付ガラス瓶に移し、100 mLのクロロホルムを加え72時間攪拌した。撹拌後の溶液をNo.1濾紙(アドバンテック社製)でろ過し、ナス型フラスコに移し変えた。その後、ロータリーエバポレーターで完全に濾液を揮発させ、共重合体を析出させた。析出した共重合体を少量のメタノールで洗い取り、約20 mLのクロロホルムに完全に溶解させた後、400 mLのメタノールに少量ずつ滴下しながら撹拌を行い精製した。精製した共重合体をNo.1濾紙で回収し、48時間ドラフト中で乾燥させ、以降の実験に使用した。
菌体内のPHA含有率とその組成は、ガスクロマトグラフ(GC)で決定した(Brauneggら, 1978)。まず、得られた乾燥菌体を耐圧ガラス管に10〜15 mL秤量し、ここに硫酸メタノール溶液(硫酸:メタノール=15 vol%:85 vol%)2mL及びクロロホルム2mLを加えて密栓し、100℃、140分間ヒートブロックで加熱しメタノール分解した。加熱中は約30分ごとにサンプルを撹拌した。その後、室温まで冷却し、純水1mLを加えて激しく撹拌した。静置後、二層に分離した下層(クロロホルム層)をパスツールピペットで吸引し、0.45μm径のMillex-FH PVDFフィルター(ミリポア社製)でろ過した。ろ過後のクロロホルム層500μLに内部標準物質である0.1vol%カプリル酸メチル500μLを加え混合したものをサンプルとした。GC装置は島津製作所製のガスクロマトグラフGC14Bを用い、カラムにはGLサイエンス社製NEUTRA-BOND-1(内径30 m×0.25 mm、膜厚0.4μm)を用いた。キャリアガスとしてHe及びN2を用い、成分の検出には水素炎イオン化検出器を用いた。
c-1) GPC(ゲル浸透クロマトグラフ)測定
菌体から精製したPHAの数平均分子量(Mn)及び分子量分布(Mw/Mn)(Mw:重量平均分子量)をGPC測定によって求めた。標準物質としてポリスチレンを使用しているため、本発明で求めた分子量はポリスチレン換算相対分子量である。用いた5種類のポリスチレンの分子量は、3,790、30,300、219,000、756,000及び4,230,000である。GPCサンプルは、精製した重合体を約1mg/mLとなるようにクロロホルムに溶解し、孔径0.45μmのMillex-FH PVDFフィルター(ミリポア社製)を取り付けたシリンジでろ過して作製した。GPC測定には島津製作所社製のLC-VPシリーズ(システムコントローラー:SCL-10AVP、オートインジェクター:SIL-10A VP、送液ユニット:LC-10AD VP、カラムオーブン:CTO-10A、ディテクター:RID-10A)を使用し、カラムにはShodex社製のK-806M及びK-802を用いた。移動層にはクロロホルムを用い、総液流量は0.8 mL/分、カラム温度は40℃に設定し、サンプル注入量は50μLとした。データの解析にはCLASS-VP用GPC(島津製作所社製)を用いた。ポリスチレンスタンダードから検量線を引き、これとサンプルデータとを照合することによりポリスチレン換算分子量及び分子量分布を算出した。
DSCサンプルは、精製したPHAを約10 mg秤り取り、5mL容のサンプルバイアルに入れ、約1〜2mLのクロロホルムに完全に溶解した。これをドラフト中で48時間乾燥させた後、24時間真空乾燥させることによりキャストフィルムを作製した。このキャストフィルムから約3mgを秤量し、専用アルミニウムパンに入れたものをDSC測定サンプルとした。測定には、パーキンエルマー社製のPyris 1 DSCを使用した。測定は20 mL/分の窒素雰囲気下で行った。対照には試料の入っていないアルミニウムパンを用いた。測定の条件として、初めに25℃〜200℃まで20℃/分の昇温速度で加熱し、200℃で1分間保持した後、-500℃/分で-120℃まで急冷した。次に、-120℃で1分間保持した後、20℃/分の昇温速度で200℃に加熱した。解析には、パーキンエルマー社製の解析ソフトData Analysisを用いた。測定した試料の融点Tm及び融解エンタルピーΔHmの決定は、最初に昇温した時のサーモグラムより、熱容量変化の中点をガラス転移温度Tgとした。
(1)部位481(グルタミン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHA
部位481(グルタミン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHAの含量及びその組成をGC測定により求めた結果を表1、図2及び3に示す。
表1及び図3中の3HB、3HHx、3HO、3HD、3HDD、C4、C6、C8、C10及びC12は以下のモノマーを示す。3HB及びC4;3-ヒドロキシブタン酸、3HHx及びC6;3-ヒドロキシヘキサン酸、3HO及びC8;3-ヒドロキシオクタン酸、3HD及びC10;3-ヒドロキシデカン酸、3HDD及びC12;3-ヒドロキシドデカン酸。PHA含量は乾燥細胞が100 %ポリマーで形成されていると仮定した場合の含量を示す。
一方、グルタミン酸(E)への置換体(参考例)では3-ヒドロキシブタン酸(3HB)の含量が低く、中鎖長モノマー含量が比較的高かった。
尚、アラニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、アスパラギン、プロリン、セリン、トレオニン又はチロシンへの置換体では、野生型に比較してPHA含量の増加が認められなかった。
部位477(セリン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHAの含量及びその組成をGC測定により求めた結果を表2、図4及び5に示す。
表2及び図5中の3HB、3HHx、3HO、3HD、3HDD、C4、C6、C8、C10及びC12は以下のモノマーを示す。3HB及びC4;3-ヒドロキシブタン酸、3HHx及びC6;3-ヒドロキシヘキサン酸、3HO及びC8;3-ヒドロキシオクタン酸、3HD及びC10;3-ヒドロキシデカン酸、3HDD及びC12;3-ヒドロキシドデカン酸。PHA含量は乾燥細胞が100 %ポリマーで形成されていると仮定した場合の含量を示す。
なかでも、(T)又は(V)に置換された変異酵素では、それぞれ野性型の約7.4倍、約8.1倍と大きな増加を示した。従って、これらの変異体と他のモノマー供給酵素遺伝子等とを組み合わせることにより、植物油からの更に効率的にPHAが製造できることが期待できる。
尚、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン又はグルタミンへの置換体では、野生型に比較してPHA含量の増加が認められなかった。
上記表1及び2においてPHA含量の高かった5菌体から、PHAの抽出を行い、得られたPHAのGPC測定及びDSC測定を行った。その結果を表3に示す。
部位130(グルタミン酸)への飽和変異導入によって蓄積されたPHAの含量及びその組成をGC測定により求めた結果を表4に示す。
表4中の3HB、3HHx、3HO、3HD、3HDD、C4、C6、C8、C10及びC12は以下のモノマーを示す。3HB及びC4;3-ヒドロキシブタン酸、3HHx及びC6;3-ヒドロキシヘキサン酸、3HO及びC8;3-ヒドロキシオクタン酸、3HD及びC10;3-ヒドロキシデカン酸、3HDD及びC12;3-ヒドロキシドデカン酸。PHA含量は乾燥細胞が100 %ポリマーで形成されていると仮定した場合の含量を示す。
部位325(セリン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHAの含量及びその組成をGC測定により求めた結果を表5に示す。
表5中の3HB、3HHx、3HO、3HD、3HDD、C4、C6、C8、C10及びC12は以下のモノマーを示す。3HB及びC4;3-ヒドロキシブタン酸、3HHx及びC6;3-ヒドロキシヘキサン酸、3HO及びC8;3-ヒドロキシオクタン酸、3HD及びC10;3-ヒドロキシデカン酸、3HDD及びC12;3-ヒドロキシドデカン酸。PHA含量は乾燥細胞が100 %ポリマーで形成されていると仮定した場合の含量を示す。
Claims (15)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列の477番のセリンが、システィン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ロイシン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列をコードする、Pseudomonas(シュウドモナス) 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子。
- 前記置換されたアミノ酸が、ロイシン、トレオニン又はバリンである、請求項1記載の遺伝子。
- 請求項1又は2記載の遺伝子から翻訳される、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
- 請求項1又は2記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項4記載の組換えベクターがRalstonia eutropha(ラルストニア・ユートロファ) PHB-4株に導入されてなる形質転換体。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列の481番のグルタミンが、システィン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、バリン、トリプトファン又はアルギニンに置換されたアミノ酸配列をコードするPseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を含む組換えベクターが、Ralstonia eutropha(ラルストニア・ユートロファ) PHB-4株に導入されてなる形質転換体。
- 前記置換されたアミノ酸が、イソロイシン、バリン又はトリプトファンである、請求項6記載の形質転換体。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列の130番のグルタミン酸が、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列をコードするPseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を含む組換えベクターが、Ralstonia eutropha PHB-4株に導入されてなる形質転換体。
- 前記置換されたアミノ酸が、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン又はチロシンである、請求項8記載の形質転換体。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列の325番のセリンが、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオチン、アスパラギン、又はチロシンに置換されたアミノ酸配列をコードするPseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を含む組換えベクターが、Ralstonia eutropha PHB-4株に導入されてなる形質転換体。
- 前記置換されたアミノ酸が、ロイシン又はチロシンである、請求項10記載の形質転換体。
- 油脂類の存在下、請求項5〜11のいずれか1項記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から、(R)-3-ヒドロキシブタン酸と(R)-3-ヒドロキシアルカン酸との共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸の製造法。
- 前記共重合体中の前記(R)-3-ヒドロキシブタン酸の含量が68〜95 mol%である、請求項12記載の製造法。
- 前記(R)-3-ヒドロキシアルカン酸が、(R)-3-ヒドロキシヘキサン酸、(R)-3-ヒドロキシオクタン酸、(R)-3-ヒドロキシデカン酸及び(R)-3-ヒドロキシドデカン酸から選ばれる、請求項12又は13記載の製造法。
- 前記油脂類が大豆油である、請求項12〜14のいずれか1項記載の製造法。
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