WO2022113530A1 - ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法 - Google Patents

ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法 Download PDF

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WO2022113530A1
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p3ha
molecular weight
poly
average molecular
powder
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PCT/JP2021/036938
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翔悟 廣田
智哉 西中
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株式会社カネカ
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
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    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
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    • C08G63/89—Recovery of the polymer
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    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing poly (3-hydroxyalkanoate).
  • P3HA poly (3-hydroxyalkanoate)
  • Patent Document 1 describes a method in which a cell containing P3HA is enzymatically treated and then treated with an alkaline aqueous solution.
  • Patent Document 2 describes a method for treating a bacterial cell containing P3HA with an alkaline aqueous solution.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing P3HA from cells containing P3HA in high yield and with reduced impurities (particularly, residual protein).
  • the present inventors have subjected to alkaline treatment of the cells containing P3HA before crushing (before enzyme treatment) and after crushing (after enzyme treatment).
  • the present invention has been completed for the first time by finding that P3HA can be obtained in high yield and with reduced impurities (particularly, residual protein) by adjusting the molecular weight of P3HA.
  • one aspect of the present invention is a method for producing a poly (3-hydroxyalkanoate) having a weight average molecular weight of 100,000 to 700,000, and (a) a cell containing the poly (3-hydroxyalkanoate).
  • the weight average molecular weight is 100,000 to 600,000, the residual protein amount is 2000 ppm or less, the particle surface is non-porous, and it is represented by the following formula (1).
  • Weight average molecular weight retention rate (%) (Weight average molecular weight of P3HA after heating at 160 ° C for 20 minutes / Weight average molecular weight of P3HA before heating at 160 ° C for 20 minutes) ⁇ 100 ... (1)
  • the method for producing a poly (3-hydroxy alkanoate) according to an embodiment of the present invention is a poly (3-hydroxy alkanoate) having a weight average molecular weight of 100,000 to 700,000.
  • a method for producing (ate) wherein (a) an alkaline aqueous solution is added to a culture solution containing cells containing poly (3-hydroxyalkanoate) to adjust the pH to 8.0 to 12.0. (B) An enzyme is added to the culture solution obtained in the step (a) to treat the cells with an enzyme, and (c) an alkaline aqueous solution is added to the culture solution obtained in the step (b). It is characterized by including a step of adjusting the pH to 10.0 to 12.0.
  • the present inventor has found that when an attempt is made to produce P3HA from a cell containing P3HA by the method described in Patent Document 1, there arises a problem that the yield of P3HA decreases. In particular, it has been found that the yield of P3HA becomes extremely poor when producing P3HA having a low molecular weight. Further, the present inventor tried to produce P3HA from cells containing P3HA by the method described in Patent Document 2, and found that the obtained P3HA contained a large amount of impurities (particularly, residual protein). .. When processed using such P3HA, foreign matter is generated in the product, which causes a problem that the quality is deteriorated.
  • the present inventor treated the cells with an alkali before crushing the cells (before enzyme treatment) and after crushing (after enzyme treatment) to adjust the molecular weight of P3HA.
  • an alkali before crushing the cells
  • after crushing after enzyme treatment
  • P3HA can be obtained in high yield and with reduced impurities (particularly, residual protein).
  • "after crushing the cells” may be after the enzyme treatment step of the step (b) described later, and is intended to include the time of crushing the cells.
  • the present inventor has found for the first time that the P3HA obtained by the above production method has the following characteristics: -Excellent thermal stability. -From the viewpoint of molecular weight distribution, it should contain a large amount of P3HA of the same molecular weight (monodispersity). -When low molecular weight P3HA is produced, the surface of the obtained P3HA powder is non-porous.
  • the present inventor presumes as follows as a factor for obtaining high-yield P3HA by this production method. That is, in the conventional method (for example, the method described in Patent Document 1), since the molecular weight is adjusted after P3HA is crystallized, the molecular weight of the crystallized portion of P3HA cannot be sufficiently adjusted, and as a result, P3HA is adjusted. Only the ends of the cells are hydrolyzed to generate small, unrecoverable molecules. On the other hand, in this production method, P3HA in an amorphous state is randomly hydrolyzed by adjusting the molecular weight before crushing the cells. As a result, the generation of unrecoverable small molecules is suppressed, and a high yield can be achieved.
  • the present inventor speculates as follows as a factor for obtaining P3HA with reduced impurities (particularly, residual protein) by this production method. That is, in the method described in the conventional method (for example, Patent Document 2), washing with a surfactant is performed immediately after crushing the cells, so that the residual protein derived from the cells is not sufficiently removed. On the other hand, in this production method, impurities such as proteins derived from cells are dispersed and dissolved by performing alkaline treatment after crushing the cells, so that P3HA having few impurities can be produced.
  • This production method is a method for producing P3HA of poly (3-hydroxyalkanoate) having a weight average molecular weight of 100,000 to 700,000, which comprises the following steps (a) to (c).
  • the manufacturing method may appropriately include steps (a'), (c'), (d), (e), (f) and the like shown below.
  • molecular weight means “weight average molecular weight” unless otherwise specified.
  • low molecular weight P3HA is intended to be P3HA having a weight average molecular weight of 300,000 or less.
  • the P3HA produced by this production method is preferably a low molecular weight P3HA.
  • the step (a) is a step of adding an alkaline aqueous solution to the culture solution containing the cells containing P3HA (also referred to as “alkaline treatment”) to adjust the pH to 8.0 to 12.0. That is, it can be said that it is a step of hydrolyzing P3HA and adjusting the molecular weight of P3HA by adjusting the pH to 8.0 to 12.0. According to this step, in the cells containing P3HA, the molecular weight of the P3HA can be adjusted in the cells (in other words, in a state where the P3HA is not crystallized (amorphous)).
  • the step (a) is a step of maintaining the culture solution containing the cells containing P3HA at a pH of 8.0 to 12.0 for a certain period of time. Further, it can be said that the step (a) is a molecular weight adjusting step.
  • P3HA means the following formula (2) :. [-O-CHR-CH 2 -CO-] (2) (In the formula, R is an alkyl group represented by C n H 2n + 1 , and n is an integer of 1 to 15) is intended to be a general term for copolymers consisting of one or more units represented by. ..
  • P3HA is not particularly limited as long as it is included in the above formula (2).
  • P3HA may be a poly (3-hydroxybutyrate) having only 3-hydroxybutyrate as a repeating unit, or 3-hydroxybutyrate and another hydroxyalkanoate. It may be a copolymer.
  • P3HA may be a mixture of a homopolymer and one or more copolymers, or may be a mixture of two or more copolymers.
  • the type of copolymerization is not particularly limited, and may be random copolymerization, alternate copolymerization, block copolymerization, graft copolymerization, or the like.
  • examples of P3HA include poly (3-hydroxybutyrate) (P3HB), poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxypropionate) (P3HB3HP), and poly (3).
  • P3HB3HH poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)
  • P3HB3HV poly (3-hydroxybutyrate-co-4- (Hydroxybutyrate)
  • P3HB4HB poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate)
  • P3HB3HO poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate)
  • P3HB3HOD Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxydecanoate)
  • P3HB3HD Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxydecanoate)
  • P3HB3HV3HH Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvariate-co-3-hydroxyhexanoate)
  • P3HB3HH, P3HB4HB, and P3HB3HP are preferable.
  • P3HB and P3HB3HV are preferable, and P3HB3HH and P3HB4HB are particularly preferable because they are industrially easy to produce.
  • the composition ratio of the copolymerization component of P3HA is within the above range, P3HA having excellent processability can be provided.
  • the weight average molecular weight (hereinafter, also referred to as “initial molecular weight”) of P3HA before adjusting the molecular weight (that is, before adding the alkaline aqueous solution) is not particularly limited, but is, for example, 3 million or less. Yes, it is preferably 2.8 million or less, and more preferably 2.5 million or less.
  • the lower limit of the initial molecular weight of P3HA is not particularly limited, but may be, for example, 400,000 or more.
  • the initial molecular weight of P3HA is measured by the method described in Examples.
  • the term "cells containing P3HA” is intended to be a microorganism that produces P3HA. That is, in one embodiment of the invention, P3HA is produced by microorganisms.
  • the microorganism used in this production method is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing P3HA in cells. For example, microorganisms isolated from nature, microorganisms deposited in a deposit agency for strains (for example, IFO, ATCC, etc.), or mutants or transformants that can be prepared from them can be used.
  • the genus Cupriavidus the genus Alcaligenes, the genus Ralstonia, the genus Pseudomonas, the genus Bacillus, the genus Azotobacter, the genus Azotobacter, the genus Nocardia.
  • bacteria of the genus Aeromonas include bacteria of the genus Aeromonas.
  • microorganisms belonging to the genus Aeromonas, Alcaligenes, Ralstonia, or Cupriavidus are preferable.
  • the target P3HA synthase gene and / or a mutant thereof can be applied to the microorganism.
  • the transformant obtained by introduction can also be used.
  • the gene for the P3HA synthase used for producing such a transformant is not particularly limited, but the gene for the P3HA synthase derived from Aeromonas cavier is preferable.
  • the cells containing P3HA are preferably inactivated.
  • the method of inactivation is not particularly limited, and examples thereof include a method of heating and stirring a culture solution containing cells containing P3HA at 70 ° C to 80 ° C for 8 hours.
  • the alkaline aqueous solution is an aqueous solution containing a basic compound.
  • the basic compound contained in the alkaline aqueous solution is not particularly limited, and for example, an alkali metal such as sodium hydroxide and potassium hydroxide or an alkali earth metal hydroxide; a metal carbonate such as sodium carbonate and potassium carbonate; Examples thereof include metal phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, sodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate and the like, or metal hydrogen phosphate salts.
  • the basic compound contained in the alkaline aqueous solution is preferably an alkali metal hydroxide or an alkaline earth metal hydroxide, and more preferably sodium hydroxide.
  • the basic compound one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • the pH is preferably adjusted to 8.0 to 12.0, more preferably 8.2 to 11.5, and 8.4 by adding an alkaline aqueous solution. It is more preferable to adjust to ⁇ 11.5.
  • the reaction time (in other words, the time for adjusting and maintaining the pH to 8.0 to 12.0) in the step (a) is, for example, 4 hours to 30 hours, preferably 8 hours to 20 hours.
  • the reaction time in the step (a) is within the above range, the molecular weight of P3HA in the cells can be adjusted to a suitable range, and excessive reduction of the molecular weight of P3HA can be prevented.
  • the temperature in the step (a) is preferably less than 100 ° C, more preferably less than 80 ° C.
  • the lower limit is not particularly limited, but is preferably 50 ° C. or higher, for example.
  • the yield of P3HA is calculated based on the following formulas (3) and (4):
  • P3HA content (g / g) (weight of dried product (g) / weight of culture solution (g)) ...
  • Yield of P3HA (%) (P3HA content of culture solution after molecular weight adjustment / P3HA content of culture solution before molecular weight adjustment) ⁇ 100 ⁇ (solid content concentration (%) of culture solution before molecular weight adjustment / after molecular weight adjustment Solid content concentration (%) of the culture solution of
  • the various parameters in the above formulas (3) and (4) are measured by the method described in Examples.
  • This manufacturing method includes a molecular weight adjustment step (alkali treatment step) at least twice.
  • the "P3HA content of the culture solution before the molecular weight adjustment" in the formula (4) is intended to be the P3HA content of the culture solution before the first molecular weight adjustment is performed, and the "P3HA content of the culture solution after the molecular weight adjustment" is The P3HA content of the culture is intended after the final molecular weight adjustment has been made.
  • P3HA content of the culture solution before molecular weight adjustment and “P3HA content of the culture solution after molecular weight adjustment” are values measured by the method described in Examples.
  • the yield of P3HA is 95% or more, preferably 95.3% or more, and more preferably 95.5% or more from the viewpoint of productivity.
  • the higher the yield of P3HA, the better, and the upper limit is not particularly limited, but for example, it is 99%, preferably 99.5%, and most preferably 100%.
  • the step (b) is a step of adding an enzyme to the culture solution obtained in the step (a) to carry out the enzyme treatment of the cells. According to this step, P3HA can be efficiently recovered from the cells by destroying and removing impurities (cell wall, protein, etc.) derived from the cells.
  • the enzymatic treatment of step (b) can be an alkaline proteolytic enzyme treatment and / or a lytic enzyme treatment.
  • the alkaline proteolytic enzyme treatment and the lytic enzyme treatment are preferably performed at least once, and if necessary, the alkaline proteolytic enzyme treatment and / or the lytic enzyme treatment may be performed twice or more.
  • the order of performing the alkaline proteolytic enzyme treatment and / or the lytic enzyme treatment is not particularly limited.
  • the enzyme treatment in step (b) is preferably performed in the order of alkaline proteolytic enzyme treatment, lytic enzyme treatment, and alkaline proteolytic enzyme treatment.
  • the enzymatic treatment in the step (b) in the above order, it is not necessary to use sulfuric acid or the like for adjusting the pH of the culture solution in this production method. That is, P3HA can be produced without using sulfuric acid or the like, which is a corrosive liquid for equipment.
  • the reason why the above order is preferable is that the present inventor lowers the pH in the culture solution to near neutral by the first treatment with an alkaline proteolytic enzyme, and as a result, it is not necessary to add sulfuric acid or the like for pH adjustment. I'm guessing there is.
  • step (b) when performing enzyme treatment (for example, alkaline proteolytic enzyme treatment and lytic enzyme treatment), the pH and temperature of the culture solution are adjusted according to the optimum pH and temperature of the enzyme to be used. It is preferable to do so.
  • the method for adjusting the pH and temperature of the culture solution is not particularly limited, and known methods can be used.
  • alkaline proteolytic enzyme treatment As used herein, the term "alkaline proteolytic enzyme” is intended to be a proteolytic enzyme having an activity of degrading a protein in an alkaline environment (for example, in a solution having a pH of 8.5).
  • alkaline proteolytic enzyme treatment is intended to be a step of adding the alkaline proteolytic enzyme to the culture solution and enzymatically treating the cells.
  • the alkaline proteolytic enzyme is not particularly limited as long as it has an activity of degrading proteins in an alkaline environment, for example, serine-specific proteolytic enzymes (eg, subtilisin, chymotrypsin, trypsin), cysteine.
  • serine-specific proteolytic enzymes eg, subtilisin, chymotrypsin, trypsin
  • Specific proteolytic enzymes eg papaine, promeline, catepsin
  • aspartate-specific proteolytic enzymes eg pepsin, catepsin D, HIV protease
  • Serine-specific proteolytic enzymes, especially subtilisin (eg, alcalase) are preferred from the viewpoint of economic advantage.
  • subtilisin eg, alcalase
  • alkaline proteolytic enzyme for example, "Alkalase 2.5L” manufactured by Novozyme Co., Ltd .; “Protin SD-AY10” and “Protease P” Amano "3SD” manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd .; “Multifect PR6L” and “Optimase PR89L” manufactured by Japan Co., Ltd .; “Sumiteam MP” manufactured by Shin Nihon Kagaku Kogyo Co., Ltd .; “Delbolase” manufactured by DSM Japan Co., Ltd .; , “Bioplase SP-20FG” and “Bioplase SP-4FG”; "Orientase 22BF” manufactured by HBI Co., Ltd .; “Aloase XA-10” manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd. and the like.
  • the optimum pH of the alkaline proteolytic enzyme is not particularly limited as long as the alkaline proteolytic enzyme has activity in an alkaline environment, but is, for example, 8.0 to 14.0, preferably 8.0 to 14.0. It is 8.0 to 12.0, more preferably 8.0 to 10.0, still more preferably 8.0 to 9.0, and most preferably 8.5.
  • the optimum temperature of the alkaline proteolytic enzyme is not particularly limited, but from the viewpoint that excessive heating is not required and thermal change (pyrolysis) of P3HA can be prevented. It is preferably 60 ° C. or lower, and more preferably 50 ° C. or lower.
  • the lower limit of the optimum temperature is not particularly limited, but is preferably room temperature (for example, 25 ° C.) or higher from the viewpoint of not requiring an excessive cooling operation and being economical.
  • the alkaline proteolytic enzyme treatment is a step of adding a lytic enzyme to the culture solution and enzymatically treating the cells.
  • lytic enzyme is intended to be an enzyme having an activity of degrading (bacteriolytic) the cell wall (for example, peptidoglycan) of a bacterial cell.
  • the lytic enzyme is not particularly limited, and examples thereof include lysozyme, labia, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, endolysine, and autolysine. Lysozyme is preferred from the perspective of being economically advantageous. One of these types may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • lytic enzyme a commercially available product can also be used, and examples thereof include “lysozyme” and “achromopeptidase” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the optimum pH of the lytic enzyme is not particularly limited as long as the lytic enzyme has cell wall degrading activity, but is, for example, 5.0 to 11.0, preferably 6.0 to 9. It is 0.0, more preferably 6.0 to 8.0.
  • the optimum temperature of the lytic enzyme is not particularly limited, but from the viewpoint that excessive heating is not required and thermal change (pyrolysis) of P3HA can be prevented, the temperature is 60 ° C. or lower. Is preferable, and 50 ° C. or lower is even more preferable.
  • the lower limit of the optimum temperature is not particularly limited, but it is preferably room temperature (for example, 25 ° C.) or higher from the viewpoint of being economical without the need for an excessive cooling operation.
  • the enzymatic treatment of step (b) can be performed by a combination of lysozyme and alcalase.
  • the enzyme treatment time in the step (b) may vary depending on the type of enzyme, pH, temperature and other conditions, but is, for example, 1 hour to 8 hours, preferably 2 hours to 6 hours.
  • the manufacturing method may further include step (a') between steps (a) and (b).
  • the step (a') is a step of adjusting the pH of the culture solution obtained in the step (a) to 6.0 to 8.0
  • the enzyme treatment in the step (b) is a lytic enzyme treatment and a lytic enzyme treatment. It involves performing alkaline proteolytic enzyme treatment in this order.
  • the method for adjusting the pH is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding an acid to the culture solution.
  • the acid is not particularly limited, and may be either an organic acid or an inorganic acid, and may or may not be volatile. More specifically, as the acid, for example, sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid and the like can be used.
  • the step (c) is a step of adding an alkaline aqueous solution to the culture solution obtained in the step (b) to adjust the pH to 10.0 to 12.0. According to this step, the molecular weight of P3HA can be adjusted to a smaller value, and when the cells are disrupted, impurities (nucleic acid, protein, etc.) derived from the cells are dispersed and dissolved to obtain high-purity P3HA. Can be separated from the body.
  • the step (c) can also be said to be an alkaline cleaning step.
  • the pH is preferably adjusted to 10.0 to 12.0, more preferably 10.2 to 11.8 by adding an alkaline aqueous solution, 10.4 to 11 It is more preferable to adjust to 6.6.
  • the pH is preferably adjusted to 10.0 or higher, the P3HA in the cells can be further adjusted to a lower molecular weight. Further, by adjusting the pH to 12.0 or less, it is possible to prevent excessive reduction in the molecular weight of P3HA.
  • the reaction time in the step (c) (in other words, the time for adjusting and maintaining the pH at 10.0 to 12.0) is, for example, 1 hour to 12 hours, preferably 1 hour to 6 hours.
  • the reaction time in the step (c) is within the above range, the molecular weight of P3HA in the cells can be adjusted to a suitable range, and excessive reduction of the molecular weight of P3HA can be prevented.
  • the manufacturing method may further include step (c') after step (c). It can be said that the step (c') is a surfactant treatment step.
  • the step (c') is a step of adding a surfactant to the culture solution obtained in the step (c). According to this step, impurities contained in the cells, particularly cell membranes, can be efficiently treated and more impurities derived from the cells can be removed, so that higher purity P3HA can be separated from the cells. can.
  • the surfactant is not particularly limited, and examples thereof include anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants, and nonionic surfactants.
  • anionic surface activity is preferable from the viewpoint of high ability to remove cell membranes.
  • One of these types may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • anionic surfactant examples include alkyl sulfates, alkylbenzene sulfonates, alkyl sulfates, alkenyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkenyl ether sulfates, ⁇ -olefin sulfonates and ⁇ -.
  • examples thereof include sulfo fatty acid salts, esters of ⁇ -sulfo fatty acid salts, alkyl ether carboxylates, alkenyl ether carboxylates, amino acid-type surfactants, N-acyl amino acid-type surfactants and the like.
  • an alkyl sulfate ester salt is preferable, and sodium dodecyl sulfate (SDS) is particularly preferable from the viewpoint of high ability to remove cell membranes and low cost.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • One of these types may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the amount of the surfactant to be added is not particularly limited, and is, for example, 0.1 to 5.0% by weight and 0.3 to 2.5% by weight with respect to the culture solution. Is preferable.
  • the step (c') may be performed before the step (c) or at the same time as the step (c). That is, the surfactant may be added before or at the same time as the addition of the alkaline aqueous solution to the culture solution. Further, the addition of the surfactant can be performed before the step (a) or at the same time as the step (a).
  • the manufacturing method may further comprise step (d).
  • Step (d) is a step of centrifuging the culture solution obtained in the step (c) and removing the supernatant to obtain a P3HA aqueous suspension enriched with P3HA. That is, it is a step of removing impurities from P3HA separated from the bacterial cells, and concentrating and purifying the cells. It can be said that the step (d) is a centrifugation step.
  • the method for centrifuging the culture solution is not particularly limited, and a known method can be used.
  • step (d) it is preferable to repeat the steps of centrifuging the culture solution, removing the supernatant, adding the solution to the sediment, and centrifuging and removing the supernatant again.
  • the solution to be added after removing the supernatant is preferably an alkaline aqueous solution adjusted to the same pH as the culture solution.
  • the solution is preferably the same as the alkaline aqueous solution used in the step (c).
  • the amount of impurities remaining in the final product is generally determined by the step (d), it is preferable to reduce these impurities as much as possible.
  • impurities may be mixed as long as the physical properties of the final product are not impaired, but when high-purity P3HA is required for medical applications, etc., impurities can be reduced as much as possible. preferable.
  • the amount of protein in the P3HA aqueous suspension can be mentioned.
  • the amount of protein in the P3HA aqueous suspension is not particularly limited as long as the amount of residual protein in the P3HA powder described later can be achieved.
  • the amount of the protein is preferably 3000 ppm or less, more preferably 2500 ppm or less, still more preferably 2000 ppm or less per P3HA weight in the P3HA aqueous suspension.
  • the solvent constituting the P3HA aqueous suspension (“solvent” is also referred to as “aqueous medium”) is not particularly limited, and may be water or a mixed solvent of water and an organic solvent. May be good. Further, in the mixed solvent, the concentration of the organic solvent is not particularly limited as long as it is equal to or less than the solubility of the organic solvent used in water.
  • the organic solvent is not particularly limited, and for example, alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, pentanol, hexanol, and heptanol; acetone and methyl ethyl ketone.
  • Ketones such as; ethers such as tetrahydrofuran and dioxane; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; amides such as dimethylformamide and acetamide; dimethylsulfoxide, pyridine, piperidine and the like.
  • methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, propionitrile and the like are preferable because they are easy to remove.
  • methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, acetone and the like are more preferable because they are easily available. Further, methanol, ethanol and acetone are particularly preferable.
  • the content of water in the aqueous medium constituting the P3HA aqueous suspension is preferably 5% by weight or more, more preferably 10% by weight or more, still more preferably 30% by weight or more, and particularly preferably 30% by weight or more. , 50% by weight or more.
  • the P3HA aqueous suspension in step (d) may contain other solvents, bacterial cell-derived components, compounds generated during purification, etc., as long as the essence of the present invention is not impaired.
  • the manufacturing method may further comprise step (e).
  • Step (e) is a step of adding a dispersant to the P3HA aqueous suspension obtained in the step (d) and preparing a P3HA aqueous suspension having a pH of 7 or less. It can be said that the step (e) is a pH adjusting step.
  • the step (e) preferably includes the following steps (e1) and step (e2). -Step (e1): Step of adding a dispersant to the P3HA aqueous suspension-Step (e2): Step of adjusting the pH of the P3HA aqueous suspension to 7 or less Step (e1) and step (e2) are carried out.
  • the order is not particularly limited, but from the viewpoint of suppressing the aggregation of P3HA in the step (e2) and obtaining an aqueous suspension having more excellent dispersion stability of P3HA, the step (e2) is performed after the step (e1). It is preferable to carry out.
  • the dispersant to be added in the step (e) is not particularly limited, and examples thereof include polyvinyl alcohol (PVA) -based dispersants, alkylene oxide-based dispersants, cellulose-based dispersants, and alcohol-based dispersants.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the polyvinyl alcohol-based dispersant and the alkylene oxide-based dispersant are preferable because they have a high effect of suppressing aggregation in the suspension of P3HA, and the alkylene oxide-based dispersant has a high processability of the obtained P3HA powder. More preferred.
  • One of these types may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the alkylene oxide-based dispersant is not particularly limited as long as it exhibits the above effects, but is composed of a block of poly (ethylene oxide) (PEO) and a block of poly (propylene oxide) (PPO). It is preferably configured and in the form of PEO-PPO-PEO.
  • poly (ethylene oxide) (PEO) block is intended to be a polymer portion formed by polymerizing ethylene oxide (EO) in the structure of an alkylene oxide-based dispersant.
  • poly (propylene oxide) (PPO) block is intended to be a polymer portion formed by polymerizing propylene oxide (PO) in the structure of an alkylene oxide-based dispersant.
  • the viscosity of the aqueous suspension is kept low and P3HA is produced with high productivity. be able to.
  • the range of PEO molecular weight and PEO molecular weight / PPO molecular weight in the alkylene oxide-based dispersant is preferably the following combination.
  • PEO molecular weight may be referred to as "EO molecular weight”
  • PPO molecular weight may be referred to as "PO molecular weight”.
  • the PEO molecular weight in the alkylene oxide-based dispersant may be 1500 or more, preferably 1750 or more, and more preferably 2000 or more.
  • the upper limit of the PEO molecular weight in the alkylene oxide-based dispersant is, for example, 30,000 or less, preferably 25,000 or less, and more preferably 20,000 or less.
  • the PEO molecular weight / PPO molecular weight in the alkylene oxide-based dispersant is preferably 0.5 or more, more preferably 0.6 or more, and 0.7 or more. Is even more preferable.
  • the upper limit of the PEO molecular weight / PPO molecular weight is preferably 5.0 or less, more preferably 4.8 or less, and further preferably 4.5 or less.
  • the alkylene oxide-based dispersant when the PEO molecular weight and the PEO molecular weight / PPO molecular weight in the alkylene oxide-based dispersant are within the above ranges, the alkylene oxide-based dispersant has hydrophilicity and the alkylene oxide-based dispersant is dispersed. Since the number of molecules increases with respect to the weight of the agent added, it is easy to maintain the dispersibility of the aqueous suspension.
  • the alkylene oxide-based dispersant has a PEO molecular weight of 1500 or more and a PEO molecular weight / PPO molecular weight of 0.5 to 5.0.
  • the alkylene oxide-based dispersant preferably has at least one PEO block having a molecular weight of 750 or more, and more preferably at least two or more.
  • the upper limit thereof is not particularly limited, but is, for example, 4 or less, preferably 3 or less.
  • the alkylene oxide-based dispersant has hydrophilicity.
  • the PPO molecular weight in the alkylene oxide-based dispersant is not particularly limited, but is, for example, 500 or more, preferably 1500 or more. Further, in one embodiment of the present invention, the upper limit of the PPO molecular weight in the alkylene oxide-based dispersant is, for example, 6700 or less, preferably 6250 or less. When the PPO molecular weight in the alkylene oxide-based dispersant is within the above range, the alkylene oxide-based dispersant has hydrophobicity.
  • the number of PPO blocks in the alkylene oxide-based dispersant is not particularly limited as long as the above effects are exhibited, and may be one or a plurality (for example, 2, 3, 4). ) May be.
  • the alkylene oxide-based dispersant is, for example, a compound represented by the following formula (5).
  • X is, for example, 17 to 340, preferably 20 to 285, and more preferably 22 to 226.
  • X is 340 or less, the number of molecules increases with respect to the weight of the alkylene oxide-based dispersant added, so that the dispersibility of the aqueous suspension can be easily maintained, and when X is 17 or more, the aqueous suspension has hydrophilicity.
  • Y is, for example, 8 to 115, preferably 10 to 110, and more preferably 24 to 107. When Y is 115 or less, it is easily dissolved in water, and when Y is 8 or more, it has hydrophobicity.
  • Z is, for example, 17 to 340, preferably 20 to 285, and more preferably 22 to 226.
  • the number of molecules increases with respect to the weight of the alkylene oxide-based dispersant added, so that the dispersibility of the aqueous suspension can be easily maintained, and when Z is 17 or more, the aqueous suspension has hydrophilicity.
  • X + Z the sum of X and Z (hereinafter, may be referred to as “X + Z”) is, for example, 34 to 680, preferably 40 to 570, and more preferably. , 44-452.
  • X + Z is 680 or less, the number of molecules increases with respect to the weight of the alkylene oxide-based dispersant added, so that the dispersibility of the aqueous suspension can be easily maintained, and when X is 34 or more, the aqueous suspension has hydrophilicity.
  • a commercially available product may be used as the alkylene oxide-based dispersant.
  • Commercially available products of alkylene oxide-based dispersants include, for example, Pluronic 10400 (manufactured by BASF), Pluronic 10500 (manufactured by BASF), Genapol PF80 (manufactured by Clariant), Unilube DP60-600B (manufactured by NOF Corporation), and Unilube DP60.
  • the amount of the dispersant added to the P3HA aqueous suspension is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 20 parts by mass with respect to 100 parts by mass of P3HA contained in the suspension, and is 0. .5 to 10 parts by mass is more preferable, and 0.75 to 5 parts by mass is further preferable.
  • the addition amount of the dispersant within the above range, the dispersion stability of P3HA in the P3HA aqueous suspension is further improved, and the P3HA powder can be efficiently produced.
  • the pH of the aqueous suspension of P3HA after the addition of the dispersant is adjusted to reduce the coloring when the P3HA is heated and melted, and to ensure the stability of the molecular weight during heating and / or drying. From the viewpoint, it is preferable to adjust to 7 or less, more preferably to 5 or less, and further preferably to 4 or less. Further, from the viewpoint of acid resistance of the container, it is preferable to prepare 1 or more, more preferably 2 or more, and further preferably 3 or more. By setting the pH of the P3HA aqueous suspension to 7 or less, the coloring when the P3HA powder is heated and melted (processed) is reduced, and the decrease in molecular weight during heating and / or drying can be suppressed.
  • the pH adjusting method is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding an acid.
  • the acid is not particularly limited, and may be either an organic acid or an inorganic acid, and may or may not be volatile. More specifically, as the acid, for example, sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid and the like can be used.
  • the concentration of P3HA in the P3HA aqueous suspension obtained in the step (e) is economically advantageous in terms of drying utility and improves productivity, so that it is preferably 30% by weight or more, more preferably 40% by weight or more. It is preferable, and more preferably 50% by weight or more. Further, the upper limit of the concentration of P3HA is the closest packing, and sufficient fluidity may not be ensured. Therefore, 65% by weight or less is preferable, and 60% by weight or less is more preferable.
  • the method for adjusting the concentration of P3HA is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding an aqueous medium or removing a part of the aqueous medium (for example, by centrifuging and then removing the supernatant). .. The adjustment of the concentration of P3HA may be carried out at any stage of the step (e), or may be carried out at a stage before the step (e).
  • the manufacturing method may further comprise step (f).
  • Step (f) is a step of drying the P3HA aqueous suspension prepared in step (e).
  • the drying method include a method of supplying a P3HA aqueous suspension in the form of fine droplets into a dryer and drying the suspension while in contact with hot air in the dryer (spray drying), vacuum drying and the like. .. Preferably, spray drying is used.
  • the step (f) can also be said to be a drying step.
  • the method (atomizer) of supplying the P3HA aqueous suspension in the form of fine droplets into the dryer is not particularly limited, and the method using a rotating disk and the method using a nozzle are not particularly limited. And the like, a known method can be mentioned.
  • the contact method between the droplet and the hot air in the dryer is not particularly limited, and examples thereof include a parallel flow type, a countercurrent type, and a method in which these are used in combination.
  • the drying temperature in the case of spray drying in the step (f) may be any temperature as long as it can remove most of the aqueous medium from the droplets of the P3HA aqueous suspension, and can be dried to the desired water content. It can be appropriately set under conditions that do not cause deterioration of quality (decrease in molecular weight, decrease in color tone, etc.), melting, etc. as much as possible.
  • the temperature of the hot air blown into the spray dryer can be appropriately selected in the range of 100 to 300 ° C.
  • the amount of hot air in the dryer can be appropriately set according to, for example, the size of the dryer.
  • the step (f) may include a step of further drying the obtained P3HA (P3HA powder or the like) (for example, a step of subjecting to vacuum drying). ..
  • the present production method may include other steps (for example, a step of adding various additives to a P3HA aqueous suspension).
  • the P3HA powder according to the embodiment of the present invention has a weight average molecular weight of 100,000 to 600,000, a residual protein amount of 2000 ppm or less, and a particle surface. It is non-porous and has a weight average molecular weight retention rate of 50% or more represented by the following formula (1).
  • Weight average molecular weight retention rate (%) (Weight average molecular weight of P3HA after heating at 160 ° C for 20 minutes / Weight average molecular weight of P3HA before heating at 160 ° C for 20 minutes) ⁇ 100 ...
  • This P3HA powder is extremely useful in various fields because it does not generate foreign matter during processing, has excellent productivity, and has high thermal stability.
  • the P3HA powder is produced by the above-mentioned production method.
  • the present P3HA powder can be produced, for example, by a method for producing P3HA including the step (a), a method for producing P3HA including the steps (a) to (c), and the like. .. Regarding P3HA, except for the matters specified in this section, [2. The description in the [Method for producing P3HA] section is incorporated.
  • the weight average molecular weight of the P3HA powder is 100,000 to 700,000, preferably 100,000 to 600,000, more preferably 100,000 to 500,000, still more preferably 100,000 to 400,000, and particularly preferably. Is 100,000 to 300,000, most preferably 100,000 to 250,000.
  • the weight average molecular weight of the P3HA powder is 700,000 or less (particularly, 600,000 or less)
  • the injection moldability and mechanical properties of the molded product can be improved by the effect of the nucleating agent when used during thermal processing.
  • a P3HA powder having a low molecular weight is preferable because it has a more excellent nuclear agent effect.
  • the weight average molecular weight of this P3HA powder is expressed as "final molecular weight" in the examples.
  • the weight average molecular weight of the P3HA powder is measured by the method described in Examples ( ⁇ Final Molecular Weight>).
  • the ratio (Mw / Mn) of the weight average molecular weight (final molecular weight) (Mw) to the number average molecular weight (Mn) of this P3HA powder is not particularly limited, but is 1.0 from the viewpoint of excellent molecular weight dispersibility. ⁇ 3.1 is preferable, 1.2 to 3.0 is more preferable, and 1.4 to 2.9 is even more preferable.
  • the Mw / Mn of this P3HA powder is measured by the method described in Examples.
  • the number average molecular weight (Mn) is a value used for evaluating the ratio (dispersity) to the weight average molecular weight (final molecular weight) (Mw), and is a value that increases or decreases substantially in proportion to Mw.
  • the Mw / Mn of the P3HA powder is 1.0 to 3.1 means that there is little variation in the molecular weight, in other words, the molecular weight of the P3HA powder is monodisperse. According to this production method, P3HA powder having Mw / Mn of 1.0 to 3.1 can be obtained.
  • the surface of the P3HA particles in the P3HA powder is non-porous.
  • the dispersibility is good, so that the particles do not become agglomerated and the alkali used in the manufacturing process does not remain inside the agglomerates.
  • the residual alkali does not serve as a hydrolysis catalyst during thermal processing, and the thermal stability is improved. Whether or not the surface of the P3HA particles is non-porous is measured by the method described in Examples.
  • the P3HA powder has a weight average molecular weight retention rate represented by the formula (1) of 60% or more, preferably 63% or more, more preferably 65% or more, and particularly preferably 68% or more.
  • the weight average molecular weight retention rate represented by the formula (1) is preferably as high as possible from the viewpoint of preventing deterioration of the P3HA powder during heating (during thermal processing), but if it is 50% or more, it is at least during heating (heat). It can prevent severe deterioration (during processing).
  • the higher the weight average molecular weight retention rate represented by the formula (1), the better, and the upper limit is not particularly limited, but for example, it is 90%, preferably 95%, more preferably 98% or less, and 100%. Most preferred.
  • the weight average molecular weight retention rate represented by the formula (1) is measured by the method described in Examples. When the particle surface of P3HA is porous, the weight average molecular weight retention rate represented by the above formula (1) tends to be low.
  • the amount of residual protein in the P3HA powder is 2000 ppm or less, preferably 1900 ppm or less, and more preferably 1800 ppm or less.
  • the amount of residual protein in the P3HA powder can serve as an indicator of the amount of various components in the P3HA powder that are produced or not removed during the manufacturing process.
  • the amount of residual protein of the P3HA is 2000 ppm or less, impurities are unlikely to affect the physical properties of the P3HA powder, and foreign matter is not generated during processing, so that a quality-stable P3HA powder can be provided.
  • the smaller the amount of residual protein in the P3HA, the better, and the lower limit thereof is not particularly limited, but for example, it may be 200 ppm or more, preferably 100 ppm or more, more preferably 50 ppm or more, or 0 ppm.
  • the amount of residual protein in this P3HA powder is measured by the method described in Examples.
  • the bulk density of the P3HA powder is not particularly limited, but is preferably 0.20 g / mL or more, more preferably 0.25 g / mL or more, and 0.30 g / mL from the viewpoint of achieving excellent fluidity. The above is more preferable.
  • the upper limit of the bulk density of the P3HA powder is not particularly limited, but may be, for example, 0.50 mg / mL or less.
  • the bulk density of this P3HA powder is measured by the following method.
  • the measurement is performed using a device in which a damper (for example, a metal plate) is attached to the device.
  • a damper for example, a metal plate
  • the median particle size (average particle size) of the P3HA powder is not particularly limited, but is preferably 60 to 1000 ⁇ m, more preferably 100 to 500 ⁇ m from the viewpoint of dust explosion prevention and powder fluidity.
  • the median particle size of the P3HA powder is measured using a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring device LA-950 (HORIBA). Specifically, 0.05 g of sodium dodecyl sulfate, which is a surfactant, is added to 20 ml of ion-exchanged water as a dispersant to obtain an aqueous surfactant solution. Next, 0.2 g of P3HA powder is added to the aqueous surfactant solution and dispersed to obtain a P3HA dispersion liquid. Then, the P3HA dispersion liquid is introduced into the laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring device LA-950 manufactured by HORIBA, and the median particle size of the P3HA powder is measured.
  • one embodiment of the present invention is as follows.
  • ⁇ 1> A method for producing a poly (3-hydroxy alkanoate) having a weight average molecular weight of 100,000 to 700,000.
  • An enzyme is added to the culture broth obtained in the step (a) to enzymatically treat the cells, and
  • an alkaline aqueous solution is added to the culture broth obtained in the step (b). Then, the step of adjusting the pH to 10.0 to 12.0,
  • a method for producing a poly (3-hydroxy alkanoate) which comprises.
  • ⁇ 2> The poly (3-hydroxyalkano) according to ⁇ 1>, wherein the enzyme treatment in the step (b) includes performing an alkaline proteolytic enzyme treatment, a bacteriolytic enzyme treatment, and an alkaline proteolytic enzyme treatment in this order.
  • manufacturing method ⁇ 3> Between the steps (a) and (b), (a') a step of adjusting the pH of the culture solution obtained in the step (a) to 6.0 to 8.0.
  • the enzyme treatment in the step (b) comprises performing a lytic enzyme treatment and an alkaline proteolytic enzyme treatment in this order.
  • ⁇ 4> The method for producing a poly (3-hydroxyalkanoate) according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the enzyme in the step (b) is lysozyme and alcalase.
  • ⁇ 5> After the step (c), (c') a step of adding a surfactant to the culture solution obtained in the step (c).
  • the method for producing a poly (3-hydroxyalkanoate) according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4> which comprises.
  • ⁇ 6> The method for producing a poly (3-hydroxyalkanoate) according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the reaction time in the step (a) is 4 hours to 30 hours.
  • ⁇ 7> The poly (3) according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the poly (3-hydroxy alkanoate) is a poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate). 3-Hydroxy alkanoate) manufacturing method.
  • the weight average molecular weight is 100,000 to 600,000, the residual protein amount is 2000 ppm or less, the particle surface is non-porous, and the weight average molecular weight retention rate represented by the following formula (1) is Poly (3-hydroxy alkanoate) powder which is 50% or more.
  • Weight average molecular weight retention rate (%) (Weight average molecular weight of P3HA after heating at 160 ° C for 20 minutes / Weight average molecular weight of P3HA before heating at 160 ° C for 20 minutes) ⁇ 100 ... (1) ⁇ 9> The poly (3-hydroxyalkanoate) according to ⁇ 8>, wherein the ratio (Mw / Mn) of the weight average molecular weight (Mw) to the number average molecular weight (Mn) is 1.0 to 3.1. powder.
  • P3HB3HH is used as “P3HA”
  • P3HA can be read as “P3HB3HH”.
  • Thermal stability was evaluated as the weight average molecular weight retention of P3HA after heating at 160 ° C. for 20 minutes.
  • the weight average molecular weight of this solution was measured using a GPC system manufactured by Shimadzu Corporation equipped with "Shodex K805L (300 x 8 mm, two concatenated)" (manufactured by Showa Denko KK) using chloroform as a mobile phase.
  • a Shodex K-804 (polystyrene gel) manufactured by Showa Denko KK was used as the molecular weight standard sample.
  • the P3HA powder was preheated at 160 ° C. for 7 minutes and then heated at 160 ° C. for 20 minutes under 5 MPa pressurization to prepare a P3HA resin sheet.
  • the weight average molecular weight of P3HA after heating was measured by the same procedure as described in (Measurement of weight average molecular weight of P3HA before heating) except that 10 mg of the P3HA resin sheet was dissolved in 10 mL of chloroform. did.
  • the initial molecular weight was measured by the following procedure: the inactivated culture containing P3HA was diluted with distilled water, centrifuged and then the supernatant was removed. Ethanol was added to the obtained precipitate (P3HA), dispersed in ethanol, and centrifuged. The supernatant was removed and dried in a vacuum dryer for 1 hour or more, and the precipitate was completely dried to obtain a dried product (P3HA powder). 10 mg of the obtained P3HA powder was dissolved in 10 mL of chloroform, and then the insoluble material was removed by filtration.
  • the yield of P3HA was measured by the following procedure: (A) 2 g each of the culture solution before the molecular weight adjustment and the culture solution after the molecular weight adjustment, which will be described later, were taken, and the solid content concentration was measured using a moisture meter (ML-50 manufactured by A & D Co., Ltd.).
  • ⁇ Amount of remaining protein> The amount of residual protein was measured using a BCA Protein Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • ⁇ SEM> A carbon tape was attached on the SEM sample table, and P3HA powder containing an external additive or P3HA powder as a comparative example was sprinkled on the carbon tape, and then the excess powder was removed with a blower.
  • the pretreatment was performed by coating with a thickness of 20 nm using an osmium plasma coater.
  • the pretreatment of the P3HA powder was carried out using an OPC60A-G osmium plasma coater manufactured by Filgen. SEM observation was performed using S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Fielding.
  • Example 1 (Preparation of cell culture solution) Ralstonia eutropha described in International Publication No. WO2019 / 142717 was cultured by the method described in paragraphs [0041] to [0048] of the same document to obtain a cell culture solution containing cells containing P3HA.
  • composition ratio of the repeating unit of P3HA composition ratio of 3-hydroxybutyrate unit / 3-hydroxyhexanoate unit
  • Alkalase manufactured by Novozymes
  • 30% sodium hydroxide was added at 50 ° C., and the pH was adjusted to 8.5 and maintained for 2 hours.
  • This P3HA aqueous suspension was dried at 60 ° C. for 12 hours or more to obtain P3HA powder.
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 173000, the number average molecular weight (Mn) was 70,000, and the thermal stability was 73% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Corporation), it was confirmed that the surface was non-porous (FIG. 1).
  • Example 2 Until (molecular weight adjustment), a liquid after molecular weight adjustment was obtained by the same method as in Example 1.
  • Enzyme treatment IW (industrial water) was added to the liquid after adjusting the molecular weight (the liquid after adjusting the molecular weight) obtained above to adjust the solid content concentration to 18%. Then, 2.5 L of Alcalase (manufactured by Novozymes), which is an alkaline proteolytic enzyme, was added and kept at 50 ° C. for 2 hours. Next, lysozyme (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a lytic enzyme that decomposes sugar chains (peptidoglycan) in the cell wall, was added and kept at 50 ° C. for 2 hours.
  • Alcalase manufactured by Novozymes
  • lysozyme manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the yield of P3HA was 97%, and the amount of residual protein was 760 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 173000, the number average molecular weight (Mn) was 70,000, and the thermal stability was 70% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was non-porous.
  • Example 3 The composition ratio of the repeating unit of P3HA (composition ratio of 3-hydroxybutyrate unit / 3-hydroxyhexanoate unit) is 96.0 / 4.0 to 92.0 / 8.0 (mol / mol).
  • a P3HA powder was obtained in the same manner as in Example 1 except that the above was used. In addition, various measurements were performed in the same manner as in Example 1.
  • the yield of P3HA was 98%, and the amount of residual protein was 1647 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 158,000, the number average molecular weight (Mn) was 84,000, and the thermal stability was 78% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was non-porous.
  • Example 4 The composition ratio of the repeating unit of P3HA (composition ratio of 3-hydroxybutyrate unit / 3-hydroxyhexanoate unit) is 92.0 / 8.0 to 87.0 / 13.0 (mol / mol).
  • a P3HA powder was obtained in the same manner as in Example 1 except that the above was used. In addition, various measurements were performed in the same manner as in Example 1.
  • the yield of P3HA was 99%, and the amount of residual protein was 1704 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 257,000, the number average molecular weight (Mn) was 91,000, and the thermal stability was 80% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was non-porous.
  • Example 5 Until (inactivation), an inactivated culture solution was obtained in the same manner as in Example 3.
  • Lysozyme (Fujifilm) is an enzyme that decomposes sugar chains (peptidoglycan) in the cell wall after adjusting the solid content concentration to 18% by adding IW (industrial water) to the inactivated culture solution obtained above. Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was kept at 50 ° C. for 2 hours. Then, 2.5 L of alcalase (manufactured by Novozymes), which is a proteolytic enzyme, was added, and then 30% sodium hydroxide was added at 50 ° C., and the pH was adjusted to 8.5 and maintained for 2 hours.
  • IW industrial water
  • the yield of P3HA was 30%, and the amount of residual protein was 796 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 224000, the number average molecular weight (Mn) was 61000, and the thermal stability was 3% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was porous.
  • Example 6 The composition ratio of the repeating unit of P3HA (composition ratio of 3-hydroxybutyrate unit / 3-hydroxyhexanoate unit) is 92.0 / 8.0 to 87.0 / 13.0 (mol / mol).
  • a P3HA powder was obtained in the same manner as in Example 5 except that the above was used. In addition, various measurements were performed in the same manner as in Example 5.
  • the yield of P3HA was 96%, and the amount of residual protein was 1326 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 556,000, the number average molecular weight (Mn) was 287,000, and the thermal stability was 80% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was non-porous.
  • Example 1 (Lysis, concentration) Sodium dodecyl sulfate (SDS, manufactured by Kao Corporation) was added so as to be 0.6 to 1.0 wt% with respect to the enzyme treatment solution obtained above, and the mixture was diluted 2-fold. Then, the pH was adjusted to 8.5 with 30% sodium hydroxide. After that, P3HA particles were obtained by the same method as in Example 1. In addition, various measurements were performed in the same manner as in Example 1.
  • the yield of P3HA was 97%, and the amount of residual protein was 3547 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 216000, the number average molecular weight (Mn) was 86000, and the thermal stability was 63% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was non-porous.
  • Lysozyme (Fujifilm) is an enzyme that decomposes sugar chains (peptidoglycan) in the cell wall after adjusting the solid content concentration to 18% by adding IW (industrial water) to the inactivated culture solution obtained above. Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was kept at 50 ° C. for 2 hours. Then, 2.5 L of alcalase (manufactured by Novozymes), which is a proteolytic enzyme, was added, and then 30% sodium hydroxide was added at 50 ° C., and the pH was adjusted to 8.5 and maintained for 2 hours.
  • IW industrial water
  • the yield of P3HA was 30%, and the amount of residual protein was 796 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 224000, the number average molecular weight (Mn) was 61000, and the thermal stability was 3% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was porous.
  • composition ratio of the repeating unit of P3HA is 96.0 / 4.0 to 92.0 / 8.0 (mol / mol).
  • a P3HA powder was obtained in the same manner as in Comparative Example 2 except that the above was used. In addition, various measurements were performed in the same manner as in Example 1.
  • the yield of P3HA was 85%, and the amount of residual protein was 1263 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 287,000, the number average molecular weight (Mn) was 68,000, and the thermal stability was 71% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was porous.
  • composition ratio of the repeating unit of P3HA is 92.0 / 8.0 to 87.0 / 13.0 (mol / mol).
  • a P3HA powder was obtained in the same manner as in Comparative Example 2 except that the above was used. In addition, various measurements were performed in the same manner as in Example 1.
  • the yield of P3HA was 80%, and the amount of residual protein was 1806 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 250,000, the number average molecular weight (Mn) was 78,000, and the thermal stability was 57% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was porous.
  • the yield of P3HA was 94%, and the amount of residual protein was 1214 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 652000, the number average molecular weight (Mn) was 336000, and the thermal stability was 78% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was non-porous.
  • the yield of P3HA was 88%, and the amount of residual protein was 1050 ppm (Table 1).
  • the final molecular weight (Mw) of the obtained P3HA powder was 603000, the number average molecular weight (Mn) was 322000, and the thermal stability was 80% (Table 1). Furthermore, when the state of the P3HA powder surface was observed using an electron microscope (SEM, S-4800 manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.), it was confirmed that the surface was non-porous.
  • Table 1 shows the physical properties measured in Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 to 6, and FIG. 3 shows the operations performed in Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 to 6 and their order.
  • P3HA with reduced impurities can be produced in high yield.
  • P3HA with reduced impurities (particularly residual protein) obtained by the production method of the present invention can be used in agriculture, fisheries, forestry, horticulture, medicine, hygiene, clothing, non-clothing, packaging, automobiles, building materials, and others. It can be suitably used in the field.

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Abstract

Ｐ３ＨＡを含む菌体から、高収率で、かつ、不純物（とりわけ、残タンパク質）が低減したＰ３ＨＡを提供することを課題とする。（ａ）Ｐ３ＨＡを含有する菌体を含む培養液のｐＨを８．０～１２．０に調整する工程、（ｂ）前記培養液に酵素を添加して、酵素処理する工程、および（ｃ）前記培養液のｐＨを１０．０～１２．０に再度調整する工程、を含む、重量平均分子量が１０万～７０万のＰ３ＨＡの製造方法により、上記課題を解決する。

Description

ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法
　本発明は、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法に関する。
　近年、廃棄プラスチックによる環境問題がクローズアップされている。中でも、廃棄プラスチックによる海洋汚染は深刻であり、自然環境下で分解する生分解性プラスチックの普及が期待されている。
　そのような生分解性プラスチックとしては、種々のものが知られているが、中でもポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）（以下、「Ｐ３ＨＡ」と称する場合がある。）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー貯蔵物質として生産、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、土中だけでなく、海水中でも生分解が進行しうる材料であるため、上記の問題を解決する素材として注目されている。
　Ｐ３ＨＡを製造する方法として、例えば、特許文献１には、Ｐ３ＨＡを含む菌体を酵素処理した後に、アルカリ水溶液で処理する方法が記載されている。また、特許文献２には、Ｐ３ＨＡを含む菌体をアルカリ水溶液で処理する方法が記載されている。
日本国公開特許公報２０１２－１１５１４５号 中国特許出願公開第１１１０１９１０８号明細書
　しかし、従来の技術は優れたものであったが、なお、改善の余地があった。
　そこで、本発明の目的は、Ｐ３ＨＡを含む菌体から、高収率で、かつ、不純物（とりわけ、残タンパク質）が低減したＰ３ＨＡを製造する方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｐ３ＨＡを含む菌体の粉砕前（酵素処理前）および粉砕後（酵素処理後）に当該菌体をアルカリ処理して、Ｐ３ＨＡの分子量調整を行うことにより、高収率で、かつ、不純物（とりわけ、残タンパク質）が低減したＰ３ＨＡが得られることを初めて見出し本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明の一態様は、重量平均分子量が１０万～７０万であるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法であり、（ａ）ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を含有する菌体を含む培養液にアルカリ水溶液を添加して、ｐＨを８．０～１２．０に調整する工程、（ｂ）前記工程（ａ）で得られた培養液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程、および（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた培養液にアルカリ水溶液を添加して、ｐＨを１０．０～１２．０に調整する工程、を含む、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法である。
　また、本発明の一態様は、重量平均分子量が１０万～６０万であり、残タンパク質量が２０００ｐｐｍ以下であり、粒子表面が非多孔質であり、かつ、以下の式（１）で示される重量平均分子量保持率が５０％以上である、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）粉体。
重量平均分子量保持率（％）＝（１６０℃で２０分間加熱した後のＰ３ＨＡの重量平均分子量／１６０℃で２０分間加熱する前のＰ３ＨＡの重量平均分子量）×１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
　本発明の一態様によれば、Ｐ３ＨＡを含む菌体から、高収率で、かつ、不純物（とりわけ、残タンパク質）が低減したＰ３ＨＡを製造する方法を提供することができる。
本発明の一実施形態に係る実施例１で製造したＰ３ＨＡ粉体の表面を電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した図である。 比較例２で製造したＰ３ＨＡ粉体の表面を電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した図である。 実施例および比較例で行った各操作およびその順番をまとめた図である。
　本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
　〔１．本発明の概要〕
　本発明の一実施形態に係るポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法（以下、「本製造方法」と称する。）は、重量平均分子量が１０万～７０万であるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法であり、（ａ）ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を含有する菌体を含む培養液にアルカリ水溶液を添加して、ｐＨを８．０～１２．０に調整する工程、（ｂ）前記工程（ａ）で得られた培養液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程、および（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた培養液にアルカリ水溶液を添加して、ｐＨを１０．０～１２．０に調整する工程、を含むことを特徴とする。
　本発明者は、特許文献１に記載の方法でＰ３ＨＡを含む菌体からＰ３ＨＡの製造を試みたところ、Ｐ３ＨＡの収率が落ちるとの問題が生じることを見出した。特に、低分子量のＰ３ＨＡを製造する際に、Ｐ３ＨＡの収率が極めて悪くなることを見出した。また、本発明者は、特許文献２に記載の方法でＰ３ＨＡを含む菌体からＰ３ＨＡの製造を試みたところ、得られたＰ３ＨＡ中に不純物（とりわけ、残タンパク質）が多く含まれることを見出した。このようなＰ３ＨＡを用いて、加工すると、製品中に異物が発生し、品質が悪くなるとの問題を生じる。
　そこで、本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、菌体粉砕前（酵素処理前）および粉砕後（酵素処理後）に菌体をアルカリ処理して、Ｐ３ＨＡの分子量調整を行うことにより、高収率で、かつ、不純物（とりわけ、残タンパク質）が低減したＰ３ＨＡが得られることを初めて見出した。なお、本明細書において、「菌体粉砕後」とは、後述する工程（ｂ）の酵素処理工程の後であればよく、菌体粉砕時も含むことを意図する。
　また、本発明者は、上記の製造方法で得られたＰ３ＨＡが、以下の特性を有することを初めて見出した：
・熱安定性に優れていること。
・分子量分布の観点から、同程度の分子量のＰ３ＨＡを多く含むこと（単分散）。
・低分子量のＰ３ＨＡを製造した場合、得られたＰ３ＨＡ粉体の表面が非多孔質となること。
　上述の通り、高収率で、かつ、不純物（とりわけ、残タンパク質）が低減したＰ３ＨＡを製造する方法についてはこれまでに報告がなく、本発明者が見出した製造方法は極めて有用である。また、従来、複数回のアルカリ処理を行うことによりＰ３ＨＡの分子量が落ちすぎると、目的の物性が出せなくなる虞があったため、Ｐ３ＨＡを製造するに際してアルカリ処理は１回しか行われていなかった。このような状況下、アルカリ処理の回数を複数回とし、Ｐ３ＨＡの高収率と低不純物（低タンパク質）を同時に達成したことは、驚くべきことである。
　なお、本製造方法により、高収率のＰ３ＨＡが得られる要因として、本発明者は以下のように推測している。すなわち、従来の方法（例えば、特許文献１に記載の方法）では、Ｐ３ＨＡが結晶化した後に分子量調整を行っているため、Ｐ３ＨＡの結晶化部分の分子量調整が十分に図れず、その結果、Ｐ３ＨＡの末端部のみが加水分解されて、回収不能な小さな分子が発生する。一方、本製造方法では、菌体粉砕前に分子量調整を行うことにより、アモルファスな状態のＰ３ＨＡがランダムに加水分解される。その結果、回収不能な小さな分子の発生が抑制され、高い収率が達成できる。
　また、本製造方法により、不純物（とりわけ、残タンパク質）が低減したＰ３ＨＡが得られる要因として、本発明者は以下のように推測している。すなわち、従来の方法（例えば、特許文献２）に記載の方法では、菌体破砕後すぐに界面活性剤による洗浄を行っているため、菌体由来の残タンパク質が十分に除去されない。一方、本製造方法では、菌体粉砕後にアルカリ処理を行うことにより、菌体由来のタンパク質等の不純物が分散、溶解されることで、不純物の少ないＰ３ＨＡを製造することができる。
　さらに、上述したような構成によれば、廃棄プラスチックによる海洋汚染を抑制することができ、これにより、例えば、目標１２「持続可能な消費生産形態を確保する」や目標１４「持続可能な開発のために、海・海洋資源を保全し、持続可能な形で利用する」等の持続可能な開発目標（ＳＤＧｓ）の達成に貢献できる。
　〔２．Ｐ３ＨＡの製造方法〕
　本製造方法は、以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、重量平均分子量が１０万～７０万であるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）のＰ３ＨＡの製造方法である。
　本発明の一実施形態において、本製造方法は、以下で示す工程（ａ’）、（ｃ’）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）等を適宜含んでいてもよい。
　なお、本明細書において、「分子量」とは、特記しない限り「重量平均分子量」を意図する。また、本明細書において、「低分子量のＰ３ＨＡ」とは、重量平均分子量が３０万以下のＰ３ＨＡを意図する。本製造方法により製造されるＰ３ＨＡは、低分子量のＰ３ＨＡであることが好ましい。
　＜工程（ａ）＞
　工程（ａ）は、Ｐ３ＨＡを含有する菌体を含む培養液にアルカリ水溶液を添加して（「アルカリ処理」ともいう。）、ｐＨを８．０～１２．０に調整する工程である。すなわち、ｐＨを８．０～１２．０に調整することで、Ｐ３ＨＡを加水分解し、Ｐ３ＨＡの分子量を調整する工程であるともいえる。当該工程によれば、Ｐ３ＨＡを含有する菌体において、菌体中で（換言すると、当該Ｐ３ＨＡが結晶化していない（アモルファスな）状態で）、当該Ｐ３ＨＡの分子量を調整することができる。工程（ａ）は、Ｐ３ＨＡを含有する菌体を含む培養液を、ｐＨが８．０～１２．０の状態に一定時間維持する工程であるとも言える。また、工程(ａ)は、分子量調整工程であるとも言える。
　（Ｐ３ＨＡ）
　本明細書において、「Ｐ３ＨＡ」とは、以下の式（２）：
　［－Ｏ－ＣＨＲ－ＣＨ２－ＣＯ－］　　　　　（２）
　（式中、Ｒは、ＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基であり、ｎは、１～１５の整数である。）で示される１種以上の単位からなる共重合体の総称を意図する。
　Ｐ３ＨＡは、上記の式（２）に含まれるものであれば特に限定されない。
　本発明の一実施形態において、Ｐ３ＨＡは、３－ヒドロキシブチレートのみを繰り返し単位とするポリ（３－ヒドロキシブチレート）であってもよいし、３－ヒドロキシブチレートと他のヒドロキシアルカノエートとの共重合体であってもよい。
　本発明の一実施形態において、Ｐ３ＨＡは、単独重合体と１種または２種以上の共重合体との混合物であってもよいし、２種以上の共重合体の混合物であってもよい。共重合の形式は特に限定されず、ランダム共重合、交互共重合、ブロック共重合、グラフト共重合等であり得る。
　本発明の一実施形態において、Ｐ３ＨＡとしては、例えば、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシプロピオネート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＰ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＨ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバリレート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＯ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタデカノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＯＤ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシデカノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＤ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバリレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ）等が挙げられる。融点を低く調節でき、加工幅を広くできる観点から、好ましくは、Ｐ３ＨＢ３ＨＨ、Ｐ３ＨＢ４ＨＢ、Ｐ３ＨＢ３ＨＰである。中でも、工業的に生産が容易であることから、Ｐ３ＨＢ、Ｐ３ＨＢ３ＨＶが好ましく、Ｐ３ＨＢ３ＨＨ、Ｐ３ＨＢ４ＨＢが特に好ましい。
　本発明の一実施形態において、Ｐ３ＨＡの共重合成分の組成比は、（３－ヒドロキシブチレート）／（３－ヒドロキシヘキサノエート）＝９９．９／０．１～８０．０／２０．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であることが好ましく、９９．９／０．１～８３．０／１７．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であることがより好ましく、９９．９／０．１～８５．０／１５．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であることがさらに好ましい。Ｐ３ＨＡの共重合成分の組成比が上記範囲内であれば、加工性に優れたＰ３ＨＡを提供し得る。
　本発明の一実施形態において、分子量調整前（すなわち、アルカリ水溶液の添加前）のＰ３ＨＡの重量平均分子量（以下、「初期分子量」とも称する。）は、特に限定されないが、例えば、３００万以下であり、２８０万以下であることが好ましく、２５０万以下であることがより好ましい。Ｐ３ＨＡの初期分子量が３００万以下であれば、分子量調整が比較的短時間で行え、生産性に優れるという利点を有する。Ｐ３ＨＡの初期分子量の下限は特に限定されないが、例えば、４０万以上であり得る。Ｐ３ＨＡの初期分子量は、実施例に記載の方法により測定される。
　（Ｐ３ＨＡを含有する菌体）
　本明細書において、「Ｐ３ＨＡを含有する菌体」とは、Ｐ３ＨＡを生産する微生物を意図する。すなわち、本発明の一実施形態において、Ｐ３ＨＡは、微生物により産生される。本製造方法において用いられる微生物は、細胞内にＰ３ＨＡを生成し得る微生物である限り、特に限定されない。例えば、天然から単離された微生物や菌株の寄託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、またはそれらから調製し得る変異体や形質転換体等を使用できる。より詳しくは、例えば、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の菌等が挙げられる。中でも、アエロモナス属、アルカリゲネス属、ラルストニア属、またはカプリアビダス属に属する微生物が好ましい。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ.ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ.ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ.ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ.ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃ.ｎｅｃａｔｏｒ）等の菌株がより好ましく、カプリアビダス・ネカトールが最も好ましい。
　また、微生物が、本来Ｐ３ＨＡの生産能力を有しないものである場合、またはＰ３ＨＡの生産量が低いものである場合には、当該微生物に目的とするＰ３ＨＡの合成酵素遺伝子および／またはその変異体を導入して得られる形質転換体を用いることもできる。このような形質転換体の作製に用いるＰ３ＨＡの合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、アエロモナス・キャビエ由来のＰ３ＨＡ合成酵素の遺伝子が好ましい。これらの微生物を適切な条件で培養することで、菌体内にＰ３ＨＡを蓄積した微生物菌体を得ることができる。当該微生物菌体の培養方法は特に限定されないが、例えば、特開平０５－９３０４９号公報等に記載された方法が用いられる。
　工程（ａ）において、Ｐ３ＨＡを含有する菌体は、不活化されていることが好ましい。不活化の方法は特に限定されないが、例えば、Ｐ３ＨＡを含有する菌体を含む培養液を、７０℃～８０℃で８時間、加熱および攪拌処理する方法が挙げられる。
　（アルカリ水溶液）
　本発明の一実施形態において、アルカリ水溶液は、塩基性化合物を含む水溶液である。アルカリ水溶液に含まれる塩基性化合物としては、特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の金属炭酸塩；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム等の金属リン酸塩または金属リン酸水素塩等が挙げられる。
　本発明の一実施形態において、アルカリ水溶液に含まれる塩基性化合物は、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基性化合物は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　工程（ａ）において、アルカリ水溶液を添加することにより、ｐＨを８．０～１２．０に調整することが好ましく、ｐＨを８．２～１１．５に調整することがより好ましく、８．４～１１．５に調整することがさらに好ましい。ｐＨを８．０以上に調整し、かつｐＨを一定値（ｐＨ８．０～１２．０の一定値）に維持することで、菌体中のＰ３ＨＡの分子量を好適に調整することができる。また、ｐＨを１２．０以下に調整することで、意図しない菌体の損傷を防ぐことができる。　工程（ａ）における反応時間（換言すると、ｐＨを８．０～１２．０に調整して維持する時間）は、例えば、４時間～３０時間であり、８時間～２０時間が好ましい。工程（ａ）における反応時間が前記の範囲内であれば、菌体中のＰ３ＨＡの分子量を、好適な範囲に調整することができるとともに、Ｐ３ＨＡの過度の低分子量化を防ぐことができる。
　工程（ａ）における温度は、１００℃未満であることが好ましく、８０℃未満であることがより好ましい。下限は特に限定されないが、例えば、５０℃以上であることが好ましい。
　本製造方法において、Ｐ３ＨＡの収率は、以下の式（３）および（４）に基づき算出される：
　Ｐ３ＨＡ含量（ｇ／ｇ）＝（乾燥物の重量（ｇ）／培養液の重量（ｇ））・・・（３）
　Ｐ３ＨＡの収率（％）＝（分子量調整後の培養液のＰ３ＨＡ含量／分子量調整前の培養液のＰ３ＨＡ含量）×１００×（分子量調整前の培養液の固形分濃度（％）／分子量調整後の培養液の固形分濃度（％））　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（４）
　上記式（３）および（４）中の各種パラメータは、実施例に記載の方法により測定される。
　本製造方法は、分子量調整工程（アルカリ処理工程）を少なくとも２回含む。式（４）中の「分子量調整前の培養液のＰ３ＨＡ含量」は、最初の分子量調整が行われる前の培養液のＰ３ＨＡ含量を意図し、「分子量調整後の培養液のＰ３ＨＡ含量」は、最後の分子量調整が行われた後の培養液のＰ３ＨＡ含量を意図する。なお、本明細書において、「分子量調整前の培養液のＰ３ＨＡ含量」および「分子量調整後の培養液のＰ３ＨＡ含量」は、実施例に記載の方法により測定した値である。
　本発明の一実施形態において、前記Ｐ３ＨＡの収率は、９５％以上であり、生産性の観点から、９５．３％以上であることが好ましく、９５．５％以上であることがより好ましい。上前記Ｐ３ＨＡの収率は高いほどよく、上限は特に限定されないが、例えば９９％であり、好ましくは９９．５％であり、１００％が最も好ましい。
　＜工程（ｂ）＞
　工程（ｂ）は、前記工程（ａ）で得られた培養液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程である。当該工程によれば、前記菌体由来の不純物（細胞壁、タンパク質等）を破壊および除去することで、前記菌体からＰ３ＨＡを効率的に回収できる。
　本発明の一実施形態において、工程（ｂ）の酵素処理は、アルカリ性タンパク質分解酵素処理および／または溶菌酵素処理であり得る。アルカリ性タンパク質分解酵素処理および溶菌酵素処理は、少なくとも１回ずつ行うことが好ましく、必要に応じて、アルカリ性タンパク質分解酵素処理および／または溶菌酵素処理を、２回以上行ってもよい。
　本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素処理および／または溶菌酵素処理を行う順序は特に限定されない。
　本発明の一実施形態において、工程（ｂ）の酵素処理は、アルカリ性タンパク質分解酵素処理、溶菌酵素処理、およびアルカリ性タンパク質分解酵素処理がこの順で行われることが好ましい。工程（ｂ）の酵素処理が上記の順で行われることにより、本製造方法は、培養液のｐＨ調整のために硫酸等を使用する必要がなくなる。すなわち、装置腐食性液体である硫酸等を使用せずに、Ｐ３ＨＡを製造できる。上記の順が好ましい理由として、本発明者は、最初のアルカリ性タンパク質分解酵素処理により、培養液中のｐＨが中性付近まで下がる結果、ｐＨ調整のために硫酸等を添加する必要がなくなるからであると、推測している。
　工程（ｂ）において、酵素処理（例えば、アルカリ性タンパク質分解酵素処理および溶菌酵素処理）を行う際には、使用する酵素の至適ｐＨおよび至適温度に合わせて前記培養液のｐＨおよび温度を調整することが好ましい。前記培養液のｐＨおよび温度の調整方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
　（アルカリ性タンパク質分解酵素処理）
　本明細書において、「アルカリ性タンパク質分解酵素」とは、アルカリ環境下（例えばｐＨ８．５の溶液中）でタンパク質を分解する活性を有するタンパク質分解酵素を意図する。
　また、本明細書において、「アルカリ性タンパク質分解酵素処理」とは、前記アルカリ性タンパク質分解酵素を前記培養液に添加し、菌体を酵素処理する工程を意図する。
　本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素は、アルカリ環境下でタンパク質を分解する活性を有する限り特に限定されず、例えば、セリン特異的タンパク質分解酵素（例えば、サブチリシン、キモトリプシン、トリプシン）、システイン特異的タンパク質分解酵素（例えばパパイン、プロメライン、カテプシン）、アスパラギン酸特異的タンパク質分解酵素（例えば、ペプシン、カテプシンＤ、ＨＩＶプロテアーゼ）等が挙げられる。経済的に有利であるとの観点から、セリン特異的タンパク質分解酵素、とりわけ、サブチリシン（例えば、アルカラーゼ）が好ましい。これらの１種類を単独で使用してもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　アルカリ性タンパク質分解酵素としては、市販品を用いることもでき、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製「アルカラーゼ２．５Ｌ」；天野エンザイム株式会社社製「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」および「プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ」；ダニスコジャパン株式会社製「マルチフェクトＰＲ６Ｌ」および「オプチマーゼＰＲ８９Ｌ」；新日本化学工業株式会社製「スミチームＭＰ」；ディー・エス・エムジャパン株式会社製「デルボラーゼ」；ナガセケムテックス株式会社製「ビオプラーゼＯＰ」、「ビオプラーゼＳＰ－２０ＦＧ」および「ビオプラーゼＳＰ－４ＦＧ」；ＨＢＩ株式会社製「オリエンターゼ２２ＢＦ」；ヤクルト薬品工業株式会社製「アロアーゼＸＡ－１０」等が挙げられる。
　本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素の至適ｐＨは、当該アルカリ性タンパク質分解酵素がアルカリ環境下で活性を有する限り特に限定されないが、例えば８．０～１４．０であり、好ましくは８．０～１２．０であり、より好ましくは８．０～１０．０であり、さらに好ましくは８．０～９．０であり、最も好ましくは８．５である。
　本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素の至適温度は、特に限定されないが、過度の加温を必要とせず、Ｐ３ＨＡの熱変化（熱分解）を防ぐことができるとの観点から、６０℃以下が好ましく、５０℃以下がさらに好ましい。至適温度の下限は、特に限定されないが、過度の冷却操作が必要なく、経済的であるとの観点から、室温（例えば、２５℃）以上であることが好ましい。
　（溶菌酵素処理）
　本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素処理とは、溶菌酵素を前記培養液に添加し、前記菌体を酵素処理する工程である。
　本明細書において、「溶菌酵素」とは、菌体の細胞壁（例えば、ペプチドグリカン）を分解する（溶菌する）活性を有する酵素を意図する。
　本発明の一実施形態において、溶菌酵素は特に限定されず、例えば、リゾチーム、ラビアー、β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、エンドリシン、オートリシン等が挙げられる。経済的に有利であるとの観点から、リゾチームが好ましい。これらの１種類を単独で使用してもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　溶菌酵素としては、市販品を用いることもでき、例えば、富士フイルム和光純薬株式会社製「リゾチーム」、「アクロモペプチダーゼ」等が挙げられる。
　本発明の一実施形態において、溶菌酵素の至適ｐＨは、当該溶菌酵素が細胞壁分解活性を有する限り特に限定されないが、例えば、５．０～１１．０であり、好ましくは６．０～９．０であり、より好ましくは６．０～８．０である。
　本発明の一実施形態において、溶菌酵素の至適温度は特に限定されないが、過度の加温を必要とせず、Ｐ３ＨＡの熱変化（熱分解）を防ぐことができるとの観点から、６０℃以下が好ましく、５０℃以下がさらに好ましい。至適温度の下限は特に限定されないが、過度の冷却操作が必要なく、経済的であるとの観点から、室温（例えば２５℃）以上であることが好ましい。
　本発明の一実施形態において、工程（ｂ）の酵素処理は、リゾチームおよびアルカラーゼの組み合わせにより行われ得る。
　工程（ｂ）における酵素処理時間は、酵素の種類、ｐＨ、温度等の条件により変わり得るが、例えば、１時間～８時間であり、２時間～６時間が好ましい。
　＜工程（ａ’）＞
　本製造方法は、工程（ａ）と（ｂ）との間に、さらに工程（ａ’）を含み得る。
　工程（ａ’）は、前記工程（ａ）で得られた培養液のｐＨを６．０～８．０に調整する工程であり、前記工程（ｂ）における酵素処理が、溶菌酵素処理、およびアルカリ性タンパク質分解酵素処理をこの順で行うことを含む。当該工程（ａ’）を実施することにより、工程（ｂ）の酵素処理が滞りなく進む。
　工程（ａ’）において、ｐＨの調整方法は、特に限定されず、例えば、培養液に酸を添加する方法等が挙げられる。酸は、特に限定されず、有機酸、無機酸のいずれでもよく、揮発性の有無は問わない。より具体的には、酸としては、例えば、硫酸、塩酸、リン酸、酢酸等が使用できる。
　工程（ａ’）の後に実施される、溶菌酵素処理およびアルカリ性タンパク質分解酵素処理については、＜工程（ｂ）＞の項の記載が援用される。
　＜工程（ｃ）＞
　工程（ｃ）は、前記工程（ｂ）で得られた培養液にアルカリ水溶液を添加して、ｐＨを１０．０～１２．０に調整する工程である。当該工程によれば、Ｐ３ＨＡの分子量をさらに小さく調整し得るとともに、菌体を破砕する際に、菌体由来の不純物（核酸、タンパク質等）を分散および溶解することで、高純度のＰ３ＨＡを菌体から分離することができる。工程（ｃ）は、アルカリ洗浄工程とも言える。
　工程（ｃ）で添加するアルカリ水溶液については、＜工程（ａ）＞の項の記載が援用される。
　工程（ｃ）において、アルカリ水溶液を添加することにより、ｐＨを１０．０～１２．０に調整することが好ましく、１０．２～１１．８に調整することがより好ましく、１０．４～１１．６に調整することがさらに好ましい。ｐＨを１０．０以上に調整することで、菌体中のＰ３ＨＡをさらに低分子量に調整することができる。また、ｐＨを１２．０以下に調整することで、Ｐ３ＨＡの過度の低分子量化を防ぐことができる。
　工程（ｃ）における反応時間（換言すると、ｐＨを１０．０～１２．０に調整して維持する時間）は、例えば、１時間～１２時間であり、１時間～６時間が好ましい。工程（ｃ）における反応時間が前記の範囲内であれば、菌体中のＰ３ＨＡの分子量を、好適な範囲に調整することができるとともに、Ｐ３ＨＡの過度の低分子量化を防ぐことができる。
　＜工程（ｃ’）＞
　本製造方法は、工程（ｃ）の後に、さらに工程（ｃ’）を含み得る。工程（ｃ’）は界面活性剤処理工程であるとも言える。
　工程（ｃ’）は、前記工程（ｃ）で得られた培養液に界面活性剤を添加する工程である。当該工程によると、前記菌体に含まれる不純物、特に細胞膜を効率的に処理することができ、菌体由来の不純物をより多く除去できるため、より高純度のＰ３ＨＡを菌体から分離することができる。
　本発明の一実施形態において、界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤等が挙げられる。このうち、細胞膜の除去能力が高いとの観点から、陰イオン界面活性が好ましい。これらの１種類を単独で使用してもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　陰イオン界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルケニル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルケニルエーテル硫酸エステル塩、α－オレフィンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、α－スルホ脂肪酸塩のエステル、アルキルエーテルカルボン酸塩、アルケニルエーテルカルボン酸塩、アミノ酸型界面活性剤、Ｎ－アシルアミノ酸型界面活性剤等が挙げられる。この中でも、アルキル硫酸エステル塩が好ましく、細胞膜の除去能力が高く、安価であるとの観点から、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が特に好ましい。これらの１種類を単独で使用してもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　工程（ｃ’）において、添加する界面活性剤の量は特に限定されず、前記培養液に対して、例えば、０．１～５．０重量％であり、０．３～２．５重量％が好ましい。
　本発明の別の一実施形態において、前記工程（ｃ）の前に、または前記工程（ｃ）と同時に、工程（ｃ’）を行ってもよい。すなわち、前記培養液にアルカリ水溶液を添加する前に、またはアルカリ水溶液の添加と同時に、前記界面活性剤を添加してもよい。また、前記界面活性剤の添加は、前記工程（ａ）の前に、または前記工程（ａ）と同時に行うこともできる。
　＜工程（ｄ）＞
　本発明の一実施形態において、本製造方法は、工程（ｄ）をさらに含み得る。
　工程（ｄ）は、前記工程（ｃ）において得られた培養液を遠心分離し、上清を除去して、Ｐ３ＨＡが濃縮されたＰ３ＨＡ水性懸濁液を得る工程である。すなわち、菌体から分離したＰ３ＨＡから不純物を除去し、濃縮および精製する工程である。工程（ｄ）は遠心分離工程であるとも言える。
　工程（ｄ）において、前記培養液を遠心分離する方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
　工程（ｄ）において、前記培養液を遠心分離し、上清を除去した後、沈降物に溶液を添加し、再度遠心分離および上清を除去する工程を繰り返し行うことが好ましい。この操作により、より濃縮および精製されたＰ３ＨＡ水性懸濁液を得ることができる。ここで、上清を除去した後に添加する溶液は、前記培養液と同じｐＨに調整されたアルカリ水溶液であることが好ましい。本発明の一実施形態において、前記溶液は、前記工程（ｃ）において使用したアルカリ水溶液と同じであることが好ましい。
　工程（ｄ）により、最終製品に残留する不純物量が概ね決定されるため、これらの不純物は、できる限り低減させた方が好ましい。当然に、用途によっては、最終製品の物性を損なわない限り不純物が混入しても構わないが、医療用用途等、高純度のＰ３ＨＡが必要とされる場合は、できる限り不純物を低減させることが好ましい。その際の精製度の指標としては、例えば、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液中のタンパク質量が挙げられる。Ｐ３ＨＡ水性懸濁液中のタンパク質量は、後述するＰ３ＨＡ粉体の残タンパク質量を達成できる量であれば、特に限定されない。当該タンパク質量は、好ましくは、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液中のＰ３ＨＡ重量当たり３０００ｐｐｍ以下、より好ましくは、２５００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは、２０００ｐｐｍ以下である。
　工程（ｄ）において、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液を構成する溶媒（「溶媒」は、「水性媒体」とも称する。）は、特に限定されず、水、または水と有機溶媒との混合溶媒であってもよい。また、当該混合溶媒において、有機溶媒の濃度は、使用する有機溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されない。また、有機溶媒は特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール等のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、アセトアミド等のアミド類；ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピペリジン等が挙げられる。中でも、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリル等が、除去しやすい点から好ましい。また、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、ブタノール、アセトン等が、入手容易であることからより好ましい。さらに、メタノール、エタノール、アセトンが、特に好ましい。
　Ｐ３ＨＡ水性懸濁液を構成する水性媒体中の水の含有量は、５重量％以上が好ましく、より好ましくは、１０重量％以上であり、さらに好ましくは、３０重量％以上であり、特に好ましくは、５０重量％以上である。
　なお、工程（ｄ）におけるＰ３ＨＡ水性懸濁液体は、本発明の本質を損なわない限り、他の溶媒、菌体由来の成分、精製時に発生する化合物等を含んでいても構わない。
　＜工程（ｅ）＞
　本発明の一実施形態において、本製造方法は、工程（ｅ）をさらに含み得る。
　工程（ｅ）は、前記工程（ｄ）において得られたＰ３ＨＡ水性懸濁液に分散剤を添加し、かつ、ｐＨが７以下であるＰ３ＨＡ水性懸濁液を調製する工程である。工程（ｅ）は、ｐＨ調整工程であるとも言える。
　工程（ｅ）は、下記の工程（ｅ１）および工程（ｅ２）を含むことが好ましい。
・工程（ｅ１）：Ｐ３ＨＡ水性懸濁液に分散剤を添加する工程
・工程（ｅ２）：Ｐ３ＨＡ水性懸濁液のｐＨを７以下に調整する工程
　工程（ｅ１）と工程（ｅ２）とを実施する順番は、特に限定されないが、工程（ｅ２）におけるＰ３ＨＡの凝集が抑制され、よりＰ３ＨＡの分散安定性に優れた水性懸濁液が得られる観点で、工程（ｅ１）の後に工程（ｅ２）を実施することが好ましい。
　工程（ｅ）において、添加する分散剤は特に限定されないが、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）系分散剤、アルキレンオキサイド系分散剤、セルロース系分散剤、アルコール系分散剤等があげられる。ポリビニルアルコール系分散剤およびアルキレンオキサイド系分散剤がＰ３ＨＡの懸濁液中での凝集を抑制する効果が高いため好ましく、アルキレンオキサイド系分散剤が、得られるＰ３ＨＡ粉体の加工性が高くなるため、より好ましい。これらの１種類を単独で使用してもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤は、上記の効果を奏する限り特に限定されないが、ポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ）のブロックと、ポリ（プロピレンオキサイド）（ＰＰＯ）のブロックとから構成され、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯの形態であることが好ましい。
　本明細書において、「ポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ）のブロック」とは、アルキレンオキサイド系分散剤の構造中、エチレンオキサイド（ＥＯ）が重合して形成された重合体部分を意図する。
　本明細書において、「ポリ（プロピレンオキサイド）（ＰＰＯ）のブロック」とは、アルキレンオキサイド系分散剤の構造中、プロピレンオキサイド（ＰＯ）が重合して形成された重合体部分を意図する。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＥＯ分子量およびＰＥＯ分子量／ＰＰＯ分子量を特定の範囲とすることにより、水性懸濁液の粘度を低く保ち、高い生産性でＰ３ＨＡを製造することができる。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＥＯ分子量およびＰＥＯ分子量／ＰＰＯ分子量の範囲は、以下の組み合わせであることが好ましい。
　なお、本明細書において、「ＰＥＯ分子量」を「ＥＯ量」と称し、「ＰＰＯ分子量」を「ＰＯ量」と称することもある。
　すなわち、本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＥＯ分子量は、１５００以上であればよく、好ましくは、１７５０以上であり、より好ましくは、２０００以上である。また、本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＥＯ分子量の上限は、例えば、３００００以下であり、好ましくは、２５０００以下であり、より好ましくは、２００００以下である。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＥＯ分子量／ＰＰＯ分子量は、０．５以上であることが好ましく、０．６以上であることがより好ましく、０．７以上であることがさらに好ましい。ＰＥＯ分子量／ＰＰＯ分子量の上限は、５．０以下であることが好ましく、４．８以下であることがより好ましく、４．５以下であることがさらに好ましい。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＥＯ分子量およびＰＥＯ分子量／ＰＰＯ分子量が上記の範囲内であれば、アルキレンオキサイド系分散剤が親水性を有し、かつ、アルキレンオキサイド系分散剤添加重量に対する分子数が多くなるため、水性懸濁液の分散性を保ちやすい。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤は、ＰＥＯ分子量が１５００以上であり、かつ、ＰＥＯ分子量／ＰＰＯ分子量が０．５～５．０である。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤は、分子量が７５０以上であるＰＥＯブロックを、少なくとも１つ以上有することが好ましく、少なくとも２つ以上有することがより好ましい。また、その上限は特に限定されないが、例えば、４以下であり、好ましくは、３以下である。ＰＥＯブロックの数が上記の範囲内であれば、アルキレンオキサイド系分散剤が親水性を有する。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＰＯ分子量は、特に限定されないが、例えば、５００以上であり、好ましくは、１５００以上である。また、本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＰＯ分子量の上限は、例えば、６７００以下であり、好ましくは、６２５０以下である。アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＰＯ分子量が上記の範囲内であれば、アルキレンオキサイド系分散剤が疎水性を有する。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤中のＰＰＯブロックの数は、上記の効果を奏する限り特に限定されず、１つであってもよいし、複数（例えば、２、３、４）であってもよい。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤は、例えば、下記の式（５）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　前記式（５）において、Ｘは、例えば、１７～３４０であり、好ましくは、２０～２８５であり、より好ましくは、２２～２２６である。Ｘが、３４０以下であると、アルキレンオキサイド系分散剤添加重量に対する分子数が多くなるため、水性懸濁液の分散性を保ちやすく、Ｘが、１７以上あると、親水性を有する。Ｙは、例えば、８～１１５であり、好ましくは、１０～１１０であり、より好ましくは、２４～１０７である。Ｙが、１１５以下であると、水への溶解が容易であり、Ｙが、８以上あると、疎水性を有する。Ｚは、例えば、１７～３４０であり、好ましくは、２０～２８５であり、より好ましくは、２２～２２６である。Ｚが、３４０以下であると、アルキレンオキサイド系分散剤添加重量に対する分子数が多くなるため、水性懸濁液の分散性を保ちやすく、Ｚが、１７以上あると、親水性を有する。
　また、前記式（５）において、ＸとＺとの和（以下、「Ｘ＋Ｚ」と称する場合がある。）は、例えば、３４～６８０であり、好ましくは、４０～５７０であり、より好ましくは、４４～４５２である。Ｘ＋Ｚが、６８０以下であると、アルキレンオキサイド系分散剤添加重量に対する分子数が多くなるため、水性懸濁液の分散性を保ちやすく、Ｘが、３４以上あると、親水性を有する。
　本発明の一実施形態において、アルキレンオキサイド系分散剤として、市販品を用いてもよい。アルキレンオキサイド系分散剤の市販品としては、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　１０４００（ＢＡＳＦ社製）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　１０５００（ＢＡＳＦ社製）、Ｇｅｎａｐｏｌ　ＰＦ８０（Ｃｌａｒｉａｎｔ社製）、ユニルーブＤＰ６０－６００Ｂ（日油社製）、ユニルーブＤＰ６０－９５０Ｂ（日油社製）、プロノン２０８（日油社製）、エパンＵ１０５（第一工業製薬社製）、エパンＵ１０８（第一工業製薬社製）、エパン７５０（第一工業製薬社製）等が挙げられる。
　工程（ｅ）において、前記Ｐ３ＨＡ水性懸濁液に対する前記分散剤の添加量は、特に限定されないが、懸濁液に含まれるＰ３ＨＡ１００質量部に対して、０．１～２０質量部が好ましく、０．５～１０質量部がより好ましく、０．７５～５質量部がさらに好ましい。分散剤の添加量を上記の範囲とすることにより、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液におけるＰ３ＨＡの分散安定性がより向上し、Ｐ３ＨＡ粉体を効率的に製造することができる。
　工程（ｅ）において、前記分散剤添加後のＰ３ＨＡ水性懸濁液のｐＨを、Ｐ３ＨＡを加熱溶融した時の着色を低減する、加熱時および／または乾燥時の分子量の安定性を確保する等の観点から、７以下に調整することが好ましく、５以下に調整することがより好ましく、４以下に調製することがさらに好ましい。また容器の耐酸性の観点より、１以上に調製することが好ましく、２以上に調製することがより好ましく、３以上に調製することがさらに好ましい。Ｐ３ＨＡ水性懸濁液のｐＨを７以下とすることによって、Ｐ３ＨＡ粉体を加熱溶融（加工）した際の着色が低減され、加熱時および／または乾燥時の分子量低下を抑制することができる。
　工程（ｅ）において、ｐＨの調整方法は、特に限定されず、例えば、酸を添加する方法等が挙げられる。酸は、特に限定されず、有機酸、無機酸のいずれでもよく、揮発性の有無は問わない。より具体的には、酸としては、例えば、硫酸、塩酸、リン酸、酢酸等が使用できる。
　工程（ｅ）により得られるＰ３ＨＡ水性懸濁液におけるＰ３ＨＡの濃度は、乾燥ユーティリティーの面から経済的に有利であり、生産性が向上するため、３０重量％以上が好ましく、４０重量％以上がより好ましく、５０重量％以上がさらに好ましい。また、Ｐ３ＨＡの濃度の上限は、最密充填となり、十分な流動性が確保できない可能性があるため、６５重量％以下が好ましく、６０重量％以下がより好ましい。Ｐ３ＨＡの濃度を調整する方法は、特に限定されず、水性媒体を添加したり、水性媒体の一部を除去する（例えば、遠心分離した後、上清を取り除く等による）等の方法が挙げられる。Ｐ３ＨＡの濃度の調整は、工程（ｅ）のいずれの段階で実施してもよいし、工程（ｅ）の前の段階で実施してもよい。
　＜工程（ｆ）＞
　本発明の一実施形態において、本製造方法は、工程（ｆ）をさらに含み得る。
　工程（ｆ）は、工程（ｅ）で調製したＰ３ＨＡ水性懸濁液を乾燥する工程である。乾燥の方法としては、例えば、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液を微細な液滴の状態として乾燥機内に供給し、当該乾燥機内で熱風と接触させながら乾燥する方法（噴霧乾燥）、減圧乾燥等が挙げられる。好ましくは、噴霧乾燥が用いられる。工程（ｆ）は、乾燥工程とも言える。
　工程（ｆ）で噴霧乾燥を行う場合、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液を微細な液滴の状態で乾燥機内に供給する方法（アトマイザー）は、特に限定されず、回転ディスクを用いる方法、ノズルを用いる方法等の公知の方法が挙げられる。乾燥機内における液滴と熱風の接触方式は、特に限定されず、並流式、向流式、これらを併用する方式等が挙げられる。
　工程（ｆ）で噴霧乾燥を行う場合の乾燥温度は、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液の液滴から水性媒体の大半を除去できる温度であればよく、目的とする含水率まで乾燥させることができ、かつ、品質悪化（分子量低下、色調低下等）、溶融等を極力生じさせないような条件で、適宜設定できる。例えば、噴霧乾燥機に吹き込む熱風の温度は、１００～３００℃の範囲で、適宜選択できる。また、乾燥機内の熱風の風量についても、例えば、乾燥機のサイズ等に応じて、適宜設定できる。
　工程（ｆ）で噴霧乾燥を行った場合、工程（ｆ）の後に、得られたＰ３ＨＡ（Ｐ３ＨＡ粉体等）をさらに乾燥させる工程（例えば、減圧乾燥に付す工程等）を含んでいてもよい。また、本製造方法は、その他の工程（例えば、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液に各種添加物を添加する工程等）を含んでいてもよい。
　〔３．Ｐ３ＨＡ粉体〕
　本発明の一実施形態に係るＰ３ＨＡ粉体（以下、「本Ｐ３ＨＡ粉体」と称する。）は、重量平均分子量が１０万～６０万であり、残タンパク質量が２０００ｐｐｍ以下であり、粒子表面が非多孔質であり、かつ、以下の式（１）で示される重量平均分子量保持率が５０％以上である。
重量平均分子量保持率（％）＝（１６０℃で２０分間加熱した後のＰ３ＨＡの重量平均分子量／１６０℃で２０分間加熱する前のＰ３ＨＡの重量平均分子量）×１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
　本Ｐ３ＨＡ粉体は、加工時に異物が発生せず、生産性に優れ、かつ、高い熱安定性を有するため、種々の分野において極めて有用である。
　本発明の一実施形態において、本Ｐ３ＨＡ粉体は、上記した本製造方法により製造される。具体的には、本Ｐ３ＨＡ粉体は、例えば、前記（ａ）の工程を含むＰ３ＨＡの製造方法、前記（ａ）～（ｃ）の工程を含むＰ３ＨＡの製造方法等により、製造することができる。Ｐ３ＨＡについて、本項で特記した事項以外については、〔２．Ｐ３ＨＡの製造方法〕項の記載が援用される。
　本Ｐ３ＨＡ粉体の重量平均分子量は、１０万～７０万であり、好ましくは１０万～６０万であり、より好ましくは１０万～５０万あり、さらに好ましくは１０万～４０万あり、特に好ましくは１０万～３０万であり、最も好ましくは１０万～２５万である。本Ｐ３ＨＡ粉体の重量平均分子量が７０万以下（とりわけ、６０万以下）であれば、熱加工時に用いると、核剤効果により成形体の射出成型性および機械特性を向上させることができる。中でも、低分子量のＰ３ＨＡ粉体である場合は、より核剤効果に優れるため好ましい。本Ｐ３ＨＡ粉体の重量平均分子量は、実施例では「最終分子量」と表記される。本Ｐ３ＨＡ粉体の重量平均分子量は、実施例（＜最終分子量＞の項）に記載の方法により測定される。
　本Ｐ３ＨＡ粉体の重量平均分子量（最終分子量）（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、特に限定されないが、分子量の分散性に優れるという観点から、１．０～３．１が好ましく、１．２～３．０がより好ましく、１．４～２．９がさらに好ましい。本Ｐ３ＨＡ粉体のＭｗ／Ｍｎは、実施例に記載の方法により測定される。なお、数平均分子量（Ｍｎ）は重量平均分子量（最終分子量）（Ｍｗ）との比（分散度）の評価に用いる値であり、Ｍｗにほぼ比例して増減する値である。Ｐ３ＨＡ粉体のＭｗ／Ｍｎが１．０～３．１であることは、分子量のばらつきが少ないこと、換言すると、Ｐ３ＨＡ粉体の分子量が単分散であることを意味する。本製造方法によれば、Ｍｗ／Ｍｎが１．０～３．１であるＰ３ＨＡ粉体を得ることができる。
　本Ｐ３ＨＡ粉体は、Ｐ３ＨＡ粉体中のＰ３ＨＡ粒子の表面が非多孔質である。Ｐ３ＨＡ粒子の表面が非多孔質である場合、分散性が良好であるため、粒子が凝集状態とならず、凝集体内部に製造過程で使用したアルカリが残存しない。その結果、熱加工時に残存アルカリが加水分解触媒とならず、熱安定性が良好となる。Ｐ３ＨＡ粒子の表面が非多孔質であるか否かは、実施例に記載の方法により測定される。
　本Ｐ３ＨＡ粉体は、前記式（１）で示される重量平均分子量保持率が、６０％以上であり、好ましくは６３％以上であり、より好ましくは６５％以上であり、特に好ましくは６８％以上である。前記式（１）で示される重量平均分子量保持率は、Ｐ３ＨＡ粉体の加熱時（熱加工時）の劣化を防止する観点から高いほど好ましいが、５０％以上であれば、少なくとも加熱時（熱加工時）の激しい劣化を防止し得る。前記式（１）で示される重量平均分子量保持率は高いほどよく、上限は特に限定されないが、例えば９０％であり、好ましくは９５％であり、より好ましくは９８％以下であり、１００％が最も好ましい。前記式（１）で示される重量平均分子量保持率は、実施例に記載の方法により測定される。なお、Ｐ３ＨＡの粒子表面が多孔質であると、前記式（１）で示される重量平均分子量保持率は、低くなる傾向がある。
　本Ｐ３ＨＡ粉体の残タンパク質量は、２０００ｐｐｍ以下であり、好ましくは１９００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは１８００ｐｐｍ以下である。本Ｐ３ＨＡ粉体の残タンパク質量は、製造の過程で生じるか、または除去されなかった、Ｐ３ＨＡ粉体中の種々の成分の量を示す指標として機能し得る。本Ｐ３ＨＡの残タンパク質量が２０００ｐｐｍ以下であれば、不純物が、Ｐ３ＨＡ粉体の物性に対して影響を与える可能性が低く、加工時に異物が発生しない、品質安定なＰ３ＨＡ粉体を提供し得る。本Ｐ３ＨＡの残タンパク質量は少ないほどよく、その下限は特に限定されないが、例えば２００ｐｐｍ以上であり、好ましくは１００ｐｐｍ以上であり、より好ましくは５０ｐｐｍ以上であり、０ｐｐｍであってもよい。本Ｐ３ＨＡ粉体の残タンパク質量は、実施例に記載の方法により測定される。
　本Ｐ３ＨＡ粉体の嵩密度は、特に限定されないが、優れた流動性が達成されるという観点から、０．２０ｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．２５ｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．３０ｇ／ｍＬ以上がさらに好ましい。本Ｐ３ＨＡ粉体の嵩密度の上限は特に限定されないが、例えば０．５０ｍｇ／ｍＬ以下であり得る。本Ｐ３ＨＡ粉体の嵩密度は、以下の方法で測定される。すなわち、ＪＩＳのＫ－７３６５に記載の方法で、体積１００ｍｌ±０．５ｍｌ、内径４５ｍｍ±５ｍｍの内面を滑らかに仕上げた金属シリンダー（受器）の上部に、下部開口部が２０ｍｍ～３０ｍｍの漏斗にダンパー（例えば、金属製の板）を付けたものがセッティングされた装置を用いて測定を行う。はかりには、０．１ｇの桁まで計ることのできるものを使用する。
　本Ｐ３ＨＡ粉体のメジアン粒子径（平均粒子径）は、特に限定されないが、粉塵爆発防止や粉体流動性の観点から、６０～１０００μｍが好ましく、１００～５００μｍがより好ましい。本Ｐ３ＨＡ粉体のメジアン粒子径は、レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ－９５０（ＨＯＲＩＢＡ社）を用いて測定される。具体的には、イオン交換水２０ｍｌに、分散剤として界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム０．０５ｇを加えて、界面活性剤水溶液を得る。次いで、上記界面活性剤水溶液に、Ｐ３ＨＡ粉体０．２ｇを加えて分散させ、Ｐ３ＨＡ分散液を得る。その後、上記Ｐ３ＨＡ分散液を、ＨＯＲＩＢＡ社製レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ－９５０に導入し、Ｐ３ＨＡ粉体のメジアン粒子径を測定する。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　すなわち、本発明の一実施形態は、以下である。
＜１＞重量平均分子量が１０万～７０万であるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法であり、
　（ａ）ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を含有する菌体を含む培養液にアルカリ水溶液を添加して、ｐＨを８．０～１２．０に調整する工程、
　（ｂ）前記工程（ａ）で得られた培養液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程、および
　（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた培養液にアルカリ水溶液を添加して、ｐＨを１０．０～１２．０に調整する工程、
を含む、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
＜２＞前記工程（ｂ）における酵素処理が、アルカリ性タンパク質分解酵素処理、溶菌酵素処理、およびアルカリ性タンパク質分解酵素処理をこの順で行うことを含む、＜１＞に記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
＜３＞前記工程（ａ）と（ｂ）との間に、さらに
　（ａ’）前記工程（ａ）で得られた培養液のｐＨを６．０～８．０に調整する工程、
を含み、
　前記工程（ｂ）における酵素処理が、溶菌酵素処理、およびアルカリ性タンパク質分解酵素処理をこの順で行うことを含む、＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞前記工程（ｂ）における酵素が、リゾチームおよびアルカラーゼである、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
＜５＞前記工程（ｃ）の後に、さらに
　（ｃ’）前記工程（ｃ）で得られた培養液に界面活性剤を添加する工程、
を含む、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
＜６＞前記工程（ａ）の反応時間が４時間～３０時間である、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
＜７＞前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）が、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）である、＜１＞～＜６＞のいずれか１に記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
＜８＞重量平均分子量が１０万～６０万であり、残タンパク質量が２０００ｐｐｍ以下であり、粒子表面が非多孔質であり、かつ、以下の式（１）で示される重量平均分子量保持率が５０％以上である、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）粉体。
重量平均分子量保持率（％）＝（１６０℃で２０分間加熱した後のＰ３ＨＡの重量平均分子量／１６０℃で２０分間加熱する前のＰ３ＨＡの重量平均分子量）×１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
＜９＞重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０～３．１である、＜８＞に記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）粉体。
　以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、実施例において、「Ｐ３ＨＡ」としては「Ｐ３ＨＢ３ＨＨ」を用いており、「Ｐ３ＨＡ」を「Ｐ３ＨＢ３ＨＨ」と読み替えることができる。
　〔測定および評価方法〕
　実施例および比較例における測定および評価を、以下の方法で行った。
　＜熱安定性＞
　熱安定性は、１６０℃で２０分間加熱した後のＰ３ＨＡの重量平均分子量保持率として評価した。Ｐ３ＨＡの重量平均分子量保持率は、以下の式（１）によって算出した：
　重量平均分子量保持率（％）＝（加熱した後のＰ３ＨＡの重量平均分子量／加熱する前のＰ３ＨＡの重量平均分子量）×１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
　（加熱する前のＰ３ＨＡの重量平均分子量）
　Ｐ３ＨＡ粉体１０ｍｇを、クロロホルム１０ｍＬに溶解させた後、不溶物を濾過により除いた。この溶液（濾液）を、「Ｓｈｏｄｅｘ　Ｋ８０５Ｌ（３００ｘ８ｍｍ、２本連結）」（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用い、クロロホルムを移動相として重量平均分子量を測定した。分子量標準サンプルには、昭和電工（株）製Ｓｈｏｄｅｘ　Ｋ－８０４（ポリスチレンゲル）を用いた。
　（加熱した後のＰ３ＨＡの重量平均分子量）
　Ｐ３ＨＡ粉体を、１６０℃で７分間予熱処理した後、５ＭＰａ加圧下、１６０℃で２０分間加熱し、Ｐ３ＨＡ樹脂シートを作製した。当該Ｐ３ＨＡ樹脂シート１０ｍｇをクロロホルム１０ｍＬに溶解させたこと以外は、（加熱する前のＰ３ＨＡの重量平均分子量の測定）に記載したのと同様の手順で、加熱した後のＰ３ＨＡの重量平均分子量を測定した。
　＜初期分子量＞
　初期分子量を以下の手順によって測定した：不活化後のＰ３ＨＡを含む培養液を蒸留水で希釈し、遠心分離を行った後、上清を除去した。得られた沈殿物（Ｐ３ＨＡ）にエタノールを加え、エタノールに分散させ、遠心分離を行った。上清を除去し、真空乾燥器で１時間以上乾燥させ、沈殿物を完全に乾燥させ、乾燥体（Ｐ３ＨＡ粉体）を得た。得られたＰ３ＨＡ粉体１０ｍｇを、クロロホルム１０ｍＬに溶解させた後、不溶物を濾過により除いた。この溶液（濾液）を、「Ｓｈｏｄｅｘ　Ｋ８０５Ｌ（３００ｘ８ｍｍ、２本連結）」（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用い、クロロホルムを移動相として初期分子量を測定した。分子量標準サンプルには、昭和電工（株）製Ｓｈｏｄｅｘ　Ｋ－８０４（ポリスチレンゲル）を用いた。
　＜最終分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）＞
　最終分子量および数平均分子量を以下の手順によって測定した：Ｐ３ＨＡ粉体１０ｍｇを、クロロホルム１０ｍＬに溶解させた後、不溶物を濾過により除いた。この溶液（濾液）を、「Ｓｈｏｄｅｘ　Ｋ８０５Ｌ（３００ｘ８ｍｍ、２本連結）」（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用い、クロロホルムを移動相として最終分子量および数平均分子量を測定した。分子量標準サンプルには、昭和電工（株）製Ｓｈｏｄｅｘ　Ｋ－８０４（ポリスチレンゲル）を用いた。
　＜Ｐ３ＨＡの収率＞
　Ｐ３ＨＡの収率を以下の手順によって測定した：
　（ａ）後述する分子量調整前の培養液と分子量調整後の培養液とをそれぞれ２ｇずつ採り、水分計（株式会社エー・アンド・デイ製ＭＬ－５０）を用いて固形分濃度を測定した。
　（ｂ）後述する分子量調整前の培養液と分子量調整後の培養液とをそれぞれ５ｇずつ、５０ｍｌファルコンチューブに量り取り、エタノール（富士フイルム和光純薬(株)社製）で２０ｍｌまでメスアップし、スラリーを分散させてから遠心分離（９５００ｒｐｍ、５分間）を行った。
　（ｃ）上清を除去後、上記チューブに蒸留水を添加し、２０ｍｌまでメスアップして沈降物を分散させ、遠心分離（９５００ｒｐｍ、５分間）を行った。
　（ｄ）上清を除去後、上記チューブに３．３％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液（ドデシル硫酸ナトリウム（花王製）を蒸留水に３．３重量％になるように溶解させた水溶液）を添加し、３０ｍｌまでメスアップし、沈降物を分散させた。
　（ｅ）超音波破砕機（株式会社日本精機製作所製超音波ホモジナイザーＵＳ－１５０Ｔ）を用いて、１分間、菌体破砕を行った。
　（ｆ）上記（ｅ）を３回繰り返した。
　（ｇ）遠心分離（９５００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去後、蒸留水を添加し、２０ｍｌまでメスアップして沈降物を分散させ、遠心分離（９５００ｒｐｍ、５分間）を行った。
　（ｈ）上清を除去後、上記チューブにエタノールを添加し、２０ｍｌまでメスアップして沈降物を分散させ、遠心分離（９５００ｒｐｍ、５分間）を行った。
　（ｉ）上清を除去後、６０℃に設定した真空乾燥器を用いて、１２時間、乾燥させた。
　（ｊ）（ｉ）で得た乾燥物の重量を測定し、以下の式（３）および（４）に従ってＰ３ＨＡ含量と収率を計算した。
　Ｐ３ＨＡ含量（ｇ／ｇ）＝（乾燥物の重量（ｇ）／培養液の重量（ｇ））・・・（３）
　収率（％）＝（分子量調整後の培養液のＰ３ＨＡ含量／分子量調整前の培養液のＰ３ＨＡ含量）×１００×（分子量調整前の培養液の固形分濃度（％）／分子量調整後の培養液の固形分濃度（％））　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（４）。
　＜残タンパク質量＞
　残タンパク質量は、ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定した。
　＜ＳＥＭ＞
　ＳＥＭ試料台の上にカーボンテープを貼り、その上から外添剤を含有したＰ３ＨＡ粉体、または比較例となるＰ３ＨＡ粉体を振りかけ後、過剰な粉体をブロアーで除去した。前処理は、オスミウム・プラズマコーターを用いて、２０ｎｍの厚みでコーティングを行った。上記Ｐ３ＨＡ粉体の前処理は、フィルジェン製　ＯＰＣ６０Ａ－Ｇオスミウム・プラズマコーターを用いて行った。ＳＥＭ観察は、日立ハイテクフィールディング製　Ｓ－４８００を用いて行った。
　〔実施例１〕
　（菌体培養液の調製）
　国際公開第ＷＯ２０１９／１４２７１７号に記載のラルストニア・ユートロファを、同文献の段落〔００４１〕～〔００４８〕に記載の方法で培養し、Ｐ３ＨＡを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。Ｐ３ＨＡの繰り返し単位の組成比（３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比）を測定したところ、９９．９／０．１～９６．０／４．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。
　（不活化）
　上記で得られた菌体培養液を内温７０℃で８時間加熱・攪拌処理し、滅菌処理を行った。
　（分子量調整）
　上記で得られた不活化した培養液（不活化培養液）に対して３０％水酸化ナトリウムを用いてｐＨを９．０±０．２に調整し、内温を７５±２℃として、菌体中のＰ３ＨＡの分子量調整を１２時間行った。Ｐ３ＨＡの収率は、９７％であった（表１）。
　（酵素処理）
　上記で得られた分子量調整後の液（分子量調整後液）に対して９５％硫酸を添加してｐＨを７．０±０．２に調整した。ＩＷ（工業用水）を添加して固形分濃度を１８％に調整した後、細胞壁中の糖鎖（ペプチドグリカン）を分解する酵素（溶菌酵素）であるリゾチーム（富士フイルム和光純薬(株)社製）を添加し、５０℃で２時間保持した。その後、アルカリ性タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ２．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を添加し、次いで、５０℃で３０％水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨ８．５に調整しながら２時間保持した。
　（溶菌、濃縮）
　上記で得られた酵素処理液に対して３０％水酸化ナトリウムを添加してｐＨ８．５に調整した（アルカリ洗浄）。次いで、上記酵素処理液に対して０．６～１．０ｗｔ％になるようにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、花王製）を添加した（界面活性剤処理）。その後、ｐＨが１１．０±０．２になるように３０％水酸化ナトリウムを用いて調整するとともに、ｐＨ１１．０の水酸化ナトリウム水溶液を添加して、上記酵素処理液に対して２倍になるよう希釈した。
　上記酵素処理液を遠心分離（４５００ｒｐｍ、１０分間）した後、上清を除去して２倍濃縮した。この濃縮したＰ３ＨＡの水性懸濁液に、除去した上清と同量の水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１１．０）を添加して遠心分離（４５００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を除去した。この工程を３回繰り返した。
　最後に、上清除去により、Ｐ３ＨＡ濃度が５４±２重量％になるように調整し、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液を得た。Ｐ３ＨＡ水性懸濁液中の残タンパク質量は、Ｐ３ＨＡ懸濁液中に存在するＰ３ＨＡの重量に対して９３９ｐｐｍであった（表１）。
　（乾燥）
　上記で得られたＰ３ＨＡ水性懸濁液に、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体非イオン性分散剤（ポリエチレンオキサイド分子量８０００、ポリプロピレンオキサイド分子量２０００、商品名プロノン２０８）を１．０ｐｈｒ（水性懸濁液中に存在するＰ３ＨＡ１００重量部に対して１重量部）添加し、混合した。この液を１２０分間撹拌した後、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液１００ｇあたりに対して、１０重量％硫酸を０．３ｍｌ添加し、Ｐ３ＨＡ水性懸濁液を得た。
　このＰ３ＨＡ水性懸濁液を６０℃で１２時間以上乾燥させ、Ｐ３ＨＡ粉体を得た。得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は１７３０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は７００００であり、熱安定性は７３％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、非多孔質表面であることが確認できた（図１）。
　〔実施例２〕
　（分子量調整）までは、実施例１と同様の方法で分子量調整後液を得た。
　（酵素処理）
　上記で得られた分子量調整後の液（分子量調整後液）に対してＩＷ（工業用水）を添加して固形分濃度を１８％に調整した。次いで、アルカリ性タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ２．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を添加し、５０℃で２時間保持した。次いで、細胞壁中の糖鎖（ペプチドグリカン）を分解する溶菌酵素であるリゾチーム（富士フイルム和光純薬(株)社製）を添加し、５０℃で２時間保持した。その後、アルカラーゼ２．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を添加し、次いで、５０℃で３０％水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨ８．５に調整しながら２時間保持した。以降は、実施例１と同様の方法でＰ３ＨＡ粉体を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。
　Ｐ３ＨＡの収率は９７％であり、残タンパク質量は７６０ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は１７３０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は７００００であり、熱安定性は７０％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、非多孔質表面であることが確認できた。
　〔実施例３〕
　Ｐ３ＨＡの繰り返し単位の組成比（３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比）が９６．０／４．０～９２．０／８．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であるＰ３ＨＡを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法でＰ３ＨＡ粉体を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。
　Ｐ３ＨＡの収率は９８％であり、残タンパク質量は１６４７ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は１５８０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は８４０００であり、熱安定性は７８％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、非多孔質表面であることが確認できた。
　〔実施例４〕
　Ｐ３ＨＡの繰り返し単位の組成比（３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比）が９２．０／８．０～８７．０／１３．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であるＰ３ＨＡを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法でＰ３ＨＡ粉体を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。
　Ｐ３ＨＡの収率は９９％であり、残タンパク質量は１７０４ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は２５７０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は９１０００であり、熱安定性は８０％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、非多孔質表面であることが確認できた。
　〔実施例５〕
　（不活化）までは、実施例３と同様の方法で不活化培養液を得た。
　（酵素処理）
　上記で得られた不活化培養液に対してＩＷ（工業用水）を添加して固形分濃度を１８％に調整した後、細胞壁中の糖鎖（ペプチドグリカン）を分解する酵素であるリゾチーム（富士フイルム和光純薬(株)社製）を添加し、５０℃で２時間保持した。その後、タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ２．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を添加し、次いで、５０℃で３０％水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨ８．５に調整しながら２時間保持した。
　（分子量調整）
　上記で得られた酵素処理後液に対して３０％水酸化ナトリウムを用いてｐＨを１１．５±０．２に調整し、内温を５０±２℃として、Ｐ３ＨＡの分子量調整を１２時間行った。以降は、実施例１と同様の方法でＰ３ＨＡ粒子を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。なお、Ｐ３ＨＡの収率は、（溶菌、濃縮）の直前（換言すれば、ｐＨを１１．５±０．２に調整し、内温を５０±２℃として１２時間保持した直後）に計測した。
　Ｐ３ＨＡの収率は３０％であり、残タンパク質量は７９６ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は２２４０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は６１０００であり、熱安定性は３％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、多孔質表面であることが確認できた。
　〔実施例６〕
　Ｐ３ＨＡの繰り返し単位の組成比（３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比）が９２．０／８．０～８７．０／１３．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であるＰ３ＨＡを用いたこと以外は、実施例５と同様の方法でＰ３ＨＡ粉体を得た。また、実施例５と同様の方法で、各種測定を行った。
　Ｐ３ＨＡの収率は９６％であり、残タンパク質量は１３２６ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は５５６０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は２８７０００であり、熱安定性は８０％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、非多孔質表面であることが確認できた。
　〔比較例１〕
　（酵素処理）までは、実施例１と同様の方法で酵素処理液を得た。
　（溶菌、濃縮）
　上記で得られた酵素処理液に対して０．６～１．０ｗｔ％になるようにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、花王製）を添加し、２倍希釈した。次いで、ｐＨが８．５になるように３０％水酸化ナトリウムを用いて調整した。以降は、実施例１と同様の方法でＰ３ＨＡ粒子を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。
　Ｐ３ＨＡの収率は９７％であり、残タンパク質量は３５４７ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は２１６０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は８６０００であり、熱安定性は６３％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、非多孔質表面であることが確認できた。
　〔比較例２〕
　（不活化）までは、実施例１と同様の方法で不活化培養液を得た。
　（酵素処理）
　上記で得られた不活化培養液に対してＩＷ（工業用水）を添加して固形分濃度を１８％に調整した後、細胞壁中の糖鎖（ペプチドグリカン）を分解する酵素であるリゾチーム（富士フイルム和光純薬(株)社製）を添加し、５０℃で２時間保持した。その後、タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ２．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を添加し、次いで、５０℃で３０％水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨ８．５に調整しながら２時間保持した。
　（分子量調整）
　上記で得られた酵素処理後液に対して３０％水酸化ナトリウムを用いてｐＨを１１．５±０．２に調整し、内温を５０±２℃として、Ｐ３ＨＡの分子量調整を１２時間行った。以降は、実施例１と同様の方法でＰ３ＨＡ粒子を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。なお、Ｐ３ＨＡの収率は、（溶菌、濃縮）の直前（換言すれば、ｐＨを１１．５±０．２に調整し、内温を５０±２℃として１２時間保持した直後）に計測した。
　Ｐ３ＨＡの収率は３０％であり、残タンパク質量は７９６ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は２２４０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は６１０００であり、熱安定性は３％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、多孔質表面であることが確認できた。
　〔比較例３〕
　Ｐ３ＨＡの繰り返し単位の組成比（３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比）が９６．０／４．０～９２．０／８．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であるＰ３ＨＡを用いたこと以外は、比較例２と同様の方法でＰ３ＨＡ粉体を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。
　Ｐ３ＨＡの収率は８５％であり、残タンパク質量は１２６３ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は２８７０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は６８０００であり、熱安定性は７１％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、多孔質表面であることが確認できた。
　〔比較例４〕
　Ｐ３ＨＡの繰り返し単位の組成比（３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比）が９２．０／８．０～８７．０／１３．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であるＰ３ＨＡを用いたこと以外は、比較例２と同様の方法でＰ３ＨＡ粉体を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。
　Ｐ３ＨＡの収率は８０％であり、残タンパク質量は１８０６ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は２５００００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は７８０００であり、熱安定性は５７％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、多孔質表面であることが確認できた。
　〔比較例５〕
　（分子量調整）で分子量調整を６時間行ったこと以外は、比較例３と同様の方法でＰ３ＨＡ粉体を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。なお、Ｐ３ＨＡの収率は、（溶菌、濃縮）の直前（換言すれば、ｐＨを１１．５±０．２に調整し、内温を５０±２℃として６時間保持した直後）に計測した。
　Ｐ３ＨＡの収率は９４％であり、残タンパク質量は１２１４ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は６５２０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は３３６０００であり、熱安定性は７８％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、非多孔質表面であることが確認できた。
　〔比較例６〕
　（分子量調整）で分子量調整を６時間行ったこと以外は、比較例４と同様の方法でＰ３ＨＡ粉体を得た。また、実施例１と同様の方法で、各種測定を行った。なお、Ｐ３ＨＡの収率は、（溶菌、濃縮）の直前（換言すれば、ｐＨを１１．５±０．２に調整し、内温を５０±２℃として６時間保持した直後）に計測した。
　Ｐ３ＨＡの収率は８８％であり、残タンパク質量は１０５０ｐｐｍであった（表１）。また、得られたＰ３ＨＡ粉体の最終分子量（Ｍｗ）は６０３０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は３２２０００であり、熱安定性は８０％であった（表１）。さらに、電子顕微鏡（ＳＥＭ、（株）日立ハイテク社製Ｓ－４８００）を用いて、上記Ｐ３ＨＡ粉体表面の状態を観察したところ、非多孔質表面であることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　〔結果〕
　実施例１～６および比較例１～６で測定した各物性を表１に、実施例１～６および比較例１～６で行った各操作およびその順番を図３にそれぞれ示す。
　表１より、実施例１～２と比較例１を比較すると、酵素処理後に（すなわち、菌体外で）アルカリ条件で保持することにより、残タンパク質量を大幅に低減できることがわかった。また、実施例１～６と比較例２～６を比較すると、酵素処理前に（すなわち、菌体内で）Ｐ３ＨＡの分子量調整を行うと、高いＰ３ＨＡ収率を達成できることがわかった。また、実施例１～４と比較例２～４を比較すると、分子量調整を行って分子量を１５万～３０万まで下げた際、酵素処理後に（すなわち、菌体外で）分子量調整を行うことにより、Ｐ３ＨＡ粉体表面を非多孔質にできることがわかった。
　本発明によれば、不純物（とりわけ、残タンパク質）が低減したＰ３ＨＡを、高収率で製造することができる。また、本発明の製造方法により得られた不純物（とりわけ、残タンパク質）が低減したＰ３ＨＡは、農業、漁業、林業、園芸、医学、衛生品、衣料、非衣料、包装、自動車、建材、その他の分野に好適に利用することができる。

 

Claims (9)

  1. 　重量平均分子量が１０万～７０万であるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法であり、
    　（ａ）ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を含有する菌体を含む培養液にアルカリ水溶液を添加して、ｐＨを８．０～１２．０に調整する工程、
    　（ｂ）前記工程（ａ）で得られた培養液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程、および
    　（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた培養液にアルカリ水溶液を添加して、ｐＨを１０．０～１２．０に調整する工程、
    を含む、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
  2. 　前記工程（ｂ）における酵素処理が、アルカリ性タンパク質分解酵素処理、溶菌酵素処理、およびアルカリ性タンパク質分解酵素処理をこの順で行うことを含む、請求項１に記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
  3. 　前記工程（ａ）と（ｂ）との間に、さらに
    　（ａ’）前記工程（ａ）で得られた培養液のｐＨを６．０～８．０に調整する工程、
    を含み、
    　前記工程（ｂ）における酵素処理が、溶菌酵素処理、およびアルカリ性タンパク質分解酵素処理をこの順で行うことを含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　前記工程（ｂ）における酵素が、リゾチームおよびアルカラーゼである、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
  5. 　前記工程（ｃ）の後に、さらに
    　（ｃ’）前記工程（ｃ）で得られた培養液に界面活性剤を添加する工程、
    を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
  6. 　前記工程（ａ）の反応時間が４時間～３０時間である、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
  7. 　前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）が、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）である、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法。
  8. 　重量平均分子量が１０万～６０万であり、残タンパク質量が２０００ｐｐｍ以下であり、粒子表面が非多孔質であり、かつ、以下の式（１）で示される重量平均分子量保持率が５０％以上である、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）粉体。
    重量平均分子量保持率（％）＝（１６０℃で２０分間加熱した後のＰ３ＨＡの重量平均分子量／１６０℃で２０分間加熱する前のＰ３ＨＡの重量平均分子量）×１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
  9. 　重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０～３．１である、請求項８に記載のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）粉体。

     
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