WO2016204256A1 - 高機能性血小板の製造方法 - Google Patents
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Definitions
- FIG. 12 shows the number of platelets produced per megakaryocyte when shaking culture was performed by adding 15% human serum or 15% human plasma instead of FBS in the presence of the combination of SR-1 and Y27632.
- the ratio of PAC-1 positive platelet count or CD62p positive platelet count is shown.
- FIG. 13 shows the results of examining the dependence of platelet production on the human plasma concentration in the presence of a combination of SR-1 and Y27632.
- FIG. 14 shows per megakaryocyte cells when static culture was performed by adding 1% human serum or 1% human plasma in the presence of SR-1 alone or in the presence of a combination of SR-1 and Y27632. The ratio of the number of platelet production and the number of PAC-1 positive platelets or CD62p positive platelets is shown.
- the “polycomb gene” is known as a gene that negatively regulates the CDKN2a (INK4a / ARF) gene and functions to avoid cellular senescence (Ogura et al., Regenerative Medicine vol.6, No. .4, pp26-32; Jseus et al., Jseus et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7, pp667-677, 2006; Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.100, pp211-216, 2003 ).
- degradation of platelets refers to a decrease in CD42b (GPIb ⁇ ) on the platelet surface. Therefore, degraded platelets include platelets with reduced expression of CD42b and platelets whose extracellular region of CD42b has been cleaved by a shedding reaction. When CD42b on the platelet surface is depleted, it cannot associate with von Willebrand factor (VWF), resulting in loss of platelet blood clotting function. Platelet degradation can be evaluated using the CD42b negative rate (or CD42b negative particle number) relative to the CD42b positive rate (or CD42b positive particle number) in the platelet fraction as an index.
- VWF von Willebrand factor
- CD42b positive rate means the proportion of platelets that can be bound by anti-CD42b antibody among platelets contained in the platelet fraction
- CD42b negative rate means that anti-CD42b antibody binds among platelets contained in the platelet fraction. Means the proportion of not platelets.
- the positions of the modified bases can be all or part of the uridine and cytidine independently, and if they are part of the base, they can be random positions at an arbitrary ratio.
- a vector containing a nucleic acid encoding let-7, miR181a or siRNA a vector containing DNA encoding each of the double strands may be used, or a single strand formed by linking double-stranded nucleic acids via a loop.
- a vector containing DNA encoding a strand nucleic acid may be used.
- siRNA single-stranded RNA obtained by transcription in a cell may be designed such that its complementary portion hybridizes within the molecule and takes a hairpin type structure. Such RNA is called shRNA (short hairpin RNA). When shRNA moves into the cytoplasm, the loop part is cleaved by the enzyme (Dicer) and becomes siRNA and exerts an RNAi effect.
- HMGA protein expression or function is performed in megakaryocyte cells before multinucleation.
- the expression or function of HMGA protein may be suppressed in the multinucleated megakaryocyte cells. Since the multinucleation and hypertrophy of megakaryocytes are promoted and the number of platelets produced per cell increases dramatically, the expression or function of HMGA protein is suppressed even in the process of producing platelets from megakaryocytes. It is preferable.
- the present invention also includes a composition comprising a multinucleated megakaryocyte, an AhR antagonist, and a medium.
- a composition comprising a multinucleated megakaryocyte, an AhR antagonist, and a medium.
- highly functional platelets can be obtained, or it can be stored frozen.
- the composition may contain DMSO, glycerol, a commercially available cell freezing reagent, and the like that protect cells during freezing.
- highly functional platelets can be obtained.
- BCL-xL virus infection of megakaryocyte self-propagating strain BCL-xL was introduced into the megakaryocyte self-growing strain on the 14th day of infection by the lentivirus method. Viral particles were added to the medium so as to have MOI of 10, and the cells were infected by spin infection (centrifugation at 32 ° C, 900 rpm, 60 minutes).
- the obtained SeV2-MKCL was statically cultured in a 10 cm dish (10 mL / dish).
- the medium used was IMDM as a basic medium, and the following components were added (the concentration was the final concentration).
- FBS Sigma # 172012 lot.12E261) 15% L-Glutamin (Gibco # 25030-081) 2mM ITS (Gibco # 41400-045) 100 times diluted MTG (monothioglycerol, sigma # M6145-25ML) 450 ⁇ M Ascorbic acid (sigma # A4544) 50 ⁇ g / mL Puromycin (sigma # P8833-100MG) 2 ⁇ g / mL SCF (Wako Pure Chemical # 193-15513) 50ng / mL TPO-like active substance 200ng / mL
- the culture conditions were 37 ° C. and 5% CO 2 .
- the forced expression of BMI1 gene, c-MYC gene, and BCL-xL gene was
Abstract
Description
しかしながら、これまでにin vitroで得られた血小板には、本来の機能、すなわち血液凝固能を十分に有しないものも見られた。
〔A1〕1又は複数の芳香族炭化水素受容体(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR)アンタゴニストと1又は複数のROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase)阻害剤とを含む、機能性の高い血小板産生促進剤;
〔A2〕AhRアンタゴニストが、4-(2-(2-(benzo[b]thiophen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)ethyl)phenol(SR-1)、2-methyl-2H-pyrazole-3-carboxylic acid(2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)-amide(CH-223191)、N-[2-(3H-indol-3-yl)ethyl]-9-isopropyl-2-(5-methyl-3-pyridyl)purin-6-amine(GNF-351)、6,2',4'-trimethoxyflavone(TMF)、及び3',4'-dimethoxyflavone(DMF)からなる群より選択される、〔A1〕に記載の血小板産生促進剤;
〔A3〕ROCK阻害剤が、Y27632、Y39983、ファスジル塩酸塩、リパスジル、SLX-2119、RKI-1447、azaindole1、SR-3677、Staurosporine、H1152 Dihydrochlorideからなる群より選択される、〔A1〕又は〔A2〕に記載の血小板産生促進剤;
〔A4〕AhRアンタゴニストがSR-1、GNF-351及び/又はCH-223191であり、ROCK阻害剤がY27632、Y39983、ファスジル塩酸塩及び/又はリパスジルである、〔A1〕~〔A3〕のいずれかに記載の血小板産生促進剤;
〔A5〕〔A1〕~〔A4〕のいずれかに記載の血小板産生促進剤と巨核球細胞又はその前駆細胞とを接触させる工程を含む、血小板の製造方法;
〔A6〕前記接触工程がフィーダー細胞を用いない条件で行われる、〔A5〕に記載の方法;
〔A7〕振とう培養条件下で実施される、〔A6〕に記載の方法。
〔A8〕前記巨核球細胞又はその前駆細胞におけるHMGA(High Mobility Group At-hook protein)タンパク質の発現又は機能を抑制する工程を更に含む、〔A5〕~〔A7〕のいずれかに記載の方法;
〔A9〕前記HMGAタンパク質の発現又は機能の抑制が、HMGA遺伝子の発現を直接的又は間接的に抑制するsiRNA又はmiRNAによって行われる、〔A8〕に記載の方法。
〔A10〕前記巨核球細胞が、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つを強制発現した後、当該強制発現を解除した細胞である、〔A5〕~〔A9〕のいずれかに記載の方法;
〔A11〕前記巨核球細胞より未分化な細胞が、多能性幹細胞より製造された造血前駆細胞である、〔A10〕に記載の方法;
〔A12〕前記巨核球細胞から血小板を回収する工程をさらに含む、〔A5〕~〔A11〕のいずれかに記載の方法;
〔A13〕〔A5〕~〔A12〕のいずれかに記載の方法で製造された血小板を含む、血小板製剤;
〔B2〕前記HMGAタンパク質の発現又は機能の抑制が、HMGA遺伝子に対するsiRNAによって行われる、〔B1〕に記載の方法;
〔B3〕前記培養する工程が、芳香族炭化水素受容体(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR)アンタゴニストの存在下で行われる、〔B1〕又は〔B2〕に記載の方法;
〔B4〕前記培養する工程が、ROCK阻害剤の存在下で行われる、〔B1〕から〔B3〕のいずれかに記載の方法;
〔B5〕前記培養する工程が、フィーダー細胞を用いない条件で行われる、〔B1〕から〔B4〕のいずれかに記載の方法;
〔B6〕前記培養する工程によって得られた培養物から血小板を回収する工程をさらに含む、〔B1〕から〔B5〕のいずれかに記載の方法;
〔B7〕〔B1〕から〔B6〕のいずれかに記載された方法で製造された血小板を含む、血小板製剤;
〔B8〕巨核球細胞において、HMGAタンパク質の発現又は機能を抑制する工程を含む、巨核球細胞の成熟化方法;
〔B9〕前記HMGAタンパク質の発現又は機能の抑制工程が、HMGA遺伝子の発現を抑制するsiRNA又はmiRNAによって行われる、〔B8〕に記載の方法;
〔B10〕前記HMGAタンパク質の発現又は機能の抑制工程が、HMGA遺伝子に対するsiRNA又はmiRNAによって行われる、〔B8〕に記載の方法;
〔B11〕前記HMGAタンパク質の発現又は機能の抑制工程が、AhRアンタゴニストを含む培地中で培養することによって行われる、〔B8〕から〔B10〕のいずれかに記載の方法;
〔B12〕前記HMGAタンパク質の発現又は機能の抑制工程が、ROCK阻害剤を含む培地中で培養することによって行われる、〔B8〕から〔B11〕のいずれかに記載の方法;
〔B13〕前記HMGAタンパク質の発現又は機能の抑制工程が、フィーダー細胞を用いない条件で行われる、〔B8〕から〔B12〕のいずれかに記載の方法;
〔B14〕前記AhRアンタゴニストが、4-(2-(2-(benzo[b]thiophen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)ethyl)phenol(SR-1)、2-methyl-2H-pyrazole-3-carboxylic acid(2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)-amide(CH-223191)、N-[2-(3H-indol-3-yl)ethyl]-9-isopropyl-2-(5-methyl-3-pyridyl)purin-6-amine(GNF-351)、6,2',4'-trimethoxyflavone(TMF)、及び3',4'-dimethoxyflavone(DMF)からなる群より選択される、〔B3〕から〔B6〕、及び〔B11〕から〔B13〕のいずれかに記載の方法;
〔B15〕前記ROCK阻害剤は、Y27632、Y39983、ファスジル塩酸塩、リパスジル、SLX-2119、RKI-1447、azaindole1、SR-3677、Staurosporine、H1152 Dihydrochlorideからなる群より選択される、〔B4〕から〔B6〕、及び〔B12〕から〔B14〕のいずれかに記載の方法;
〔B16〕前記巨核球細胞が、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つを強制発現した後、当該強制発現を解除した細胞である、〔B1〕から〔B15〕のいずれかに記載の方法;
〔B17〕前記巨核球細胞より未分化な細胞が、多能性幹細胞より製造された造血前駆細胞である、〔B16〕に記載の方法;
〔B18〕HMGAタンパク質の発現又は機能を抑制した巨核球細胞;
〔B19〕HMGA遺伝子の発現を抑制するsiRNA、miRNA又はこれらをコードする核酸を含む、上記〔B18〕に記載の巨核球細胞;
〔B20〕癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子からなる群より選択される外来性の遺伝子の少なくとも1つを染色体に含む、〔B18〕または〔B19〕に記載の巨核球細胞;
〔B21〕芳香族炭化水素受容体(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR)を含む培地で巨核球細胞を培養する工程を含む、血小板の製造方法;
〔B22〕前記培地が、さらにROCK阻害剤を含む、〔B21〕に記載の方法;
〔B23〕前記培養工程が、フィーダー細胞を用いない条件で行われる、〔B21〕又は〔B22〕に記載の方法;
〔B24〕前記AhRアンタゴニストが、4-(2-(2-(benzo[b]thiophen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)ethyl)phenol(SR-1)、2-methyl-2H-pyrazole-3-carboxylic acid(2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)-amide(CH-223191)、N-[2-(3H-indol-3-yl)ethyl]-9-isopropyl-2-(5-methyl-3-pyridyl)purin-6-amine(GNF-351)、6,2',4'-trimethoxyflavone(TMF)、及び3',4'-dimethoxyflavone(DMF)からなる群より選択される、〔B21〕から〔B23〕のいずれかに記載の方法;
〔B25〕前記ROCK阻害剤は、Y27632、Y39983、ファスジル塩酸塩、リパスジル、SLX-2119、RKI-1447、azaindole1、SR-3677、Staurosporine、H1152 Dihydrochlorideからなる群より選択される、〔B21〕から〔B24〕のいずれかに記載の方法;
〔B26〕前記巨核球細胞が、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つを強制発現した後、当該強制発現を解除した細胞である、〔B21〕から〔B25〕のいずれかに記載の方法;及び
〔B27〕前記巨核球細胞より未分化な細胞が、多能性幹細胞より製造された造血前駆細胞である、〔B26〕に記載の方法
に関する。
第一の態様において、本発明は、1又は複数の芳香族炭化水素受容体(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR)アンタゴニストと1又は複数のROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase)阻害剤とを含む血小板産生促進剤を提供する。別の態様において、本発明は更に、巨核球細胞又はその前駆細胞と上記血小板産生促進剤とを接触させる工程を含む、血小板の製造方法を提供する。
し、細胞老化を回避するために機能する遺伝子として知られている(小倉ら, 再生医療 vol.6, No.4, pp26-32;Jseus et al., Jseus et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7, pp667-677, 2006;Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.100, pp211-216, 2003)。ポリコーム遺伝子の非限定的な例として、BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3bが挙げられる。
・4-(2-(2-(benzo[b]thiophen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)ethyl)phenol(SR-1);
・αナフトフラボン
・1,4-ジヒドロキシアントラキノン
・1,5-ジヒドロキシアントラキノン
・1,8-ジヒドロキシアントラキノン
・galangin
・レスベラトロール
・2-methyl-2H-pyrazole-3-carboxylic acid(2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)-amide(CH-223191);
・N-[2-(3H-indol-3-yl)ethyl]-9-isopropyl-2-(5-methyl-3-pyridyl)purin-6-amine(GNF-351);
・2-(29-amino-39-methoxyphenyl)-oxanaphthalen-4-one(PD98059);
・(Z)-3-[(2,4-dimethylpyrrol-5-yl)methylidenyl]-2-indolinone(TSU-16);
・2-(29-amino-39-methoxyphenyl)-oxanaphthalen-4-one(PD98059);及び
・6,2',4'-trimethoxyflavone(TMF)
・3',4'-dimethoxyflavone(DMF)
第二の態様において、本発明は、巨核球細胞又はその前駆細胞におけるHMGA(High Mobility Group At-hook protein)タンパク質の発現又は機能を抑制する工程を含む血小板の製造方法を提供する。
第三の態様において、本発明は、AhRアンタゴニスト及び/又はROCK阻害剤の存在下でHMGAタンパク質の発現又は機能を抑制した巨核球細胞を培養する工程を含む、成熟巨核球の製造方法を提供する。また、培養工程は、上述の接触工程と同様に行うことができる。別の態様において、本発明に係る成熟巨核球の製造方法は血小板を産生する工程を含んでもよい。
本発明のいずれの態様においても、巨核球細胞の培養条件は、通常の条件とすることができる。例えば、温度は約35℃~約42℃、約36℃~約40℃、又は約37℃~約39℃とすることができ、5%CO2及び/又は20%O2としてもよい。静置培養であっても、振とう培養であってもよい。本発明によれば、SR-1等のAhRアンタゴニストを用いる場合にはフィーダーフリー条件下での培養が実現可能になるため、血小板を大量に製造する場合には振とう培養が好ましい。振とう培養の場合の振とう速度も特に限定されず、例えば、10rpm~200rpm、30rpm~150rpm等とすることができる。
1-1.iPS細胞からの造血前駆細胞の調製
ヒトiPS細胞(TKDN SeV2:センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞)から、Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830 (2010)に記載の方法に従って、血球細胞への分化培養を実施した。即ち、ヒトES/iPS細胞コロニーを20ng/mL VEGF (R&D SYSTEMS)存在下でC3H10T1/2フィーダー細胞と14日間共培養して造血前駆細胞(Hematopoietic Progenitor Cells;HPC)を作製した。培養条件は20% O2、5% CO2で実施した(特に記載がない限り、以下同条件)。
予めC3H10T1/2フィーダー細胞を播種した6 well plate上に、上記の方法で得られたHPCを5x104cells/wellずつ播種し、レンチウイルス法にてc-MYCおよびBMI1を強制発現さた。このとき、細胞株1種類につき6 wellずつ使用した。即ち、それぞれMOI 20になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション(32℃ 900rpm, 60分間遠心)で感染させた。本操作は、12時間おきに2回実施した。このとき、基本培地(15% Fetal Bovine Serum (GIBCO)、1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO)、1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G) (GIBCO)、0.45mM 1-Thioglycerol (Sigma-Aldrich)、50μg/mL L-Ascorbic Acid (Sigma-Aldrich)を含有するIMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) (Sigma-Aldrich))へ50ng/mL Human thrombopoietin (TPO) (R&D SYSTEMS)、50ng/mL Human Stem Cell Factor (SCF) (R&D SYSTEMS)および2μg/mL Doxycycline (Dox)を含有した培地(以下、分化培地)に、更に、Protamineを最終濃度10μg/mL加えたものを使用した。なお、レンチウイルスベクターは、Tetracycline制御性のinducible vectorであり、LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(Kobayashi, T., et al. Cell 142, 787-799 (2010))のmOKSカセットをc-MYC、BMI1、BCL-xLに組み替えることで作製された(それぞれ、LV-TRE- c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、およびLV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G)。感染に用いたウイルス粒子は、293T細胞へ上記レンチウイルスベクターを発現させて作製された。
上記の方法でcMYC及びBMI1ウイルス感染を実施した日を感染0日目として、以下の通り、cMYC及びBMI1遺伝子導入型巨核球細胞を培養することで、巨核球自己増殖株をそれぞれ作製した。
ピペッティングにて上記の方法で得られたウイルス感染済み血球細胞を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行って上清を除去した後、新しい分化培地で懸濁して新しいC3H10T1/2フィーダー細胞上に播種した(6well plate)。感染9日目に同様の操作をすることによって継代を実施した。細胞数を計測後1×105cells/2mL/wellでC3H10T1/2フィーダー細胞上に播種した(6well plate)。
感染2日目と同様の操作を実施した。細胞数を計測後3×105cells/10mL/100mm dishでC3H10T1/2フィーダー細胞上に播種した(100mm dish)。
ウイルス感染済み血球細胞を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、抗ヒトCD235ab-pacific blue(BioLegend
)抗体をそれぞれ2μL、1μL、1μLずつを用いて抗体反応した。反応後に、FACS Verse(BD)を用いて解析した。感染14日目において、CD41a陽性率が50%以上であった細胞を、巨核球自己増殖株とした。
前記感染14日目の巨核球自己増殖株に、レンチウイルス法にてBCL-xLを遺伝子導入した。MOI 10になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション(32℃ 900rpm、60分間遠心)で感染させた。
・感染14目~感染18日目
前述の方法で得られたBCL-xLを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行った。遠心後、沈殿した細胞を新しい分化培地で懸濁した後、新しいC3H10T1/2フィーダー細胞上に2×105cells/2mL/wellで播種した(6well plate)。
細胞数を計測後、3×105cells/10mL/100mm dishで播種した。
細胞数を計測後、1×105cells/10mL/100mm dishで播種した。以後、4-7日毎に継代を行い、維持培養を行った。
FBS(シグマ#172012 lot.12E261)15%
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mM
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μM
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/mL
Puromycin (sigma #P8833-100MG) 2μg/mL
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質 200ng/mL
培養条件は、37℃、5%CO2とした。
BMI1遺伝子、c-MYC遺伝子、及びBCL-xL遺伝子の強制発現は、培地にドキシサイクリン (clontech #631311) 1μg/mLを加えることにより行った。
1.の方法で得た不死化巨核球細胞株(SeV2-MKCL)を、PBS(-)で2度洗浄し、ドキシサイクリンを含まない培地中で培養することで強制発現を解除した。培養は、6ウェルプレートに播種密度1x105cells/mL、2mL/ウェルで播種し、次の培地中で静置培養した。
培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた(濃度は終濃度)。
FBS 15%
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mM
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μM
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/mL
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質 200ng/mL
ADAM阻害剤 15μM
培養条件は、37℃、5%CO2とした。
同時にSR-1を図1に示す濃度で加え、7日間培養した後、血小板の数及び機能を測定した。測定方法は以下のとおりである。
遺伝子発現OFF培養7日後に培養上清を1mLピペットマンを用いて緩やかに懸濁した。培養液200μLを5mL sample tubeに分注し、以下の抗体で染色を行った。
0.5μL 抗CD42a抗体 PB標識(eBioscience #48-0428-42)
0.5μL 抗CD42b抗体PE標識(Bio Legend #303906)
0.5μL 抗CD62a抗体APC標識(Bio Legend #304910)
10μL PAC-1抗体FITC標識(BD #304910)
血小板の刺激は終濃度0.2μMでPMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, sigma #P1585-1MG)、又は、終濃度20uMでADP(sigma #A2754)、終濃度20μMでTRAP-6(Thtombin Receptor Activator Peptide 6,TFA salt, BACHEM #H8365)、終濃度1μg/mLで collagen(collagen reagent HORM, モリヤ産業)、若しくはそれらの混合物を添加し室温にて反応させた。
反応30分後にBD社FACSverceにて測定を実施した。測定直前にTyrode buffer Ca+ 400μLを添加して、計600μLにした。その計600μLをFACS測定サンプルとした。
CD42a陽性CD42b陽性の粒子数を血小板数とし、この血小板画分における刺激前後のPAC-1およびCD62pの平均蛍光強度(Mean Fluorescence Intensity; MFI)の比を算出した。
1.の不死化巨核球細胞の調製における最後の継代の日から、PBS(-)で洗浄するまでの期間を1日、2日又は3日とし、強制発現終了後、SR-1の濃度を75nM又は750nM、播種密度を1×105cells/mLとして、2.と同様の実験を行った。
結果を図2に示す。強制発現1日~3日で、血小板産生数にはほとんど差が見られなかったが、2日以上強制発現を行った方が、機能が高くなる傾向が見られた。
6ウェルプレートに代えて、E125フラスコに播種密度1x105cells/mL、25mL/フラスコで播種して振とう培養する以外は、2.及び3.と同様の実験を行い、SR-1の濃度と不死化巨核球細胞の播種密度を検討した。
結果を図3及び4に示す。静置培養と同様の結果が得られた。
AhRアンタゴニストとしてSR-1の類縁体を図中の濃度で用いたこと以外は、2.と同様の実験を行った。
結果を図5に示す。いずれのAhRアンタゴニストを加えても、血小板産生数と機能が増大することが確認された。また、AhRアンタゴニストについて、さらに詳細に濃度を変更した結果を図6A及び図6Bに示す。
SR-1(AhRアンタゴニスト)とY27632(ROCK阻害剤)の共添加効果を調べた。1.の方法で得た不死化巨核球細胞を、PBS(-)で2度洗浄してドキシサイクリンを除去して強制発現を解除し、6ウェルプレートに播種密度1x105cells/mL、2mL/ウェルで播種して静置培養し、E125フラスコに播種密度1x105cells/mL、25mL/フラスコで播種して振とう培養した。
培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた(濃度は終濃度)。
FBS 15%
L-Glutamin
ITS
MTG
アスコルビン酸
SCF 50ng/mL
TPO様作用物質 200ng/mL
SR-1 750nM
Y27632 10μM
培養条件は、37℃、5%CO2、20%O2とした。上記2.と同様の方法で、血小板数とPAC-1陽性細胞を測定した。
結果を図7及び図8に示す。SR-1とY27632を共添加すると、それぞれを単独で添加した場合に比較して、血小板産生数と機能が相乗的に高くなることが確認された。同様に、SR-1と他のROCK阻害剤の組み合わせ(例えばY39983、ファスジル塩酸塩、リパスジル、SLX-2119、RKI-1447、azaindole1、SR-3677)についても同様に相乗効果が確認された。Y27632を上回る顕著な相乗効果を示したY-39983の結果を図9に示す。ファスジル塩酸塩及びリパスジルもY27632に匹敵する相乗効果を濃度依存的に示した。続いて、Y27632と他のAhRアンタゴニストの組み合わせについても血小板産生数等を検討したところ、いずれも相乗効果が確認された。SR-1を上回る顕著な相乗効果を示したGNF-351及びCH-223191の結果を図10に示す。結果は示さないが、GNF-351とY-39983の組み合わせは特に驚くべき顕著な効果を奏した。
ヒト由来成分でFBSを代替できるかどうか調べるために、15%FBSに代えて、15%ヒト由来血清(図中human serum;正常ヒト血清プール(コージンバイオ#12181201))又は15%ヒト由来血漿(図中human plasma;正常ヒト血漿プール・ヘパリン処理(コージンバイオ#12250210))を用いたこと以外は、上記2.又は6.と同様の実験を行った。
結果を図11に示す。FBSに代えて、15%ヒト血清又は15%ヒト血漿を用いても、機能的な血小板が得られることがわかった。ヒト血清やヒト血漿を用いれば、異種動物成分を排除できるので、より安全性の高い血小板を得ることができる。
結果を図12に示す。静置培養ではなく振とう培養の場合も、15%ヒト血清又は15%ヒト血漿を用いて機能的な血小板が得られた。振とう培養によれば、大量培養・大量生産が可能となる。
結果を図13に示す。血小板産生量には、ある程度の血漿濃度依存性が見られたものの、血漿濃度1%まで低下させても、十分な量の機能的な血小板が得られることが確認された。培地中のヒト血漿濃度の低下させることができれば、血小板製剤の生産コストを低減することが可能である。
結果を図14及び15に示す。血清濃度を1%まで低下させても、十分な量の機能的な血小板が得られることが確認された。
上記1.で調製した不死化巨核球細胞に、ウイルスベクターによってshRunx1 with GFP, shHMGA2 with GFP, SCRAMBLE with GFPを遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞(GFP陽性細胞)をソーティングした。用いたshRNAを以下の表1に示す。
図示されるとおり、強制発現解除前(ON MGK)に比較して、強制発現解除後は、CD41a陽性CD42b陽性の巨核球細胞の含有率が増加し(OFF MGK)、CD41a陽性CD42b陽性の血小板が大量に産生されているのが確認された。図19上段に示されるとおり、HMGA2をノックダウンすると、巨核球細胞の多核化が著しく促進され、下段に示されるとおり、巨核球細胞において1細胞あたりの血小板数が飛躍的に増加することが確認された。
上記1.で調製した不死化巨核球細胞に、上記8.と同様にshRunx1 with GFP, shHMGA2 with GFP, shSCRAMBLE with GFPを遺伝子導入し、1 μg / mlドキシサイクリン(DOX)を含む巨核球細胞用培地(すなわち、15% FBS、L-Glutamin、ITS、MTG、アスコルビン酸、50ng/mL SCF、50ng/mL TPOを添加したIMDM)で7日間培養後、遺伝子導入された細胞(GFP陽性細胞)をソーティングにより単離した。shHMGA2を導入し単離した細胞を1×105個を6ウェルプレートに播種し、無添加、750nM SR-1のみ、10μM Y27632のみ、又は750nM SR-1および10μM Y27632を添加したDOXを含まない巨核球細胞用培地(すなわち、外来性の遺伝子発現を止める培地)で7日間培養した。
一方、shRunx1およびshSCRAMBLEを導入し単離した細胞を、750nM SR-1および10μM Y27632を添加したDOXを含まない巨核球細胞培養培地で7日間培養した。得られた細胞をサイトスピンによってスライドグラスへ密着させ、顕微鏡によって観察した(図20上図)。
また、培養上清における血小板数(CD41a陽性CD42b陽性)をFACSを用いて測定した(図20下図)。その結果、HMGA2をノックダウンした巨核球細胞をAhRアンタゴニストおよびROCK阻害剤を含む培地で培養することで、多核化および肥大化した細胞が多くみられ、単位細胞あたりの血小板産生数が著しく増加することが確認された。また、AhRアンタゴニストおよびROCK阻害剤を組み合わせて用いた場合、血小板産生効率がより高くなることが確認された。
10.HMGA2阻害と巨核球細胞の成熟化
上記9.で得られたshRunx1、shHMGA2およびshSCRAMBLEを導入して得られた細胞をSR-1およびY27632を添加したDOXを含まない巨核球細胞用培地で培養した細胞を電子顕微鏡で観察した。
結果を図21に示す。その結果、shRunx1を導入した場合では、小型有核細胞が多く、細胞では分離膜系(demarcation membrane system:DMS)の発達が乏しく、分泌顆粒は中程度に形成されていることが確認された。同様に、shSCRAMBLEを導入した場合では、小型有核細胞が多く、細胞ではDMSの発達が乏しく、分泌顆粒はほとんど形成されていないことが確認された。一方、shHMGA2を導入した場合では、多核化および肥大化した細胞が認められ、さらに、このような細胞ではDMSと分泌顆粒の形成が認められた。
以上の結果より、巨核球細胞においてHMGA2を阻害することで血小板産生効率を高めることが可能であり、AhRアンタゴニストおよびROCK阻害剤を組み合わせることによって、得られる巨核球が生体内の巨核球と同様に多核化および肥大化し、DMSと分泌顆粒の形成が認められるほど成熟し、そのことにより、血小板産生効率がより高くなることが示唆された。
配列番号:2は、shSCRAMBLEのDNA配列を示す。
配列番号:3は、shRunx1の標的配列を示す。
配列番号:4は、shRunx1のDNA配列を示す。
配列番号:5は、shHMGA2の標的配列を示す。
配列番号:6は、shHMGA2のDNA配列を示す。
Claims (13)
- 1又は複数の芳香族炭化水素受容体(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR)アンタゴニストと1又は複数のROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase)阻害剤とを含む、機能性の高い血小板産生促進剤。
- AhRアンタゴニストが、4-(2-(2-(benzo[b]thiophen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)ethyl)phenol(SR-1)、2-methyl-2H-pyrazole-3-carboxylic acid(2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)-amide(CH-223191)、N-[2-(3H-indol-3-yl)ethyl]-9-isopropyl-2-(5-methyl-3-pyridyl)purin-6-amine(GNF-351)、6,2',4'-trimethoxyflavone(TMF)、及び3',4'-dimethoxyflavone(DMF)からなる群より選択される、請求項1に記載の血小板産生促進剤。
- ROCK阻害剤が、Y27632、Y39983、ファスジル塩酸塩、リパスジル、SLX-2119、RKI-1447、azaindole1、SR-3677、Staurosporine、H1152 Dihydrochlorideからなる群より選択される、請求項1又は2に記載の血小板産生促進剤。
- AhRアンタゴニストがSR-1、GNF-351及び/又はCH-223191であり、ROCK阻害剤がY27632、 Y39983、ファスジル塩酸塩及び/又はリパスジルである、請求項1~3のいずれか1項に記載の血小板産生促進剤。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載の血小板産生促進剤と巨核球細胞又はその前駆細胞とを接触させる工程を含む、血小板の製造方法。
- 前記接触工程がフィーダー細胞を用いない条件で行われる、請求項5に記載の方法。
- 振とう培養条件下で実施される、請求項6に記載の方法。
- 前記巨核球細胞又はその前駆細胞におけるHMGA(High Mobility Group At-hook protein)タンパク質の発現又は機能を抑制する工程を更に含む、請求項5~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HMGAタンパク質の発現又は機能の抑制が、HMGA遺伝子の発現を直接的又は間接的に抑制するsiRNA又はmiRNAによって行われる、請求項8に記載の方法。
- 前記巨核球細胞が、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つを強制発現した後、当該強制発現を解除した細胞である、請求項5~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記巨核球細胞より未分化な細胞が、多能性幹細胞より製造された造血前駆細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記巨核球細胞から血小板を回収する工程をさらに含む、請求項5~11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項5~12のいずれか1項に記載の方法で製造された血小板を含む、血小板製剤。
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