KR102600772B1 - 고기능성 혈소판의 제조 방법 - Google Patents

고기능성 혈소판의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 또는 복수의 방향족 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR) 안타고니스트와 하나 또는 복수의 ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase) 저해제를 포함하는, 기능성이 높은 혈소판 산생 촉진제를 제공한다.

Description

고기능성 혈소판의 제조 방법
본 발명은 생체 외에서의 혈소판의 제조 방법 등에 관한 것이다.
혈액 관련 질환을 치료하는 경우, 혹은 외과적인 치료를 행하는 경우, 치료에 제공되는 혈구계 세포가 필요해진다. 혈구계 세포 중에서도, 혈액 응고(지혈)를 위하여 필수 세포인 혈소판, 혈소판 전구체(proplatelet), 나아가 혈소판을 산생하는 세포인 거핵구 세포는 특히 요구가 높은 세포이다. 특히 혈소판은, 백혈병, 골수 이식, 항암 치료 등에 있어서의 수요가 많아，안정 공급의 필요성은 높다.
지금까지 생체 외에서의 혈소판 산생 방법으로서, 각종 줄기 세포를 분화시켜 거핵구 세포를 얻고, 이것을 배양하여 혈소판을 방출시키는 방법이 개발되고 있다. 근년, iPS 세포의 수립에 의해, 재생 의료에 있어서의 세포 요법의 중요한 소스로서 다능성 줄기 세포의 유용성이 한층 주목을 받아 왔다. 지금까지, 예를 들어 다카야마(Takayama) 등이, 인간 ES 세포로부터 거핵구 세포 및 혈소판을 분화 유도하는 데 성공하고 있다(비특허문헌 1).
그러나, 지금까지 생체 외에서 얻어진 혈소판에는, 본래의 기능, 즉 혈액 응고능을 충분히 갖지 않는 것도 보였다.
또한, 종래의 생체 외에서의 혈소판 산생 방법에서는, 피더(feeder) 세포를 사용하지 않으면, 충분히 기능적인 혈소판을 얻음은 곤란했다. 그러나, 피더 세포는 인간 이외의 종에서 유래하는 세포를 사용하는 일도 많아, 인간에게 투여하기 위한 혈소판 제조에는, 피더 세포를 사용하지 않는 방법이 바람직하다.
지금까지 제안된 생체 외에서 조혈 전구 세포로부터 혈소판을 만드는 방법의 일례로서, 거핵구 세포를 TPO와 방향족 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR) 안타고니스트의 존재 하에서 배양하는 방법이 제안되고 있다(특허문헌 1).
국제 공개 제2014/138485호
Takayama N. et al., Blood, 111, pp.5298-5306, 2008
본 발명은 거핵구 세포로부터 효율적으로 기능성이 높은 혈소판을 생체 외에서 산생하는 방법을 제공함을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 검토를 거듭한 결과, 거핵구 세포를 AhR 안타고니스트의 존재 하에서 배양하면, 산생되는 혈소판의 수가 증가됨과 함께 기능도 상승함, 그리고, 또한 ROCK 저해제를 병용한 경우에는 상가적이 아니라 상승적으로 작용함을 알아내었다. 그리고, 기능성이 보다 높은 혈소판을 얻기 위한 배양 조건을 검토하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명자들은 또한, 거핵구 세포에 있어서, HMGA 단백질의 발현 또는 기능을 억제함으로써, 단위당 거핵구 세포로부터 출산되는 혈소판 수가 증대됨을 알아내었다. 또한, 당해 거핵구 세포를 시각적으로 파악한바, 다핵비대화되고 있어, 분리막과 분비 과립의 형성이 확인되어, 생체 외에 있어서 거핵구 세포를 성숙시키는 데 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은
〔A1〕 하나 또는 복수의 방향족 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR) 안타고니스트와 하나 또는 복수의 ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase) 저해제를 포함하는, 기능성이 높은 혈소판 산생 촉진제;
〔A2〕AhR 안타고니스트가, 4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6-일아미노)에틸)페놀(SR-1), 2-메틸-2H-피라졸-3-카르복실산(2-메틸-4-o-톨릴라조-페닐)-아미드(CH-223191), N-[2-(3H-인돌-3-일)에틸]-9-이소프로필-2-(5-메틸-3-피리딜)퓨린-6-아민(GNF-351), 6,2',4'-트리메톡시플라본(TMF) 및 3',4'-디메톡시플라본(DMF)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 〔A1〕에 기재된 혈소판 산생 촉진제;
〔A3〕ROCK 저해제가, Y27632, Y39983, 파수딜 염산염, 리파수딜, SLX-2119, RKI-1447, 아자인돌(azaindole) 1, SR-3677, 스타우로스포린(Staurosporine), H1152 디히드로클로라이드(Dihydrochloride)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 〔A1〕또는 〔A2〕에 기재된 혈소판 산생 촉진제;
〔A4〕AhR 안타고니스트가 SR-1, GNF-351 및/또는 CH-223191이며, ROCK 저해제가 Y27632, Y39983, 파수딜 염산염 및/또는 리파수딜인, 〔A1〕 내지 〔A3〕 중 어느 하나에 기재된 혈소판 산생 촉진제;
〔A5〕〔A1〕 내지 〔A4〕 중 어느 하나에 기재된 혈소판 산생 촉진제와 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는, 혈소판의 제조 방법;
〔A6〕상기 접촉 공정이 피더 세포를 사용하지 않는 조건에서 행하여지는, 〔A5〕에 기재된 방법;
〔A7〕진탕 배양 조건 하에서 실시되는, 〔A6〕에 기재된 방법.
〔A8〕상기 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포에 있어서의 HMGA(고이동성 군 At-후크 단백질(High Mobility Group At-hook protein)) 단백질의 발현 또는 기능을 억제하는 공정을 더 포함하는, 〔A5〕 내지 〔A7〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔A9〕상기 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제가, HMGA 유전자의 발현을 직접적 또는 간접적으로 억제하는 siRNA 또는 miRNA에 의해 행하여지는, 〔A8〕에 기재된 방법.
〔A10〕상기 거핵구 세포가, 거핵구 세포보다 미분화된 세포에 있어서, 암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 적어도 하나를 강제 발현한 후, 당해 강제 발현을 해제한 세포인, 〔A5〕 내지 〔A9〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔A11〕상기 거핵구 세포보다 미분화된 세포가, 다능성 줄기 세포로 제조된 조혈 전구 세포인, 〔A10〕에 기재된 방법;
〔A12〕상기 거핵구 세포로부터 혈소판을 회수하는 공정을 더 포함하는, 〔A5〕 내지 〔A11〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔A13〕〔A5〕 내지 〔A12〕 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 혈소판을 포함하는, 혈소판 제제;
〔B1〕HMGA 단백질의 발현 또는 기능을 억제한 거핵구 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 혈소판의 제조 방법;
〔B2〕상기 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제가, HMGA 유전자에 대한 siRNA에 의해 행하여지는, 〔B1〕에 기재된 방법;
〔B3〕상기 배양하는 공정이, 방향족 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR) 안타고니스트의 존재 하에서 행하여지는, 〔B1〕또는 〔B2〕에 기재된 방법;
〔B4〕상기 배양하는 공정이, ROCK 저해제의 존재 하에서 행하여지는, 〔B1〕 내지 〔B3〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B5〕상기 배양하는 공정이, 피더 세포를 사용하지 않는 조건에서 행하여지는, 〔B1〕 내지 〔B4〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B6〕상기 배양하는 공정에 의해 얻어진 배양물로부터 혈소판을 회수하는 공정을 더 포함하는, 〔B1〕 내지 〔B5〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B7〕〔B1〕 내지 〔B6〕중 어느 것에 기재된 방법으로 제조된 혈소판을 포함하는, 혈소판 제제;
〔B8〕거핵구 세포에 있어서, HMGA 단백질의 발현 또는 기능을 억제하는 공정을 포함하는, 거핵구 세포의 성숙화 방법;
〔B9〕상기 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제 공정이, HMGA 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 또는 miRNA에 의해 행하여지는, 〔B8〕에 기재된 방법;
〔B10〕상기 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제 공정이, HMGA 유전자에 대한 siRNA 또는 miRNA에 의해 행하여지는, 〔B8〕에 기재된 방법;
〔B11〕상기 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제 공정이, AhR 안타고니스트를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 행해지는, 〔B8〕 내지 〔B10〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B12〕상기 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제 공정이, ROCK 저해제를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 행해지는, 〔B8〕 내지 〔B11〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B13〕상기 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제 공정이, 피더 세포를 사용하지 않는 조건에서 행하여지는, 〔B8〕 내지 〔B12〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B14〕상기 AhR 안타고니스트가, 4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6-일아미노)에틸)페놀(SR-1), 2-메틸-2H-피라졸-3-카르복실산(2-메틸-4-o-톨릴라조-페닐)-아미드(CH-223191), N-[2-(3H-인돌-3-일)에틸]-9-이소프로필-2-(5-메틸-3-피리딜)퓨린-6-아민(GNF-351), 6,2',4'-트리메톡시플라본(TMF) 및 3',4'-디메톡시플라본(DMF)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 〔B3〕 내지 〔B6〕 및 〔B11〕 내지 〔B13〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B15〕상기 ROCK 저해제는, Y27632, Y39983, 파수딜 염산염, 리파수딜, SLX-2119, RKI-1447, 아자인돌 1, SR-3677, 스타우로스포린, H1152 디히드로클로라이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 〔B4〕 내지 〔B6〕 및 〔B12〕 내지 〔B14〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B16〕상기 거핵구 세포가, 거핵구 세포보다 미분화된 세포에 있어서, 암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 적어도 하나를 강제 발현한 후, 당해 강제 발현을 해제한 세포인, 〔B1〕 내지 〔B15〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B17〕상기 거핵구 세포보다 미분화된 세포가, 다능성 줄기 세포로 제조된 조혈 전구 세포인, 〔B16〕에 기재된 방법;
〔B18〕HMGA 단백질의 발현 또는 기능을 억제한 거핵구 세포;
〔B19〕HMGA 유전자의 발현을 억제하는 siRNA, miRNA 또는 이들을 코딩하는 핵산을 포함하는, 상기 〔B18〕에 기재된 거핵구 세포;
〔B20〕암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 외래성의 유전자의 적어도 하나를 염색체에 포함하는, 〔B18〕 또는 〔B19〕에 기재된 거핵구 세포;
〔B21〕방향족 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR)를 포함하는 배지에서 거핵구 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 혈소판의 제조 방법;
〔B22〕상기 배지가 ROCK 저해제를 더 포함하는, 〔B21〕에 기재된 방법;
〔B23〕상기 배양 공정이, 피더 세포를 사용하지 않는 조건에서 행하여지는, 〔B21〕또는 〔B22〕에 기재된 방법;
〔B24〕상기 AhR 안타고니스트가, 4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6-일아미노)에틸)페놀(SR-1), 2-메틸-2H-피라졸-3-카르복실산(2-메틸-4-o-톨릴라조-페닐)-아미드(CH-223191), N-[2-(3H-인돌-3-일)에틸]-9-이소프로필-2-(5-메틸-3-피리딜)퓨린-6-아민(GNF-351), 6,2',4'-트리메톡시플라본(TMF) 및 3',4'-디메톡시플라본(DMF)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 〔B21〕 내지 〔B23〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B25〕상기 ROCK 저해제는, Y27632, Y39983, 파수딜 염산염, 리파수딜, SLX-2119, RKI-1447, 아자인돌 1, SR-3677, 스타우로스포린, H1152 디히드로클로라이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 〔B21〕 내지 〔B24〕 중 어느 하나에 기재된 방법;
〔B26〕상기 거핵구 세포가, 거핵구 세포보다 미분화된 세포에 있어서, 암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 적어도 하나를 강제 발현한 후, 당해 강제 발현을 해제한 세포인, 〔B21〕 내지 〔B25〕 중 어느 하나에 기재된 방법; 및
〔B27〕상기 거핵구 세포보다 미분화된 세포가, 다능성 줄기 세포로 제조된 조혈 전구 세포인, 〔B26〕에 기재된 방법
에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 피더 세포를 사용하지 않아도, 높은 기능을 갖는 혈소판을 효율적으로 산생할 수 있다. 피더 세포를 사용할 필요가 없는 점에서, 혈소판의 제조에 종형 대형 배양 장치를 사용할 수 있고, 나아가서는 임상에 사용하는 혈소판을 효율적으로 대량으로 산생하는 것이 가능해진다.
도 1은 거핵구 세포의 배지에 있어서의 SR-1(AhR 안타고니스트)의 농도를 다양하게 바꾸어 정치 배양을 행하고, 산생된 혈소판의 수 및 기능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 계대 후의 배양 일수를 바꾸어, SR-1을 첨가한 정치 배양을 행했을 때에 산생된 혈소판의 수 및 기능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 거핵구 세포의 배지에 있어서의 SR-1의 농도를 다양하게 바꾸어 진탕 배양을 행하고, 산생된 혈소판의 수 및 기능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 SR-1 첨가 시의 거핵구 세포의 파종 밀도를 다양하게 바꾸어 진탕 배양을 행하고, 산생된 혈소판의 수 및 기능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 거핵구 세포의 배지에 SR-1 유사체를 첨가하여 정치 배양을 행하고, 산생된 혈소판의 수 및 기능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6a는 거핵구 세포의 배지에 다양한 농도의 SR-1 유사체(CH-223191 또는 GNF-351)를 첨가하여 정치 배양을 행하고, 산생된 혈소판의 수 및 기능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6b는 거핵구 세포의 배지에 다양한 농도의 SR-1 유사체(TMF 또는 DMF)를 첨가하여 정치 배양을 행하고, 산생된 혈소판의 수 및 기능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 SR-1 단독, Y27632(ROCK 저해제) 단독, 또는 SR-1과 Y27632의 조합을 첨가하여 거핵구 세포를 정치 배양(6웰) 또는 진탕 배양(E125)하고, 산생된 혈소판의 수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 SR-1 단독, Y27632(ROCK 저해제) 단독, 또는 SR-1과 Y27632의 조합을 첨가하여 거핵구 세포를 정치 배양(6웰) 또는 진탕 배양(E125)하고, 산생된 혈소판의 기능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 SR-1과 Y-39983, 파수딜 염산염 또는 리파수딜(ROCK 저해제)의 조합을 첨가하여 거핵구 세포를 진탕 배양(E125)하고, 산생된 혈소판의 수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 GNF-351 또는 CH-223191(AhR 안타고니스트)과 Y-27632(ROCK 저해제)의 조합을 첨가하여 거핵구 세포를 진탕 배양(E125)하고, 산생된 혈소판의 수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 11은 SR-1 단독의 존재 하에서, Y27632 단독의 존재 하에서, 또는 SR-1과 Y27632의 조합의 존재 하에서, FBS 대신에, 15％ 인간 혈청 또는 15％ 인간 혈장을 첨가하여 정치 배양했을 때의, 1거핵구 세포당 혈소판 산생수와, PAC-1 양성 혈소판 수 또는 CD62p 양성 혈소판 수의 비율을 나타낸다.
도 12는 SR-1과 Y27632의 조합의 존재 하에서, FBS 대신에, 15％ 인간 혈청 또는 15％ 인간 혈장을 첨가하여 진탕 배양했을 때의, 1거핵구 세포당 혈소판 산생수와, PAC-1 양성 혈소판 수 또는 CD62p 양성 혈소판 수의 비율을 나타낸다.
도 13은 SR-1과 Y27632의 조합의 존재 하에서, 혈소판 산생수의 인간 혈장 농도 의존성을 조사한 결과를 나타낸다.
도 14는 SR-1 단독의 존재 하에서, 또는 SR-1과 Y27632의 조합의 존재 하에서, 1％ 인간 혈청 또는 1％ 인간 혈장을 첨가하여 정치 배양했을 때의, 1거핵구 세포당 혈소판 산생수와, PAC-1 양성 혈소판 수 또는 CD62p 양성 혈소판 수의 비율을 나타낸다.
도 15는 도 14의 경우의 배양물에 대하여, 항CD62p 항체와 항PAC-1 항체를 사용하여 플로우 사이토메트리를 행한 결과를 나타낸다.
도 16은 BMI1 유전자, c-MYC 유전자 및 BCL-xL 유전자의 강제 발현에 의해 불사화된 거핵구 세포에 있어서, HMGA2 유전자 및 RUNX1 유전자의 발현을 shRNA에 의해 억제한 실험의 개요를 나타낸다.
도 17은 BMI1 유전자, c-MYC 유전자 및 BCL-xL 유전자의 강제 발현에 의해 불사화된 거핵구 세포를, 도 16에 도시되는 shRNA 존재 하에서 배양한 후의, CD41a 양성 세포의 수를 측정한 결과이다.
도 18은 BMI1 유전자, c-MYC 유전자 및 BCL-xL 유전자의 강제 발현 해제의 전후에 있어서의 거핵구 세포와 혈소판에 대하여, 항CD42b 항체와 항41a 항체를 사용하여 플로우 사이토메트리를 행한 결과를 나타낸다.
도 19는 BMI1 유전자, c-MYC 유전자 및 BCL-xL 유전자의 강제 발현을 해제하고 나서 배양했을 때의 거핵구 세포의 모습(상단)과, 산생된 혈소판 수(하단)를 측정한 결과이다.
도 20은 HMGA2 및 RUNX1에 대한 siRNA 및 대조(각각, shHMGA2, shRUNX1 및 shSCRAMBLE라고 나타낸다)를 도입한 거핵구 세포에 있어서, BMI1 유전자, c-MYC 유전자 및 BCL-xL 유전자의 강제 발현을 해제하고 나서 SR-1 및/또는 ROCK 저해제를 첨가 또는 첨가하지 않고 배양했을 때의 거핵구 세포의 모습(상단)과, 단위 세포(1×105 세포)당 산생된 혈소판 수(하단)를 측정한 결과이다. 도면 중 SR-1은, SR-1의 첨가를 의미하고, ROCKi는 Y27632의 첨가를 의미한다.
도 21은 HMGA2 및 RUNX1에 대한 siRNA 및 대조(각각, shHMGA2, shRUNX1 및 shSCRAMBLE라고 나타낸다)를 도입한 거핵구 세포에 있어서, BMI1 유전자, c-MYC 유전자 및 BCL-xL 유전자의 강제 발현을 해제하고 나서 SR-1 및 ROCK 저해제를 첨가하여 배양했을 때의 거핵구 세포의 전자 현미경상이다. 도면 중 하단은, 상단의 확대도를 나타낸다.
(제1 형태)
제1 형태에 있어서, 본 발명은 하나 또는 복수의 방향족 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR) 안타고니스트와 하나 또는 복수의 ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase) 저해제를 포함하는 혈소판 산생 촉진제를 제공한다. 다른 형태에 있어서, 본 발명은 또한 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포와 상기 혈소판 산생 촉진제를 접촉시키는 공정을 포함하는, 혈소판의 제조 방법을 제공한다.
본 명세서에 있어서 「거핵구 세포」란, 생체 내에서는 골수 중에 존재하는 최대의 세포이며, 혈소판을 방출하는 것을 특징으로 한다. 또한, 거핵구 세포는 세포 표면 마커 CD41a, CD42a 및 CD42b 양성으로 특징지어지고, 이외에도, CD9, CD61, CD62p, CD42c, CD42d, CD49f, CD51, CD110, CD123, CD131 및 CD203c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마커를 더욱 발현하고 있는 경우도 있다. 거핵구 세포는, 다핵화(다배체화)되면, 통상의 세포의 16 내지 32배의 게놈을 갖지만, 본 명세서에 있어서, 간단히 거핵구 세포라고 하는 경우, 상기한 특징을 갖추고 있는 한, 다핵화된 거핵구 세포와 다핵화 전의 거핵구 세포의 양쪽을 포함한다. 「다핵화 전의 거핵구 세포」는, 「미숙한 거핵구 세포」, 또는 「증식기의 거핵구 세포」와도 동의이다.
거핵구 세포는, 공지된 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 거핵구 세포의 제조 방법의 비한정적인 예로서, 국제 공개 제2011/034073호에 기재된 방법을 들 수 있다. 동 방법에서는, 「거핵구 세포보다 미분화된 세포」, 즉 거핵구 전구 세포(본건 명세서에 있어서는 간단히 「전구 세포」라고도 한다)에 있어서, 암 유전자와 폴리콤 유전자를 강제 발현시킴으로써, 무한히 증식하는 불사화 거핵구 세포주를 얻을 수 있다. 또한, 국제 공개 제2012/157586호에 기재된 방법에 따라, 「거핵구 세포보다 미분화된 세포」에 있어서, 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시킴으로써도, 불사화 거핵구 세포를 얻을 수 있다. 이들 불사화 거핵구 세포는, 유전자의 강제 발현을 해제함으로써, 다핵화가 진행되어, 혈소판을 방출하게 된다.
거핵구 세포를 얻기 위하여, 상기한 문헌에 기재된 방법을 조합해도 된다. 그 경우, 암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자의 강제 발현은, 동시에 행해도 되고, 순차 행해도 된다. 예를 들어, 암 유전자와 폴리콤 유전자를 강제 발현시키고, 당해 강제 발현을 억제하고, 다음에 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시키고, 당해 강제 발현을 억제하여, 다핵화 거핵구 세포를 얻어도 된다. 또한, 암 유전자와 폴리콤 유전자와 아포토시스 억제 유전자를 동시에 강제 발현시키고, 당해 강제 발현을 동시에 억제하여, 다핵화 거핵구 세포를 얻을 수도 있다. 먼저, 암 유전자와 폴리콤 유전자를 강제 발현시키고, 계속하여 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시키고, 당해 강제 발현을 동시에 억제하여, 다핵화 거핵구 세포를 얻을 수도 있다.
본 명세서에 있어서 「거핵구 세포보다 미분화된 세포」 또는 「거핵구 전구 세포」란, 거핵구에 대한 분화능을 갖는 세포이며, 조혈 줄기 세포계부터 거핵구 세포에 이르는 다양한 분화 단계의 세포를 의미한다. 거핵구보다 미분화된 세포의 비한정적인 예로서는, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, CD34 양성 세포, 거핵구·적아구계 전구 세포(MEP)를 들 수 있다. 이들 세포는, 예를 들어 골수, 제대혈, 말초혈로부터 단리되어 얻을 수도 있고, 또한 보다 미분화된 세포인 ES 세포, iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도하여 얻을 수도 있다.
본 명세서에 있어서 「암 유전자」란, 생체 내에서 세포의 암화를 유도하는 유전자를 의미하고, 예를 들어 MYC 패밀리 유전자(예를 들어, c-MYC, N-MYC, L-MYC), SRC 패밀리 유전자, RAS 패밀리 유전자, RAF 패밀리 유전자, c-Kit, PDGFR, Abl 등의 프로테인 키나아제 패밀리 유전자를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「폴리콤 유전자」란, CDKN2a(INK4a/ARF) 유전자를 부(-)로 제어하여, 세포 노화를 회피하기 위하여 기능하는 유전자로서 알려져 있다(Okura et al., 재생 의료 vol.6, No.4, pp26-32; Jseus et al., Jseus et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7, pp667-677, 2006; Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.100, pp211-216, 2003). 폴리콤 유전자의 비한정적인 예로서, BMI1, Mel18, Ring1a/b, Phc1/2/3, Cbx2/4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HADC, D㎚t1/3a/3b를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「아포토시스 억제 유전자」란, 세포의 아포토시스를 억제하는 기능을 갖는 유전자를 의미하고, 예를 들어 BCL2 유전자, BCL-xL 유전자, 서바이빈(Survivin) 유전자, MCL1 유전자 등을 들 수 있다.
유전자의 강제 발현 및 강제 발현의 해제는, 국제 공개 제2011/034073호, 국제 공개 제2012/157586호, 국제 공개 제2014/123242 또는 문헌 [Nakamura S et al, Cell Stem Cell. 14, 535-548, 2014]에 기재된 방법, 그 밖의 공지된 방법 또는 거기에 준하는 방법으로 행할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「방향족 탄화수소 수용체(AhR)」란, Per/ARNT/SIM(PAS)패밀리에 속하는 전사 인자이다. AhR은 리간드가 결합되어 있지 않은 상태에서는 불활성이며, 방향족 탄화수소 화합물이 리간드로서 결합하면 핵 내로 이행한다. 핵 내에서 ARNT(AhR Nuclear Translocator)라고 불리는 분자와 헤테로 2량체를 형성하고, DNA 상의 이물 응답 서열(Xenobiotic response element; XRE)에 결합함으로써, 전사를 활성화한다.
본 명세서에 있어서 「AhR 안타고니스트」란, AhR에 아고니스트가 결합되었을 때에 발생하는 반응의 적어도 하나의 전부 또는 일부를 저해하는 물질을 의미한다. AhR 안타고니스트는, AhR에 직접 작용하는 것이어도 되고, 혹은 별도의 물질에 대한 작용을 통하여 AhR에 간접적으로 작용하는 것이어도 된다.
본 명세서에 있어서 「AhR 아고니스트」란, AhR에 그 중 내인성의 리간드가 결합된 경우에 야기되는 반응의 적어도 하나를 야기하는 물질을 의미한다. AhR 아고니스트는, AhR에 직접 작용하는 것이어도 되고, 혹은, 별도의 물질에 대한 작용을 통하여 AhR에 간접적으로 작용하는 것이어도 된다.
여기서 「AhR에 작용하는 물질」에는, 저분자 화합물, 고분자 화합물, 항체나 그 프래그먼트 등의 단백질, 펩티드 및 핵산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 AhR 안타고니스트의 비한정적인 예는 이하를 포함한다.
·4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6-일아미노)에틸)페놀(SR-1);
·α나프토플라본
·1,4-디히드록시안트라퀴논
·1,5-디히드록시안트라퀴논
·1,8-디히드록시안트라퀴논
·갈랑긴(galangin)
·레스베라트롤
·2-메틸-2H-피라졸-3-카르복실산(2-메틸-4-o-톨릴라조-페닐)-아미드(CH-223191);
·N-[2-(3H-인돌-3-일)에틸]-9-이소프로필-2-(5-메틸-3-피리딜)퓨린-6-아민(GNF-351);
·2-(29-아미노-39-메톡시페닐)-옥사나프탈렌-4-온(PD98059);
·(Z)-3-[(2,4-디메틸피롤-5-일)메틸리데닐]-2-인돌리논(TSU-16);
·2-(29-아미노-39-메톡시페닐)-옥사나프탈렌-4-온(PD98059); 및
·6,2',4'-트리메톡시플라본(TMF)
·3',4'-디메톡시플라본(DMF)
피더 프리 조건 하에서 거핵구를 배양하고, 나아가서는 혈소판의 산생수를 증대하고, 그리고/혹은 기능을 개선하는 관점에서, AhR은 SR-1, GNF-351, CH-223191, TMF, DMF가 바람직하고, SR-1, GNF-351 및 CH-223191이 보다 바람직하고, GNF-351 및 SR-1이 보다 더욱 바람직하다. GNF-351은 SR-1이나 CH-223191보다도 보다 저농도이고 동등 이상의 효과를 발휘하기 때문에 특히 바람직하다. 원하는 효과가 손상되지 않는 한, AhR 안타고니스트는 복수의 것을 병용할 수 있다.
상기한 예 외에도, 국제 공개 제2012/015914호에 AhR 안타고니스트로서 기재되어 있는 화합물을 본 발명에 사용할 수도 있다.
거핵구 세포와의 접촉 공정에 있어서, AhR 안타고니스트의 농도는 특별히 한정되지 않고 당업자가 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어, 배지 중의 AhR 안타고니스트의 농도를, SR-1을 사용하는 경우, 200nM 이상 1000mM 미만, CH-223191의 경우, 0.2μM 이상 4μM 미만, GNF-351을 사용하는 경우, 20nM 이상 300nM 미만, TMF를 사용하는 경우, 2.5μM 이상 40μM 미만, DMF를 사용하는 경우, 2.5μM 이상 40μM 미만의 범위로 하면, 얻어지는 혈소판의 수나 기능을 보다 높일 수 있지만, 이 범위 밖의 양이어도 된다.
「거핵구 세포보다 미분화된 세포에 있어서, 암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 적어도 하나를 강제 발현한 후, 당해 강제 발현을 해제한 세포」를 사용하는 경우, 강제 발현의 기간도 특별히 한정되지 않고 당업자가 적절히 결정할 수 있다.
또한, 강제 발현 후에, 세포를 계대 배양해도 되고, 마지막 계대부터 강제 발현을 해제하는 날까지의 기간도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1일간, 2일간 또는 3일간 이상으로 해도 된다.
혈소판의 산생량 및/또는 기능이 항진하는 한, AhR 안타고니스트를 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포에 접촉시키는 타이밍은 특별히 한정되지 않지만, 거핵구는 적어도 다핵화되어 있는, 성숙 초기 단계의 것이 바람직하다.
거핵구보다 미분화된 세포에 있어서, 암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜 불사화 거핵구 세포를 제작하고, 그 후 강제 발현을 해제하여 불사화 거핵구 세포의 다핵화를 진행하는 경우에는, 강제 발현의 해제 후, 배지에 AhR 안타고니스트를 첨가하는 것이 바람직하다.
거핵구 세포와 AhR 안타고니스트를 접촉하는 기간은 특별히 한정되지 않는다. 상기 강제 발현의 해제 후에 AhR 안타고니스트를 배지에 첨가하는 경우, AhR 안타고니스트를 배지에 첨가하여 3일째경부터 서서히 기능적인 혈소판이 방출되게 되고, 수는 배양 일수에 수반하여 늘어난다. AhR 안타고니스트로서 SR-1을 첨가한 경우, 5일간 배양하면 특히 기능이 높은 혈소판을 얻어지는 경향이 있지만, 기능적인 혈소판이 얻어지는 한 배양 일수는 그것보다 짧아도 길어도 된다.
거핵구 세포에 있어서의 상기 유전자의 강제 발현 해제 후, AhR 안타고니스트를 배지에 첨가할 때까지의 기간도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1일, 2일, 또는 3일 이내에 AhR 안타고니스트 존재 하에서의 배양을 개시해도 된다. AhR 안타고니스트는 배양 기간 중 1회 이상 추가로 배지에 첨가해도 된다.
거핵구 세포는 AhR 안타고니스트 외에도, ROCK 저해제와 접촉될 수 있다. AhR 안타고니스트와 ROCK 저해제를 병용함으로써, 산생되는 혈소판의 수나 기능을 현저하게 항진할 수 있다. 특히, 혈소판 산생 촉진 효과에 대해서는, AhR 안타고니스트와 ROCK 저해제는 각각을 단독으로 사용한 경우와 비교하여 상승 효과를 발휘한다. 본 명세서에 있어서 「ROCK 저해제」란, Rho 결합 키나아제(Rho-associated coiled-coil forming kinase; ROCK)의 안타고니스트를 의미한다. ROCK 저해제로서는, 예를 들어 Y27632, Y39983, 파수딜 염산염, 리파수딜, SLX-2119, RKI-1447, 아자인돌 1, SR-3677, 스타우로스포린, H1152 디히드로클로라이드, AR-12286, INS-117548 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 원하는 효과가 손상되지 않는 한, ROCK 저해제는 복수의 것을 병용할 수 있다.
피더 프리 조건 하에서 거핵구를 배양하고, 나아가서는 혈소판의 산생수를 증대시키고, 그리고/혹은 기능을 개선하는 관점에서, ROCK 저해제는 Y27632, Y39983, 파수딜 염산염, 리파수딜이 바람직하고, Y39983이 보다 바람직하다. 혈소판의 산생량 및/또는 기능이 항진하는 한, ROCK 저해제를 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포에 접촉시키는 타이밍은 특별히 한정되지 않지만, 거핵구는 적어도 다핵화되어 있는 것이 바람직하다.
후술하는 실시예에 나타내는 대로, 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 AhR 안타고니스트 및 ROCK 저해제와 접촉시키면, 피더 프리 조건 하에서도, 얻어지는 혈소판의 산생수가 촉진되고, 또한 그의 기능도 향상된다. 특히 주목해야 할 것은, AhR 안타고니스트와 ROCK 저해제는, 각 약제를 단독으로 사용한 경우와 비교하여, 혈소판 산생 촉진 효과에 대하여 상승적으로 작용한다는 점이다. AhR 안타고니스트와 ROCK 저해제의 조합은 특별히 한정되지 않지만, SR-1, GNF-351 및 CH-223191로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 AhR 안타고니스트와, Y27632, Y39983, 파수딜 염산염 및 리파수딜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 ROCK 저해제의 조합은, 혈소판의 수나 기능을 현저하게 증대시키므로 바람직하다. 그 중에서도, SR-1 및/또는 GNF-351과, Y27632 및/또는 Y39983의 조합이 보다 바람직하다. 특히 GNF-351과 Y39983의 조합을 사용한 경우, 기능성이 있는 혈소판의 산생량이 현저하게 증대되었다(데이터는 나타내지 않음). AhR 안타고니스트와 ROCK 저해제는, 동시에 첨가해도 되고, 어느 것을 먼저 첨가해도 된다.
「혈소판」은 혈액 중의 세포 성분의 하나이며, 본 명세서에 있어서는 CD41a 양성 및 CD42b 양성으로 특징지어진다. 혈소판은, 혈전 형성과 지혈에 있어서 중요한 역할을 함과 함께, 손상 후의 조직 재생이나 염증의 병태 생리에도 관여한다. 출혈 등에 의해 혈소판이 활성화되면, 그 막 위에 인테그린(Integrin) αⅡBβ3(당단백질 Ⅱb/Ⅲa; CD41a와 CD61의 복합체) 등의 세포 접착 인자의 수용체가 발현된다. 그 결과, 혈소판끼리 응집되어, 혈소판으로부터 방출되는 각종 혈액 응고 인자에 의해 피브린이 응고됨으로써, 혈전이 형성되어, 지혈이 진행된다.
본 명세서에서 사용하는 경우, 혈소판의 「기능」이란 당업계에서 알려져 있기는 하지만, 예를 들어 생체에 있어서의 순환능, 혈전 형성능, 지혈능 등을 가리킨다. 본 명세서에 있어서 「기능성이 높다」, 「혈소판의 기능이 높다」 또는 「활성화되었다」라는 표현 또는 이들에 유사한 표현은, AhR 안타고니스트나 ROCK 저해제를 사용하지 않는 종래의 방법으로 얻어진 혈소판 또는 생체로부터 단리된 혈소판과 비교하여, 후술하는 방법의 적어도 하나로 측정한 혈소판의 기능(혹은 생리 활성)이 동등 이상, 바람직하게는 유의미하게 높거나, 혹은 형상 혈소판이 동등 이하, 바람직하게는 유의미하게 적은 것을 의미한다. 혹은, 차가 유의하지 않아도 기능이 개선되어 있는 경향이 있다고 당업자가 판단할 수 있는 상태를 지명한다.
혹은, 본 명세서에 있어서 「기능성이 높은 혈소판」, 「혈소판의 기능이 높다」 또는 「활성화되었다」 등의 표현은, 후술하는 방법의 적어도 하나로 측정한 혈소판의 기능이, AhR 안타고니스트나 ROCK 저해제를 사용하지 않는 종래의 방법으로 얻어진 혈소판이나 생체로부터 단리된 천연의 혈소판 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 또는 90％ 이상임을 의미한다.
상술한 혈소판의 기능은, 공지된 방법에 의해 측정하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 혈소판막 위에 존재하는 활성화 마커 인테그린 αⅡBβ3(당단백질 Ⅱb/Ⅲa; CD41a와 CD61의 복합체)에 특이적으로 결합하는 항체인 PAC-1 항체를 사용하여, 활성화된 혈소판량을 측정할 수 있다. 또한, 마찬가지로 혈소판의 활성화 마커인 CD62b(P-셀렉틴(selectin))를 항체로 검출하여 활성화된 혈소판량을 측정해도 된다. 혈소판량의 측정은, 예를 들어 플로우 사이토메트리를 사용하여, 활성화 비의존성의 혈소판 마커 CD61 또는 CD41에 대한 항체로 게이팅을 행하고, 그 후 혈소판에 대한 PAC-1 항체나 항CD62P 항체의 결합을 검출함으로써 행할 수 있다. 이들 공정은, 아데노신이인산(ADP) 존재 하에서 행해도 된다.
또한, 혈소판의 기능의 평가는, ADP 존재 하에서 피브리노겐과 결합하는지 여부를 보아 행할 수도 있다. 혈소판이 피브리노겐과 결합함으로써, 혈전 형성의 초기에 필요한 인테그린의 활성화가 발생한다. 또한, 혈소판의 기능의 평가는, 국제 공개 제2011/034073호의 도 6에 도시된 바와 같이, 생체 내에서의 혈전 형성능을 가시화하여 관찰하는 방법으로 행할 수도 있다.
혈소판의 생체 내에 있어서의 순환능의 평가는 통상법에 따라 행할 수 있다. 보다 구체적으로는, γ선 조사(2.4Gy)에 의해 유발된 혈소판 감소증 모델 NOG 마우스에 혈소판을 2×108 혈소판/마리로 미정맥 내 투여한 후에, 일정 간격으로 경정맥으로부터 채혈한 혈액 중의 인간 유래 혈소판을 항인간 CD41 항체를 사용하여 정량함으로써 혈소판의 순환능을 평가할 수 있다.
혈소판의 지혈능의 평가는 통상법에 따라 행할 수 있다. 보다 구체적으로는, γ선 조사(2.4Gy)에 의해 유발된 혈소판 감소증 모델 NOG 마우스에 혈소판을 2×108 혈소판/마리로 미정맥 내 투여한 후에, 마취 하(우레탄, 1.5g/㎏)에서 28G의 주사 바늘을 사용하여 미동맥(선단으로부터 2㎝)에 천자하고, 꼬리의 선단을 37℃로 보온해 둔 PBS에 침지하면서 지혈될 때까지의 시간을 측정함으로써, 지혈능을 평가할 수 있다.
한편, 혈소판의 CD42b의 발현율이 낮은 경우나, 아넥신 V 양성률이 높은 경우는, 혈소판이 열화 또는 이상하다고 평가된다. 이들 혈소판은, 혈전 형성이나 지혈 기능을 충분히 갖지 않아, 임상적으로 유용하지 않다.
본 명세서에 있어서 「혈소판의 열화」란, 혈소판 표면의 CD42b(GPIbα)가 감소됨을 의미한다. 따라서, 열화된 혈소판에는 CD42b의 발현이 저하된 혈소판이나, 쉐딩 반응에 의해 CD42b의 세포 외 영역이 절단된 혈소판이 포함된다. 혈소판 표면의 CD42b가 없어지면, 본·윌브랜드 인자(von Willebrand factor: VWF)와의 회합을 할 수 없게 되어, 결과적으로 혈소판의 혈액 응고 기능이 상실된다. 혈소판의 열화는, 혈소판 분획 중의 CD42b 양성률(또는 CD42b 양성 입자수)에 대한 CD42b 음성율(또는 CD42b 음성 입자수)을 지표로 하여 평가할 수 있다. CD42b 양성률에 대한 CD42b 음성율이 높을수록, 또는 CD42b 양성 입자수에 대한 CD42b 음성 입자수가 많을수록, 혈소판은 열화되고 있다. CD42b 양성률이란, 혈소판 분획에 포함되는 혈소판 중 항CD42b 항체를 결합할 수 있는 혈소판의 비율을 의미하고, CD42b 음성율이란, 혈소판 분획에 포함되는 혈소판 중 항CD42b 항체가 결합되지 않는 혈소판의 비율을 의미한다.
본 명세서에 있어서 「이상한 혈소판」이란, 음성 전하 인지질인 포스파티딜세린이 지질 이중층의 내측으로부터 외측으로 노출된 혈소판을 의미한다. 생체 내에서는, 포스파티딜세린은 혈소판의 활성화에 수반하여 표면에 노출되고, 거기에 많은 혈액 응고 인자가 결합됨으로써, 혈액 응고 캐스케이드 반응이 증폭됨이 알려져 있다. 한편, 이상한 혈소판에서는, 항상 많은 포스파티딜세린이 표면에 노출되어 있으며, 이러한 혈소판이 환자에게 투여되면, 과잉의 혈액 응고 반응을 야기하여, 파종성 혈관 내 응고 증후군 등의 위독한 병태로 연결될 가능성이 있다. 포스파티딜세린에는 아넥신 V가 결합되므로, 혈소판 표면 위의 포스파티딜세린은, 형광 표식한 아넥신 V의 결합량을 지표로 하여 플로우 사이토메트리를 사용하여 검출할 수 있다. 따라서, 이상한 혈소판의 양은, 혈소판 분획 중의 아넥신 V 양성률, 즉 아넥신이 결합하는 혈소판의 비율 또는 수로 평가할 수 있다. 아넥신 V 양성률이 높을수록, 또는 아넥신 V 입자수가 많을수록, 이상한 혈소판이 많다.
또한, 혈소판의 기능의 평가는, ADP 존재 하에서 피브리노겐과 결합하는지 여부를 보아 행할 수도 있다. 혈소판이 피브리노겐과 결합함으로써, 혈전 형성의 초기에 필요한 인테그린의 활성화가 발생한다.
또한, 혈소판의 평가는, 국제 공개 제2011/034073호의 도 6에 도시된 바와 같이, 생체 내에서의 혈전 형성능을 가시화하여 관찰하는 방법으로 행할 수도 있다.
거핵구보다 미분화된 세포에 있어서, 암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜 불사화 거핵구 세포를 제작하고, 그 후 강제 발현을 해제하여 불사화 거핵구 세포의 다핵화를 진행하는 경우에는, 강제 발현의 해제 후, 배지에 ROCK 저해제를 첨가하는 것이 바람직하다.
(제2 형태)
제2 형태에 있어서, 본 발명은 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포에 있어서의 HMGA(고이동성 군 At-후크 단백질) 단백질의 발현 또는 기능을 억제하는 공정을 포함하는 혈소판의 제조 방법을 제공한다.
고이동성 군 At-후크 단백질(또는 고이동성 군 A(HMGA)) 단백질은, 주로 AT를 많이 포함하는 DNA에 결합하는 비히스톤성의 크로마틴 단백질이며, HMGA1과 HMGA2가 알려져 있다. 본 명세서에서 사용하는 경우, HMGA2가 특히 바람직하다. 인간 HMGA2 단백질은 NCBI 참조 서열(Reference Sequence): NP_001287847.1이라고도 불린다.
본 명세서에 있어서 「단백질의 발현」이라는 용어는, 전사 및 번역을 포함하는 개념으로 사용되고, 「발현을 억제한다」는 경우, 전사 레벨 또는 번역 레벨로 발현의 전부 또는 일부를 억제함을 의미한다.
HMGA 단백질의 발현 또는 기능을 억제하는 공정은, 공지된 방법 또는 거기에 준하는 방법을 사용하여 행할 수 있다.
또한, HMGA 단백질의 기능을 저해하는 방법으로서, 우성 음성법을 사용해도 된다. 우성 음성법은, 변이를 도입하여 활성을 저하 또는 상실시킨 HMGA 단백질을 세포 내에서 대량으로 발현시키고, 세포 내의 정상 HMGA 단백질에 대한 불활성의HMGA 단백질의 비율을 압도적으로 높여, 결과적으로 HMGA 단백질의 기능을 얻지 못하게 된 거동을 나타내는 세포를 얻는 방법이다.
HMGA 단백질의 기능을 저해하는 방법으로서는, 항HMGA 항체를 사용해도 된다. 항HMGA 항체로서는, 공지된 방법으로 제조하거나, 또는 시판되고 있는 항체를 사용할 수 있어, HMGA 단백질의 기능을 억제하는 것을 통하여 본 발명의 효과가 얻어지는 한, 어떤 항체여도 좋다.
HMGA 단백질의 발현을 억제하는 방법으로서는, 예를 들어 HMGA 유전자의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 miRNA를 사용하는 방법을 들 수 있다. miRNA는, HMGA 유전자에 직접 작용하는 것이어도 되고, 간접적으로 작용하는 것이어도 된다. 예를 들어, 이 방법은 let-7이라고 불리는 miRNA를 사용함으로써 행할 수 있다. 본 발명에 있어서, let-7은, 예를 들어 인간의 경우, hsa-let-7a-1, hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d, hsa-let-7e, hsa-let-7f-1, hsa-let-7f-2, hsa-let-7g 및 hsa-let-7i로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA이지만, 다른 동물종의 let-7을 사용하는 것이 가능하다. let-7의 서열 등은, 데이터베이스의 정보(예를 들어, http://www.mirbase.org/ 또는 http://www.microrna.org/)에 등록된 정보로부터 적절히 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직한 let-7은 hsa-let-7b이다.
또한, HMGA2 단백질의 발현을 억제하는 방법으로서, let-7의 발현을 부(-)로 제어하는 Lin28b의 발현을 억제하는 miRNA를 사용함으로써도 행할 수 있다. 이러한 miRNA로서는, 예를 들어 miR181a를 들 수 있다. miR181a는, 예를 들어 인간의 경우, hsa-mir-213, hsa-mir-181a-1 및 hsa-mir-181a-2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA이지만, 다른 동물종의 miR181a를 사용하는 것이 가능하다. miR181a의 서열 등은, 상기와 마찬가지의 데이터베이스의 정보로부터 적절히 얻을 수 있다.
「miRNA」란, mRNA로부터 단백질로의 번역의 저해나 mRNA의 분해를 통하여, 유전자의 발현 조절에 관여하는, 세포 내에 존재하는 단쇄(20-25 염기)의 논코딩RNA이다. 이 miRNA는, miRNA와 그의 상보쇄를 포함하는 헤어핀 루프 구조를 취하는 것이 가능한, 단일쇄인 점이 다른 pri-miRNA로서 전사되고, 핵 내에 있는 드로샤(Drosha)라고 불리는 효소에 의해 일부가 절단되어 pre-miRNA가 되어 핵외로 수송된 후, 재차 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 기능한다. 따라서, 본 발명에 있어서 사용되는 let-7 또는 miR181a는, 단일쇄의 pri-miRNA여도 되고, 이중쇄의 pre-miRNA의 형태여도 된다.
HMGA 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 안티센스법, 리보자임법, RNAi법 등을 사용해도 된다.
안티센스법은, 표적 유전자(기본적으로는 전사 산물인 mRNA)에 상보적인 염기 서열을 갖고, 일반적으로는 10염기 길이 내지 100염기 길이, 바람직하게는 15염기 길이 내지 30염기 길이의 단일쇄 핵산을 사용하여 유전자의 발현을 억제하는 방법이다. 안티센스 핵산을 세포 내에 도입하고, 표적 유전자에 하이브리다이즈시킴으로써 유전자의 발현이 저해된다. 안티센스 핵산은, 표적 유전자의 발현 저해 효과가 얻어지는 한, 표적 유전자와 완전히 상보적이지 않아도 된다. 안티센스 핵산은, 공지된 소프트웨어 등을 사용하여 당업자가 적절히 설계할 수 있다. 안티센스 핵산은, DNA, RNA, DNA-RNA 키메라의 어느 것이어도 되고, 또한 수식되어 있어도 된다.
리보자임은, 표적 RNA를 촉매적으로 가수분해하는 핵산 분자이며, 표적 RNA와 상보적인 서열을 갖는 안티센스 영역과, 절단 반응을 담당하는 촉매 중심 영역으로 구성되어 있다. 리보자임은 당업자가 공지된 방법에 따라 적절히 설계할 수 있다. 리보자임은 일반적으로는 RNA 분자이지만, DNA-RNA 키메라형 분자를 사용할 수도 있다.
RNAi법은, 이중쇄 핵산에 의해 유도되는 서열 특이적인 유전자 발현 억제 기구이다. 표적 특이성이 매우 높고, 생체 내에 원래 존재하는 유전자 발현 억제 메커니즘을 이용하는 방법이므로 안전성이 높다.
RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산으로서는, 예를 들어 siRNA를 들 수 있다. siRNA는, 포유 동물 세포에 사용되는 경우, 통상 19 내지 30염기 정도, 바람직하게는 21염기 내지 25염기 정도의 이중쇄 RNA이다. RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산은, 일반적으로 그 한쪽이 표적 핵산의 일부와 상보적인 염기 서열을 갖고, 다른 쪽이 이것에 상보적인 서열을 갖는다. HMGA의 발현을 억제하는 siRNA는, 공지된 소프트웨어 등을 사용하여 당업자가 적절히 설계할 수 있고, 이중쇄 핵산 서열의 한쪽으로서, 후술하는 실시예에서 사용한 표적 서열이 예시된다. HMGA의 발현을 억제하는 siRNA는, HMGA 유전자에 직접 작용하는 것(HMGA 유전자의 일부에 상보적인 서열을 포함하는 것)이어도, 간접적으로 작용하는 것(HMGA 유전자 이외의 유전자의 발현을 억제하여, 결과적으로 HMGA 유전자의 발현을 억제하는 것)이어도 된다.
let-7, miR181a, siRNA, 안티센스 핵산, 리보자임은, 각각을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 세포 내에 도입함으로써, 세포 내에서 발현시킬 수 있고, 이 밖에도 RNA의 형태로 세포에 도입할 수도 있다. RNA의 형태로 도입하는 경우, 예를 들어 리포펙션, 마이크로인젝션 등의 공지 방법에 의해 세포 내에 도입해도 되고, RNA의 분해를 억제하기 위하여, 5-메틸시티딘 및 슈도우리딘(pseudouridine)(트리링크 바이오테크놀로지스(TriLink Biotechnologies))을 도입시킨 RNA(Warren L, (2010) Cell Stem Cell.7:618-630) 또는 DNA를 도입시킨 DNA-RNA 키메라형을 사용해도 된다. 수식 염기의 위치는, 우리딘, 시티딘의 어떤 경우든, 독립적으로, 모두 혹은 일부로 할 수 있고, 일부인 경우에는 임의의 비율로 랜덤한 위치로 할 수 있다. let-7, miR181a 또는 siRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는, 이중쇄 각각을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 사용해도 되고, 이중쇄 핵산이 루프를 개재시켜 연결되어 있는 단일쇄 핵산을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 사용해도 된다. siRNA의 경우, 세포 내에서 전사에 의해 얻어지는 단일쇄 RNA는, 그의 상보적인 부분이 분자 내에서 하이브리다이즈되어, 헤어핀형의 구조를 취하도록 설계되어도 된다. 이러한 RNA는 shRNA(short hairpin RNA)라고 불린다. shRNA는 세포질로 이행하면 효소(다이서)에 의해 루프 부분이 절단되어, siRNA가 되어 RNAi 효과를 발휘한다.
본 명세서에 있어서, 단백질의 발현의 억제를 「siRNA에 의해 행한다」 또는 「miRNA에 의해 행한다」라는 경우, 최종적으로 siRNA 또는 miRNA가 발현을 억제함을 의미하고, 세포에 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 RNA의 형태로 투여해도 되고, siRNA, shRNA 또는 miRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 투여해도 된다.
let-7, miR181a, 혹은 HMGA에 대한 siRNA 또는 shRNA를 벡터 등으로 도입하는 경우, 당해 RNA의 발현은, 약제 응답성 프로모터에 의해 제어되어도 된다. 이러한 RNA를 약제 응답성으로 제어할 수 있는 벡터는, 예를 들어 다카라 바이오사로부터 입수할 수 있다. 이 경우, 당해 RNA를 도입한다는 것은, 대응하는 약제를 접촉시켜, 세포 내에서 RNA를 발현시킴을 의미한다.
실시예로부터 이해되는 바와 같이, 거핵구 세포의 다핵화 및 비대화라는 성숙화 과정에 유효하다는 관점에서, HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제는, 다핵화 전의 거핵구 세포에 있어서 행하여져도 되고, 다핵화된 거핵구 세포에 있어서 더 한층의 다핵화를 행한다는 관점에서, 다핵화된 거핵구 세포에 있어서 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제가 행하여져도 된다. 거핵구 세포의 다핵화 및 비대화가 촉진되어, 1세포당 혈소판 산생수가 비약적으로 증가하는 점에서, 거핵구 세포로부터 혈소판을 제조하는 공정에 있어서도 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제를 행하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의해 얻어지는 성숙 거핵구는 기능적인 혈소판을 효율적으로 산생할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 거핵구의 성숙이란, 거핵구가 충분히 다핵화되어, 기능적인 혈소판을 산생할 수 있음을 의미한다. 거핵구의 성숙은, 예를 들어 GATA1, p45 NF-E2, 베타1-튜불린(tubulin) 등의 거핵구 성숙 관련 유전자군의 발현의 상승, 혈소판 전구체의 형성, 세포 내의 다핵화에 의해서도 확인할 수 있다.
또한, 거핵구 세포보다 미분화된 세포에 있어서, 암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자를 강제 발현시켜 불사화 거핵구 세포를 제작하고, 그 후 강제 발현을 해제하여 불사화 거핵구 세포의 다핵화를 진행하는 경우, 상기한 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제의 개시는, 당해 유전자의 강제 발현 해제 전이든 해제 후든 특별히 한정되지 않지만, 적어도 강제 발현 해제 후에 있어서, HMGA 단백질의 발현 또는 기능이 억제되어 있는 것이 바람직하다. 당해 유전자의 강제 발현 해제 전에 HMGA 단백질의 발현 또는 기능을 억제함으로써, CD41a 양성 세포의 수, 즉 다핵화 전의 거핵구 세포의 수가 감소하는 경향이 있는 점에서, 다핵화 전의 거핵구 세포 수를 유지한다는 관점에서, 보다 바람직하게는 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제의 개시는, 당해 유전자의 강제 발현 해제 후이다.
(제3 형태)
제3 형태에 있어서, 본 발명은 AhR 안타고니스트 및/또는 ROCK 저해제의 존재 하에서 HMGA 단백질의 발현 또는 기능을 억제한 거핵구 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 성숙 거핵구의 제조 방법을 제공한다. 또한, 배양 공정은, 상술한 접촉 공정과 마찬가지로 행할 수 있다. 다른 형태에 있어서, 본 발명에 관한 성숙 거핵구의 제조 방법은 혈소판을 산생하는 공정을 포함해도 된다.
(배양 조건 등)
본 발명의 어느 형태에 있어서도, 거핵구 세포의 배양 조건은, 통상의 조건으로 할 수 있다. 예를 들어, 온도는 약 35℃ 내지 약 42℃, 약 36℃ 내지 약 40℃, 또는 약 37℃ 내지 약 39℃로 할 수 있고, 5％ CO2 및/또는 20％ O2로 해도 된다. 정치 배양이어도, 진탕 배양이어도 된다. 본 발명에 따르면, SR-1 등의 AhR 안타고니스트를 사용하는 경우에는 피더 프리 조건 하에서의 배양이 실현 가능해지기 때문에, 혈소판을 대량으로 제조하는 경우에는 진탕 배양이 바람직하다. 진탕 배양의 경우의 진탕 속도도 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 10rpm 내지 200rpm, 30rpm 내지 150rpm 등으로 할 수 있다.
본 발명에서는, 상술한 바와 같이 거핵구 세포를 배양함으로써, 거핵구 세포가 성숙하여, 그 세포질로부터 혈소판이 산생된다. 여기서, 거핵구 세포가 성숙된다는 것은, 거핵구 세포가 다핵화되어, 혈소판을 방출할 수 있게 됨을 의미한다.
거핵구 세포를 배양할 때의 배지는 특별히 한정되지 않고 거핵구 세포로부터 혈소판이 산생되는 데 적합한 공지된 배지나 그것에 준하는 배지를 적절히 사용할 수 있다. 예를 들어, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 제조할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어 IMDM 배지, 미디움(Medium) 199 배지, 이글 최소 필수 미디움(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM) 배지, αMEM 배지, 둘베코 변형 이글 미디움(Dulbe㏄o's modified Eagle's Medium)(DMEM) 배지, 햄(Ham's) F12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔(Fischer's) 배지, 뉴로바살 미디움(Neurobasal Medium)(라이프 테크놀로지스) 및 이들의 혼합 배지를 들 수 있다.
배지에는, 혈청 또는 혈장이 함유되어 있어도 되고, 혹은 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 배지는, 예를 들어 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 지방산, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 티올글리세롤, 모노티오글리세롤(MTG), 지질, 아미노산(예를 들어 L-글루타민), 아스코르브산, 헤파린, 비필수 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류, 사이토카인 등의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 사이토카인이란, 혈구계 분화를 촉진하는 단백질이며, 예를 들어 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF), 트롬보포이에틴(TPO), 각종 TPO 유사 작용 물질, 줄기 세포 인자(Stem Cell Factor)(SCF), ITS(인슐린-트랜스페린-셀레나이트)서플리먼트, ADAM 저해제 등이 예시된다. 본 발명에 있어서 바람직한 배지는, 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 세린, 티올글리세롤, 아스코르브산, TPO를 포함하는 IMDM 배지이다. SCF를 더 포함하고 있어도 되고, 헤파린을 더 포함하고 있어도 된다. 각각의 농도도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 TPO는, 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 또는 약 50ng/mL 내지 약 100ng/mL로 할 수 있고, SCF는, 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 또는 약 50ng/mL로 할 수 있고, 헤파린은, 약 10U/mL 내지 약 100U/mL, 또는 약 25U/mL로 할 수 있다. 포르볼에스테르(예를 들어, 포르볼-12-미리스타트-13-아세테이트; PMA)를 첨가해도 된다.
혈청을 사용하는 경우는 인간 혈청이 바람직하다. 또한, 혈청 대신 인간 혈장 등을 사용해도 된다. 본 발명에 관한 방법에 의하면, 이들 성분을 사용해도, 혈청을 사용했을 때와 동등한 혈소판이 얻어질 수 있다.
유전자의 강제 발현 및 그 해제를 위하여 테트-온(Tet-on)(등록 상표) 또는 테트-오프(Tet-off)(등록 상표) 시스템과 같은 약제 응답성의 유전자 발현 유도 시스템을 사용하는 경우, 강제 발현하는 공정에 있어서는, 대응하는 약제, 예를 들어 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 배지에 함유시키고, 이들을 배지로부터 제외함으로써 강제 발현을 억제해도 된다.
본 발명에 있어서의 거핵구 세포의 배양 공정은, 피더 세포 없이 실시할 수 있다. 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명에 관한 방법에 의하면, 피더 세포 없이 배양해도, 기능적인 혈소판을 얻을 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「피더 세포」란, 증식 또는 분화시키고자 하는 세포(목적 세포)의 배양에 필요한 환경을 정돈하기 위하여, 목적 세포와 공배양되는 세포를 의미한다. 피더 세포는, 목적 세포와 식별할 수 있는 세포인 한, 동종 유래의 세포도 이종 유래의 세포도 포함한다. 피더 세포는, 항생 물질이나 감마선에 의해 증식하지 않도록 처리한 세포여도, 처리되어 있지 않은 세포여도 된다.
본 발명은 본 발명에 관한 방법으로 제조한 혈소판도 포함한다. 본 발명에 관한 방법으로 제조된 혈소판은, 후술하는 실시예에 기재한 바와 같이, 종래법에 의해 생체 외에서 제조된 혈소판에 비교하여 개방 소관계의 발달이 진행되고 있고, 미토콘드리아도 확인할 수 있는 점에서, 형태학적으로 천연의 혈소판에 가깝다고 인정된다.
본 발명에 관한 혈소판 제제의 제조 방법은, 상술한 바와 같이 제조된 성숙 거핵구 세포에 혈소판을 산생시키는 공정, 임의로, 배양물로부터 혈소판이 풍부하게 존재하는 획분을 회수하는 공정 및 당해 혈소판 획분으로부터 혈소판 이외의 혈구계 세포 성분을 제거하는 공정을 포함한다. 혈구계 세포 성분을 제거하는 공정은, 백혈구 제거 필터(예를 들어, 테루모사제, 아사히 가세이 메디컬사제) 등을 사용하여, 거핵구 세포를 포함하는 혈소판 이외의 혈구계 세포 성분을 제거함으로써 행할 수 있다. 혈소판 제제의 보다 구체적인 제조 방법은, 예를 들어 국제 공개 제2011/034073호에 기재되어 있다.
본 발명에 관한 혈액 제재의 제조 방법은, 상술한 혈소판 제제를 제조하는 공정과, 당해 혈소판 제제를 다른 성분과 혼합하는 공정을 포함한다. 다른 성분으로서는, 예를 들어 적혈구 세포를 들 수 있다.
혈소판 제제 및 혈액 제재에는, 그 밖에, 세포의 안정화에 이바지하는 다른 성분을 첨가해도 된다.
또한, 본 발명은 다핵화된 거핵구 세포와, AhR 안타고니스트와, 배지를 포함하는 조성물도 포함한다. 본 조성물은, 그대로 배양함으로써 기능성이 높은 혈소판을 얻을 수 있고, 동결 보존할 수도 있다. 특히 동결 보존하는 경우, 당해 조성물에는, 동결 시에 세포를 보호하는 DMSO, 글리세롤, 시판되고 있는 세포 동결용 시약 등이 포함되어 있어도 된다. 동결된 조성물을 해동하여 배양함으로써, 기능성이 높은 혈소판을 얻을 수 있다.
본 명세서에 있어서 인용되는 모든 특허문헌 및 비특허문헌의 개시는, 전체적으로 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
실시예 1
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 구체적으로 설명하겠지만, 본 발명은 전혀 이것에 한정되는 것은 아니다. 당업자는, 본 발명의 의의를 일탈하지 않고 다양한 형태로 본 발명을 변경할 수 있으며, 이러한 변경도 본 발명의 범위에 포함된다.
1. 불사화 거핵구 세포의 제작
1-1. iPS 세포로부터의 조혈 전구 세포의 제조
인간 iPS 세포(TKDN SeV2: 센다이 바이러스를 사용하여 수립된 인간 태아 피부 섬유아 세포 유래 iPS 세포)로부터, 문헌 [Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830(2010)]에 기재된 방법에 따라, 혈구 세포에 대한 분화 배양을 실시했다. 즉, 인간 ES/iPS 세포 콜로니를 20ng/mL VEGF(R&D SYSTEMS) 존재 하에서 C3H10T1/2 피더 세포와 14일간 공배양하여 조혈 전구 세포(Hematopoietic Progenitor Cells; HPC)를 제작했다. 배양 조건은 20％ O2, 5％ CO2로 실시했다(특별히 기재가 없는 한, 이하 동일한 조건).
1-2. 조혈 전구 세포에 대한 c- MYC 및 BMI1 바이러스 감염
미리 C3H10T1/2 피더 세포를 파종한 6웰 플레이트 위에 상기의 방법으로 얻어진 HPC를 5×104 세포/웰씩 파종하고, 렌티바이러스법으로 c-MYC 및 BMI1을 강제 발현된다. 이때, 세포주 1종류당 6웰씩 사용했다. 즉, 각각 MOI 20이 되도록 배지 중에 바이러스 입자를 첨가하고, 스핀 인펙션(32℃ 900rpm, 60분간 원심)으로 감염시켰다. 본 조작은 12시간 간격으로 2회 실시했다. 이때, 기본 배지(15％ 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)(GIBCO), 1％ 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(Penicillin-Streptomycin-Glutamine)(GIBCO), 1％ 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 솔루션(ITS-G)(GIBCO), 0.45mM 1-티오글리세롤(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 50㎍/mL L-아스코르브산(시그마-알드리치)를 함유하는 IMDM(이스코브 변형 둘베코 미디움(Iscove's Modified Dulbe㏄o's Medium)(시그마-알드리치))으로 50ng/mL 인간 트롬보포이에틴(TPO)(R&D SYSTEMS), 50ng/mL 인간 줄기 세포 인자(SCF)(R&D SYSTEMS) 및 2㎍/mL 독시사이클린(Dox)을 함유한 배지(이하, 분화 배지)에, 프로타민(Protamine)을 최종 농도 10㎍/mL 더 첨가한 것을 사용했다. 또한, 렌티바이러스 벡터는, 테트라사이클린 제어성의 유도성 벡터이며, LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(Kobayashi, T., et al. Cell 142, 787-799(2010))의 mOKS 카세트를 c-MYC, BMI1, BCL-xL에 재조합함으로써 제작되었다(각각, LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G, LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G 및 LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G). 감염에 사용한 바이러스 입자는, 293T 세포로 상기 렌티바이러스 벡터를 발현시켜 제작되었다.
1-3. 거핵구 자기 증식주의 제작 및 유지 배양
상기한 방법으로 cMYC 및 BMI1 바이러스 감염을 실시한 날을 감염 0일째로 하고, 이하와 같이 cMYC 및 BMI1 유전자 도입형 거핵구 세포를 배양함으로써, 거핵구 자기 증식주를 각각 제작했다.
·감염 2일째 내지 감염 11일째
피펫팅으로 상기한 방법으로 얻어진 바이러스 감염 완료 혈구 세포를 회수하고, 1200rpm, 5분간 원심 조작을 행하여 상청을 제거한 후, 새로운 분화 배지에서 현탁하여 새로운 C3H10T1/2 피더 세포 위에 파종했다(6웰 플레이트). 감염 9일째에 마찬가지의 조작을 함으로써 계대를 실시했다. 세포 수를 계측 후 1×105 세포/2mL/웰로 C3H10T1/2 피더 세포 위에 파종했다(6웰 플레이트).
·감염 12일째 내지 감염 13일째
감염 2일째와 마찬가지의 조작을 실시했다. 세포 수를 계측 후 3×105 세포/10mL/100㎜ 디쉬로 C3H10T1/2 피더 세포 위에 파종했다(100㎜ 디쉬).
·감염 14일째
바이러스 감염 완료 혈구 세포를 회수하고, 세포 1.0×105개당, 항인간 CD41a-APC 항체(바이오레전드(BioLegend)), 항인간 CD42b-PE 항체(이바이오사이언스(eBioscience)), 항인간 CD235ab-퍼시픽 블루(pacific blue)(바이오레전드) 항체를 각각 2μL, 1μL, 1μL씩을 사용하여 항체 반응했다. 반응 후에, FACS Verse(BD)를 사용하여 해석했다. 감염 14일째에 있어서, CD41a 양성률이 50％ 이상인 세포를 거핵구 자기 증식주로 했다.
1-4. 거핵구 자기 증식주에 대한 BCL - xL 바이러스 감염
상기 감염 14일째의 거핵구 자기 증식주에, 렌티바이러스법으로 BCL-xL을 유전자 도입했다. MOI 10이 되도록 배지 중에 바이러스 입자를 첨가하고, 스핀 인펙션(32℃ 900rpm, 60분간 원심)으로 감염시켰다.
1-5. 거핵구 불사화주의 제작 및 유지 배양
·감염 14일째 내지 감염 18일째
전술한 방법으로 얻어진 BCL-xL을 유전자 도입한 거핵구 자기 증식주를 회수하여, 1200rpm, 5분간 원심 조작을 행했다. 원심 후, 침전된 세포를 새로운 분화 배지에서 현탁한 후, 새로운 C3H10T1/2 피더 세포 위에 2×105 세포/2mL/웰로 파종했다(6웰 플레이트).
·감염 18일째: 계대
세포 수를 계측 후, 3×105 세포/10mL/100㎜ 디쉬로 파종했다.
·감염 24일째: 계대
세포 수를 계측 후, 1×105 세포/10mL/100㎜ 디쉬로 파종했다. 이후, 4-7일마다 계대를 행하여, 유지 배양을 행했다.
감염 24일째에 BCL-xL을 유전자 도입한 거핵구 자기 증식주를 회수하고, 세포 1.0×105개당, 항인간 CD41a-APC 항체(바이오레전드), 항인간 CD42b-PE 항체(이바이오사이언스), 항인간 CD235ab-퍼시픽 블루(Anti-CD235ab-PB; 바이오레전드) 항체를 각각 2μL, 1μL, 1μL씩을 사용하여 면역 염색한 후에 FACS Verse(BD)를 사용하여 해석하고, 감염 24일째에 있어서도, CD41a 양성률이 50％ 이상인 주를 거핵구 불사화주로 했다.
상기 BCL-xL을 유전자 도입한 거핵구 자기 증식주를 유지 배양한 결과, iPS 세포(692D2, 1108A2) 유래의 세포는, 감염 후 24일 이상 증식할 수 있었다. 이들 세포를, 거핵구 불사화 세포주(SeV2-MKCL)로 했다.
얻어진 SeV2-MKCL을, 10㎝ 디쉬(10mL/디쉬)로 정치 배양했다. 배지는, IMDM을 기본 배지로 하고, 이하의 성분을 첨가했다(농도는 최종 농도).
FBS(시그마 #172012 lot.12E261) 15％
L-글루타민(깁코(Gibco) #25030-081) 2mM
ITS(깁코 #41400-045) 100배 희석
MTG(모노티오글리세롤, 시그마 #M6145-25ML) 450μM
아스코르브산(시그마 #A4544) 50㎍/mL
푸로마이신(시그마 #P8833-100MG) 2㎍/mL
SCF(와코준야쿠 #193-15513) 50ng/mL
TPO 유사 작용 물질 200ng/mL
배양 조건은, 37℃, 5％ CO2로 했다.
BMI1 유전자, c-MYC 유전자 및 BCL-xL 유전자의 강제 발현은, 배지에 독시사이클린(클론테크(clontech) #631311) 1㎍/mL을 가함으로써 행했다.
2. SR-1 농도의 검토
1.의 방법으로 얻은 불사화 거핵구 세포주(SeV2-MKCL)를, PBS(-)로 두번 세정하고, 독시사이클린을 포함하지 않는 배지 중에서 배양함으로써 강제 발현을 해제했다. 배양은, 6웰 플레이트에 파종 밀도 1×105 세포/mL, 2mL/웰로 파종하고, 다음 배지 중에서 정치 배양했다.
배지는, IMDM을 기본 배지로 하고, 이하의 성분을 첨가했다(농도는 최종 농도).
FBS 15％
L-글루타민(깁코 #25030-081) 2mM
ITS(깁코 #41400-045) 100배 희석
MTG(모노티오글리세롤, 시그마 #M6145-25ML) 450μM
아스코르브산(시그마 #A4544) 50㎍/mL
SCF(와코준야쿠 #193-15513) 50ng/mL
TPO 유사 작용 물질 200ng/mL
ADAM 저해제 15μM
배양 조건은, 37℃, 5％ CO2로 했다.
동시에 SR-1을 도 1에 도시하는 농도로 첨가하고, 7일간 배양한 후, 혈소판의 수 및 기능을 측정했다. 측정 방법은 이하와 같다.
유전자 발현 OFF 배양 7일 후에 배양 상청을 1mL 피펫맨을 사용하여 완만하게 현탁했다. 배양액 200μL를 5mL 샘플 튜브에 분주하고, 이하의 항체로 염색을 행했다.
0.5μL 항CD42a 항체 PB 표지(이바이오사이언스 #48-0428-42)
0.5μL 항CD42b 항체 PE 표지(바이오레전드 #303906)
0.5μL 항CD62a 항체 APC 표지(바이오레전드 #304910)
10μL PAC-1 항체 FITC 표지(BD #304910)
혈소판의 자극은 최종 농도 0.2μM으로 PMA(포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, 시그마 #P1585-1MG), 또는 최종 농도 20uM으로 ADP(시그마 #A2754), 최종 농도 20μM으로 TRAP-6(트롬빈 수용체 활성화제 펩티드 6(Thrombin Receptor Activator Peptide 6), TFA 염, BACHEM #H8365), 최종 농도 1㎍/mL로 콜라겐(콜라겐 시약 HORM, 모리야 산교), 혹은 이들의 혼합물을 첨가하여 실온에서 반응시켰다.
반응 30분 후에 BD사 FACSverse로 측정을 실시했다. 측정 직전에 티로드 버퍼(Tyrode buffer) Ca+ 400μL를 첨가하고, 합계 600μL로 했다. 그 합계 600μL를 FACS 측정 샘플로 했다.
CD42a 양성 CD42b 양성의 입자수를 혈소판 수로 하고, 이 혈소판 획분에 있어서의 자극 전후의 PAC-1 및 CD62p의 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity; MFI)의 비를 산출했다.
결과를 도 1에 도시한다. SR-1을 첨가하면, PAC-1 및 항CD62p 항체가 결합되는 혈소판이 증가하여, SR-1 없는 경우보다도 기능이 높아짐이 확인되었다. 특히 PAC-1의 결과로부터, 이 후의 실험에서는 SR-1을 750nM으로 했다.
3. BMI1 유전자, c- MYC 유전자 및 BCL - xL 유전자의 강제 발현 기간의 검토
1.의 불사화 거핵구 세포의 제조에 있어서의 마지막 계대의 날부터, PBS(-)로 세정할 때까지의 기간을 1일, 2일 또는 3일로 하고, 강제 발현 종료 후, SR-1의 농도를 75nM 또는 750nM, 파종 밀도를 1×105 세포/mL로 하여, 2.와 마찬가지의 실험을 행했다.
결과를 도 2에 도시한다. 강제 발현 1일 내지 3일에, 혈소판 산생수에는 거의 차가 보이지 않았지만, 2일 이상 강제 발현을 행하는 편이, 기능이 높아지는 경향이 보였다.
4. 진탕 배양의 검토
6웰 플레이트 대신에, E125 플라스크에 파종 밀도 1×105 세포/mL, 25mL/플라스크로 파종하여 진탕 배양하는 것 이외에는, 2. 및 3.과 마찬가지의 실험을 행하여, SR-1의 농도와 불사화 거핵구 세포의 파종 밀도를 검토했다.
결과를 도 3 및 4에 도시한다. 정치 배양과 마찬가지의 결과가 얻어졌다.
5. SR-1 유사체의 검토
AhR 안타고니스트로서 SR-1의 유사체를 도면 중의 농도로 사용한 것 이외는, 2.와 마찬가지의 실험을 행했다.
결과를 도 5에 도시한다. 어느 AhR 안타고니스트를 첨가해도, 혈소판 산생수와 기능이 증대됨이 확인되었다. 또한, AhR 안타고니스트에 대하여, 더욱 상세하게 농도를 변경한 결과를 도 6a 및 도 6b에 도시한다.
6. AhR 안타고니스트와 ROCK 저해제의 공첨가 효과의 검토
SR-1(AhR 안타고니스트)과 Y27632(ROCK 저해제)의 공첨가 효과를 조사했다. 1.의 방법으로 얻은 불사화 거핵구 세포를, PBS(-)로 두번 세정하여 독시사이클린을 제거하여 강제 발현을 해제하고, 6웰 플레이트에 파종 밀도 1×105 세포/mL, 2mL/웰로 파종하여 정치 배양하고, E125 플라스크에 파종 밀도 1×105 세포/mL, 25mL/플라스크로 파종하여 진탕 배양했다.
배지는, IMDM을 기본 배지로서, 이하의 성분을 첨가했다(농도는 최종 농도).
FBS 15％
L-글루타민
ITS
MTG
아스코르브산
SCF 50ng/mL
TPO 유사 작용 물질 200ng/mL
SR-1 750nM
Y27632 10μM
배양 조건은, 37℃, 5％ CO2, 20％ O2로 했다. 상기 2.와 마찬가지의 방법으로, 혈소판 수와 PAC-1 양성 세포를 측정했다.
결과를 도 7 및 도 8에 도시한다. SR-1과 Y27632를 공첨가하면, 각각을 단독으로 첨가한 경우에 비교하여 혈소판 산생수와 기능이 상승적으로 높아짐이 확인되었다. 마찬가지로, SR-1과 다른 ROCK 저해제의 조합(예를 들어 Y39983, 파수딜 염산염, 리파수딜, SLX-2119, RKI-1447, 아자인돌 1, SR-3677)에 대해서도 마찬가지로 상승 효과가 확인되었다. Y27632를 상회하는 현저한 상승 효과를 나타낸 Y-39983의 결과를 도 9에 도시한다. 파수딜 염산염 및 리파수딜도 Y27632에 필적하는 상승 효과를 농도 의존적으로 나타냈다. 계속하여, Y27632와 다른 AhR 안타고니스트의 조합에 대해서도 혈소판 산생수 등을 검토한바, 모두 상승 효과가 확인되었다. SR-1을 상회하는 현저한 상승 효과를 나타낸 GNF-351 및 CH-223191의 결과를 도 10에 도시한다. 결과는 나타내지 않지만, GNF-351과 Y-39983의 조합은 특히 놀랍게도 현저한 효과를 발휘했다.
또한, 혈소판 산생수는 배양 일수에 수반하여 증대되었지만, PAC1 양성의 기능성 혈소판은, 첨가를 5일째경에 가장 많아지는 경향이 보였다.
7. FBS 대체물의 검토
인간 유래 성분으로 FBS를 대체할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 15％ FBS 대신에, 15％ 인간 유래 혈청(도면 중 인간 혈청; 정상 인간 혈청 풀(고진바이오 #12181201)) 또는 15％ 인간 유래 혈장(도면 중 인간 혈장; 정상 인간 혈장 풀·헤파린 처리(고진바이오 #12250210))을 사용한 것 이외는, 상기 2. 또는 6.과 마찬가지의 실험을 행했다.
결과를 도 11에 도시한다. FBS 대신에, 15％ 인간 혈청 또는 15％ 인간 혈장을 사용해도, 기능적인 혈소판이 얻어짐을 알 수 있다. 인간 혈청이나 인간 혈장을 사용하면, 이종 동물 성분을 배제할 수 있으므로, 보다 안전성이 높은 혈소판을 얻을 수 있다.
이어서, SR-1 및 Y27632 존재 하에서, 진탕 배양으로 한 것 이외는, 도 11과 동일 조건에서 실험을 행했다.
결과를 도 12에 도시한다. 정치 배양이 아니고 진탕 배양의 경우도, 15％ 인간 혈청 또는 15％ 인간 혈장을 사용하여 기능적인 혈소판이 얻어졌다. 진탕 배양에 의하면, 대량 배양·대량 생산이 가능해진다.
일반적으로, 혈청을 배지에 첨가하면 응고 반응을 발생시키므로 로트차가 나오기 쉬운 점에서, 배지 첨가물로서는 인간 혈청보다도 인간 혈장이 보다 바람직함이 알려져 있다. 그래서, 인간 혈장에 대하여, SR-1 및 Y27632 존재 하에서 진탕 배양을 행하여, 혈소판 산생량의 농도 의존성을 조사했다.
결과를 도 13에 도시한다. 혈소판 산생량에는, 어느 정도의 혈장 농도 의존성이 보이기는 했으나, 혈장 농도 1％까지 저하시켜도, 충분한 양의 기능적인 혈소판이 얻어짐이 확인되었다. 배지 중의 인간 혈장 농도를 저하시킬 수 있으면, 혈소판 제제의 생산 비용을 저감시키는 것이 가능하다.
계속하여, 인간 혈청의 농도도 저하시켜 마찬가지로 실험했다. 인간 혈장으로서는, 정상 인간 혈장 풀·시트르산(고진바이오 #12250110)을 사용하고, 인간 혈청으로서는, 정상 인간 혈청 풀(고진바이오 #12181201)을 사용하여, 정치 배양으로 했다.
결과를 도 14 및 15에 도시한다. 혈청 농도를 1％까지 저하시켜도, 충분한 양의 기능적인 혈소판이 얻어짐이 확인되었다.
8. HMGA2의 저해
상기 1.에서 제조한 불사화 거핵구 세포에, 바이러스 벡터에 의해 GFP가 있는 shRunx1, GFP가 있는 shHMGA2, GFP가 있는 shSCRAMBLE를 유전자 도입했다. 유전자 도입된 세포(GFP 양성 세포)를 소팅했다. 사용한 shRNA를 이하의 표 1에 나타낸다.
Figure 112018003547507-pct00001
실험 방법의 개략 및 결과를 도 16 및 17에 도시한다. HMGA2를 녹다운하면 CD41a 양성 세포의 수가 저하된 점에서, HMGA2는 증식기에 있는 다핵화 전의 거핵구 세포의 자기 복제에 있어서 필요한 인자임을 알 수 있다. 한편, Runx1은, 녹다운하면 CD41a 양성 세포가 증가된 점에서, 다핵화 전의 거핵구 세포의 증식을 약간 저해한다고 생각되었다.
이어서, 상기 1-5. 등에 기재된 방법으로, cMYC, BMI1 및 BCL-xL 유전자의 강제 발현을 해제하여, 혈소판의 산생을 측정했다. 결과를 도 18 및 19에 도시한다.
도시되는 바와 같이, 강제 발현 해제 전(ON MGK)에 비교하여 강제 발현 해제 후는 CD41a 양성 CD42b 양성의 거핵구 세포의 함유율이 증가되어(OFF MGK), CD41a 양성 CD42b 양성의 혈소판이 대량으로 산생되어 있음이 확인되었다. 도 19 상단에 도시한 바와 같이, HMGA2를 녹다운하면, 거핵구 세포의 다핵화가 현저하게 촉진되고, 하단에 도시한 바와 같이, 거핵구 세포에 있어서 1세포당 혈소판 수가 비약적으로 증가됨이 확인되었다.
9. HMGA2 저해, AhR 안타고니스트 및 ROCK 저해제의 효과
상기 1.에서 제조한 불사화 거핵구 세포에, 상기 8.과 마찬가지로 GFP가 있는 shRunx1, GFP가 있는 shHMGA2, GFP가 있는 shSCRAMBLE를 유전자 도입하고, 1㎍/ml 독시사이클린(DOX)을 포함하는 거핵구 세포용 배지(즉, 15％ FBS, L-글루타민, ITS, MTG, 아스코르브산, 50ng/mL SCF, 50ng/mL TPO를 첨가한 IMDM)에서 7일간 배양 후, 유전자 도입된 세포(GFP 양성 세포)를 소팅에 의해 단리했다. shHMGA2를 도입하여 단리한 세포를 1×105개를 6웰 플레이트에 파종하고, 무첨가, 750nM SR-1만, 10μM Y27632만, 또는 750nM SR-1 및 10μM Y27632를 첨가한 DOX를 포함하지 않는 거핵구 세포용 배지(즉, 외래성의 유전자 발현을 멈추게 하는 배지)에서 7일간 배양했다.
한편, shRunx1 및 shSCRAMBLE를 도입하여 단리한 세포를, 750nM SR-1 및 10μM Y27632를 첨가한 DOX를 포함하지 않는 거핵구 세포 배양 배지에서 7일간 배양했다. 얻어진 세포를 사이트 스핀에 의해 슬라이드 유리에 밀착시켜, 현미경에 의해 관찰했다(도 20 상단 도면).
또한, 배양 상청에 있어서의 혈소판 수(CD41a 양성 CD42b 양성)를 FACS를 사용하여 측정했다(도 20 하단 도면). 그 결과, HMGA2를 녹다운한 거핵구 세포를 AhR 안타고니스트 및 ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양함으로써, 다핵화 및 비대화된 세포가 많이 보여, 단위 세포당 혈소판 산생수가 현저하게 증가됨이 확인되었다. 또한, AhR 안타고니스트 및 ROCK 저해제를 조합하여 사용한 경우, 혈소판 산생 효율이 보다 높아짐이 확인되었다.
10. HMGA2 저해와 거핵구 세포의 성숙화
상기 9.에서 얻어진 shRunx1, shHMGA2 및 shSCRAMBLE를 도입하여 얻어진 세포를 SR-1 및 Y27632를 첨가한 DOX를 포함하지 않는 거핵구 세포용 배지로 배양한 세포를 전자 현미경으로 관찰했다.
결과를 도 21에 도시한다. 그 결과, shRunx1을 도입한 경우에는, 소형 유 핵 세포가 많고, 세포에서는 분리막계(demarcation membrane system: DMS)의 발달이 부족하고, 분비 과립은 중간 정도로 형성되어 있음이 확인되었다. 마찬가지로, shSCRAMBLE를 도입한 경우에는, 소형 유핵 세포가 많고, 세포에서는 DMS의 발달이 부족하고, 분비 과립은 거의 형성되어 있지 않음이 확인되었다. 한편, shHMGA2를 도입한 경우에는, 다핵화 및 비대화된 세포가 확인되고, 또한 이러한 세포에서는 DMS와 분비 과립의 형성이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 거핵구 세포에 있어서 HMGA2를 저해함으로써 혈소판 산생 효율을 높이는 것이 가능하고, AhR 안타고니스트 및 ROCK 저해제를 조합함으로써, 얻어지는 거핵구가 생체 내의 거핵구와 마찬가지로 다핵화 및 비대화되어, DMS와 분비 과립의 형성이 확인될수록 성숙하고, 그것에 의해, 혈소판 산생 효율이 보다 높아짐이 시사되었다.
서열표 프리텍스트
서열 번호: 1은 shSCRAMBLE의 표적 서열을 나타낸다.
서열 번호: 2는 shSCRAMBLE의 DNA 서열을 나타낸다.
서열 번호: 3은 shRunx1의 표적 서열을 나타낸다.
서열 번호: 4는 shRunx1의 DNA 서열을 나타낸다.
서열 번호: 5는 shHMGA2의 표적 서열을 나타낸다.
서열 번호: 6은 shHMGA2의 DNA 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> KYOTO UNIVERSITY Megakaryon Corporation <120> Method of Producing Highly Functional Platelets <130> 5032 <140> Not yet assigned <141> 2016-06-16 <150> JP2015-121456 <151> 2015-06-16 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggtcacac tagagagtta ta 22 <210> 2 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA. <400> 2 gatccccgag gtcacactag agagttatat tcaagagata taactctcta gtgtgacctc 60 tttttggaaa a 71 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 actttccagt cgactctca 19 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA. <400> 4 gatccccact ttccagtcga ctctcattca agagatgaga gtcgactgga aagttttttg 60 gaaaa 65 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgagacgaa atgctgatgt at 22 <210> 6 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA. <400> 6 gatccccatg agacgaaatg ctgatgtatt tcaagagaat acatcagcat ttcgtctcat 60 tttttggaaa a 71

Claims (13)

  1. 하나 또는 복수의 방향족 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor; AhR) 안타고니스트와 하나 또는 복수의 ROCK(Rho-관련 코일드-코일 형성 키나제(Rho-associated coiled-coil forming kinase)) 저해제를 포함하는, 기능성이 높은, 혈소판 산생 촉진제.
  2. 제1항에 있어서, AhR 안타고니스트가, 4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6-일아미노)에틸)페놀(SR-1), 2-메틸-2H-피라졸-3-카르복실산(2-메틸-4-o-톨릴라조-페닐)-아미드(CH-223191), N-[2-(3H-인돌-3-일)에틸]-9-이소프로필-2-(5-메틸-3-피리딜)퓨린-6-아민(GNF-351), 6,2',4'-트리메톡시플라본(TMF) 및 3',4'-디메톡시플라본(DMF)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 혈소판 산생 촉진제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, ROCK 저해제가, Y27632, Y39983, 파수딜 염산염, 리파수딜, SLX-2119, RKI-1447, 아자인돌 1, SR-3677, 스타우로스포린, H1152 디히드로클로라이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 혈소판 산생 촉진제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, AhR 안타고니스트가 SR-1, GNF-351 및/또는 CH-223191이며, ROCK 저해제가 Y27632, Y39983, 파수딜 염산염 및/또는 리파수딜인, 혈소판 산생 촉진제.
  5. 제1항 또는 제2항에 기재된 혈소판 산생 촉진제와 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는, 혈소판의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 접촉 공정이 피더(feeder) 세포를 사용하지 않는 조건에서 행하여지는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 진탕 배양 조건 하에서 실시되는, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 거핵구 세포 또는 그의 전구 세포에 있어서의 HMGA(고이동성 군 At-후크 단백질(High Mobility Group At-hook protein)) 단백질의 발현 또는 기능을 억제하는 공정을 더 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 HMGA 단백질의 발현 또는 기능의 억제가, HMGA 유전자의 발현을 직접적 또는 간접적으로 억제하는 siRNA 또는 miRNA에 의해 행하여지는, 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 거핵구 세포는 상기 거핵구 세포보다 미분화된 세포를 암 유전자, 폴리콤 유전자 및 아포토시스 억제 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 적어도 하나를 과발현시킨 후, 과발현을 종결시킨 세포인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 거핵구 세포보다 미분화된 세포가, 다능성 줄기 세포로 제조된 조혈 전구 세포인, 방법.
  12. 제5항에 있어서, 상기 거핵구 세포로부터 혈소판을 회수하는 공정을 더 포함하는, 방법.
  13. 삭제
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