WO2021117886A1 - 巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤 - Google Patents

巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤 Download PDF

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精司 大鳥
康浩 志賀
健太朗 小坂
浩之 江藤
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国立大学法人千葉大学
国立大学法人京都大学
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    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the present invention relates to a lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets. Specifically, the present invention relates to a lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets, and an application for promoting bone fusion in the preparation, or treating or preventing a skin disease.
  • PRP platelet-rich plasma
  • rat spinal fusion significantly promotes bone union without the risk of infection or rejection
  • Non-Patent Document 2 it was also reported in an animal experiment using rats that good bone fusion can be obtained by using hydroxyapatite, which has been used as an artificial bone, in combination with PRP. Then, based on the results obtained in animal experiments, as a result of conducting two clinical trials using PRP as translational research, in spinal fusion surgery, when fresh PRP was used in combination with autologous bone or allogeneic bone, In each case, it was obtained that the bone fusion period could be shortened by an average of about 1 to 2 months (Non-Patent Document 3). As described above, PRP is highly safe and has an excellent bone fusion promoting effect, so that it is very useful in the treatment of the orthopedic field, and it is strongly suggested that it can provide a promising treatment method.
  • PRP can be used for PRP therapy.
  • PRP therapy is a regenerative medicine that enhances the "healing power" inherent in humans by utilizing the tissue repair ability of proteins that possess physiological activity such as growth factors of platelets contained in autologous blood.
  • PRP can be administered to these affected areas for refractory skin ulcers and pressure sores (bedsores), burns, necrosis or gangrene of the lower extremities of diabetic patients, and promotion of dental alveolar bone and gingival regeneration.
  • PRP may be administered to the patient to improve wrinkles on the skin such as the face and neck and promote hair growth.
  • PRP when administered intradermally, it releases multiple proteins having physiological activities such as growth factors, increases capillary lymphatic vessels in the skin, and migrates skin fibroblasts. It is expected to be able to regenerate capillaries and new skin granulation tissue.
  • Non-Patent Document 4 Non-Patent Document 5
  • both PRP and lyophilized PRP are not derived from autologous blood, which is prepared for each occasion by self-collecting blood, but from the viewpoint of further reducing patient invasion and improving supply efficiency, and are ready-made commercial products. It is considered that the safe formulation is more desirable.
  • PRP and lyophilized PRP can be used in large doses in a wide range of treatment or in severe cases.
  • platelets which are the raw material of PRP, have an extremely short expiration date of 4 days, making stable supply difficult. At present, it depends on the person or blood donor, and it is expected that supply will not be able to keep up with demand in many countries including Japan in the near future. Another problem is that the lot difference in the components and amounts of growth factors and the like in the platelet-rich plasma derived from autologous plasma and the freeze-dried preparation thereof is large, and the effect is not constant.
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • a lyophilized preparation prepared using platelets induced to differentiate from pluripotent stem cells including iPS cells has a desired effect, for example, without side effects or adverse events, like PRP derived from autologous plasma and lyophilized PRP.
  • the question is whether or not it has the effect of promoting bone fusion.
  • the present inventors prepared a lyophilized preparation using platelets induced to differentiate from stem cells in vitro, and the prepared lyophilized preparation was similar to PRP derived from autologous plasma and lyophilized PRP. It was confirmed that it contained abundant growth factors.
  • This lyophilized preparation contained megakaryocytes in addition to platelets, and the content of BMP2 and BMP4 was higher than that of PRP derived from autologous plasma or lyophilized PRP.
  • the bone fusion promoting effect in the posterior lateral fusion model of the lumbar spine using rats was examined using the freeze-dried preparation, it was found that the bone fusion and bone formation ability were vigorous, and the present invention was completed.
  • the present invention includes the following aspects. ⁇ Freeze-dried product> [1] A lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets. [2] The lyophilized preparation according to [1], wherein megakaryocytes and platelets are induced to differentiate from stem cells in vitro. [3] The lyophilized preparation according to [1] or [2], wherein the stem cells are pluripotent stem cells or hematopoietic stem cells. [4] The lyophilized preparation according to [2] or [3], wherein the pluripotent stem cells are iPS cells. [5] The lyophilized preparation according to any one of [1] to [4], which further contains a growth factor released from megakaryocytes and / or platelets.
  • Growth factors include bone-forming proteins, platelet-derived growth factors, platelet-derived angiogenesis factors, transforming growth factors, vascular endothelial cell growth factors, epithelial cell growth factors, fibroblast growth factors, hepatocellular growth factors, and platelet-derived endothelial cells.
  • a pharmaceutical composition comprising the lyophilized preparation according to any one of [1] to [6] for promoting bone fusion or treating or preventing a skin disease.
  • ⁇ Pharmaceutical use> [9] The lyophilized preparation according to any one of claims 1 to 6, which is a method for promoting bone fusion or treating or preventing a skin disease, is administered to a subject in need of such treatment or the like. How to include. [10] The lyophilized preparation according to any one of claims 1 to 6, which is a method for promoting bone fusion or treating or preventing a skin disease, is effective for a subject in need of such treatment or the like.
  • lyophilized preparation for promoting bone fusion or treating or preventing a skin disease.
  • ⁇ Preparation method of lyophilized preparation> [13] A method for preparing a lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets. A method comprising (A) preparing a cell mixture of platelets and megakaryocytes, and (B) lyophilizing the cell mixture of platelets and megakaryocytes.
  • step (A) The method according to [13], wherein in step (A), the megakaryocytes are immortalized megakaryocytes that are induced to differentiate from stem cells.
  • step (A) The method according to [13] or [14], which activates the cell mixture prepared in the step (A).
  • iPS cell-derived FD-PRP freeze-drying platelet-derived PRP induced to differentiate from stem cells including iPS cells
  • it becomes possible to supply it as a pharmaceutical preparation when necessary.
  • antigen-free iPS cell-derived FD-PRP is developed and can be safely used in other patients, it will eliminate the need for preparation for surgery and will greatly increase the possibility of versatility as an effective new formulation.
  • existing commercialized materials effectively promote early bone fusion in fractures and spinal surgery without patient invasiveness or medical staff burden, a dramatic improvement in patient ADL and QOL can be achieved. It is thought that this will greatly contribute to the improvement of the medical economy by reducing and alleviating complications due to surgery and shortening the length of hospital stay.
  • FIG. 1 shows that in a lumbar spine fusion rat model, the lyophilized preparation of the present invention containing iPS cell-derived immortalized megakaryocytes and platelets has an excellent bone fusion promoting effect and bone forming ability. It is an X-ray image of.
  • FIG. 2 shows the same PRP prepared from human peripheral blood containing the same number of platelets in the preparation process of the lyophilized preparation of the present invention immediately after the activation of megakaryocytes / platelets (before lyophilization) (before FD). It is a graph which shows the result of having measured the BMP2 and BMP4 concentration in the activated product (human PRP1, human PRP2), and the control (differentiation medium).
  • FIG. 3 is a graph showing changes with maturation of cytokine gene expression in mature megakaryocytes and platelets (MMK-PLT) derived from iPS cell-derived immortalized megakaryocytes (imMKCL).
  • FIG. 4 is a graph showing changes in the amount of cytokine protein (pg / ml) released by activation from mature megakaryocytes derived from iPS cell-derived immortalized megakaryocytes (imMKCL) and platelets (MMK-PLT) with maturation. Is.
  • FIG. 3 is a graph showing changes with maturation of cytokine gene expression in mature megakaryocytes and platelets (MMK-PLT) derived from iPS cell-derived immortalized megakaryocytes (imMKCL).
  • MMK-PLT iPS cell-derived immortalized megakaryocytes
  • FIG. 5 shows the effect of the supernatant obtained by activating mature megakaryocytes and platelets (MMK / PLT) derived from iPS cell-derived immortalized megakaryocytes (imMKCL) on the proliferation of human primary cultured fibroblasts. It is a graph which shows.
  • FIG. 5 (right) is a photograph of primary human cultured fibroblasts on the 5th day of culture.
  • FIG. 6 (left) is a graph showing the effect of mature megakaryocytes and platelets (MMK / PLT) derived from iPS cell-derived immortalized megakaryocytes (imMKCL) on the wound area reduction rate.
  • FIG. 5 shows the effect of the supernatant obtained by activating mature megakaryocytes and platelets (MMK / PLT) derived from iPS cell-derived immortalized megakaryocytes (imMKCL) on the proliferation of human primary cultured fibroblasts. It is a graph which shows.
  • FIG. 5 (right) is
  • FIG. 6 (right) is a graph of the wound area reduction rate and a photograph of the wound on the 7th day.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of a lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets derived from an iPS cell-derived immortalized megakaryocyte strain on novel bone formation in a rat lumbar fusion model.
  • FIG. 8 shows the results of monitoring the differentiation of iPS cell-derived immortalized megakaryocyte strains into platelets over time with a flow cytometer. The upper right fraction corresponds to platelets. The vertical axis shows lateral scattering, and the horizontal axis shows forward scattering.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of a lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets derived from an iPS cell-derived immortalized megakaryocyte strain on novel bone formation in a rat lumbar fusion model.
  • FIG. 8 shows the results of monitoring the differentiation of iPS cell-derived immortalized megakaryocyte strains
  • FIG. 9 shows the results of monitoring the differentiation of iPS cell-derived immortalized megakaryocytes into mature megakaryocytes over time with a flow cytometer.
  • the upper right fraction corresponds to a mature megakaryocyte.
  • the vertical axis shows lateral scattering, and the horizontal axis shows forward scattering.
  • FIG. 10 is a graph showing changes over time in the numbers of platelets (CD41 + 42 + Plt) and mature megakaryocytes (CD41 + MK) after differentiation culture.
  • the present invention relates to a lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets as one aspect.
  • the lyophilized preparation of the present invention has a tissue repair ability.
  • blood-derived platelet-rich plasma (PRP) and / or freeze-dried PRP preparations which have tissue repair ability and have been widely confirmed to be effective in plastic surgery, dental and orthopedic fields, are known.
  • the lyophilized preparation of the present invention differs from the conventional PRP preparation in that it contains a relatively large amount of megakaryocytes.
  • the lyophilized preparation of the present invention may also differ in that it has a higher content of certain humoral factors such as BMP2 and / or BMP4 as compared to conventional PRP preparations.
  • Megakaryocytes are derived from hematopoietic stem cells in vivo and mature into megakaryocytes in the bone marrow via megakaryocyte precursor cells (CFU-Meg), megakaryocytes, and premegakaryocytes, but without cell division.
  • megakaryocytes mean any megakaryocytes capable of providing platelets, such as immortalized megakaryocytes, immature megakaryocytes, and mature megakaryocytes.
  • the "immature megakaryocyte” in the present invention is a megakaryocyte (about 2N to 8N) in which multinuclearization has not progressed.
  • CD41 a group of genes related to megakaryocyte maturation. It is a megakaryocyte with a low expression level of (GATA1, NF-E2, c-MPL, ⁇ 1-tubulin and MYH9) and a high expression level of MYH10.
  • immature megakaryocytes can be paraphrased as "megakaryocyte progenitor cells".
  • immature megakaryocytes include immature megakaryocytes artificially produced from hematopoietic progenitor cells.
  • the immature megakaryocytes may or may not be cloned, and the cloned one may be referred to as an immature megakaryocyte strain, although it is not particularly limited.
  • “mature megakaryocytes” are megakaryocytes with high expression levels of megakaryocyte maturation-related genes and low expression levels of MYH10, and are megakaryocytes (8N or more) with advanced polynuclearization.
  • “maturation” refers to the progress of maturation of megakaryocyte cells, that is, the progress of multinucleation or cytoplasmic increase, the increase in the expression level of megakaryocyte maturation-related genes, and the progress of megakaryocyte immaturity-related genes. It means that the expression level decreases, and as long as these tendencies are observed as compared with before the maturation step, it includes the case where the mature megakaryocytes as defined above are not necessarily reached.
  • “maturation” refers to the case where the cell group before and after culture is compared and the maturation of the group as a whole is progressing, that is, the total number of nuclei in the entire cell group is increased or (in addition) the cytoplasm is increased. This refers to the case where the volume is increasing.
  • the lyophilized preparation is a powdery or granular preparation prepared by a process such as freeze-drying or lyophilization well known to those skilled in the art. It is a chemically and biologically stable preparation and can be stored for a long period of time.
  • the lyophilized preparation is used by dissolving or suspending it in water or physiological saline when it is to be administered to a subject.
  • the lyophilized preparation of the present invention in the lyophilized preparation of the present invention containing megakaryocytes and platelets, the lyophilized preparation of the present invention in which megakaryocytes and platelets are induced to differentiate from stem cells in vitro, more specifically, stem cells. More specifically, it relates to a lyophilized preparation of the present invention in which pluripotent stem cells or hematopoietic stem cells, more specifically, pluripotent stem cells are iPS cells.
  • a stem cell means a cell having both pluripotency capable of differentiating into many types of cells constituting a living body and self-renewal ability capable of maintaining pluripotency even after division and proliferation. Any stem cell that can differentiate into platelets will do.
  • pluripotent stem cells mean stem cells that do not form individuals but have the ability to differentiate into all cell lines belonging to the three germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm), and are pluripotent that can differentiate into platelets. Any capable stem cell will do.
  • pluripotent stem cells are ES cells, iPS cells, embryonic germ cell (EG cells) derived from primordial germ cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transplantation, and sperm stem cells. (GS cells), cultured fibroblasts, pluripotent cells derived from bone marrow stem cells (Muse cells), and the like.
  • ES cells may be ES cells generated by nuclear reprogramming from somatic cells.
  • Pluripotent stem cells are preferably ES cells or iPS cells.
  • the pluripotent stem cells may be of mammalian origin, preferably human-derived pluripotent stem cells.
  • Hematopoietic stem cells are stem cells that can differentiate into blood cells, which are mainly present in the bone marrow in adult humans, and are white blood cells (basophils, eosinophils, basophils, lymphocytes, monocytes, macrophages) and red blood cells. , Produces white blood cells, mast cells, dendritic cells. Hematopoietic stem cells are also called hematopoietic stem cells or bone marrow stem cells.
  • ES cells are pluripotent stem cells derived from embryos in the blastocyst stage, which is the early stage of animal development.
  • ES cells can be established by removing the inner cell mass from the blastocyst of a fertilized mammalian egg and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • ES cells can generally be selected using the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, and Nanog as an index.
  • gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, and Nanog as an index.
  • the expression of genetic markers such as OCT-3 / 4, NANOG, etc. is detected by the Real-Time PCR method, and / or the cell surface antigens SSEA-3, SSEA-4, This can be done by detecting TRA-1-60 and TRA-1-81 by immunostaining (Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444: 481-485).
  • mouse ES cells various mouse ES cell lines established by inGenious, RIKEN (RIKEN), etc. can be used.
  • human ES cells various human ES cell lines established by the National Institutes of Health (NIH), RIKEN, Kyoto University, and Cellartis can be used.
  • NIH CHB-1 to CHB-12 strains various human ES cell lines established by the National Institutes of Health (NIH), RIKEN, Kyoto University, and Cellartis can be used.
  • NIH CHB-1 to CHB-12 strains various human ES cell lines established by the National Institutes of Health (NIH), RIKEN, Kyoto University, and Cellartis can be used.
  • NIH National Institutes of Health
  • RIKEN Kyoto University
  • Cellartis e.g., WisCell Research Institute WA01 (H1) strain, WA09 (H9) strain, RIKEN KhES- One strain, KhES-2 strain, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SS
  • WA01 (H1) and WA09 (H9) are from the WiCell Research Institute
  • KhES-1, KhES-2, KhES-3 and KthES11 are from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University. Available from (Kyoto, Japan).
  • iPS cells are also called induced pluripotent stem cells or induced pluripotent stem cells, and introduce one or more specific nuclear reprogramming substances into somatic cells such as fibroblasts in the form of DNA or protein.
  • pluripotency which can be made by increasing the expression levels of the endogenous mRNA and protein of the nuclear reprogramming agent, either by means or by the use of certain one or more agents.
  • Cells that have acquired self-renewal ability K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M.
  • the "somatic cell” means any animal cell (preferably a mammalian cell including human) except a germline cell such as an egg, an egg mother cell, an ES cell, or a differentiation pluripotent cell, and a fetus (pup). ) Somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells, passaged cells, and established cells. Will be done.
  • somatic cells include, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue precursor cells, (3) lymphocytes, and epithelium.
  • tissue stem cells such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells
  • tissue precursor cells such as lymphocytes, and epithelium.
  • brain cells lung cells, renal cells
  • differentiated cells such as fat cells are exemplified.
  • a nuclear reprogramming substance is a gene that is specifically expressed in ES cells, its gene product or non-cording RNA, or a gene that plays an important role in maintaining undifferentiated ES cells, its gene product or non-coding RNA, Alternatively, it may be composed of a low molecular weight compound.
  • Nucleotide sequence information of mouse and human cDNAs of each of the above nuclear reprogrammers, and amino acid sequence information of the protein encoded by the cDNA can be found in GenBank (US NCBI) or EMBL (Germany) described in WO2007 / 069666. It can be obtained by accessing Accession numbers.
  • the cDNA sequence information and amino acid sequence information of mice and humans of L-Myc, Lin28, Lin28b, Esrrb, Esrrg and Glis1 can be obtained by accessing NCBI Accession numbers shown in Table 1.
  • One of ordinary skill in the art can prepare a desired nuclear reprogramming substance by a conventional method based on the cDNA sequence or amino acid sequence information.
  • nuclear reprogrammers may be introduced into somatic cells in the form of proteins by techniques such as lipofection, binding to cell membrane permeable peptides (eg, HIV-derived TAT and polyarginine), microinjection, etc.
  • cell membrane permeable peptides eg, HIV-derived TAT and polyarginine
  • somatic cells in the form of DNA or RNA by techniques such as vectors such as viruses, plasmids, artificial chromosomes, lipofection, the use of liposomes, microinjection and the like.
  • Viral vectors include retroviral vectors and lentiviral vectors (these vectors are Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872,2007; Science, 318, pp.1917- 1920,2007), adenovirus vector (Science, 322,945-949,2008), adeno-associated virus vector, Sendai virus vector (Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci.85,348-62, 2009), etc. are exemplified. ..
  • the artificial chromosome vector includes, for example, a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC and PAC) and the like.
  • HAC human artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC and PAC bacterial artificial chromosome
  • plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • Vectors can include regulatory sequences such as promoters, enhancers, ribosome binding sequences, terminators, polyadenylation sites or polyadenylation signals so that nuclear reprogrammers can be expressed.
  • promoters used include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Molony mouse leukemia virus) LTR, HSV- A TK (simple herpesvirus thymidine kinase) promoter or the like is used.
  • the EF1 ⁇ promoter, the CAG promoter, the MoMuLV LTR, the CMV promoter, the SR ⁇ promoter and the like are preferable examples.
  • selectable marker sequences such as drug resistance genes (eg, canamycin resistance gene, ampicillin resistance gene or puromycin resistance gene), thymidin kinase gene, and diphtheriatoxin gene or fragments thereof, and green fluorescent protein (GFP). ), Beta-glucuronidase (GUS) or reporter gene sequences such as FLAG can be included.
  • LoxP sequences are added before and after the gene encoding the nuclear reprogramming substance or the promoter and the gene encoding the nuclear reprogramming substance that binds to the promoter. You may have.
  • a method in which the transgene is integrated into the chromosome using a transposon and then the transgene is allowed to act on the cell using a plasmid vector or an adenovirus vector to completely remove the transgene from the chromosome.
  • Can be Preferred transposons include, for example, piggyBac, which is a transposon derived from lepidopteran insects (Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775, Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770, WO 2010/012077).
  • the vector is replicated without integration into the chromosome and is episomatically present at the origin of the lymphotrophic herpesvirus, BK virus and Bovine papillomavirus. It may contain sequences involved in replication. For example, it may contain EBNA-1 and oriP, or Large T and SV40 ori sequences (WO 2009/115295, WO 2009/157201 and WO 2009/149233).
  • an expression vector that can be polycistronically expressed may be used to simultaneously introduce two or more nuclear reprogramming substances.
  • the sequence encoding the gene may be linked by an IRES or foot-and-mouth disease virus (FMDV) 2A coding region (Science, 322: 949-953, 2008). , WO 2009/092042 and WO 2009/15 259).
  • FMDV foot-and-mouth disease virus
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • MC1293, M344 small molecule inhibitors
  • siRNAs and shRNAs against HDACs eg, HDAC1 siRNA Smartpool® (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs Nucleic acid expression inhibitors such as against HDAC1 (OriGene))
  • DNA methyltransferase inhibitors eg 5'-azacytidine
  • G9a histone methyltransferase inhibitors eg, BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), siRNA and shRNA against G9a (eg, G9a siRNA (human)) (Santa Cruz Biotechnology, etc.), etc.), L-channel calcium agonist (eg, Bayk 8644) (Cell Stem Cell, 3,568-574 (2008)), butyric acid, TGF ⁇ inhibition Agents or ALK5 inhibitors (eg LY364947, SB431542, 616453 and A-83-01), p53 inhibitors (eg siRNA and shRNA for p53) (Cell Stem Cell, 3,475-479 (2008)), Wnt signaling activation Factors (eg, soluble Wnt3a) (Cell Stem Cell, 3,132-135 (2008)), growth factors such as LIF or bFGF, ALK5 inhibitors (e
  • Such agents include 6-bromoinzylbin-3'-oxime, indylbin-5-nitro-3'-oxime, valproic acid, 2- (3- (6-methylpyridine-2-yl) -1H-.
  • ARID3A inhibitors for example, siRNA and shRNA for ARID3A
  • neuropeptide Y for example, UTF1, IRX6, PITX2, DMRTBl and the like may be used.
  • Combinations of nuclear reprogramming materials include WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009 / 126655, WO2009 / 157593, WO2010 / 009015, WO2010 / 033906, WO2010 / 033920, WO2010 / 042800, WO2010 / 050626, WO2010 / 056831, WO2010 / 068955, WO2010 / 098419, WO2010/1022
  • Culture media for iPS cell induction include, for example, (1) DMEM, DMEM / F12 or DME medium containing 10 to 15% FBS (bovine fetal serum) (in addition to these media, LIF, penicillin / streptomycin, Puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. can be appropriately contained), (2) ES cell culture medium containing bFGF or SCF, for example, mouse ES cell culture medium (for example). TX-WES medium, Thrombo X) or primate ES cell culture medium (eg, primate (human or monkey) ES cell medium (sales destination: Reprocell, Kyoto, Japan), mTeSR-1), etc. are included. ..
  • Examples of culture methods include contacting somatic cells with a nuclear reprogramming substance (DNA, RNA or protein) in DMEM or DMEM / F12 medium containing 10% FBS in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. After culturing for about 4 to 7 days, the cells are re-sown on feeder cells (eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and bFGF-containing primates about 10 days after contact between somatic cells and nuclear reprogramming substances. It can be cultured in ES cell culture medium to generate ES cell-like colonies about 30 to about 45 days or more after the contact. In addition, in order to increase the induction efficiency of iPS cells, the cells may be cultured under conditions of a low oxygen concentration of 5 to 10%.
  • a nuclear reprogramming substance DNA, RNA or protein
  • the cells are placed in DMEM medium containing 10% FBS (eg, LIF, penicillin, etc.) on feeder cells (eg, mitomycin C-treated STO cells or SNL cells, etc.) in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. / Streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, b-mercaptoethanol, etc. can be appropriately contained), and ES-like colonies are formed after about 25 to about 30 days or more. be able to.
  • feeder cells use the reprogrammed somatic cells themselves (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One.
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 x 10 3 to about 5 x 10 6 cells per culture dish (100 cm2).
  • the iPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a DNA containing a drug resistance gene expressed in conjunction with a gene expressed when a somatic cell is reprogrammed for example, Oct3 / 4, Nanog
  • a medium containing the corresponding drug for example, Nanog. That is, marker gene-expressing cells (that is, established iPS cells) can be selected by culturing the cells in a selective medium).
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • it is observed with a fluorescence microscope
  • when it is a luciferase gene it is added with a luminescent substrate, or when it is a luciferase gene, it is added with a chromogenic substrate.
  • Ie established iPS cells
  • the "somatic cell” used herein may be any cell other than a germ cell (preferably a mammalian (eg, human, mouse, monkey, pig and rat) cell). Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells. , Passed cells, and established cells are all included.
  • somatic cells include, for example, keratinizing epithelial cells (eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells on the surface of the tongue), exocrine gland epithelial cells (eg, mammary cells), hormones.
  • keratinizing epithelial cells eg, keratinized epidermal cells
  • mucosal epithelial cells eg, epithelial cells on the surface of the tongue
  • exocrine gland epithelial cells eg, mammary cells
  • Secretory cells eg, adrenal medulla cells
  • cells for metabolism and storage eg, hepatocytes
  • luminal epithelial cells that make up the interface eg, type I alveolar cells
  • luminal epithelial cells of the inner canal e.g, vascular endothelial cells
  • ciliated cells capable of carrying eg, airway epithelial cells
  • extracellular matrix secretory cells eg, fibroblasts
  • contractile cells eg, smooth muscle cells
  • blood And immune system cells eg, T lymphocytes
  • sensory cells eg, rod cells
  • autonomic nervous system neurons eg, cholinergic neurons
  • sensory organ and peripheral neuron support cells eg, companion cells
  • Central nervous system nerve cells and glial cells eg, stellate glial cells
  • pigment cells eg, retinal pigment epithelial cells
  • their precursor cells tissue precursor cells
  • undifferentiated progenitor cells or stem cells including somatic stem cells
  • final differentiated mature cells can be used as the origin of somatic cells in the present invention.
  • undifferentiated stem cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • somatic cells having the same or substantially the same HLA genotype as the transplant destination individual are selected from the viewpoint that rejection does not occur. It is desirable to use it.
  • substantially the same HLA type means that the HLA genotypes match to the extent that the transplanted cells can engraft when the cells are transplanted.
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci including HLA-C
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci including HLA-C
  • EG cells are pluripotent stem cells derived from spermatogonia (references: Nature. 2008, 456, 344-49). EG cells can be established by culturing primordial germ cells in the presence of substances such as LIF, bFGF, stem cell factor (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841- 847; JLResnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551).
  • ntES cells are ES cells derived from cloned embryos produced by nuclear transfer technology and have almost the same characteristics as ES cells derived from fertilized eggs (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72: 932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450: 497-502). That is, ES cells established from the inner cell mass of blastocysts derived from cloned embryos obtained by replacing the nuclei of unfertilized eggs with the nuclei of somatic cells are ntES (nuclear transfer ES) cells.
  • ntES cells For the production of ntES cells, a combination of nuclear transfer technology (JB Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16: 642-646) and ES cell production technology (above) is used (Seika Wakayama). Et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Special Edition), pp. 47-52).
  • somatic cell nuclei can be injected into unfertilized mammalian eggs and cultured for several hours to reprogram them.
  • sperm stem cells are testis-derived pluripotent stem cells, which are the origin cells for spermatogenesis. Similar to ES cells, these cells can induce differentiation into cells of various lineages, and have the property of producing chimeric mice when transplanted into mouse blastocysts (M. Kanatsu-Shinohara et al. (M. Kanatsu-Shinohara et al.). 2003) Biol.Reprod., 69: 612-616; K.Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012).sperm stem cells can self-renew in a medium containing glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), and by repeating passage under the same culture conditions as ES cells. Sperm stem cells can be obtained (Masanori Takebayashi et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Special Edition), pp. 41-46, Yodosha (Tokyo, Japan)).
  • GDNF glial cell line
  • Muse cells are pluripotent stem cells isolated from mesenchymal cells (references: Proc Natl Acad Sci USA. 2010, 107, 8639-43). It can be produced by the method described in WO2011 / 007900, and more specifically, fibroblasts or bone marrow stromal cells are treated with trypsin for a long period of time, preferably for 8 hours or 16 hours, and then suspended-cultured. The pluripotent cells obtained in SSEA-3 and CD105 are positive.
  • megakaryocytes and platelets induced to differentiate in vitro from "cells capable of differentiating into megakaryocytes" other than pluripotent stem cells may be used.
  • cells derived from hematopoietic stem cells that can differentiate into megakaryocytes depending on the differentiation-inducing conditions can be used as a starting material. Examples thereof include hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, CD34-positive cells, megakaryocyte / erythroblast progenitor cells (MEP), and megakaryocyte progenitor cells.
  • Cells capable of differentiating into megakaryocytes can be obtained by known methods, for example, isolated from bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, etc., and induced to differentiate from pluripotent stem cells such as ES cells, iPS cells, etc. You can also.
  • pluripotent stem cells such as ES cells, iPS cells, etc.
  • hematopoietic precursor cells for example, c-MYC gene
  • apoptosis-suppressing genes for example, BCL-xL gene
  • c-MYC gene and polycomgene (eg BMI1 gene) or oncogene (eg c-MYC gene), polycomgene (eg BMI1 gene) and apoptosis suppressor gene (eg and BCL-xL gene) into cells It may be (WO2014 / 123242, WO2011 / 034073, WO2012 / 157586, US2016 / 002599, US2012 / 238023, US2014 / 127815).
  • the lyophilized preparation of the present invention is characterized by containing megakaryocytes and platelets.
  • the mixing ratio of megakaryocytes and platelets can be mixed at a desired ratio.
  • the mixing ratio of megakaryocytes and platelets is specifically represented by the ratio of the number of megakaryocytes and platelets.
  • the ratio of the number of megakaryocytes and platelets is not particularly limited, but for example, 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 5 megakaryocytes (immortalized megakaryocytes) with respect to 1 ⁇ 10 6 platelets.
  • Tamakabu to preferably 1 ⁇ to 10 6 platelets, 1 ⁇ 10 3 ⁇ 5 ⁇ 10 4 pieces of megakaryocytes (immortalized megakaryocytic lines), and more preferably 1 ⁇ 10 6 platelets, 2 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 megakaryocytes (immortalized megakaryocytes), more preferably 1 ⁇ 10 6 platelets, 2 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 3 megakaryocytes (immortalized) Megakaryocyte strain) is included.
  • freeze-dried preparation of the present invention with respect to 2-3 x 10 6 platelets, including 5-6 x 10 3 cells from a maximum 10 4 megakaryocytes (immortalized megakaryocytic Co.) be able to.
  • the ratio of the number of megakaryocytes to platelets contained in the lyophilized preparation of the present invention is 1 ⁇ 10 3 megakaryocytes (immortalized megakaryocytes, mature megakaryocytes, etc.) to 2 ⁇ 10 2 to 1.5 ⁇ 10 4 platelets, preferably 1.1 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 platelets.
  • the number of megakaryocytes contained in the lyophilized preparation of the present invention is, for example, 3% or more, preferably 5% or more, more preferably 5% or more of the number of platelets contained in the same preparation. It can be 10% or more.
  • the upper limit of the number of megakaryocytes contained in the freeze-dried preparation of the present invention is not particularly limited, but as an example, 500% or less, preferably 100% or less, more preferably 50% of the number of platelets contained in the same preparation. It can be:
  • the lyophilized preparation of the present invention contains megakaryocytes and platelets, and the mixing ratio of platelets and megakaryocytes can be adjusted to a desired ratio.
  • the ratio of megakaryocytes to platelets in the preparation is determined by lyophilizing at the stage of inducing differentiation from pluripotent stem cells, for example, iPS cells. It is possible to adjust whether the size is large or the size of megakaryocytes is small with respect to platelets.
  • those collected before the release of platelets that is, at the stage of only megakaryocytes, and those obtained by separating and collecting only the released platelets can be prepared and mixed at a desired ratio ().
  • WO2009 / 122747, US2011 / 053267 can determine whether or not platelets are released from megakaryocytes by any method, for example, by collecting and observing a part of the culture solution.
  • the released platelets can be recovered by any method. Therefore, a mixed solution obtained by recovering only megakaryocytes or only platelets and mixing them at an arbitrary ratio can be used in the preparation of the present invention.
  • a mixture containing megakaryocytes and platelets in an arbitrary ratio can be recovered by an arbitrary method, for example, by collecting and observing a part of the culture solution, and it can be used for preparing the preparation of the present invention.
  • the megakaryocytes and platelets contained in the lyophilized preparation of the present invention may be living cells or non-living cells. Furthermore, the lyophilized preparation of the present invention may have crushed megakaryocytes and platelets due to activation in preparation or subsequent lyophilization, and such lyophilized preparations also have the megakaryocytes and the present invention. Included in lyophilized preparations containing platelets.
  • the lyophilized preparation of the present invention can be prepared by inducing differentiation of an immortalized megakaryocyte strain induced to differentiate from iPS cells into platelets in vitro (Cell Stem Cell 14, 535-548, April 3, 2014 / WO2012). / 157586, US2014 / 127815).
  • One of the objects of the present invention is to eliminate the point that the lot difference in the components and amounts of growth factors and the like in PRP derived from autologous plasma and freeze-dried PRP is large and the effect is not constant for each lot. In general, it is important to construct a mass supply system for cells for the spread of regenerative medicine.
  • the active ingredient is prepared from stem cells in order to guarantee the effect with a certain degree of certainty, but as a mass supply system, iPS cells and immortalized megakaryocyte strains are stocked and these are induced to differentiate into platelets. Is possible. It is also possible that a third party may obtain a stock of immortalized megakaryocyte strains and differentiate them into platelets.
  • a third party may obtain a stock of immortalized megakaryocyte strains and differentiate them into platelets.
  • stem cells eg, pluripotent stem cells (iPS cells, etc.), hematopoietic stem cells
  • immortalized megakaryocyte strains induced to differentiate from stem cells in vitro. It is also possible to induce differentiation of platelets by using.
  • an immortalized megakaryocyte strain induced to differentiate from stem cells eg, pluripotent stem cells (iPS cells, etc.), hematopoietic stem cells
  • this immortalized megakaryocyte strain is further in vitro.
  • Megakaryocytes and platelets obtained by inducing differentiation are also included in "megakaryocytes and platelets induced to differentiate from stem cells in vitro".
  • the lyophilized preparation of the present invention may further contain growth factors released from megakaryocytes and / or platelets.
  • Growth factors in the present invention include bone-forming proteins (Bonemorphogenetic proteins) such as BMP2, BMP4, BMP7; Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), such as PDGF-BB; Platelet-derived angiogenesis factors (Platelet).
  • BMP2, BMP4, BMP7 bone-forming proteins
  • PDGF Platelet-Derived Growth Factor
  • BB Platelet-derived angiogenesis factors
  • PDAF -Derived Angiogenesis Factor
  • TGF Transforming Growth Factor
  • TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3 Vascular Endothelial Growth Factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • EGF Epithelial cell growth Factor (Epidermal Growth Factor: EGF); Fibroblast growth factor (FGF), for example, Basic FGF; Hepatocyte growth factor (HGF); Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor: PD-ECGF); Insulin-like Growth Factor: IGF; and Platelet Factor IV (PF4); and at least one selected from platelet factor IV (PF4) are included.
  • the lyophilized preparation of the present invention contains at least BMP2 and / or BMP4.
  • the lyophilized preparations of the present invention are: , Megakaryocytes and platelets, and mixtures of these growth factors.
  • the lyophilized preparation of the present invention comprises BMP2 and / or BMP4 in addition to other growth factors such as PDGF, PDAF, TGF, VEGF, EGF, FGF, HGF, PD-ECGF, IGF and It can further contain one or more factors selected from PF4 and the like, whereby a better effect can be exerted.
  • Preferred lyophilized preparations of the present invention include a preparation in which a platelet / megakaryocyte mixture having a high BMP-2 and a platelet / megakaryocyte mixture having a high BMP-4 are mixed in a desired ratio.
  • the pharmaceutical product of the present invention contains a plurality of these growth factors as active ingredients. Since these growth factors are stable, they can be used even if they are dissolved or suspended in water or physiological saline and stored at low temperature. They are freeze-dried and then dissolved or suspended in water or physiological saline before use. it can. Since the growth factors released from activated megakaryocytes and / or platelets are more important as active ingredients, for example, with the megakaryocytes and / or platelets remaining, or by filtering the platelets as a preparation. It can also be administered to the subject.
  • the lyophilized preparation of the present invention contains stabilizers, pH adjusters, isotonic agents, excipients, etc., which are generally used in lyophilized preparations well known to those skilled in the art, or plasma.
  • Stabilizers used in lyophilization preparations include sugars such as sucrose and trehalose, sugar alcohols such as sorbitol, amino acids such as L-arginine, and water-soluble polymers such as HES and PVP.
  • Nonionic surfactants such as polysorbate can be mentioned.
  • the pH adjuster include sodium phosphate buffer and histidine buffer
  • examples of the tonicity agent include sodium chloride
  • examples of the excipient include mannitol and glycine.
  • the lyophilized preparation of the present invention is characterized by containing megakaryocytes and platelets induced to differentiate in vitro from stem cells, and has a tissue repair ability similar to platelet-rich plasma (PRP). Therefore, the lyophilized preparation of the present invention is expected to be widely effective in the fields of dermatology, plastic surgery, dentistry, and orthopedics, for example, intractable skin ulcers, pressure sores (bedsores), burns, and diabetes in dermatology. It can be used for patient gangrene, promotion of dental alveolar bone and gingival regeneration, and promotion of bone fusion.
  • PRP platelet-rich plasma
  • the lyophilized preparation of the present invention can be applied to damaged parts of cartilage and muscle, to affected parts during surgery, to affected parts of osteoarthritis, rheumatism, meniscus tear, lateral humerus condyleitis, and to the face. It can be administered to improve wrinkles on the skin such as the neck and neck and promote hair growth.
  • the present invention is a method for preparing a lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets.
  • the platelets used in step (A) are platelets that have been induced to differentiate from stem cells in vitro. Platelets induced to differentiate from megakaryocytes induced to differentiate from stem cells in vitro are preferable. Megakaryocytes can be induced to differentiate from pluripotent stem cells such as stem cells, preferably hematopoietic stem cells or iPS cells by known methods (WO2012 / 157586, US2014 / 127815, Nakamura, Eto, et al. Cell Stem Cell. 14, 535-548, April 3, 2014). Since platelets and megakaryocytes are usually contained in the culture after differentiating and culturing platelets from megakaryocytes, this can be used as a cell mixture of platelets and megakaryocytes. Then, the cells and the culture supernatant are separated by centrifugation or the like, the selected cell portions are dispersed by pipetting or the like, and then the cells are preferably activated. All of these are preferably performed aseptically.
  • the stimulation method includes, but is not limited to, thrombin, CaCl 2 , TXA 2 , epinephrine, and ADP.
  • thrombin a combination of thrombin and CaCl 2 is used. This releases growth factors contained in platelets and / or megakaryocytes to the outside of the cell.
  • the lyophilized preparation of the present invention includes a lyophilized preparation in which water is removed by an arbitrary method without going through the lyophilization method.
  • the method for preparing the lyophilized preparation of the present invention is described in detail below.
  • the sample for freeze-drying treatment is sufficiently pre-frozen at -60 ° C below the eutectic point for 1 day and night or more.
  • the product is subjected to a freeze-dryer (EYELA FDU-1200) set to ⁇ 45 ° C. or lower in advance, and freeze-dried under reduced pressure by a vacuum pump over a day and night to prepare a preparation.
  • EYELA FDU-1200 freeze-dryer
  • Stabilizers used in lyophilization preparations include sugars such as sucrose and trehalose, sugar alcohols such as sorbitol, amino acids such as L-arginine, and water-soluble polymers such as HES and PVP.
  • Nonionic surfactants such as polysorbate can be mentioned.
  • the pH adjuster include sodium phosphate buffer and histidine buffer
  • examples of the tonicity agent include sodium chloride
  • examples of the excipient include mannitol and glycine.
  • the above-mentioned series of genes (c-MYC /) An immortalized megakaryocyte cell line produced by introducing cells of BMI1 / BCL-xL, etc.) into cells using a vector whose expression can be controlled in a doxicycline-dependent manner, for example, in the presence of doxycycline (ie, c-MYC / BMI1 / BCL-xL) By culturing by culturing (in the state where the expression of c-MYC / BMI1 / BCL-xL etc.
  • the culture of this condition as (an example immortalized megakaryocytic lines remain, seeded immortalized megakaryocytic lines 2-3 x 10 5 / ml, subjected to platelet production medium conditions doxycycline removal.
  • the flask produces about 2-3 x 10 6 / ml platelets. 10-15 platelets are produced per immortalized megakaryocyte cell line. 5-6 x 10 per flask. About 3 to 10 4 / ml of immortalized megakaryocyte cell lines remain.
  • the cell culture (mixture of platelets and immortalized megakaryocyte strain) is collected after 4 days (eg, 4th, 5th, 6th, 7th days) after induction of differentiation (doxycycline removal). ..
  • the obtained mixture of platelets and immortalized megakaryocyte strain eg, CaCl 2 1 mM + thrombin 1 U
  • a mixture containing activated megakaryocytes and platelets can be obtained.
  • the lyophilized preparation of the present invention may further contain growth factors released from megakaryocytes and / or platelets in addition to megakaryocytes and platelets to form a mixture.
  • growth factors are released from megakaryocytes and / or platelets by activation of megakaryocytes and / or platelets, or by disruption of megakaryocytes and / or platelets by lyophilization.
  • the mixture in the present invention can be prepared by stimulating megakaryocytes and / or platelets derived from pluripotent stem cells to release growth factors. Examples of the stimulation method include thrombin, CaCl2, TXA2, epinephrine, and ADP.
  • a preferred method for preparing the lyophilized preparation of the present invention includes a method of mixing a platelet / megakaryocyte mixture having a high BMP-2 and a platelet / megakaryocyte mixture having a high BMP-4 in a desired ratio. ..
  • the macronuclear cells and / or platelets used in the present invention are seeded with human-derived ES cells or iPS cells on feeder cells such as C3H10T1 / 2 cells or OP9 cells, and are cultured for 14 to 17 days in the presence of VEGF, for example.
  • ES cells or iPS cell clones with high production ability of net-like structures containing hematopoietic precursor cells obtained by culturing under conditions suitable for inducing differentiation of hematopoietic precursor cells are selected, and the ES cells or iPS cell clones are selected.
  • the cells that form the partition wall of the net-like structure produced by are separated from the hematopoietic precursor cells, and the obtained hematopoietic precursor cells are seeded on the feeder cells and cultured under conditions suitable for inducing differentiation of macronuclear cells and / or platelets. It can be prepared by (WO2009 / 122747).
  • megakaryocytes and / or platelets form hematopoietic progenitor cells inside the embryoid body by culturing human-derived ES cells or iPS cells in liquid, and the embryoid body is used for, for example, 5 to 7 days. It can be prepared by further culturing in the presence of TPO and SCF (ibid.).
  • the mature megakaryocyte cells and / or platelets used in the present invention are exotic, such as the MYC family gene, to amplify cells induced to differentiate from human ES cells or iPS cells, such as pre-multinucleated megakaryocyte progenitor cells. It can be prepared by introducing an oncogene or a polycomgene such as BMI1 and forcibly expressing the oncogene or the oncogene and the polycomgene (WO2011 / 034073, WO2011 / 034073). , Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-130866).
  • the multinucleated macronuclear cell used in the present invention forcibly expresses an apoptosis-suppressing gene such as the BCL-XL gene in the macronuclear cell before polynuclearization, and (a) an actomyosin complex function inhibitor such as brevistatin.
  • ROCK inhibitor such as Y27632
  • SR StemRegenin
  • AhR aromatic hydrocarbon receptor
  • HDAC purine-6-ylamino
  • valproic acid Treatment with (b) ROCK inhibitor such as Y27632, (c) StemRegenin (SR) -1 (4- (2- (2- (benzo [b] thiophen-3-yl) -9-isopropyl-9H) -Treatment with an aromatic hydrocarbon receptor (arylhydrocarbon receptor; AhR) antagonist such as purine-6-ylamino) ethyl) phenol) or treatment with an HDAC inhibitor such as (d) valproic acid. It can be prepared by culturing cells (WO2012 / 157586, JP-A-2019-026591).
  • the platelets used in the present invention suppress the forced expression of the anti-apoptosis gene in the multinucleated megakaryocyte cells obtained here, or remove the anti-apoptosis gene from the cells, and use a ROCK inhibitor and / or It can be prepared by culturing in a medium containing an apoptomyosin complex function inhibitor (same as above).
  • the platelets used in the present invention are (a) holding megakaryocytes in a holding portion having a porous structure through which a culture medium can pass: and (b) from an anterior chamber provided on one side of the holding portion.
  • the megakaryocytes can be prepared from the megakaryocytes by culturing the megakaryocytes while passing the culture solution through the holding portion to the flow path portion provided on the other side of the holding portion (Japanese Patent Laid-Open No. 2013). -031428).
  • the macronuclear cell used in the present invention is obtained by culturing pluripotent stem cells on C3H10T1 / 2 cells in a culture medium containing VEGF and inducing differentiation into hematopoietic progenitor cells. It can be prepared by forcibly expressing and culturing an apoptosis-suppressing gene and a cancer gene, and culturing the obtained cells by stopping the forced expression of the apoptosis-suppressing gene and the cancer gene (WO2014 / 123242, US2016 / 002599). ).
  • the platelets used in the present invention can be prepared by recovering from the culture of megakaryocytes obtained here (ibid.).
  • the megakaryocyte cells used in the present invention are produced from hematopoietic progenitor cells derived from pluripotent stem cells, for example, in a culture medium containing an inhibitor of the C family of ABC transporters, for example, an ABC transporter inhibitor such as Probenecid. It can be prepared by culturing the immature megakaryocytes (re-table 2014/168255).
  • the megakaryocytes used in the present invention are obtained by culturing a group of cells containing megakaryocytes or cells capable of differentiating into megakaryocytes under conditions in which cells that do not express genes specifically expressed in megakaryocytes are lethal. It can be prepared by preparing a culture containing megakaryocytes or megakaryocyte precursor cells (WO2016 / 143836, US2018 / 044634). The platelets used in the present invention can be prepared by using the megakaryocytes obtained here (ibid.).
  • Platelets used in the present invention are highly functional, comprising one or more aromatic hydrocarbon receptor (arylhydrocarbon receptor; AhR) antagonists and one or more ROCK (Rho binding kinase) inhibitors. It can be prepared by contacting a platelet production promoter of (WO2016 / 204256) with megakaryocyte cells or their precursor cells.
  • arylhydrocarbon receptor arylhydrocarbon receptor
  • ROCK Ra binding kinase
  • the megakaryocytes and / or platelets used in the present invention can be prepared by culturing the progenitor cells of megakaryocytes or platelets in the presence of IL-1 ⁇ and collecting the produced megakaryocytes or platelets. (Japanese Patent Laid-Open No. 2017-122049).
  • the platelet used in the present invention is a step of contacting a megakaryocyte cell and / or its progenitor cell with a platelet production promoter containing one or more substances selected from the group consisting of a Wnt inhibitor and an FLT inhibitor. It can be prepared by a culture method containing (WO2017 / 131230).
  • Platelets used in the present invention are receptor-type tyrosine kinase inhibitors, vanilloid receptor inhibitors, PDGFR inhibitors, TrioN inhibitors, SIRT2 inhibitors, H +, K + -ATPase inhibitors, benzodiazepine reverse agonists and neurogenic promoters. It can be prepared by a culture method including a step of contacting a platelet production promoter containing one or more AhR antagonists selected from the group consisting of agents with giant nuclei cells and / or precursor cells thereof (Japanese Patent Laid-Open No. 2019-026591).
  • the platelet used in the present invention is a method for producing platelets, which comprises a step of culturing giant nuclei cells in a platelet-producing medium, wherein the culturing step uses a stirring blade to cultivate the platelet-producing medium in a container. includes agitation to step, a step of stirring: (a) a about turbulent energy of 0.0005m 2 / s 2 ⁇ about 0.02m 2 / s 2; (b ) a shear stress of about 0.2 Pa ⁇ about 6.0 Pa; And (c) can be prepared by a method for producing platelets, including reciprocating the stirring blade to satisfy one or more indicators selected from the Kormogorov scale of about 100 ⁇ m to about 600 ⁇ m (WO2019). / 009364).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the lyophilized preparation of the present invention as yet another aspect.
  • the lyophilized preparation of the present invention has a tissue repair ability similar to platelet-rich plasma (PRP) prepared from blood and the lyophilized preparation thereof. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is expected to have a wide range of effects in the fields of dermatology, plastic surgery, dentistry, and orthopedics, for example, for intractable skin ulcers, pressure sores (bedsores), burns, and diabetes in dermatology. It can be used for patient gangrene, promotion of dental alveolar bone and gingival regeneration, and promotion of bone fusion.
  • PRP platelet-rich plasma
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be applied to a damaged part of cartilage or muscle, to an affected part during surgery, to an affected part of osteoarthritis, rheumatism, meniscus tear, lateral humerus condyleitis, or to the face. It can be administered to improve wrinkles on the skin such as the neck and neck and promote hair growth.
  • the lyophilized preparation of the present invention is rich in BMP2 and / or BMP4, it is suitably used among the above-mentioned applications, particularly for promoting bone union or for treating or preventing skin diseases.
  • it relates to the pharmaceutical composition of the present invention, which comprises the lyophilized preparation of the present invention in an amount effective for promoting bone fusion or treating or preventing a skin disease.
  • Bone fracture is called a fracture, and it is also a fracture when a bone is cracked, a part of the bone is missing, or the bone is dented.
  • the bone and its surroundings are rich in nerves and blood vessels, so that the fracture causes pain and swelling at the site, and if the fracture is severe, it becomes immobile and the appearance is deformed.
  • Fractures include open fractures in which the skin is torn at the same time as the fracture and the fractured part is exposed, crushed fractures in which the fractured part is complicatedly crushed, and incomplete fractures with only cracks without dislocation (displacement). Fractures damage the bones, the periosteum that covers the bones, or the surrounding soft tissues, causing bleeding.
  • the bleeding blood contains certain fibers, which induce differentiation of osteoblasts that produce and secrete collagen and proteoglycan, form collagen fibers that serve as pillars of bone tissue, and construct bone tissue. ..
  • the process of reconstructing this bone tissue is "bone fusion". Bone adhesion is synonymous with bone adhesion.
  • promoting bone union means a process of reconstructing a bone fragment destroyed and separated by a fracture, restoring the continuity of the broken bone tissue, and regaining the support and strength of the bone.
  • promoting bone fusion means, in addition to the mere process of regaining the support and strength of bone, it is destroyed and separated by fracture earlier and more appropriately than the above-mentioned natural bone tissue reconstruction. It also means the process of reconstructing broken bone fragments, restoring the continuity of broken bone tissue, and regaining bone support and strength.
  • stage 1 to 5 Fracture hematoma stage (1st stage, 8-10 days) where periosteum, bone marrow, muscles and blood vessels are damaged and hematoma is formed.
  • Stage (2nd stage, 10 to 25 days) periosteal cell proliferation stage (3rd stage, 20 to 60 days) in which the initial callus shrinks and becomes bone as a whole, hardening of the spongy bone-like callus into hard bone
  • stage 4th stage, 50 days to 6 months
  • a modification stage (5th stage, 4 to 12 months) in which the bone is completely wrapped in normal periosteum.
  • "promoting bone fusion""earlier and more appropriately than this natural reconstruction of bone tissue” means an aspect that induces bone fusion earlier and more reliably than this healing process.
  • the skin disease means a wound on the skin, for example, intractable skin ulcer or pressure sore (bed sore), burn, necrosis or gangrene of the lower limbs of a diabetic patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention releases a plurality of proteins having physiological activities such as growth factors, increases capillary lymph vessels in the skin, and migrates skin fibroblasts. It is expected to be able to regenerate capillary lymphatic vessels, capillaries and new cutaneous granulation tissue, and to treat or prevent skin diseases such as skin ulcers, skin decubitus, and skin damage that occur during lower limb ischemia.
  • it can be administered to a subject to improve wrinkles on the skin such as the face and neck and promote hair growth.
  • platelets are positioned as functional cells that do not have cell nuclei and do not scientifically proliferate, or as cell fragmentation preparations in the pharmaceutical affairs, and are indicated in blood transfusion preparations for the purpose of killing mixed nucleated cells.
  • the megakaryocytes and platelets which are the active ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention, can be prepared in the same manner as the lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets which have been induced to differentiate from stem cells in vitro.
  • the definition of stem cells and the like and the method for preparing the stem cells and the like are the same as those in the lyophilized preparation of the present invention.
  • the "effective amount for promoting bone fusion" of megakaryocytes and platelets in the pharmaceutical composition of the present invention may be any amount as long as it can promote bone fusion, and the values are not particular. The same applies to "effective amounts for treating or preventing skin diseases".
  • megakaryocytes and platelets are produced at a dose of about 2 x 10 6 to about 2 x 10 10 cells, preferably about 2 x 10 7 to about 2 x 10 9 cells, per dose. , Can be administered.
  • megakaryocytes and platelets are about 2 x 10 6 to about 2 x 10 10 cells per 1 cm 2 wound, preferably about 2 x 10 cells per dose. It can be administered in 10 7 to about 2 x 10 9 cells (eg, 4.5 x 10 7 cells).
  • the number of megakaryocytes administered per administration is not particularly limited, but as an example, 3% or more, preferably 5% or more, more than the number of platelets administered per administration.
  • the upper limit of the number of megakaryocytes administered per administration is not particularly limited, but as an example, 500% or less, preferably 100% or less, more preferably 100% or less of the number of platelets administered per administration. It can be 50% or less.
  • the amount administered depends on a variety of factors, including age, body weight, gender of the subject, disease / condition to be treated, and its extent and severity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can further contain growth factors released from megakaryocytes and / or platelets, in addition to megakaryocytes and platelets.
  • Growth factors in the present invention include bone-forming proteins (Bonemorphogenetic proteins) such as BMP2, BMP4, BMP7; Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), such as PDGF-BB; platelet-derived angiogenic factors (Platelet).
  • BMP2, BMP4, BMP7 bone-forming proteins
  • PDGF Platelet-Derived Growth Factor
  • BB platelet-derived angiogenic factors
  • -Derived Angiogenesis Factor PDAF; Transforming Growth Factor: TGF, for example TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3; Vascular Endothelial Growth Factor: VEGF, epithelial cell proliferation Factor (Epidermal Growth Factor: EGF), Fibroblast growth factor (FGF), for example, Basic FGF; Hepatocyte growth factor (HGF) Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor: PD-ECGF); Insulin-like Growth Factor (IGF); and Platelet Factor IV (PF4); at least one selected from these is included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains at least BMP2 and / or BMP4. The definitions of these growth factors and the method for preparing them are similar to those in the lyophilized preparation of the present invention.
  • composition of the present invention may be formulated with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or as a pharmaceutical formulation component.
  • the test compound may be formulated for administration in any convenient way for use in pharmaceuticals.
  • Suitable medications are one or more pharmaceutically acceptable sterile isotonic or non-aqueous solutions (eg, Equilibrium Salt Solution (BSS)), dispersions, suspensions or emulsions, or just before use. It can be combined with sterile injectable solutions or dispersions that may contain oxidants, buffers, bacteriostats, solutes or suspensions or thickeners.
  • BSS Equilibrium Salt Solution
  • the composition of the present invention may be a preparation suitable for therapeutic use, such as no febrile substance, or substantially no febrile substance, and sterile.
  • the medicament used in the present invention may be in sterile, physiologically acceptable form without febrile material.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered in suspensions, gels, colloids, slurries, or mixtures.
  • the base materials used for the pharmaceutical composition and the lyophilized preparation of the present invention are as follows.
  • the present invention can typically include the step of administering the pharmaceutical composition or lyophilized formulation of the present invention as a graft to the fractured area.
  • the present invention comprises an active agent dispersed in a biodegradable polymer substrate.
  • the biodegradable polymer may be, for example, a poly (lactic acid-co-glycolic acid) acid (PLGA) copolymer, a biodegradable poly (DL-lactic acid-co-glycolic acid) film, or a PLLA / PLGA polymer substrate. Good.
  • the ratio of glycolic acid monomers in the polymer is about 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25, more preferably about 50/50 weight percent.
  • the PLGA copolymer may be about 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 to about 90% by weight of the biodegradable implant.
  • the PLGA copolymer may be from about 30 to about 50% by weight, preferably about 40% by weight of the biodegradable implant.
  • the pharmaceutical compositions and lyophilized formulations of the present invention are polylactic acid, poly (lactic acid-co-glycolic acid), 50:50 PDLGA, 85:15 PDLGA, and INION GTR® biodegradable membranes (biocompatibility).
  • the present invention is a method for promoting bone fusion or treating or preventing a skin disease, and the lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets of the present invention requires such treatment.
  • the present invention relates to a method comprising administering to such a subject, preferably a method comprising administering an effective amount of the lyophilized preparation of the present invention to such a subject.
  • the present invention relates to another aspect of the lyophilized preparation containing the megakaryocytes and platelets of the present invention for promoting bone fusion or treating or preventing a skin disease.
  • the present invention relates to the use of the lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets of the present invention for producing a medicament for promoting bone fusion or treating or preventing a skin disease.
  • the term "subject” or “patient” means humans and non-human animals, and the non-human animals include pet animals such as primates, dogs, cats, and small birds, mice, and rats. , Guinea pigs, rabbits, chickens, pigs, horses, sheep and cows, but not limited to these.
  • the subject or patient is a human and a pet animal, more preferably a human.
  • Reference example 1 Establishment of immortalized megakaryocytes and induction of differentiation into platelets Cell Stem Cell. 2014 Apr 3; 14 (4): Induced differentiation of platelets from the immortalized megakaryocyte strain established in 535-48. That is, the iPS cell line Sev2 prepared by introducing Yamanaka 4 factors into the purchased fetal fibroblasts with Sendai virus has been reported (Takayama et al., Blood 111, 5298-5306 (2008); Takayama et al., J.
  • pluripotent hematopoietic progenitor cells were obtained by the Sac method.
  • the pluripotent hematopoietic progenitor cells were infected with c-MYC and BMI-1 using lentiviral vector-derived viruses (2 types).
  • the BCL-xL gene was introduced into the proliferating cell population to acquire a cell population that proliferated while maintaining CD41a / CD42b expression for 1 month or longer. This is called an immortalized megakaryocyte cell line (imMKCL).
  • imMKCL Clone 7 was used for the following tests.
  • imMKCL Clone 7 was grown by culturing in the presence of doxycycline (ie, expressing c-MYC / BMI-1 / BCL-xL) and then under medium conditions without doxycycline (ie). By culturing for 6 to 7 days (with the expression of c-MYC / BMI-1 / BCL-xL stopped), differentiation into platelets was induced.
  • the culture conditions were according to Cell Stem Cell. 2014 Apr 3; 14 (4): 535-48.
  • Example 1 Preparation of lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets
  • Example 1-1 Activation of cell mixture of platelets and immortalized megakaryocytes 2.0 x 10 5 cells / ml immortalized megakaryocyte cell line Clone 7 (another name, Sev2 clone: Nakamura et al., Cell Stem Cell.
  • Example 1-2 Freeze-drying treatment of a cell mixture of platelets and immortalized megakaryocytes
  • the cell mixture (sterile) of platelets and immortalized megakaryocytes prepared in Example 1-1 was placed in a tube for freeze-drying.
  • the cells were dispensed (1 ml x 9 and 750 ⁇ l x 4) and transferred to a sterile culture vessel equipped with a membrane filter, which was used as a sample for lyophilization.
  • This freeze-drying sample was first sufficiently pre-frozen at -60 ° C below the eutectic point for more than one day and night. Next, it was subjected to a freeze-drying machine (EYELA FDU-1200) previously set to ⁇ 45 ° C. or lower, and freeze-dried for 1 day and night or more under reduced pressure by a vacuum pump to prepare a desired freeze-dried preparation.
  • EYELA FDU-1200 freeze-drying machine
  • Example 2 Confirmation of bone fusion effect in lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets
  • a rat lumbar fusion model was prepared according to the method described in Shiga, et al. Sci Rep. 2016 Nov 11; 6: 36715, and Example 1
  • the bone fusion promoting effect of the freeze-dried preparation containing iPS cell-derived immortalized megakaryocytes and platelets prepared in -2 was confirmed. That is, a lumbar fusion model was created using SD rats (8 weeks old). A skin incision was made at the 4th-6th lumbar spinous process level, and a longitudinal fascial incision was made 1.5 mm lateral to the center of the spinous process. The back muscles were bluntly deployed to expose the 4th-6th lumbar transverse processes.
  • Figure 1 shows an X-ray image of the rat spine 2 weeks after transplantation.
  • a lyophilized preparation containing iPS cell-derived immortalized megakaryocytes and platelets was transplanted between the rat spinal transverse processes, bone bridge was observed between the transverse processes 2 weeks after the transplantation. From this result, it was suggested that the lyophilized preparation containing iPS cell-derived immortalized megakaryocytes and platelets has an excellent bone fusion promoting effect and bone forming ability.
  • Example 3 Measurement of Growth Factor Concentration in Formulation
  • the growth factor concentration in the preparation immediately after activation of megakaryocytes / platelets and after freeze-drying was measured by ELISA.
  • the kit used is shown in [Table 2].
  • the concentration of megakaryocyte cells at the time of activation was 1 x 10 6 cells / ml.
  • the results are shown in [Table 3].
  • the growth factor concentration immediately after activation (before FD) is the concentration in 1 ml of the cell mixture.
  • the growth factor concentration after freeze-drying (after FD) is the concentration when each vial is filled up to 1 ml with purified water. Even after lyophilization, the amount of each cytokine contained in the formulation was well maintained.
  • Example 4 Measurement of BMP2 and BMP4 Concentration
  • the BMP2 and BMP4 concentration in the preparation immediately after the activation of megakaryocytes / platelets (before FD formation) was measured.
  • PRP prepared from human peripheral blood containing the same number of platelets was activated in the same manner as in Example 1-2 (2 individuals: human PRP1 and human PRP2), and the BMP2 and BMP4 concentrations in PRP were measured.
  • a differentiation medium (doxycycline was removed from the growth medium and SR1 750uM, Y27632 10 mM and KP457 15 mM was added) was used.
  • the results are shown in Fig. 2.
  • the activated supernatants of iPS cell-derived immortalized megakaryocytes and platelets had higher BMP2 and BMP4 concentrations than human peripheral blood-derived activated PRPs with the same platelet count. Individual differences were observed in the BMP2 and BMP4 concentrations in activated PRP derived from human peripheral blood.
  • Example 5 Detection of mature iPS cell-derived megakaryocytes and cytokines released from platelets
  • the iPS cell-derived immortalized megakaryocyte strain imMKCL prepared in Reference Example 1 was used as a differentiation medium (SR1 750uM, Y27632 10 mM and KP457 15 mM excluding doxicycline from the growth medium).
  • Mature megakaryocytes and platelets (MMK-PLT) were obtained by shaking culture in (added). We examined whether MMK-PLT releases wound healing-promoting cytokines similar to human peripheral blood-derived PRP.
  • mRNA was recovered from MMK-PLT on days 0, 4 and 6 of differentiation, and the gene expression of TGF- ⁇ 1, PDGF-BB and EGF was analyzed over time using the RT-qPCR method.
  • CaCl 2 and thrombin were added to each MMK-PLT for activation, and centrifugation was performed to collect the supernatant.
  • concentrations of TGF ⁇ , PDGF-BB, EGF, and bFGF protein contained in this supernatant were measured by the ELISA method.
  • the obtained results are shown in FIG.
  • the number of cells in the MMK / PLT-administered group was significantly increased as compared with the control group.
  • the proliferation ability decreased in the FBS-administered group, but the proliferation continued in the MMK / PLT-administered group, and a significant difference was observed in the number of cells.
  • Example 7 In vivo Wound Healing Assay MMK-PLT was verified using an animal model to actually promote wound healing. Specifically, 6 mm-sized full-thickness skin defects were created on the left and right backs of immunodeficient mice (NOD / SCID IL2R deficiency) (obtained from Claire Japan). On the 5th day of differentiation, MMK-PLT (prepared as described in Example 5) was collected, and 8 ⁇ 10 5 cells were subcutaneously placed around the skin defect as the number of immortalized megakaryocyte line cells at the start of differentiation culture. I injected it.
  • the number of immortalized megakaryocyte lineage cells at the start of differentiation culture was 2 ⁇ 10 5 mixed with the basement membrane matrix preparation, applied to the wound surface, and dressed with a polyurethane film.
  • the total dose for one wound is 1 ⁇ 10 6 as the number of immortalized megakaryocyte cells at the start of differentiation culture, which is 3 as the number of immortalized megakaryocyte cells at the start of differentiation culture per 1 cm 2 of wound.
  • ⁇ 10 Corresponds to a dose of 6 doses. From Table 5 of Example 10, at the time of administration (5th day of differentiation), about 2.2 ⁇ 10 6 megakaryocytes and about 1.5 ⁇ 10 7 platelets (about 6.6 per 1 cm 2 wound) per wound.
  • Example 8 Preparation of lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets 2
  • An immortalized megakaryocyte cell line (NC13X) differentiated from an iPS cell line (MKCL21 #) different from that of Example 1 was used.
  • 2.3 x 10 7 NC13X cells were subjected to differentiation culture (Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174 (3): 636-648, 2018) in the absence of doxycycline as in Example 1. ..
  • the cell mixture of platelets and megakaryocytes on day 6 of differentiation was centrifuged, the culture supernatant was discarded, and the resulting mixture of platelets and megakaryocytes was sterilized with 0.1% CaCl 2 in Tyrode buffer (23 ml). ) was added. Platelets and megakaryocytes were aseptically activated by incubation at 37 ° C. for 1 hour. The mixed solution of activated platelets and megakaryocytes was subjected to lyophilization treatment in the same manner as in Example 1-2 to obtain a lyophilized preparation.
  • the obtained lyophilized preparation was diluted with distilled water to a concentration of 1.0 x 10 6 cells / ml as NC13X cells at the start of differentiation culture, and PDGF, FGF, TGF- ⁇ and VEGF concentrations were measured by ELISA. The results are shown in [Table 4].
  • the obtained lyophilized preparation contained a sufficient amount of major cytokines.
  • Refit Hoya Corporation, Tokyo, Japan
  • the mixture of the lyophilized preparation of Example 8 was transplanted, and 5 weeks after the transplantation, the amount of new bone formation on the left and right was measured by Image J and compared. As a result, the amount of new bone formation was significantly increased on the side transplanted with the lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets derived from the iPS cell-derived immortalized megakaryocyte strain (Fig. 7).
  • the lyophilized preparation containing megakaryocytes and platelets derived from the iPS cell-derived immortalized megakaryocyte strain regardless of the type of iPS cell line, repairs the tissue and forms bones. It was suggested that it is rich in promoting cytokines and has excellent bone-forming ability.
  • Example 10 Analysis of Mixing Ratio of Megakaryocytes and Platelets Similar to Example 1, the immortalized megakaryocyte cell line Clone 7 was differentiated and cultured in the absence of doxycycline (Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174 (3): 636). -648, 2018)), the number of mature megakaryocytes (CD41 +) and platelets (CD41 + CD42 +) in the culture was measured with a flow cytometer over time, and the ratio of platelets to megakaryocytes was calculated.
  • doxycycline Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174 (3): 636.
  • FIG. 8 shows the result of monitoring the differentiation into platelets with a flow cytometer
  • FIG. 9 shows the result of monitoring the differentiation into mature megakaryocytes with a flow cytometer.
  • a numerical graph based on the results of FIGS. 8 and 9 is shown in FIG.
  • platelets after differentiation culture are indicated by "CD41 + 42 + Plt”
  • mature megakaryocytes are indicated by "CD41 + MK”.
  • the specific numerical values of each cell number in FIG. 10 are shown in Table 5.
  • the number of mature megakaryocytes gradually increased from day 0 to day 6 of differentiation (Fig. 9, Table 5).
  • the number of platelets was very small until the 3rd day, but increased sharply after the 4th day (Fig. 8, Table 5).
  • Table 5 shows the ratio of the number of platelets to the number of megakaryocytes calculated from the results of each flow cytometer and its graph.
  • Table 6 shows that the ratio of the number of megakaryocytes to platelets is 2 ⁇ 10 2 to 1.5 ⁇ 10 4 platelets per 1 ⁇ 10 3 megakaryocytes.
  • the present invention by lyophilizing and storing platelet-derived PRP induced to differentiate from stem cells including iPS cells, it can be supplied as a pharmaceutical preparation when necessary.
  • a completely antigenic-free iPS cell-derived FD-PRP and it can be safely used for other patients, it will not be necessary to prepare errands in surgery, and it will be possible to use it as an effective new formulation.
  • the sex will be significantly improved and the treatment in the orthopedic field and the dermatological field will be dramatically developed. It also plays a role in patient ADL and quality of life, as existing commercialized materials can effectively promote early bone fusion and skin repair in fractures and spinal surgery without patient invasion or burden on the healthcare professional.
  • the vigorous tissue repair ability of PRP in the present invention may be useful for ulcerative intractable wounds, nerve damage, spinal cord injury, etc., which were conventionally difficult to treat, and the composition of the present invention is worldwide. It is expected to develop into a commercial industrial product.

Abstract

自己血漿由来の多血小板血漿およびその凍結乾燥製剤における成長因子等の成分および量におけるロット差が大きく、効果が一定でない点を解消する。　具体的には、幹細胞から分化誘導される巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤、当該凍結乾燥製剤を含む医薬組成物等を提供する。

Description

巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤
　本発明は、巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤に関する。詳細には、本発明は、巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤、ならびに当該製剤における骨癒合を促進させる、または皮膚疾患を処置もしくは予防する用途に関する。
　外傷による骨折、および腰椎すべり症や腰部脊柱管狭窄症等の腰椎変性疾患では、不安定性に伴う痛み・麻痺などの症状が問題となるため、病変部の安定化を目的として骨の連続性が絶たれた部分や隣接する可動性の複数要素を固定する手術が行われる。これらの手術において、骨癒合による安定化は非常に重要な要素であり、整形外科手術の大きな目的の一つである。しかし、現状では、術後でも自然経過による骨癒合を期待せざるを得ず、完全な骨癒合には早くとも数週間、場合により一年近くを要することがあり、経過によっては、完全な骨癒合は得られず慢性的な不安定状態である偽関節を生じ、慢性的な不安定化・疼痛を来たすことも見受けられる。
　骨癒合に関するこのような治療経過は時に、患者のADL（Activities of Daily Living、日常生活動作）やQOL（Quality of Life、生活の質）の重大な障害にもつながるため、術後の骨癒合促進の効率化に関する追究は整形外科領域において急務である。
　この命題に対し、自己血漿の遠心、濃縮により安全に得られる多血小板血漿(Platelet Rich Plasma: PRP)が注目されている。PRPは旺盛な組織修復能を持つことが知られ、形成外科や歯科領域、そして整形外科領域では腱や靭帯の修復効果を期待した研究が多くなされ、そしてスポーツ領域ではメジャーリーガーに対する自家PRP治療としても注目を浴びており、世界的にさらなる研究が進められている。しかし、PRPについて骨癒合を目的とした研究は、これまでのところあまり行われていない。本発明者らは既に先行研究においてラット脊椎固定術におけるPRP投与が、感染や拒絶反応の危険性がなく有意に骨癒合を促進することを確認した（非特許文献１）。さらに、これまで人工骨として用いられてきたハイドロキシアパタイトとPRPの併用にて良好な骨癒合が得られる事もラットを用いた動物実験で報告した（非特許文献２）。そして、動物実験で得られた結果をもとに、トランスレーショナルリサーチとしてPRPを用いた2つの臨床試験を行った結果、脊椎固定術において、自家骨もしくは他家骨に新鮮PRPを併用すると、いずれも、平均約1－2ヶ月間の骨癒合期間短縮を得られるという結果を得た（非特許文献３）。このようにPRPは、安全性が高く、優れた骨癒合促進効果を持つため、整形外科領域の治療において非常に有用であり、将来性のある治療法を提供できることが強く示唆されている。
　さらに、PRPは、PRP療法に用いることができる。PRP療法は、自己血液中に含まれる血小板の成長因子等の生理活性を保有するタンパク質が持つ組織修復能力を利用し、ヒトに本来備わっている「治癒力」を高める再生医療である。例えば、難治性皮膚潰瘍や褥瘡（床ずれ）、熱傷、糖尿病患者の下肢の壊死または壊疽、歯科の歯槽骨や歯肉の再生促進のためにこれらの患部にPRPを投与することができる。さらには、顔や首などの皮膚のしわ改善や発毛促進のために患者にPRPを投与してもよい。特に、PRPは、皮膚内に投与すると成長因子等の生理活性を保有する複数のタンパク質を放出し、皮膚内に毛細リンパ管を増加させ、また皮膚線維芽細胞が遊走することから、毛細リンパ管や毛細血管および皮膚新生肉芽組織を再生できると期待される。
　しかし、PRPは問題点として、寿命が数時間～数日程度と極めて短いため、効果的な使用のためには、使用直前に患者本人から一定量の血液を採取し自家PRPとして用事調製する必要がある。具体的には、手術での使用の際には術直前に約200cc程度の採血をする必要があり、患者の身体に大きな負担になるのみではなく、短時間での用事調製となるため品質を一定にすることが難しいことに加え、多くの人手と手間を要する。その理由から、特に外傷等の緊急を要する場面での使用は極めて困難であった。新鮮PRPの持つこのような問題点を克服するため、本発明者らは凍結乾燥PRP（Freeze-dried PRP: FD-PRP）に注目し、研究を重ねてきた。結果、FD-PRPは常温で８週間保存後も成長因子が消失せずに大半が維持されること、そして新鮮PRPと同等の骨癒合促進効果を有することが確認出来、FD-PRPの有効性が示された（非特許文献４、非特許文献５）。
Kamoda H, et al., J Bone Joint Surg Am. 2013 Jun 19; 95 (12): 1109-16 Kamoda et al., Spine (Phila Pa 1976). 2012 Sep 15; 37 (20): 1727-33 Kubota, et al. Asian Spine J. 2017 Apr; 11 (2): 272-277 Shiga, et al. Sci Rep. 2016 Nov 11; 6: 36715 Shiga Y et al., Asian Spine J., 2017, Jun; 11 (3): 329-336
　一方で、PRPおよび凍結乾燥PRPのいずれであっても、さらなる患者侵襲の低減および供給効率化の観点からすると、自己の採血でその都度ごとに用事調製する自己血由来ではなく、既成の製品化された安全な製剤がより望ましいと考えられる。また、治療対象範囲が広い場合や重症例には、PRPおよび凍結乾燥PRPは多くの使用量となりうる。しかし、PRPの原料である血小板は有効期限が４日間と極端に短く、安定供給が困難である。現状では本人もしくは献血ドナーに依存し、近い将来、日本を含む多くの国において、需要に供給が追いつかないことが予想される。また、自己血漿由来の多血小板血漿およびその凍結乾燥製剤における成長因子等の成分および量におけるロット差が大きく、効果が一定でない点も問題である。
　自己採血や献血にとって代わる新たな生産システムとして、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells: iPSC）を用いた血小板作製技術が希求されてきた。江藤らは、2010年にヒトiPS細胞から血小板が生産できることを発表し（Takayama, Eto, et al. J Exp Med. Vol. 207, December 20, 2010）、さらに同グループでは2014年にヒトiPS細胞から自己複製が可能な巨核球を、生体外で凍結保存が可能な不死化巨核球株として作製する方法を確立した（Nakamura, Eto, et al. Cell Stem Cell 14, 535-548, April 3, 2014）。2019年6月より京都大学にて同血小板を用いた臨床試験が世界に先駆けて開始されている。
　そこで、iPS細胞を含む多能性幹細胞から分化誘導される血小板を用いて調製された凍結乾燥製剤が、自己血漿由来のPRPおよび凍結乾燥PRPと同様、副作用や有害事象無く、所望の効果、例えば骨癒合促進効果を有するか否かが問題である。
　本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、インビトロにおいて幹細胞から分化誘導した血小板を用いて凍結乾燥製剤を調製し、調製された凍結乾燥製剤が、自己血漿由来のPRPおよび凍結乾燥PRPと同様、豊富な成長因子を含むことを確認した。この凍結乾燥製剤には、血小板に加えて巨核球が含まれ、BMP2やBMP4の含有量が自己血漿由来のPRPや凍結乾燥PRPよりも高かった。同凍結乾燥製剤を用いて、ラットを使用した腰椎後側方固定術モデルにおける骨癒合促進効果を検討したところ、骨癒合および骨形成能が旺盛であることを見出し、本発明を完成した。
　したがって、本発明は、以下の態様を含む。
＜凍結乾燥製剤＞
［１］
　巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤。
［２］
　巨核球および血小板が、インビトロで幹細胞から分化誘導される、［１］記載の凍結乾燥製剤。
［３］
　幹細胞が多能性幹細胞または造血幹細胞である、［１］または［２］記載の凍結乾燥製剤。
［４］
　多能性幹細胞がiPS細胞である、［２］または［３］記載の凍結乾燥製剤。
［５］
　巨核球および／または血小板から放出される成長因子をさらに含有する、［１］から［４］のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
［６］
　成長因子が、骨形成タンパク質、血小板由来増殖因子、血小板由来血管形成因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子、インスリン様成長因子、および血小板因子IVからなる群から選ばれる少なくとも一つの因子である、［５］記載の凍結乾燥製剤。
＜医薬組成物＞
［７］
　［１］から［６］のいずれか記載の凍結乾燥製剤を含む、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための医薬組成物。
［８］
　［１］から［６］のいずれか記載の凍結乾燥製剤を、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するのに有効な量で含む、［７］記載の医薬組成物。
＜医薬用途＞
［９］
　骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための方法であって、請求項１から６のいずれか記載の凍結乾燥製剤を、そのような処置等を必要としている対象に投与することを含む方法。
［１０］
　骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための方法であって、請求項１から６のいずれか記載の凍結乾燥製剤を、そのような処置等を必要としている対象に、その有効量を投与することを含む、［９］記載の方法。
［１１］
　骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための、［１］から［６］のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
［１２］
　骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための医薬を製造するための、［１］から［６］のいずれか記載の凍結乾燥製剤の使用。
＜凍結乾燥製剤の調製方法＞
［１３］
　巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤を調製する方法であって、
（A）血小板および巨核球の細胞混合液を調製し、および
（B）血小板および巨核球の細胞混合液を凍結乾燥する、ことを特徴とする方法。
［１４］
　工程（A）において、巨核球が、幹細胞から分化誘導される不死化巨核球である、［１３］記載の方法。
［１５］
　工程（A）にて調製する細胞混合液を活性化させる、［１３］または［１４］記載の方法。
　本発明によれば、iPS細胞を含む幹細胞から分化誘導される血小板由来PRPを凍結乾燥することにより、必要時に医薬製剤として供給することが可能となる。抗原性フリーのiPS細胞由来FD-PRPを開発し、他患者への安全使用が可能になれば、手術における用事調製を不要とし、有効な新規製剤としての汎用性の可能性が格段に高まる。また、患者の侵襲や医療者の負担なく、既存の製品化された材料で骨折や脊椎手術における早期の骨癒合が効率的に促進されれば、患者のADLおよびQOLの劇的な改善が図られ、手術による合併症の減少・緩和、入院期間の短縮による医療経済の改善に大きく寄与するものと考えられる。
図１は、腰椎固定術ラットモデルにおいて、iPS細胞由来不死化巨核球および血小板を含む本発明の凍結乾燥製剤が優れた骨癒合促進効果および骨形成能を有していることを示す、ラット脊椎のレントゲン画像である。 図２は、本発明の凍結乾燥製剤の調製過程において、巨核球／血小板活性化直後（凍結乾燥前）における製剤（FD化前）、同じ数の血小板を含むヒト末梢血から調製したPRPを同様に活性化したもの（ヒトPRP１、ヒトPRP2）、および対照（分化培地）におけるBMP2およびBMP4濃度を測定した結果を示すグラフである。本発明の製剤（FD化前）は、同一血小板数を含む活性化PRPよりもBMP2およびBMP4濃度が高いことが分かる。 図３は、iPS細胞由来不死化巨核球株 (imMKCL)由来の成熟巨核球および血小板 (MMK-PLT)におけるサイトカイン遺伝子発現の成熟に伴う変化を示すグラフである。 図４は、iPS細胞由来不死化巨核球株 (imMKCL)由来の成熟巨核球および血小板 (MMK-PLT)から活性化により放出されるサイトカインタンパク質量（pg/ml）の成熟に伴う変化を示すグラフである。 図５（左）は、iPS細胞由来不死化巨核球株 (imMKCL)由来の成熟巨核球および血小板 (MMK/PLT)を活性化して得た上清がヒト初代培養線維芽細胞の増殖に与える影響を示すグラフである。図５（右）は、培養5日目のヒト初代培養線維芽細胞の写真である。 図６（左）は、iPS細胞由来不死化巨核球株 (imMKCL)由来の成熟巨核球および血小板 (MMK/PLT)が創面積縮小率に与える影響を示すグラフである。図６（右）は、7日目における創面積縮小率のグラフと創部の写真である。 図７は、ラット腰椎固定術モデルにおける、iPS細胞由来不死化巨核球株由来の巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の新規骨形成への効果を示すグラフである。 図８は、iPS細胞由来不死化巨核球株由来の血小板への分化を経時的にフローサイトメーターでモニターした結果である。右上の画分が血小板に相当する。縦軸は側方散乱を、横軸は前方散乱をそれぞれ示す。 図９は、iPS細胞由来不死化巨核球株由来の成熟巨核球への分化を経時的にフローサイトメーターでモニターした結果である。右上の画分が成熟巨核球に相当する。縦軸は側方散乱を、横軸は前方散乱をそれぞれ示す。 図１０は、分化培養後の血小板（CD41+42+Plt）および成熟巨核球（CD41+MK）の数の経時的な変化を示したグラフである。
＜凍結乾燥製剤＞
　本発明はひとつの態様として、巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤に関する。
　本発明の凍結乾燥製剤は、組織修復能を有している。同様に、組織修復能を持つ、形成外科、歯科領域および整形外科領域において広くその効果が確認されている血液由来の多血小板血漿（PRP）および／またはそれを凍結乾燥した凍結乾燥PRP製剤が知られている（Kamoda H, et al., J Bone Joint Surg Am. 2013 Jun 19;95(12):1109-16, Shiga, et al. Sci Rep. 2016 Nov 11;6: 36715, , Shiga Y, Asian Spine J. 2017 Jun;11(3):329-336.）。これらPRP製剤には、「巨核球」が実質的に含まれないため、この点、本発明の凍結乾燥製剤とは構成を異にする。詳細には、本発明の凍結乾燥製剤は、従来のPRP製剤と比較し、巨核球を比較的多く含む点で相違している。また、本発明の凍結乾燥製剤は、従来のPRP製剤と比較し、特定の液性因子、例えばBMP2および／またはBMP4の含有量が高い点で、相違し得る。巨核球は生体内では造血幹細胞に由来し、骨髄の中で、巨核球系前駆細胞(CFU-Meg)、巨核芽球、前巨核球を経て巨核球へと成熟するが、細胞***せずに核のみ2Nから64Nまで***するため、大きな多形核を持つ大型細胞へと成熟した結果である。巨核球は骨髄内では一般に洞様血管付近に存在するが、骨髄から出ることは出来ず、末梢血中では観察できない。細胞***を伴わない胞体内核***を起こし多形核を持つ。1個の巨核球から数千個の血小板が作成される。血小板は、血栓の形成や止血に必須の細胞であるため、白血病、骨髄移植、血小板減少症、抗癌治療などにおいて、血小板の需要は極めて高い。
　本発明において、巨核球は、不死化巨核球、未熟巨核球、成熟巨核球など、血小板を提供できるあらゆる巨核球を意味する。ここに、本発明における「未熟巨核球」とは、多核化が進んでいない巨核球（2Nから8N程度）であり、例えば、CD41が発現している巨核球のうち、巨核球成熟関連遺伝子群（GATA1、NF-E2、c-MPL、β1-チューブリンおよびMYH9）の発現量が低く、MYH10の発現量が高い巨核球である。従って、未熟巨核球は、「巨核球前駆細胞」と言い換えることができる。このような未熟巨核球として、造血前駆細胞から人工的に製造された未熟巨核球が例示される。本発明において、未熟巨核球は、クローン化されていても、されていなくても良く、特に限定されないが、クローン化されたものを未熟巨核球株と呼ぶこともある。一方、「成熟巨核球」とは、巨核球成熟関連遺伝子群の発現量が高く、MYH10の発現量が低い巨核球であり、多核化が進んでいる巨核球（8N以上）である。本発明において、「成熟化」とは、巨核球細胞の成熟が進むこと、即ち多核化あるいは細胞質の増加が進むこと、巨核球成熟関連遺伝子の発現量が増加すること、巨核球未熟関連遺伝子の発現量が低下することなどを意味し、成熟化させる工程を行う前と比較してこれらの傾向が見られる限り、必ずしも上記定義にいう成熟巨核球に至らない場合も含む。また、「成熟化」は、培養前後の細胞群を比較して、群全体として成熟化が進んでいる場合、即ち細胞群全体の核の合計が増加しているもしくは（加えて）細胞質が増加している（体積が増加している）場合をいう。
　本発明において、凍結乾燥製剤とは、当業者に周知のフリーズドライまたは凍結乾燥などのプロセスによって調製される、粉末状または粒状の製剤である。化学的かつ生物学的に安定な製剤であり、長期にわたり保存することができる。凍結乾燥製剤は、対象に投与する用時に水または生理食塩水等で溶解または懸濁して使用する。
　本発明は具体的な態様として、巨核球および血小板を含む本発明の凍結乾燥製剤において、巨核球および血小板が、インビトロで幹細胞から分化誘導される本発明の凍結乾燥製剤、より具体的には幹細胞が多能性幹細胞または造血幹細胞、さらに具体的には、多能性幹細胞がiPS細胞である本発明の凍結乾燥製剤に関する。
　本発明において、幹細胞は、生体を構成する多くの種類の細胞に分化できる分化多能性（pluripotency）と、***増殖を経ても分化多能性を維持できる自己複製能を併せ持つ細胞を意味し、血小板に分化できる幹細胞であれば何でもよい。
　本発明において、多能性幹細胞は、個体は形成しないが、三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に属する細胞系列すべてに分化し得る能力を有する幹細胞を意味し、血小板に分化できる多能性幹細胞であれば何でもよい。多能性幹細胞の好ましい例としては、ES細胞、iPS細胞、始原生殖細胞に由来する胚性生殖幹細胞（EG細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES)細胞、***幹細胞(GS細胞)、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが挙げられる。ES細胞は体細胞から核初期化されて生じたES細胞であってもよい。多能性幹細胞は、好ましくはES細胞またはiPS細胞である。多能性幹細胞は哺乳動物に由来するものであってもよく、好ましくはヒト由来の多能性幹細胞である。
　造血幹細胞とは、血球系細胞に分化可能な幹細胞であり、ヒト成体では主に骨髄に存在し、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージ）、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞を生み出す。造血幹細胞は、血球芽細胞または骨髄幹細胞とも呼ばれる。
　以下、多能性幹細胞の好ましい例について、説明する。
　ES細胞とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚に由来する多能性幹細胞である。ES細胞は、哺乳動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848；Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147；H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
　ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にして行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、などの遺伝子マーカーの発現をReal-Time PCR法で検出する、および/または、細胞表面抗原であるSSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81を免疫染色法にて検出することで行うことができる(Klimanskaya I,et al.(2006),Nature.444:481-485)。
　マウスES細胞としては、inGenious社、理化学研究所（理研）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能である。ヒトES細胞としては、米国国立衛生研究所（NIH）、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえばES細胞株としては、NIHのCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell Research InstituteのWA01(H1)株、WA09(H9)株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。また、ヒトES細胞株としては、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Research Instituteから、KhES-1、KhES-2、KhES-3およびKthES11は、京都大学ウイルス・再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
　iPS細胞とは、人工多能性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞とも称され、線維芽細胞などの体細胞へ特定の１種もしくは複数種の核初期化物質を、DNA又はタンパク質の形態で導入することによるか、または、ある特定の１種もしくは複数種の薬剤の使用により該核初期化物質の内在性のmRNAおよびタンパク質の発現量を上昇させることによって作製することができる、分化多能性と自己複製能を獲得した細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら, Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。ここで「体細胞」とは、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）を意味し、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。特に限定されないが、例えば、Oct3/4、Klf4、Klf1、Klf2、Klf5、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18、c-Myc、L-Myc、N-Myc、TERT、SV40LargeTantigen、HPV16E6、HPV16E7、Bmil、Lin28、Lin28b、Nanog、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Sall1、Sall4、Esrrb 、Esrrg、Nr5a2、Tbx3およびGlis1が例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、単独で使用されてもよく、組み合わされて使用されてもよい。そのような組合せは、上記初期化物質を、少なくとも1種、2種もしくは3種を含む組み合わせ、好ましくは3種もしくは4種を含む組み合わせとすることができる。
　上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトcDNAのヌクレオチド配列情報、並びに、該cDNAによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO2007/069666に記載のGenBank(米国NCBI)またはEMBL（ドイツ国）のAccession numbersにアクセスすることによって入手可能である。また、L-Myc、Lin28、Lin28b、Esrrb、EsrrgおよびGlis1のマウスおよびヒトのcDNA配列情報およびアミノ酸配列情報については、表１に示したNCBI Accession numbersにアクセスすることにより取得できる。当業者は、該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、DNAまたはRNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソームの使用、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（これらのベクターは、Cell,126,pp.663-676,2006;Cell,131,pp.861-872,2007;Science,318,pp.1917-1920,2007に準ずる。)、アデノウイルスベクター（Science,322,945-949,2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci.85,348-62,2009)などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BACおよびPAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science,322:949-953,2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトもしくはポリアデニル化シグナルなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい例として挙げられる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子またはピューロマイシン耐性遺伝子）、チミジンキナーゼ遺伝子、およびジフテリアトキシン遺伝子もしくはその断片などの選択マーカー配列、並びに、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）またはFLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。別の好ましい実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる(Kaji,K.et al.,(2009),Nature,458:771-775、Woltjen et al.,(2009),Nature,458:766-770、WO 2010/012077)。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（lymphotrophic herpes virus)、BKウイルスおよび牛乳頭腫ウイルス（Bovine papillomavirus)の起点とその複製に関わる配列を含んでいてもよい。例えば、EBNA-1およびoriP、または、Large TおよびSV40ori配列を含むことが挙げられる(WO 2009/115295、WO 2009/157201およびWO 2009/149233)。また、2種またはそれ以上の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させることができる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列と配列の間は、IRESまたは口蹄病ウイルス（FMDV)2Aコード領域により結合されていてもよい（Science,322:949-953,2008、WO 2009/092042およびWO 2009/152529)。
　核初期化に際して、iPS細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸（VPA)(Nat.Biotechnol.,26(7):795-797(2008)）、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例えば、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標)(Millipore)、HuSH  29mer shRNA Constructs against HDAC1(OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば5’-アザシチジン(5’-azacytidine))(Nat.Biotechnol.,26(7):795-797(2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294(Cell Stem Cell,2:525-528(2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human)(Santa Cruz Biotechnology）等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-チャネルカルシウムアゴニスト（L-channel calcium  agonist)(例えばBayk8644)(Cell Stem Cell,3,568-574(2008))、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤(例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA)(Cell Stem Cell,3,475-479(2008))、Wntシグナル伝達活性化因子（例えば可溶性Wnt3a)(Cell Stem Cell,3,132-135(2008))、LIFまたはbFGFなどの増殖因子、ALK5阻害剤(例えば、SB431542)(Nat.Methods,6:805-8(2009)）、有糸***活性化プロテインキナーゼシグナル伝達（mitogen-activated protein kinase signaling）阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（glycogen synthase kinase)-3阻害剤(PloS Biology,6(10),2237-2247(2008))、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA(R.L.Judson et al.,Nat.Biotech.,27:459-461(2009))、等を使用することができる。
　薬剤によって核初期化物質の内在性のタンパク質の発現量を上昇させる方法に使用される。そのような薬剤としては、6－ブロモインジルビン－3’－オキシム、インジルビン－5－ニトロ－3’－オキシム、バルプロ酸、2－(3－(6－メチルピリジン－2－イル）－1H－ピラゾール－4－イル）－1,5－ナフチリジン、1－(4－メチルフェニル）－2－(4,5,6,7－テトラヒドロ－2－イミノ－3(2H)－ベンゾチアゾリル）エタノンHBr(pifithrin－alpha）、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンJ2およびプロスタグランジンE2）等が例示される(WO 2010/068955）。
　また、樹立効率を高めることを目的として、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、神経ペプチドY、UTF1、IRX6、PITX2、DMRTBl等を用いてもよい。
　核初期化物質等の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　iPS細胞誘導のための培養培地としては、例えば(1)10～15%FBS（ウシ胎児血清）を含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培地(これらの培地にはさらに、LIF、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、(2)bFGFまたはSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用培地(例えばTX-WES培地、トロンボX社）または霊長類ES細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒトまたはサル）ES細胞用培地（販売先：リプロセル、京都、日本）、mTeSR-1）、などが含まれる。
　培養法の例としては、例えば、37℃、5%CO2存在下にて、10%FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培地中で体細胞と核初期化物質(DNA、RNAまたはタンパク質）を接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培地で培養し、該接触から約30～約45日またはそれ以上ののちにES細胞様コロニーを生じさせることができる。また、iPS細胞の誘導効率を高めるために、5～10%と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
　あるいは、上記細胞を、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理STO細胞またはSNL細胞等)上で10%FBS含有DMEM培地(これにはさらに、LIF、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、b-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25～約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを形成させることができる。フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外マトリックス（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法も例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
　上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ(100cm2)あたり約5 x 103～約5 x 106細胞の範囲である。
　iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。マーカー遺伝子として、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子を含むDNAを用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（すなわち、選択培地）で細胞の培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞（すなわち、樹立したiPS細胞）を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、または、発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞（すなわち、樹立したiPS細胞）を検出又は選択することができる。
　本明細書中で使用する「体細胞」は、生殖細胞以外のいかなる細胞(好ましくは、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタおよびラット）細胞)であってもよい。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞もしくは幹細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な幹細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
　iPS細胞および／またはそれらから分化誘導した細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、HLAの型が「実質的に同一」とは、細胞を移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLA遺伝子型が一致していることをいう。例えば、主たるHLA(例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる。
　EG細胞とは、精原細胞に由来する多能性幹細胞である（参考文献：Nature. 2008, 456, 344-49）。EG細胞は、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Y.Matsui et al.(1992),Cell,70:841-847;J.L.Resnick et al.(1992),Nature,359:550-551)。
　ntES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がntES(nuclear transfer ES)細胞である。ntES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47～52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
　***幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、***形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（M.Kanatsu-Shinohara et al.(2003)Biol.Reprod.,69:612-616; K.Shinohara et al.(2004),Cell,119:1001-1012)。***幹細胞は、神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF))を含む培地で自己複製可能であるし、ES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって***幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41～46頁,羊土社(東京、日本))。
　Muse細胞とは、間葉系細胞から分離される多能性幹細胞である（参考文献：Proc Natl Acad Sci USA. 2010, 107, 8639-43）。WO2011/007900に記載された方法にて製造することができ、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
　本発明においては、多能性幹細胞以外の「巨核球への分化能を有する細胞」からインビトロで分化誘導された巨核球および血小板を用いてもよい。例えば、造血幹細胞に由来する細胞であって分化誘導条件によっては巨核球へ分化することができる細胞を出発材料として用いることができる。その例として、造血幹細胞、造血前駆細胞、CD34 陽性細胞、巨核球細胞・赤芽球前駆細胞（MEP）、巨核球前駆細胞などが挙げられる。巨核球への分化能を有する細胞は公知の方法で得ることができ、例えば骨髄、臍帯血、末梢血等から単離するほか、ES細胞、iPS細胞等の多能性幹細胞から分化誘導することもできる。巨核球への分化能を有する細胞として造血前駆細胞を使用する場合、本発明の培養工程前に予め、癌遺伝子（例えばc-MYC遺伝子）およびアポトーシス抑制遺伝子（例えばBCL-xL遺伝子）、癌遺伝子（例えばc-MYC遺伝子）およびポリコーム遺伝子（例えばBMI1遺伝子）、または癌遺伝子（例えばc-MYC遺伝子）、ポリコーム遺伝子（例えばBMI1遺伝子）およびアポトーシス抑制遺伝子（例えばおよびBCL-xL遺伝子）を細胞に導入してもよい（WO2014/123242、WO2011/034073、WO2012/157586、US2016/002599、US2012/238023、US2014/127815）。
　本発明の凍結乾燥製剤は、巨核球および血小板を含むことを特徴とする。本発明の凍結乾燥製剤において、巨核球および血小板の混合比率は所望の比率で混合することができる。巨核球および血小板の混合比率とは具体的には、巨核球および血小板の個数の比率で表される。本発明において、巨核球および血小板の個数の比率は特に制限されるものではないが、例えば1×106個の血小板に対し、1×103～1×105個の巨核球（不死化巨核球株）、好ましくは1×106個の血小板に対し、1×103～5×104個の巨核球（不死化巨核球株）、より好ましくは1×106個の血小板に対し、2×103～1×104個の巨核球（不死化巨核球株）、さらに好ましくは1×106個の血小板に対し、2×103～5×103個の巨核球（不死化巨核球株）が含まれる。より、詳細には、本発明の凍結乾燥製剤は、2-3 x 106個の血小板に対し、5-6 x 103個から最大104個の巨核球（不死化巨核球株）を含むことができる。更なる局面において、本発明の凍結乾燥製剤に含まれる巨核球と血小板の個数の比率は、1×103個の巨核球（不死化巨核球株、成熟巨核球等）に対して、2×102～1.5×104個の血小板、好ましくは1.1×103～1.5×104個の血小板である。更なる局面において、特に限定されないが、本発明の凍結乾燥製剤に含まれる巨核球の個数は、一例として、同一製剤に含まれる血小板の個数の３％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上であり得る。本発明の凍結乾燥製剤に含まれる巨核球の個数の上限値は、特に限定されないが、一例として、同一製剤に含まれる血小板の個数の５００％以下、好ましくは１００％以下、より好ましくは５０％以下であり得る。
　本発明の凍結乾燥製剤は巨核球および血小板を含むが、血小板と巨核球の混合比率は所望の比率に調整することができる。所望の比率で調整する手法としては、多能性幹細胞、例えばiPS細胞からの分化誘導段階のどの時点で凍結乾燥するかで、製剤中における巨核球および血小板の比率を、血小板に対して巨核球が大なのか、血小板に対して巨核球が小なのかを調整できる。あるいは、血小板が放出される前の段階、すなわち巨核球のみの段階で回収したものと、放出された血小板のみを分離・回収したものを用意しておき、所望の比率で混合することもできる（例えば、WO2009/122747、US2011/053267）。当業者であれば任意の方法で、例えば培養液の一部分を採取して観察することにより、巨核球から血小板が放出されているかどうかを判別することができる。また、放出された血小板を任意の方法で回収することもできる。したがって、巨核球のみ、あるいは血小板のみを回収し、それらを任意の比率で混合して得た混合液を本発明の製剤に用いることができる。あるいは、任意の方法で、例えば培養液の一部分を採取して観察することにより、巨核球および血小板を任意の比率で含む混合物を回収し、それを本発明の製剤の作製に用いることもできる。
　本発明の凍結乾燥製剤に含まれる巨核球および血小板は、生存している細胞であっても、生存していない細胞であってもよい。さらに、本発明の凍結乾燥製剤は、調製における活性化またはその後の凍結乾燥により、巨核球および血小板が破砕されている可能性もあるが、このような凍結乾燥製剤も、本発明の巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤に含まれる。
　本発明の凍結乾燥製剤は、インビトロでiPS細胞から分化誘導された不死化巨核球株を血小板へ分化誘導して調製することができる（Cell Stem Cell 14, 535-548, April 3, 2014／WO2012/157586、US2014/127815）。本発明の目的のひとつに、自己血漿由来のPRPおよび凍結乾燥PRPにおける成長因子等の成分および量におけるロット差が大きく、ロット毎に効果が一定でない点を解消することである。一般に、再生医療の普及には目的とする細胞の大量供給システムの構築が重要である。本発明では、一定の確度で効果を保証するため、幹細胞から有効成分を調製するが、大量供給システムとして、iPS細胞および不死化巨核球株をストックしておき、これらを血小板に分化誘導するビジネスが可能となる。また、ストックしてある不死化巨核球株を第三者が入手し、これを血小板へ分化させる可能性もある。このように、本発明の調製工程においては、出発原料として、幹細胞（例：多能性幹細胞（iPS細胞等）、造血幹細胞）のみならず、インビトロで幹細胞から分化誘導された不死化巨核球株を利用し、血小板を分化誘導することもできる。このように、インビトロで幹細胞（例：多能性幹細胞（iPS細胞等）、造血幹細胞）から分化誘導された不死化巨核球株を出発材料として使用し、この不死化巨核球株を更にインビトロで分化誘導することにより得られた巨核球および血小板も「インビトロで幹細胞から分化誘導された巨核球および血小板」に含まれるものとする。
　本発明の凍結乾燥製剤は、巨核球および／または血小板から放出される成長因子をさらに含有していてもよい。本発明における成長因子には、骨形成タンパク質（Bone morphogenetic protein）、例えばBMP2、BMP4、BMP7；血小板由来増殖因子（Platelet-Derived Growth Factor：PDGF）、例えばPDGF-BB；血小板由来血管形成因子（Platelet-Derived Angiogenesis Factor：PDAF）；トランスフォーミング増殖因子（Transforming Growth Factor：TGF）、例えばTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3；血管内皮細胞増殖因子（Vascular Endothelial Growth Factor：VEGF）；上皮細胞増殖因子（Epidermal Growth Factor：EGF）；線維芽細胞増殖因子（Fibroblast growth factors：FGF）、例えばBasic FGF；肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor：HGF）；血小板由来内皮細胞増殖因子(Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor：PD-ECGF) ；インスリン様成長因子（Insulin-like Growth Factor：IGF）；および血小板因子IV（Platelet Factor IV：PF4）の中から選ばれる少なくとも一つが含まれる。好ましい態様において、本発明の凍結乾燥製剤は、少なくともBMP2および／またはBMP4を含有する。これらの成長因子は、巨核球および／または血小板の活性化により、あるいは凍結乾燥による巨核球および／または血小板の破砕により、巨核球および／または血小板から放出されるため、本発明の凍結乾燥製剤は、巨核球および血小板、ならびにこれら成長因子の混合物を構成し得る。好ましい態様では、本発明の凍結乾燥製剤は、BMP2および／またはBMP4を含み、これに加えて他の成長因子、例えばPDGF、PDAF、TGF、VEGF、EGF、FGF、HGF、PD-ECGF、IGFおよびPF4等の中から選ばれる１または複数の因子をさらに含むことができ、それにより、より優れた効果を発揮することができる。
　好ましい本発明の凍結乾燥製剤としては、BMP-2が高い血小板／巨核球混合物と、BMP-4が高い血小板／巨核球混合物を、所望の比率で混合している製剤が挙げられる。
　本発明の製剤には、これら成長因子が有効成分として複数含有される。これら成長因子は安定であるから、水や生理食塩水等に溶解または懸濁し、低温保存しても使用でき、凍結乾燥しておき、用時に水や生理食塩水等に溶解または懸濁して使用できる。なお、活性化した巨核球および／または血小板から放出された成長因子の方が、有効成分として重要であるため、例えば巨核球および／または血小板を残存させたままで、または血小板を濾別して製剤として、対象に投与することも可能である。
　本発明の凍結乾燥製剤には、当業者に周知の凍結乾燥製剤に一般的に使用される安定化剤、pH調整剤、等張化剤、賦形剤など、あるいは血漿が含まれていてもよい。凍結乾燥製剤に使用される安定化剤としては、糖類、例えばショ糖，トレハロースなど、糖アルコール類、例えばソルビトールなど、アミノ酸類、例えばL-アルギニンなど、水溶性高分子、例えばHES，PVPなど、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベートなどが挙げられる。pH調整剤としては、リン酸ナトリウム緩衝液、ヒスチジン緩衝液などが、等張化剤としては、塩化ナトリウムなどが、賦形剤としては、マンニトール、グリシンなどが挙げられる。
　本発明の凍結乾燥製剤は、幹細胞からインビトロで分化誘導された巨核球および血小板を含むことを特徴とし、多血小板血漿（PRP）同様、組織修復能を有している。従って、本発明の凍結乾燥製剤は、皮膚科、形成外科、歯科領域、そして整形外科領域において広くその効果が期待され、例えば、皮膚科の難治性皮膚潰瘍や褥瘡（床ずれ）、やけど、糖尿病の患者の壊疽、歯科の歯槽骨や歯肉の再生促進、および骨癒合促進という用途に使用できる。また、本発明の凍結乾燥製剤は、軟骨や筋肉の損傷部位に，外科手術の際に患部に、変形性関節症やリウマチ、半月板損傷、上腕骨外側上顆炎の患部に、また、顔や首などの皮膚のしわ改善や発毛促進のために投与することができる。
＜凍結乾燥製剤の調製方法＞
　本発明は、さらなる態様として、巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤を調製する方法であって、
（A）血小板および巨核球の細胞混合液、具体的には血小板および、インビトロにおいて幹細胞から分化誘導された不死化巨核球の細胞混合液を調製し、好ましくは、得られた細胞混合液を活性化し、および
（B）血小板および巨核球の細胞混合液を凍結乾燥する、ことを特徴とする方法に関する。
　工程（A）にて使用する血小板は、インビトロにて幹細胞から分化誘導された血小板である。好ましくはインビトロにて幹細胞から分化誘導された巨核球から分化誘導された血小板が好ましい。巨核球は、公知の方法により、幹細胞、好ましくは造血幹細胞またはiPS細胞等の多能性幹細胞から分化誘導することができる（WO2012/157586、US2014/127815、Nakamura, Eto, et al. Cell Stem Cell 14, 535-548, April 3, 2014）。巨核球から血小板を分化培養した後の培養物中には、通常、血小板および巨核球が含まれるので、これを血小板および巨核球の細胞混合液とすることができる。次いで、遠心分離などにより、細胞と培養上清とを分離し、選ばれる細胞部分をピペッティング等にて分散させ、次いで、好ましくは、細胞を活性化させる。これらはすべて、無菌的に行うのが好ましい。
　工程(A)において、細胞混合液（血小板および巨核球）を活性化する場合、刺激の手法としては、トロンビン、CaCl2、TXA2、エピネフリン、ADP が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、CaCl2、またはトロンビンとCaCl2との組み合わせが用いられる。これにより血小板および／または巨核球中に含まれる成長因子が細胞外へ放出される。
　工程（B）では、当業者に良く知られている凍結乾燥機を利用し、凍結乾燥を行う。凍結乾燥なる手法に特に拘るものでなく、水分を留去するすべての手法を適用することができる。従って、本発明の凍結乾燥製剤には、凍結乾燥なる手法を経ずに、任意の手法により水分が除去されている製剤が包含される。
　本発明の凍結乾燥製剤を調製する手法は以下に詳述するが、一例では、（a）血小板と不死化巨核球の細胞混合液の活性化、および（b）血小板と不死化巨核球の細胞混合液の凍結乾燥処理の2工程を実施する：
（a）血小板と不死化巨核球の細胞混合液の活性化
　105細胞/mlオーダーでの不死化巨核球の分化培養で得た培養後6～7日目の血小板と、不死化巨核球の細胞混合液を900rpm(170G)、15分の条件下で遠心分離した後、培養上清を廃棄する。次に、細胞濃度が培養時の10倍となるように、遠心沈渣に対して培養上清の1/10量の滅菌済み0.1％CaCl2 in Tyrode bufferを添加する。これをピペッティングにて、前記血小板と不死化巨核球の細胞混合液を緩くほぐし、そのままインキュベータ中で37℃で1時間反応させ、血小板と巨核球を無菌的に活性化させる。
（b）血小板と不死化巨核球の細胞混合液の凍結乾燥処理
　前記活性化された血小板と不死化巨核球の細胞混合液をメンブレンフィルター付きの無菌培養容器に移し、これを凍結乾燥処理用サンプルとする。凍結乾燥処理用サンプルを、まず共晶点以下の-60℃にて、1昼夜以上かけて十分に予備凍結する。次に予め－45℃以下に設定した凍結乾燥機（EYELA FDU-1200）に供し、バキュームポンプによる減圧で1昼夜以上かけて凍結乾燥処理し製剤を作成する。
　本発明の凍結乾燥製剤には、当業者に周知の凍結乾燥製剤に一般的に使用される安定化剤、pH調整剤、等張化剤、賦形剤など、あるいは血漿を添加することができる。凍結乾燥製剤に使用される安定化剤としては、糖類、例えばショ糖，トレハロースなど、糖アルコール類、例えばソルビトールなど、アミノ酸類、例えばL-アルギニンなど、水溶性高分子、例えばHES，PVPなど、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベートなどが挙げられる。pH調整剤としては、リン酸ナトリウム緩衝液、ヒスチジン緩衝液などが、等張化剤としては、塩化ナトリウムなどが、賦形剤としては、マンニトール、グリシンなどが挙げられる。
　本発明の凍結乾燥製剤を調製する別の例では、本発明における多能性幹細胞を自体公知の方法で）多能性造血前駆細胞に分化誘導したのち、前述の一連の遺伝子（c-MYC/BMI1/BCL-xL等）を例えばドキシサイクリン依存的に発現が制御可能なベクターによって細胞導入して製造する不死化巨核球細胞株を、ドキシサイクリン存在下で（即ち、c-MYC/BMI1/BCL-xL等を発現させた状態で）培養することにより増殖させ、次にドキシサイクリンを除いた培地条件にて（即ち、c-MYC/BMI1/BCL-xL等の発現を停止した状態で）培養することにより、不死化巨核球細胞株から血小板への分化が誘導される（培地条件：例えば、WO2012/157586、US2014/127815、Nakamura, Eto, et al. Cell Stem Cell 14, 535-548, April 3, 2014、WO2019/009364）。この条件の培養物中には依然、不死化巨核球株が残存する（一例として、2-3 x 105/mlの不死化巨核球株を播種し、ドキシサイクリン除去の血小板製造培地条件に付す。フラスコでは2-3 x 106/ml程度の血小板が産生される。１個の不死化巨核球細胞株あたり、10-15個の血小板が産生される。１つのフラスコにつき、5-6 x 103から104/ml程度の不死化巨核球細胞株が残存する。）。例えば、分化誘導（ドキシサイクリン除去）後4日目以降（例、4日目、5日目、6日目、7日目）に細胞培養物（血小板と不死化巨核球株の混合物）を回収する。得られた血小板と不死化巨核球株の混合物を活性化する（例、CaCl2 1mM＋トロンビン１U）ことにより、活性化された巨核球および血小板を含む混合物を得ることができる。
　上述の通り、本発明の凍結乾燥製剤は、巨核球および血小板に加え、巨核球および／または血小板から放出される成長因子をさらに含有し、混合物を構成し得る。これらの成長因子は、巨核球および／または血小板の活性化により、あるいは凍結乾燥による巨核球および／または血小板の破砕により、巨核球および／または血小板から放出される。本発明における混合物は、多能性幹細胞由来の巨核球および／または血小板を刺激し、成長因子を放出させ、それにより調製することができる。刺激の手法としては、トロンビン、CaCl2、TXA2、エピネフリン、ADP が挙げられる。
　好ましい本発明の凍結乾燥製剤の調製方法としては、BMP-2が高い血小板／巨核球混合物と、BMP-4が高い血小板／巨核球混合物を、所望の比率で混合して調製する方法が挙げられる。
　本発明の凍結乾燥製剤を調製するさらなる別の例として、以下を挙げることができる。
　ア．本発明で使用される巨核球および／または血小板は、ヒト由来のES細胞あるいはiPS細胞を、C3Ｈ10T1/2細胞またはOP9細胞などのフィーダー細胞上に播き、例えば、VEGF存在下、14～17日間培養する造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物の産生能力の高いES細胞あるいはiPS細胞クローンを選択し、該ES細胞あるいはiPS細胞クローンが産生するネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、巨核球および／または血小板の分化誘導に適した条件で培養することで、調製することができる（WO2009/122747）。また、巨核球および／または血小板は、ヒト由来のES細胞あるいはiPS細胞を液体培養することで、胚様体の内部に造血前駆細胞を形成させ、該胚様体を、例えば5～7日間、TPOおよびSCFの存在下、さらに培養することで、調製することができる（同上）。
　イ．本発明で使用される成熟巨核球細胞および／または血小板は、ヒトES細胞またはiPS細胞から分化誘導された細胞、例えば多核化前の巨核球前駆細胞を増幅するために、MYCファミリー遺伝子などの外来の癌遺伝子、または、癌遺伝子およびBMI1などのポリコーム遺伝子を導入し、該癌遺伝子または、該癌遺伝子および該ポリコーム遺伝子を強制発現させることによって、調製することができる（WO2011/034073、WO2011/034073、特開2015-130866）。
　ウ．本発明で使用される多核化巨核球細胞は、多核化前の巨核球細胞において、BCL－XL遺伝子などのアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、(a) ブレビスタチンなどのアクトミオシン複合体機能阻害剤による処理、(b) Y27632などのROCK阻害剤による処理、(c) StemRegenin (SR)-1（4-(2-(2-(ベンゾ[b]チオフェン-3-イル)-9-イソプロピル-9H-プリン-6-イルアミノ)エチル)フェノール）などの芳香族炭化水素受容体（アリールハイドロカーボン受容体; AhR）アンタゴニストによる処理、または(d) バルプロ酸などのHDAC阻害剤による処理を行いつつ、該細胞を培養することで、調製することができる（WO2012/157586、特開2019-026591）。本発明で使用される血小板は、ここで得られた多核化巨核球細胞を、前記アポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制し、または、前記アポトーシス抑制遺伝子を細胞から除去し、ROCK阻害剤および／またはアクトミオシン複合体機能阻害剤を加えた培地において、培養を行うことで、調製することができる（同上）。
　エ．本発明で使用される血小板は、（a）培養液が通過可能な多孔構造を有する保持部に巨核球を保持すること：および（b）前記保持部の一方側に設けられた前室部から、前記保持部の他方側に設けられた流路部へ、前記保持部を介して前記培養液を通過させながら前記巨核球を培養することにより、巨核球から調製することができる（特開2013-031428）。
　オ．本発明で使用される巨核球細胞は、多能性幹細胞をVEGFが含有されている培養液中でC3H10T1/2細胞上で培養し、造血前駆細胞に分化誘導し、得られた造血前駆細胞においてアポトーシス抑制遺伝子および癌遺伝子を強制発現させて培養し、得られた細胞について、アポトーシス抑制遺伝子および癌遺伝子の強制発現を止めて培養することで、調製することができる（WO2014/123242、US2016/002599）。本発明で使用される血小板は、ここに得られた巨核球の培養物から回収することで、調製することができる（同上）。
　カ．本発明で使用される巨核球細胞は、ABCトランスポーターのCファミリーの阻害剤、例えば、プロベネシドなどのABCトランスポーター阻害剤を含む培養液中で、例えば多能性幹細胞由来の造血前駆細胞から製造された未熟巨核球を培養することで調製することができる（再表2014/168255）。
　キ．本発明で使用される巨核球は、巨核球特異的に発現する遺伝子を発現しない細胞が致死する条件下、巨核球または巨核球への分化能を有する細胞を含む細胞群を培養することにより、巨核球または巨核球前駆細胞を含む培養物を調製することにより、調製することができる（WO2016/143836、US2018/044634）。本発明で使用される血小板は、ここに得られた巨核球を用いることで、調製することができる（同上）。
　ク．本発明で使用される血小板は、１または複数の芳香族炭化水素受容体（アリールハイドロカーボン受容体; AhR）アンタゴニストと１または複数のROCK（Rho結合キナーゼ）阻害剤とを含む、機能性の高いの血小板産生促進剤と巨核球細胞またはその前駆細胞とを接触させることにより、調製することができる（WO2016/204256）。
　ケ．本発明で使用される巨核球および／または血小板は、IL-1αの存在下で巨核球または血小板の前駆細胞を培養し、産生される巨核球または血小板を採取することにより、調製することができる（特開2017-122049）。
　コ．本発明で使用される血小板は、Wnt阻害剤およびFLT阻害剤から成る群より選択される１または複数の物質を含む血小板産生促進剤と、巨核球細胞および／またはその前駆細胞とを接触させる工程を含む培養法により、調製することができる（WO2017/131230）。
　サ．本発明で使用される血小板は、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、バニロイド受容体阻害剤、PDGFR阻害剤、TrioN阻害剤、SIRT2阻害剤、H+,K+-ATPase阻害剤、ベンゾジアゼピン逆作動薬および神経発生促進剤からなる群より選択される１または複数のAhRアンタゴニストを含む血小板産生促進剤と、巨核球細胞および／またはその前駆細胞とを接触させる工程を含む培養法により、調製することができる（特開2019-026591）。
　シ．本発明で使用される血小板は、血小板産生培地中の巨核球細胞を培養する工程を含む血小板の製造方法であって、前記培養する工程が、撹拌翼を用いて容器内の前記血小板産生培地を撹拌する工程を含み、撹拌する工程が、以下：（ａ）約0.0005m2/s2～約0.02m2/s2の乱流エネルギー；（ｂ）約0.2Pa～約6.0Paの剪断応力；および（ｃ）約100μm～約600μmのコルモゴロフスケールから選択される１以上の指標を充足するように、前記撹拌翼を往復動させることを含む、血小板の製造方法により、調製することができる（WO2019/009364）。
＜医薬組成物＞
　本発明はさらなる別の態様として、本発明の凍結乾燥製剤を含む、医薬組成物に関する。
　本発明の凍結乾燥製剤は、血液から調製された多血小板血漿（PRP）やその凍結乾燥製剤と同様に、組織修復能を有している。従って、本発明の医薬組成物は、皮膚科、形成外科、歯科領域、そして整形外科領域において広くその効果が期待され、例えば、皮膚科の難治性皮膚潰瘍や褥瘡（床ずれ）、やけど、糖尿病の患者の壊疽、歯科の歯槽骨や歯肉の再生促進、および骨癒合促進という用途に使用できる。また、本発明の医薬組成物は、軟骨や筋肉の損傷部位に，外科手術の際に患部に、変形性関節症やリウマチ、半月板損傷、上腕骨外側上顆炎の患部に、また、顔や首などの皮膚のしわ改善や発毛促進のために投与することができる。本発明の凍結乾燥製剤は、BMP2および／またはBMP4を豊富に含むので、上述の用途のなかでも、とりわけ骨癒合を促進する用途、または皮膚疾患を処置もしくは予防する用途に好適に用いられる。好ましくは本発明の凍結乾燥製剤を、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するのに有効な量で含む、本発明の医薬組成物に関する。
　骨が壊れることを骨折と言い、骨のヒビ、骨の一部分が欠け、または骨が凹んだ場合も骨折である。通常、骨折の症状として、骨とその周囲は神経と血管が豊富であるため、骨折するとその部位に痛みと腫脹が出現し、骨折がひどい場合は、動かせなくなり、外見が変形する。骨折には、骨折と同時に皮膚が破れて骨折部が露出した開放骨折、骨折部が複雑に粉砕した粉砕骨折、また、転位(ずれ)の無いヒビだけの不全骨折を含む。骨折を起こすと、骨や骨を覆う骨膜あるいは周囲の軟部組織が損傷し、出血が起こる。出血した血液の中には一定の線維が含まれ、その線維がコラーゲンやプロテオグリカンを産生・分泌する骨芽細胞を分化誘導し、骨組織の支柱となる膠原線維を形成し、骨組織を構築する。この骨組織を再構築する過程が「骨癒合」である。骨癒合は、骨癒着と同義である。
　本発明において「骨癒合を促進」とは、骨折により破壊、分離された骨片を再構築し、折れた骨組織の連続性を回復させ、骨の支持性と強度を取り戻す過程を意味する。また、本発明において「骨癒合を促進」とは、この単なる骨の支持性と強度を取り戻す過程に加え、上記自然な骨組織の再構成よりも、早期かつ適切に、骨折により破壊、分離された骨片を再構築し、折れた骨組織の連続性を回復させ、骨の支持性と強度を取り戻す過程をも意味する。
　一般に、骨折部の治癒は以下の第1期から第5期を所定の期間経て起こる。骨膜・骨髄・筋肉・血管が損傷され、血腫を作る骨折血腫期（第1期、8～10日）、増殖した組織が周囲と明らかに区別でき、線維軟骨の硬さになる初期仮骨形成期（第2期、10～25日）、初期仮骨が縮小し全体が骨になる骨芽細胞増殖期（第3期、20～60日）、海綿骨様仮骨が硬い骨に変わる硬化期（第4期、50日～6ヶ月）、および正常な骨膜に包まれた完全な骨となる改変期（第5期、4～12ヶ月）という過程を得る。
　本発明における「骨癒合を促進」の「この自然な骨組織の再構成よりも、早期かつ適切に」とは、この治癒過程よりも早期かつ、確実な骨癒合を招来させる態様を意味する。
　本発明において、皮膚疾患とは、皮膚における創傷、例えば難治性皮膚潰瘍や褥瘡（床ずれ）、熱傷、糖尿病患者の下肢の壊死または壊疽を意味する。本発明の医薬組成物は、皮膚内に投与すると成長因子等の生理活性を保有する複数のタンパク質を放出し、皮膚内に毛細リンパ管を増加させ、また皮膚線維芽細胞が遊走することから、毛細リンパ管や毛細血管および皮膚新生肉芽組織を再生でき、下肢虚血時に発生する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の皮膚疾患を、処置または予防できると期待される。さらには、顔や首などの皮膚のしわ改善や発毛促進のために対象に投与することもできる。
　現在、iPS細胞などの幹細胞から分化誘導される血小板から献血PRP同様の創傷治癒用製剤を作製し、その効果や安全性を検討した報告は皆無である。本発明者らは、ドナー非依存的な輸血用血小板製剤の開発を通じ(Ito Y, Nakamura S, Sugimoto N. et al, Cell, 174(3): 636-648, 2018: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30017246)、ドナーが全く見出せない再生不良性貧血患者への自家iPS細胞を原材料とするiPS人工自家血小板輸血治療法の臨床研究が開始される段階まで到達済みである。
　また、血小板は細胞核がなく、科学的には増殖しない機能細胞もしくは、薬事上、細胞断片化製剤として位置付けられており、混在する有核細胞を死滅させる等の目的で輸血製剤において適応している15-25Gy以上の放射線を照射した後に使用する。そのため、iPS細胞を用いる移植医療、再生医療において安全性が高く（癌化リスク低減等）、本発明は極めて大きなアドバンテージを有すると考えられる。
　本発明の医薬組成物の有効成分である巨核球および血小板は、幹細胞からインビトロにて分化誘導された巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤と同様に、調製することができる。幹細胞等の定義およびその調製方法等は、本発明の凍結乾燥製剤におけるそれらと同様である。本発明の医薬組成物における「骨癒合を促進するのに有効な量」の巨核球および血小板とは、骨癒合を促進できる量であれば、良く、その数値にこだわるものではない。「皮膚疾患を処置もしくは予防するのに有効な量」も同様である。敢えて例示すれば、巨核球および血小板は、１回の投与につき、血小板数として約2 x 106から約2 x 1010細胞、好ましくは約2 x 107から約2 x 109細胞の用量で、投与され得る。更なる局面において、皮膚創傷の処置のため、巨核球および血小板は、創部1cm2あたり、１回の投与につき血小板の個数として約2 x 106から約2 x 1010細胞、好ましくは約2 x 107から約2 x 109細胞（例、4.5×107細胞）で投与され得る。更なる局面において、１回の投与につき投与される巨核球の個数は、特に限定されないが、一例として、１回の投与につき投与される血小板の個数の３％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上であり得る。１回の投与につき投与される巨核球の個数の上限値は、特に限定されないが、一例として、１回の投与につき投与される血小板の個数の５００％以下、好ましくは１００％以下、より好ましくは５０％以下であり得る。投与される量は、年齢、体重、対象の性別、治療される疾患・病態、およびその範囲と重症度を含む、種々の因子に依存する。
　本発明の医薬組成物は、巨核球および血小板に加え、巨核球および／または血小板から放出される成長因子をさらに含有することができる。本発明における成長因子には、骨形成タンパク質（Bone morphogenetic protein）、例えばBMP2、BMP4、BMP7；血小板由来成長因子（Platelet-Derived Growth Factor：PDGF）、例えばPDGF-BB；血小板由来血管形成因子（Platelet-Derived Angiogenesis Factor：PDAF）；トランスフォーミング増殖因子（Transforming Growth Factor：TGF）、例えばTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3；血管内皮細胞増殖因子（Vascular Endothelial Growth Factor：VEGF）、上皮細胞増殖因子（Epidermal Growth Factor：EGF）、線維芽細胞増殖因子（Fibroblast growth factors：FGF）、例えばBasic FGF；肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor：HGF）血小板由来内皮細胞増殖因子(Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor：PD-ECGF) ；インスリン様成長因子（Insulin-like Growth Factor：IGF）；および血小板因子IV（Platelet Factor IV：PF4）の中から選ばれる少なくとも一つが含まれる。好ましい態様において、本発明の医薬組成物は、少なくともBMP2および／またはBMP4を含有する。これら成長因子の定義およびその調製方法は、本発明の凍結乾燥製剤におけるそれらと同様である。
　本発明の組成物は、薬学的に許容できる担体と共に調合してもよい。例えば本発明の医薬組成物は単独で、または製剤処方成分として投与してもよい。被験化合物は、医薬に使用するための任意の都合良い方法での投与のために、調合してよい。投与に適する医薬品は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な無菌等張水性または非水性溶液（例えば平衡塩類溶液（BSS））、分散体、懸濁液またはエマルジョン、または使用直前に、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、溶質または懸濁または増粘剤を含有してもよい無菌の注入可能な溶液または分散体に戻されてもよい無菌粉末と組み合わせることができる。
　本発明の組成物は、発熱性物質なし、または実質的発熱性物質なし、および無菌など、治療で使用するのに適する製剤であってよい。投与時に、本発明で使用される医薬は、発熱性物質なしで無菌の生理学的に許容できる形態であってよい。本発明の医薬組成物は、懸濁液、ゲル、コロイド、スラリー、または混合物中で投与されてよい。
　本発明の医薬組成物および凍結乾燥製剤のために使用される基材は次の通りである。
　本発明では、典型的には、骨折患部に移植片として、本発明の医薬組成物または凍結乾燥製剤を投与するステップを含むことができる。特定の実施形態では、本発明は、生分解性ポリマー基材に分散した活性薬剤を含んでいる。生分解性ポリマーは、例えば、ポリ（乳酸－コ－グリコール）酸（PLGA）共重合体、生分解性ポリ（DL-乳酸‐コ‐グリコール酸）フィルム、またはPLLA／PLGAポリマー基質であってもよい。ポリマー中のグリコール酸モノマーの比率は、約25/75、40/60、50/50、60/40、75/25、より好ましくは約50/50重量パーセントである。ＰＬＧＡ共重合体は、生体内分解性移植片の約20、30、40、50、60、70、80～約90重量％であってもよい。PLGA共重合体は、生体内分解性移植片の約30～約50重量％、好ましくは約40重量％であってもよい。本発明の医薬組成物および凍結乾燥製剤は、ポリ乳酸、ポリ（乳酸‐コ‐グリコール酸）、50：50 PDLGA、85：15 PDLGA、およびINION GTR（登録商標）生分解性膜（生体適合性ポリマー混合物）などの生体適合性ポリマーと併せて移植してもよい。Lu，et al．（1998）J Biomater Sci Polym Ed 9：1187－205；およびTomita，et al．（2005）Stem Cells 23：1579－88も参照。
　本発明は別の態様として、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための方法であって、本発明の巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤を、そのような処置等を必要としている対象に投与することを含む方法、好ましくは、本発明の凍結乾燥製剤の有効量をそのような対象に投与することを含む方法に関する。
　さらに、本発明は別の態様として、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための本発明の巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤に関する。
　本発明はさらなる別の態様として、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための医薬を製造するための、本発明の巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の使用に関する。
　本明細書で使用する場合、用語「対象」または「患者」はヒトおよび非ヒト動物を意味し、非ヒト動物として、霊長類、イヌ、ネコ、小鳥等に代表される愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ウマ、ヒツジおよびウシが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、対象または患者はヒトおよび愛玩動物であり、より好ましくはヒトである。
　刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。
　以下、本発明を実施例により、詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでなく、単なる例示であることに留意すべきである。
参考例１
不死化巨核球の樹立および血小板への分化誘導
　Cell Stem Cell. 2014 Apr 3;14(4):535-48にて樹立された不死化巨核球株から血小板を分化誘導した。即ち、購入した胎児繊維芽細胞にセンダイウイルスにて山中4因子を導入して作製したiPS細胞株Sev2を既報（Takayama et al., Blood 111, 5298-5306 (2008)；Takayama et al., J Exp Med 207, 2817-30, 2010）に従い、CH3T10T1/2細胞上でVEGF存在下11～14日間培養し、Sac法にて多能性造血前駆細胞を獲得した。この多能性造血前駆細胞に、c-MYCおよびBMI-1をレンチウイルスベクター由来ウイルス（2種類）を用いて感染させた。さらに増殖中の本細胞集団にBCL-xL遺伝子を導入し、1ヶ月以上にわたってCD41a/CD42b発現を維持したまま増殖する細胞集団を獲得した。これを不死化巨核球細胞株（imMKCL）と称する。imMKCL Clone 7を以下の試験に使用した。imMKCL Clone 7を、ドキシサイクリン存在下で（即ち、c-MYC/BMI-1/BCL-xLを発現させた状態で）培養することにより増殖させ、次にドキシサイクリンを除いた培地条件にて（即ち、c-MYC/BMI-1/BCL-xLの発現を停止した状態で）6～7日培養することにより、血小板への分化を誘導した。培養条件はCell Stem Cell. 2014 Apr 3;14(4):535-48に従った。
実施例１
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の調製
実施例１－１：血小板および不死化巨核球の細胞混合液の活性化
　2.0 x 105細胞/mlの不死化巨核球細胞株Clone 7 (別名称、Sev2クローン：Nakamura et al., Cell Stem Cell. 2014 Apr 3; 14 (4):535-48; Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174(3): 636-648, 2018)（25 ml x 5、125 ml三角フラスコ）をドキシサイクリン不在下での上記の分化培養方法（Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174(3):636-648, 2018)）で得た液体培養後6～7日目の血小板と不死化巨核球の細胞混合液（120 ml）を900rpm(170G)、15分の条件下で遠心分離した後、培養上清を廃棄した。次に細胞濃度が培養時の10倍となるように、遠心沈渣に対して培養上清の1/10量の滅菌済み0.1％CaCl2 in Tyrode buffer（12 ml）を添加した。ピペッティングにて遠心沈査を緩くほぐし、血小板と不死化巨核球の細胞混合液を得、そのままインキュベータ中、37℃で1時間反応させ、血小板と巨核球を無菌的に活性化した。これにより、血小板および不死化巨核球の細胞混合液（無菌）を得た。
実施例１－２：血小板と不死化巨核球の細胞混合液の凍結乾燥処理
　実施例１－１にて調製した、血小板および不死化巨核球の細胞混合液（無菌）を凍結乾燥用のチューブに分注し（1ml x 9本および750μl x 4本）、メンブレンフィルター付きの無菌培養容器に移し、これを凍結乾燥処理用サンプルとした。この凍結乾燥処理用サンプルを、まず共晶点以下の-60℃にて、1昼夜以上かけて十分に予備凍結した。次に、予め－45℃以下に設定した凍結乾燥機（EYELA FDU-1200）に供し、バキュームポンプによる減圧で1昼夜以上かけて凍結乾燥処理し、所望の凍結乾燥製剤を作製した。
実施例２
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤における骨癒合効果の確認
　Shiga, et al. Sci Rep. 2016 Nov 11; 6: 36715に記載の方法に準じて、ラット腰椎固定術モデルを作成し、実施例１－２で調製したiPS細胞由来不死化巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の骨癒合促進効果を確認した。即ち、SDラット（8週齢）を用いて、腰椎固定術モデルを作成した。第4－6腰椎棘突起レベルで皮膚を切開し、棘突起中央から1.5mm外側部で約2cm筋膜縦切開を加えた。背筋を鈍的に展開し第4－6腰椎横突起を露出させた。人工骨であるハイドロキシアパタイトコラーゲン複合体、Refit（Hoya Corporation, Tokyo, Japan）0.5mlを粉砕し、上記凍結乾燥製剤10μgと混合し、腰椎の両サイドに移植した。筋膜、皮膚を縫合し、モデル作成を終了した。術後2週、4週、6週において、レントゲン撮影で骨癒合評価を行った。
　移植2週間後のラット脊椎のレントゲン画像を図１に示す。ラット脊椎横突起間にiPS細胞由来不死化巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤を移植したところ、移植後2週間で横突起間に骨性架橋が見られた。この結果から、iPS細胞由来不死化巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤が優れた骨癒合促進効果および骨形成能を有することが示唆された。
実施例３
製剤中の成長因子濃度測定
　実施例１－２の凍結乾燥製剤の調製過程において、巨核球／血小板活性化直後、および凍結乾燥後の製剤中の成長因子濃度をELISAにより測定した。使用したキットを［表２］に示す。活性化時の巨核球細胞濃度は1 x 106 細胞/mlであった。結果を［表３］に示す。［表３］において、活性化直後（FD前）の成長因子濃度は、1mlの細胞混合液中の濃度である。また、凍結乾燥後（FD後）の成長因子濃度は、各バイアルを精製水で１mlにフィルアップした時の濃度である。凍結乾燥後も、製剤中に含有される各サイトカインの量が良好に維持された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例４
BMP2およびBMP4濃度の測定
　実施例１－２の凍結乾燥製剤の調製過程において、巨核球／血小板活性化直後（FD化前）における製剤中のBMP2およびBMP4濃度を測定した。また、同じ数の血小板を含むヒト末梢血から調製したPRPを用いて実施例１－２と同様に活性化し（2個体：ヒトPRP1およびヒトPRP2）、PRP中のBMP2およびBMP4濃度を測定した。対照として、分化培地（増殖培地からドキシサイクリンを除き、SR1 750uM、Y27632 10mMおよびKP457 15mMを添加）を使用した。
　結果を図２に示す。iPS細胞由来不死化巨核球および血小板の活性化上清は、同一血小板数を含むヒト末梢血由来活性化PRPよりもBMP2およびBMP4濃度が高かった。ヒト末梢血由来活性化PRP中のBMP2およびBMP4濃度には、個体差が認められた。
実施例５
iPS細胞由来成熟巨核球および血小板から放出されるサイトカインの検出
　参考例１にて調製したiPS細胞由来不死化巨核球株 imMKCLを分化培地（増殖培地からドキシサイクリンを除き、SR1 750uM、Y27632 10mMおよびKP457 15mMを添加）中で振とう培養することにより、成熟巨核球および血小板 (MMK-PLT)を得た。MMK-PLTがヒト末梢血由来PRPと同様に創傷治癒促進サイトカインを放出するか検証した。まず分化0、4、6日目のMMK-PLTからmRNAを回収し、RT-qPCR法を用いてTGF-β1、PDGF-BB、EGFの遺伝子発現を経時的に解析した。また各MMK-PLTにCaCl2およびトロンビンを添加して活性化し、遠心分離して上清を回収した。ELISA法でこの上清に含まれるTGFβ、PDGF-BB、EGF、bFGFタンパクの濃度を測定した。
　得られた結果を図３および図４に示す。
　各サイトカインの遺伝子発現は巨核球の成熟に伴い6日目まで著明に上昇していた。また、活性化により放出された各サイトカインのタンパク濃度も成熟により上昇していたが、4日目と6日目に有意差は認められなかった。これらの結果から、分化4日目以降のMMK-PLTに、各サイトカインが豊富に含まれていることが示唆された。
実施例６
インビトロ創傷治癒アッセイ
　創傷治癒の増殖期では、創部に存在する線維芽細胞によりコラーゲンなどの細胞外マトリックスが構築される。MMK-PLTがヒト初代培養線維芽細胞の増殖能に与える影響を解析した。
　詳細には、ヒト初代培養線維芽細胞の培養液 (無血清) 中に、実施例５にて調製した活性化MMK-PLT（6日目）上清を添加し、3および5日目の細胞数を測定した。何も投与していない対照群およびポジティブ対照としてのFBS投与群との比較を行った (n=3)。
　得られた結果を図５に示す。
　MMK/PLT投与群では対照群と比較し、有意に細胞数が増加した。また、5日間培養を続けると、FBS投与群では増殖能が低下したが、MMK/PLT投与群では増殖が継続し細胞数に有意差を認めた。
実施例７
インビボ創傷治癒アッセイ
　MMK-PLTが実際に創傷治癒を促進するか、動物モデルを用いて検証した。
　詳細には、免疫不全マウス (NOD/SCID IL2R欠損) （日本クレアより入手）の左右背部に6mm大の皮膚全層欠損を作製した。分化5日目のMMK-PLT（実施例５に記載のようにして調製）を回収し、分化培養開始時の不死化巨核球株細胞数として8×105個の細胞を皮膚欠損周囲に皮下注射した。また、分化培養開始時の不死化巨核球株細胞数として2×105個を基底膜マトリックス製剤と混和して創面に塗布し、ポリウレタンフィルムでドレッシングした。１つの創部に対する合計投与量は、分化培養開始時の不死化巨核球株細胞数として1×106個であり、これは創部1cm2あたり分化培養開始時の不死化巨核球株細胞数として3×106個の投与量に相当する。実施例１０の表５より、投与時（分化５日目）においては、１つの創部に対して約2.2×106個の巨核球および約1.5×107個の血小板（創部1cm2あたり約6.6×106個の巨核球及び約4.5×107個の血小板）が投与されたと見積もられる。創部の収縮を予防するため、シリコンゴム製リングを周囲に縫着した。創面の大きさを3日おきに10日間測定し、その縮小率を解析した。PBS投与群を対照として比較した (n=4)。
　得られた結果を図６に示す。
　MMK/PLT投与群ではPBS群と比較し、創面積の縮小率が高い傾向にあり、7日目では有意差を認めた。この結果から、MMK/PLTが創傷治癒を促進する可能性が示唆された。
実施例８
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の調製２
　実施例１とは異なるiPS細胞株（MKCL21#）から分化誘導した不死化巨核球細胞株（NC13X）を用いた。2.3 x 107個のNC13X細胞を、実施例１と同様にドキシサイクリン不在下での分化培養（Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174(3):636-648, 2018)）に付した。分化6日目の血小板と巨核球の細胞混合液を遠心分離に付して、培養上清を廃棄し、得られた血小板と巨核球の混合物に滅菌済み0.1％CaCl2 in Tyrode buffer（23 ml）を添加した。37℃で1時間インキュベートすることにより、血小板と巨核球を無菌的に活性化した。活性化した血小板と巨核球の混合液を実施例１－２と同様に凍結乾燥処理に付し、凍結乾燥製剤を得た。
　得られた凍結乾燥製剤を蒸留水で、分化培養開始時のNC13X細胞として1.0 x 106細胞／ml の濃度に希釈して、PDGF、FGF、TGF-βおよびVEGF濃度をELISAにて測定した。結果を［表４］に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　この結果から、得られた凍結乾燥製剤は、主要なサイトカインを十分量含有することが示唆された。
実施例９
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤における骨癒合効果の確認２
　実施例２と同様に、ラット腰椎固定術モデルを作成し、実施例８で調製したiPS細胞由来不死化巨核球株から作成した巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の骨癒合促進効果を評価した。詳細には、SDラット（n=4）の腰椎横突起を露出させ、その右側へは人工骨であるハイドロキシアパタイトコラーゲン複合体、Refit（Hoya Corporation, Tokyo, Japan）のみを、左側へはRefitと実施例８の凍結乾燥製剤の混合物を、それぞれ移植し、移植５週間後に、左右の新規骨形成量をImageJで測定し比較した。その結果、iPS細胞由来不死化巨核球株から誘導した巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤を移植した側で、新規骨形成量が有意に増加した（図７）。
　この結果から、実施例２の結果と相まって、iPS細胞株の種類に関わらず、iPS細胞由来不死化巨核球株から誘導した巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤は、組織の修復や骨形成を促進するサイトカインを豊富に含有し、優れた骨形成能を有することが示唆された。
実施例１０
巨核球と血小板の混合比率の解析
　実施例１と同様に、不死化巨核球細胞株Clone 7をドキシサイクリン不在下での分化培養（Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174(3):636-648, 2018)）に付し、経時的に培養物中の成熟巨核球（CD41+）および血小板（CD41+CD42+）の数をフローサイトメーターで計測し、巨核球に対する血小板の割合を算出した。
　血小板への分化をフローサイトメーターでモニターした結果を図８に、成熟巨核球への分化をフローサイトメーターでモニターした結果を図９に示す。図８および図９の結果を元に、数値化したグラフを図１０に示す。ここでは、分化培養後の血小板は「CD41+42+Plt」、成熟巨核球は「CD41+MK」で示している。図１０の各細胞数の具体的数値を表５に示す。成熟巨核球の数は、分化０日目から６日目にかけて緩やかに増加した（図９、表５）。一方、血小板の数は、３日目までは非常に少ないが、４日目以降急激に増加した（図８、表５）。４日目においては、成熟巨核球の数と血小板の数がほぼ同数であったが、６日目においては成熟巨核球数１に対して、血小板数１５であった。各フローサイトメーターおよびそのグラフの結果から算定される巨核球の数に対する血小板の数の割合を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　表６は、巨核球と血小板の個数の比率として、1×103個の巨核球に対し、2×102～1.5×104個の血小板が含まれていることを示している。
　これらの結果から、分化の進行とともに、血小板/巨核球の割合が増加し、分化日数を変化させることにより、様々な血小板/巨核球の割合を有する凍結乾燥製剤を調製することが可能であり、使用目的に応じ、分化日数を調整し得ることが示唆された。
　本発明によれば、iPS細胞を含む幹細胞から分化誘導される血小板由来PRPを凍結乾燥保存することにより、必要時に医薬製剤として供給が可能となる。今後の展望として、完全に抗原性フリーのiPS細胞由来FD-PRPを開発し、他患者への安全使用が可能になれば、手術における用事調製が不要となり、有効な新規製剤としての汎用の可能性が格段に高まり、整形外科領域および皮膚科領域の治療を飛躍的に発展させることが期待できる。また、患者の侵襲や医療者の負担がなく、既存の製品化された材料で骨折や脊椎手術における早期の骨癒合や皮膚修復が効率的に促進できるので、これによって患者のADLおよびQOLの劇的な改善が図られ、手術による合併症の減少・緩和、入院期間の短縮による医療経済の改善などにも大きく寄与すると考えられる。その他、本発明におけるPRPの旺盛な組織修復能は、従来は治療困難であった潰瘍性難治創、そして神経損傷・脊髄損傷等についても有用である可能性があり、本発明組成物は世界的な商業産業製品に発展することが予測される。

Claims (15)

  1. 　巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤。
  2. 　巨核球および血小板が、インビトロで幹細胞から分化誘導される、請求項１記載の凍結乾燥製剤。
  3. 　幹細胞が多能性幹細胞または造血幹細胞である、請求項１または２記載の凍結乾燥製剤。
  4. 　多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項２または３記載の凍結乾燥製剤。
  5. 　巨核球および／または血小板から放出される成長因子をさらに含有する、請求項１から４のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
  6. 　成長因子が、骨形成タンパク質、血小板由来増殖因子、血小板由来血管形成因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子、インスリン様成長因子、および血小板因子IVからなる群から選ばれる少なくとも一つの因子である、請求項５記載の凍結乾燥製剤。
  7. 　請求項１から６のいずれか記載の凍結乾燥製剤を含む、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための医薬組成物。
  8. 　請求項１から６のいずれか記載の凍結乾燥製剤を、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するのに有効な量で含む、請求項７記載の医薬組成物。
  9. 　骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための方法であって、請求項１から６のいずれか記載の凍結乾燥製剤を、そのような処置等を必要としている対象に投与することを含む方法。
  10. 　骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための方法であって、請求項１から６のいずれか記載の凍結乾燥製剤を、そのような処置等を必要としている対象に、その有効量を投与することを含む、請求項９記載の方法。
  11. 　骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための、請求項１から６のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
  12. 　骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための医薬を製造するための、請求項１から６のいずれか記載の凍結乾燥製剤の使用。
  13. 　巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤を調製する方法であって、
    （A）血小板および巨核球の細胞混合液を調製し、および
    （B）血小板および巨核球の細胞混合液を凍結乾燥する、ことを特徴とする方法。
  14. 　工程（A）において、巨核球が、幹細胞から分化誘導される不死化巨核球である、請求項１３記載の方法。
  15. 　工程（A）にて調製する細胞混合液を活性化させる、請求項１３または１４記載の方法。
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