ES2839220T3 - Procedimiento de fabricación de plaquetas de alto rendimiento - Google Patents

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Sou Nakamura
Yukitaka Ito
Tomohiro Shigemori
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Abstract

Agente promotor de la producción de plaquetas altamente funcional que comprende uno o una pluralidad de antagonistas del receptor de aril hidrocarburos (AhR) y uno o una pluralidad de inhibidores de quinasa formadora de superhélice asociada a Rho (ROCK).

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de fabricación de plaquetas de alto rendimiento
Campo técnico
[0001] La presente invención se refiere a un procedimiento para producir plaquetas in vitro.
Antecedentes de la técnica
[0002] Las células hematopoyéticas usadas para aplicaciones terapéuticas son necesarias en casos de tratamiento de enfermedades relacionadas con la sangre o en casos de tratamiento quirúrgico. Entre estas células hematopoyéticas, las plaquetas, que son células esenciales para la coagulación sanguínea (hemostasia), las proplaquetas y los megacariocitos, que son células que producen plaquetas, son células para las que hay una demanda particularmente alta. Las plaquetas en particular tienen una alta demanda para leucemia, trasplantes de médula ósea, terapia contra el cáncer y similares, y existe una fuerte necesidad de un suministro estable de las mismas.
[0003] Un procedimiento para obtener megacariocitos mediante la diferenciación de diversos tipos de células madre seguida de su cultivo para liberar plaquetas en el medio se ha desarrollado previamente como un procedimiento para producir plaquetas in vitro. Más recientemente, la utilidad de las células madre pluripotentes como una fuente importante para la terapia celular en la medicina regenerativa ha atraído aún más atención debido al establecimiento de células iPS. Takayama, y col., por ejemplo, han tenido éxito previamente en inducir células ES humanas para diferenciarse en megacariocitos y plaquetas (documento no de patente 1).
[0004] Sin embargo, hasta ahora se ha observado que las plaquetas obtenidas in vitro carecen de la función inherente a las mismas, a saber, la capacidad de coagular la sangre.
[0005] Además, los procedimientos convencionales para producir plaquetas in vitro han encontrado dificultades para obtener plaquetas suficientemente funcionales sin usar células nutrientes. Sin embargo, dado que las células nutrientes usan con frecuencia células derivadas de especies distintas de los seres humanos, es deseable no usar células nutrientes cuando se producen plaquetas para su administración a seres humanos.
[0006] Un ejemplo de un procedimiento propuesto previamente para producir plaquetas a partir de células progenitoras hematopoyéticas in vitro incluye cultivar megacariocitos en presencia de TPO y un antagonista del receptor de aril hidrocarburos (AhR) (documento de patente 1). Lindsey y col. (J Thromb Haemost. 2014; 12(3): 383­ 94) describe que las plaquetas de ratones que carecen del receptor de aril hidrocarburos exhiben señalización dependiente del colágeno defectuosa. Chang y col. (Blood. 15 de mayo de 2007; 109(10): 4229-36) describe que la formación de proplaquetas está regulada por la vía Rho/ROCK.
Lista de referencias
Documentos de patentes
[0007] Documento de patente 1: WO 2014/138485
Documentos no de patente
[0008] Documento no de patente 1: Takayama, N. y col., Blood, 111, págs. 5298-5306, 2008
Resumen
Problema técnico
[0009] Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir de manera eficiente plaquetas altamente funcionales a partir de megacariocitos in vitro.
Solución al problema
[0010] Como resultado de la realización de amplios estudios para resolver el problema mencionado anteriormente, los inventores de la presente invención descubrieron que, cuando se cultivan megacariocitos en presencia de un antagonista de AhR, aumenta el número de plaquetas producidas y se mejora su función, y que, en el caso de combinarse con el uso de un inhibidor de ROCK, la acción de este no es aditiva, sino sinérgica. También se examinaron las condiciones de cultivo para obtener plaquetas que demostraban una funcionalidad aún mayor, lo que llevó a la finalización de la presente invención.
[0011] Además, los inventores de la presente invención también descubrieron que, al suprimir la expresión o función de las proteínas HMGA, aumenta el número de plaquetas producidas por unidad de megacariocitos. Además, cuando estos megacariocitos se percibieron visualmente, se observó que se habían vuelto multinucleados y agrandados mientras también formaban una membrana de separación y gránulos secretores, lo que indica que los inventores de la presente invención habían tenido éxito en hacer que los megacariocitos maduraran in vitro y, por lo tanto, llevaron a la finalización de la presente invención.
[0012] La presente invención está definida por las reivindicaciones. La presente descripción se refiere a la que se indica a continuación.
[A1] Un agente promotor de la producción de plaquetas altamente funcional que comprende uno o una pluralidad de antagonistas del receptor de aril hidrocarburos (AhR) y uno o una pluralidad de inhibidores de quinasaformadora de superhélice asociada a Rho (ROCK).
[A2] El agente promotor de la producción de plaquetas descrito en [A1], en el que el antagonista de AhR se selecciona del grupo que consiste en 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (SR-1), (2-metil-4-o-tolilazo-fenil)-amida del ácido 2-metil-2H-pirazol-3-carboxílico (CH-223191), N-[2-(3H-indol-3-il)etil]-9-isopropil-2-(5-metil-3-piridil)purin-6-amina (GNF-351), 6,2',4'-trimetoxflavona (TMF) y 3',4'-dimetoxiflavona (DMF).
[A3] El agente promotor de la producción de plaquetas descrito en [A1] o [A2], en el que el inhibidor de ROCK se selecciona del grupo que consiste en Y27632, Y39983, clorhidrato fasudil, ripasudil, SLX-2119, RKI-1447, azaindol1, SR-3677, estaurosporina y diclorhidrato de H1152.
[A4] El agente promotor de la producción de plaquetas descrito en cualquiera de [A1] a [A3], en el que el antagonista de AhR es SR-1, GNF-351 y/o CH-223191, y el inhibidor de ROCK es Y27632, Y39983, clorhidrato de fasudil y/o ripasudil.
[A5] Un procedimiento de producción de plaquetas, que comprende una etapa para poner en contacto el agente promotor de la producción de plaquetas descrito en cualquiera de [A1] a [A4] con megacariocitos o células progenitoras de los mismos.
[A6] El procedimiento descrito en [A5], en el que la etapa de contacto se lleva a cabo en condiciones de no usar células nutrientes.
[A7] El procedimiento descrito en [A6], que se lleva a cabo en condiciones de cultivo en agitación.
[A8] El procedimiento descrito en cualquiera de [A5] a [A7], que comprende además una etapa para suprimir la expresión o función de las proteínas del grupo de alta movilidad At-hook (HMGA) en los megacariocitos o células progenitoras de los mismos.
[A9] El procedimiento descrito en [A8], en el que la supresión de la expresión o función de las proteínas HMGA se lleva a cabo mediante ARNip o miARN que suprime directa o indirectamente la expresión del gen HMGA.
[A10] El procedimiento descrito en cualquiera de [A5] a [A9], en el que los megacariocitos son células obtenidas por sobreexpresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis en células menos diferenciadas que los megacariocitos, seguida de la terminación de la sobreexpresión.
[A11] El procedimiento descrito en [A10], en el que las células menos diferenciadas que los megacariocitos son células progenitoras hematopoyéticas producidas a partir de células madre pluripotentes.
[A12] El procedimiento descrito en cualquiera de [A5] a [A11], que comprende además una etapa para recuperar plaquetas a partir de los megacariocitos.
[A13] Una preparación de plaquetas que contiene plaquetas producidas según el procedimiento descrito en cualquiera de [A5] a [A12].
[B1] Un procedimiento de producción de plaquetas, que comprende una etapa para cultivar megacariocitos en los que se ha suprimido la expresión o función de las proteínas HMGA.
[B2] El procedimiento descrito en [B1], en el que la supresión de la expresión o función de las proteínas HMGA se lleva a cabo usando ARNip contra el gen HMGA.
[B3] El procedimiento descrito en [B1] o [B2], en el que la etapa de cultivo se lleva a cabo en presencia de un antagonista del receptor de aril hidrocarburos (AhR).
[B4] El procedimiento descrito en cualquiera de [B1] a [B3], en el que la etapa de cultivo se lleva a cabo en presencia de un inhibidor de ROCK.
[B5] El procedimiento descrito en cualquiera de [B1] a [B4], en el que la etapa de cultivo se lleva a cabo en condiciones de no usar células nutrientes.
[B6] El procedimiento descrito en cualquiera de [B1] a [B5], que comprende además una etapa para recuperar plaquetas a partir de un cultivo obtenido según la etapa de cultivo.
[B7] Una preparación de plaquetas que contiene plaquetas producidas según el procedimiento descrito en cualquiera de [B1] a [B6].
[B8] Un procedimiento para madurar megacariocitos, que comprende una etapa para suprimir la expresión o función de las proteínas HMGA en megacariocitos.
[B9] El procedimiento descrito en [B8], en el que la etapa para suprimir la expresión o función de las proteínas HMGA se lleva a cabo mediante ARNip o miARN que suprime la expresión del gen HMGA.
[B10] El procedimiento descrito en [B8], en el que la etapa para suprimir la expresión o función de las proteínas HMGA se lleva a cabo usando ARNip o miARN contra el gen HMGA.
[B11] El procedimiento descrito en cualquiera de [B8] a [B10], en el que la etapa para suprimir la expresión o función de las proteínas HMGA se lleva a cabo mediante cultivo en un medio que contiene un antagonista de AhR.
[B12] El procedimiento descrito en cualquiera de [B8] a [B11], en el que la etapa para suprimir la expresión o función de las proteínas HMGA se lleva a cabo mediante cultivo en un medio que contiene un inhibidor de ROCK.
[B13] El procedimiento descrito en cualquiera de [B8] a [B12], en el que la etapa para suprimir la expresión o función de las proteínas HMGA se lleva a cabo en condiciones de no usar células nutrientes.
[B14] El procedimiento descrito en cualquiera de [B3] a [B6] y [B11] a [B13], en el que el antagonista de AhR se selecciona del grupo que consiste en 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (SR-1), (2-metil-4-o-tolilazo-fenil)-amida del ácido 2-metil-2H-pirazol-3-carboxílico (CH-223191), N-[2-(3H-indol-3-il)etil]-9-isopropil-2-(5-metil-3-piridil)purin-6-amina (GNF-351), 6,2',4-trimetoxiflavona (TMF) y 3',4'-dimetoxiflavona (DMF).
[B15] El procedimiento descrito en cualquiera de [B4] a [B6] y [B12] a [B14], en el que el inhibidor de ROCK se selecciona del grupo que consiste en Y27632, Y39983, clorhidrato de fasudil, ripasudil, SLX-2119, RKI-1447, azaindol1, SR- 3677, estaurosporina y diclorhidrato de H1152.
[B16] El procedimiento descrito en cualquiera de [B1] a [B15], en el que los megacariocitos son células en las que al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis se ha sobreexpresado en células menos diferenciadas que los megacariocitos seguido por la terminación de esa sobreexpresión.
[B17] El procedimiento descrito en [B16], en el que las células menos diferenciadas que los megacariocitos son células progenitoras hematopoyéticas producidas a partir de células madre pluripotentes.
[B18] Megacariocitos en los que se ha suprimido la expresión o función de las proteínas HMGA.
[B19] Los megacariocitos descritos en [B18], que contienen ARNip, miARN o un ácido nucleico que lo codifica, que suprime la expresión de las proteínas HMGA.
[B20] Los megacariocitos descritos en [B18] o [B19], que contienen al menos un gen exógeno seleccionado del grupo que consiste en un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis en un cromosoma de los mismos.
[B21] Un procedimiento de producción de plaquetas, que comprende una etapa para cultivar megacariocitos en un medio que contiene un antagonista del receptor de aril hidrocarburos (AhR).
[B22] El procedimiento descrito en [B21], en el que el medio contiene además un inhibidor de ROCK.
[B23] El procedimiento descrito en [B21] o [B22], en el que la etapa de cultivo se lleva a cabo en condiciones de no usar células nutrientes.
[B24] El procedimiento descrito en cualquiera de [B21] a [B23], en el que el antagonista de AhR se selecciona del grupo que consiste en 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil) fenol (SR-1), (2-metil-4-otolilazo-fenil)-amida del ácido 2-metil-2H-pirazol-3-carboxílico (CH-223191), N-[2-(3H-indol-3-il)etil]-9-isopropil-2-(5-metil-3-piridil)purin-6-amina (GNF-351), 6,2',4-trimetoxiflavona (TMF) y 3',4'-dimetoxiflavona (DMF).
[B25] El procedimiento descrito en cualquiera de [B21] a [B24], en el que el inhibidor de ROCK se selecciona del grupo que consiste en Y27632, Y39983, clorhidrato de fasudil, ripasudil, SLX-2119, RKI-1447, azaindol1, SR-3677, estaurosporina y diclorhidrato de H1152.
[B26] El procedimiento descrito en cualquiera de [B21] a [B25], en el que los megacariocitos son células en las que al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis se ha sobreexpresado en células menos diferenciadas que los megacariocitos seguido por la terminación de esa sobreexpresión. [B27] El procedimiento descrito en [B26], en el que las células menos diferenciadas que los megacariocitos son células progenitoras hematopoyéticas producidas a partir de células madre pluripotentes.
Efectos ventajosos de la invención
[0013] Según la presente invención, las plaquetas altamente funcionales pueden producirse eficientemente sin usar células nutrientes. Dado que no se requiere el uso de células nutrientes, se puede usar un aparato de cultivo vertical a gran escala para producir plaquetas, y las plaquetas para uso clínico se pueden producir eficientemente en gran volumen.
Breve descripción de los dibujos
[0014]
La figura 1 indica los resultados de la medición del número y la función de las plaquetas producidas al llevar a cabo cultivo estático a diversas concentraciones de SR-1 (antagonista de AhR) en un medio de megacariocitos.
La figura 2 indica los resultados de la medición del número y la función de las plaquetas producidas cuando se lleva a cabo un cultivo estático después de la adición de SR-1 mientras se cambia el número de días de cultivo después del subcultivo.
La figura 3 indica los resultados de la medición del número y la función de las plaquetas producidas al llevar a cabo un cultivo en agitación a diversas concentraciones de SR-1 en medio de megacariocitos.
La figura 4 indica los resultados de la medición del número y la función de las plaquetas producidas al llevar a cabo un cultivo en agitación a diversas densidades de siembra de megacariocitos durante la adición de SR-1.
La figura 5 indica los resultados de la medición del número y la función de las plaquetas producidas al añadir análogos de SR-1 al medio de megacariocitos y al llevar a cabo un cultivo estático.
La figura 6A indica los resultados de la medición del número y la función de las plaquetas producidas al añadir diversas concentraciones de análogos de SR-1 (CH-223191 o GNF-351) al medio de megacariocitos y al llevar a cabo un cultivo estático. La figura 6B indica los resultados de la medición del número y la función de las plaquetas producidas al añadir diversas concentraciones de análogos de SR-1 (TMF o DMF) al medio de megacariocitos y al llevar a cabo cultivo estático.
La figura 7 indica los resultados de la medición de la cantidad y plaquetas producidas al añadir SR-1 solo, Y27632 (inhibidor de ROCK) solo o una combinación de SR-1 e Y27632 y cultivar en estático (6 pocillos) o cultivar en agitación (E125) megacariocitos.
La figura 8 indica los resultados de la medición de la función de las plaquetas producidas al añadir SR-1 solo, Y27632 (inhibidor de ROCK) solo o una combinación de SR-1 e Y27632 y cultivar en estático (6 pocillos) o cultivar en agitación (E125) megacariocitos.
La figura 9 indica los resultados de la medición de la cantidad de plaquetas producidas al añadir una combinación de SR-1 e Y- 39983, clorhidrato fasudil o ripasudil (inhibidores de ROCK) y cultivar en agitación (E125) megacariocitos.
La figura 10 indica los resultados de la medición de la cantidad de plaquetas producidas al añadir combinaciones de GNF-351 o CH-223191 (antagonistas de AhR) e Y27632 (inhibidor de ROCK) y cultivar en agitación (E125) megacariocitos.
La figura 11 indica el número de plaquetas producidas por megacariocito individual y la proporción de plaquetas positivas para PAC-1 o plaquetas positivas para CD62p cuando los megacariocitos se cultivaron en estático después de la adición de suero humano al 15 % o plasma humano al 15 % en lugar de FBS en presencia de SR-1 solo, en presencia de Y27632 solo o en presencia de una combinación de SR-1 e Y27632.
La figura 12 indica la cantidad de plaquetas producidas por megacariocito individual y la proporción de plaquetas positivas para PAC-1 o plaquetas positivas para CD62p cuando los megacariocitos se cultivaron en agitación después de la adición de suero humano al 15 % o plasma humano al 15 % en lugar de FBS en presencia de una combinación de SR-1 e Y27632.
La figura 13 indica los resultados de la investigación de la dependencia del número de plaquetas producidas de la concentración plasmática en presencia de una combinación de SR-1 e Y27632.
La figura 14 indica el número de plaquetas producidas por megacariocito individual y la proporción de plaquetas positivas para PAC-1 o plaquetas positivas para CD62p cuando los megacariocitos se cultivaron en estático después de la adición de suero humano al 1 % o plasma humano al 1 % en presencia de SR-1 solo o en presencia de una combinación de SR-1 e Y27632. La figura 15 indica los resultados de llevar a cabo citometría de flujo en un cultivo en el caso de la figura 14 usando anticuerpo anti-CD62p y anticuerpo anti-PAC-1.
La figura 16 muestra una visión general de un experimento que incluye suprimir la expresión del gen HMGA2 y el gen RUNX1 mediante ARNhc en megacariocitos inmortalizados mediante la sobreexpresión del gen BMI1, el gen c-MYC y el gen BCL-xL.
La figura 17 indica los resultados de la medición del número de células positivas para CD41a después de cultivar megacariocitos inmortalizados por sobreexpresión del gen BMI1, el gen c-MYC y el gen BCL-xL en presencia del ARNhc que se muestra en la figura 16.
La figura 18 indica los resultados de llevar a cabo citometría de flujo usando anticuerpo anti-CD42b y anticuerpo anti-41a en megacariocitos y plaquetas antes y después de terminar la sobreexpresión del gen BMI1, el gen c-MYC y el gen BCL-xL.
La figura 19 indica los resultados de observar el estado de los megacariocitos (arriba) y medir el número de plaquetas producidas (abajo) cuando los megacariocitos se cultivaron después de terminar la sobreexpresión del gen BMI1, el gen c-MYC y el gen BCL-xL.
La figura 20 indica los resultados de observar el estado de los megacariocitos (arriba) y el número de plaquetas producidas por células unitarias (1 3 105 células) (abajo) cuando se cultivaron megacariocitos introducidos con ARNip contra HMGA2 y RUNX1 o un control (indicado como shHMGA2, shRUNX1 y shSCRAMBLE, respectivamente) en presencia o ausencia de adición de SR-1 y/o inhibidor de ROCK después de terminar la sobreexpresión del gen BMI1, el gen c-MYC y el gen BCL-xL. En el dibujo, SR-1 se refiere a la adición de SR-1, mientras que ROCKi se refiere a la adición de Y27632.
La figura 21 ilustra microfotografías electrónicas de megacariocitos introducidos con ARNip contra HMGA2 y RUNX1 o un control (indicado como shHMGA2, shRUNX1 y shSCRAMBLE, respectivamente) que se cultivaron después de añadir SR-1 y un inhibidor de ROCK después de la terminación de la sobreexpresión del gen BMI1, el gen c-MYC y el gen BCL-xL. La fila inferior de microfotografías representa vistas ampliadas de la fila superior de microfotografías.
Descripción de las realizaciones
(Primer aspecto)
[0015] En un primer aspecto de este, la presente invención proporciona un agente promotor de la producción de plaquetas que contiene uno o una pluralidad de antagonistas del receptor de aril hidrocarburos (AhR) o uno o una pluralidad de inhibidores de ROCK (quinasa formadora de superhélice asociada a Rho). En otro aspecto, la presente invención proporciona además un procedimiento de producción de plaquetas que comprende una etapa para poner megacariocitos o células progenitoras de los mismos en contacto con el agente promotor de la producción de plaquetas mencionado anteriormente.
[0016] Como se usa en esta solicitud, «megacariocitos» se refieren a las células más grandes presentes en la médula ósea en el cuerpo, y que se caracterizan por liberar plaquetas. Además, los megacariocitos también se caracterizan por ser positivos para los marcadores de superficie celular CD41a, CD42a y CD42b, y también pueden expresar, adicionalmente, marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD9, CD61, CD62p, CD42c, CD42d, CD49f, CD51, CD110, CD123, CD131 y CD203c. Aunque los megacariocitos tienen un genoma que es de 16 a 32 veces mayor que el de las células normales cuando se vuelven multinucleados (poliploidía), en la presente descripción, en el caso de referirse simplemente a megacariocitos, tanto los megacariocitos multinucleados como los megacariocitos antes de la multinucleación se incluyen, siempre y cuando estén provistos de las características mencionadas anteriormente. «Megacariocitos antes de la multinucleación» tiene el mismo significado que «megacariocitos inmaduros» o «megacariocitos en fase de crecimiento».
[0017] Los megacariocitos se pueden obtener mediante diversos procedimientos conocidos. Un ejemplo no limitativo de un procedimiento para producir megacariocitos se describe en el documento WO 2011/034073. En este procedimiento, se pueden obtener megacariocitos inmortalizados que proliferan infinitamente al sobreexpresar un gen de cáncer y un gen Polycomb en «células menos diferenciadas que los megacariocitos» o, en otras palabras, células progenitoras de megacariocitos (también denominadas simplemente «células progenitoras» en la descripción del asunto). Además, según el procedimiento descrito en el documento WO 2012/157586, los megacariocitos inmortalizados también se pueden obtener sobreexpresando un gen supresor de apoptosis en «células menos diferenciadas que los megacariocitos». Estos megacariocitos inmortalizados se vuelven multinucleados y liberan plaquetas como resultado de terminar esta sobreexpresión génica.
[0018] Los procedimientos descritos en las publicaciones mencionadas anteriormente también se pueden combinar para obtener megacariocitos. En ese caso, la sobreexpresión de un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis puede llevarse a cabo simultánea o secuencialmente. Por ejemplo, los megacariocitos multinucleados se pueden obtener sobreexpresando un gen de cáncer y un gen Polycomb, suprimiendo la sobreexpresión de los mismos y después sobreexpresando un gen supresor de apoptosis seguido de la supresión de la sobreexpresión del mismo. Además, los megacariocitos multinucleados también se pueden obtener mediante la sobreexpresión simultánea de un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis seguida de la supresión simultánea de la sobreexpresión de los mismos. Los megacariocitos multinucleados también se pueden obtener sobreexpresando primero un gen de cáncer y un gen Polycomb seguido de sobreexpresión de un gen supresor de apoptosis y, finalmente, suprimiendo simultáneamente la sobreexpresión de los mismos.
[0019] En la presente descripción, «células menos diferenciadas que los megacariocitos» o «células progenitoras de megacariocitos» se refieren a células que tienen la capacidad de diferenciarse en megacariocitos que se encuentran en diversas fases de diferenciación, que van desde células madre hematopoyéticas hasta megacariocitos. Ejemplos no limitativos de células menos diferenciadas que los megacariocitos incluyen células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas, células positivas para CD34 y progenitores de megacariocitos-eritroides (MEP). Estas células se pueden obtener aislando a partir de, por ejemplo, médula ósea, sangre del cordón umbilical o sangre periférica, y se pueden obtener adicionalmente induciéndolas a diferenciarse a partir de células menos diferenciadas tales como células ES, células iPS y otras células madre pluripotentes.
[0020] En la presente descripción, un «gen de cáncer» se refiere a un gen que induce una transformación maligna de células en el cuerpo, y ejemplos de los mismos incluyen genes de la familia MYC (tales como c-MYC, N-MYC o L-MYC), genes de la familia SRC, genes de la familia rAs , genes de la familia RAF y genes de la familia de proteína quinasas tales como c-Kit, PDGFR o Abl.
[0021] En la presente descripción, se sabe que un «gen Polycomb» es un gen que funciona para evitar el envejecimiento celular mediante el control negativo del gen CDKN2a (INK4a/ARF) (Okura, y col. Regenerative Medicine, Vol. 6, No. 4, págs. 26-32; Jseus, y col., Nature Reviews Molecular Cell Biology, Vol. 7, págs. 667-677, 2006; Proc. Natl. Acad. Sci. uSa ., vol. 100, págs.211-216, 2003). Ejemplos no limitativos de genes Polycomb incluyen BMI1, Mel18, Ring1a/b, Phc1/2/3, Cbx2/4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HADC y Dnmt1/3a/3b.
[0022] En la presente descripción, un «gen supresor de apoptosis» se refiere a un gen que tiene una función que suprime la apoptosis celular, y ejemplos de los mismos incluyen el gen BCL2, el gen BCL-xL, el gen de Survivina y el gen MCL1.
[0023] La sobreexpresión de un gen y la terminación de esa sobreexpresión se pueden llevar a cabo mediante un procedimiento descrito en los documentos WO 2011/03473, WO 2012/157586, WO 2014/123242 o Nakamura, S. y col., Cell Stem Cell. 14, 535-548, 2014, así como otros procedimientos o procedimientos conocidos de acuerdo con estos.
[0024] En la presente descripción, un «receptor de aril hidrocarburos (AhR)» se refiere a un factor de transcripción perteneciente a la familia Per/ARNT/SIM(PAS). El AhR es inactivo cuando no está unido por un ligando, y migra al núcleo cuando está unido por un compuesto de aril hidrocarburo que sirve como un ligando. Dentro del núcleo, el AhR forma un heterodímero denominado translocador nuclear de AhR (ARNT) y posteriormente activa la transcripción mediante la unión a un elemento de respuesta a xenobióticos (XRE) presente en el ADN.
[0025] En la presente descripción, un «antagonista de AhR» se refiere a una sustancia que suprime la totalidad o una parte de al menos una reacción que se produce cuando un agonista se une a AhR. El antagonista de AhR puede actuar directamente sobre AhR o puede actuar indirectamente sobre AhR a través de la acción de otra sustancia.
[0026] En la presente descripción, un «agonista de AhR» se refiere a una sustancia que induce al menos una reacción que se induce en el caso de que un ligando intrínseco del mismo se haya unido a AhR. El agonista de AhR puede actuar directamente sobre AhR o puede actuar indirectamente sobre AhR a través de otra sustancia.
[0027] Una «sustancia que actúa sobre AhR» incluye, pero sin limitarse a, compuestos de bajo peso molecular, compuestos de alto peso molecular, proteínas tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos, péptidos y ácidos nucleicos.
[0028] Los ejemplos no limitativos de antagonistas de AhR usados en la presente invención incluyen los siguientes:
• 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (SR-1),
• a-naftoflavona,
• 1,4-dihidroxiantraquinona
• 1,5-dihidroxiantraquinona,
• 1,8-dihidroxiantraquinona,
• galangina,
• resveratrol,
• (2-metil-4-o-tolilazo-fenil)-amida del ácido 2-metil-2H-pirazol-3-carboxílico (CH-223191),
• N-[2-(3H-indol-3-il)etil]-9-isopropil-2-(5-metil-3-piridil)purin-6-amina (GNF-351),
• 2-(29-amino-39-metoxifenil)-oxanaftalen-4-ona (PD98059),
• (Z)-3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilidenil]-2-indolinona (TSU-16),
• 2-(29-amino-39-metoxifenil)-oxanaftalen-4-ona (PD98059),
• 6,2',4'-trimetoxiflavona (TMF), y
• 3',4'-dimetoxiflavona (DMF).
[0029] El AhR es preferentemente SR-1, GNF-351, CH-223191, TMF o DMF, más preferentemente SR-1, GNF-351 o CH- 223191, e incluso más preferentemente GNF-351 o SR-1 desde el punto de vista de cultivar megacariocitos en condiciones en ausencia de células nutrientes e incrementar el número y/o mejorar la función de las plaquetas producidas. GNF-351 es particularmente preferible ya que demuestra efectos iguales o mejores que los de SR-1 y CH-223191 a concentraciones más bajas. Se puede usar una pluralidad de antagonistas de AhR en combinación, siempre que los efectos deseados no se vean alterados.
[0030] Además de los ejemplos mencionados anteriormente, los compuestos descritos como antagonistas de AhR en el documento WO 2012/015914 también pueden usarse en la presente invención.
[0031] No hay limitaciones particulares en la concentración de antagonista de AhR en la etapa para la puesta en contacto con megacariocitos y puede ser determinada adecuadamente por un experto en la materia. Por ejemplo, si la concentración de antagonista de AhR en el medio es de 200 nM a menos de 1000 nM en el caso de usar SR-1, de 0,2 mM a menos de 4 mM en el caso de usar CH-223191, de 20 nM a menos de 300 nM en el caso de usar GNF-351, de 2,5 mM a menos de 40 mM en el caso de usar TMF, o de 2,5 mM a menos de 40 mM en el caso de usar DMF, el número y la función de las plaquetas resultantes pueden mejorarse, aunque el antagonista de AhR también puede estar presente en una cantidad fuera de estos intervalos.
[0032] En el caso de usar «células en las que al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis se ha sobreexpresado en células menos diferenciadas que los megacariocitos seguido de terminar esa sobreexpresión», no hay limitaciones particulares en el tiempo de esa sobreexpresión y puede ser determinado adecuadamente por un experto en la técnica.
[0033] Además, las células se pueden subcultivar después de la sobreexpresión, y aunque no hay limitaciones particulares en la cantidad de tiempo desde la ronda final de subcultivo hasta el día en que se termina la sobreexpresión, esa cantidad de tiempo puede ser, por ejemplo, 1 día, 2 días o 3 días o más.
[0034] Aunque no hay limitaciones particulares en el momento en que el antagonista de AhR se pone en contacto con los megacariocitos o células progenitoras de los mismos, siempre que se mejore el volumen de producción y/o la función de las plaquetas, los megacariocitos son preferentemente, al menos, multinucleados y están en una fase temprana de maduración.
[0035] En el caso de proceder con la multinucleación de megacariocitos inmortalizados mediante la producción de megacariocitos inmortalizados mediante la sobreexpresión de un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis en células menos diferenciadas que los megacariocitos seguida de la terminación de esa sobreexpresión, es preferible añadir antagonista de AhR al medio después de terminar la sobreexpresión.
[0036] No hay limitaciones particulares en el período de tiempo durante el cual los megacariocitos se ponen en contacto con el antagonista de AhR. Cuando se añade el antagonista de AhR al medio después de que se ha terminado la sobreexpresión, las plaquetas funcionales se liberan gradualmente a partir de aproximadamente el tercer día después de añadir el antagonista de AhR al medio, y el número de plaquetas aumenta con el número de días de cultivo. En el caso de añadir SR-1 como antagonista de AhR, aunque las plaquetas altamente funcionales, en particular, tienden a obtenerse después del cultivo durante 5 días, la duración del cultivo puede acortarse o alargarse siempre que se obtengan plaquetas funcionales.
[0037] No hay limitaciones particulares en la cantidad de tiempo hasta que se añade el antagonista de AhR al medio después de que se haya terminado la sobreexpresión de los genes mencionados anteriormente en los megacariocitos, y el cultivo puede iniciarse en presencia del antagonista de AhR dentro de 1 día, 2 días o 3 días o más. El antagonista de AhR se puede añadir al medio en una o más adiciones durante el período de cultivo.
[0038] Los megacariocitos son capaces de contactar con un inhibidor de ROCK además del antagonista de AhR. El uso combinado de un antagonista de AhR y un inhibidor de ROCK permite mejorar significativamente el número y la función de las plaquetas producidas. En particular, el efecto de promover la producción de plaquetas demuestra un efecto sinérgico en comparación con el caso de, respectivamente, usar el antagonista de AhR y el inhibidor de ROCK solos. En la presente descripción, un «inhibidor de ROCK» se refiere a un antagonista de la quinasa formadora de superhélice asociada a Rho (ROCK). Los ejemplos de inhibidores de ROCK incluyen, pero no se limitan a, Y27632, Y39983, clorhidrato de fasudil, ripasudil, SLX-2119, RKI-1447, azaindol1, SR-3677, estaurosporina y diclorhidrato de H1152, AR-12286 e INS-117548. Se puede usar una pluralidad de inhibidores de ROCK en combinación, siempre que los efectos deseados no se vean alterados.
[0039] El inhibidor de ROCK es preferentemente Y27632, Y39983, clorhidrato fasudil o ripasudil y más preferentemente Y39983 desde el punto de vista de cultivar megacariocitos en condiciones en ausencia de células nutrientes y aumentar el número y/o mejorar la función de las plaquetas producidas. Aunque no hay limitaciones particulares en el momento en que el inhibidor de ROCK se pone en contacto con los megacariocitos o células progenitoras de los mismos siempre que se mejore el volumen de producción y/o la función de las plaquetas, los megacariocitos son preferentemente aquellos que son al menos multinucleados.
[0040] Tal como se indica en los ejemplos que se describirán posteriormente, cuando megacariocitos o células progenitoras de los mismos se ponen en contacto con un antagonista de AhR e inhibidor de ROCK, la cantidad de plaquetas resultantes producidas aumenta, y la función de las mismas mejoras incluso en condiciones de cultivo en ausencia de células nutrientes. Lo que es particularmente notable es que, en comparación con el caso de usar cada uno de antagonista de AhR e inhibidor de ROCK solo, el uso combinado de los dos fármacos actúa sinérgicamente sobre el efecto de promover la producción de plaquetas. Aunque no hay limitaciones particulares en la combinación de antagonista de AhR e inhibidor de ROCK, una combinación de uno o una pluralidad de antagonistas de AhR seleccionados del grupo que consiste en SR-1, GNF-351 y CH-223191, y uno o una pluralidad de inhibidores de ROCK seleccionados del grupo que consiste en Y27632, Y39983, clorhidrato fasudil y ripasudil, es preferible desde el punto de vista de mejorar significativamente el número y la función de las plaquetas. Entre estas, la combinación de SR-1 y/o GNF-351 e Y27632 y/o Y39983 es más preferible. En el caso de usar la combinación de GNF-351 e Y39983 en particular, el volumen de producción de plaquetas funcionales aumenta significativamente (datos no mostrados). El antagonista de AhR y el inhibidor de ROCK pueden añadirse simultáneamente o cualquiera de los fármacos puede añadirse primero.
[0041] Las «plaquetas» constituyen una parte de los componentes celulares de la sangre, y en la presente descripción, se caracterizan por ser positivas para CD41a y positivas para CD42b. Además de cumplir un papel importante en la formación de trombos y la hemostasia, las plaquetas también participan en la regeneración tisular después de una lesión y la fisiopatología de la inflamación. Cuando las plaquetas se activan por factores tales como hemorragia, los receptores de factores adhesivos celulares tales como integrina aIIBp3 (glucoproteína Ilb/IIIa; complejo de CD41a y CD61) se expresan en la membrana de las mismas. Como resultado, las plaquetas comienzan a acumularse, se forman trombos debido a la coagulación de la fibrina por diversos tipos de factores de coagulación de la sangre liberados desde las plaquetas, y la hemostasia progresa.
[0042] Cuando se usan en la presente descripción, las «funciones» de las plaquetas se refieren a aquellas funciones conocidas en la técnica, tales como una función de circulación, función de formación de trombos o función de hemostasia. En la presente descripción, las expresiones de «altamente funcional», «alta función plaquetaria» o «activada», o expresiones similares a estas, se refieren a la función plaquetaria (o actividad fisiológica), medida por, al menos, un procedimiento que se describirá posteriormente, que es igual o superior, y preferentemente significativamente superior, o plaquetas con forma que es igual o inferior, y preferentemente significativamente inferior, en comparación con las plaquetas obtenidas por un procedimiento convencional que no usa un antagonista de AhR o inhibidor de ROCK, o plaquetas aisladas del cuerpo. De manera alternativa, estas expresiones se refieren a un estado en el que un experto en la materia puede juzgar que la función plaquetaria ha tendido a mejorarse incluso si la diferencia no es significativa.
[0043] De manera alternativa, en la presente invención, expresiones tales como «plaquetas altamente funcionales», «función plaquetaria alta» o «activada» significan que la función plaquetaria, medida mediante al menos un procedimiento que se describirá posteriormente, es del 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más o 90 % o más de la de las plaquetas obtenidas mediante un procedimiento convencional que no usa un antagonista AhR o inhibidor de ROCK, o plaquetas naturales aisladas del cuerpo.
[0044] La función plaquetaria mencionada anteriormente se puede evaluar midiendo según un procedimiento conocido. Por ejemplo, la cantidad de plaquetas activadas se puede medir usando anticuerpo PAC-1, que es un anticuerpo que se une específicamente al marcador de activación, integrina aMBp3 (glucoproteína Mb/iiia; complejo de CD41a y CD61), presente en la membrana de plaquetas activadas. Además, la cantidad de plaquetas activadas también puede medirse de manera similar mediante la detección del marcador de activación de plaquetas, CD62b (P-selectina), con anticuerpo. La medición de la cantidad de plaquetas se puede llevar a cabo, por ejemplo, separando las plaquetas con anticuerpo para el marcador plaquetario independiente de activación CD61 o CD41 usando citometría de flujo, seguido por la detección de la unión del anticuerpo PAC-1 o anticuerpo anti-CD62P a las plaquetas. Estas etapas también se pueden llevar a cabo en presencia de difosfato de adenosina (ADP).
[0045] Además, la evaluación de la función plaquetaria se puede llevar a cabo observando si las plaquetas se unen o no con fibrinógeno en presencia de ADP. La activación de la integrina, que inicialmente es necesaria para la formación de trombos, se produce como resultado de la unión de plaquetas con fibrinógeno. Además, la evaluación de la función plaquetaria también se puede llevar a cabo mediante un procedimiento que comprende visualizar y posteriormente observar la capacidad de formar trombo in vivo como se indica en la figura 6 del documento WO 2011/034073.
[0046] La evaluación de la función de circulación de plaquetas en el cuerpo se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos ordinarios. Más específicamente, después de administrar plaquetas a 23108 plaquetas/animal en las venas de la cola de ratones NOG que sirven como un modelo de trombocitopenia inducido por radiación gamma (2,4 Gy), las plaquetas derivadas de seres humanos presentes en la sangre recogida de la vena yugular a intervalos fijos se analizan usando anticuerpo anti-CD41 humano para evaluar la función de circulación de las plaquetas.
[0047] La evaluación de la función hemostática de las plaquetas se puede evaluar de acuerdo con procedimientos ordinarios. Más específicamente, después de administrar plaquetas a 23108 plaquetas/animal en las venas de la cola de ratones NOG que sirven como un modelo de trombocitopenia inducido por radiación gamma (2,4 Gy), la vena de la cola se perfora (2 cm desde la punta) usando una jeringa de 28 G bajo anestesia (uretano, 1,5 g/kg) seguida de medir la cantidad de tiempo hasta que se produce la hemostasia mientras se sumerge la punta de la cola en PBS calentada a 37°C para evaluar la función hemostática.
[0048] Por otro lado, se evalúa que las plaquetas han sufrido degradación o son anormales en el caso de que la tasa de expresión de CD42b por las plaquetas sea baja o en el caso de que la tasa de positivas para anexina V sea alta. Estas plaquetas no son útiles clínicamente ya que no tienen la capacidad adecuada para formar trombos o demostrar hemostasia.
[0049] En la presente descripción, «degradación plaquetaria» se refiere a una reducción de CD42b (GPIba) en la superficie plaquetaria. Por tanto, las plaquetas degradadas incluyen plaquetas para las que la expresión de CD42b ha disminuido y plaquetas en las que la región extracelular de CD42b se ha escindido mediante una reacción de desprendimiento. Cuando CD42b ya no está presente en la superficie plaquetaria, la conjugación con el factor de von Willebrand (VWF) ya no es posible, y como resultado de ello, las plaquetas pierden la función de coagular la sangre. La degradación plaquetaria se puede evaluar usando como indicador la relación de la tasa de negativas para CD42b (o el número de partículas negativas para CD42b) con la tasa de positivas para CD42b (o el número de partículas positivas para CD42b) presentes en una fracción plaquetaria. Las plaquetas se degradan a medida que la relación entre la tasa de negativas para CD42b y la tasa de positivas para CD42b se vuelve más alta, o a medida que el número de partículas negativas para CD42b se vuelve grande en relación con el número de partículas positivas para CD42b. La tasa de positivas para CD42b se refiere a la relación de plaquetas contenidas en una fracción de plaquetas a las que puede unirse el anticuerpo anti-CD42b, mientras que la tasa de negativas para CD42b se refiere a la relación de plaquetas a las que no se une el anticuerpo anti-CD42b.
[0050] En la presente descripción, «plaquetas anormales» se refieren a plaquetas en las que un fosfolípido cargado negativamente en forma de fosfatidilserina ha quedado expuesto desde el interior al exterior de la bicapa lipídica. En el cuerpo, la fosfatidilserina está expuesta en la superficie que acompaña la activación plaquetaria, y se sabe que la reacción en cascada de coagulación sanguínea se amplifica como resultado de numerosos factores de coagulación sanguínea que se unen a la misma. Por otro lado, en plaquetas anormales, una gran cantidad de fosfatidilserina está presente en la superficie en todo momento, y cuando dichas plaquetas se administran a un paciente, se induce una reacción de coagulación sanguínea excesiva que tiene el potencial de conducir a una afección grave, tal como síndrome de coagulación intravascular diseminada. Dado que la anexina V se une a la fosfatidilserina, la fosfatidilserina en la superficie de las plaquetas se puede detectar mediante citometría de flujo usando la cantidad de anexina V marcada con fluorescencia unida como indicador. Por consiguiente, la cantidad de plaquetas anormales se puede evaluar en función de la tasa de positivas para anexina V o, en otras palabras, la relación o cantidad de plaquetas a las que se une la anexina. El número de plaquetas anormales se vuelve mayor cuanto mayor sea la tasa de positivas para anexina V, o mayor sea el número de partículas de anexina V.
[0051] Además, la evaluación de la función plaquetaria también se puede llevar a cabo observando si las plaquetas se unen o no al fibrinógeno en presencia de ADP. La integrina, que es necesaria para la formación inicial de trombos, se activa como resultado de la unión de las plaquetas al fibrinógeno.
[0052] Además, la evaluación de las plaquetas también se puede llevar a cabo mediante un procedimiento que comprende visualizar y posteriormente observar la capacidad de formar trombo in vivo como se indica en la figura 6 del documento WO 2011/034073.
[0053] En el caso de proceder con la multinucleación de megacariocitos inmortalizados mediante la producción de megacariocitos inmortalizados mediante la sobreexpresión de un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis en células menos diferenciadas que los megacariocitos seguida de la terminación de esa sobreexpresión, es preferible añadir inhibidor de ROCK al medio después de terminar la sobreexpresión.
(Segundo aspecto)
[0054] En esta solicitud se describe un procedimiento para producir plaquetas que comprende una etapa para suprimir la expresión o función de una proteína del grupo de alta movilidad At-hook (HMGA) en megacariocitos o células progenitoras de los mismos.
[0055] La proteína del grupo de alta movilidad At-hook (o grupo de alta movilidad A) (HMGA) es una proteína de cromatina no histona que se une principalmente al ADN que contiene grandes cantidades de AT, y se conoce como HMGA1 y HMGA2. HMGA, tal como se usa en esta solicitud particularmente, es preferentemente HMGA2. La proteína HMGA2 humana también se conoce como secuencia de referencia NCBI: NP_001287847.1.
[0056] En la presente descripción, el término «expresión de proteína» se usa basándose en el concepto de incluir tanto la transcripción como la traducción, y en el caso de referirse a «suprimir la expresión», se refiere a suprimir la totalidad o una parte de la expresión en el nivel de transcripción o nivel de traducción.
[0057] La etapa para suprimir la expresión o función de la proteína HMGA puede llevarse a cabo usando un procedimiento conocido o un procedimiento de acuerdo con este.
[0058] Además, el procedimiento negativo dominante puede usarse como procedimiento para suprimir la función de la proteína HMGA. El procedimiento negativo dominante comprende expresar una gran cantidad de proteína HMGA, para la cual la actividad de la misma se ha reducido o perdido mediante la introducción de una mutación, en células para aumentar abrumadoramente la proporción de proteína HMGA inactiva con respecto a la proteína HMGA normal en las células y obtener células que exhiben un comportamiento que impide que se obtenga la función de la proteína HMGA.
[0059] El anticuerpo anti-HMGA se puede usar para inhibir la función de la proteína HMGA. El anticuerpo producido de acuerdo con un procedimiento conocido o anticuerpo comercialmente disponible puede usarse para el anticuerpo anti-HMGA, y cualquier anticuerpo de este tipo puede usarse, siempre que los efectos de la presente invención se obtengan a través de la supresión de la función de las proteínas HMGA.
[0060] Un ejemplo de un procedimiento para suprimir la expresión de proteínas HMGA incluye el uso de miARN que suprime directa o indirectamente la expresión del gen HMGA. El miARN puede ser aquel que actúa directamente sobre el gen HMGA o aquel que actúa indirectamente. Por ejemplo, este procedimiento puede llevarse a cabo mediante el uso de miARN al que se hace referencia como let-7. En la presente invención, aunque let-7 es cualquier miARN seleccionado del grupo que consiste en hsa-let-7a-1, hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d, hsa-let-7e, hsa-let-7f-1, hsa-let-7f-2, hsa-let-7g y has-let-7i en el caso de los seres humanos, por ejemplo, también se puede utilizar let-7 de otras especies animales. La secuencia de let-7 y así sucesivamente puede obtenerse adecuadamente de información registrada en una base de datos (tal como http://www.mirbase.org/ o http://www.microrna.org/). En la presente invención, let-7 es preferentemente hsa-let-7b.
[0061] Además, la supresión de la expresión de proteínas HMGA2 también puede llevarse a cabo usando un procedimiento que comprende usar miARN que suprime la expresión de Lin28b, que controla negativamente la expresión de let-7. Un ejemplo de este miARN es miR181a. Aunque miR181a es cualquier miARN seleccionado del grupo que consiste en hsa-mir-213, hsa-mir-181a-1 y hsa-mir-181a-2 en el caso de los seres humanos, por ejemplo, también se puede usar miR181a de otras especies animales. La secuencia de miR181a y así sucesivamente se puede obtener adecuadamente de información registrada en las mismas bases de datos que se describieron anteriormente.
[0062] «miARN» se refiere a ARN no codificante que tiene una cadena corta (de 20 a 25 bases) presente en células que participan en la regulación de la expresión génica a través de la inhibición de la traducción de ARNm a proteínas y la descomposición de ARNm. Este miARN funciona al transcribirse como pri-miARN, que difiere en una sola cadena de este, que es capaz de adoptar una estructura de bucle de horquilla que contiene miARN y una cadena complementaria del mismo, y que tiene una parte del mismo escindida por una enzima denominada DROSHA dentro del núcleo de la célula, lo que da como resultado la formación de pre-miARN, seguido por este pre-miARN que se transporta fuera de la célula y se escinde adicionalmente por Dicer. Por lo tanto, en la presente invención, el let-7 o miR181 usado puede ser pri-miARN monocatenario o pre-miARN bicatenario.
[0063] Los ejemplos de procedimientos que se pueden usar para suprimir la expresión del gen HMGA incluyen el procedimiento antisentido, el procedimiento de ribozimas y el procedimiento de iARN.
[0064] El procedimiento antisentido comprende suprimir la expresión de un gen usando un ácido nucleico monocatenario típicamente de 10 a 100 bases de longitud, y preferentemente de 15 a 30 bases de longitud, que tiene una secuencia de bases complementaria al gen diana (básicamente, el producto de transcripción del mismo en forma de ARNm). La expresión génica se suprime mediante la introducción del ácido nucleico antisentido en las células y la hibridación del ácido nucleico antisentido con el gen diana. No se requiere que el ácido nucleico antisentido sea completamente complementario al gen diana, siempre que permita obtener el efecto de suprimir la expresión del gen diana. El ácido nucleico antisentido puede ser diseñado adecuadamente por un experto en la materia usando software conocido y similares. El ácido nucleico antisentido puede ser cualquiera de ADN, ARN o quimera de ADN/ARN, y no se requiere que se modifique.
[0065] Las ribozimas son moléculas de ácido nucleico que hidrolizan catalíticamente un ARN diana y están compuestas por una cadena antisentido que tiene una secuencia complementaria al ARN diana y una región central catalítica responsable de la reacción de escisión. Las ribozimas pueden ser diseñadas adecuadamente por un experto en la materia de acuerdo con procedimientos conocidos. Aunque las ribozimas son típicamente moléculas de ARN, también se pueden usar moléculas de quimera de ADN y ARN.
[0066] El procedimiento de iARN es un mecanismo de supresión de la expresión génica específico de secuencia inducido por un ácido nucleico bicatenario. Además de que la especificidad diana es extremadamente alta, también ofrece un alto grado de seguridad, ya que usa el mecanismo de supresión de la expresión génica inherentemente presente en el cuerpo.
[0067] Un ejemplo de un ácido nucleico bicatenario que tiene un efecto de iARN es ARNip. En el caso del uso en mamíferos, el ARNip es ARN bicatenario que normalmente tiene aproximadamente de 19 a 30 bases y preferentemente de 21 a 25 bases. Típicamente, una de las cadenas de ácidos nucleicos bicatenarios que demuestran un efecto de iARN tiene una secuencia base complementaria a una parte de un ácido nucleico diana, mientras que la otra cadena tiene una secuencia complementaria a esta. El ARNip que suprime la expresión de HMGA puede ser diseñado adecuadamente por un experto en la materia usando software conocido y similares, y la secuencia diana usada en los ejemplos que se describirán posteriormente se ejemplifica como una de las cadenas de una secuencia de ácido nucleico bicatenario. El ARNip que suprime la expresión de HMGA puede actuar directamente sobre el gen HMGA (al contener una secuencia que es complementaria a una parte del gen HMGA) o puede actuar indirectamente (al suprimir la expresión de un gen distinto del gen HMGA para suprimir la expresión del gen HMGA como resultado de esto).
[0068] El ácido nucleico antisentido let-7, miR181a mencionado anteriormente y ribozimas se pueden expresar dentro de las células mediante la introducción de un vector (tal como un vector de lentivirus) que contiene ácido nucleico, respectivamente, que lo codifica en las células, o se puede introducir en las células en forma de ARN. En el caso de la introducción en forma de ARN, ácido nucleico antisentido el let-7, miR181a o ribozimas se pueden introducir en las células mediante un procedimiento conocido tal como lipofección o microinyección, y ARN que incorpora 5-metilcitidina y pseudouridina (TriLink Biotechnologies) (Warren, L., Cell Stem Cell, 7: 618-630 (2010)) o también se puede usar quimera de ADN y ARN que incorpora ADN para suprimir la degradación de ARN. En el caso de uridina o citidina, las ubicaciones de las bases modificadas pueden ser independientemente todas o una parte de las ubicaciones, y en el caso de solo una parte de las ubicaciones, pueden ser ubicaciones aleatorias en una proporción arbitraria. Se puede usar un vector que contiene ADN que codifica cada cadena doble para el vector que contiene ácido nucleico que codifica let-7, miR181a o ARNip, o se puede usar un vector que contiene ADN que codifica un ácido nucleico monocatenario capaz de enlazar ácido nucleico bicatenario a través de un bucle. En el caso de ARNip, el ARN monocatenario obtenido por transcripción intracelular puede diseñarse para hibridar con una parte complementaria del ARNip dentro de una molécula del mismo para adoptar una estructura de horquilla. Este tipo de ARN se conoce como ARN horquillado corto (ARNhc). Cuando el ARNhc migra al citoplasma, la parte de bucle se escinde mediante una enzima (Dicer) lo que da como resultado la formación de ARNip y permite que se demuestre el efecto iARN del mismo.
[0069] En la presente descripción, cuando se hace referencia a la supresión de la expresión de una proteína como «llevada a cabo por ARNip» o «llevada a cabo por miARN», esto significa en última instancia que el ARNip o miARN suprime la expresión, y el ARNip, ARNhc o miARN se pueden administrar en forma de ARN, o se puede administrar un vector que contiene ácido nucleico que codifica ARNip, ARNhc o miARN.
[0070] En el caso de introducir let-7, miR181a o ARNip o ARNhc contra HMGA con un vector y similares, la expresión de ese ARN puede controlarse mediante un promotor sensible al fármaco. Un vector capaz de controlar el ARN de forma sensible al fármaco de esta manera se puede adquirir de, por ejemplo, Takara Bio Inc. En este caso, la introducción de este ARN significa que el ARN se expresa dentro de las células al ponerse en contacto con el fármaco correspondiente.
[0071] Tal como se entenderá a partir de los ejemplos, desde el punto de vista de ser eficaz en el proceso de maduración de megacariocitos que incluye multinucleación y aumento de tamaño, la supresión de la expresión o función de la proteína HMGA puede llevarse a cabo en megacariocitos antes de la multinucleación, o desde el punto de vista de hacer que los megacariocitos multinucleados se sometan a una multinucleación adicional, la supresión de la expresión o función de la proteína HMGA puede llevarse a cabo en megacariocitos multinucleados. Dado que se promueve la multinucleación y el aumento de tamaño de megacariocitos y el número de plaquetas producidas por célula aumenta drásticamente, es preferible llevar a cabo la supresión de la expresión o función de la proteína HMGA en una etapa para producir plaquetas a partir de megacariocitos.
[0072] Los megacariocitos maduros obtenidos según la presente invención son capaces de producir plaquetas funcionales de manera eficiente. En la presente descripción, la maduración de los megacariocitos se refiere a que los megacariocitos se vuelven suficientemente multinucleados para poder producir plaquetas funcionales. La maduración de megacariocitos puede confirmarse mediante aumentos en la expresión de un grupo de genes asociados a la maduración de megacariocitos tales como GATA1, p45 NF-E2 o beta1-tubulina, la formación de proplaquetas y la multinucleación intracelular.
[0073] Además, en el caso de proceder con la multinucleación de megacariocitos inmortalizados al sobreexpresar un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis en células menos diferenciadas que los megacariocitos para producir megacariocitos inmortalizados seguido de terminar esa sobreexpresión, aunque no hay limitaciones particulares sobre si la supresión mencionada anteriormente de la expresión o función de la proteína HMGA se inicia antes o después de la terminación de la sobreexpresión de esos genes, la expresión o función de la proteína HMGA se suprime preferentemente al menos después de haber terminado la sobreexpresión. Dado que el número de células positivas para CD41a, es decir, el número de megacariocitos antes de la multinucleación, tiende a disminuir mediante la supresión de la expresión o función de la proteína HMGA antes de la terminación de la sobreexpresión de esos genes, el inicio de la supresión de la expresión o función de la proteína HMGA se lleva a cabo más preferentemente después de haber terminado la sobreexpresión de esos genes desde el punto de vista de mantener el número de megacariocitos antes de la multinucleación.
(Tercer aspecto)
[0074] En esta solicitud se describe un procedimiento para producir megacariocitos que comprende una etapa para cultivar megacariocitos, en el que se ha suprimido la expresión o función de proteínas HMGA, en presencia de un antagonista de AhR y/o inhibidor de ROCK. Además, la etapa de cultivo puede llevarse a cabo de la misma manera que la etapa de contacto mencionada anteriormente. Un procedimiento para producir megacariocitos que se describe en esta solicitud también puede comprender una etapa para producir plaquetas.
(Condiciones de cultivo y otros parámetros)
[0075] Las condiciones de cultivo de megacariocitos pueden incluir las usadas durante el cultivo ordinario. Por ejemplo, la temperatura puede ser una temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 42°C, de aproximadamente 36°C a aproximadamente 40°C o de aproximadamente 37°C a aproximadamente 39°C, y el cultivo puede llevarse a cabo en presencia del 5 % de CO2 y/o el 20 % de O2. El cultivo puede llevarse a cabo mediante cultivo estático o cultivo en agitación. De acuerdo con la presente descripción, dado que el cultivo se puede realizar en condiciones en ausencia de células nutrientes en el caso de usar un antagonista de AhR tal como SR-1, el cultivo en agitación es preferible en el caso de producir una gran cantidad de plaquetas. No hay limitaciones particulares en la velocidad de agitación en el caso del cultivo en agitación, y se puede usar una velocidad de agitación de, por ejemplo, 10 rpm a 200 rpm o de 30 rpm a 150 rpm.
[0076] En la presente descripción, se permite que los megacariocitos maduren y se producen plaquetas a partir del citoplasma de los mismos mediante el cultivo de los megacariocitos de la manera descrita anteriormente. En este caso, la maduración de los megacariocitos se refiere a permitir que los megacariocitos se vuelvan multinucleados y liberen plaquetas.
[0077] No hay limitaciones particulares en el medio usado cuando se cultivan megacariocitos, y se pueden usar adecuadamente medios conocidos o medios de acuerdo con estos que son preferibles para producir plaquetas a partir de megacariocitos. Por ejemplo, los medios usados para cultivar células animales se pueden preparar para su uso como medios basales. Los ejemplos de medios basales incluyen medio IMDM, Medio 199, medio mínimo esencial de Eagle (EMEM), aMEM, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio F12 de Ham, medio RPMI 1640, medio Fisher, medio Neurobasal (Life Technologies Corporation) y medios mixtos de los mismos.
[0078] El medio puede contener suero o plasma o puede estar libre de suero. El medio puede contener una o más sustancias tales como albúmina, insulina, transferrina, selenio, ácidos grasos, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, tioglicerol, monotioglicerol (MTG), lípidos, aminoácidos (tales como L-glutamina), ácido ascórbico, heparina, aminoácidos no esenciales, vitaminas, factores de crecimiento, compuestos de bajo peso molecular, antibióticos, antioxidantes, ácido pirúvico, tampones, sales inorgánicas o citocinas, según sea necesario. Las citocinas son proteínas que promueven la diferenciación hematopoyética, y sus ejemplos incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), trombopoyetina (TPO), diversos tipos de agentes similares a TPO, factor de células madre (SCF), suplemento de insulina-transferina-selenio (ITS) e inhibidores de ADAM. El medio IMDM que contiene suero, insulina, transferrina, selenio, tioglicerol, ácido ascórbico y TPO se usa preferentemente en la presente invención. Este medio IMDM puede contener además SCF y puede contener además heparina. No hay limitaciones particulares en la concentración de cada sustancia y, por ejemplo, la concentración de TPO puede ser de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 200 ng/ml o de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, la concentración de SCF puede ser de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 200 ng/ml o aproximadamente 50 ng/ml y la concentración de heparina puede ser de aproximadamente 10 U/ml a aproximadamente 100 U/ml o aproximadamente 25 U/ml. También se puede añadir un éster de forbol (tal como 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA)).
[0079] El suero humano es preferible en el caso de usar suero. Además, el plasma humano y similares pueden usarse en lugar del suero. De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, se pueden obtener plaquetas equivalentes a las obtenidas cuando se usa suero, incluso si se usan estos componentes.
[0080] En el caso de usar un sistema de inducción de expresión génica sensible al fármaco a la manera de un sistema Tet-on® o Tet-off® para la sobreexpresión de un gen o la terminación de la misma, el fármaco correspondiente tal como tetraciclina o doxiciclina en la etapa de sobreexpresión está contenido en el medio, y la sobreexpresión puede suprimirse mediante la eliminación del fármaco del medio.
[0081] La etapa para cultivar megacariocitos en la presente invención se puede llevar a cabo en ausencia de células nutrientes. Como se indica en los ejemplos que se describirán posteriormente, de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, se pueden obtener plaquetas funcionales incluso si el cultivo se lleva a cabo en ausencia de células nutrientes.
[0082] En la presente descripción, «células nutrientes» se refiere a células cultivadas con células que se desea que proliferen o se diferencien (células diana) con el fin de proporcionar un entorno necesario para el cultivo de las células diana. Las células nutrientes incluyen células derivadas de la misma especie y células derivadas de una especie diferente, siempre que sean células que puedan distinguirse de las células diana. Las células nutrientes pueden ser células que han sido tratadas con un antibiótico o rayos gamma para no proliferar, o pueden ser células no sometidas a dicho tratamiento.
[0083] Las plaquetas producidas de acuerdo con el procedimiento de la presente invención se describen en esta solicitud. Como se indica en los ejemplos que se describirán posteriormente, las plaquetas producidas de acuerdo con el procedimiento de la presente invención demuestran un desarrollo más avanzado del sistema canalicular abierto en comparación con las plaquetas producidas in vitro de acuerdo con procedimientos convencionales, y se observa que son morfológicamente similares a las plaquetas naturales desde el punto de vista de poder confirmar la presencia de mitocondrias.
[0084] El procedimiento para producir una preparación plaquetaria según la presente invención comprende una etapa para producir plaquetas en megacariocitos maduros preparados de la manera descrita anteriormente, y opcionalmente comprende una etapa para recuperar una fracción rica en plaquetas a partir del cultivo y una etapa para eliminar componentes de células sanguíneas distintos de plaquetas de la fracción plaquetaria. La etapa para eliminar componentes de células sanguíneas se puede llevar a cabo mediante la eliminación de componentes de células sanguíneas distintos de plaquetas, incluidos megacariocitos, utilizando un filtro de eliminación de leucocitos (tal como el fabricado por Terumo Corporation o Asahi Kasei Medical Co., Ltd.). Un ejemplo específico de un procedimiento para producir una preparación plaquetaria se describe en el documento WO 2011/034073.
[0085] El procedimiento para producir una preparación sanguínea de acuerdo con la presente descripción comprende una etapa para producir la preparación plaquetaria mencionada anteriormente y una etapa para mezclar la preparación plaquetaria con otros componentes. Un ejemplo de los otros componentes son los eritrocitos.
[0086] Otros componentes que contribuyen a la estabilización de las células también se pueden añadir a la preparación plaquetaria y la preparación sanguínea.
[0087] Además, en esta solicitud se describe una composición que contiene megacariocitos multinucleados, antagonista de AhR y medio. La presente composición permite la obtención de plaquetas altamente funcionales mediante cultivo tal cual o se puede liofilizar. En el caso de liofilización en particular, la composición puede contener DMSO, glicerol o un reactivo de crioconservación celular disponible comercialmente que protege a las células durante la congelación. Las plaquetas altamente funcionales se pueden obtener descongelando y cultivando la composición congelada.
[0088] Las descripciones de todos los documentos de patentes y documentos no de patente citados en la presente descripción se describen en esta solicitud.
Ejemplo 1
[0089] Aunque a continuación se proporciona una explicación detallada de la presente invención basada en ejemplos de la misma, la presente invención no se limita a la misma. Un experto en la materia es capaz de modificar la presente invención de diversas maneras sin desviarse del significado de la presente invención, y dichas modificaciones se incluyen dentro del alcance de la presente invención.
1. Preparación de megacariocitos inmortalizados
1-1. Preparación de células progenitoras hematopoyéticas a partir de células iPS
[0090] Las células iPS humanas (TKDN SeV2: células iPS derivadas de fibroblastos cutáneos fetales humanos establecidas usando el virus Sendai) se cultivaron para diferenciarse en células sanguíneas de acuerdo con el procedimiento descrito en Takayama, N., y col., J. Exp. Med., 2817-2830 (2010). Es decir, se cocultivaron colonias de células ES/iPS humanas durante 14 días con células nutrientes C3H10T1/2 en presencia de VEGF (R&D Systems, Inc.) a 20 ng/ml para preparar células progenitoras hematopoyéticas (HPC). El cultivo se llevó a cabo en condiciones de cultivo de O2 al 20 % y CO2 al 5 % (para aplicarse de manera similar en lo sucesivo, a menos que se indique específicamente lo contrario).
1-2. Infección vírica de c-MYC y BMI1 en células progenitoras hematopoyéticas
[0091] HPC obtenidas de la manera descrita anteriormente se diseminaron a 53 104 células/pocillo en una placa de 6 pocillos, diseminadas preliminarmente en células nutrientes C3H10T1/2 seguida de sobreexpresión de c-MYC y BMI1 usando el procedimiento de lentivirus. En este momento, se usaron 6 pocillos para cada línea celular. Es decir, las partículas de virus se añadieron respectivamente al medio en una relación m Oi de 20, y las células se infectaron por infección por centrifugación (mediante centrifugación a 32°C y 900 rpm durante 60 minutos). Este procedimiento se llevó a cabo dos veces a intervalos de 12 horas. En este momento, el medio obtenido mediante la adición adicional de protamina a una concentración final de 10 mg/ml a medio que contiene 50 ng/ml de trombopoyetina humana (TPO) (R&D Systems, Inc.), 50 ng/ml de factor de células madre humanas (SCF) (R&D Systems, Inc.) y 2 mg/ml de doxiciclina (Dox) en un medio basal (IMDM (medio de Dulbecco modificado por Iscove) (Sigma-Aldrich Company Ltd.) que contiene 15% de suero fetal bovino (Gibco Corporation), 1 % de penicilina-estreptomicinaglutamina (Gibco Corporation), 1 % de solución de insulina, transferrina y selenio (ITS-G) (Gibco Corporation), 0,45 mM de 1-tioglicerol (Sigma-Aldrich Company Ltd.) y 50 mg/ml de ácido L-ascórbico (Sigma-Aldrich Company Ltd.)) (que se denominará medio de diferenciación) se usó como medio. Además, el vector de lentivirus fue un vector inducible regulado por tetraciclina producido mediante la recombinación del casete mOKS de LV-TRE-mOKS-UbctTA-I2G (Kobayashi, T., y col., Cell, 142, 787-799 (2010)) en c-MYC, BMI1 y BCL-xL (respectivamente denominados LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G, LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G y LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA- I2G). Las partículas de virus usadas para la infección se prepararon expresando el vector de lentivirus mencionado anteriormente en células 293T.
[0092] 1-3. Preparación y mantenimiento del cultivo de líneas de megacariocitos autorrenovables
[0093] Después de designar el día en el que se llevó a cabo la infección vírica con cMYC y BMI1 de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente como día 0 de infección, se prepararon líneas de megacariocitos autorrenovables, respectivamente, cultivando las células de megacariocitos introducidas con cMYC y BMI1 como se describe a continuación.
• Día 2 de infección a día 11 de infección
[0094] Las células sanguíneas infectadas por virus obtenidas según el procedimiento descrito anteriormente se recuperaron mediante pipeteo, y después de retirar el sobrenadante por centrifugación durante 5 minutos a 1200 rpm, las células se suspendieron en medio de diferenciación fresco y se diseminaron en células nutrientes C3H10T1/2 frescas (placa de 6 pocilios). El subcultivo se llevó a cabo mediante la realización del mismo procedimiento el día 9 de la infección. Después de contar el número de células, las células se diseminaron en células nutrientes C3H10T1/2 a 1 3 105 células/2 ml/pocillo (placa de 6 pocillos).
• Día 12 de infección a día 13 de infección
[0095] Se llevó a cabo el mismo procedimiento que el realizado el día 2 de la infección. Después de contar el número de células, las células se diseminaron en células nutrientes C3H10T1/2 a 33105 células/10 ml/placa de 100 mm (placa de 100 mm).
• Día 14 de infección
[0096] Las células sanguíneas en las que se había completado la infección vírica se recuperaron y se sometieron a reacciones de anticuerpo usando 2 ml, 1 ml y 1 ml de anticuerpo anti-CD41a-APC humano (BioLegend Inc.), anticuerpo anti-CD42b-PE humano (eBioscience, Inc.) y anticuerpo anti-CD235ab-Pacific Blue humano (BioLegend Inc.), respectivamente, por 1,03105 células. Después de las reacciones, las células se analizaron usando FACS Verse (Becton Dickinson and Company). Se consideró que las células que tenían una tasa de positivas para CD41a del 50 % o superior el día 14 de la infección constituían una línea de megacariocitos autorrenovables.
1-4. Infección vírica de BCL-xL en líneas de megacariocitos autopropagantes
[0097] El gen BCL-xL se introdujo en las líneas de megacariocitos autorrenovables mencionadas anteriormente el día 14 de la infección
usando el procedimiento de lentivirus. Se añadieron partículas de virus al medio a una relación MOI de 10, seguido de infección por infección por centrifugación (mediante centrifugación a 32°C y 900 rpm durante 60 minutos).
1-5. Preparación y cultivo de mantenimiento de líneas de megacariocitos inmortalizados
• Día 14 de infección a día 18 de infección
[0098] Las líneas de megacariocitos autorrenovables en las que se introdujo el gen BCL-xL obtenido de la manera descrita anteriormente se recuperaron y se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm. Después de la centrifugación, las células depositadas se suspendieron en medio de diferenciación fresco seguido de diseminación en células nutrientes C3H10T1/2 frescas a 23105 células/2 ml/pocillo (placa de 6 pocillos).
• Día 18 de la infección: Subcultivo
[0099] Después de contar el número de células, las células se diseminaron a 33105 células/10 ml/placa de 100 mm.
• Día 24 de la infección: Subcultivo
[0100] Después de contar el número de células, las células se diseminaron a 13105 células/10 ml/placa de 100 mm. El cultivo de mantenimiento se llevó a cabo posteriormente mediante subcultivo cada 4 a 7 días.
[0101] Las líneas de megacariocitos autorrenovables en las que se introdujo el gen BCL-xL se recuperaron el día 24 de la infección, y después de la inmunotinción usando 2 ml, 1 ml y 1 ml de anticuerpo anti-CD41a-APC humano (BioLegend Inc.), anticuerpo anti-CD42b-PE humano (eBioscience, Inc.) y anticuerpo anti-CD235ab-Pacific Blue humano (anti-CD235ab-PB) (BioLegend Inc.), respectivamente, por 1,03105 células, las células se analizaron usando FACS Verse (Becton Dickinson and Company), y aquellas células que tenían una tasa de positivas para CD41a del 50 % o superior el día 24 de la infección se consideraron que constituían una línea de megacariocitos inmortalizados.
[0102] Como resultado del cultivo de mantenimiento de las líneas de megacariocitos autorrenovables mencionadas anteriormente en las que se introdujo el gen BCL-xL, las células derivadas de células iPS (692D2, 1108A2) pudieron proliferar durante 24 días o más después de la infección. Se consideró que estas células constituían una línea de megacariocitos inmortalizados (SeV2-MKCL).
[0103] Las células SeV2-MKCL resultantes se cultivaron en estático en una placa de 10 cm (10 ml/placa). El medio se obtuvo añadiendo los siguientes componentes al IMDM que sirve como medio basal (las concentraciones indican concentraciones finales).
FBS (#172012, Lote No. 12E261 (Sigma)): 15%
L-glutamina (#25030-081 (Gibco Corporation)): 2 mM
ITS (#41400-045 (Gibco Corporation)): Dilución 100 veces
MTG (monotioglicerol, #6145-25ML (Sigma)): 450 mM
Ácido ascórbico (#A4544 (Sigma)): 50 mg/ml
Puromicina (#P8833-100Mg (Sigma)): 2 mg/ml
SCF (#193-15513 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)): 50 ng/ml
Agente similar a TOP: 200 ng/ml
El cultivo se implementó en condiciones de 37°C y 5 % de CO2.
[0104] La sobreexpresión del gen BMI1, el gen c-MYC y el gen BCL-xL se llevó a cabo mediante la adición de 1 mg/ml de doxiciclina (#631311 (Clontech Laboratories, Inc.)) al medio.
2. Examen de la concentración de SR-1
[0105] La línea de megacariocitos inmortalizados (SeV2-MKCL) obtenida según el procedimiento descrito en la sección 1 se lavó dos veces con PBS(-) y a continuación se cultivó en un medio que no contenía doxiciclina para terminar la sobreexpresión. El cultivo se implementó mediante la diseminación de las células a 2 ml/pocillo en una placa de 6 pocillos a una concentración de siembra de 13 105 células/ml seguida de cultivo estático en el medio indicado a continuación.
[0106] El medio se obtuvo añadiendo los siguientes componentes al IMDM que sirve como medio basal (las concentraciones indican concentraciones finales).
FBS: 15 %
L-glutamina (#25030-081 (Gibco Corporation)): 2 mM
ITS (#41400-045 (Gibco Corporation)): Dilución 100 veces
MTG (monotioglicerol, #M6145-25ML (Sigma)): 450 mM
Ácido ascórbico (#A4544 (Sigma)): 50 mg/ml
SCF (#193-15513 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)): 50 mg/ml
Agente similar a t Po : 200 ng/ml de inhibidor de ADAM: 15 mM
El cultivo se implementó en condiciones de 37°C y 5 % de CO2.
[0107] Después de añadir simultáneamente SR-1 a las concentraciones mostradas en la figura 1 y cultivar durante 7 días, se midió el número y la función de las plaquetas. El procedimiento de medición fue como se muestra a continuación.
[0108] El sobrenadante de cultivo se suspendió suavemente usando una pipeta Pipetman de 1 ml 7 días después del cultivo para terminar la expresión génica. Se dispensaron 200 ml del caldo de cultivo en un tubo de muestra de 5 ml seguido de tinción con los anticuerpos indicados a continuación.
0,5 |jl de anticuerpo anti-CD42a marcado con PB (#48-0428-42 (eBioscience, Inc.))
0,5 j l de anticuerpo anti-CD42b marcado con PE (#303906 (BioLegend, Inc.))
0,5 j l de anticuerpo CD62a marcado con APC (#304910 (BioLegend, Inc.))
10 j l de anticuerpo PAC-1 marcado con FITC (#304910 (Becton, Dickinson and Company))
[0109] Las plaquetas se estimularon haciendo reaccionar a temperatura ambiente después de añadir PMA (12­ miristato-13-acetato de forbol, #P1585-1MG (Sigma)) a una concentración final de 0,2 mM, Ad P (#A2754 (Sigma)) a una concentración final de 20 mM, TRAP-6 (péptido activador del receptor de trombina 6, sal de TFA, #H8365 (Bachem)) a una concentración final de 20 mM, colágeno (reactivo de colágeno HORM, Moriya Sangyo K. K.) a una concentración final de 1 mg/ml o una mezcla de los mismos.
[0110] La medición se llevó a cabo usando FACS Verse fabricado por Becton Dickinson and Company 30 minutos después de la reacción. Se añadieron 400 ml de tampón Ca+ de Tyrode inmediatamente antes de la medición para llevar a un volumen total de 600 ml. Este volumen total de 600 ml se usó para la muestra de medición de FACS.
[0111] Se consideró que el número de partículas positivas para CD42a y CD42b representaba el número de plaquetas, y se calculó la relación de las intensidades medias de fluorescencia (MFI) de PAC-1 y CD62p en esta fracción plaquetaria antes y después de la estimulación.
[0112] Los resultados se muestran en la figura 1. Se confirmó que el número de plaquetas a las que se unió anticuerpo PAC-1 y anti-CD62p aumentaba después de la adición de SR-1, y se confirmó que la función era mayor que en el caso de la ausencia de SR-1. Basándose en los resultados para PAC-1 en particular, se usó SR-1 a una concentración de 750 nM en experimentos posteriores.
3. Examen de la duración de la sobreexpresión del gen BMI1, el gen c-MYC y el gen BCL-xL
[0113] Se llevó a cabo un experimento de la misma manera que en la sección 2 al hacer que el período de tiempo desde el último día de subcultivo en la preparación de megacariocitos inmortalizados de la sección 1 hasta el lavado de las células con PBS(-) fuera de 1 día, 2 días o 3 días, haciendo que la concentración de SR-1 fuera de 75 nM o 750 nM después de completar la sobreexpresión y haciendo que la densidad de siembra fuera de 13 105 células/ml.
[0114] Los resultados se muestran en la figura 2. Aunque apenas se observaron diferencias en el número de plaquetas producidas entre los días 1 y 3 de sobreexpresión, se observó que la sobreexpresión durante dos días o más daba como resultado una tendencia hacia una función más alta.
4. Examen del cultivo en agitación
[0115] Se llevó a cabo un experimento de la misma manera que en las secciones 2 y 3 con la excepción de llevar a cabo el cultivo en agitación después de haber diseminado las células en un matraz E125 en lugar de una placa de 6 pocillos a 25 ml/matraz y una densidad de siembra de 13 105 células/ml para examinar la relación entre la concentración de SR-1 y la densidad de siembra de megacariocitos inmortalizados.
[0116] Los resultados se muestran en las figuras 3 y 4. Se obtuvieron resultados que fueron similares a los del cultivo estático.
5. Examen de análogos de SR-1
[0117] Se llevó a cabo un experimento de la misma manera que en la sección 2 con la excepción de usar análogos de SR-1 como antagonistas de AhR a las concentraciones que se muestran en el diagrama.
[0118] Los resultados se muestran en la figura 5. Se confirmó que la cantidad de plaquetas producidas y su función mejoraban independientemente de qué antagonista de AhR se añadiera. Además, los resultados de cambiar las concentraciones de los antagonistas de AhR se muestran con mayor detalle en las figuras 6A y 6B.
6. Examen del efecto de la adición conjunta del antagonista de AhR y el inhibidor de ROCK
[0119] Se investigó el efecto de añadir SR-1 (antagonista de AhR) e Y27632 (inhibidor de ROCK). Los megacariocitos inmortalizados obtenidos de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección 1 se lavaron dos veces con PBS(-) seguido de retirar la doxiciclina para terminar la sobreexpresión, cultivo estático después de diseminar las células en una placa de 6 pocillos a 2 ml/pocillo y una densidad de siembra de 13105 células/ml, y a continuación agitar el cultivo en un matraz E125 a 25 ml/matraz y una densidad de siembra de 13105 células/ml.
[0120] El medio se obtuvo añadiendo los siguientes componentes al IMDM que sirve como medio basal (las concentraciones indican concentraciones finales).
FBS: 15%
L-glutamina
ITS MTG
Ácido ascórbico
SCF: 50 ng/ml
Agente similar a TOP: 200 ng/ml
SR-1: 750 |JM
Y27632: 10 mM
[0121] El cultivo se implementó en condiciones de 37°C, 5 % de CO2 y 20 % de O2. Los números de plaquetas y células positivas para PAC-1 se midieron usando el mismo procedimiento descrito en la sección 2 mencionada anteriormente.
[0122] Los resultados se muestran en las figuras 7 y 8. Se confirmó que la adición conjunta de SR-1 e Y27632 daba como resultado una mejora sinérgica del número y la función de las plaquetas producidas en comparación con el caso de añadir cada uno solo. Se confirmaron efectos sinérgicos similares para combinaciones de SR-1 y otros inhibidores de ROCK (tales como Y39983, clorhidrato de fasudil, ripasudil, s Lx -2119, RKI-1447, azaindol1 o SR-3677). Los resultados para Y-39983, que demostraron un efecto sinérgico prominente que excedió el de Y27632, se muestran en la figura 9. El clorhidrato de fasudil y ripasudil también demostraron efectos sinérgicos dependientes de la concentración comparables a los de Y27632. Cuando el número de plaquetas producidas y demás se examinó posteriormente para detectar combinaciones de Y27632 y otros antagonistas de AhR, se observaron efectos sinérgicos para todas las combinaciones de los mismos. Los resultados para GNF-351 y CH-223191, que demostraron efectos sinérgicos prominentes que excedieron el de SR-1, se muestran en la figura 10. Aunque no se muestran los resultados, la combinación de GNF-351 e Y-39983 en particular demostró un efecto sorprendentemente prominente.
[0123] Además, aunque el número de plaquetas producidas aumentó con el número de días de cultivo, el número de plaquetas funcionales positivas para PAC1 tendió a alcanzar un máximo alrededor del día 5 de adición.
7. Examen de sustitutos de FBS
[0124] Se llevó a cabo un experimento de la misma manera que el descrito en la sección 2 o 6 mencionada anteriormente con la excepción de usar suero derivado del ser humano al 15 % (indicado como suero humano en el dibujo, suero humano normal agrupado (#12181201 (Kohjin Bio Co., Ltd.)) o plasma derivado del ser humano al 15 % (indicado como plasma humano en el dibujo, plasma humano normal agrupado, tratado con heparina (#12250210 (Kohjin Bio Co., Ltd.)) en lugar de FBS al 15 % para investigar si la FBS puede sustituirse o no con un componente derivado del ser humano.
[0125] Los resultados se muestran en la figura 11. Se determinó que las plaquetas funcionales se obtenían incluso si se utilizaba suero humano al 15 % o plasma humano al 15 % en lugar de FBS. Dado que el uso de suero humano o plasma humano permite eliminar cualquier componente derivado de diferentes especies animales, se pueden obtener plaquetas que tengan un mayor grado de seguridad.
[0126] A continuación, se llevó a cabo un experimento en las mismas condiciones que la figura 11 con la excepción de llevar a cabo el cultivo en agitación en presencia de SR-1 e Y27632.
[0127] Los resultados se muestran en la figura 12. Las plaquetas funcionales se obtuvieron usando suero humano al 15 % y plasma humano al 15 % incluso en el caso del cultivo en agitación en lugar del cultivo estático. El cultivo en agitación permite tanto el cultivo a gran escala como la producción a gran escala.
[0128] En general, se sabe que el plasma humano es más preferible que el suero humano para su uso como aditivo para el medio, ya que la adición de suero al medio provoca una reacción de coagulación que da como resultado una mayor susceptibilidad a las diferencias entre lotes. Por lo tanto, se investigó la dependencia de la concentración de la cantidad de plaquetas producidas para plasma humano mediante el cultivo en agitación en presencia de SR-1 e Y27632.
[0129] Los resultados se muestran en la figura 13. Aunque se observó un cierto grado de dependencia de la concentración para la cantidad de plaquetas producidas, se confirmó que se podía obtener una cantidad adecuada de plaquetas funcionales incluso si la concentración plasmática se reducía al 1 %. Ser capaz de reducir la concentración plasmática humana en medios permite reducir el coste de producción de preparaciones plaquetarias.
[0130] Continuando, se llevó a cabo un experimento similar al disminuir la concentración de suero humano. El cultivo estático se llevó a cabo usando plasma humano normal agrupado tratado con citrato (#12250110 (Kohjin Bio Co., Ltd.)) como plasma humano, y suero humano normal agrupado (#12181201 (Kohjin Bio Co., Ltd.)) como suero humano.
[0131] Los resultados se muestran en las figuras 14 y 15. Se confirmó que se obtendría una cantidad adecuada de plaquetas funcionales, incluso si la concentración sérica se reducía al 1 %.
8. Inhibición de HMGA2
[0132] Los genes de shRUNX1 con GFP, shHMGA2 con GFP y SCRAMBLE con GFP se introdujeron en los megacariocitos inmortalizados preparados en la sección 1 mencionada anteriormente usando un vector viral. A continuación, se clasificaron las células introducidas con los genes anteriores (células positivas para GFP). Los ARNhc usados se muestran en la Tabla 1 a continuación.
T l 1
Figure imgf000018_0001
continuación
Figure imgf000019_0001
[0133] Una visión general del procedimiento experimental y los resultados del mismo se muestran en las figuras 16 y 17. Dado que la inactivación de HMGA2 dio como resultado una disminución en el número de células positivas para CD41a, se determinó que HMGA2 era un factor necesario para la autorreplicación de megacariocitos antes de la multinucleación durante la fase de crecimiento. Por otro lado, dado que la inactivación de RUNX1 dio como resultado un aumento en el número de células positivas para CD41a, se pensó que RUNX1 inhibe ligeramente el crecimiento de megacariocitos antes de la multinucleación.
[0134] A continuación, se midió la producción de plaquetas después de haber terminado la sobreexpresión de los genes cMYC, BMI1 y BCL-xL usando el procedimiento descrito en la sección 1-5 mencionada anteriormente. Los resultados se muestran en las figuras 18 y 19.
[0135] Como se muestra en los dibujos, el contenido de megacariocitos positivos para CD41a y CD42b aumentó después de terminar la sobreexpresión (MGK OFF) en comparación con antes de terminar la sobreexpresión (MGK ON), y se confirmó que las plaquetas positivas para CD41a y CD42b se produjeron en grandes cantidades. Como se muestra en la parte superior de la figura 19, la inactivación de HMGA2 da como resultado una promoción considerable de la multinucleación de megacariocitos, y como se muestra en la parte inferior de la figura 19, se confirmó que la cantidad de plaquetas producidas por megacariocito aumentó drásticamente.
9. Efectos de la inhibición de HMGA2, antagonistas de AhR e inhibidores de ROCK
[0136] Se introdujeron genes de shRUNX1 con GFP, shHMGA2 con GFP y shSCRAMBLE con GFP en los megacariocitos inmortalizados preparados en la sección 1 anterior de la misma manera que la sección 8 anterior, y después de añadir medio de megacariocitos que contenía 1 mg/ml de doxiciclina (DOX) (es decir, IMDM que contenía FBS al 15 %, L-glutamina, ITS, MTG, ácido ascórbico, 50 ng/ml de SCF y 50 ng/ml de TPO) y cultivar durante 7 días, las células en las que se introdujeron los genes mencionados anteriormente (células positivas para GFP) se aislaron mediante clasificación. 13105 células aisladas en las que se introdujo shHMGA2 se diseminaron en una placa de 6 pocillos y se cultivaron durante 7 días en medio de megacariocitos libre de DOX (es decir, medio para interrumpir la expresión de genes exógenos) en ausencia de cualquier adición, después de añadir solo SR-1 750 nM , después de añadir solo Y2763210 mM o después de añadir SR-1 750 nM y Y2763210 mM.
[0137] Por otro lado, las células aisladas en las que introdujeron shRUNX1 y shSCRAMBLE se cultivaron durante 7 días en medio de megacariocitos libre de DOX que contenía SR-1 750 nM y Y27632 10 mM. Las células resultantes se adhirieron a un portaobjetos de vidrio usando Cytospin y se observaron con un microscopio electrónico (parte superior de la figura 20).
[0138] Además, las plaquetas (positivas para CD41a, positivas para CD42b) presentes en los sobrenadantes de cultivo se midieron usando FACS (parte inferior de la figura 20). Como resultado, se observaron células multinucleadas y agrandadas como resultado del cultivo de megacariocitos sometidos a inactivación de HMGA2 en medio que contenía un antagonista de AhR y un inhibidor de ROCK, y se confirmó que el número de plaquetas producidas por célula unitaria aumentaba considerablemente. Además, se confirmó que la eficiencia de producción de plaquetas era aún mayor en el caso de combinar un antagonista de AhR y un inhibidor de ROCK.
10. Inhibición de HMGA2 y maduración de megacariocitos
[0139] Las células en las que se introdujeron los genes shRUNX1, shHMGA2 y shSCRAMBLE obtenidos en la sección 9 anterior se cultivaron en medio de megacariocitos libre de DOX que contenía SR-1 e Y27632 y se observaron con un microscopio electrónico.
[0140] Los resultados se muestran en la figura 21. Como resultado, en el caso de haber introducido shRUNX1, había numerosas células pequeñas nucleadas, faltaba el desarrollo de sistemas de demarcación de membranas (DMS) en las células y se confirmó que los gránulos secretores solo se formaban en un grado moderado. De manera similar, en el caso de haber introducido shSCRAMBLE, había numerosas células pequeñas nucleadas, el desarrollo de DMS en las células era deficiente, y se confirmó que no había casi ninguna formación de gránulos secretores. Por otro lado, en el caso de haber introducido shHMGA2, se observaron células multinucleadas y agrandadas y se observó la formación de un DMS y gránulos secretores en estas células.
[0141] Sobre la base de los resultados anteriores, se sugirió que la inhibición de HMGA2 en megacariocitos hace posible mejorar la eficiencia de producción de plaquetas, los megacariocitos resultantes se vuelven multinucleados y agrandados de la misma manera que los megacariocitos en el cuerpo como resultado de la combinación de un antagonista de AhR y un inhibidor de ROCK, los megacariocitos maduran hasta un grado en que se observa la formación de DMS y gránulos secretores, y la eficiencia de producción de plaquetas se vuelve aún mayor como resultado de los mismos.
Texto libre de listado de secuencias
[0142]
SEQ ID NO 1 indica la secuencia diana de shSCRAMBLE.
SEQ ID NO 2 indica la secuencia de ADN de shSCRAMBLE.
SEQ ID NO 3 indica la secuencia diana de shRUNX1.
SEQ ID NO 4 indica la secuencia ADN de shRUNX1.
SEQ ID NO 5 indica la secuencia diana de shHMGA2.
SEQ ID NO 6 indica la secuencia ADN de shHMGA2.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Agente promotor de la producción de plaquetas altamente funcional que comprende uno o una pluralidad de antagonistas del receptor de aril hidrocarburos (AhR) y uno o una pluralidad de inhibidores de quinasa formadora de superhélice asociada a Rho (ROCK).
2. Agente promotor de la producción de plaquetas según la reivindicación 1, en el que el antagonista de AhR se selecciona del grupo que consiste en 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (SR-1), (2-metil-4-o-tolilazo-fenil)-amida del ácido 2-metil-2H-pirazol-3-carboxílico (CH-223191), N-[2-(3H-indol-3-il)etil]-9-isopropil-2-(5-metil-3-piridil)purin-6-amina (GNF-351), 6,2',4'-trimetoxiflavona (TMF) y 3',4'-dimetoxiflavona (DMF).
3. Agente promotor de la producción de plaquetas según la reivindicación 1 o 2, en el que el inhibidor de ROCK se selecciona del grupo que consiste en Y27632, Y39983, clorhidrato de fasudil, ripasudil, SLX-2119, RKI-1447, azaindol1, SR-3677, estaurosporina y diclorhidrato de H1152.
4. Agente promotor de la producción de plaquetas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el antagonista de AhR es SR-1, GNF-351 y/o c H-223191, y el inhibidor de ROCK es Y27632, Y39983, clorhidrato de fasudil y/o ripasudil.
5. Procedimiento de producción de plaquetas, que comprende una etapa para poner en contacto el agente promotor de la producción de plaquetas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con megacariocitos o células progenitoras de los mismos.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la etapa de contacto se lleva a cabo en condiciones de no usar células nutrientes.
7. Procedimiento según la reivindicación 6 , que se lleva a cabo en condiciones de cultivo en agitación.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que comprende además una etapa para suprimir la expresión o función de proteínas del grupo de alta movilidad At-hook (HMGA) en los megacariocitos o células progenitoras de los mismos.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la supresión de la expresión o función de las proteínas HMGA se lleva a cabo mediante ARNip o miARN que suprime directa o indirectamente la expresión del gen de HMGA.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que los megacariocitos son células obtenidas por sobreexpresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen de cáncer, gen Polycomb y gen supresor de apoptosis en células menos diferenciadas que los megacariocitos, seguido de la terminación de la sobreexpresión.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que las células menos diferenciadas que los megacariocitos son células progenitoras hematopoyéticas producidas a partir de células madre pluripotentes.
12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, que comprende además una etapa para recuperar plaquetas a partir de los megacariocitos.
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