CN107709546B - 高功能性血小板的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种功能性高的血小板生成促进剂，其包含1种或多种芳香烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor；AhR)拮抗剂以及1种或多种ROCK(Rho‑associated coiled‑coil forming kinase：Rho相关卷曲螺旋形成激酶)抑制剂。

Description

高功能性血小板的制造方法
技术领域
本发明涉及在体外(in vitro)的血小板的制造方法等。
背景技术
在治疗与血液有关的疾病时或进行外科治疗时，需要用于治疗的血球类细胞。在血球类细胞中，作为进行凝血(止血)所必须的细胞的血小板、血小板前体(proplatelet)以及作为生成血小板的细胞的巨核细胞是需求特别高的细胞。特别是血小板，在白血病、骨髓移植、抗癌治疗等的需求多，稳定供给非常有必要。
迄今为止，作为在体外生成血小板的方法，开发了使各种干细胞分化而得到巨核细胞，对该巨核细胞进行培养而释放出血小板的方法。近年来，由于iPS细胞的建立，多能干细胞作为再生医疗中的细胞疗法的重要来源，其有用性备受关注。迄今为止，例如，Takayama等成功从人类ES细胞分化诱导出巨核细胞和血小板(非专利文献1)。
然而，发现迄今为止在体外得到的血小板不具有充分的原本功能，即凝血能力。
另外，在现有的在体外生成血小板的方法中，如果不使用饲养细胞，则难以充分地获得功能性血小板。然而，饲养细胞大多也利用来源于除人类以外的物种的细胞，在制造用于给予人类的血小板中，优选不使用饲养细胞的方法。
作为迄今为止提出的在体外由造血前体细胞制造血小板的方法的一个例子，提出了在TPO和芳香烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor；AhR)拮抗剂的存在下培养巨核细胞的方法(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2014/138485号
非专利文献
非专利文献1：Takayama N.et al.,Blood,111,pp.5298-5306,2008
发明内容
技术问题
本发明的课题在于，提供一种在体外高效地从巨核细胞生成功能性高的血小板的方法。
技术方案
本发明人等为了解决上述问题反复进行了研究，其结果发现，如果在AhR拮抗剂的存在下培养巨核细胞，则生成的血小板的数目增加，并且功能也上升，此外，还发现在并用了ROCK抑制剂的情况下不是起到相加作用，而是起到协同作用。此外，对用于得到功能性更高的血小板的培养条件进行了研究，从而完成了本发明。
本发明人等还发现，在巨核细胞中，通过抑制HMGA蛋白质的表达或功能，从而从每单位中的巨核细胞生成的血小板数增加。另外，对该巨核细胞进行视觉上观察，其结果发生多核肥大化，观察到分离膜和分泌颗粒的形成，在体外成功地使巨核细胞成熟，从而完成了本发明。
即，本发明涉及，
〔A1〕一种功能性高的血小板生成促进剂，其特征在于，包含1种或多种芳香烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor；AhR)拮抗剂以及1种或多种ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase：Rho相关卷曲螺旋形成激酶)抑制剂；
〔A2〕根据〔A1〕中记载的血小板生成促进剂，其特征在于，AhR拮抗剂选自4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚(SR-1)、2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(2-甲基-4-邻甲苯偶氮-苯基)-酰胺(CH-223191)、N-[2-(3H-吲哚-3-基)乙基]-9-异丙基-2-(5-甲基-3-吡啶基)嘌呤-6-胺(GNF-351)、6,2',4'-三甲氧基黄酮(TMF)和3',4'-二甲氧基黄酮(DMF)；
〔A3〕根据〔A1〕或〔A2〕中记载的血小板生成促进剂，其特征在于，ROCK抑制剂选自Y27632、Y39983、法舒地尔盐酸盐、利舒地尔(Ripasudil)、SLX-2119、RKI-1447、氮杂吲哚1、SR-3677、星孢菌素(Staurosporine)、H1152二盐酸盐；
〔A4〕根据〔A1〕～〔A3〕中任一项记载的血小板生成促进剂，其特征在于，AhR拮抗剂是SR-1、GNF-351和/或CH-223191，ROCK抑制剂是Y27632、Y39983、法舒地尔盐酸盐和/或利舒地尔(Ripasudil)；
〔A5〕一种血小板的制造方法，其特征在于，包括使〔A1〕～〔A4〕中任一项记载的血小板生成促进剂与巨核细胞或其前体细胞接触的工序；
〔A6〕根据〔A5〕中记载的方法，其特征在于，上述接触工序在不使用饲养细胞的条件下进行；
〔A7〕根据〔A6〕中记载的方法，其特征在于，在振摇培养条件下实施。
〔A8〕根据〔A5〕～〔A7〕中任一项记载的方法，其特征在于，还包括抑制上述巨核细胞或其前体细胞中的HMGA(High Mobility Group At-hookprotein：高迁移率族At-hook蛋白)蛋白质的表达或功能的工序；
〔A9〕根据〔A8〕中记载的方法，其特征在于，上述HMGA蛋白质的表达或功能的抑制通过直接或间接地抑制HMGA基因的表达的siRNA或miRNA来进行。
〔A10〕根据〔A5〕～〔A9〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述巨核细胞是在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，使选自癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因中的至少1个基因强制表达之后，解除该强制表达而得到的细胞；
〔A11〕根据〔A10〕中记载的方法，其特征在于，上述与巨核细胞相比分化程度低的细胞是通过多能性干细胞制造而成的造血前体细胞；
〔A12〕根据〔A5〕～〔A11〕中任一项记载的方法，其特征在于，还包括从上述巨核细胞中回收血小板的工序；
〔A13〕一种血小板制剂，其特征在于，包含通过〔A5〕～〔A12〕中任一项记载的方法制造而成的血小板；
〔B1〕一种血小板的制造方法，其特征在于，包括培养抑制了HMGA蛋白质的表达或功能的巨核细胞的工序；
〔B2〕根据〔B1〕中记载的方法，其特征在于，上述HMGA蛋白质的表达或功能的抑制利用针对HMGA基因的siRNA来进行；
〔B3〕根据〔B1〕或〔B2〕中记载的方法，其特征在于，上述培养的工序在芳香烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor；AhR)拮抗剂的存在下进行；
〔B4〕根据〔B1〕～〔B3〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述培养的工序在ROCK抑制剂的存在下进行；
〔B5〕根据〔B1〕～〔B4〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述培养的工序在不使用饲养细胞的条件下进行；
〔B6〕根据〔B1〕～〔B5〕中任一项记载的方法，其特征在于，还包括从通过上述培养的工序得到的培养物中回收血小板的工序；
〔B7〕一种血小板制剂，其特征在于，包含通过〔B1〕～〔B6〕中任一项记载的方法制造而成的血小板；
〔B8〕一种巨核细胞的成熟化方法，其特征在于，包括在巨核细胞中，抑制HMGA蛋白质的表达或功能的工序；
〔B9〕根据〔B8〕中记载的方法，其特征在于，上述HMGA蛋白质的表达或功能的抑制工序通过抑制HMGA基因的表达的siRNA或miRNA来进行；
〔B10〕根据〔B8〕中记载的方法，其特征在于，上述HMGA蛋白质的表达或功能的抑制工序利用针对HMGA基因的siRNA或miRNA来进行；
〔B11〕根据〔B8〕～〔B10〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述HMGA蛋白质的表达或功能的抑制工序通过在包含AhR拮抗剂的培养基中进行培养来进行；
〔B12〕根据〔B8〕～〔B11〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述HMGA蛋白质的表达或功能的抑制工序通过在包含ROCK抑制剂的培养基中进行培养来进行；
〔B13〕根据〔B8〕～〔B12〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述HMGA蛋白质的表达或功能的抑制工序在不使用饲养细胞的条件下进行；
〔B14〕根据〔B3〕～〔B6〕和〔B11〕～〔B13〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述AhR拮抗剂选自4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚(SR-1)、2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(2-甲基-4-邻甲苯偶氮-苯基)-酰胺(CH-223191)、N-[2-(3H-吲哚-3-基)乙基]-9-异丙基-2-(5-甲基-3-吡啶基)嘌呤-6-胺(GNF-351)、6,2',4'-三甲氧基黄酮(TMF)和3',4'-二甲氧基黄酮(DMF)；
〔B15〕根据〔B4〕～〔B6〕和〔B12〕～〔B14〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述ROCK抑制剂选自Y27632、Y39983、法舒地尔盐酸盐、利舒地尔(Ripasudil)、SLX-2119、RKI-1447、氮杂吲哚1、SR-3677、星孢菌素、H1152二盐酸盐；
〔B16〕根据〔B1〕～〔B15〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述巨核细胞是在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，使选自癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因中的至少1个基因强制表达之后，解除该强制表达而得到的细胞；
〔B17〕根据〔B16〕中记载的方法，其特征在于，上述与巨核细胞相比分化程度低的细胞是通过多能性干细胞制造而成的造血前体细胞；
〔B18〕一种巨核细胞，其特征在于，抑制了HMGA蛋白质的表达或功能；
〔B19〕根据上述〔B18〕中记载的巨核细胞，其特征在于，包括抑制HMGA基因的表达的siRNA、miRNA或编码这些siRNA、miRNA的核酸；
〔B20〕根据〔B18〕或〔B19〕中记载的巨核细胞，其特征在于，在染色体中包含选自癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因的外源性基因中的至少1个；
〔B21〕一种血小板的制造方法，其特征在于，包括在含有芳香烃受体(ArylHydrocarbon Receptor；AhR)的培养基中培养巨核细胞的工序；
〔B22〕根据〔B21〕中记载的方法，其特征在于，上述培养基还含有ROCK抑制剂；
〔B23〕根据〔B21〕或〔B22〕中记载的方法，其特征在于，上述培养工序在不使用饲养细胞的条件下进行；
〔B24〕根据〔B21〕～〔B23〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述AhR拮抗剂选自4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚(SR-1)、2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(2-甲基-4-邻甲苯偶氮-苯基)-酰胺(CH-223191)、N-[2-(3H-吲哚-3-基)乙基]-9-异丙基-2-(5-甲基-3-吡啶基)嘌呤-6-胺(GNF-351)、6,2',4'-三甲氧基黄酮(TMF)和3',4'-二甲氧基黄酮(DMF)；
〔B25〕根据〔B21〕～〔B24〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述ROCK抑制剂选自Y27632、Y39983、法舒地尔盐酸盐、利舒地尔(Ripasudil)、SLX-2119、RKI-1447、氮杂吲哚1、SR-3677、星孢菌素、H1152二盐酸盐；
〔B26〕根据〔B21〕～〔B25〕中任一项记载的方法，其特征在于，上述巨核细胞是在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，使选自癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因中的至少1个基因强制表达之后，解除该强制表达而得到的细胞；以及
〔B27〕根据〔B26〕中记载的方法，其特征在于，上述与巨核细胞相比分化程度低的细胞是通过多能性干细胞制造而成的造血前体细胞。
发明效果
根据本发明，即使不使用饲养细胞，也能够高效地生成具有高功能的血小板。由于不需要使用饲养细胞，所以能够在制造血小板时使用直立大型培养装置，进而能够高效且大量生成在临床上使用的血小板。
附图说明
图1表示对巨核细胞的培养基中的SR-1(AhR拮抗剂)的浓度进行各种改变而进行静置培养，并对生成的血小板的数目和功能进行测定而得到的结果。
图2表示改变传代后的培养天数，并对加入SR-1后进行静置培养时生成的血小板的数目和功能进行测定而得到的结果。
图3表示对巨核细胞的培养基中的SR-1的浓度进行各种改变而进行振摇培养，并对生成的血小板的数目和功能进行测定而得到的结果。
图4表示对添加SR-1时的巨核细胞的接种密度进行各种改变而进行振摇培养，并对生成的血小板的数目和功能进行测定而得到的结果。
图5表示向巨核细胞的培养基中加入SR-1类似物而进行静置培养，并对生成的血小板的数目和功能进行测定而得到的结果。
图6A表示向巨核细胞的培养基中加入各种浓度的SR-1类似物(CH-223191或GNF-351)而进行静置培养，并对生成的血小板的数目和功能进行测定而得到的结果。
图6B表示向巨核细胞的培养基中加入各种浓度的SR-1类似物(TMF或DMF)而进行静置培养，并对生成的血小板的数目和功能进行测定而得到的结果。
图7表示单独添加SR-1、单独添加Y27632(ROCK抑制剂)，或者添加SR-1和Y27632的组合而对巨核细胞进行静置培养(6孔)或振摇培养(E125)，并对生成的血小板的数目进行测定而得到的结果。
图8表示单独添加SR-1、单独添加Y27632(ROCK抑制剂)，或者添加SR-1和Y27632的组合而对巨核细胞进行静置培养(6孔)或振摇培养(E125)，并对生成的血小板的功能进行测定而得到的结果。
图9表示添加SR-1与Y-39983、法舒地尔盐酸盐或利舒地尔(Ripasudil)(ROCK抑制剂)的组合而对巨核细胞进行振摇培养(E125)，并对生成的血小板的数目进行测定而得到的结果。
图10表示添加GNF-351或CH-223191(AhR拮抗剂)与Y-27632(ROCK抑制剂)的组合而对巨核细胞进行振摇培养(E125)，并对生成的血小板的数目进行测定而得到的结果。
图11表示在SR-1单独存在下、Y27632单独存在下、或SR-1和Y27632组合存在下，加入15％的人血清或15％的人血浆来代替FBS进行静置培养时的、每个巨核细胞的血小板生成数与PAC-1阳性血小板数或CD62p阳性血小板数的比例。
图12表示在SR-1与Y27632组合存在下，加入15％的人血清或15％的人血浆来代替FBS进行振摇培养时的、每个巨核细胞的血小板生成数与PAC-1阳性血小板数或CD62p阳性血小板数的比例。
图13表示在SR-1和Y27632组合存在下，对血小板生成数的人血浆浓度依赖性进行调查而得到的结果。
图14表示在SR-1单独存在下、或SR-1和Y27632组合存在下，加入1％的人血清或1％的人血浆而进行静置培养时的、每个巨核细胞的血小板生成数与PAC-1阳性血小板数或CD62p阳性血小板数的比例。
图15表示对图14的情况下的培养物使用抗CD62p抗体和抗PAC-1抗体而进行流式细胞术所得到的结果。
图16表示在通过BMI1基因、c-MYC基因和BCL-xL基因的强制表达而永生化的巨核细胞中，通过shRNA抑制了HMGA2基因和RUNX1基因的表达的实验的概要。
图17是对通过BMI1基因、c-MYC基因和BCL-xL基因的强制表达而永生化的巨核细胞在图16中示出的shRNA存在下进行培养之后的CD41a阳性细胞的数目进行测定而得到的结果。
图18表示对解除BMI1基因、c-MYC基因和BCL-xL基因的强制表达前后的巨核细胞和血小板使用抗CD42b抗体和抗41a抗体进行流式细胞术而得到的结果。
图19是从解除了BMI1基因、c-MYC基因和BCL-xL基因的强制表达之后进行培养时的巨核细胞的情况(上部)和对生成的血小板数(下部)进行测定而得到的结果。
图20是在导入了针对HMGA2和RUNX1的siRNA和对照(分别示为sh HMGA2、sh RUNX1和sh SCRAMBLE)的巨核细胞中，从解除了BMI1基因、c-MYC基因和BCL-xL基因的强制表达之后，在添加或不添加SR-1和/或ROCK抑制剂的情况下进行培养时的巨核细胞的情况(上部)、以及对每单位细胞(1×105个细胞)生成的血小板数(下部)进行测定而得到的结果。图中SR-1表示SR-1的添加，ROCKi表示Y27632的添加。
图21是在导入了针对HMGA2和RUNX1的siRNA和对照(分别示为sh HMGA2、sh RUNX1和sh SCRAMBLE)的巨核细胞中，从解除BMI1基因、c-MYC基因和BCL-xL基因的强制表达之后添加SR-1和ROCK抑制剂进行培养时的巨核细胞的电子显微镜图像。图中下部表示上部的放大图。
具体实施方式
(第一方式)
在第一方式中，本发明提供一种血小板生成促进剂，包含1种或多种芳香烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor；AhR)拮抗剂和1种或多种ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase：Rho相关卷曲螺旋形成激酶)抑制剂。在另一方式中，本发明还提供一种血小板的制造方法，其包括使巨核细胞或其前体细胞与上述血小板生成促进剂接触的工序。
在本说明书中，“巨核细胞”是在生物体中存在于骨髄中的最大的细胞，其特征是释放出血小板。另外，巨核细胞以细胞表面标志物CD41a、CD42a、和CD42b阳性表征，此外，有时也进一步表达选自CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131和CD203c中的标志物。如果巨核细胞多核化(多倍体化)，则具有通常的细胞的16～32倍的基因组，但在本说明书中，简称为巨核细胞的情况下，只要具备上述特征，就可以包括多核化的巨核细胞和多核化前的巨核细胞这两者。“多核化前的巨核细胞”与“未成熟的巨核细胞”或“增殖期的巨核细胞”同义。
巨核细胞可以通过公知的各种方法得到。作为巨核细胞的制造方法的非限定性例子，可举出国际公开第2011/034073号中记载的方法。在该方法中，在“与巨核细胞相比分化程度低的细胞(cells less differentiated than megakaryocytes)”，即巨核细胞前体细胞(在本说明书中简称为“前体细胞”)中，通过使癌基因和多梳基因强制表达，能够得到无限增殖的永生化巨核细胞株。另外，根据国际公开第2012/157586号中记载的方法，在“与巨核细胞相比分化程度低的细胞”中，通过使细胞凋亡抑制基因强制表达，也能够得到永生化巨核细胞。这些永生化巨核细胞通过解除基因的强制表达，进行多核化，释放出血小板。
为了得到巨核细胞，可以组合上述的文献中记载的方法。在这种情况下，癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因的强制表达可以同时进行，也可以按顺序进行。例如，可以使癌基因和多梳基因强制表达，并抑制该强制表达，接着使细胞凋亡抑制基因强制表达，并抑制该强制表达而得到多核化巨核细胞。另外，也可以使癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因同时强制表达，并将这些强制表达同时抑制而得到多核化巨核细胞。还可以首先使癌基因和多梳基因强制表达，接下来使细胞凋亡抑制基因强制表达，并将这些该强制表达同时抑制而得到多核化巨核细胞。
在本说明书中，“与巨核细胞相比分化程度低的细胞”或“巨核细胞前体细胞”是指具有向巨核细胞的分化能力的细胞，表示从造血干细胞系到巨核细胞为止的各种分化阶段的细胞。作为与巨核细胞相比分化程度低的细胞的非限定性例子，可举出造血干细胞、造血前体细胞、CD34阳性细胞、巨核细胞-红细胞前体细胞(MEP)。这些细胞例如可以从骨髄、脐带血、外周血分离而得到，也可以从作为分化程度更低的细胞的ES细胞、iPS细胞等多能性干细胞分化诱导而得到。
在本说明书中，“癌基因”是指在生物体中诱导细胞的癌化的基因，例如可举出MYC家族基因(例如c-MYC、N-MYC、L-MYC)、SRC家族基因、RAS家族基因、RAF家族基因、c-Kit、PDGFR、Abl等蛋白激酶家族基因。
在本说明书中，“多梳基因”已知是指对CDKN2a(INK4a/ARF)基因进行负调控，为了避免细胞老化而发挥功能的基因(小仓等,再生医疗vol.6,No.4,pp26-32；Jseus et al.,Jseus et al.,Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7,pp667-677,2006；Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.100,pp211-216,2003)。作为多梳基因的非限定性例子，可举出BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3b。
在本说明书中，“细胞凋亡抑制基因”是指细胞的具有抑制细胞凋亡的功能的基因，例如可举出BCL2基因、BCL-xL基因、存活素(Survivin)基因、MCL1基因等。
基因的强制表达和强制表达的解除可以通过国际公开第2011/034073号、国际公开第2012/157586号、国际公开第2014/123242或Nakamura S et al,Cell Stem Cell.14,535-548,2014中记载的方法、其他公知的方法或以此为基准的方法来进行。
在本说明书中，“芳香烃受体(AhR)”是指属于Per/ARNT/SIM(PAS)家族的转录因子。AhR在没有结合配体的状态下是非活性的，如果芳香烃化合物作为配体结合，则转移到核内。在核内形成被称为ARNT(AhR Nuclear Translocator：芳香烃受体核转位蛋白)的分子和异源二聚体，通过与DNA上的外源物反应元件(Xenobiotic response element；XRE)结合，从而激活转录。
在本说明书中，“AhR拮抗剂”是指阻碍AhR与激动剂结合时产生的反应中的至少一个的全部或一部分的物质。AhR拮抗剂可以直接作用于AhR，或者介由对其他物质的作用而间接作用于AhR。
在本说明书中，“AhR激动剂”是指引起AhR与其内源性的配体结合时引起的反应中的至少一个的物质。AhR激动剂可以直接作用于AhR，或者可以介由对其他物质的作用而间接作用于AhR。
这里，“作用于AhR的物质”包括低分子化合物、高分子化合物、抗体或其片段等蛋白质、肽和核酸，但不受这些限定。
本发明中使用的AhR拮抗剂的非限定性例子包括以下。
·4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚(SR-1)；
·α萘黄酮
·1,4-二羟基蒽醌
·1,5-二羟基蒽醌
·1,8-二羟基蒽醌
·高良姜素
·白藜芦醇
·2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(2-甲基-4-邻甲苯偶氮-苯基)-酰胺(CH-223191)；
·N-[2-(3H-吲哚-3-基)乙基]-9-异丙基-2-(5-甲基-3-吡啶基)嘌呤-6-胺(GNF-351)；
·2-(29-氨基-39-甲氧基苯基)-氧杂萘-4-酮(PD98059)；
·(Z)-3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)甲基茚基]-2-吲哚酮(TSU-16)；
·2-(29-氨基-39-甲氧基苯基)-氧杂萘-4-酮(PD98059)；和
·6,2',4'-三甲氧基黄酮(TMF)
·3',4'-二甲氧基黄酮(DMF)
从在无饲养层条件(feeder-free condition)下培养巨核细胞，进而增加血小板的生成数目，和/或改善功能的观点考虑，AhR优选为SR-1、GNF-351、CH-223191、TMF、DMF，更优选为SR-1、GNF-351和CH-223191，进一步优选为GNF-351和SR-1。GNF-351与SR-1和/或CH-223191相比，以更低浓度就起到同等以上的效果，所以特别优选。只要不损害所希望的效果，就可以并用多种AhR拮抗剂。
除了上述的例子以外，本发明中还可以使用国际公开第2012/015914号中作为AhR拮抗剂记载的化合物。
在与巨核细胞的接触工序中，AhR拮抗剂的浓度没有特别限定，本领域技术人员可以适当决定。例如，在使用SR-1的情况下，使培养基中的AhR拮抗剂的浓度为200nM以上且小于1000mM，在使用CH-223191的情况下，使培养基中的AhR拮抗剂的浓度为0.2μM以上且小于4μM，在使用GNF-351的情况下，使培养基中的AhR拮抗剂的浓度为20nM以上且小于300nM，在使用TMF的情况下，使培养基中的AhR拮抗剂的浓度为2.5μM以上且小于40μM，在使用DMF的情况下，使培养基中的AhR拮抗剂的浓度为2.5μM以上且小于40μM的范围，则能够进一步提高所得到的血小板的数目、功能，但也可以是该范围以外的量。
在使用“在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，使选自癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因中的至少一个基因强制表达之后，解除该强制表达而得到的细胞”的情况下，强制表达的期间也没有特别限定，本领域技术人员可以适当决定。
应予说明，在强制表达后，可以对细胞进行传代培养，从最后的传代到解除强制表达之日为止的期间也没有特别限定，但例如可以为1天、2天或3天以上。
只要血小板的生成量和/或功能得到增强，使AhR拮抗剂与巨核细胞或其前体细胞细胞接触的时刻就没有特别限定，但优选巨核细胞至少是正在多核化的成熟初期阶段的细胞。
在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，在使癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因强制表达而制作永生化巨核细胞，其后解除强制表达而进行永生化巨核细胞的多核化的情况下，优选在强制表达的解除之后，向培养基加入AhR拮抗剂。
使巨核细胞与AhR拮抗剂接触的期间没有特别限定。在上述强制表达的解除之后向培养基加入AhR拮抗剂的情况下，将AhR拮抗剂添加到培养基，从第3天左右开始缓慢地释放出功能性血小板，数目随着培养天数而增加。在加入SR-1作为AhR拮抗剂的情况下，如果培养5天，则有得到功能特别高的血小板的趋势，但只要能够得到功能性血小板，培养天数可以比5天长，也可以比5天短。
巨核细胞中的上述基因的强制表达解除后，直到向培养基加入AhR拮抗剂为止的期间也没有特别限定，但例如可以在1天、2天或3天以内开始进行在AhR拮抗剂存在下的培养。AhR拮抗剂在培养期间中可以追加1次以上来添加到培养基中。
巨核细胞除了与AhR拮抗剂接触以外，还可以与ROCK抑制剂接触。通过并用AhR拮抗剂和ROCK抑制剂，从而能够显著增强所生成的血小板的数目、功能。特别是，对于血小板生成促进效果，与分别单独使用AhR拮抗剂和ROCK抑制剂的情况相比，起到协同效果。在本说明书中，“ROCK抑制剂”是指Rho结合激酶(Rho-associated coiled-coil formingkinase：Rho相关卷曲螺旋形成激酶；ROCK)的拮抗剂。作为ROCK抑制剂，例如可举出Y27632、Y39983、法舒地尔盐酸盐、利舒地尔(Ripasudil)、SLX-2119、RKI-1447、氮杂吲哚1、SR-3677、星孢菌素、H1152二盐酸盐、AR-12286、INS-117548等，但不限于这些。只要不损害所希望的效果，就可以并用多种ROCK抑制剂。
从在无饲养层条件下培养巨核细胞，进而增加血小板的生成数目，和/或改善功能的观点考虑，ROCK抑制剂优选Y27632、Y39983、法舒地尔盐酸盐、利舒地尔(Ripasudil)，更优选Y39983。只要血小板的生成量和/或功能得到增强，使ROCK抑制剂与巨核细胞或其前体细胞细胞接触的时刻就没有特别限定，但优选巨核细胞是至少正在多核化的细胞。
如后述的实施例所示，如果使巨核细胞或其前体细胞与AhR拮抗剂和ROCK抑制剂接触，则即使在无饲养层条件下，所得到的血小板的生成数目也得到促进，另外，其功能也提高。应该特别注意到的是，AhR拮抗剂和ROCK抑制剂与单独使用各药剂的情况相比，对血小板生成促进效果起到协同作用。AhR拮抗剂与ROCK抑制剂的组合没有特别限定，但由于选自SR-1、GNF-351和CH-223191中的1种或多种AhR拮抗剂与选自Y27632、Y39983、法舒地尔盐酸盐和利舒地尔(Ripasudil)中的1种或多种ROCK抑制剂的组合使血小板的数目、功能显著增强，因此优选。其中，更优选SR-1和/或GNF-351与Y27632和/或Y39983的组合。特别是在使用GNF-351与Y39983的组合的情况下，功能性的血小板的生成量显著增加(未示出数据)。AhR拮抗剂和ROCK抑制剂可以同时添加，也可以先添加任一种。
“血小板”是血液中的细胞成分之一，在本说明书中，以CD41a阳性和CD42b阳性表征。血小板在血栓形成和止血中起到重要的作用，并且与损伤后的组织再生、炎症的病理生理也有关系。如果血小板因出血等被激活，则在其膜上表达IntegrinαIIBβ3(糖蛋白IIb/IIIa；CD41a和CD61的复合体)等细胞粘附因子的受体。其结果，血小板彼此凝聚，利用从血小板释放出的各种凝血因子而使血纤维蛋白(Fibrin)凝固，从而形成血栓，进行止血。
在本说明书中使用的情况下，血小板的“功能”是指本领域已知的、例如生物体中的循环能力、血栓形成能力、止血能力等。在本说明书中，“功能性高”、“血小板的功能高”或“被激活”这样的文字或与这些类似的文字是指与通过不使用AhR拮抗剂、ROCK抑制剂的现有的方法得到的血小板或从生物体分离出的血小板相比，通过后述的方法中的至少一个测得的血小板的功能(或生理活性)为同等以上，优选显著地高，或者形状血小板为同等以下，优选显著地少。或者，是指即使差异不显著，本领域技术人员也能够判断为有功能得到改善的趋势的状态。
或者，在本说明书中，“功能性高的血小板”、“血小板的功能高”或“被激活”等文字是指，通过后述的方法中的至少一个测得的血小板的功能为通过不使用AhR拮抗剂、ROCK抑制剂的现有的方法得到的血小板、从生物体分离的天然的血小板的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或者90％以上。
上述的血小板的功能可以通过公知的方法测定和评价。例如，可以使用作为与存在于被激活的血小板膜上的激活标志物IntegrinαIIBβ3(糖蛋白IIb/IIIa；CD41a与CD61的复合体)特异性结合的抗体的PAC-1抗体，来测定被激活的血小板量。另外，同样地可以用抗体检测作为血小板的激活标志物的CD62b(P-selectin)来测被激活的血小板量。血小板量的测定例如可以通过使用流式细胞术，用针对激活非依赖性的血小板标志物CD61或CD41的抗体进行分选(gating)，其后，检测PAC-1抗体、抗CD62P抗体与血小板的结合来进行。这些工序可以在二磷酸腺苷(ADP)存在下进行。
另外，血小板的功能的评价也可以通过观察在ADP存在下是否与纤维蛋白原结合来进行。通过血小板与纤维蛋白原结合，从而发生在血栓形成的初期所必需的整联蛋白(integrin)的活化。此外，血小板的功能的评价还可以如国际公开第2011/034073号的图6所示，通过可视化地观察体外的血栓形成能力的方法进行。
血小板的生物体内的循环能力的评价可以根据常规方法进行。更具体而言，可以在对通过γ射线照射(2.4Gy)诱发的血小板减少症模型NOG小鼠以2×108个血小板/只尾静脉内给予血小板之后，使用抗人类CD41抗体对以恒定间隔从颈静脉采集的血液中的来自人类的血小板进行定量来评价血小板的循环能力。
血小板的止血能力的评价可以根据常规方法进行。更具体而言，在对通过γ射线照射(2.4Gy)诱发的血小板减少症模型NOG小鼠以2×108个血小板/只尾静脉内给予血小板之后，在麻醉下(氨基甲酸乙酯，1.5g/kg)使用28G的注射针对尾动脉(距离前端2cm)进行穿刺，将尾部的前端浸在保温到37℃的PBS中，同时测定直到止血为止的时间，由此能够评价止血能力。
另一方面，在血小板的CD42b的表达率低的情况下，或者膜联蛋白V阳性率高的情况下，评价为血小板恶化或异常。这些血小板不足以具有血栓形成、止血功能，临床上没有用。
在本说明书中，“血小板的恶化”是指血小板表面的CD42b(GPIbα)减少的情况。因此，恶化的血小板包括CD42b的表达降低的血小板、因沉淀(shedding)反应而导致CD42b的细胞外区域裂解的血小板。如果血小板表面的CD42b消失，则无法进行与冯·维勒布兰德因子(von Willebrand factor：VWF)的缔合，结果丧失血小板的凝血功能。血小板的恶化可以以血小板组分中的CD42b阴性率(或CD42b阴性粒子数)相对于CD42b阳性率(或CD42b阳性粒子数)的情况为指标来评价。CD42b阴性率相对于CD42b阳性率越高，或者CD42b阴性粒子数相对于CD42b阳性粒子数越大，则血小板越恶化。CD42b阳性率是指血小板组分所含的血小板中的、抗CD42b抗体能够结合的血小板的比例，CD42b阴性率是指血小板组分所含的血小板中的、抗CD42b抗体无法结合的血小板的比例。
在本说明书中，“异常的血小板”是指作为阴性电荷磷脂质的磷脂酰丝氨酸从脂质双分子层的内侧向外侧露出的血小板。在生物体中，已知磷脂酰丝氨酸随着血小板的激活而在表面露出，在此结合了大量的凝血因子，由此凝血级联反应扩大。另一方面，在异常的血小板中，大量的磷脂酰丝氨酸始终在表面露出，如果向患者给予该血小板，则可能引起过度的凝血反应，导致弥散性血管内凝血综合征等严重的疾病。由于膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸结合，所以血小板表面上的磷脂酰丝氨酸可以通过以荧光标记的膜联蛋白V的结合量为指标，使用流式细胞仪来检测。因此，异常的血小板的量可以用血小板组分中的膜联蛋白V阳性率，即膜联蛋白结合的血小板的比例或数目来评价。膜联蛋白V阳性率越高，或者膜联蛋白V粒子数越多，异常的血小板越多。
另外，血小板的功能的评价也可以通过在ADP存在下，观察是否与纤维蛋白原结合来进行。通过血小板与纤维蛋白原的结合，从而发生血栓形成的初期所必需的整联蛋白的活化。
此外，血小板的评价还可以如国际公开第2011/034073号的图6所示，通过可视化地观察体外的血栓形成能力的方法进行。
在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，在使癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因强制表达而制作永生化巨核细胞，其后解除强制表达而进行永生化巨核细胞的多核化的情况下，优选在强制表达的解除之后，向培养基加入ROCK抑制剂。
(第二方式)
在第二方式中，本发明提供一种血小板的制造方法，其包括抑制巨核细胞或其前体细胞中的HMGA(High Mobility Group At-hook protein：高迁移率族At-hook蛋白)蛋白质的表达或功能的工序。
高迁移率族At-hook蛋白(或High Mobility Group A(HMGA)：高迁移率族蛋白)蛋白质主要是与大量包含AT的DNA结合的非组蛋白性的染色质蛋白质，已知有HMGA1和HMGA2。在本说明书中使用的情况下，特别优选HMGA2。人类HMGA2蛋白质也被称为NCBI(参考序列:NP_001287847.1)。
在本说明书中，“蛋白质的表达”这一术语以包括转录和翻译的概念使用，“抑制表达”是指以转录级别或翻译级别抑制表达的全部或一部分。
抑制HMGA蛋白质的表达或功能的工序可以使用公知的方法或以此为基准的方法来进行。
另外，作为阻碍HMGA蛋白质的功能的方法，可以使用显性负性法。显性负性法(dominant negative method)是如下方法：使导入变异而使活性降低或丧失了的HMGA蛋白质大量地在细胞内表达，细胞内的非活性的HMGA蛋白质与正常HMGA蛋白质的比率压倒性地增高，结果得到HMGA蛋白质的功能无法获得的行为的细胞。
作为阻碍HMGA蛋白质的功能的方法，可以使用抗HMGA抗体。作为抗HMGA抗体，可以使用通过公知的方法制造的、或者市售的抗体，只要通过抑制HMGA蛋白质的功能得到本发明的效果，就可以是任意抗体。
作为抑制HMGA蛋白质的表达的方法，例如可举出使用直接或间接地抑制HMGA基因的表达的miRNA的方法。miRNA可以直接作用于HMGA基因，也可以间接作用于HMGA基因。例如，该方法可以通过使用被称为let-7的miRNA来进行。在本发明中，例如在人类的情况下，let-7可以为选自hsa-let-7a-1、hsa-let-7a-2、hsa-let-7a-3、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f-1、hsa-let-7f-2、hsa-let-7g和hsa-let-7i中的任一个miRNA，但也可以使用其他动物物种的let-7。let-7的序列等可以从在数据库的信息(例如，http://www.mirbase.org/或http://www.microrna.org/)中注册的信息适当获得。在本发明中，优选let-7为hsa-let-7b。
另外，作为抑制HMGA2蛋白质的表达的方法，可以通过使用抑制负调控let-7的表达的Lin28b的表达的miRNA来进行。作为上述miRNA，例如可举出miR181a。例如在人类的情况下，miR181a是选自hsa-mir-213、hsa-mir-181a-1和hsa-mir-181a-2中的任一个miRNA，但也可以使用其他动物物种的miR181a。miR181a的序列等可以从与上述同样的数据库的信息适当得到。
“miRNA”是指通过阻碍mRNA向蛋白质的翻译、mRNA的分解，而参与基因的表达调节的、存在于细胞内的短链(20-25个碱基)的非编码RNA。该miRNA以如下方式发挥功能：转录为能够得到包含miRNA及其互补链的发夹突环(hairpin loop)结构的与单链不同的pri-miRNA，利用在核内的被称为Drosha的酶剪切其一部分而成为pre-miRNA并输送到核外之后，进一步利用Dicer剪切。因此，在本发明中使用的let-7或miR181a可以是单链的pri-miRNA，也可以是双链的pre-miRNA的形态。
作为抑制HMGA基因的表达的方法，可以使用反义法(antisense method)、核酶法(ribozyme method)、RNAi法等。
反义法是使用具有与靶基因(基本上是作为转录产物的mRNA)互补的碱基序列，且通常10个碱基长度～100个碱基长度、优选15个碱基长度～30个碱基长度的单链核酸来抑制基因的表达的方法。通过向细胞内导入反义核酸，使其与靶基因杂交，从而阻碍基因的表达。只要得到靶基因的表达阻碍效果，反义核酸也可以不与靶基因完全互补。反义核酸可以由本领域技术人员使用公知的软件等适当设计。反义核酸可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体中的任一个，另外也可以被修饰。
核酶是将靶RNA催化水解的核酸分子，由具有与靶RNA互补的序列的反义序列区域和负责剪切反应的催化剂中心区域构成。核酶可以由本领域技术人员根据公知的方法适当设计。核酶通常是RNA分子，但也可以使用DNA-RNA嵌合体型分子。
RNAi法是由双链核酸诱导的序列特异性的基因表达抑制机构。由于是利用了靶特异性非常高、且在生物体中原本存在的基因表达抑制机制的方法，所以安全性高。
作为具有RNAi效果的双链核酸，例如可举出siRNA。siRNA在哺乳动物细胞中使用的情况下，通常是19个～30个碱基的程度，优选21个碱基～25个碱基的程度的双链RNA。具有RNAi效果的双链核酸通常其一方具有与靶核酸的一部分互补的碱基序列，另一方具有与其互补的序列。抑制HMGA的表达的siRNA可以通过本领域技术人员使用公知的软件等进行适当设计，作为双链核酸序列的一方，例示有在后述的实施例中使用的靶序列。抑制HMGA的表达的siRNA可以是直接作用于HMGA基因(包括与HMGA基因的一部分互补的序列)，也可以是间接作用于HMGA基因(抑制HMGA基因以外的基因的表达，结果抑制HMGA基因的表达)。
let-7、miR181a、siRNA、反义核酸、核酶可以通过将包含分别编码它们的核酸的载体(例如，慢病毒载体)向细胞内导入，在细胞内使其表达，除此以外，也可以以RNA的形态导入到细胞。在以RNA的形态导入的情况下，例如可以通过脂质体转染法、显微注射法等公知的方式导入到细胞内，为了抑制RNA的分解，可以使用掺入了5-甲基胞苷和假尿苷(pseudouridine)(TriLink Biotechnologies)的RNA(Warren L,(2010)Cell StemCell.7:618-630)，或者掺入了DNA的DNA-RNA嵌合体型。在为尿苷、胞苷中的任一个的情况下，修饰碱基的位置可以独立地在全部或一部分，在为一部分的情况下，可以以任意的比例在随机的位置。包含编码let-7、miR181a或siRNA的核酸的载体可以使用包含分别编码双链的DNA的载体，也可以使用包含编码双链核酸介由环连结的单链核酸的DNA的载体。siRNA的情况下，可以设计成在细胞内通过转录得到的单链RNA的互补的部分在分子内杂交，采用发夹型的结构。这样的RNA被称为shRNA(short hairpin RNA：短发夹RNA)。如果shRNA转移到细胞质，则环状部分被酶(Dicer)剪切，成为siRNA而发挥RNAi效果。
在本说明书中，将蛋白质的表达的抑制称为“通过siRNA进行”或“通过miRNA进行”的情况下，是指最终siRNA或miRNA抑制表达，在细胞可以以RNA的形态给予siRNA、shRNA或miRNA，也可以给予包含编码siRNA、shRNA或miRNA的核酸的载体。
在用载体等导入针对let-7、miR181a或HMGA的siRNA或shRNA的情况下，该RNA的表达可以通过药剂应答性启动子来控制。这样的能够药剂应答性地控制RNA的载体例如可以从宝生物公司(Takara Bio Inc.)得到。此时，导入该RNA是指与对应的药剂接触，在细胞内使RNA表达。
如从实施例理解得知，从在巨核细胞的多核化和肥大化的成熟化过程中有效的观点考虑，HMGA蛋白质的表达或功能的抑制可以在多核化前的巨核细胞中进行，从对多核化的巨核细胞进行进一步的多核化的观点考虑，可以在多核化的巨核细胞中进行HMGA蛋白质的表达或功能的抑制。由于巨核细胞的多核化和肥大化得到促进，每一个细胞的血小板生成数显著增加，所以优选在从巨核细胞制造血小板的工序中也进行HMGA蛋白质的表达或功能的抑制。
通过本发明得到的成熟巨核细胞可以高效地生成功能性血小板。在本说明书中，巨核细胞的成熟是指巨核细胞充分多核化，能够生成功能性血小板。巨核细胞的成熟例如可以通过GATA1、p45NF-E2、beta1-tubulin等巨核细胞成熟相关基因组的表达的提升、血小板前体的形成、细胞内的多核化而确认。
应予说明，在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，在使癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因强制表达而制作永生化巨核细胞，其后解除强制表达而进行永生化巨核细胞的多核化的情况下，上述的HMGA蛋白质的表达或功能的抑制的开始可以在该基因的强制表达解除前进行也可以在解除后进行没有特别限定，但优选至少在强制表达解除后抑制HMGA蛋白质的表达或功能。通过该基因的强制表达解除前抑制HMGA蛋白质的表达或功能，从而CD41a阳性细胞的数目，即多核化前的巨核细胞的数目有减少的趋势，所以从保持多核化前的巨核细胞数目的观点考虑，更优选HMGA蛋白质的表达或功能的抑制的开始在该基因的强制表达解除后进行。
(第三方式)
在第三方式中，本发明提供一种成熟巨核细胞的制造方法，包括在AhR拮抗剂和/或ROCK抑制剂的存在下培养抑制了HMGA蛋白质的表达或功能的巨核细胞的工序。另外，培养工序可以与上述的接触工序同样地进行。在另一方式中，本发明的成熟巨核细胞的制造方法也可以包括生成血小板的工序。
(培养条件等)
在本发明任一方式中，巨核细胞的培养条件可以为通常的条件。例如，温度可以为约35℃～约42℃、约36℃～约40℃或约37℃～约39℃，可以采用5％的CO2和/或20％的O2。可以进行静置培养，也可以进行振摇培养。根据本发明，在使用SR-1等AhR拮抗剂的情况下，由于可以实现在无饲养层条件下的培养，所以在大量制造血小板时优选进行振摇培养。振摇培养情况下的振摇速度也没有特别限定，例如可以为10rpm～200rpm、30rpm～150rpm等。
在本发明中，通过像上述那样培养巨核细胞，从而巨核细胞成熟，从其细胞质生成血小板。在此，巨核细胞成熟是指巨核细胞多核化，能够释放出血小板。
培养巨核细胞时的培养基没有特别限定，可以适当使用从巨核细胞生成血小板所适宜的公知的培养基或以此为基准的培养基。例如，可以将动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基，例如可举出IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔氏基本成分培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM)培养基、αMEM培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's Medium)(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal培养基(LifeTechnologies公司)和它们的混合培养基。
培养基中可以含有血清或血浆，或者无血清。根据需要，培养基可以含有例如白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油(thiol glycerol)、单硫代甘油(MTG)、脂质、氨基酸(例如L-谷氨酰胺)、抗坏血酸、肝素、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等中的1种以上的物质。细胞因子是指促进血细胞分化的蛋白质，例如例示有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板生成素(TPO)、各种TPO类活性物质、干细胞因子(SCF：Stem CellFactor)、ITS(胰岛素-转铁蛋白-***盐)添加剂、ADAM抑制剂等。在本发明中优选的培养基是含有血清、胰岛素、转铁蛋白、丝氨酸、硫醇甘油、抗坏血酸、TPO的IMDM培养基。此外，可以含有SCF，还可以含有肝素。各自的浓度也没有特别限定，但例如，TPO可以为约10ng/mL～约200ng/mL或约50ng/mL～约100ng/mL，SCF可以为约10ng/mL～约200ng/mL或约50ng/mL，肝素可以为约10U/mL～约100U/mL或约25U/mL。可以加入佛波酯(例如，佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯；PMA)。
在使用血清的情况下优选人血清。另外，可以使用人血浆等代替血清。根据本发明的方法，即使使用这些成分，也可以得到与使用血清时同等的血小板。
为了进行基因的强制表达及其解除而使用Tet-on(注册商标)或Tet-off(注册商标)***那样的药剂应答性的基因表达诱导***的情况下，在强制表达的工序中，可以在培养基中含有对应的药剂，例如四环素或多西环素，并将它们从从培养基中除去而抑制强制表达。
本发明中的巨核细胞的培养工序可以在无饲养细胞(feeder cell)的情况下实施。如后述的实施例所示，根据本发明的方法，即使在无饲养细胞的情况下培养，也能够得到功能性血小板。
在本说明书中，“饲养细胞”是指为了调整想要进行增殖或分化的细胞(靶细胞)的培养所必需的环境，而与靶细胞共同培养的细胞。饲养细胞只要是能够与靶细胞区分识别的细胞，也可以包含来自同种的细胞或来自异种的细胞。饲养细胞可以是以利用抗生素、γ射线不增殖的方式进行了处理的细胞，也可以是没有经过处理的细胞。
本发明也包含通过本发明的方法制造的血小板。通过本发明的方法制造的血小板如后述的实施例所示，与利用现有方法在体外制造的血小板相比，从推进开放小管***的发展，且还能够确认线粒体的角度考虑，认为形态学上接近天然的血小板。
本发明的血小板制剂的制造方法包括：使如上所述制备的成熟巨核细胞生成血小板的工序，任意地从培养物中回收富含血小板的组分的工序以及从该血小板组分中除去血小板以外的血细胞成分的工序。除去血细胞成分的工序可以通过使用去白细胞过滤器(例如，Terumo公司制、Asahi Kasei Medical公司制)等，将含有巨核细胞的血小板以外的血细胞成分去除来进行。血小板制剂的更具体的制造方法例如记载于国际公开第2011/034073号中。
本发明的血液制剂的制造方法包括制造上述的血小板制剂的工序和将该血小板制剂与其他成分混合的工序。作为其他成分例如可举出红细胞。
在血小板制剂和血液制剂中可以另行加入有利于细胞的稳定化的其他成分。
另外，本发明也包含含有多核化的巨核细胞、AhR拮抗剂、培养基的组合物。该组合物可以通过直接培养来得到功能性高的血小板，也可以进行冷冻保存。特别是在冷冻保存的情况下，该组合物可以含有在冷冻时保护细胞的DMSO、甘油、市售的细胞冷冻用试剂等。通过将冷冻的组合物解冻并进行培养，从而能够得到功能性高的血小板。
在本说明书中，所引用的所有专利文献和非专利文献的公开可以整体作为参照援引到本说明书中。
实施例1
以下，基于实施例具体地说明本发明，但本发明不受其任何限定。本领域技术人员可以在不脱离本发明的主旨的情况下以各种方式改变本发明，该改变也包括在本发明的范围内。
1.永生化巨核细胞的制作
1-1.从iPS细胞制备造血前体细胞
根据Takayama N.,et al.J Exp Med.2817-2830(2010)中记载的方法，实施从人类iPS细胞(TKDN SeV2：来自于使用仙台病毒建立的人胎儿皮肤成纤维细胞的iPS细胞)向血细胞的分化培养。即，在20ng/mL的VEGF(R&DSYSTEMS)存在下，将人类ES/iPS细胞集落与C3H10T1/2饲养细胞共培养14天来制作造血前体细胞(Hematopoietic Progenitor Cells；HPC)。在20％的O2、5％的CO2的培养条件下实施(只要没有特别记载，以下就为相同条件)。
1-2.c-MYC和BMI1病毒向造血前体细胞的感染
在预先接种了C3H10T1/2饲养细胞的6孔板上，以5×104个细胞/孔的方式接种按照上述方法得到的HPC，通过慢病毒法使c-MYC和BMI1强制表达。此时，对每1种细胞株使用6孔。即，以分别成为MOI 20的方式在培养基中添加病毒粒子，通过自旋感染(spininfection)(32℃、900rpm,离心60分钟)进行感染。本操作每12小时实施2次。此时，使用如下的培养基：向基本培养基(含有15％的胎牛血清(GIBCO)、1％的青霉素-链霉素-谷氨酰胺(GIBCO)、1％的胰岛素、转铁蛋白、硒溶液(ITS-G)(GIBCO)、0.45mM的1-硫代甘油(Sigma-Aldrich)、50μg/mL的L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)的IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium：伊思考夫改良的杜尔贝科培养基)(Sigma-Aldrich))中加入50ng/mL的人血小板生成素(TPO)(R&DSYSTEMS)、50ng/mL的人干细胞因子(SCF)(R&D SYSTEMS)和2μg/mL的多西环素(Dox)，向所得到的培养基(以下，称为分化培养基)中进一步加入鱼精蛋白，以使得最最终浓度成为10μg/mL。应予说明，慢病毒载体是四环素控制性的诱导型载体(induciblevector)，是通过将LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(Kobayashi,T.,et al.Cell 142,787-799(2010))的mOKS试剂盒替换为c-MYC、BMI1、BCL-xL而制作的(分别为LV-TREc-Myc-Ubc-tTA-I2G、LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、和LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G)。感染中使用的病毒粒子通过使上述慢病毒载体向293T细胞表达而制作。
1-3.巨核细胞自增殖株的制作和维持培养
将通过上述方法实施了cMYC和BMI1病毒感染的日期作为感染第0天，如下，通过培养cMYC和BMI1基因导入型巨核细胞，分别制作巨核细胞自增殖株。
·感染第2天～感染第11天
利用移液器回收通过上述方法得到的病毒感染完毕的血细胞，进行1200rpm、5分钟离心操作并除去上清液后，在新的分化培养基悬浮地接种于新的C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。通过在感染第9天进行同样的操作来实施传代。在测量细胞数之后，以1×105个细胞/2mL/孔接种于C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。
·感染第12天～感染第13天
实施与感染第2天同样的操作。在测量细胞数之后，以3×105个细胞/10mL/100mmdish的条件接种在C3H10T1/2饲养细胞上(100m培养皿)。
·感染第14天
回收病毒感染完毕的血细胞，针对每1.0×105个细胞，使用抗人类CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人类CD42b-PE抗体(eBioscience)、抗人类CD235ab-pacific blue(BioLegend)抗体分别为2μL、1μL、1μL进行抗体反应。在反应后，使用FACS Verse(BD)进行解析。在感染第14天，将CD41a阳性率为50％以上的细胞作为巨核细胞自增殖株。
1-4.BCL-xL病毒向巨核细胞自增殖株的感染
通过慢病毒法向上述感染第14天的巨核细胞自增殖株基因导入BCL-xL。以成为MOI 10的方式向培养基中添加病毒粒子，通过自旋感染(32℃、900rpm，60分钟离心)进行感染。
1-5.巨核细胞永生化株的制作和维持培养
·感染第14天～感染第18天
回收通过上述方法得到的导入了BCL-xL基因的巨核细胞自增殖株，进行1200rpm、5分钟离心操作。离心后，用新的分化培养基将沉淀的细胞悬浮之后，以2×105个细胞/2mL/孔的条件接种于新的C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。
·感染第18天：传代
在测量细胞数之后，以3×105个细胞/10mL/100mm dish的条件进行接种。
·感染第24天：传代
在测量细胞数之后，以1×105个细胞/10mL/100mm dish的条件进行接种。以后，每4-7天进行传代，进行维持培养。
在感染第24天回收导入了BCL-xL基因的巨核细胞自增殖株，针对每1.0×105个细胞，使用抗人类CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人类CD42b-PE抗体(eBioscience)、抗人类CD235ab-Pacific Blue(Anti-CD235ab-PB；BioLegend)抗体分别为2μL、1μL、1μL进行免疫染色之后，使用FACS Verse(BD)进行解析，在感染第24天，将CD41a阳性率为50％以上的株作为巨核细胞永生化株。
将导入了上述BCL-xL基因的巨核细胞自增殖株维持培养，结果来自iPS细胞(692D2、1108A2)的细胞在感染后能够增殖24天以上。将这些细胞作为巨核细胞永生化细胞株(SeV2-MKCL)。
将得到的SeV2-MKCL在10cm培养皿(10mL/dish)中静置培养。培养基以IMDM作为基本培养基，并加入了以下的成分(浓度为最终浓度)。
Figure BDA0001509748380000241
BMI1基因、c-MYC基因和BCL-xL基因的强制表达通过向培养基加入1μg/mL的多西环素(clontech#631311)来进行。
2.SR-1浓度的研究
利用PBS(-)将通过1.的方法得到的永生化巨核细胞株(SeV2-MKCL)清洗2次，在不含有多西环素的培养基中进行培养，由此解除强制表达。培养在6孔板以接种密度1×105个细胞/mL、2mL/孔的条件进行接种，在如下的培养基中静置培养。
培养基以IMDM作为基本培养基，并加入了以下的成分(浓度为最终浓度)。
Figure BDA0001509748380000242
Figure BDA0001509748380000251
同时以图1所示的浓度加入SR-1，培养7天之后，对血小板的数目和功能进行测定。测定方法如下。
在基因表达OFF培养7天后，使用1mL的移液器(Pipetman)将培养上清液缓慢地悬浮。将200μL培养液分注到5mL样品管中，用以下的抗体进行染色。
0.5μL的抗CD42a抗体PB标记(eBioscience#48-0428-42)
0.5μL的抗CD42b抗体PE标记(Bio Legend#303906)
0.5μL的抗CD62a抗体APC标记(Bio Legend#304910)
10μL的PAC-1抗体FITC标记(BD#304910)
血小板的刺激通过以最终浓度0.2μM添加PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯,sigma#P1585-1MG)、或者以最终浓度20uM添加ADP(sigma#A2754)、以最终浓度20μM添加TRAP-6(Thtombin Receptor Activator Peptide6：凝血酶受体激活肽,TFA盐,BACHEM#H8365)、以最终浓度1μg/mL添加胶原(胶原试剂HORM,MORIYA产业)，或者它们的混合物，使其在室温下反应。
在反应30分钟后，利用BD公司的FACSverce实施测定。在刚测定之前添加400μL的Tyrode buffer Ca+，总计600μL。将该总计600μL作为FACS测定样品。
将CD42a阳性CD42b阳性的粒子数作为血小板数，算出该血小板组分中的刺激前后的PAC-1和CD62p的平均荧光强度(Mean Fluorescence Intensity；MFI)之比。
将结果示于图1。确认了如果加入SR-1，则PAC-1和抗CD62p抗体结合的血小板增加，与没有SR-1的情况相比，功能更高。特别是根据PAC-1的结果，在后续的实验中，将SR-1设为750nM。
3.BMI1基因、c-MYC基因和BCL-xL基因的强制表达期间的研究
将从1.的永生化巨核细胞的制备中的最后的传代日起到用PBS(-)清洗为止的期间记为1天、2天或3天，在强制表达结束之后，使SR-1的浓度为75nM或750nM，使接种密度为1×105个细胞/mL，进行与2.同样的实验。
将结果示于图2。在强制表达1天～3天，血小板生成数几乎没有观察到差异，但进行了2天以上强制表达的可以观察到功能变高的趋势。
4.振摇培养的研究
代替6孔板，在E125烧瓶中以接种密度1×105个细胞/mL，25mL/***条件接种，进行振摇培养，除此以外，进行与2.和3.同样的实验，对SR-1的浓度和永生化巨核细胞的接种密度进行研究。
将结果示于图3和4所示的。得到与静置培养同样的结果。
5.SR-1类似物的研究
以图中的浓度使用SR-1的类似物作为AhR拮抗剂，除此以外，进行与2.同样的实验。
将结果示于图5。确认了添加任一种AhR拮抗剂，血小板生成数和功能均增大。另外，对于AhR拮抗剂，进一步改变了浓度的结果详细地示于图6A和图6B。
6.AhR拮抗剂和ROCK抑制剂的共同添加效果的研究
调查SR-1(AhR拮抗剂)和Y27632(ROCK抑制剂)的共同添加效果。利用PBS(-)对通过1.的方法得到的永生化巨核细胞进行2次清洗，除去多西环素而解除强制表达，以接种密度1×105个细胞/mL，2mL/孔的条件在6孔板接种，进行静置培养，以接种密度1×105个细胞/mL，25mL/***条件在E125烧瓶接种，进行振摇培养。
培养基以IMDM作为基本培养基，加入了以下的成分(浓度为最终浓度)。
Figure BDA0001509748380000261
Figure BDA0001509748380000271
培养条件为37℃，5％的CO2，20％的O2。通过与上述2.同样的方法对血小板数和PAC-1阳性细胞进行测定。
将结果示于图7和图8。确认了如果共同添加SR-1和Y27632，则与分别单独添加的情况相比，血小板生成数和功能协同性地变高。同样地，确认了对于SR-1与其他ROCK抑制剂的组合(例如Y39983、法舒地尔盐酸盐、利舒地尔(Ripasudil)、SLX-2119、RKI-1447、氮杂吲哚1、SR-3677)同样起到协同效果。将表示了超过Y27632的显著的协同效果的Y-39983的结果示于图9。法舒地尔盐酸盐和利舒地尔(Ripasudil)也浓度依赖性地示出了与Y27632相当的协同效果。接下来，对于Y27632与其他AhR拮抗剂的组合而言，也对血小板生成数等进行了研究，结果确认为均起到协同效果。将表示了超过SR-1的显著的协同效果的GNF-351和CH-223191的结果示于图10。虽然未示出结果，但GNF-351与Y-39983的组合起到特别令人惊奇的显著效果。
另外，血小板生成数随着培养天数增加而增加，但PAC1阳性的功能性血小板在添加第5天左右时可以观察到变得最多的趋势。
7.FBS替代物的研究
为了调查是否可以用来自人类的成分来代替FBS，使用15％人类来自血清(图中human serum(人血清)；正常人血清库(KOHJIN-BIO#12181201))或15％的来自人类的血浆(图中human plasma(人血清)；正常人血浆库·肝素处理(KOHJIN-BIO#12250210))来代替15％的FBS，除此以外，进行与上述2.或6.同样的实验。
将结果示于图11。可知即便使用15％的人血清或15％的人血浆来代替FBS，也能够得到功能性血小板。如果使用人血清、人血浆，则能够排除异源动物成分，因此能够得到安全性更高的血小板。
接下来，在SR-1和Y27632存在下进行振摇培养，除此以外，在与图11相同的条件下进行实验。
将结果示于图12。即使在振摇培养而非静置培养的情况下使用15％的人血清或15％的人血浆也能够得到功能性血小板。通过振摇培养，能够进行大量培养/大量生产。
通常，已知如果在培养基中添加血清，则产生凝固反应，因此容易出现批次(lot)差异，所以作为培养基添加物，与人血清相比，更优选人血浆。因此，针对人血浆，在SR-1和Y27632存在下进行振摇培养，调查了血小板生成量的浓度依赖性。
将结果示于图13。确认了对于血小板生成量，虽然可以观察到一定程度的血浆浓度依赖性，但是即便使血浆浓度降低到1％，也能够得到足够量的功能性血小板。如果能够降低培养基中的人血浆浓度，则能够降低血小板制剂的生产成本。
接下来，也使人血清的浓度降低而同样地进行了实验。作为人血浆，使用正常人血浆库·柠檬酸(KOHJIN-BIO#12250110)，作为人血清，使用正常人血清库(KOHJIN-BIO#12181201)，进行静置培养。
将结果示于图14和15。确认了即便使血清浓度降低到1％，也能够得到足够量的功能性血小板。
8.HMGA2的抑制
利用病毒载体，向上述1.中制备的永生化巨核细胞导入sh Runx1和GFP、sh HMGA2和GFP、SCRAMBLE和GFP基因。将经过基因导入的细胞(GFP阳性细胞)进行分选(sorting)。将所使用的sh RNA示于以下的表1。
[表1]
Figure BDA0001509748380000281
将实验方法的概要和结果示于图16和17。可知如果敲减(knock down)HMGA2，则CD41a阳性细胞的数目降低，因此HMGA2是处于增殖期的多核化前的巨核细胞的自己复制中所需要的因素。另一方面，对于Runx1，如果敲减，则CD41a阳性细胞增加，因此认为若干抑制多核化前的巨核细胞的增殖。
接下来，通过上述1-5.等中记载的方法解除cMYC、BMI1和BCL-xL基因的强制表达，测定血小板的生成。将结果示于图18和19。
如图所示，确认了与强制表达解除前(ON MGK)相比，强制表达解除后的CD41a阳性CD42b阳性的巨核细胞的含有率增加(OFF MGK)，大量生成CD41a阳性CD42b阳性的血小板。如图19上部所示，如果敲减HMGA2，则巨核细胞的多核化得到显著促进，如下部所示，确认了在巨核细胞中，每1个细胞的血小板数显著增加。
9.HMGA2阻碍、AhR拮抗剂和ROCK抑制剂的效果
将与上述8.同样地将shRunx1和GFP、shHMGA2和GFP、shSCRAMBLE和GFP基因导入到上述1.中制备的永生化巨核细胞中，在含有1μg/ml的多西环素(DOX)的巨核细胞用培养基(即，添加了15％的FBS、L-Glutamin、ITS、MTG、抗坏血酸、50ng/mL的SCF、50ng/mL的TPO的IMDM)中培养7天后，通过分选分离经过基因导入的细胞(GFP阳性细胞)。将导入shHMGA2并分离的细胞以1×105个接种于6孔板，在未添加、仅添加了750nM的SR-1、仅添加了10μMY27632或者添加了750nM SR-1和10μMY27632的不含有DOX的巨核细胞用培养基(即，阻止外源性的基因表达的培养基)中培养7天。
另一方面，将导入shRunx1和shSCRAMBLE并分离的细胞在添加了750nM的SR-1和10μM的Y27632的不含有DOX的巨核细胞培养培养基中培养7天。通过定点旋转(site spin)使得到的细胞向载玻片(slide glass)密合，利用显微镜进行观察(图20上图)。
另外，使用FACS对培养上清液中的血小板数(CD41a阳性CD42b阳性)进行测定(图20的下图)。其结果，确认了通过用含有AhR拮抗剂和ROCK抑制剂的培养基对敲减了HMGA2的巨核细胞进行培养，可观察到多核化和肥大化的细胞变多，每单位细胞的血小板生成数显著增加。另外，确认了在组合使用AhR拮抗剂和ROCK抑制剂的情况下，血小板生成效率变得更高。
10.HMGA2阻碍和巨核细胞的成熟化
利用添加了SR-1和Y27632的不含有DOX的巨核细胞用培养基对上述9.中得到的导入shRunx1、shHMGA2和shSCRAMBLE而得到的细胞进行培养，将所得到的细胞用电子显微镜进行观察。
将结果示于图21。其结果，确认了在导入了shRunx1的情况下，小型有核细胞多，在细胞中，分界膜***(demarcation membrane system：DMS)的发展缺乏，分泌颗粒形成为中等程度。同样地，确认了在导入了shSCRAMBLE的情况下，小型有核细胞多，在细胞中，DMS的发展缺乏，分泌颗粒几乎没有形成。另一方面，在导入了shHMGA2的情况下，可观察到多核化和肥大化的细胞，此外，在这样的细胞中，可观察到DMS和分泌颗粒的形成。
由以上的结果可知，在巨核细胞中，通过阻碍HMGA2，从而能够提高血小板生成效率，通过组合AhR拮抗剂和ROCK抑制剂，从而所得到的巨核细胞与生物体的巨核细胞同样地发征多核化和肥大化，以可观察到DMS和分泌颗粒的形成的程度成熟，由此，血小板生成效率变得更高。
序列表自由文本
序列编号：1表示shSCRAMBLE的靶序列。
序列编号：2表示shSCRAMBLE的DNA序列。
序列编号：3表示shRunx1的靶序列。
序列编号：4表示shRunx1的DNA序列。
序列编号：5表示shHMGA2的靶序列。
序列编号：6表示shHMGA2的DNA序列。
序列表
<110> 国立大学法人京都大学（KYOTO UNIVERSITY）
株式会社美加细胞（Megakaryon Corporation）
<120> 高功能性血小板的制造方法
<130> 5032
<140> Not yet assigned
<141> 2017-12-15
<150> JP2015-121456
<151> 2015-06-16
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
gaggtcacac tagagagtta ta 22
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成DNA(Synthesized DNA.)
<400> 2
gatccccgag gtcacactag agagttatat tcaagagata taactctcta gtgtgacctc 60
tttttggaaa a 71
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
actttccagt cgactctca 19
<210> 4
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成DNA(Synthesized DNA.)
<400> 4
gatccccact ttccagtcga ctctcattca agagatgaga gtcgactgga aagttttttg 60
gaaaa 65
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
atgagacgaa atgctgatgt at 22
<210> 6
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成DNA(Synthesized DNA.)
<400> 6
gatccccatg agacgaaatg ctgatgtatt tcaagagaat acatcagcat ttcgtctcat 60
tttttggaaa a 71

Claims (9)

1.一种功能性高的血小板生成促进剂，其特征在于，包含1种或多种芳香烃受体(ArylHydrocarbon Receptor；AhR)拮抗剂以及1种或多种ROCK(Rho-associated coiled-coilforming kinase：Rho相关卷曲螺旋形成激酶)抑制剂，AhR拮抗剂选自4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚(SR-1)、2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(2-甲基-4-邻甲苯偶氮-苯基)-酰胺(CH-223191)、N-[2-(3H-吲哚-3-基)乙基]-9-异丙基-2-(5-甲基-3-吡啶基)嘌呤-6-胺(GNF-351)，ROCK抑制剂选自Y27632、Y39983。
2.一种体外的血小板的制造方法，其特征在于，包括使权利要求1所述的血小板生成促进剂与巨核细胞或其前体细胞接触的工序。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接触工序在不使用饲养细胞的条件下进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在振摇培养条件下实施。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括抑制所述巨核细胞或其前体细胞中的HMGA(High Mobility Group At-hook protein：高迁移率族At-hook蛋白)蛋白质的表达或功能的工序。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述HMGA蛋白质的表达或功能的抑制通过直接或间接地抑制HMGA基因的表达的siRNA或miRNA来进行。
7.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述巨核细胞是在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，使选自癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因中的至少1个基因强制表达之后，解除该强制表达而得到的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述与巨核细胞相比分化程度低的细胞是由多能性干细胞制造而成的造血前体细胞。
9.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括从所述巨核细胞中回收血小板的工序。
CN201680035205.0A 2015-06-16 2016-06-16 高功能性血小板的制造方法 Active CN107709546B (zh)

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