WO2007141903A1 - スペクトル観察方法及びスペクトル観察システム - Google Patents

スペクトル観察方法及びスペクトル観察システム Download PDF

Info

Publication number
WO2007141903A1
WO2007141903A1 PCT/JP2007/000526 JP2007000526W WO2007141903A1 WO 2007141903 A1 WO2007141903 A1 WO 2007141903A1 JP 2007000526 W JP2007000526 W JP 2007000526W WO 2007141903 A1 WO2007141903 A1 WO 2007141903A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
spectrum
wavelength
data
excitation
observation
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/000526
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoko Fukuda
Hisashi Okugawa
Original Assignee
Nikon Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38801172&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2007141903(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Nikon Corporation filed Critical Nikon Corporation
Priority to EP07737182.1A priority Critical patent/EP2037255B2/en
Publication of WO2007141903A1 publication Critical patent/WO2007141903A1/ja
Priority to US12/292,924 priority patent/US7724365B2/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the present invention relates to a spectrum observation method and a spectrum observation system for an observation object including a plurality of types of substances having different excitation wavelengths, such as specimens that are multiple-stained with a plurality of types of fluorescent reagents.
  • a spectrum imaging fluorescent laser microscope is effective for observing a specimen that has been multiple-stained with a plurality of types of fluorescent reagents (see Patent Document 1, etc.).
  • This laser microscope irradiates a specimen with excitation light, and then splits the generated fluorescence with a grating (diffraction grating) or the like, and detects the intensity of each wavelength component after the spectrum with a spectrum detector.
  • a grating diffiffraction grating
  • Patent Document 1 Special Table 2 0 0 4— 5 0 6 1 9 1
  • the present invention provides a spectrum observation method and a spectrum observation system capable of acquiring necessary data without omission in observing an object including a plurality of types of substances having different excitation wavelengths.
  • the purpose is to provide.
  • the spectral observation method of the present invention irradiates light to an observation object including a plurality of types of substances having different excitation wavelengths and detects the spectrum of light emitted from the observation object.
  • a method for observing the spectrum wherein the wavelength of the light to be irradiated is sequentially acquired from the spectrum data of the substance having a long excitation wavelength while switching the wavelength between the excitation wavelengths of the plurality of kinds of substances.
  • the excitation wavelength of the substance is excluded from the detection wavelength of the spectrum.
  • the acquired spectrum data may be synthesized.
  • the spectrum observation system of the present invention includes an irradiation means for irradiating light to an observation object including a plurality of types of substances having different excitation wavelengths, and a spectrum of light emitted from the observation object.
  • a spectrum observing device comprising: a detecting means for detecting the light; a wavelength switching means for switching the wavelength of the light emitted by the irradiating means; and A control device that sequentially acquires from the spectrum data of the substance having a long excitation wavelength while switching between the excitation wavelengths of each of the plurality of types of substances, and when acquiring the spectrum data of each substance, And a movable shading mechanism that excludes the excitation wavelength of the substance from the detection wavelength of the spectrum.
  • another spectrum observation system of the present invention includes an irradiating means for irradiating light to an observation object including a plurality of types of substances having different excitation wavelengths, and light emitted from the observation object.
  • a spectrum observing device comprising: a detecting unit that detects a spectrum; a wavelength switching unit that switches a wavelength of light emitted by the irradiation unit; and a wavelength switching unit that controls the wavelength switching unit, thereby controlling the wavelength of the irradiated light.
  • a plurality of types of wavelengths A controller that sequentially acquires spectrum data of a substance having a long excitation wavelength while switching between the excitation wavelengths of the substance; and a range switching unit that switches a detection wavelength range of the detection unit. Is characterized in that, when the spectrum data of each substance is acquired, the excitation wavelength of the substance is excluded from the detected wavelength of the spectrum by controlling the range switching means.
  • control device may synthesize the acquired spectrum data.
  • [001 1] According to the present invention, a spectrum observation method and a spectrum observation capable of acquiring necessary data without omission in observing an object including a plurality of types of substances having different excitation wavelengths. The system is realized.
  • FIG. 1 is a block diagram of this system.
  • FIG. 2 is a diagram showing characteristics peculiar to G F P.
  • FIG. 3 is a diagram showing characteristics peculiar to R F P.
  • FIG. 4 is an overview of the operation flow chart of C P U 37 according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram visualizing the contents of each step in FIG.
  • FIG. 6 is a diagram showing characteristics unique to C F P.
  • FIG. 7 is a summary of the operation flow chart of C P U 37 according to the second embodiment.
  • the present embodiment is an embodiment of a spectral imaging fluorescence laser microscope system.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of the present system.
  • the system includes a confocal microscope 1, a spectrum detector 2, a controller 3, and a monitor 4.
  • the confocal microscope 1 includes a specimen stage 1 1, a laser unit 1 2, an optical fiber / 1 3, a collimator lens 1 4, a dichroic mirror 1 5, an XY scanner 1 6, an objective A lens 17, an imaging lens 18, a pinhole plate 19, and an optical fiber 20 are provided.
  • the specimen 1 OA which is multiple-stained with multiple types of fluorescent reagents, is supported. Details of these fluorescent reagents will be described later.
  • the laser unit 12 includes, for example, a plurality of types of laser light sources 1 21, 1 22,
  • the wavelength tunable filter 1 24 (or each laser shutter 100) operates the wavelength of the emitted laser light (laser wavelength). Can be switched.
  • the laser wavelength switches between three wavelengths of 543 nm, 488 nm, and 440 nm.
  • the laser light emitted from the laser unit 1 2 passes through an optical fiber 1 3, a collimating lens 1 4, a dichroic mirror 1 5, an XY scanner 1 6, and an objective lens 1 7 in order. It focuses on one point and excites a specific fluorescent substance present there.
  • the fluorescence generated by the fluorescent substance is transmitted through an objective lens 1 7, an XY scanner 1 6, a dichroic mirror 1 5, an imaging lens 1 8, a pinhole plate 1 9, and an optical fiber 20 in this order. Led to. In the pinhole plate 19, extra light is cut.
  • the spectrum detector 2 includes a collimating lens 21, a grating 22, a grating stage 22M, a condenser lens 23, a light shielding plate 30, a slide mechanism 30M, a spectrum detector 24, and a sampling circuit 2 And 5 are provided.
  • the grating 22 is supported by a grating stage 22M, and the insertion angle with respect to the optical path can be adjusted.
  • the grating stage 22 M together with the grating 22, supports the gratings 22 'and 22 "with different grating pitches, and the grating inserted in the optical path can be switched between the gratings 22, 22' and 22". it can.
  • the spectrum detector 24 is formed by arranging a plurality of photomultiplier tubes (PMT) 4A that are sensitive to weak fluorescent light in a one-dimensional array.
  • the electric power necessary for the spectrum detector 24 is supplied from a high voltage power supply 34 P in the control unit 3.
  • One PMT 4 A constitutes one channel of the spectrum detector 24.
  • the number of PMT4A arrays (that is, the number of channels of the spectrum detector 24) is 32.
  • the light shielding plate 30 is a strip-shaped mask for shielding one of the channels of the spectrum detector 24, and is supported by the slide mechanism 3OM.
  • the sliding mechanism 3 OM can switch the light-shielded channel by sliding the light-shielding plate 30 in the channel arrangement direction.
  • the slide mechanism 3 OM can also open all 32 channels by placing the light shielding plate 30 in the retracted position.
  • each wavelength component When the fluorescence guided to the spectrum detector 2 is incident on the grating 22 via the collimator lens 21, it is spectrally decomposed into each wavelength component.
  • Each wavelength component individually enters the 32 channels of the spectrum detector 24 and is converted into an electrical signal corresponding to its intensity. Since light does not enter the channel in which the light shielding plate 30 is disposed, an electrical signal corresponding to zero intensity is generated in the channel.
  • the 32 electrical signals generated by the 32 channels are sampled at a certain timing by the sampling circuit 25 and are sequentially transmitted to the control unit 3.
  • the 32 electrical signals transmitted at this time can be obtained from the spectrum data of one point (condensing point of laser beam) of sample 1 OA.
  • the control unit 3 includes an image processing circuit 36, a CPU 37, an XY scanner drive circuit 38, a grating drive circuit 32 C, a light shielding plate drive circuit 30 C, and a high-voltage power supply 34P. It is done.
  • the CPU 37 is equipped with a ROM for storing an operation program of the CPU 37 and a RAM used for primary storage during the operation of the CPU 37.
  • the image processing circuit 36 is provided with a plurality of frames. It is assumed that a memory that can store image data (described later) is installed. To do.
  • the CPU 37 drives the XY scanner 16 of the confocal microscope 1 via the XY scanner driving circuit 38 to scan the sample 1 OA two-dimensionally at the laser light focusing point. Further, the CPU 37 repeatedly instructs the sampling circuit 25 to perform sampling during this scanning, and sequentially captures the spectrum data of each point of the sample 1 OA into the image processing circuit 36. According to this operation of the CPU 37, before the two-dimensional scan of the sample 1 OA is completed, the spectrum image data of one frame of the sample 10 is transferred to the memory in the image processing circuit 36. It has the value for 32 channels as spectrum data.
  • the operation of the CPU 37 for acquiring spectral image data in this way is referred to as “spectral imaging”.
  • the image processing circuit 36 generates monitor display image data as necessary based on the spectrum image data acquired by the spectrum imaging, and sends it to the monitor 4.
  • the spectral image data can be continuously acquired (real-time imaging).
  • the CPU 37 is used for spectral imaging.
  • the CPU 37 drives the grating stage 22 M via the grating driving circuit 32 C and drives the slide mechanism 3 OM via the light shielding plate driving circuit 3 OC during spectrum imaging.
  • the detection wavelength range of the spectrum detector 24 can be changed.
  • the detection wavelength range of the spectrum detector 24 in order to expand or contract the detection wavelength range of the spectrum detector 24, it is only necessary to switch the grating inserted in the optical path between the gratings 22, 22 'and 22 ". However, the channel of the spectrum detector 24 Since the number is unchanged, if the detection wavelength range is expanded or contracted, the wavelength resolution changes accordingly. To do. For example, when the grating 22 is inserted into the optical path, the detection wavelength range is 80 nm and the wavelength resolution is 2.5 nn. When the grating 22 'is inserted into the optical path, the detection wavelength range is 160 nm and the wavelength resolution is When the grating 22 "is inserted, the detection wavelength range is 320 nm and the wavelength resolution is 10 nm.
  • the insertion angle of the grating being inserted Can be changed.
  • the light shielding plate 30 is connected to the channel corresponding to the specific wavelength component. May be arranged.
  • specimen 1 OA of this system will be described.
  • Specimen 1 OA is a specimen of biological cells that are multiple-stained with two types of fluorescent reagents, GFP and RFP.
  • FIG. 2 is a diagram showing characteristics peculiar to G F P
  • FIG. 3 is a diagram showing characteristics peculiar to R F P.
  • the dotted line indicates the absorption spectrum
  • the solid line indicates the radiation spectrum
  • the thick straight line indicates the excitation wavelength.
  • the excitation wavelength of G F P is 488 nm
  • the wavelength range of the emission spectrum of G F P is about 450 nm to about 650 nm.
  • the wavelength range of the RFP radiation spectrum is about 550 to about 7 OO nm.
  • the 543 nm channel is removed from the detection wavelength range.
  • Spectral imaging may be performed while exciting with nm laser light.
  • data indicating the RFP contribution is reflected mainly in the data on the longer wavelength side than 543 nm.
  • CPU 37 operates according to the following procedure to avoid the above problems.
  • FIG. 4 is an operation flowchart of the CPU 37. The contents of each step in Fig. 4 are visualized as shown in Fig. 5.
  • the CPU 37 sets the detection wavelength range of the spectrum detector 24 to 490 to 650 nm and the wavelength resolution to 5 nm (step S 11).
  • This detection wavelength range (490-650 nm) covers the main wavelength range of the emission spectrum of GFP and the main wavelength range of the emission spectrum of RFP, and deviates from the excitation wavelength of GFP (488 nm) Yes.
  • the CPU 37 sets the light shielding destination of the light shielding plate 30 to a channel of 543 nm and removes the channel from the detection wavelength range (step S 12). This wavelength is the RFP excitation wavelength.
  • the CPU 37 sets the laser wavelength to 543 nm and performs spectral imaging (step S13).
  • the CPU 37 regards all the acquired spectral image data on the wavelength longer side than 543 nm (551 nm to the upper limit) as valid data.
  • this 543 nm excitation light excites RFP, but does not excite GFP with a shorter excitation wavelength, so this effective data is considered to reflect only RFP data.
  • step S 14 the CPU 37 places the light shielding plate 30 at the retracted position. As a result, all channels from 490 to 650 nm are in the detection wavelength range.
  • the CPU 37 sets the laser wavelength to 488 nm and performs spectral imaging (step S15).
  • the CPU 37 regards all data (496 nm to the upper limit) longer than 488 nm as valid data from the acquired spectral image data.
  • this 488 nm excitation light excites GFP
  • this effective data reflects GFP data.
  • the 488 nm excitation light slightly excites the RFP, and the effective data wavelength range includes the wavelength range of the RFP emission spectrum. Therefore, it is considered that the R F P data is slightly reflected in this valid data.
  • the CPU 37 obtains the valid data (551 ⁇ m to the upper limit spectrum image data) acquired in step S 13 and the effective data (496 nm to the upper limit spectrum acquired in step S 15).
  • Image data is read from the memory in the image processing circuit 36, and these valid data are synthesized (step S16).
  • This composition is addition (integration) composition, and among these valid data, the values of the same pixel of the same channel are added (integrated).
  • Spectral image data (composite spectral image data) obtained after addition (accumulation) is It can be regarded as equivalent to the spectrum image data when RFP is simultaneously excited. Therefore, the CPU 37 gives an instruction to the image processing circuit 36 so as to perform a known unmix operation on the synthesized spectral image data. By this unmixing, the GFP data and the RFP data contained in the synthesized spectrum image data are completely separated, and the contributions of GFP and RFP are accurately known.
  • the acquired information is output to the monitor 4 as necessary.
  • Information necessary for unmixing (information on the emission spectrum of GFP and the information on the emission spectrum of RFP) is obtained by using an interface (not shown) provided in the control unit 3 together with the information on the excitation wavelength described above. Is input to the system from the outside in advance.
  • the CPU 37 of this system changes the wavelength of the laser light to two fluorescent reagents (R
  • Spectral imaging was performed twice while switching between the excitation wavelengths of FP and GFP), mainly spectral data related to RFP (valid data in step S1 3) and spectral data related mainly to GFP (step S). 1 (5 valid data) are obtained sequentially.
  • the CPU 37 of the present system overlaps the wavelength range of the effective data acquired in step S15 with the wavelength range of the effective data acquired in step S13, and then combines the two.
  • the image processing circuit 36 of this system then performed an unmix operation on the synthesized spectral data. Therefore, 2 Spectral data of two fluorescent reagents can be acquired more accurately.
  • the CPU 37 of the present embodiment overlaps the wavelength range of the effective data acquired in step S 15 with the wavelength range of the effective data acquired in step S 13, but separates both wavelength ranges. You may let them. In that case, the synthesis procedure (step S 16) may be omitted.
  • the CPU 37 creates an image showing the spatial distribution of the RFP in the sample 10 based on the valid data obtained in step S 1 3, and sets the sample 10 in the sample 10 based on the valid data obtained in step S 15.
  • An image showing the spatial distribution of GFP can be created and displayed on the monitor 4.
  • This embodiment is also an embodiment of a spectral imaging fluorescent laser microscope system. Only the differences from the first embodiment will be described here. The difference is that the fluorescent reagent added to Sample 1 OA
  • Specimen 1 There are three types of fluorescent reagents added to OA: GFP and RFP. CFP, and characteristics unique to GFP and RFP are as described in the first embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing characteristics unique to CFP.
  • the dotted line indicates the absorption spectrum
  • the solid line indicates the radiation spectrum
  • the bold line indicates the excitation wavelength.
  • the excitation wavelength of CFP is 440 nm, which is shorter than that of GFP and RFP
  • the wavelength range of the emission spectrum of CFP is about 450 nm to about 600 nm.
  • data indicating CFP contribution appears mainly in the data on the longer wavelength side from 440 nm.
  • FIG. 7 is an operation flowchart of the CPU 37 of the present embodiment. The contents of each step in Figure 7 are visualized as shown in Figure 8.
  • the CPU 37 sets the detection wavelength range of the spectrum detector 24 to 440 to 600 nm and the wavelength resolution to 10 nm (step S 21).
  • This detection wavelength range (440-600 nm) covers the main wavelength range of the CFP emission spectrum, the main wavelength range of the GFP emission spectrum, and the main wavelength range of the RFP emission spectrum.
  • the CFP excitation wavelength deviates from 440 nm.
  • the CPU 37 sets the light shielding destination of the light shielding plate 30 to a channel of 543 nm and removes the channel from the detection wavelength range (step S 22).
  • This wavelength is the RFP excitation wavelength.
  • the CPU 37 sets the laser wavelength to 543 nm and performs spectral imaging (step S23).
  • the CPU 37 regards all the acquired spectral image data on the wavelength longer than 543 nm (558 nm to the upper limit) as valid data.
  • this 543 nm excitation light excites RF P, but does not excite GFP and CFP with shorter excitation wavelengths, so this valid data reflects only RFP data. it is conceivable that.
  • the CPU 37 sets the light shielding destination of the light shielding plate 30 to a channel of 488 nm, and removes the channel from the detection wavelength range (step S 24).
  • the CPU 37 sets the laser wavelength to 488 nm and performs spectral imaging (step S25).
  • the CPU 37 regards the acquired spectrum image data as valid data that is longer than 488 nm and shorter than 543 nm (503 nm to 528 nm).
  • this valid data reflects the GFP data.
  • the 488 nm excitation light slightly excites the RFP, but this valid data wavelength range does not include the RFP radiation spectrum. Torr wavelength range is almost not included. Therefore, it is considered that this valid data reflects only GFP data.
  • step S 26 the CPU 37 places the light shielding plate 30 at the retracted position.
  • the CPU 37 sets the laser wavelength to 440 nm and performs spectral imaging (step S 27).
  • CPU 37 regards the acquired spectrum image data as valid data for data longer than 440 nm and shorter than 488 nm (455 nm to 473 nm) (see Figure 8). .
  • this 440 nm excitation light excites CFP
  • CFP data is reflected in this effective data.
  • the excitation light at 440 nm slightly excites GFP, but the wavelength range of this effective data hardly includes the wavelength range of the emission spectrum of GFP. Therefore, it is considered that only the C F P data is reflected in this valid data.
  • the CPU 37 reads the valid data (558 ⁇ m to the upper limit spectrum image data) acquired in step S23 from the memory in the image processing circuit 36, and based on this, the RFP of the sample 10 is read. Create an image showing the spatial distribution and display it on the monitor 4. Similarly, the CPU 37 reads the effective data (spectral image data of 503 nm to 528 nm) obtained in step S 25 from the memory in the image processing circuit 36, and based on that, the spatial distribution of G FP in the sample 10 An image showing is displayed and displayed on the monitor 4.
  • the CPU 37 reads the valid data (spectral image data from 455 nm to 473 nm) acquired in step S27 from the memory in the image processing circuit 36, and based on the read data in the sample 10 An image showing the spatial distribution of CFP is created and displayed on the monitor 4 (step S28).
  • the CPU 37 of this system changes the wavelength of the laser beam to three fluorescent reagents (R
  • Spectral imaging was performed three times while switching between the excitation wavelengths of FP, GFP, and CFP), and spectral data related to RFP (valid data in step S2 3) and spectral data related to GFP (in step S25) Valid data) and spectrum data related to CFP (valid data in step S27) are acquired sequentially.
  • the CPU 37 in this embodiment includes the wavelength range (A) of the effective data acquired in step S 23, the wavelength range (B) of the effective data acquired in step S 25, and the step S 2
  • the wavelength range (C) of the effective data acquired in 8 was separated, but (B) was expanded to the longer wavelength side and overlapped with (A), and (C) was expanded to the longer wavelength side (B) And (A) may be duplicated. In that case, three valid data may be combined and unmixed.
  • the fluorescence microscope system has been described.
  • the present invention is not limited to obtaining fluorescence spectrum data generated in a specimen, but also using phosphor spectrum data generated in a specimen. It is also effective when acquiring.
  • the microscope system provided with the imaging function has been described.
  • the present invention can obtain spectrum data of a representative point (a plurality of points or a single point) of a specimen. Is also effective.
  • part or all of the processing by C P U 37 may be executed by a dedicated circuit other than C P U. Further, a part or all of the processing by C P U 37 may be executed by a computer connected to the control unit 3. In this case, a processing program to be executed by the computer may be installed in the computer in advance.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

　本発明は、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物の観察において、必要なデータを欠落無く取得することを目的とする。そのために、本発明のスペクトル観察方法は、励起波長の異なる複数種類の物質（ＲＦＰ，ＧＦＰなど）を含む被観察物へ光を照射すると共に、その被観察物から放射される光のスペクトルを検出するスペクトル観察方法であって、前記照射する光の波長を前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、前記励起波長の長い物質のスペクトルデータから順次取得し（Ｓ１３，Ｓ１５）、前記各物質のスペクトルデータ取得の際は、前記スペクトルの検出波長から、その物質の励起波長を除外する（Ｓ１２）。

Description

明 細 書
スぺクトル観察方法及びスぺクトル観察システム
技術分野
[0001 ] 本発明は、 複数種類の蛍光試薬で多重染色された標本など、 励起波長の異 なる複数種類の物質を含む被観察物のスぺクトル観察方法、 及びスぺクトル 観察システムに関する。
背景技術
[0002] 複数種類の蛍光試薬で多重染色された標本の観察には、 スぺクトルィメー ジング蛍光レーザ顕微鏡が有効である （特許文献 1など参照） 。 このレーザ 顕微鏡は、 標本へ励起光を照射し、 そこで発生した蛍光をグレーティング （ 回折格子） 等で分光し、 分光後の各波長成分の強度をスペクトルディテクタ で検出する。 このレーザ顕微鏡でも、 他の蛍光顕微鏡と同様、 標本の表面や レンズ表面などで反射する余分な励起光は、 観察の妨げとならないよう何れ かの箇所でカツ卜する必要がある。
[0003] 但し、 スぺクトル検出を行うこのレーザ顕微鏡では、 蛍光の波長帯域を広 く確保しておく必要があるので、 蛍光の光路へバリアフィルタを挿入する代 わりに、 スペクトルディテクタのうち、 励起波長に対応する特定のチャンネ ルをスぺクトルディテクタの検出波長範囲から外す （チャンネル前に遮光板 を配置 （固定） する） ことになる。 標本が 2種類の蛍光試薬で染色されたと きには、 それらの励起波長に対応する 2つのチャンネルの各々を検出波長範 囲から外し、 それらの蛍光試薬を同時に又は順次励起してスぺクトルィメー ジングを行えばよいと考えられる。
特許文献 1 ：特表 2 0 0 4— 5 0 6 1 9 1号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] しかし、 このようなスペクトルイメージングでは、 必要なデータの一部が 欠落する可能性がある。 なぜなら、 或る蛍光試薬の励起波長が他の蛍光試薬 の放射スぺクトルの波長範囲内に含まれていた場合、 必要な波長が検出波長 範囲から外されてしまう （欠落する） からである。
[0005] そこで本発明は、 励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物の観察 において、 必要なデータを欠落無く取得することの可能なスぺクトル観察方 法及びスぺクトル観察システムを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明のスぺクトル観察方法は、 励起波長の異なる複数種類の物質を含む 被観察物へ光を照射すると共に、 その被観察物から放射される光のスぺク卜 ルを検出するスぺクトル観察方法であって、 前記照射する光の波長を前記複 数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、 前記励起波長の長い 物質のスぺクトルデータから順次取得し、 前記各物質のスぺクトルデータ取 得の際は、 前記スぺクトルの検出波長から、 その物質の励起波長を除外する ことを特徴とする。
[0007] なお、 前記取得した前記スぺクトルデータを合成してもよい。
[0008] また、 本発明のスぺクトル観察システムは、 励起波長の異なる複数種類の 物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段と、 前記被観察物から放射され る光のスぺクトルを検出する検出手段と、 前記照射手段が照射する光の波長 を切り替える波長切替手段と、 を備えたスペクトル観察装置と、 前記波長切 替手段を制御することにより、 前記照射する光の波長を前記複数種類の物質 の各々の励起波長の間で切り替えながら、 前記励起波長の長い物質のスぺク トルデータから順次取得する制御装置と、 前記各物質のスぺクトルデータ取 得の際は、 前記スぺクトルの検出波長から、 その物質の励起波長を排除する 可動式遮光機構と、 を備えたことを特徴とする。
[0009] また、 本発明の別のスぺクトル観察システムは、 励起波長の異なる複数種 類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段と、 前記被観察物から放射 される光のスぺクトルを検出する検出手段と、 前記照射手段が照射する光の 波長を切り替える波長切替手段と、 を備えたスペクトル観察装置と、 前記波 長切替手段を制御することにより、 前記照射する光の波長を前記複数種類の 物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、 前記励起波長の長い物質のス ぺクトルデータから順次取得する制御装置と、 前記検出手段の検出波長範囲 を切り替える範囲切替手段とを備え、 前記制御装置は、 前記範囲切替手段を 制御することにより、 前記各物質のスぺクトルデータ取得の際は、 前記スぺ クトルの検出波長から、 その物質の励起波長を排除することを特徴とする。
[0010] なお、 前記制御装置は、 前記取得した前記スぺクトルデータを合成しても よい。
発明の効果
[001 1 ] 本発明によれば、 励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物の観察 において、 必要なデータを欠落無く取得することの可能なスぺクトル観察方 法及びスぺクトル観察システムが実現する。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1 ]本システムの構成図である。
[図 2] G F Pに固有の特性を示す図である。
[図 3] R F Pに固有の特性を示す図である。
[図 4]第 1実施形態の C P U 3 7の動作フローチヤ一卜である。
[図 5]図 4の各ステップの内容を可視化した図である。
[図 6] C F Pに固有の特性を示す図である。
[図 7]第 2実施形態の C P U 3 7の動作フローチヤ一卜である。
[図 8]図，の各ステップの内容を可視化した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0013] [第 1実施形態]
以下、 本発明の第 1実施形態を説明する。 本実施形態は、 スぺクトルィメ 一ジング蛍光レーザ顕微鏡システムの実施形態である。
[0014] 先ず、 本システムの構成を説明する。
[0015] 図 1は、 本システムの構成図である。 図 1に示すとおり、 本システムには 、 共焦点顕微鏡 1と、 スペクトル検出部 2と、 制御部 3と、 モニタ 4とが備 えられる。 [0016] 共焦点顕微鏡 1には、 標本ステージ 1 1と、 レーザュニッ卜 1 2と、 光フ アイ/ 1 3と、 コリメートレンズ 1 4と、 ダイクロイツクミラー 1 5と、 X Yスキャナ 1 6と、 対物レンズ 1 7と、 結像レンズ 1 8と、 ピンホール板 1 9と、 光ファイバ 20とが備えられる。 標本ステージ 1 1上には、 複数種類 の蛍光試薬で多重染色された標本 1 OAが支持される。 これら蛍光試薬の詳 細については、 後述する。
[0017] レーザュニッ卜 1 2は、 例えば、 複数種類のレーザ光源 1 21， 1 22，
1 23と、 波長可変フィルタ （AOT F等） 1 24とを備えており、 波長可 変フィルタ 1 24 (又は各レーザシャツタ 1 00) の動作により、 出射する レーザ光の波長 （レーザ波長） を切り替えることができる。 ここでは、 レー ザ波長が、 543 nm， 488 n m, 440 nmの 3波長の間で切リ替わる とする。
[0018] このレーザユニット 1 2から射出したレーザ光は、 光ファイバ 1 3、 コリ メートレンズ 1 4、 ダイクロイツクミラー 1 5、 XYスキャナ 1 6、 対物レ ンズ 1 7を順に介して標本 1 OAの 1点へ集光し、 そこに存在している特定 の蛍光物質を励起する。 その蛍光物質で発生した蛍光は、 対物レンズ 1 7、 XYスキャナ 1 6、 ダイクロイツクミラー 1 5、 結像レンズ 1 8、 ピンホー ル板 1 9、 光ファイバ 20を順に介してスぺクトル検出部 2へ導かれる。 ピ ンホール板 1 9では、 余分な光線がカツ卜される。
[0019] スペクトル検出部 2には、 コリメートレンズ 21と、 グレーティング 22 と、 グレーティングステージ 22Mと、 集光レンズ 23と、 遮光板 30と、 スライド機構 30Mと、 スぺクトルディテクタ 24と、 サンプリング回路 2 5とが備えられる。
[0020] グレーティング 22は、 グレーティングステージ 22 Mによって支持され ており、 光路に対する挿入角度が調節可能になっている。 グレーティングス テージ 22 Mは、 グレーティング 22と共に、 格子ピッチの異なるグレーテ イング 22' ， 22" を支持しており、 光路に挿入されるグレーティングを 、 グレーティング 22， 22' ， 22" の間で切り替えることもできる。 [0021] スぺクトルディテクタ 24は、 強度の微弱な蛍光に感応する複数の光電子 増倍管（PMT) 4Aを、 一次元アレイ状に配列してなる。 このスペクトルデ ィテクタ 24に必要な電力は、 制御部 3内の高圧電源 34 Pから供給される 。 1つの PMT 4 Aがスぺクトルディテクタ 24の 1つのチャンネルを構成 する。 以下、 PMT4Aの配列数 （すなわちスペクトルディテクタ 24のチ ヤンネル数） を、 32とする。
[0022] 遮光板 30は、 スペクトルディテクタ 24の何れか 1つのチャンネルを遮 光するための短冊状のマスクであり、 スライド機構 3 OMによって支持され ている。 スライド機構 3 OMは、 遮光板 30をチャンネルの配列方向へスラ イドさせ、 それにより遮光されるチャンネルを切り替えることができる。 ま た、 スライド機構 3 OMは、 遮光板 30を退避位置へ配置することで、 32 個のチヤンネルの全てを開放することもできる。
[0023] このスぺクトル検出部 2に導かれた蛍光は、 コリメートレンズ 21を介し てグレーティング 22へ入射すると、 各波長成分にスぺクトル分解される。 各波長成分は、 スぺクトルディテクタ 24の 32個のチャンネルへ個別に入 射し、 その強度に応じた電気信号へとそれぞれ変換される。 なお、 遮光板 3 0の配置されたチャンネルには光が入射しないので、 そのチャンネルでは強 度ゼロに相当する電気信号が生成される。 32個のチャンネルで生成された 32個の電気信号は、 サンプリング回路 25によって或るタイミングでサン プリングされ、 制御部 3へと順次送出される。 このとき送出される 32個の 電気信号が、 標本 1 OAの 1点 （レーザ光の集光点） のスぺクトルデータで める。
[0024] 制御部 3には、 画像処理回路 36と、 CPU 37と、 XYスキャナ駆動回 路 38と、 グレーティング駆動回路 32 Cと、 遮光板駆動回路 30 Cと、 高 圧電源 34 Pとが備えられる。 以下、 CPU 37には、 CPU 37の動作プ ログラムを格納する ROMと、 CPU 37の動作中の一次記憶に用いられる RAMとが搭載されており、 画像処理回路 36には、 複数フレーム分のスぺ クトル画像データ （後述） を格納可能なメモリが搭載されているとして説明 する。
[0025] CPU 37は、 XYスキャナ駆動回路 38を介して共焦点顕微鏡 1の XY スキャナ 1 6を駆動することにより、 レーザ光の集光点で標本 1 OAを 2次 元的に走査する。 また、 CPU 37は、 この走査中にサンプリング回路 25 に対し繰り返しサンプリングの指示を与え、 標本 1 OAの各点のスぺクトル データを画像処理回路 36へと順次取り込む。 CPU 37のこの動作による と、 標本 1 OAの二次元走査が終了するまでに、 画像処理回路 36内のメモ リへ、 標本 1 0 の1フレーム分のスぺクトル画像データ （個々のピクセル は、 スペクトルデータとして 32チャンネル分の値を持つ。 ） が格納される ことになる。 以下、 このように、 スペクトル画像データを取得するための C PU37の動作を、 「スペクトルイメージング」 という。 画像処理回路 36 は、 このスぺクトルイメージングで取得されたスぺクトル画像データに基づ き、 必要に応じてモニタ表示用の画像データを生成し、 モニタ 4へ送出する
[0026] なお、 CPU 37がスぺクトルイメージングを繰り返せば、 スぺクトル画 像データの連続取得 （リアルタイムイメージング） も可能である。
[0027] また、 CPU37は、 スペクトルイメージングに当たり、 レーザユニット
1 2内の波長可変フィルタ 1 24 (又は各レーザシャツタ 1 00) へ指示を 与えることにより、 レーザ光のオンオフ制御や、 レーザ光の波長切り替え制 御を行うことができる。
[0028] また、 CPU37は、 スペクトルイメージングに当たり、 グレーティング 駆動回路 32 Cを介してグレーティングステージ 22 Mを駆動し、 また、 遮 光板駆動回路 3 OCを介してスライド機構 3 OMを駆動することにより、 ス ぺクトルディテクタ 24の検出波長範囲を変化させることができる。
[0029] 因みに、 スぺクトルディテクタ 24の検出波長範囲を拡縮するには、 光路 に揷入されるグレーティングをグレーティング 22， 22' ， 22" の間で 切り替えればよい。 但し、 スペクトルディテクタ 24のチャンネル数は不変 なので、 その検出波長範囲を拡縮させると、 それに応じて波長分解能も変化 する。 例えば、 グレーティング 22が光路へ挿入されたときには、 検出波長 範囲は 80 n m、 波長分解能は 2. 5 n nとなり、 グレーティング 22' が 光路へ挿入されたときには、 検出波長範囲は 1 60 nm、 波長分解能は 5 η mとなり、 グレーティング 22" が挿入されたときには、 検出波長範囲は 3 20 nm、 波長分解能は 1 0 nmとなる。
[0030] また、 スぺクトルディテクタ 24の検出波長範囲の上限を短波長側に変更 したり、 検出波長範囲の下限を長波長側に変更したりするには、 挿入中のグ レーティングの挿入角度を変化させればよい。
[0031] また、 スぺクトルディテクタ 24の検出波長範囲から特定の波長成分を除 外するには、 スペクトルディテクタ 24の 32個のチャンネルのうち、 その 特定の波長成分に対応するチャンネルに遮光板 30を配置すればよい。
[0032] 次に、 本システムの標本 1 OAを説明する。
[0033] 標本 1 OAは、 G F P、 R F Pの 2種類の蛍光試薬で多重染色された生体 細胞の標本である。 図 2は、 G F Pに固有の特性を示す図であり、 図 3は、 R F Pに固有の特性を示す図である。 図 2， 図 3において、 点線で示すのは 、 吸収スぺクトルであり、 実線で示すのは、 放射スぺクトルであり、 太い直 線で示すのは、 励起波長である。
[0034] 先ず、 図 2に示すとおり、 G F Pの励起波長は 488 nmであり、 G F P の放射スペクトルの波長範囲は、 約 450 nm〜約 650 nmである。 この ような G F Pの標本 1 OAにおける寄与を本システムで知るためには、 48 8 nmのチャンネルを検出波長範囲から外し、 488 nmのレーザ光で励起 しながらスぺクトルイメージングを行えばよい。 取得されたスぺクトル画像 データのうち、 主として 488 nmより長波長側のデータに、 G F Pの寄与 を示すデータ （G F Pデータ） が反映される。
[0035] 一方、 図 3に示すとおり、 R F Pの励起波長は、 G F Pのそれよりも長い
543 nmであり、 R F Pの放射スペクトルの波長範囲は、 約 550〜約 7 O O nmである。 このような R F Pの標本 1 0 Aにおける寄与を本システム で知るためには、 543 nmのチャンネルを検出波長範囲から外し、 543 nmのレーザ光で励起しながらスぺクトルイメージングを行えばよい。 取得 されたスぺクトル画像データのうち、 主として 543 nmより長波長側のデ ータに、 R F Pの寄与を示すデータ （R F Pデータ） が反映される。
[0036] 但し、 G F Pと R F Pとを同時励起してスペクトルイメージングを行おう とすると、 488 nmのチャンネルと 543 n mのチャンネルとの双方を検 出波長範囲から外す必要があるので、 G F Pデータの比較的重要な部分 （5 43 n mの近傍の部分） が欠落する。
[0037] また、 G F Pと R F Pとを別々に励起してスペクトルイメージングを行う としても、 励起波長の短い G F Pのスペクトルイメージング （つまり励起に 高いエネルギーを要する） を、 励起波長の長い R F Pのスペクトルイメージ ング （つまり励起に高いエネルギーを要しない） よりも先に行うと、 R F P データの取得前に R F Pが反応し、 その退色が始まってしまうので、 R F P データを正確に取得することができない。 このことは、 G F Pの励起波長 （ 図 2の太い直線） が、 R F Pの吸収スペクトル （図 3点線） の波長範囲に含 まれることからも明らかである。
[0038] なお、 標本 1 OAに添加された蛍光試薬の各々の励起波長は、 本システム の CPU 37が認識しているものとする。 それらの励起波長の情報は、 制御 部 3に設けられた不図示のインタフェースを介して予め外部から本システム へ入力される。
[0039] 次に、 CPU 37の動作手順を説明する。 CPU 37は、 以上の問題を回 避するため、 以下の手順で動作する。
[0040] 図 4は、 CPU 37の動作フローチャートである。 図 4中の各ステップの 内容を可視化すると、 図 5に示すとおりになる。 これらの図 4， 図 5に示す とおり、 先ず、 CPU 37は、 スぺクトルディテクタ 24の検出波長範囲を 490〜 650 n m、 波長分解能を 5 n mに設定する （ステップ S 1 1) 。 この検出波長範囲 （490〜650 nm) は、 G F Pの放射スペクトルの主 な波長範囲と、 R F Pの放射スペクトルの主な波長範囲とをカバーし、 かつ 、 G F Pの励起波長 （488 nm) から外れている。 [0041] 次に、 CPU 37は、 遮光板 30の遮光先を、 543 nmのチャンネルに 設定し、 そのチャンネルを検出波長範囲から外す （ステップ S 1 2) 。 この 波長は、 RFPの励起波長である。
[0042] その状態で、 CPU 37は、 レーザ波長を 543 nmに設定し、 スぺクト ルイメージングを行う （ステップ S 1 3) 。 CPU 37は、 取得したスぺク トル画像データのうち、 543 nmよりも長波長側 （551 nm〜上限） の 全データを、 有効データとみなす。 因みに、 この 543 nmの励起光は、 R FPを励起する一方で、 それよりも励起波長の短い G FPを励起しないので 、 この有効データには、 RFPデータのみが反映されていると考えられる。
[0043] 続いて、 CPU37は、 遮光板 30を退避位置に配置する （ステップ S 1 4) 。 これによつて、 490〜650 nmの全チャンネルが検出波長範囲と なる。
[0044] その状態で、 CPU 37は、 レーザ波長を 488 nmに設定し、 スぺクト ルイメージングを行う （ステップ S 1 5) 。 CPU 37は、 取得したスぺク トル画像データのうち、 488 nmよりも長波長側の全データ （496 nm 〜上限） を、 有効データとみなす。 因みに、 この 488 nmの励起光は、 G FPを励起するので、 この有効データには、 G FPデータが反映されている 。 また、 488 nmの励起光は、 RFPを少しだけ励起し、 有効データの波 長範囲には、 RFPの放射スペクトルの波長範囲も含まれている。 よって、 この有効データには、 R F Pデータも少しだけ反映されていると考えられる
[0045] その後、 CPU 37は、 ステップ S 1 3で取得した有効データ （551 η m〜上限のスぺクトル画像データ） と、 ステップ S 1 5で取得した有効デー タ （496 nm〜上限のスペクトル画像データ） とを画像処理回路 36内の メモリから読み出し、 これらの有効データを合成する （ステップ S 1 6) 。 この合成は、 加算 （積算） 合成であり、 これらの有効データのうち、 同一チ ヤンネルの同一ピクセルの値同士が加算 （積算） される。 加算 （積算） 後に 得られるスペクトル画像データ （合成スペクトル画像データ） は、 G FPと R F Pとを同時励起したときのスぺクトル画像データと同等とみなせる。 そ こで、 CPU 37は、 合成スペクトル画像データに対し公知のアンミックス 演算を施すよう、 画像処理回路 36へ指示を与える。 このアンミックスによ リ、 合成スぺクトル画像データに含まれている G F Pデータと R F Pデータ とが完全に分離され、 G F Pの寄与と R F Pの寄与とがそれぞれ正確に既知 となる。 これらの取得した情報は、 必要に応じてモニタ 4へと出力される。
[0046] なお、 アンミックスに必要な情報 （G F Pの放射スペクトルと R F Pの放 射スぺクトルの情報） は、 前述した励起波長の情報と共に、 制御部 3に設け られた不図示のィンタフェースを介して予め外部から本システムへ入力され る。
[0047] 以上、 本システムの CPU 37は、 レーザ光の波長を 2つの蛍光試薬 （R
F P, G F P) の各々の励起波長の間で切り替えながらスペクトルイメージ ングを 2回行い、 主に R F Pに関するスぺクトルデータ （ステップ S 1 3の 有効データ） と、 主に G F Pに関するスペクトルデータ （ステップ S 1 5の 有効データ） とをシーケンシャルに取得する。
[0048] したがって、 各々のスぺクトルイメージングにおいて、 その励起波長に対 応するチャンネルを検出波長範囲から外したにも拘わらず、 R F Pデータの 主要部と G F Pデータの主要部とを、 何れも欠落無く取得することができる
[0049] また、 本システムの CPU 37は、 励起波長の長いスぺクトルイメージン グ （R F Pに関するスペクトルイメージング） を先に行ったので、 或る蛍光 試薬に関するスぺクトルイメージングが他の蛍光試薬に干渉する （退色を招 <) という事態は、 回避される。 したがって、 2つの蛍光試薬のスペクトル データは、 それぞれ正確に取得される。
[0050] また、 本システムの CPU 37は、 ステップ S 1 5で取得する有効データ の波長範囲を、 ステップ S 1 3で取得する有効データの波長範囲に重複させ た上で、 両者を合成した。 そして、 本システムの画像処理回路 36は、 合成 されたスペクトルデータに対しアンミックス演算を施した。 したがって、 2 つの蛍光試薬のスぺクトルデータを、 より正確に取得することができる。
[0051] なお、 本実施形態の CPU37は、 ステップ S 1 5で取得する有効データ の波長範囲を、 ステップ S 1 3で取得する有効データの波長範囲に重複させ たが、 両者の波長範囲を分離させてもよい。 その場合、 合成の手順 （ステツ プ S 1 6) を省略してもよい。 例えば、 CPU 37は、 ステップ S 1 3で取 得した有効データに基づき、 標本 1 0における RFPの空間分布を示す画像 を作成し、 ステップ S 1 5で取得した有効データに基づき、 標本 1 0におけ る G F Pの空間分布を示す画像を作成し、 それらをモニタ 4へ表示してもよ い。
[0052] [第 2実施形態]
以下、 本発明の第 2実施形態を説明する。 本実施形態もスぺクトルィメー ジング蛍光レーザ顕微鏡システムの実施形態である。 ここでは、 第 1実施形 態との相違点のみ説明する。 相違点は、 標本 1 OAに添加された蛍光試薬と
、 CPU 37の動作とにある。
[0053] 先ず、 本実施形態の標本 1 OAに添加された蛍光試薬を説明する。
[0054] 標本 1 OAに添加された蛍光試薬は、 G FP、 RFP. CFPの 3種類で あり、 G FP， RFPに固有の特性は、 第 1実施形態で説明したとおりであ る。
[0055] 図 6は、 CFPに固有の特性を示す図である。 図 6において、 点線で示す のは、 吸収スぺクトルであり、 実線で示すのは、 放射スぺクトルであり、 太 い直線で示すのは、 励起波長である。 図 6に示すとおり、 CFPの励起波長 は、 G F P及び R F Pのそれよりも短い 440 nmであり、 CFPの放射ス ぺクトルの波長範囲は、 約 450 nmから約 600 n mである。 このような 〇「卩の標本1 OAにおける寄与を本システムで知るためには、 440 nm のチャンネルを検出波長範囲から外し、 440 nmのレーザ光で励起しなが らスぺクトルイメージングを行えばよい。 取得されたスぺクトル画像データ のうち、 主として 440 nmより長波長側のデータに、 CFPの寄与を示す データ （CFPデータ） が現れる。 [0056] 次に、 CPU 37の動作手順を説明する。
[0057] 図 7は、 本実施形態の CPU 37の動作フローチャートである。 図 7中の 各ステップの内容を可視化すると、 図 8に示すとおりになる。 これらの図 7 ， 図 8に示すとおり、 先ず、 CPU 37は、 スペクトルディテクタ 24の検 出波長範囲を 440〜600 nm、 波長分解能を 1 0 n mに設定する （ステ ップ S 21 ) 。 この検出波長範囲 （440〜600 nm) は、 CFPの放射 スぺクトルの主な波長範囲と、 G F Pの放射スぺクトルの主な波長範囲と、 R F Pの放射スペクトルの主な波長範囲とをカバーし、 かつ、 CFPの励起 波長 440 n mから外れている。
[0058] 次に、 CPU 37は、 遮光板 30の遮光先を、 543 nmのチャンネルに 設定し、 そのチャンネルを検出波長範囲から外す （ステップ S 22) 。 この 波長は、 RFPの励起波長である。
[0059] その状態で、 CPU 37は、 レーザ波長を 543 nmに設定し、 スぺクト ルイメージングを行う （ステップ S 23) 。 CPU 37は、 取得したスぺク トル画像データのうち、 543 nmよりも長波長側 （558 nm〜上限） の 全データを有効データとみなす。 因みに、 この 543 nmの励起光は、 RF Pを励起する一方で、 それよりも励起波長の短い G FP， CFPを励起しな いので、 この有効データには、 R F Pデータのみが反映されていると考えら れる。
[0060] 続いて、 CPU 37は、 遮光板 30の遮光先を、 488 nmのチャンネル に設定し、 そのチャンネルを検出波長範囲から外す （ステップ S 24) 。
[0061] その状態で、 CPU 37は、 レーザ波長を 488 nmに設定し、 スぺクト ルイメージングを行う （ステップ S 25) 。 CPU 37は、 取得したスぺク トル画像データのうち、 488 nmよりも長波長側かつ 543 nmよりも短 波長側のデータ （503 n m〜 528 n m) を有効データとみなす。 因みに 、 この 488 nmの励起光は、 G FPを励起するので、 この有効データには 、 G F Pデータが反映されている。 また、 488 nmの励起光は、 RFPを 少しだけ励起するが、 この有効データの波長範囲には、 RFPの放射スぺク トルの波長範囲が殆ど含まれない。 よって、 この有効データには、 G FPデ ータのみが反映されていると考えられる。
[0062] 続いて、 CPU 37は、 遮光板 30を退避位置に配置する （ステップ S 2 6) 。
[0063] その状態で、 CPU 37は、 レーザ波長を 440 nmに設定し、 スぺクト ルイメージングを行う （ステップ S 27) 。 CPU 37は、 取得したスぺク トル画像データのうち、 440 nmよりも長波長側かつ 488 nmよりも短 波長側のデータ （455 n m〜 473 n m) を有効データとみなす （図 8参 照） 。 因みに、 この 440 nmの励起光は、 CFPを励起するので、 この有 効データには、 CFPデータが反映されている。 また、 440 nmの励起光 は、 G FPを少しだけ励起するが、 この有効データの波長範囲には G FPの 放射スペクトルの波長範囲が殆ど含まれない。 よって、 この有効データには 、 C F Pデータのみが反映されていると考えられる。
[0064] その後、 CPU 37は、 ステップ S 23で取得した有効データ （558 η m〜上限のスぺクトル画像データ） を画像処理回路 36内のメモリから読み 出し、 それに基づき標本 1 0における RFPの空間分布を示す画像を作成し 、 それをモニタ 4へ表示する。 同様に、 CPU 37は、 ステップ S 25で取 得した有効データ （503 nm〜528 nmのスペクトル画像データ） を画 像処理回路 36内のメモリから読み出し、 それに基づき標本 1 0における G FPの空間分布を示す画像を作成し、 それをモニタ 4へ表示する。 また、 同 様に、 CPU 37は、 ステップ S 27で取得した有効データ （455 nm〜 473 nmのスぺクトル画像データ） を画像処理回路 36内のメモリから読 み出し、 それに基づき標本 1 0における CFPの空間分布を示す画像を作成 し、 それをモニタ 4へ表示する （ステップ S 28) 。
[0065] 以上、 本システムの CPU 37は、 レーザ光の波長を 3つの蛍光試薬 （R
F P, G F P, CFP) の各々の励起波長の間で切り替えながらスペクトル イメージングを 3回行い、 RFPに関するスペクトルデータ （ステップ S 2 3の有効データ） と、 G F Pに関するスペクトルデータ （ステップ S 25の 有効データ） と、 C F Pに関するスペクトルデータ （ステップ S 2 7の有効 データ） とをシーケンシャルに取得する。
[0066] したがって、 各々のスぺクトルイメージングにおいて、 その励起波長に対 応するチャンネルを検出波長範囲から外したにも拘わらず、 R F Pデータの 主要部と G F Pデータの主要部と C F Pデータの主要部とを、 何れも欠落無 く取得することができる。
[0067] また、 本システムの C P U 3 7は、 励起波長の長いスぺクトルイメージン グを先に行ったので、 或る蛍光試薬に関するスぺクトルイメージングが他の 蛍光試薬に干渉する （退色を招く） という事態は、 回避される。 したがって 、 3つの蛍光試薬のスペクトルデータは、 正確に取得される。
[0068] なお、 本実施形態の C P U 3 7は、 ステップ S 2 3で取得する有効データ の波長範囲 （A) と、 ステップ S 2 5で取得する有効データの波長範囲 （B ) と、 ステップ S 2 8で取得する有効データの波長範囲 （C) とを分離した が、 （B ) を長波長側へ拡大して （A) に重複させ、 （C) を長波長側へ拡 大して （B ) 及び （A) に重複させてもよい。 その場合、 3つの有効データ を合成し、 アンミックス演算を施してもよい。
[0069] [その他]
なお、 以上の各実施形態では、 蛍光顕微鏡システムを説明したが、 本発明 は、 標本で生じた蛍光のスぺクトルデータを取得するときだけでなく、 標本 で生じた燐光のスぺクトルデータを取得するときにも有効である。
[0070] また、 以上の各実施形態では、 イメージング機能を備えた顕微鏡システム を説明したが、 本発明は、 標本の代表点 （複数又は単一の点） のスぺクトル データを取得するときにも有効である。
[0071 ] また、 以上の各実施形態において、 C P U 3 7による処理の一部又は全部 を、 C P U以外の専用の回路に実行させてもよい。 また、 C P U 3 7による 処理の一部又は全部を、 制御部 3に接続されたコンピュータに実行させても よい。 その場合、 コンピュータが実行するための処理のプログラムを、 予め コンピュータへインス I ^一ルしてもよい。

Claims

請求の範囲
励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射すると共に、 その被観察物から放射される光のスぺクトルを検出するスぺクトル観察方法 であって、
前記照射する光の波長を前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で切り 替えながら、 前記励起波長の長い物質のスぺクトルデータから順次取得し、 前記各物質のスぺクトルデータ取得の際は、 前記スぺクトルの検出波長か ら、 その物質の励起波長を除外する
ことを特徴とするスぺクトル観察方法。
請求項 1に記載のスぺクトル観察方法において、
前記取得した前記スぺクトルデータを合成する
ことを特徴とするスぺクトル観察方法。
励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段 前記被観察物から放射される光のスぺクトルを検出する検出手段と、 前記照射手段が照射する光の波長を切り替える波長切替手段と、 を備えたスぺクトル観察装置と、
前記波長切替手段を制御することにより、 前記照射する光の波長を前記複 数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、 前記励起波長の長い 物質のスぺクトルデータから順次取得する制御装置と、
前記各物質のスぺクトルデータ取得の際は、 前記スぺクトルの検出波長か ら、 その物質の励起波長を排除する可動式遮光機構と、
を備えたことを特徴とするスぺクトル観察システム。
励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段 前記被観察物から放射される光のスぺクトルを検出する検出手段と、 前記照射手段が照射する光の波長を切り替える波長切替手段と、 を備えたスぺクトル観察装置と、 前記波長切替手段を制御することにより、 前記照射する光の波長を前記複 数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、 前記励起波長の長い 物質のスぺクトルデータから順次取得する制御装置と、
前記検出手段の検出波長範囲を切リ替える範囲切替手段とを備え、 前記制御装置は、
前記範囲切替手段を制御することにより、 前記各物質のスぺクトルデータ 取得の際は、 前記スぺクトルの検出波長から、 その物質の励起波長を排除す る
ことを特徴とするスぺクトル観察システム。
請求項 3又は請求項 4に記載のスぺクトル観察システムにおいて、 前記制御装置は、
前記取得した前記スぺクトルデータを合成する
ことを特徴とするスぺクトル観察システム。
PCT/JP2007/000526 2006-06-05 2007-05-16 スペクトル観察方法及びスペクトル観察システム WO2007141903A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07737182.1A EP2037255B2 (en) 2006-06-05 2007-05-16 Spectrum observation method and spectrum observation system
US12/292,924 US7724365B2 (en) 2006-06-05 2008-12-01 Spectral observation method and spectral observation system

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-156500 2006-06-05
JP2006156500A JP4899648B2 (ja) 2006-06-05 2006-06-05 スペクトル観察方法及びスペクトル観察システム

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/292,924 Continuation US7724365B2 (en) 2006-06-05 2008-12-01 Spectral observation method and spectral observation system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007141903A1 true WO2007141903A1 (ja) 2007-12-13

Family

ID=38801172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/000526 WO2007141903A1 (ja) 2006-06-05 2007-05-16 スペクトル観察方法及びスペクトル観察システム

Country Status (4)

Country Link
US (1) US7724365B2 (ja)
EP (2) EP2037255B2 (ja)
JP (1) JP4899648B2 (ja)
WO (1) WO2007141903A1 (ja)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2525706C2 (ru) * 2009-04-15 2014-08-20 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. Устройство для регулируемого по времени определения флуоресценции
WO2014103793A1 (ja) 2012-12-28 2014-07-03 株式会社ニコン 分光器及び顕微分光システム
EP3764084A1 (en) 2013-03-12 2021-01-13 Ventana Medical Systems, Inc. Digitally enhanced microscopy for multiplexed histology
DE102014111167A1 (de) 2014-08-06 2016-02-11 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie mit der Unterscheidung mindestens zweier Wellenlängenbereiche
US9995626B1 (en) * 2014-12-30 2018-06-12 Dow Global Technologies Llc Micro-fluorescence capable micro-Raman spectrometer
DE102015116435A1 (de) 2015-09-29 2017-03-30 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie mit der Unterscheidung mindestens zweier Spektralbereiche
DE102016116377A1 (de) * 2016-09-01 2018-03-01 Rheinisch-Westfälisch Technische Hochschule (RWTH) Aachen Verfahren und Vorrichtung zur Erfassung von Prozessparametern in Flüssigkulturen
US10394008B2 (en) * 2016-10-19 2019-08-27 Cornell University Hyperspectral multiphoton microscope for biomedical applications
WO2019217846A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Line excitation array detection microscopy
EP3992614A4 (en) * 2019-06-27 2023-06-28 HORIBA, Ltd. Analysis device

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020036824A1 (en) 2000-06-12 2002-03-28 Olympus Optical Co., Ltd. Scanning optical microscope and method of acquiring image
JP2002287034A (ja) * 2001-03-22 2002-10-03 Olympus Optical Co Ltd 走査型光学顕微鏡
JP2004506191A (ja) 2000-08-08 2004-02-26 カール　ツァイス　イエナ　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング 照明された試料の波長依存特性把握のための方法および装置
JP2004093286A (ja) * 2002-08-30 2004-03-25 Dkk Toa Corp 分光分析方法および分光分析装置
JP2005524051A (ja) * 2001-08-28 2005-08-11 ベイラー　カレッジ　オブ　メディスン カラーブラインド蛍光のためのパルスマルチライン励起法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5171534A (en) * 1984-01-16 1992-12-15 California Institute Of Technology Automated DNA sequencing technique
JPH04127039A (ja) * 1990-09-19 1992-04-28 Hitachi Ltd 蛍光スペクトルによる物質の同定方法
DE4330347C2 (de) 1993-09-08 1998-04-09 Leica Lasertechnik Verwendung einer Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls
JP3172060B2 (ja) * 1995-06-23 2001-06-04 沖電気工業株式会社 細胞内イオン濃度変化および膜電位変化同時測定方法
JPH09243921A (ja) * 1996-03-12 1997-09-19 Nikon Corp レーザ走査型蛍光顕微鏡
WO1999042884A1 (de) * 1998-02-19 1999-08-26 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Optische anordnung mit spektral selektivem element
DE19829981C2 (de) 1998-07-04 2002-10-17 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und Anordnung zur konfokalen Mikroskopie
JP4608043B2 (ja) * 1999-09-24 2011-01-05 オリンパス株式会社 顕微鏡用焦点検出装置
US6414805B1 (en) * 1999-12-07 2002-07-02 Chroma Technology Corp. Reflected-light type fluorescence microscope and filter cassette used therefor
JP2001356272A (ja) * 2000-06-12 2001-12-26 Olympus Optical Co Ltd 画像取得方法及び走査型光学顕微鏡
US6858852B2 (en) * 2000-08-08 2005-02-22 Carl Zeiss Jena Gmbh Method and apparatus for rapid change of fluorescence bands in the detection of dyes in fluorescence microscopy
DE10040988A1 (de) 2000-08-22 2002-03-21 Evotec Biosystems Ag Verfahren und Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben
AU2002221326A1 (en) * 2000-12-11 2002-06-24 Varian Australia Pty Ltd Method and apparatus for analysis of multiplexed samples
JP3686898B2 (ja) * 2003-01-09 2005-08-24 独立行政法人理化学研究所 蛍光エネルギー移動解析装置
DE10340020B4 (de) 2003-08-28 2005-08-11 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Vorrichtung zum selektiven Nachweis bestimmter Wellenlängenanteile eines Lichtstrahls
JP5197916B2 (ja) * 2004-09-08 2013-05-15 オリンパス株式会社 内視鏡装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020036824A1 (en) 2000-06-12 2002-03-28 Olympus Optical Co., Ltd. Scanning optical microscope and method of acquiring image
JP2004506191A (ja) 2000-08-08 2004-02-26 カール　ツァイス　イエナ　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング 照明された試料の波長依存特性把握のための方法および装置
JP2002287034A (ja) * 2001-03-22 2002-10-03 Olympus Optical Co Ltd 走査型光学顕微鏡
JP2005524051A (ja) * 2001-08-28 2005-08-11 ベイラー　カレッジ　オブ　メディスン カラーブラインド蛍光のためのパルスマルチライン励起法
JP2004093286A (ja) * 2002-08-30 2004-03-25 Dkk Toa Corp 分光分析方法および分光分析装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2037255A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2037255A1 (en) 2009-03-18
US7724365B2 (en) 2010-05-25
JP4899648B2 (ja) 2012-03-21
JP2007322389A (ja) 2007-12-13
EP3214430A1 (en) 2017-09-06
EP2037255B1 (en) 2017-06-21
EP2037255B2 (en) 2020-11-18
US20090116008A1 (en) 2009-05-07
EP2037255A4 (en) 2010-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007141903A1 (ja) スペクトル観察方法及びスペクトル観察システム
JP5485289B2 (ja) 分解能増進顕微鏡法
WO2019230878A1 (ja) 蛍光観察装置及び蛍光観察方法
US6963398B2 (en) Laser scanning microscope
JP5640273B2 (ja) 試料の高分解能光学的走査方法及び装置
JP2012132741A (ja) 時間分解蛍光測定装置、及び方法
JP2010054391A (ja) 光学顕微鏡、及びカラー画像の表示方法
US20070109634A1 (en) Microscope apparatus
JP4270884B2 (ja) 顕微鏡システム
JP4855009B2 (ja) 走査型蛍光顕微鏡
JP2006275964A (ja) 走査型蛍光顕微鏡のシェーディング補正方法
JP4331454B2 (ja) 走査型レーザ顕微鏡
JP2006125970A (ja) 分光装置および分光システム
JP4156856B2 (ja) レーザ走査型顕微鏡システム、システム制御方法およびシステム制御をコンピュータに実行させる制御プログラム
JP4869562B2 (ja) 走査型共焦点顕微鏡
KR101629576B1 (ko) 다파장 형광 이미지를 획득하는 장치 및 방법
JP2014170105A (ja) 顕微鏡装置
JP4896301B2 (ja) 走査型光学顕微鏡
CN107015353B (zh) 多色受激辐射耗尽超分辨成像装置、方法及光学显微镜
WO2008010405A1 (fr) Procédé d&#39;observation d&#39;un échantillon et microscope
JP5394893B2 (ja) レーザ走査型顕微鏡
JP2004354346A (ja) 測定装置
JP4633386B2 (ja) 走査型レーザ顕微鏡及びそれを用いたデータ取得方法
JP2006195076A (ja) 走査型光学装置
JP4242627B2 (ja) レーザ顕微鏡

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07737182

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2007737182

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007737182

Country of ref document: EP