JP3686898B2 - 蛍光エネルギー移動解析装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、蛍光エネルギー移動現象の解析に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer：ＦＲＥＴ）は、ある蛍光分子から他の分子へ励起エネルギーが移動する現象である。エネルギーを他の分子へ与える分子はドナー、エネルギーを受け取る分子はアクセプタと呼ばれる。ＦＲＥＴが起きると、ドナーの蛍光は弱まる。アクセプタが蛍光分子であれば、アクセプタから蛍光が発する。
【０００３】
細胞内で起こるＦＲＥＴを顕微鏡観察によって測定する場合、ドナーを励起したときのドナーおよびアクセプタの蛍光強度をそれぞれ測定し、両者の比（アクセプタの蛍光強度／ドナーの蛍光強度）を計算することが簡便な測定方法としてよく行われている（例えば、非特許文献１参照）。ドナーとアクセプタの蛍光強度は、検出器の前に配置するバンドパスフィルタを切り替えることで、順次に測定できる。また、ドナーとアクセプタの蛍光をダイクロイックミラーで分離した後、バンドパスフィルタに通すことで、それぞれの蛍光を二つの検出器（Ｗ−ｖｉｅｗ光学系を使えば一つの検出器）で同時に検出することもできる。検出器としては、例えば、冷却型ＣＣＤカメラなどのカメラや、光電子増倍管が使用される。
【０００４】
この方法では、ドナーの蛍光が弱まり、アクセプタの蛍光が強まるというＦＲＥＴ特有の蛍光の変化が確認できる。ドナーおよびアクセプタの蛍光強度比を算出することは、蛍光強度の変化量を明確に示す。また、この方法では、細胞の厚さ、色素の分布および光源の照明むらに起因する蛍光強度の変動がキャンセルされるため、都合がよい。しかし、この方法は、ＦＲＥＴの変化を検出することはできても、蛍光強度比の定量的な測定には向かない。細胞内に存在するドナーおよびアクセプタの量比が変わったり、蛍光を検出する波長域が変更されたり、使用する蛍光試薬の種類が変更されたり、検出器の分光感度特性が変わったときなどには、それに応じて蛍光強度比の値も変化する。このため、これらの実験条件が変わる前後の測定値の間では、定量的な比較ができない。
【０００５】
実験条件が異なる場合にも定量的に比較できる値として、ＦＲＥＴ効率（Ｅｔ）がある。これを求めるための計算式の一つとして、Ｅｔ＝１−Ｆｄ′／Ｆｄが知られている。ここで、Ｆｄは、ＦＲＥＴが起きていないときのドナーの蛍光強度、Ｆｄ′は、ＦＲＥＴが起きているときのドナーの蛍光強度である。Ｆｄの値は、ドナーとアクセプタを含む試料にアクセプタの吸収波長の光を照射し、測定範囲内にあるすべてのアクセプタ分子を光退色によって壊した後にドナーの蛍光強度を測定することで求めることができる。この退色実験の前にＦｄ′を経時的に測定しておけば、計算によりＥｔの時間変化を知ることができる。
【０００６】
Ｆｄ′の測定の後、退色実験を行うときは、試料に照射する光の波長とダイクロイックミラーをＦｄ′測定用のものから退色用のものに切り替える。ドナーの吸収波長域を含まず、かつ、なるべく広くアクセプタの吸収波長域を含む強い光が試料に照射される。これは、ドナーの蛍光に退色などの影響を与えずに、なるべく迅速にアクセプタを退色させるためである。しかし、退色用の光の波長域は、アクセプタの蛍光波長域の一部と重なることが多い。そのため、アクセプタの蛍光をモニタするための検出器には、退色用の光のダイクロイックミラーからの漏れ光が入る。この漏れ光が過大な強度を有するため、検出器によってアクセプタの退色過程をモニタすることができなくなる。
【０００７】
例えば、ドナーとしてＥＣＦＰ、アクセプタとしてＥＹＦＰという蛍光色素を使用し、それぞれの蛍光をフィルタで分光して測定する場合を想定する。図７は、ＥＣＦＰの吸収スペクトル５１および蛍光スペクトル５２、ならびにＥＹＦＰの吸収スペクトル５３および蛍光スペクトル５４を示している。これらのスペクトルを考慮して、ＥＣＦＰの励起用に４４０ｎｍ（半値幅２０ｎｍ）、ＥＣＦＰの蛍光用に４８０ｎｍ（半値幅３０ｎｍ）、ＥＹＦＰの蛍光用に５３５ｎｍ（半値幅２５ｎｍ）の透過波長域ａ、ｃおよびｄをそれぞれ有するバンドパスフィルタが使用される。この場合、４５５ｎｍ以上の波長の光を透過させるダイクロイックミラーが使用される。この後、ＥＹＦＰを退色させるときには、ＥＣＦＰの吸収波長域を含まずにＥＹＦＰの吸収波長域を広く含むように、５２５ｎｍ（半値幅４５ｎｍ）の透過波長域ｂを有するバンドパスフィルタが使用される。この場合、５６０ｎｍのダイクロイックミラーが使用される（例えば、非特許文献２および３参照）。なるべく強い光を試料に照射するために、光路に減光フィルタなどが入っている場合には、これを光路から取り除く。したがって、ＥＹＦＰの退色実験の際には、ＥＹＦＰ測定用の検出器にこの強い照明光の一部が入ることになる。
【０００８】
したがって、どの時点で退色が完了し、光の照射を停止すべきかを知るためには、退色用の光をある時間にわたって試料に照射した後、顕微鏡のダイクロイックミラーやフィルター等の設定を蛍光測定用のものに戻してアクセプタの蛍光を測定する。その後、再び退色のための設定に戻して、退色用の光を試料に照射する。このような作業を、アクセプタの蛍光の減衰がなくなるまで繰り返し行わなければならない（例えば、非特許文献４参照）。このような作業は煩雑である。
【０００９】
このほかに、ＦＲＥＴ効率を定量的に求める方法として、ドナーの蛍光の退色速度を求める方法がある。この場合、ＦＲＥＴ効率Ｅｔは、Ｅｔ＝１−τbl／τ′blで表される。ここで、τblは、ＦＲＥＴが起きていないときのドナー蛍光の退色速度、τ′blは、ＦＲＥＴが起きているときのドナー蛍光の退色速度である。ドナー蛍光の退色速度は、ドナーの吸収波長の光を連続して試料に照射しながら蛍光強度を時間を追って何回か計測したときの蛍光強度の減衰速度として求められる。しかし、この方法では、測定のときにドナーの蛍光を退色させてしまうため、同一試料でＦＲＥＴ効率の時間変化を追うことができない。また、τblを求めるための領域を試料内に設け、その領域内のアクセプタ分子をあらかじめ光退色によって壊す必要があり、この点で作業が煩雑である（例えば、非特許文献５および６）。
【００１０】
【非特許文献１】
Miyawaki, A. et al., Nature, 388, 882-887, 1997
【非特許文献２】
宮脇敦史、「ＧＦＰを用いた分子間ＦＲＥＴ」、生体の科学、
５３巻１号、２００２年２月、７５−８１頁
【非特許文献３】
Sawano, A., Biophysical Journal, 82, 1076-1085, 2002/09/09
【非特許文献４】
Miyawaki, A. and Tsien, R. Y., Methods in Enzymology, 327,
４72-500, 2000
【非特許文献５】
Wouters, F. S. et al., EMBO J., 17, 7179-7189, 1998
【非特許文献６】
Bastiaens, P. I. H. et al., Proceedings of the Second
Hamamatsu International Symposium on Biomolecular Mechanisms
and Photonics: Cell-Cell Communication, 77-82, 1995
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、蛍光エネルギー移動効率を簡易な作業で定量的に測定することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明の蛍光エネルギー移動解析装置は、ドナーおよびアクセプタを含む試料の蛍光エネルギー移動効率を測定する。この装置は、投光部、検出部および演算部を備えている。投光部は、試料に照射すべきドナー励起用の光およびアクセプタ退色用の光を選択的に放出する。検出部は、ドナー励起用の光の試料への照射に起因して試料から発する蛍光を検出し、その蛍光の強度に応じた出力を生成する。演算部は、検出部の出力を用いて蛍光エネルギー移動効率を算出する。検出部は、互いに異なる第１、第２および第３の波長域の光を独立に検出する。第１波長域は、アクセプタの蛍光スペクトルとの間よりもドナーの蛍光スペクトルとの間に大きな重なりを有している。第２波長域は、ドナーの蛍光スペクトルとの間よりもアクセプタの蛍光スペクトルとの間に大きな重なりを有している。第３波長域は、ドナーの蛍光スペクトルとの間よりもアクセプタの蛍光スペクトルとの間に大きな重なりを有しており、かつ、アクセプタ退色用の光の波長域との間に実質的な重なりを有さない。
【００１３】
ドナー励起用の光を投光部から試料に照射すれば、試料中のドナーが励起されて蛍光が発する。また、ドナーからの蛍光エネルギー移動によって、試料中のアクセプタからも蛍光が発する。検出部の第１および第２波長域の出力は、蛍光エネルギー移動が起きているときのドナーおよびアクセプタの蛍光強度をそれぞれ示す。この後、アクセプタ退色用の光を投光部から試料に照射すれば、アクセプタの退色が始まる。退色により、アクセプタの蛍光の強度は徐々に弱まっていく。検出部の第３波長域の出力は、退色中におけるアクセプタの蛍光強度を示す。したがって、第３波長域の出力をモニタすることにより、退色の完了時点を確認できる。退色が完了した後、退色用の光の照射を停止し、ドナー励起用の光を再び試料に照射すれば、第１波長域の出力は、蛍光エネルギー移動が起きていないときのドナーの蛍光強度を示す。したがって、退色の前後における第１波長域の出力を用いることにより、Ｅｔ＝１−Ｆｄ′／Ｆｄの式にしたがって蛍光エネルギー移動効率を定量的に求めることができる。
【００１４】
第３波長域は、アクセプタの蛍光スペクトルと重なりを有し、かつ、アクセプタ退色用の光の波長域を実質的に含まない。したがって、第３波長域は、アクセプタ退色用の光を試料に照射しながらのアクセプタ蛍光強度の測定に適している。検出部がこのような第３波長域を有しているので、アクセプタ退色用の光を継続的に照射しながら、第３波長域の出力に基づいてアクセプタ退色の完了時点を確認できる。従来技術のように、退色中のアクセプタ蛍光強度を測定するためにアクセプタ退色用の光の照射を停止したり、光学系を切り替える必要はない。したがって、本発明の装置は、簡易な作業で迅速に蛍光エネルギー移動効率を求めることができる。
【００１５】
投光部は、減光フィルタを光路上に配置する減光手段を有していてもよい。投光部がドナー励起用の光を放出するとき、減光手段は、ドナー励起用の光が減光フィルタを通過するように減光フィルタを光路上に配置する。投光部がアクセプタ退色用の光を放出するとき、減光手段は、アクセプタ退色用の光が減光フィルタを通過しないように、減光フィルタを光路上から取り除く。減光フィルタによってドナー励起用の光の強度が低減されるので、検出部を飽和させることなくドナーおよびアクセプタの蛍光を検出できる。アクセプタ退色用の光の強度は低減されないので、アクセプタを効率良く退色させることができる。
【００１６】
投光部は、ドナー励起用の光の波長域およびアクセプタ退色用の光の波長域の双方にわたって発光する光源と、光源から光を受光するとともに減光フィルタを光路上に配置する減光手段と、減光手段から光を受光し、ドナー励起用の光の波長域およびアクセプタ退色用の光の波長域のいずれか一方の成分を抽出する波長選択手段とを有していてもよい。投光部がドナー励起用の光を放出するとき、減光手段は、光源からの光が減光フィルタを通過してから波長選択手段に向かうように減光フィルタを光路上に配置する。投光部がアクセプタ退色用の光を放出するとき、減光手段は、光源からの光が減光フィルタを通過しないように、減光フィルタを光路上から取り除く。減光フィルタによってドナー励起用の光の強度が低減されるので、検出部を飽和させることなくドナーおよびアクセプタの蛍光を検出できる。アクセプタ退色用の光の強度は低減されないので、アクセプタを効率良く退色させることができる。
【００１７】
検出部の第３波長域は、アクセプタ退色用の光が試料に照射されるときにアクセプタから発する蛍光を検出部が飽和することなく検出できるような重なりをアクセプタの蛍光スペクトルとの間に有していることが好ましい。アクセプタ退色用の光の強度は低減されないため、退色中に発するアクセプタの蛍光は大きな強度を有する。この場合でも、第３波長域とアクセプタの蛍光スペクトルとの重なりが十分に小さければ、第３波長域で検出される蛍光の強度は、検出部が飽和しない程度の大きさとなる。例えば、第３波長域がアクセプタの蛍光スペクトルのうち低強度の領域とだけ重なっていると、第３波長域で検出される蛍光強度を十分に抑えられる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照しながら本発明の実施形態を詳細に説明する。なお、理解の容易のため、図面に共通の同一要素を表すときは、可能な限り、同一の参照番号を使用する。また、図示の便宜上、図面の寸法比率は説明のものと必ずしも一致しない。
【００１９】
図１は、本実施形態の蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）解析装置１００の構成を示すブロック図である。ＦＲＥＴ解析装置１００は、試料５のＦＲＥＴ効率を測定する。試料５には、蛍光色素であるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰが含まれている。ＥＣＦＰはドナーであり、ＥＹＦＰはアクセプタである。図２は、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示している。図２には、ＦＲＥＴ解析装置１００が利用する各種の波長域も示されている。
【００２０】
ＦＲＥＴ解析装置１００は、次の計算式
Ｅｔ＝１−Ｆｄ′／Ｆｄ （１）
にしたがってＦＲＥＴ効率を算出する。ここで、ＥｔはＦＲＥＴ効率、ＦｄはＦＲＥＴが起きていないときのドナーの蛍光強度、Ｆｄ′はＦＲＥＴが起きているときのドナーの蛍光強度である。
【００２１】
装置１００は、まず、ドナー励起用の光を試料５に照射してＦＲＥＴを発生させ、ドナーの蛍光強度をＦｄ′として測定する。次に、装置１００は、アクセプタ退色用の光を試料５に照射してアクセプタを破壊する。その後で、装置１００は、ドナーの蛍光強度をＦｄとして測定する。装置１００は、こうして測定したＦｄおよびＦｄ′を用いてＥｔを算出する。
【００２２】
図１に示されるように、ＦＲＥＴ解析装置１００は、投光部１、光学系２、検出部３および制御演算部４から構成されている。投光部１、光学系２および検出部３は、互いに光学的に結合されている。投光部１、光学系２および検出部３は、制御演算部４に電気的に接続されている。
【００２３】
投光部１は、試料５に照射すべきドナー励起用の光およびアクセプタ退色用の光のいずれか一方を選択的に放出する。投光部１は、互いに光学的に結合された光源１０、シャッタ１２、ＮＤフィルタ切替装置１３および波長切替装置１４を有している。シャッタ１２、ＮＤフィルタ切替装置１３および波長切替装置１４は、信号線を介して制御演算部４に電気的に接続されている。
【００２４】
光源１０は、ドナー励起用の波長域およびアクセプタ退色用の波長域の双方にわたって発光する。この実施形態では、光源１０として白色光源、例えば、キセノンランプが使用される。
【００２５】
シャッタ１２は、光源１０とＮＤフィルタ切替装置１３の間の光路上に配置されている。シャッタ１２は、光源１０から発する光のＮＤフィルタ切替装置１３への入射を制御する。光源１０から発する光は、シャッタ１２が開いているときはＮＤフィルタ切替装置１３に入射し、シャッタ１２が閉じているときはＮＤフィルタ切替装置１３に入射しない。
【００２６】
ＮＤフィルタ切替装置１３は、光源１０から発する光の強度を低減可能な減光手段である。ＮＤフィルタ切替装置１３は、シャッタ１２から光を受け取り、波長切替装置１４に送る。ＮＤフィルタ切替装置１３は、減光フィルタとして複数枚のＮＤフィルタを内蔵している。これらのＮＤフィルタは、互いに異なる光透過率（例えば、１０％、１％および０．１％）を有している。
【００２７】
ＦＲＥＴを起こさせるとき、ＮＤフィルタ切替装置１３は、これらのＮＤフィルタのうち一枚を光路上に配置する。ドナー励起用の光は、ＮＤフィルタを通過し、その結果、その強度が低減される。適正なＮＤフィルタを光路上に配置することにより、検出部３の感度に見合った強度を持つ試料５の蛍光像を検出部３に送ることができる。
【００２８】
また、ＮＤフィルタ切替装置１３は、いずれのＮＤフィルタも光路上に配置しないことが可能である。この場合、ＮＤフィルタ切替装置１３の光透過率は、１００％となる。後述するように、アクセプタを退色させるときは、ＮＤフィルタ切替装置１３は、ＮＤフィルタを光路から取り除く。このため、アクセプタ退色用の光はＮＤフィルタを通過せず、したがって、その強度は低減されない。
【００２９】
光源１０から発した光は、シャッタ１２およびＮＤフィルタ切替装置１３を通過して、波長切替装置１４に入射する。波長切替装置１４は、光源１０で発した光から特定の波長成分を切替可能に抽出する。すなわち、波長切替装置１４は、フィルタ装置の一種である。波長切替装置１４は、モノクロメータ、バンドパスフィルタ、その他の波長選択手段を用いて作製することができる。
【００３０】
波長切替装置１４は、光源１０からの光を受け取ると、波長域λex1およびλex2のいずれかを有する成分を透過させる。λex1は、４３０ｎｍ以上４５０ｎｍ以下（中心波長４４０ｎｍ、半値幅２０ｎｍ）の波長域である。λex2は、５０２．５ｎｍ以上５４７．５ｎｍ以下（中心波長５２５ｎｍ、半値幅４５ｎｍ）の波長域である。波長域λex1の光は、試料５中のドナーＥＣＦＰを励起し、蛍光を生じさせる。波長域λex2の光は、試料５中のアクセプタＥＹＦＰを退色させる。波長域λex1およびλex2は、ドナーＥＣＦＰおよびアクセプタＥＹＦＰの吸収スペクトルを考慮して決められている。
【００３１】
ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの吸収スペクトルは、図２に示されている。図２において、破線５１がＥＣＦＰの吸収スペクトルを示し、破線５３がＥＹＦＰの吸収スペクトルを示している。実線ａは波長域λex1を示し、実線ｂは波長域λex2を示している。波長域λex1は、ＥＣＦＰの吸収スペクトル５１との間に重なりを有しており、吸収スペクトル５１のピーク波長を含んでいる。波長域λex2は、ＥＹＦＰの吸収スペクトル５３との間に重なりを有しており、吸収スペクトル５３のピーク波長を含んでいる。波長域λex2は、ＥＣＦＰの吸収スペクトル５１とは重ならない。
【００３２】
光学系２は、投光部１から放出された光を受け取り、試料５に照射する。また、試料５から発した蛍光を受け取り、検出部３へ送る。光学系２は、投光部１からの光が試料５によって反射されて検出部３へ入射することを防止する。ＦＲＥＴ装置１００を顕微鏡とみなせば、光学系２は、落射照明光学系に当たる。
【００３３】
光学系２は、互いに光学的に結合されたダイクロイックミラー切替装置１６、対物レンズ１８および全反射ミラー２０を有している。ダイクロイックミラー切替装置１６は、投光部１の波長切替装置１４とも光学的に結合されている。また、ダイクロイックミラー切替装置１６は、信号線を介して制御演算部４に電気的に接続されている。
【００３４】
波長切替装置１４から出射した光は、ダイクロイックミラー切替装置１６に入射する。ダイクロイックミラー切替装置１６は、異なる特性を有する二枚のダイクロイックミラーＤＭ１およびＤＭ２を内蔵している。ダイクロイックミラー切替装置１６は、これらのダイクロイックミラーのいずれか一方を選択的に光路上に配置する。このため、波長切替装置１４からの光は、いずれか一方のダイクロイックミラーに入射する。どちらのミラーを光路上に配置するかは、制御演算部４からの指示に従う。ダイクロイックミラーＤＭ１は、４５５ｎｍ以上の波長の光を透過させ、４５５ｎｍ未満の波長の光は反射する。ダイクロイックミラーＤＭ２は、５６０ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５６０ｎｍ未満の波長の光は反射する。これらのダイクロイックミラーは、投光部１からの光を反射して試料５に送るとともに、試料５で反射された投光部１からの光を遮断して、検出部３に入射しないようにするために使用される。
【００３５】
対物レンズ１８は、ダイクロイックミラー切替装置１６と試料５の間に配置される。言い換えると、試料５のＦＲＥＴ解析を行う場合は、試料５を対物レンズ１８に対向させて配置する。対物レンズ１８は、ダイクロイックミラーＤＭ１またはＤＭ２で反射された投光部１の出射光を受け取り、これを集光して試料５に照射する。また、対物レンズ１８は、試料５から発する蛍光を受け取り、これをダイクロイックミラー切替装置１６に送る。
【００３６】
全反射ミラー２０は、ダイクロイックミラー切替装置１６を挟んで対物レンズ１８の反対側に配置されている。全反射ミラー２０は、対物レンズ１８およびダイクロイックミラー切替装置１６を介して、試料５から発する蛍光を受け取る。全反射ミラー２０は、受け取った蛍光を検出部３に向けて高い反射率で反射する。
【００３７】
検出部３は、３板ＣＣＤカメラ２２から構成されている。３板ＣＣＤカメラ２２は、試料５から発する蛍光を検出して画像化する撮像装置である。３板ＣＣＤカメラ２２は、全反射ミラー２０によって反射された試料５からの蛍光を受け取り、その蛍光の強度に応じた電気出力信号を生成する。この出力信号は、試料５上における蛍光の空間分布画像（以下、「蛍光画像」と呼ぶ）を表す。この出力信号は、制御演算部４に送られる。
【００３８】
３板ＣＣＤカメラ２２は、プリズム２３と、３枚のＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅを搭載している。プリズム２３は、ＣＣＤカメラ２２の光入射部に配置されている。全反射ミラー２０からの光は、プリズム２３の光入射面に入射する。ＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅは、プリズム２３の光出射面と対向している。プリズム２３は、分光器である。プリズム２３は、全反射ミラー２０から光を受け取ると、その光を波長に応じた方向に分散させる。プリズム２３の分光特性は、異なる波長域λem1〜λem3の光がＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅにそれぞれ入射するように設定されている。これらの波長域は、実質的に重なりを有さない。各ＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅは、入射光の強度に応じた出力電気信号を生成する光検出器である。したがって、ＣＣＤカメラ２２は、入射光の異なる波長域λem1〜λem3の成分を独立に検出できる。本実施形態では、λem1は４６０ｎｍ以上５００ｎｍ未満の波長域であり、λem2は５００ｎｍ以上５６５ｎｍ未満の波長域であり、λem3は５６５ｎｍ以上６００ｎｍ以下の波長域である。波長域λem1〜λem3は、ドナーＥＣＦＰおよびアクセプタＥＹＦＰの蛍光スペクトルを考慮して決められている。
【００３９】
ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光スペクトルは、図２に示されている。図２において、実線５２がＥＣＦＰの蛍光スペクトルを示し、実線５４がＥＹＦＰの蛍光スペクトルを示している。実線ｃは波長域λem1を示し、実線ｄは波長域λem2を示し、実線ｅは波長域λem3を示している。波長域λem1は、ＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２と間に重なりを有しており、蛍光スペクトル５２のピーク波長を含んでいる。波長域λem1は、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との間には、ほとんど重なりを有さない。波長域λem2は、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との間に重なりを有しており、蛍光スペクトル５４のピーク波長を含んでいる。波長域λem2は、ＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との間にも重なりを有している。波長域λem3は、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光スペクトル５２、５４の双方と重なりを有している。
【００４０】
図２に示されるように、波長域λem1とＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との重なりは非常に小さい。したがって、波長域λem1の蛍光成分を受け取るＣＣＤチップ２４ｃの出力は、実質的にＥＣＦＰの蛍光の強度を示す。このように、波長域λem1は、波長域λem1に関する検出部４の出力がＥＣＦＰの蛍光強度を示すように決められる。一般に、波長域λem1とＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との重なりが波長域λem1とＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との重なりよりも十分に大きければ、波長域λem1の出力（ＣＣＤチップ２４ｃの出力）をＥＣＦＰの蛍光強度を示すものとして扱うことができる。なお、本明細書では、「波長域とスペクトルとの重なり」とは、その波長域にわたるスペクトルの強度の積分値を意味する。
【００４１】
波長域λem2は、ＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との間よりも、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との間に、より大きな重なりを有している。波長域λem2とＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との重なりは、波長域λem2とＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との重なりよりも十分に大きい。したがって、波長域λem2に関する検出部４の出力（ＣＣＤチップ２４ｄの出力）をＥＹＦＰの蛍光強度を示すものとして扱うことができる。このように、波長域λem2は、波長域λem2に関する検出部４の出力がＥＹＦＰの蛍光強度を示すように決められる。
【００４２】
波長域λem3も、ＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との間よりも、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との間に、より大きな重なりを有している。また、波長域λem3は、アクセプタ退色用の光の波長域λex2とは重ならない。波長域λem3とＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との重なりは、波長域λem3とＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との重なりよりも十分に大きい。波長域λem3は、ＥＹＦＰの退色中にＥＹＦＰの蛍光強度を測定するために使用される。後述するように、ＥＹＦＰを退色させるときは、ＥＣＦＰの吸収波長を含まずにＥＹＦＰの吸収波長を広く含む波長域λex2の光が試料５に照射される。このため、波長域λem3で検出される蛍光は、ほとんどすべてＥＹＦＰから発したものとなる。したがって、波長域λem3に関する検出部４の出力（ＣＣＤチップ２４ｅの出力）を退色中のＥＹＦＰの蛍光強度を示すものとして扱うことができる。
【００４３】
制御演算部４は、一つのコンピュータシステムである。制御演算部４は、ＦＲＥＴ効率の測定手順を制御する制御部と、検出部３の出力を用いてＦＲＥＴ効率を算出する演算部の双方として機能する。制御演算部４は、シャッタ１２、ＮＤフィルタ切替装置１３、波長切替装置１４、ダイクロイックミラー切替装置１６およびＣＣＤカメラ２２の動作を制御して、試料５のドナー励起およびアクセプタ退色を実行する。また、制御演算部４は、ＣＣＤカメラ２２の出力信号を用いてＦＲＥＴ解析処理を実行する。制御演算部４は、表示装置を含んでいる。制御演算部４は、ＦＲＥＴ解析の結果を表示装置の画面上に表示する。
【００４４】
次に、図３および図４を参照しながら、装置１００を用いたＦＲＥＴ解析の手順を説明する。ここで、図３および図４は、解析手順を示すフローチャートである。
【００４５】
ＦＲＥＴ解析を開始するとき、オペレータは、制御演算部４を操作して画像取得パラメータを設定する（ステップＳ３１０）。これには、ドナーおよびアクセプタの蛍光測定用の設定と、アクセプタ退色モニタ用の設定とが含まれる。蛍光測定に関連するパラメータとしては、ＣＣＤカメラ２２による画像取得数や画像取得の時間間隔などが設定される。アクセプタ退色モニタに関連するパラメータとしては、ＣＣＤカメラ２２による蛍光強度測定の時間間隔や、退色モニタを終了するときの蛍光強度値または減衰率などが設定される。
【００４６】
次に、装置１００は、ドナーおよびアクセプタからの蛍光を測定するための光学系を構築する（ステップＳ３２０）。このステップでは、制御演算部４は、波長切替装置１４に制御信号を送り、波長切替装置１４の透過波長域をλex1に設定する。また、制御演算部４は、ＮＤフィルタ切替装置１３に制御信号を送り、いずれか一枚のＮＤフィルタを選択して光路上に配置させる。さらに、制御演算部４は、ダイクロイックミラー切替装置１６に制御信号を送り、ダイクロイックミラーＤＭ１を光路上に配置させる。
【００４７】
続いて、ＣＣＤカメラ２２の感度を調整する（ステップＳ３３０）。オペレータは、制御演算部４を操作して、ＣＣＤカメラ２２の露光時間およびゲインを設定する。
【００４８】
この後、ＣＣＤカメラ２２によってダーク画像を取得する（ステップＳ３４０）。このダーク画像は、ＣＣＤカメラ２２から制御演算部４に送られる。ダーク画像は、試料５の蛍光画像のデータ補正に使用される。
【００４９】
次に、オペレータは、制御演算部４を操作して試料５上の測定領域（撮像領域）を指定する（ステップＳ３５０）。これには、ドナーおよびアクセプタの蛍光強度を測定する領域の指定と、アクセプタの退色をモニタする領域の指定とが含まれる。
【００５０】
以上の準備作業が完了すると、装置１００は、設定された条件のもとでドナーおよびアクセプタの蛍光画像を取得する（ステップＳ３６０）。以下では、このステップについて詳細に説明する。
【００５１】
制御演算部４は、ステップＳ３１０で設定された時間間隔でシャッタ１２を繰り返し開閉する。シャッタ１２が開くと、光源１０から発した白色光は、ＮＤフィルタ切替装置１３内のＮＤフィルタを通過し、波長切替装置１４に入射する。ＮＤフィルタによって、光の強度が低減される。波長切替装置１４は、波長域λex1の成分のみを透過させ、他の波長成分を遮断する。このようにして、ドナー励起用の光が生成される。波長切替装置１４から出射するドナー励起用の光は、ダイクロイックミラーＤＭ１によって反射され、対物レンズ１８を透過して試料５に照射される。これにより、試料５中のドナー、すなわちＥＣＦＰが励起され、蛍光が発生する。
【００５２】
試料５から発する蛍光には、ＥＣＦＰ自身から発するものに加えて、ＦＲＥＴによってＥＣＦＰから励起エネルギーを受け取ったＥＹＦＰ（アクセプタ）から発するものが含まれる。図２において符号５２および５４で示されるように、ＥＣＦＰの蛍光とＥＹＦＰの蛍光は、異なる波長域を有している。これらの蛍光は、対物レンズ１８を透過して、ダイクロイックミラー切替装置１６に入射する。
【００５３】
ダイクロイックミラーＤＭ１は、上述のように、４５５ｎｍ以上の波長の光を透過させ、４５５ｎｍ未満の波長の光を反射する。したがって、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰから発した蛍光の大部分は、ダイクロイックミラーＤＭ１を透過する。この蛍光は、全反射ミラー２０によって反射され、ＣＣＤカメラ２２に入射する。
【００５４】
一方、試料５によって反射されたドナー励起用の光は、ダイクロイックミラーＤＭ１によって遮断される。これは、ドナー励起用の光が、４３０〜４５０ｎｍという波長域λex1を有しているからである。このようにして、ドナー励起用の光のＣＣＤカメラ２２への入射が防がれる。
【００５５】
ＣＣＤカメラ２２内のプリズム２３は、入射した蛍光を分散し、その波長域に応じてＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅに送る。これにより、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光画像が取得される。上述のように、ＥＣＦＰの蛍光は、主としてＣＣＤチップ２４ｃによって検出され、ＥＹＦＰの蛍光は、主としてＣＣＤチップ２４ｄによって検出される。
【００５６】
制御演算部４は、ＣＣＤチップ２４ｃの出力値からＣＣＤチップ２４ｃのダークを減算し、得られた値を換算してＥＣＦＰの蛍光強度を求める。また、制御演算部４は、ＣＣＤチップ２４ｄの出力値からＣＣＤチップ２４ｄのダークを減算し、得られた値を換算してＥＹＦＰの蛍光強度を求める。この演算は、画素ごとに行われる。このようにして、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光画像が得られる。制御演算部４は、（ＥＹＦＰの蛍光強度）／（ＥＣＦＰの蛍光強度）で表される蛍光強度比を算出する。制御演算部４は、算出した蛍光強度比の値を表示装置上に表示する。
【００５７】
制御演算部４は、上記のような蛍光画像の取得をステップＳ３１０で設定された回数にわたって繰り返す。蛍光画像が取得されるたびに、蛍光強度比が表示される。各測定時刻におけるＥＣＦＰの蛍光強度が、その時刻でのＦｄ′（上記（１）式を参照）である。
【００５８】
蛍光画像の取得が終了すると、装置１００は、アクセプタの退色をモニタするための光学系を構築する（ステップＳ３７０）。制御演算部４は、波長切替装置１４に制御信号を送り、その透過波長域をλex1からλex2に変更させる。また、制御演算部４は、ＮＤフィルタ切替装置１３に制御信号を送り、ＮＤフィルタを光路上から取り除かせる。さらに、制御演算部４は、ダイクロイックミラー切替装置１６に制御信号を送り、ダイクロイックミラーＤＭ１に代えてダイクロイックミラーＤＭ２を光路上に配置させる。
【００５９】
次に、アクセプタの退色モニタが開始される（ステップＳ３８０）。波長切替装置１４は、波長域λex2の成分のみを透過させ、他の波長成分を遮断する。このようにして、アクセプタ退色用の光が生成される。波長切替装置１４から出射するアクセプタ退色用の光は、ダイクロイックミラーＤＭ２によって反射され、対物レンズ１８を透過して試料５に照射される。これにより、試料５中のアクセプタ、すなわちＥＹＦＰが退色を始める。この照射光は、ＮＤフィルタによって減光されていないので、高い強度を有する。したがって、この照射光は、アクセプタを効率良く退色させることができる。
【００６０】
退色用の光の波長域λex2は、図２において実線ｂで示されるように、ＥＣＦＰの吸収波長を含まず、かつ、ＥＹＦＰの吸収波長を広く含んでいる。このため、試料５から発する蛍光は、そのほとんどがＥＹＦＰから生じたものとなる。この蛍光は、対物レンズ１８を透過して、ダイクロイックミラー切替装置１６に入射する。
【００６１】
ダイクロイックミラーＤＭ２は、上述のように、５６０ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５６０ｎｍ未満の波長の光を反射する。したがって、図２に示されるＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４から明らかなように、ＥＹＦＰの蛍光の一部のみがダイクロイックミラーＤＭ２を透過する。この蛍光は、全反射ミラー２０によって反射され、ＣＣＤカメラ２２に入射する。
【００６２】
一方、試料５によって反射されたアクセプタ退色用の光は、ダイクロイックミラーＤＭ２によって遮断される。これは、アクセプタ退色用の光が、５０２．５〜５４７．５ｎｍという波長域λex2を有しているからである。このようにして、アクセプタ退色用の光のＣＣＤカメラ２２への入射が防がれる。
【００６３】
ＣＣＤカメラ２２に入射した蛍光のほとんどは、５６５ｎｍ以上６００ｎｍ以下の検出波長域λem3を有するＣＣＤチップ２４ｅによって検出される。これは、ダイクロイックミラーＤＭ２が５６０ｎｍ以上の波長の蛍光を透過させるからである。上述のように、退色用の光の波長域λex2は、ＥＣＦＰの吸収スペクトルと重ならないので、退色中にＥＣＦＰは蛍光をほとんど発しない。また、検出波長域λem3は、退色用の光の波長域λex2と重ならないので、ダイクロイックミラーＤＭ２から退色用の光が漏れて検出部３に入射しても、その漏れ光は波長域λem3では検出されない。したがって、ＣＣＤチップ２４ｅの出力は、退色中のＥＹＦＰの蛍光強度を示す。
【００６４】
なお、退色用の光はＮＤフィルタによって減光されていないので強度が大きく、それに応じてＥＹＦＰの蛍光の強度も大きくなる。もしも過大な強度の蛍光がＣＣＤチップ２４ｅに入射すると、ＣＣＤチップ２４ｅが飽和して、蛍光の強度を測定できなくなる。しかし、ＣＣＤチップ２４ｅの検出波長域λem3は、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４のうち長波長側の裾とだけ重なっている。蛍光スペクトル５４の裾では、蛍光の強度が低い。このため、ＣＣＤチップ２４ｅは、ＣＣＤチップ２４ｅを飽和させない適当な強度のＥＹＦＰ蛍光を検出できる。このように、ＣＣＤチップ２４ｅは、退色用の光を試料５に照射している間、ＥＹＦＰの蛍光を適切に検出し、蛍光画像を取得できる。
【００６５】
制御演算部４は、ＣＣＤチップ２４ｅの出力値からＣＣＤチップ２４ｅのダークを減算し、得られた値を換算して退色中のＥＹＦＰの蛍光強度を求める。この演算は、画素ごとに行われる。このようにして、退色中におけるＥＹＦＰ蛍光画像が得られる。制御演算部４は、求めた蛍光強度の値を表示装置上に表示する。
【００６６】
制御演算部４は、上記のような退色中におけるＥＹＦＰ蛍光画像の取得をステップＳ３１０で設定された時間間隔で繰り返す。ＥＹＦＰ蛍光画像が取得されるたびに、蛍光強度値が表示される。また、制御演算部４は、蛍光強度の減衰率も画像取得のたびに算出する。減衰率Ａは、以下の式にしたがって算出される。
【００６７】
Ａ＝１−Ｉt／Ｉt-1 …（２）
ここで、Ｉtは今回の画像取得時に得られたアクセプタの蛍光強度であり、Ｉt-1は前回の画像取得時に得られたアクセプタの蛍光強度である。アクセプタの退色が進むにつれて、減衰率Ａは０に近づく。
【００６８】
制御演算部４は、蛍光画像を取得するたびに、算出した蛍光強度または減衰率を、ステップＳ３１０で設定された値と比較する。蛍光強度または減衰率がステップＳ３１０で設定された値よりも小さくなると、制御演算部４は、ＥＦＹＰの退色が完了したと判断し、退色モニタを終了する。このように、制御演算部４は、退色中のアクセプタ蛍光強度に基づいてアクセプタの退色が完了したか否かを判断する。
【００６９】
制御演算部４は、アクセプタの退色が完了したと判断すると、ドナーであるＥＣＦＰの蛍光を測定するための光学系を構築する（ステップＳ４１０）。制御演算部４は、波長切替装置１４に制御信号を送り、その透過波長域をλex2からλex1に戻す。また、制御演算部４は、ＮＤフィルタ切替装置１３に制御信号を送り、ステップＳ３２０で使用したＮＤフィルタと同じＮＤフィルタを光路上に配置させる。さらに、制御演算部４は、ダイクロイックミラー切替装置１６に制御信号を送り、ダイクロイックミラーＤＭ２に代えてダイクロイックミラーＤＭ１を再び光路上に配置させる。
【００７０】
この後、波長域λex1の光が投光部１から試料５に再び照射され、ドナーの蛍光画像がＣＣＤカメラ２２中のＣＣＤチップ２４ｃによって取得される（ステップＳ４２０）。これは、上記のステップＳ３６０と同様に行われる。制御演算部４は、ＣＣＤチップ２４ｃの出力値からダークを減算し、得られた値を換算して、ドナーＥＣＦＰの蛍光強度値を求める。この値は、ＦＲＥＴが発生していないときのドナーの蛍光強度Ｆｄを示す。この演算は、画素ごとに行われる。
【００７１】
この後、制御演算部４は、取得した蛍光画像および作成したグラフのデータを保存する（ステップＳ４３０）。これらのデータは、制御演算部４が有する記憶装置内に格納される。蛍光画像の各画素の輝度値は、その画素に対応する試料５上の位置から発した蛍光の強度を示す。
【００７２】
続いて、制御演算部４は、画像演算を実行し、各測定時刻における蛍光強度比画像およびＦＲＥＴ効率画像を生成する（ステップＳ４４０）。蛍光強度比画像は、ステップＳ３６０で算出された各画素の蛍光強度比、すなわち（ＥＹＦＰの蛍光強度）／（ＥＣＦＰの蛍光強度）を輝度として有する画像である。また、ＦＲＥＴ効率画像は、各画素について算出されたＦＲＥＴ効率を輝度として有する画像である。上述のように、制御演算部４は、ＦＲＥＴ効率Ｅｔを次の式
Ｅｔ＝１−Ｆｄ′／Ｆｄ （１）
に基づいて算出する。Ｆｄ′およびＦｄには、ステップＳ３６０およびＳ４２０で算出された値がそれぞれ代入される。この式（１）の計算は、各画素について行われる。これにより、試料５上のＦＲＥＴ効率の空間分布を画像化できる。
【００７３】
制御演算部４は、算出した蛍光強度比画像およびＦＲＥＴ効率画像のデータを保存する（ステップＳ４５０）。これらのデータは、制御演算部４が有する記憶装置内に格納される。
【００７４】
この後、制御演算部４は、蛍光強度比画像およびＦＲＥＴ効率画像の解析を開始する（ステップＳ４６０）。ここでは、試料５上におけるＦＲＥＴ効率の空間分布や時間変化が解析される。解析結果は、制御演算部４の表示装置の画面上に擬似カラー、グラフ、数値などで表示される。
【００７５】
以下では、この実施形態の効果を説明する。ＦＲＥＴ解析装置１００は、アクセプタの退色過程を連続的にモニタできる。つまり、装置１００は、アクセプタ退色用の光を試料５に照射しながら、退色中のアクセプタの蛍光強度をリアルタイムに測定できる。これは、このようなアクセプタ蛍光強度の測定に適した検出波長域λem3を検出部３が有しているからである。したがって、従来技術のように、退色中のアクセプタ蛍光強度を測定するために退色用の光の照射を停止し、光学系を組み替える必要はない。装置１００によれば、退色用の光を試料５に継続的に照射しながら、検出部３の波長域λem3の出力に基づいてアクセプタ退色の完了時点を確認できる。試料に照射する光の波長および光学系を退色中に何度も切り替えて退色の進行度を確認するという繁雑な作業は、省くことができる。したがって、装置１００によれば、ＦＲＥＴ効率の定量的な測定を簡易な作業で迅速に行うことができる。
【００７６】
また、装置１００は、退色中のアクセプタ蛍光強度をリアルタイムに測定するので、試料５に退色用の強い光を照射する時間を最小限に抑えることができる。この結果、試料５の細胞の形態異常や破壊など、試料５に対する影響を最小限にとどめることができる。例えば、細胞の形態変化にともない試料５の厚みが変化すると、ＦＲＥＴに依存しない蛍光強度の変化が生じる。この結果、ＦＲＥＴ効率を正確に求められなくなってしまう。本実施形態では、このような問題を防いで、精度良くＦＲＥＴ効率を測定できる。
【００７７】
（第２実施形態）
以下では、本発明に係る第２の実施形態を説明する。図５は、この実施形態に係るＦＲＥＴ解析装置２００の構成を示すブロック図である。ＦＲＥＴ解析装置２００は、第１実施形態の装置１００の検出部３に代えて、検出部３ａを備えている。その他の構成は、第１実施形態の装置１００と同じである。
【００７８】
検出部３ａは、フィルタ切替装置３０および光検出器３２を有している。フィルタ切替装置３０は、光検出器３２および全反射ミラー２０に光学的に結合されている。フィルタ切替装置３０および光検出器３２は、制御演算部４に電気的に接続されている。
【００７９】
フィルタ切替装置３０は、３枚のバンドパスフィルタ３１ｃ、３１ｄおよび３１ｅを内蔵している。フィルタ切替装置３０は、これらのフィルタのいずれか一つを選択的に光路上に配置する。試料５からの蛍光は、いずれか一つのフィルタに入射する。どのフィルタを光路上に配置するかは、制御演算部４からの指示に従う。フィルタ３１ｃ〜３１ｅは、それぞれ波長域λem1〜λem3をその透過波長域として有している。したがって、フィルタ切替装置３０は、入射した蛍光のうち波長域λem1〜λem3のいずれか一つの成分を透過させる。
【００８０】
フィルタ切替装置３０から出射する波長域λem1、λem2またはλem3の蛍光は、光検出器３２に入射する。光検出器３２は、例えば、冷却ＣＣＤカメラなどの撮像装置、または光電子増倍管である。光検出器３２は、その蛍光の強度に応じた出力電気信号を生成する。この出力信号は、制御演算部４へ送られる。このように、検出部３ａは、試料５からの蛍光をフィルタ切替装置３０によってフィルタリングすることにより、波長域λem1、λem2およびλem3の蛍光成分を独立に検出する。したがって、この実施形態でも、図３および図４に示される手順にしたがってＦＲＥＴ効率を測定できる。なお、ステップＳ３６０においてドナーおよびアクセプタの蛍光画像を取得するときは、フィルタ３１ｃおよび３１ｄが高速で切り替えられる。
【００８１】
ＦＲＥＴ解析装置２００は、第１実施形態の装置１００と同じ効果を奏する。装置２００は、検出波長域λem3を有するので、装置１００と同様に、退色中のアクセプタの蛍光強度をリアルタイムに測定できる。このため、ＦＲＥＴ効率の定量的な測定を簡易な作業で迅速に行うことができる。また、試料５に退色用の強い光を照射する時間を最小限に抑えて、試料５に対する影響を低減し、それによって精度良くＦＲＥＴ効率を測定できる。
【００８２】
（第３実施形態）
以下では、本発明に係る第３の実施形態を説明する。図６は、この実施形態に係るＦＲＥＴ解析装置３００の構成を示すブロック図である。ＦＲＥＴ解析装置３００は、第１実施形態の装置１００の検出部３に代えて、検出部３ｂを備えている。その他の構成は、第１実施形態の装置１００と同じである。
【００８３】
検出部３ｂは、３枚のダイクロイックミラー３５ｃ〜３５ｅ、３枚のバンドパスフィルタ３６ｃ〜３６ｅ、および３個の光検出器３７ｃ〜３７ｅを有している。ダイクロイックミラー３５ｃ、バンドパスフィルタ３６ｃおよび光検出器３７ｃは、互いに光学的に結合されている。ダイクロイックミラー３５ｃは、全反射ミラー２０およびダイクロイックミラー３５ｄとも光学的に結合されている。ダイクロイックミラー３５ｄ、バンドパスフィルタ３６ｄおよび光検出器３７ｄは、互いに光学的に結合されている。ダイクロイックミラー３５ｄは、ダイクロイックミラー３５ｅとも光学的に結合されている。ダイクロイックミラー３５ｅ、バンドパスフィルタ３６ｅおよび光検出器３７ｅは、互いに光学的に結合されている。また、光検出器３７ｃ〜３７ｅは、制御演算部４に電気的に接続されている。
【００８４】
ダイクロイックミラー３５ｃは、５６５ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５６５ｎｍ未満の波長の光を反射する。ダイクロイックミラー３５ｄは、５００ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５００ｎｍ未満の波長の光を反射する。ダイクロイックミラー３５ｅは、５６５ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５６５ｎｍ未満の波長の光を反射する。バンドパスフィルタ３６ｃ〜３６ｅは、それぞれ波長域λem1〜λem3をその透過波長域として有している。したがって、全反射ミラー２０から検出部３ｂに送られる蛍光のうち波長域λem1の成分は、光検出器３７ｄに入射し、波長域λem2の成分は、光検出器３７ｅに入射し、波長域λem3の成分は、光検出器３７ｃに入射する。なお、ダイクロイックミラー３５ｅの代わりに、全反射ミラーを使用してもよい。
【００８５】
光検出器３７ｃ〜３７ｅは、例えば、冷却ＣＣＤカメラなど撮像装置、または光電子増倍管である。光検出器３７ｃ〜３７ｅは、それぞれ入射した蛍光の強度に応じた出力電気信号を生成する。この出力信号は、制御演算部４へ送られる。
【００８６】
このように、検出部３ｂは、試料５からの蛍光をダイクロイックミラー３５ｃ〜３５ｅおよびバンドパスフィルタ３６ｃ〜３６ｅによって波長域λem1〜λem3の蛍光に分岐することにより、これらの波長域の蛍光を独立に検出する。したがって、この実施形態でも、図３および図４に示される手順にしたがってＦＲＥＴ効率を測定できる。
【００８７】
ＦＲＥＴ解析装置３００は、上記実施形態の装置と同じ効果を奏する。装置３００は、検出波長域λem3を有するので、退色中のアクセプタの蛍光強度をリアルタイムに測定できる。このため、ＦＲＥＴ効率の定量的な測定を簡易な作業で迅速に行うことができる。また、試料５に退色用の強い光を照射する時間を最小限に抑えて、試料５に対する影響を低減し、それによって精度良くＦＲＥＴ効率を測定できる。
【００８８】
（第４実施形態）
以下では、本発明に係る第４の実施形態を説明する。第４実施形態のＦＲＥＴ解析装置は、第１実施形態と同様に、図１に示される構成を有し、図３および図４に示される手順にしたがってＦＲＥＴ解析を実行する。しかし、本実施形態は、図３のステップＳ３８０においてアクセプタの退色モニタの終了を判定する手法が第１〜第３実施形態と異なっている。以下では、この相違点を中心に説明する。
【００８９】
本実施形態では、退色モニタ中に測定されるアクセプタの蛍光の輝度に基づいて、退色モニタの終了時刻を計算により求める。一般に、退色中のアクセプタの蛍光輝度は、時間の経過とともに指数関数的に減衰する。したがって、退色モニタ中にＣＣＤチップ２４ｅによって検出される光の輝度Ｉは、
Ｉ＝ａ・ｅ-bt＋ｃ （３）
のように表される。ここで、第１項ａ・ｅ-btは、アクセプタの蛍光強度を示す。ａおよびｂは定数であり、ｔは退色開始から経過した時間である。第２項ｃは、アクセプタの蛍光以外にＣＣＤチップ２４ｅによって検出される光の強度を示す。このような光としては、ＦＲＥＴ解析装置内で発生する迷光や試料５の細胞自身が持つ自家蛍光などが挙げられる。アクセプタの蛍光強度に対してｃが十分に小さければ、
Ｉ＝ａ・ｅ-bt （４）
とみなすことができる。
【００９０】
退色の初期の段階では、ｃはアクセプタの蛍光に比べ無視できるほど小さいと考えられる。そこで、本実施形態では、アクセプタ退色過程の初期に２度に分けてＣＣＤチップ２４ｅにより蛍光輝度を測定し、その結果から上記（３）式における定数ａおよびｂを求める。
【００９１】
具体的に述べると、ステップＳ３８０において制御演算部４は、退色の開始から所定の時間が経過した時刻ｔ０に、ＥＹＦＰ蛍光画像を取得する。さらに、制御演算部４は、時刻ｔ０から所定の時間が経過した時刻ｔ１に、再びＥＹＦＰ蛍光画像を取得する。これらの時刻ｔ０およびｔ１は、上記（３）式におけるｃを無視できるように、退色過程の初期に設定される。このため、時刻ｔ０およびｔ１に測定された輝度値Ｉ0およびＩ1は、
Ｉ0＝ａ・ｅ-bt0 （５）
Ｉ1＝ａ・ｅ-bt1 （６）
のように表される。これら二つの式から、定数ａおよびｂを算出できる。これにより、退色中の任意の時点におけるＥＹＦＰの蛍光強度を（４）式に基づいて推測できる。
【００９２】
制御演算部４は、ステップＳ３１０で設定された蛍光強度または減衰率の値が得られる時刻を（４）式を用いて算出する。このとき、ステップＳ３１０で設定された減衰率は、Ｉ0からの蛍光強度の減衰率、すなわち１−Ｉ／Ｉ0として扱われる。制御演算部４は、ステップＳ３１０での設定値が得られるのに要する時間を（４）式にしたがって算出し、その時間を退色モニタ開始時刻に加算して、退色モニタ終了時刻を求める。制御演算部４は、こうして算出した時刻になると、退色モニタを終了し、ステップＳ４１０以降の処理を進める。
【００９３】
本実施形態のＦＲＥＴ解析装置は、第１実施形態と同じ効果に加えて、次のような効果を奏する。本実施形態は、退色モニタの終了時点を決定するために、アクセプタの蛍光強度の測定を２回しか必要としない。したがって、ＦＲＥＴ効率をいっそう迅速に測定することができる。
【００９４】
ただし、本実施形態の手法では、上記（３）式におけるｃが無視できないほど大きい場合、退色モニタ終了時点の判断精度が低下する。また、上記（３）式が何らかの要因で成立しない場合もある。これらの場合には、第１〜第３実施形態で採用する手法によって退色モニタの終了時点を判定することが好ましい。
【００９５】
なお、本実施形態で採用したアクセプタ退色時点の決定手法は、図５および図６に示される構成のＦＲＥＴ解析装置にも採用できる。
【００９６】
以上、本発明をその実施形態に基づいて詳細に説明した。しかし、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【００９７】
上記実施形態では、ドナーおよびアクセプタのペアとして、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰが使用されている。しかし、本発明は、他の蛍光色素の組合せにも適用できる。このような色素の組合せとしては、例えば、（ドナー：ＥＧＦＰ、アクセプタ：ＲＦＰ）や、（ドナー：ＥＹＦＰ、アクセプタ：ＲＥＰ）が挙げられる。上記実施形態と異なる色素の組合せを使用する場合でも、フィルタ、ダイクロイックミラーまたはプリズムの波長特性をそれらの色素に合わせて設定すれば、上記実施形態と同じ効果を得ることができる。
【００９８】
【発明の効果】
この発明の蛍光移動エネルギー解析装置は、アクセプタ退色用の光を試料に照射しながらアクセプタ蛍光強度を測定するのに適した検出波長域を有しているので、退色中のアクセプタ蛍光強度をリアルタイムに測定できる。このため、蛍光エネルギー移動効率の定量的な測定を簡易な作業で迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１実施形態のＦＲＥＴ解析装置の構成を示すブロック図である。
【図２】ドナーおよびアクセプタの蛍光スペクトルおよび吸収スペクトル、ならびに実施形態のＦＲＥＴ解析装置で使用される波長域を示すグラフである。
【図３】ＦＲＥＴ解析の手順を示すフローチャートである。
【図４】ＦＲＥＴ解析の手順を示すフローチャートである。
【図５】第２実施形態のＦＲＥＴ解析装置の構成を示すブロック図である。
【図６】第３実施形態のＦＲＥＴ解析装置の構成を示すブロック図である。
【図７】ドナーおよびアクセプタの蛍光スペクトルおよび吸収スペクトル、ならびに従来技術のＦＲＥＴ解析装置で使用される波長域を示すグラフである。
【符号の説明】
１…投光部、２…光学系、３…検出部、４…制御演算部、５…試料、１０…光源、１２…シャッタ、１３…ＮＤフィルタ切替装置、１４…波長選択装置、１６…ダイクロイックミラー切替装置、１８…対物レンズ、２０…全反射ミラー、２２…３板ＣＣＤカメラ、２３…プリズム、２４ｃ〜２４ｅ…ＣＣＤチップ。
【発明の属する技術分野】
この発明は、蛍光エネルギー移動現象の解析に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer：ＦＲＥＴ）は、ある蛍光分子から他の分子へ励起エネルギーが移動する現象である。エネルギーを他の分子へ与える分子はドナー、エネルギーを受け取る分子はアクセプタと呼ばれる。ＦＲＥＴが起きると、ドナーの蛍光は弱まる。アクセプタが蛍光分子であれば、アクセプタから蛍光が発する。
【０００３】
細胞内で起こるＦＲＥＴを顕微鏡観察によって測定する場合、ドナーを励起したときのドナーおよびアクセプタの蛍光強度をそれぞれ測定し、両者の比（アクセプタの蛍光強度／ドナーの蛍光強度）を計算することが簡便な測定方法としてよく行われている（例えば、非特許文献１参照）。ドナーとアクセプタの蛍光強度は、検出器の前に配置するバンドパスフィルタを切り替えることで、順次に測定できる。また、ドナーとアクセプタの蛍光をダイクロイックミラーで分離した後、バンドパスフィルタに通すことで、それぞれの蛍光を二つの検出器（Ｗ−ｖｉｅｗ光学系を使えば一つの検出器）で同時に検出することもできる。検出器としては、例えば、冷却型ＣＣＤカメラなどのカメラや、光電子増倍管が使用される。
【０００４】
この方法では、ドナーの蛍光が弱まり、アクセプタの蛍光が強まるというＦＲＥＴ特有の蛍光の変化が確認できる。ドナーおよびアクセプタの蛍光強度比を算出することは、蛍光強度の変化量を明確に示す。また、この方法では、細胞の厚さ、色素の分布および光源の照明むらに起因する蛍光強度の変動がキャンセルされるため、都合がよい。しかし、この方法は、ＦＲＥＴの変化を検出することはできても、蛍光強度比の定量的な測定には向かない。細胞内に存在するドナーおよびアクセプタの量比が変わったり、蛍光を検出する波長域が変更されたり、使用する蛍光試薬の種類が変更されたり、検出器の分光感度特性が変わったときなどには、それに応じて蛍光強度比の値も変化する。このため、これらの実験条件が変わる前後の測定値の間では、定量的な比較ができない。
【０００５】
実験条件が異なる場合にも定量的に比較できる値として、ＦＲＥＴ効率（Ｅｔ）がある。これを求めるための計算式の一つとして、Ｅｔ＝１−Ｆｄ′／Ｆｄが知られている。ここで、Ｆｄは、ＦＲＥＴが起きていないときのドナーの蛍光強度、Ｆｄ′は、ＦＲＥＴが起きているときのドナーの蛍光強度である。Ｆｄの値は、ドナーとアクセプタを含む試料にアクセプタの吸収波長の光を照射し、測定範囲内にあるすべてのアクセプタ分子を光退色によって壊した後にドナーの蛍光強度を測定することで求めることができる。この退色実験の前にＦｄ′を経時的に測定しておけば、計算によりＥｔの時間変化を知ることができる。
【０００６】
Ｆｄ′の測定の後、退色実験を行うときは、試料に照射する光の波長とダイクロイックミラーをＦｄ′測定用のものから退色用のものに切り替える。ドナーの吸収波長域を含まず、かつ、なるべく広くアクセプタの吸収波長域を含む強い光が試料に照射される。これは、ドナーの蛍光に退色などの影響を与えずに、なるべく迅速にアクセプタを退色させるためである。しかし、退色用の光の波長域は、アクセプタの蛍光波長域の一部と重なることが多い。そのため、アクセプタの蛍光をモニタするための検出器には、退色用の光のダイクロイックミラーからの漏れ光が入る。この漏れ光が過大な強度を有するため、検出器によってアクセプタの退色過程をモニタすることができなくなる。
【０００７】
例えば、ドナーとしてＥＣＦＰ、アクセプタとしてＥＹＦＰという蛍光色素を使用し、それぞれの蛍光をフィルタで分光して測定する場合を想定する。図７は、ＥＣＦＰの吸収スペクトル５１および蛍光スペクトル５２、ならびにＥＹＦＰの吸収スペクトル５３および蛍光スペクトル５４を示している。これらのスペクトルを考慮して、ＥＣＦＰの励起用に４４０ｎｍ（半値幅２０ｎｍ）、ＥＣＦＰの蛍光用に４８０ｎｍ（半値幅３０ｎｍ）、ＥＹＦＰの蛍光用に５３５ｎｍ（半値幅２５ｎｍ）の透過波長域ａ、ｃおよびｄをそれぞれ有するバンドパスフィルタが使用される。この場合、４５５ｎｍ以上の波長の光を透過させるダイクロイックミラーが使用される。この後、ＥＹＦＰを退色させるときには、ＥＣＦＰの吸収波長域を含まずにＥＹＦＰの吸収波長域を広く含むように、５２５ｎｍ（半値幅４５ｎｍ）の透過波長域ｂを有するバンドパスフィルタが使用される。この場合、５６０ｎｍのダイクロイックミラーが使用される（例えば、非特許文献２および３参照）。なるべく強い光を試料に照射するために、光路に減光フィルタなどが入っている場合には、これを光路から取り除く。したがって、ＥＹＦＰの退色実験の際には、ＥＹＦＰ測定用の検出器にこの強い照明光の一部が入ることになる。
【０００８】
したがって、どの時点で退色が完了し、光の照射を停止すべきかを知るためには、退色用の光をある時間にわたって試料に照射した後、顕微鏡のダイクロイックミラーやフィルター等の設定を蛍光測定用のものに戻してアクセプタの蛍光を測定する。その後、再び退色のための設定に戻して、退色用の光を試料に照射する。このような作業を、アクセプタの蛍光の減衰がなくなるまで繰り返し行わなければならない（例えば、非特許文献４参照）。このような作業は煩雑である。
【０００９】
このほかに、ＦＲＥＴ効率を定量的に求める方法として、ドナーの蛍光の退色速度を求める方法がある。この場合、ＦＲＥＴ効率Ｅｔは、Ｅｔ＝１−τbl／τ′blで表される。ここで、τblは、ＦＲＥＴが起きていないときのドナー蛍光の退色速度、τ′blは、ＦＲＥＴが起きているときのドナー蛍光の退色速度である。ドナー蛍光の退色速度は、ドナーの吸収波長の光を連続して試料に照射しながら蛍光強度を時間を追って何回か計測したときの蛍光強度の減衰速度として求められる。しかし、この方法では、測定のときにドナーの蛍光を退色させてしまうため、同一試料でＦＲＥＴ効率の時間変化を追うことができない。また、τblを求めるための領域を試料内に設け、その領域内のアクセプタ分子をあらかじめ光退色によって壊す必要があり、この点で作業が煩雑である（例えば、非特許文献５および６）。
【００１０】
【非特許文献１】
Miyawaki, A. et al., Nature, 388, 882-887, 1997
【非特許文献２】
宮脇敦史、「ＧＦＰを用いた分子間ＦＲＥＴ」、生体の科学、
５３巻１号、２００２年２月、７５−８１頁
【非特許文献３】
Sawano, A., Biophysical Journal, 82, 1076-1085, 2002/09/09
【非特許文献４】
Miyawaki, A. and Tsien, R. Y., Methods in Enzymology, 327,
４72-500, 2000
【非特許文献５】
Wouters, F. S. et al., EMBO J., 17, 7179-7189, 1998
【非特許文献６】
Bastiaens, P. I. H. et al., Proceedings of the Second
Hamamatsu International Symposium on Biomolecular Mechanisms
and Photonics: Cell-Cell Communication, 77-82, 1995
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、蛍光エネルギー移動効率を簡易な作業で定量的に測定することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明の蛍光エネルギー移動解析装置は、ドナーおよびアクセプタを含む試料の蛍光エネルギー移動効率を測定する。この装置は、投光部、検出部および演算部を備えている。投光部は、試料に照射すべきドナー励起用の光およびアクセプタ退色用の光を選択的に放出する。検出部は、ドナー励起用の光の試料への照射に起因して試料から発する蛍光を検出し、その蛍光の強度に応じた出力を生成する。演算部は、検出部の出力を用いて蛍光エネルギー移動効率を算出する。検出部は、互いに異なる第１、第２および第３の波長域の光を独立に検出する。第１波長域は、アクセプタの蛍光スペクトルとの間よりもドナーの蛍光スペクトルとの間に大きな重なりを有している。第２波長域は、ドナーの蛍光スペクトルとの間よりもアクセプタの蛍光スペクトルとの間に大きな重なりを有している。第３波長域は、ドナーの蛍光スペクトルとの間よりもアクセプタの蛍光スペクトルとの間に大きな重なりを有しており、かつ、アクセプタ退色用の光の波長域との間に実質的な重なりを有さない。
【００１３】
ドナー励起用の光を投光部から試料に照射すれば、試料中のドナーが励起されて蛍光が発する。また、ドナーからの蛍光エネルギー移動によって、試料中のアクセプタからも蛍光が発する。検出部の第１および第２波長域の出力は、蛍光エネルギー移動が起きているときのドナーおよびアクセプタの蛍光強度をそれぞれ示す。この後、アクセプタ退色用の光を投光部から試料に照射すれば、アクセプタの退色が始まる。退色により、アクセプタの蛍光の強度は徐々に弱まっていく。検出部の第３波長域の出力は、退色中におけるアクセプタの蛍光強度を示す。したがって、第３波長域の出力をモニタすることにより、退色の完了時点を確認できる。退色が完了した後、退色用の光の照射を停止し、ドナー励起用の光を再び試料に照射すれば、第１波長域の出力は、蛍光エネルギー移動が起きていないときのドナーの蛍光強度を示す。したがって、退色の前後における第１波長域の出力を用いることにより、Ｅｔ＝１−Ｆｄ′／Ｆｄの式にしたがって蛍光エネルギー移動効率を定量的に求めることができる。
【００１４】
第３波長域は、アクセプタの蛍光スペクトルと重なりを有し、かつ、アクセプタ退色用の光の波長域を実質的に含まない。したがって、第３波長域は、アクセプタ退色用の光を試料に照射しながらのアクセプタ蛍光強度の測定に適している。検出部がこのような第３波長域を有しているので、アクセプタ退色用の光を継続的に照射しながら、第３波長域の出力に基づいてアクセプタ退色の完了時点を確認できる。従来技術のように、退色中のアクセプタ蛍光強度を測定するためにアクセプタ退色用の光の照射を停止したり、光学系を切り替える必要はない。したがって、本発明の装置は、簡易な作業で迅速に蛍光エネルギー移動効率を求めることができる。
【００１５】
投光部は、減光フィルタを光路上に配置する減光手段を有していてもよい。投光部がドナー励起用の光を放出するとき、減光手段は、ドナー励起用の光が減光フィルタを通過するように減光フィルタを光路上に配置する。投光部がアクセプタ退色用の光を放出するとき、減光手段は、アクセプタ退色用の光が減光フィルタを通過しないように、減光フィルタを光路上から取り除く。減光フィルタによってドナー励起用の光の強度が低減されるので、検出部を飽和させることなくドナーおよびアクセプタの蛍光を検出できる。アクセプタ退色用の光の強度は低減されないので、アクセプタを効率良く退色させることができる。
【００１６】
投光部は、ドナー励起用の光の波長域およびアクセプタ退色用の光の波長域の双方にわたって発光する光源と、光源から光を受光するとともに減光フィルタを光路上に配置する減光手段と、減光手段から光を受光し、ドナー励起用の光の波長域およびアクセプタ退色用の光の波長域のいずれか一方の成分を抽出する波長選択手段とを有していてもよい。投光部がドナー励起用の光を放出するとき、減光手段は、光源からの光が減光フィルタを通過してから波長選択手段に向かうように減光フィルタを光路上に配置する。投光部がアクセプタ退色用の光を放出するとき、減光手段は、光源からの光が減光フィルタを通過しないように、減光フィルタを光路上から取り除く。減光フィルタによってドナー励起用の光の強度が低減されるので、検出部を飽和させることなくドナーおよびアクセプタの蛍光を検出できる。アクセプタ退色用の光の強度は低減されないので、アクセプタを効率良く退色させることができる。
【００１７】
検出部の第３波長域は、アクセプタ退色用の光が試料に照射されるときにアクセプタから発する蛍光を検出部が飽和することなく検出できるような重なりをアクセプタの蛍光スペクトルとの間に有していることが好ましい。アクセプタ退色用の光の強度は低減されないため、退色中に発するアクセプタの蛍光は大きな強度を有する。この場合でも、第３波長域とアクセプタの蛍光スペクトルとの重なりが十分に小さければ、第３波長域で検出される蛍光の強度は、検出部が飽和しない程度の大きさとなる。例えば、第３波長域がアクセプタの蛍光スペクトルのうち低強度の領域とだけ重なっていると、第３波長域で検出される蛍光強度を十分に抑えられる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照しながら本発明の実施形態を詳細に説明する。なお、理解の容易のため、図面に共通の同一要素を表すときは、可能な限り、同一の参照番号を使用する。また、図示の便宜上、図面の寸法比率は説明のものと必ずしも一致しない。
【００１９】
図１は、本実施形態の蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）解析装置１００の構成を示すブロック図である。ＦＲＥＴ解析装置１００は、試料５のＦＲＥＴ効率を測定する。試料５には、蛍光色素であるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰが含まれている。ＥＣＦＰはドナーであり、ＥＹＦＰはアクセプタである。図２は、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示している。図２には、ＦＲＥＴ解析装置１００が利用する各種の波長域も示されている。
【００２０】
ＦＲＥＴ解析装置１００は、次の計算式
Ｅｔ＝１−Ｆｄ′／Ｆｄ （１）
にしたがってＦＲＥＴ効率を算出する。ここで、ＥｔはＦＲＥＴ効率、ＦｄはＦＲＥＴが起きていないときのドナーの蛍光強度、Ｆｄ′はＦＲＥＴが起きているときのドナーの蛍光強度である。
【００２１】
装置１００は、まず、ドナー励起用の光を試料５に照射してＦＲＥＴを発生させ、ドナーの蛍光強度をＦｄ′として測定する。次に、装置１００は、アクセプタ退色用の光を試料５に照射してアクセプタを破壊する。その後で、装置１００は、ドナーの蛍光強度をＦｄとして測定する。装置１００は、こうして測定したＦｄおよびＦｄ′を用いてＥｔを算出する。
【００２２】
図１に示されるように、ＦＲＥＴ解析装置１００は、投光部１、光学系２、検出部３および制御演算部４から構成されている。投光部１、光学系２および検出部３は、互いに光学的に結合されている。投光部１、光学系２および検出部３は、制御演算部４に電気的に接続されている。
【００２３】
投光部１は、試料５に照射すべきドナー励起用の光およびアクセプタ退色用の光のいずれか一方を選択的に放出する。投光部１は、互いに光学的に結合された光源１０、シャッタ１２、ＮＤフィルタ切替装置１３および波長切替装置１４を有している。シャッタ１２、ＮＤフィルタ切替装置１３および波長切替装置１４は、信号線を介して制御演算部４に電気的に接続されている。
【００２４】
光源１０は、ドナー励起用の波長域およびアクセプタ退色用の波長域の双方にわたって発光する。この実施形態では、光源１０として白色光源、例えば、キセノンランプが使用される。
【００２５】
シャッタ１２は、光源１０とＮＤフィルタ切替装置１３の間の光路上に配置されている。シャッタ１２は、光源１０から発する光のＮＤフィルタ切替装置１３への入射を制御する。光源１０から発する光は、シャッタ１２が開いているときはＮＤフィルタ切替装置１３に入射し、シャッタ１２が閉じているときはＮＤフィルタ切替装置１３に入射しない。
【００２６】
ＮＤフィルタ切替装置１３は、光源１０から発する光の強度を低減可能な減光手段である。ＮＤフィルタ切替装置１３は、シャッタ１２から光を受け取り、波長切替装置１４に送る。ＮＤフィルタ切替装置１３は、減光フィルタとして複数枚のＮＤフィルタを内蔵している。これらのＮＤフィルタは、互いに異なる光透過率（例えば、１０％、１％および０．１％）を有している。
【００２７】
ＦＲＥＴを起こさせるとき、ＮＤフィルタ切替装置１３は、これらのＮＤフィルタのうち一枚を光路上に配置する。ドナー励起用の光は、ＮＤフィルタを通過し、その結果、その強度が低減される。適正なＮＤフィルタを光路上に配置することにより、検出部３の感度に見合った強度を持つ試料５の蛍光像を検出部３に送ることができる。
【００２８】
また、ＮＤフィルタ切替装置１３は、いずれのＮＤフィルタも光路上に配置しないことが可能である。この場合、ＮＤフィルタ切替装置１３の光透過率は、１００％となる。後述するように、アクセプタを退色させるときは、ＮＤフィルタ切替装置１３は、ＮＤフィルタを光路から取り除く。このため、アクセプタ退色用の光はＮＤフィルタを通過せず、したがって、その強度は低減されない。
【００２９】
光源１０から発した光は、シャッタ１２およびＮＤフィルタ切替装置１３を通過して、波長切替装置１４に入射する。波長切替装置１４は、光源１０で発した光から特定の波長成分を切替可能に抽出する。すなわち、波長切替装置１４は、フィルタ装置の一種である。波長切替装置１４は、モノクロメータ、バンドパスフィルタ、その他の波長選択手段を用いて作製することができる。
【００３０】
波長切替装置１４は、光源１０からの光を受け取ると、波長域λex1およびλex2のいずれかを有する成分を透過させる。λex1は、４３０ｎｍ以上４５０ｎｍ以下（中心波長４４０ｎｍ、半値幅２０ｎｍ）の波長域である。λex2は、５０２．５ｎｍ以上５４７．５ｎｍ以下（中心波長５２５ｎｍ、半値幅４５ｎｍ）の波長域である。波長域λex1の光は、試料５中のドナーＥＣＦＰを励起し、蛍光を生じさせる。波長域λex2の光は、試料５中のアクセプタＥＹＦＰを退色させる。波長域λex1およびλex2は、ドナーＥＣＦＰおよびアクセプタＥＹＦＰの吸収スペクトルを考慮して決められている。
【００３１】
ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの吸収スペクトルは、図２に示されている。図２において、破線５１がＥＣＦＰの吸収スペクトルを示し、破線５３がＥＹＦＰの吸収スペクトルを示している。実線ａは波長域λex1を示し、実線ｂは波長域λex2を示している。波長域λex1は、ＥＣＦＰの吸収スペクトル５１との間に重なりを有しており、吸収スペクトル５１のピーク波長を含んでいる。波長域λex2は、ＥＹＦＰの吸収スペクトル５３との間に重なりを有しており、吸収スペクトル５３のピーク波長を含んでいる。波長域λex2は、ＥＣＦＰの吸収スペクトル５１とは重ならない。
【００３２】
光学系２は、投光部１から放出された光を受け取り、試料５に照射する。また、試料５から発した蛍光を受け取り、検出部３へ送る。光学系２は、投光部１からの光が試料５によって反射されて検出部３へ入射することを防止する。ＦＲＥＴ装置１００を顕微鏡とみなせば、光学系２は、落射照明光学系に当たる。
【００３３】
光学系２は、互いに光学的に結合されたダイクロイックミラー切替装置１６、対物レンズ１８および全反射ミラー２０を有している。ダイクロイックミラー切替装置１６は、投光部１の波長切替装置１４とも光学的に結合されている。また、ダイクロイックミラー切替装置１６は、信号線を介して制御演算部４に電気的に接続されている。
【００３４】
波長切替装置１４から出射した光は、ダイクロイックミラー切替装置１６に入射する。ダイクロイックミラー切替装置１６は、異なる特性を有する二枚のダイクロイックミラーＤＭ１およびＤＭ２を内蔵している。ダイクロイックミラー切替装置１６は、これらのダイクロイックミラーのいずれか一方を選択的に光路上に配置する。このため、波長切替装置１４からの光は、いずれか一方のダイクロイックミラーに入射する。どちらのミラーを光路上に配置するかは、制御演算部４からの指示に従う。ダイクロイックミラーＤＭ１は、４５５ｎｍ以上の波長の光を透過させ、４５５ｎｍ未満の波長の光は反射する。ダイクロイックミラーＤＭ２は、５６０ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５６０ｎｍ未満の波長の光は反射する。これらのダイクロイックミラーは、投光部１からの光を反射して試料５に送るとともに、試料５で反射された投光部１からの光を遮断して、検出部３に入射しないようにするために使用される。
【００３５】
対物レンズ１８は、ダイクロイックミラー切替装置１６と試料５の間に配置される。言い換えると、試料５のＦＲＥＴ解析を行う場合は、試料５を対物レンズ１８に対向させて配置する。対物レンズ１８は、ダイクロイックミラーＤＭ１またはＤＭ２で反射された投光部１の出射光を受け取り、これを集光して試料５に照射する。また、対物レンズ１８は、試料５から発する蛍光を受け取り、これをダイクロイックミラー切替装置１６に送る。
【００３６】
全反射ミラー２０は、ダイクロイックミラー切替装置１６を挟んで対物レンズ１８の反対側に配置されている。全反射ミラー２０は、対物レンズ１８およびダイクロイックミラー切替装置１６を介して、試料５から発する蛍光を受け取る。全反射ミラー２０は、受け取った蛍光を検出部３に向けて高い反射率で反射する。
【００３７】
検出部３は、３板ＣＣＤカメラ２２から構成されている。３板ＣＣＤカメラ２２は、試料５から発する蛍光を検出して画像化する撮像装置である。３板ＣＣＤカメラ２２は、全反射ミラー２０によって反射された試料５からの蛍光を受け取り、その蛍光の強度に応じた電気出力信号を生成する。この出力信号は、試料５上における蛍光の空間分布画像（以下、「蛍光画像」と呼ぶ）を表す。この出力信号は、制御演算部４に送られる。
【００３８】
３板ＣＣＤカメラ２２は、プリズム２３と、３枚のＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅを搭載している。プリズム２３は、ＣＣＤカメラ２２の光入射部に配置されている。全反射ミラー２０からの光は、プリズム２３の光入射面に入射する。ＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅは、プリズム２３の光出射面と対向している。プリズム２３は、分光器である。プリズム２３は、全反射ミラー２０から光を受け取ると、その光を波長に応じた方向に分散させる。プリズム２３の分光特性は、異なる波長域λem1〜λem3の光がＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅにそれぞれ入射するように設定されている。これらの波長域は、実質的に重なりを有さない。各ＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅは、入射光の強度に応じた出力電気信号を生成する光検出器である。したがって、ＣＣＤカメラ２２は、入射光の異なる波長域λem1〜λem3の成分を独立に検出できる。本実施形態では、λem1は４６０ｎｍ以上５００ｎｍ未満の波長域であり、λem2は５００ｎｍ以上５６５ｎｍ未満の波長域であり、λem3は５６５ｎｍ以上６００ｎｍ以下の波長域である。波長域λem1〜λem3は、ドナーＥＣＦＰおよびアクセプタＥＹＦＰの蛍光スペクトルを考慮して決められている。
【００３９】
ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光スペクトルは、図２に示されている。図２において、実線５２がＥＣＦＰの蛍光スペクトルを示し、実線５４がＥＹＦＰの蛍光スペクトルを示している。実線ｃは波長域λem1を示し、実線ｄは波長域λem2を示し、実線ｅは波長域λem3を示している。波長域λem1は、ＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２と間に重なりを有しており、蛍光スペクトル５２のピーク波長を含んでいる。波長域λem1は、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との間には、ほとんど重なりを有さない。波長域λem2は、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との間に重なりを有しており、蛍光スペクトル５４のピーク波長を含んでいる。波長域λem2は、ＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との間にも重なりを有している。波長域λem3は、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光スペクトル５２、５４の双方と重なりを有している。
【００４０】
図２に示されるように、波長域λem1とＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との重なりは非常に小さい。したがって、波長域λem1の蛍光成分を受け取るＣＣＤチップ２４ｃの出力は、実質的にＥＣＦＰの蛍光の強度を示す。このように、波長域λem1は、波長域λem1に関する検出部４の出力がＥＣＦＰの蛍光強度を示すように決められる。一般に、波長域λem1とＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との重なりが波長域λem1とＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との重なりよりも十分に大きければ、波長域λem1の出力（ＣＣＤチップ２４ｃの出力）をＥＣＦＰの蛍光強度を示すものとして扱うことができる。なお、本明細書では、「波長域とスペクトルとの重なり」とは、その波長域にわたるスペクトルの強度の積分値を意味する。
【００４１】
波長域λem2は、ＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との間よりも、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との間に、より大きな重なりを有している。波長域λem2とＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との重なりは、波長域λem2とＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との重なりよりも十分に大きい。したがって、波長域λem2に関する検出部４の出力（ＣＣＤチップ２４ｄの出力）をＥＹＦＰの蛍光強度を示すものとして扱うことができる。このように、波長域λem2は、波長域λem2に関する検出部４の出力がＥＹＦＰの蛍光強度を示すように決められる。
【００４２】
波長域λem3も、ＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との間よりも、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との間に、より大きな重なりを有している。また、波長域λem3は、アクセプタ退色用の光の波長域λex2とは重ならない。波長域λem3とＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４との重なりは、波長域λem3とＥＣＦＰの蛍光スペクトル５２との重なりよりも十分に大きい。波長域λem3は、ＥＹＦＰの退色中にＥＹＦＰの蛍光強度を測定するために使用される。後述するように、ＥＹＦＰを退色させるときは、ＥＣＦＰの吸収波長を含まずにＥＹＦＰの吸収波長を広く含む波長域λex2の光が試料５に照射される。このため、波長域λem3で検出される蛍光は、ほとんどすべてＥＹＦＰから発したものとなる。したがって、波長域λem3に関する検出部４の出力（ＣＣＤチップ２４ｅの出力）を退色中のＥＹＦＰの蛍光強度を示すものとして扱うことができる。
【００４３】
制御演算部４は、一つのコンピュータシステムである。制御演算部４は、ＦＲＥＴ効率の測定手順を制御する制御部と、検出部３の出力を用いてＦＲＥＴ効率を算出する演算部の双方として機能する。制御演算部４は、シャッタ１２、ＮＤフィルタ切替装置１３、波長切替装置１４、ダイクロイックミラー切替装置１６およびＣＣＤカメラ２２の動作を制御して、試料５のドナー励起およびアクセプタ退色を実行する。また、制御演算部４は、ＣＣＤカメラ２２の出力信号を用いてＦＲＥＴ解析処理を実行する。制御演算部４は、表示装置を含んでいる。制御演算部４は、ＦＲＥＴ解析の結果を表示装置の画面上に表示する。
【００４４】
次に、図３および図４を参照しながら、装置１００を用いたＦＲＥＴ解析の手順を説明する。ここで、図３および図４は、解析手順を示すフローチャートである。
【００４５】
ＦＲＥＴ解析を開始するとき、オペレータは、制御演算部４を操作して画像取得パラメータを設定する（ステップＳ３１０）。これには、ドナーおよびアクセプタの蛍光測定用の設定と、アクセプタ退色モニタ用の設定とが含まれる。蛍光測定に関連するパラメータとしては、ＣＣＤカメラ２２による画像取得数や画像取得の時間間隔などが設定される。アクセプタ退色モニタに関連するパラメータとしては、ＣＣＤカメラ２２による蛍光強度測定の時間間隔や、退色モニタを終了するときの蛍光強度値または減衰率などが設定される。
【００４６】
次に、装置１００は、ドナーおよびアクセプタからの蛍光を測定するための光学系を構築する（ステップＳ３２０）。このステップでは、制御演算部４は、波長切替装置１４に制御信号を送り、波長切替装置１４の透過波長域をλex1に設定する。また、制御演算部４は、ＮＤフィルタ切替装置１３に制御信号を送り、いずれか一枚のＮＤフィルタを選択して光路上に配置させる。さらに、制御演算部４は、ダイクロイックミラー切替装置１６に制御信号を送り、ダイクロイックミラーＤＭ１を光路上に配置させる。
【００４７】
続いて、ＣＣＤカメラ２２の感度を調整する（ステップＳ３３０）。オペレータは、制御演算部４を操作して、ＣＣＤカメラ２２の露光時間およびゲインを設定する。
【００４８】
この後、ＣＣＤカメラ２２によってダーク画像を取得する（ステップＳ３４０）。このダーク画像は、ＣＣＤカメラ２２から制御演算部４に送られる。ダーク画像は、試料５の蛍光画像のデータ補正に使用される。
【００４９】
次に、オペレータは、制御演算部４を操作して試料５上の測定領域（撮像領域）を指定する（ステップＳ３５０）。これには、ドナーおよびアクセプタの蛍光強度を測定する領域の指定と、アクセプタの退色をモニタする領域の指定とが含まれる。
【００５０】
以上の準備作業が完了すると、装置１００は、設定された条件のもとでドナーおよびアクセプタの蛍光画像を取得する（ステップＳ３６０）。以下では、このステップについて詳細に説明する。
【００５１】
制御演算部４は、ステップＳ３１０で設定された時間間隔でシャッタ１２を繰り返し開閉する。シャッタ１２が開くと、光源１０から発した白色光は、ＮＤフィルタ切替装置１３内のＮＤフィルタを通過し、波長切替装置１４に入射する。ＮＤフィルタによって、光の強度が低減される。波長切替装置１４は、波長域λex1の成分のみを透過させ、他の波長成分を遮断する。このようにして、ドナー励起用の光が生成される。波長切替装置１４から出射するドナー励起用の光は、ダイクロイックミラーＤＭ１によって反射され、対物レンズ１８を透過して試料５に照射される。これにより、試料５中のドナー、すなわちＥＣＦＰが励起され、蛍光が発生する。
【００５２】
試料５から発する蛍光には、ＥＣＦＰ自身から発するものに加えて、ＦＲＥＴによってＥＣＦＰから励起エネルギーを受け取ったＥＹＦＰ（アクセプタ）から発するものが含まれる。図２において符号５２および５４で示されるように、ＥＣＦＰの蛍光とＥＹＦＰの蛍光は、異なる波長域を有している。これらの蛍光は、対物レンズ１８を透過して、ダイクロイックミラー切替装置１６に入射する。
【００５３】
ダイクロイックミラーＤＭ１は、上述のように、４５５ｎｍ以上の波長の光を透過させ、４５５ｎｍ未満の波長の光を反射する。したがって、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰから発した蛍光の大部分は、ダイクロイックミラーＤＭ１を透過する。この蛍光は、全反射ミラー２０によって反射され、ＣＣＤカメラ２２に入射する。
【００５４】
一方、試料５によって反射されたドナー励起用の光は、ダイクロイックミラーＤＭ１によって遮断される。これは、ドナー励起用の光が、４３０〜４５０ｎｍという波長域λex1を有しているからである。このようにして、ドナー励起用の光のＣＣＤカメラ２２への入射が防がれる。
【００５５】
ＣＣＤカメラ２２内のプリズム２３は、入射した蛍光を分散し、その波長域に応じてＣＣＤチップ２４ｃ〜２４ｅに送る。これにより、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光画像が取得される。上述のように、ＥＣＦＰの蛍光は、主としてＣＣＤチップ２４ｃによって検出され、ＥＹＦＰの蛍光は、主としてＣＣＤチップ２４ｄによって検出される。
【００５６】
制御演算部４は、ＣＣＤチップ２４ｃの出力値からＣＣＤチップ２４ｃのダークを減算し、得られた値を換算してＥＣＦＰの蛍光強度を求める。また、制御演算部４は、ＣＣＤチップ２４ｄの出力値からＣＣＤチップ２４ｄのダークを減算し、得られた値を換算してＥＹＦＰの蛍光強度を求める。この演算は、画素ごとに行われる。このようにして、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光画像が得られる。制御演算部４は、（ＥＹＦＰの蛍光強度）／（ＥＣＦＰの蛍光強度）で表される蛍光強度比を算出する。制御演算部４は、算出した蛍光強度比の値を表示装置上に表示する。
【００５７】
制御演算部４は、上記のような蛍光画像の取得をステップＳ３１０で設定された回数にわたって繰り返す。蛍光画像が取得されるたびに、蛍光強度比が表示される。各測定時刻におけるＥＣＦＰの蛍光強度が、その時刻でのＦｄ′（上記（１）式を参照）である。
【００５８】
蛍光画像の取得が終了すると、装置１００は、アクセプタの退色をモニタするための光学系を構築する（ステップＳ３７０）。制御演算部４は、波長切替装置１４に制御信号を送り、その透過波長域をλex1からλex2に変更させる。また、制御演算部４は、ＮＤフィルタ切替装置１３に制御信号を送り、ＮＤフィルタを光路上から取り除かせる。さらに、制御演算部４は、ダイクロイックミラー切替装置１６に制御信号を送り、ダイクロイックミラーＤＭ１に代えてダイクロイックミラーＤＭ２を光路上に配置させる。
【００５９】
次に、アクセプタの退色モニタが開始される（ステップＳ３８０）。波長切替装置１４は、波長域λex2の成分のみを透過させ、他の波長成分を遮断する。このようにして、アクセプタ退色用の光が生成される。波長切替装置１４から出射するアクセプタ退色用の光は、ダイクロイックミラーＤＭ２によって反射され、対物レンズ１８を透過して試料５に照射される。これにより、試料５中のアクセプタ、すなわちＥＹＦＰが退色を始める。この照射光は、ＮＤフィルタによって減光されていないので、高い強度を有する。したがって、この照射光は、アクセプタを効率良く退色させることができる。
【００６０】
退色用の光の波長域λex2は、図２において実線ｂで示されるように、ＥＣＦＰの吸収波長を含まず、かつ、ＥＹＦＰの吸収波長を広く含んでいる。このため、試料５から発する蛍光は、そのほとんどがＥＹＦＰから生じたものとなる。この蛍光は、対物レンズ１８を透過して、ダイクロイックミラー切替装置１６に入射する。
【００６１】
ダイクロイックミラーＤＭ２は、上述のように、５６０ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５６０ｎｍ未満の波長の光を反射する。したがって、図２に示されるＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４から明らかなように、ＥＹＦＰの蛍光の一部のみがダイクロイックミラーＤＭ２を透過する。この蛍光は、全反射ミラー２０によって反射され、ＣＣＤカメラ２２に入射する。
【００６２】
一方、試料５によって反射されたアクセプタ退色用の光は、ダイクロイックミラーＤＭ２によって遮断される。これは、アクセプタ退色用の光が、５０２．５〜５４７．５ｎｍという波長域λex2を有しているからである。このようにして、アクセプタ退色用の光のＣＣＤカメラ２２への入射が防がれる。
【００６３】
ＣＣＤカメラ２２に入射した蛍光のほとんどは、５６５ｎｍ以上６００ｎｍ以下の検出波長域λem3を有するＣＣＤチップ２４ｅによって検出される。これは、ダイクロイックミラーＤＭ２が５６０ｎｍ以上の波長の蛍光を透過させるからである。上述のように、退色用の光の波長域λex2は、ＥＣＦＰの吸収スペクトルと重ならないので、退色中にＥＣＦＰは蛍光をほとんど発しない。また、検出波長域λem3は、退色用の光の波長域λex2と重ならないので、ダイクロイックミラーＤＭ２から退色用の光が漏れて検出部３に入射しても、その漏れ光は波長域λem3では検出されない。したがって、ＣＣＤチップ２４ｅの出力は、退色中のＥＹＦＰの蛍光強度を示す。
【００６４】
なお、退色用の光はＮＤフィルタによって減光されていないので強度が大きく、それに応じてＥＹＦＰの蛍光の強度も大きくなる。もしも過大な強度の蛍光がＣＣＤチップ２４ｅに入射すると、ＣＣＤチップ２４ｅが飽和して、蛍光の強度を測定できなくなる。しかし、ＣＣＤチップ２４ｅの検出波長域λem3は、ＥＹＦＰの蛍光スペクトル５４のうち長波長側の裾とだけ重なっている。蛍光スペクトル５４の裾では、蛍光の強度が低い。このため、ＣＣＤチップ２４ｅは、ＣＣＤチップ２４ｅを飽和させない適当な強度のＥＹＦＰ蛍光を検出できる。このように、ＣＣＤチップ２４ｅは、退色用の光を試料５に照射している間、ＥＹＦＰの蛍光を適切に検出し、蛍光画像を取得できる。
【００６５】
制御演算部４は、ＣＣＤチップ２４ｅの出力値からＣＣＤチップ２４ｅのダークを減算し、得られた値を換算して退色中のＥＹＦＰの蛍光強度を求める。この演算は、画素ごとに行われる。このようにして、退色中におけるＥＹＦＰ蛍光画像が得られる。制御演算部４は、求めた蛍光強度の値を表示装置上に表示する。
【００６６】
制御演算部４は、上記のような退色中におけるＥＹＦＰ蛍光画像の取得をステップＳ３１０で設定された時間間隔で繰り返す。ＥＹＦＰ蛍光画像が取得されるたびに、蛍光強度値が表示される。また、制御演算部４は、蛍光強度の減衰率も画像取得のたびに算出する。減衰率Ａは、以下の式にしたがって算出される。
【００６７】
Ａ＝１−Ｉt／Ｉt-1 …（２）
ここで、Ｉtは今回の画像取得時に得られたアクセプタの蛍光強度であり、Ｉt-1は前回の画像取得時に得られたアクセプタの蛍光強度である。アクセプタの退色が進むにつれて、減衰率Ａは０に近づく。
【００６８】
制御演算部４は、蛍光画像を取得するたびに、算出した蛍光強度または減衰率を、ステップＳ３１０で設定された値と比較する。蛍光強度または減衰率がステップＳ３１０で設定された値よりも小さくなると、制御演算部４は、ＥＦＹＰの退色が完了したと判断し、退色モニタを終了する。このように、制御演算部４は、退色中のアクセプタ蛍光強度に基づいてアクセプタの退色が完了したか否かを判断する。
【００６９】
制御演算部４は、アクセプタの退色が完了したと判断すると、ドナーであるＥＣＦＰの蛍光を測定するための光学系を構築する（ステップＳ４１０）。制御演算部４は、波長切替装置１４に制御信号を送り、その透過波長域をλex2からλex1に戻す。また、制御演算部４は、ＮＤフィルタ切替装置１３に制御信号を送り、ステップＳ３２０で使用したＮＤフィルタと同じＮＤフィルタを光路上に配置させる。さらに、制御演算部４は、ダイクロイックミラー切替装置１６に制御信号を送り、ダイクロイックミラーＤＭ２に代えてダイクロイックミラーＤＭ１を再び光路上に配置させる。
【００７０】
この後、波長域λex1の光が投光部１から試料５に再び照射され、ドナーの蛍光画像がＣＣＤカメラ２２中のＣＣＤチップ２４ｃによって取得される（ステップＳ４２０）。これは、上記のステップＳ３６０と同様に行われる。制御演算部４は、ＣＣＤチップ２４ｃの出力値からダークを減算し、得られた値を換算して、ドナーＥＣＦＰの蛍光強度値を求める。この値は、ＦＲＥＴが発生していないときのドナーの蛍光強度Ｆｄを示す。この演算は、画素ごとに行われる。
【００７１】
この後、制御演算部４は、取得した蛍光画像および作成したグラフのデータを保存する（ステップＳ４３０）。これらのデータは、制御演算部４が有する記憶装置内に格納される。蛍光画像の各画素の輝度値は、その画素に対応する試料５上の位置から発した蛍光の強度を示す。
【００７２】
続いて、制御演算部４は、画像演算を実行し、各測定時刻における蛍光強度比画像およびＦＲＥＴ効率画像を生成する（ステップＳ４４０）。蛍光強度比画像は、ステップＳ３６０で算出された各画素の蛍光強度比、すなわち（ＥＹＦＰの蛍光強度）／（ＥＣＦＰの蛍光強度）を輝度として有する画像である。また、ＦＲＥＴ効率画像は、各画素について算出されたＦＲＥＴ効率を輝度として有する画像である。上述のように、制御演算部４は、ＦＲＥＴ効率Ｅｔを次の式
Ｅｔ＝１−Ｆｄ′／Ｆｄ （１）
に基づいて算出する。Ｆｄ′およびＦｄには、ステップＳ３６０およびＳ４２０で算出された値がそれぞれ代入される。この式（１）の計算は、各画素について行われる。これにより、試料５上のＦＲＥＴ効率の空間分布を画像化できる。
【００７３】
制御演算部４は、算出した蛍光強度比画像およびＦＲＥＴ効率画像のデータを保存する（ステップＳ４５０）。これらのデータは、制御演算部４が有する記憶装置内に格納される。
【００７４】
この後、制御演算部４は、蛍光強度比画像およびＦＲＥＴ効率画像の解析を開始する（ステップＳ４６０）。ここでは、試料５上におけるＦＲＥＴ効率の空間分布や時間変化が解析される。解析結果は、制御演算部４の表示装置の画面上に擬似カラー、グラフ、数値などで表示される。
【００７５】
以下では、この実施形態の効果を説明する。ＦＲＥＴ解析装置１００は、アクセプタの退色過程を連続的にモニタできる。つまり、装置１００は、アクセプタ退色用の光を試料５に照射しながら、退色中のアクセプタの蛍光強度をリアルタイムに測定できる。これは、このようなアクセプタ蛍光強度の測定に適した検出波長域λem3を検出部３が有しているからである。したがって、従来技術のように、退色中のアクセプタ蛍光強度を測定するために退色用の光の照射を停止し、光学系を組み替える必要はない。装置１００によれば、退色用の光を試料５に継続的に照射しながら、検出部３の波長域λem3の出力に基づいてアクセプタ退色の完了時点を確認できる。試料に照射する光の波長および光学系を退色中に何度も切り替えて退色の進行度を確認するという繁雑な作業は、省くことができる。したがって、装置１００によれば、ＦＲＥＴ効率の定量的な測定を簡易な作業で迅速に行うことができる。
【００７６】
また、装置１００は、退色中のアクセプタ蛍光強度をリアルタイムに測定するので、試料５に退色用の強い光を照射する時間を最小限に抑えることができる。この結果、試料５の細胞の形態異常や破壊など、試料５に対する影響を最小限にとどめることができる。例えば、細胞の形態変化にともない試料５の厚みが変化すると、ＦＲＥＴに依存しない蛍光強度の変化が生じる。この結果、ＦＲＥＴ効率を正確に求められなくなってしまう。本実施形態では、このような問題を防いで、精度良くＦＲＥＴ効率を測定できる。
【００７７】
（第２実施形態）
以下では、本発明に係る第２の実施形態を説明する。図５は、この実施形態に係るＦＲＥＴ解析装置２００の構成を示すブロック図である。ＦＲＥＴ解析装置２００は、第１実施形態の装置１００の検出部３に代えて、検出部３ａを備えている。その他の構成は、第１実施形態の装置１００と同じである。
【００７８】
検出部３ａは、フィルタ切替装置３０および光検出器３２を有している。フィルタ切替装置３０は、光検出器３２および全反射ミラー２０に光学的に結合されている。フィルタ切替装置３０および光検出器３２は、制御演算部４に電気的に接続されている。
【００７９】
フィルタ切替装置３０は、３枚のバンドパスフィルタ３１ｃ、３１ｄおよび３１ｅを内蔵している。フィルタ切替装置３０は、これらのフィルタのいずれか一つを選択的に光路上に配置する。試料５からの蛍光は、いずれか一つのフィルタに入射する。どのフィルタを光路上に配置するかは、制御演算部４からの指示に従う。フィルタ３１ｃ〜３１ｅは、それぞれ波長域λem1〜λem3をその透過波長域として有している。したがって、フィルタ切替装置３０は、入射した蛍光のうち波長域λem1〜λem3のいずれか一つの成分を透過させる。
【００８０】
フィルタ切替装置３０から出射する波長域λem1、λem2またはλem3の蛍光は、光検出器３２に入射する。光検出器３２は、例えば、冷却ＣＣＤカメラなどの撮像装置、または光電子増倍管である。光検出器３２は、その蛍光の強度に応じた出力電気信号を生成する。この出力信号は、制御演算部４へ送られる。このように、検出部３ａは、試料５からの蛍光をフィルタ切替装置３０によってフィルタリングすることにより、波長域λem1、λem2およびλem3の蛍光成分を独立に検出する。したがって、この実施形態でも、図３および図４に示される手順にしたがってＦＲＥＴ効率を測定できる。なお、ステップＳ３６０においてドナーおよびアクセプタの蛍光画像を取得するときは、フィルタ３１ｃおよび３１ｄが高速で切り替えられる。
【００８１】
ＦＲＥＴ解析装置２００は、第１実施形態の装置１００と同じ効果を奏する。装置２００は、検出波長域λem3を有するので、装置１００と同様に、退色中のアクセプタの蛍光強度をリアルタイムに測定できる。このため、ＦＲＥＴ効率の定量的な測定を簡易な作業で迅速に行うことができる。また、試料５に退色用の強い光を照射する時間を最小限に抑えて、試料５に対する影響を低減し、それによって精度良くＦＲＥＴ効率を測定できる。
【００８２】
（第３実施形態）
以下では、本発明に係る第３の実施形態を説明する。図６は、この実施形態に係るＦＲＥＴ解析装置３００の構成を示すブロック図である。ＦＲＥＴ解析装置３００は、第１実施形態の装置１００の検出部３に代えて、検出部３ｂを備えている。その他の構成は、第１実施形態の装置１００と同じである。
【００８３】
検出部３ｂは、３枚のダイクロイックミラー３５ｃ〜３５ｅ、３枚のバンドパスフィルタ３６ｃ〜３６ｅ、および３個の光検出器３７ｃ〜３７ｅを有している。ダイクロイックミラー３５ｃ、バンドパスフィルタ３６ｃおよび光検出器３７ｃは、互いに光学的に結合されている。ダイクロイックミラー３５ｃは、全反射ミラー２０およびダイクロイックミラー３５ｄとも光学的に結合されている。ダイクロイックミラー３５ｄ、バンドパスフィルタ３６ｄおよび光検出器３７ｄは、互いに光学的に結合されている。ダイクロイックミラー３５ｄは、ダイクロイックミラー３５ｅとも光学的に結合されている。ダイクロイックミラー３５ｅ、バンドパスフィルタ３６ｅおよび光検出器３７ｅは、互いに光学的に結合されている。また、光検出器３７ｃ〜３７ｅは、制御演算部４に電気的に接続されている。
【００８４】
ダイクロイックミラー３５ｃは、５６５ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５６５ｎｍ未満の波長の光を反射する。ダイクロイックミラー３５ｄは、５００ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５００ｎｍ未満の波長の光を反射する。ダイクロイックミラー３５ｅは、５６５ｎｍ以上の波長の光を透過させ、５６５ｎｍ未満の波長の光を反射する。バンドパスフィルタ３６ｃ〜３６ｅは、それぞれ波長域λem1〜λem3をその透過波長域として有している。したがって、全反射ミラー２０から検出部３ｂに送られる蛍光のうち波長域λem1の成分は、光検出器３７ｄに入射し、波長域λem2の成分は、光検出器３７ｅに入射し、波長域λem3の成分は、光検出器３７ｃに入射する。なお、ダイクロイックミラー３５ｅの代わりに、全反射ミラーを使用してもよい。
【００８５】
光検出器３７ｃ〜３７ｅは、例えば、冷却ＣＣＤカメラなど撮像装置、または光電子増倍管である。光検出器３７ｃ〜３７ｅは、それぞれ入射した蛍光の強度に応じた出力電気信号を生成する。この出力信号は、制御演算部４へ送られる。
【００８６】
このように、検出部３ｂは、試料５からの蛍光をダイクロイックミラー３５ｃ〜３５ｅおよびバンドパスフィルタ３６ｃ〜３６ｅによって波長域λem1〜λem3の蛍光に分岐することにより、これらの波長域の蛍光を独立に検出する。したがって、この実施形態でも、図３および図４に示される手順にしたがってＦＲＥＴ効率を測定できる。
【００８７】
ＦＲＥＴ解析装置３００は、上記実施形態の装置と同じ効果を奏する。装置３００は、検出波長域λem3を有するので、退色中のアクセプタの蛍光強度をリアルタイムに測定できる。このため、ＦＲＥＴ効率の定量的な測定を簡易な作業で迅速に行うことができる。また、試料５に退色用の強い光を照射する時間を最小限に抑えて、試料５に対する影響を低減し、それによって精度良くＦＲＥＴ効率を測定できる。
【００８８】
（第４実施形態）
以下では、本発明に係る第４の実施形態を説明する。第４実施形態のＦＲＥＴ解析装置は、第１実施形態と同様に、図１に示される構成を有し、図３および図４に示される手順にしたがってＦＲＥＴ解析を実行する。しかし、本実施形態は、図３のステップＳ３８０においてアクセプタの退色モニタの終了を判定する手法が第１〜第３実施形態と異なっている。以下では、この相違点を中心に説明する。
【００８９】
本実施形態では、退色モニタ中に測定されるアクセプタの蛍光の輝度に基づいて、退色モニタの終了時刻を計算により求める。一般に、退色中のアクセプタの蛍光輝度は、時間の経過とともに指数関数的に減衰する。したがって、退色モニタ中にＣＣＤチップ２４ｅによって検出される光の輝度Ｉは、
Ｉ＝ａ・ｅ-bt＋ｃ （３）
のように表される。ここで、第１項ａ・ｅ-btは、アクセプタの蛍光強度を示す。ａおよびｂは定数であり、ｔは退色開始から経過した時間である。第２項ｃは、アクセプタの蛍光以外にＣＣＤチップ２４ｅによって検出される光の強度を示す。このような光としては、ＦＲＥＴ解析装置内で発生する迷光や試料５の細胞自身が持つ自家蛍光などが挙げられる。アクセプタの蛍光強度に対してｃが十分に小さければ、
Ｉ＝ａ・ｅ-bt （４）
とみなすことができる。
【００９０】
退色の初期の段階では、ｃはアクセプタの蛍光に比べ無視できるほど小さいと考えられる。そこで、本実施形態では、アクセプタ退色過程の初期に２度に分けてＣＣＤチップ２４ｅにより蛍光輝度を測定し、その結果から上記（３）式における定数ａおよびｂを求める。
【００９１】
具体的に述べると、ステップＳ３８０において制御演算部４は、退色の開始から所定の時間が経過した時刻ｔ０に、ＥＹＦＰ蛍光画像を取得する。さらに、制御演算部４は、時刻ｔ０から所定の時間が経過した時刻ｔ１に、再びＥＹＦＰ蛍光画像を取得する。これらの時刻ｔ０およびｔ１は、上記（３）式におけるｃを無視できるように、退色過程の初期に設定される。このため、時刻ｔ０およびｔ１に測定された輝度値Ｉ0およびＩ1は、
Ｉ0＝ａ・ｅ-bt0 （５）
Ｉ1＝ａ・ｅ-bt1 （６）
のように表される。これら二つの式から、定数ａおよびｂを算出できる。これにより、退色中の任意の時点におけるＥＹＦＰの蛍光強度を（４）式に基づいて推測できる。
【００９２】
制御演算部４は、ステップＳ３１０で設定された蛍光強度または減衰率の値が得られる時刻を（４）式を用いて算出する。このとき、ステップＳ３１０で設定された減衰率は、Ｉ0からの蛍光強度の減衰率、すなわち１−Ｉ／Ｉ0として扱われる。制御演算部４は、ステップＳ３１０での設定値が得られるのに要する時間を（４）式にしたがって算出し、その時間を退色モニタ開始時刻に加算して、退色モニタ終了時刻を求める。制御演算部４は、こうして算出した時刻になると、退色モニタを終了し、ステップＳ４１０以降の処理を進める。
【００９３】
本実施形態のＦＲＥＴ解析装置は、第１実施形態と同じ効果に加えて、次のような効果を奏する。本実施形態は、退色モニタの終了時点を決定するために、アクセプタの蛍光強度の測定を２回しか必要としない。したがって、ＦＲＥＴ効率をいっそう迅速に測定することができる。
【００９４】
ただし、本実施形態の手法では、上記（３）式におけるｃが無視できないほど大きい場合、退色モニタ終了時点の判断精度が低下する。また、上記（３）式が何らかの要因で成立しない場合もある。これらの場合には、第１〜第３実施形態で採用する手法によって退色モニタの終了時点を判定することが好ましい。
【００９５】
なお、本実施形態で採用したアクセプタ退色時点の決定手法は、図５および図６に示される構成のＦＲＥＴ解析装置にも採用できる。
【００９６】
以上、本発明をその実施形態に基づいて詳細に説明した。しかし、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【００９７】
上記実施形態では、ドナーおよびアクセプタのペアとして、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰが使用されている。しかし、本発明は、他の蛍光色素の組合せにも適用できる。このような色素の組合せとしては、例えば、（ドナー：ＥＧＦＰ、アクセプタ：ＲＦＰ）や、（ドナー：ＥＹＦＰ、アクセプタ：ＲＥＰ）が挙げられる。上記実施形態と異なる色素の組合せを使用する場合でも、フィルタ、ダイクロイックミラーまたはプリズムの波長特性をそれらの色素に合わせて設定すれば、上記実施形態と同じ効果を得ることができる。
【００９８】
【発明の効果】
この発明の蛍光移動エネルギー解析装置は、アクセプタ退色用の光を試料に照射しながらアクセプタ蛍光強度を測定するのに適した検出波長域を有しているので、退色中のアクセプタ蛍光強度をリアルタイムに測定できる。このため、蛍光エネルギー移動効率の定量的な測定を簡易な作業で迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１実施形態のＦＲＥＴ解析装置の構成を示すブロック図である。
【図２】ドナーおよびアクセプタの蛍光スペクトルおよび吸収スペクトル、ならびに実施形態のＦＲＥＴ解析装置で使用される波長域を示すグラフである。
【図３】ＦＲＥＴ解析の手順を示すフローチャートである。
【図４】ＦＲＥＴ解析の手順を示すフローチャートである。
【図５】第２実施形態のＦＲＥＴ解析装置の構成を示すブロック図である。
【図６】第３実施形態のＦＲＥＴ解析装置の構成を示すブロック図である。
【図７】ドナーおよびアクセプタの蛍光スペクトルおよび吸収スペクトル、ならびに従来技術のＦＲＥＴ解析装置で使用される波長域を示すグラフである。
【符号の説明】
１…投光部、２…光学系、３…検出部、４…制御演算部、５…試料、１０…光源、１２…シャッタ、１３…ＮＤフィルタ切替装置、１４…波長選択装置、１６…ダイクロイックミラー切替装置、１８…対物レンズ、２０…全反射ミラー、２２…３板ＣＣＤカメラ、２３…プリズム、２４ｃ〜２４ｅ…ＣＣＤチップ。
Claims (13)
- ドナーおよびアクセプタを含む試料の蛍光エネルギー移動効率を測定する蛍光エネルギー移動解析装置であって、
前記試料に照射すべきドナー励起用の光およびアクセプタ退色用の光を選択的に放出する投光部と、
前記ドナー励起用の光の前記試料への照射に起因して前記試料から発する蛍光を検出し、その蛍光の強度に応じた出力を生成する検出部と、
前記検出部の出力を用いて蛍光エネルギー移動効率を算出する演算部と
を備え、
前記検出部は、互いに異なる第１、第２および第３の波長域の光を独立に検出し、
前記第１波長域は、前記アクセプタの蛍光スペクトルとの間よりも前記ドナーの蛍光スペクトルとの間に大きな重なりを有しており、
前記第２波長域は、前記ドナーの蛍光スペクトルとの間よりも前記アクセプタの蛍光スペクトルとの間に大きな重なりを有しており、
前記第３波長域は、前記ドナーの蛍光スペクトルとの間よりも前記アクセプタの蛍光スペクトルとの間に大きな重なりを有し、かつ、前記アクセプタ退色用の光の波長域との間に実質的な重なりを有さない
蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記ドナー励起用の光は、前記ドナーの吸収スペクトルと重なる波長域を有しており、
前記アクセプタ退色用の光は、前記ドナーの吸収スペクトルと実質的に重ならず、かつ、前記アクセプタの吸収スペクトルと重なる波長域を有している
請求項１に記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 蛍光エネルギー移動効率の測定手順を制御する制御部をさらに備える請求項１記載の蛍光エネルギー移動解析装置であって、
前記制御部は、前記投光部にドナー励起用の光を放出させて前記試料から蛍光を発生させ、その後、前記投光部にアクセプタ退色用の光を放出させ、前記検出部の第３波長域の出力に基づいて前記アクセプタの退色が完了したか否かを判断し、前記アクセプタの退色が完了したと判断すると、前記投光部にドナー励起用の光を放出させて前記試料から蛍光を発生させる
請求項１または２に記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記演算部は、前記アクセプタの退色の前後における前記第１波長域の出力を用いて、次の式
Ｅｔ＝１−Ｆｄ′／Ｆｄ
ここで、Ｅｔ ：蛍光エネルギー移動効率
Ｆｄ′：蛍光エネルギー移動が起きているときのドナーの蛍光強度
Ｆｄ ：蛍光エネルギー移動が起きていないときのドナーの蛍光強度
にしたがって蛍光エネルギー移動効率を算出する
請求項３に記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記投光部と前記検出部の間の光路上に配置された光学系をさらに備える請求項１記載の蛍光エネルギー移動解析装置であって、
前記光学系は、前記投光部からの光を受光して前記試料に送り、前記試料から発する蛍光を受光して前記検出部に送るとともに、前記試料によって反射された前記投光部からの光の前記検出部への入射を防止する
請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記光学系は、複数のダイクロイックミラーの一つを光路上に選択的に配置するダイクロイックミラー切替装置を含んでおり、
前記複数のダイクロイックミラーは、光路上に配置されると、前記投光部からの光を前記試料に送り、前記試料から発する蛍光を前記検出部に送るとともに、前記試料によって反射された前記投光部からの光を遮断する
請求項５に記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記複数のダイクロイックミラーには、前記ドナー励起用の光を遮断する第１のダイクロイックミラーと、前記アクセプタ退色用の光を遮断する第２のダイクロイックミラーとが含まれており、
前記ダイクロイックミラー切替装置は、前記投光部から前記ドナー励起用の光が放出されるときに前記第１ダイクロイックミラーを光路上に配置し、前記投光部から前記アクセプタ退色用の光が放出されるときに前記第２ダイクロイックミラーを光路上に配置する
請求項６に記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記検出部は、入射面および出射面を有する分光器と、前記分光器の出射面と光学的に結合された第１、第２および第３の光検出器とを有しており、
前記分光器は、前記試料からの蛍光を前記入射面で受け取り、その波長に応じた方向に分散させ、前記第１、第２および第３波長域の成分を前記出射面から前記第１、第２および第３の光検出器にそれぞれ送り、
前記第１、第２および第３の光検出器は、前記第１、第２および第３波長域の成分の強度に応じた出力をそれぞれ生成する
請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記検出部は、第１、第２および第３の光学フィルタの一つを選択的に光路上に配置するフィルタ切替装置と、前記フィルタ切替装置に光学的に結合された光検出器とを有しており、
前記第１、第２および第３の光学フィルタは、光路上に配置されると、それぞれ前記第１、第２および第３波長域の光を透過させ、
前記フィルタ切替装置は、前記試料からの蛍光を受け取り、光路上に配置された前記第１、第２および第３の光学フィルタの一つによって抽出された前記第１、第２および第３波長域のいずれかの成分を前記光検出器に送り、
前記光検出器は、前記フィルタ切替装置から送られる成分の強度に応じた出力を生成する
請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記検出部は、
前記試料からの蛍光を受け取って３本に分岐し、第１、第２および第３の光路上にそれぞれ送る光分岐手段と、
前記第１、第２および第３の光路上にそれぞれ配置された第１、第２および第３の光学フィルタと、
前記第１、第２および第３の光学フィルタを透過した光を検出し、その強度に応じた出力をそれぞれ生成する第１、第２および第３の光検出器と
を有しており、
前記第１、第２および第３の光学フィルタは、それぞれ前記第１、第２および第３波長域の光を透過させる
請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記投光部は、減光フィルタを光路上に配置する減光手段を有しており、
前記投光部が前記ドナー励起用の光を放出するとき、前記減光手段は、前記ドナー励起用の光が前記減光フィルタを通過するように前記減光フィルタを光路上に配置し、
前記投光部が前記アクセプタ退色用の光を放出するとき、前記減光手段は、前記アクセプタ退色用の光が前記減光フィルタを通過しないように、前記減光フィルタを光路上から取り除く
請求項１〜１０のいずれかに記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記投光部は、
前記ドナー励起用の光の波長域および前記アクセプタ退色用の光の波長域の双方にわたって発光する光源と、
前記光源から光を受光するとともに、減光フィルタを光路上に配置する減光手段と、
前記減光手段から光を受光し、前記ドナー励起用の光の波長域および前記アクセプタ退色用の光の波長域のいずれか一方の成分を抽出する波長選択手段と
を有しており、
前記投光部が前記ドナー励起用の光を放出するとき、前記減光手段は、前記光源からの光が前記減光フィルタを通過してから前記波長選択手段に向かうように前記減光フィルタを光路上に配置し、
前記投光部が前記アクセプタ退色用の光を放出するとき、前記減光手段は、前記光源からの光が前記減光フィルタを通過しないように、前記減光フィルタを光路上から取り除く
請求項１〜１０のいずれかに記載の蛍光エネルギー移動解析装置。 - 前記第３波長域は、前記アクセプタ退色用の光が前記試料に照射されるときに前記アクセプタから発する蛍光を前記検出部が飽和することなく検出できるような重なりを前記アクセプタの蛍光スペクトルとの間に有している
請求項１１または１２に記載の蛍光エネルギー移動解析装置。
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