JP2007322389A - スペクトル観察方法及びスペクトル観察システム - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明は、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物の観察において、必要なデータを欠落無く取得することの可能なスペクトル観察方法及びスペクトル観察システムを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明のスペクトル観察方法は、励起波長の異なる複数種類の物質（ＲＦＰ，ＧＦＰなど）を含む被観察物へ光を照射すると共に、その被観察物から放射される光のスペクトルを検出するスペクトル観察方法であって、前記照射する光の波長を前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、前記励起波長の長い物質のスペクトルデータから順次取得し（Ｓ１３，Ｓ１５）、前記各物質のスペクトルデータ取得の際は、前記スペクトルの検出波長から、その物質の励起波長を除外する（Ｓ１２）ことを特徴とする。
【選択図】 図４

Description

本発明は、複数種類の蛍光試薬で多重染色された標本など、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物のスペクトル観察方法、及びスペクトル観察システムに関する。
複数種類の蛍光試薬で多重染色された標本の観察には、スペクトルイメージング蛍光レーザ顕微鏡が有効である（特許文献１など参照）。このレーザ顕微鏡は、標本へ励起光を照射し、そこで発生した蛍光をグレーティング（回折格子）等で分光し、分光後の各波長成分の強度をスペクトルディテクタで検出する。このレーザ顕微鏡でも、他の蛍光顕微鏡と同様、標本の表面やレンズ表面などで反射する余分な励起光は、観察の妨げとならないよう何れかの箇所でカットする必要がある。
但し、スペクトル検出を行うこのレーザ顕微鏡では、蛍光の波長帯域を広く確保しておく必要があるので、蛍光の光路へバリアフィルタを挿入する代わりに、スペクトルディテクタのうち、励起波長に対応する特定のチャンネルをスペクトルディテクタの検出波長範囲から外す（チャンネル前に遮光板を配置（固定）する）ことになる。標本が２種類の蛍光試薬で染色されたときには、それらの励起波長に対応する２つのチャンネルの各々を検出波長範囲から外し、それらの蛍光試薬を同時に又は順次励起してスペクトルイメージングを行えばよいと考えられる。
特表２００４−５０６１９１号公報
しかし、このようなスペクトルイメージングでは、必要なデータの一部が欠落する可能性がある。なぜなら、或る蛍光試薬の励起波長が他の蛍光試薬の放射スペクトルの波長範囲内に含まれていた場合、必要な波長が検出波長範囲から外されてしまう（欠落する）からである。
そこで本発明は、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物の観察において、必要なデータを欠落無く取得することの可能なスペクトル観察方法及びスペクトル観察システムを提供することを目的とする。
本発明のスペクトル観察方法は、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射すると共に、その被観察物から放射される光のスペクトルを検出するスペクトル観察方法であって、前記照射する光の波長を前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、前記励起波長の長い物質のスペクトルデータから順次取得し、前記各物質のスペクトルデータ取得の際は、前記スペクトルの検出波長から、その物質の励起波長を除外することを特徴とする。
なお、前記取得した前記スペクトルデータを合成してもよい。
また、本発明のスペクトル観察システムは、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段と、前記被観察物から放射される光のスペクトルを検出する検出手段と、前記照射手段が照射する光の波長を切り替える波長切替手段と、を備えたスペクトル観察装置と、前記波長切替手段を制御することにより、前記照射する光の波長を前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、前記励起波長の長い物質のスペクトルデータから順次取得する制御装置と、前記各物質のスペクトルデータ取得の際は、前記スペクトルの検出波長から、その物質の励起波長を排除する可動式遮光機構と、を備えたことを特徴とする。
また、本発明の別のスペクトル観察システムは、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段と、前記被観察物から放射される光のスペクトルを検出する検出手段と、前記照射手段が照射する光の波長を切り替える波長切替手段と、を備えたスペクトル観察装置と、前記波長切替手段を制御することにより、前記照射する光の波長を前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、前記励起波長の長い物質のスペクトルデータから順次取得する制御装置と、前記検出手段の検出波長範囲を切り替える範囲切替手段とを備え、前記制御装置は、前記範囲切替手段を制御することにより、前記各物質のスペクトルデータ取得の際は、前記スペクトルの検出波長から、その物質の励起波長を排除することを特徴とする。
なお、前記制御装置は、前記取得した前記スペクトルデータを合成してもよい。
本発明によれば、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物の観察において、必要なデータを欠落無く取得することの可能なスペクトル観察方法及びスペクトル観察システムが実現する。
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態は、スペクトルイメージング蛍光レーザ顕微鏡システムの実施形態である。
先ず、本システムの構成を説明する。
図１は、本システムの構成図である。図１に示すとおり、本システムには、共焦点顕微鏡１と、スペクトル検出部２と、制御部３と、モニタ４とが備えられる。
共焦点顕微鏡１には、標本ステージ１１と、レーザユニット１２と、光ファイバ１３と、コリメートレンズ１４と、ダイクロイックミラー１５と、ＸＹスキャナ１６と、対物レンズ１７と、結像レンズ１８と、ピンホール板１９と、光ファイバ２０とが備えられる。標本ステージ１１上には、複数種類の蛍光試薬で多重染色された標本１０Ａが支持される。これら蛍光試薬の詳細については、後述する。
レーザユニット１２は、例えば、複数種類のレーザ光源１２１，１２２，１２３と、波長可変フィルタ（ＡＯＴＦ等）１２４とを備えており、波長可変フィルタ１２４（又は各レーザシャッタ１００）の動作により、出射するレーザ光の波長（レーザ波長）を切り替えることができる。ここでは、レーザ波長が、５４３ｎｍ，４８８ｎｍ，４４０ｎｍの３波長の間で切り替わるとする。
このレーザユニット１２から射出したレーザ光は、光ファイバ１３、コリメートレンズ１４、ダイクロイックミラー１５、ＸＹスキャナ１６、対物レンズ１７を順に介して標本１０Ａの１点へ集光し、そこに存在している特定の蛍光物質を励起する。その蛍光物質で発生した蛍光は、対物レンズ１７、ＸＹスキャナ１６、ダイクロイックミラー１５、結像レンズ１８、ピンホール板１９、光ファイバ２０を順に介してスペクトル検出部２へ導かれる。ピンホール板１９では、余分な光線がカットされる。
スペクトル検出部２には、コリメートレンズ２１と、グレーティング２２と、グレーティングステージ２２Ｍと、集光レンズ２３と、遮光板３０と、スライド機構３０Ｍと、スペクトルディテクタ２４と、サンプリング回路２５とが備えられる。
グレーティング２２は、グレーティングステージ２２Ｍによって支持されており、光路に対する挿入角度が調節可能になっている。グレーティングステージ２２Ｍは、グレーティング２２と共に、格子ピッチの異なるグレーティング２２’，２２”を支持しており、光路に挿入されるグレーティングを、グレーティング２２，２２’，２２”の間で切り替えることもできる。
スペクトルディテクタ２４は、強度の微弱な蛍光に感応する複数の光電子増倍管(ＰＭＴ)４Ａを、一次元アレイ状に配列してなる。このスペクトルディテクタ２４に必要な電力は、制御部３内の高圧電源３４Ｐから供給される。１つのＰＭＴ４Ａがスペクトルディテクタ２４の１つのチャンネルを構成する。以下、ＰＭＴ４Ａの配列数（すなわちスペクトルディテクタ２４のチャンネル数）を、３２とする。
遮光板３０は、スペクトルディテクタ２４の何れか１つのチャンネルを遮光するための短冊状のマスクであり、スライド機構３０Ｍによって支持されている。スライド機構３０Ｍは、遮光板３０をチャンネルの配列方向へスライドさせ、それにより遮光されるチャンネルを切り替えることができる。また、スライド機構３０Ｍは、遮光板３０を退避位置へ配置することで、３２個のチャンネルの全てを開放することもできる。
このスペクトル検出部２に導かれた蛍光は、コリメートレンズ２１を介してグレーティング２２へ入射すると、各波長成分にスペクトル分解される。各波長成分は、スペクトルディテクタ２４の３２個のチャンネルへ個別に入射し、その強度に応じた電気信号へとそれぞれ変換される。なお、遮光板３０の配置されたチャンネルには光が入射しないので、そのチャンネルでは強度ゼロに相当する電気信号が生成される。３２個のチャンネルで生成された３２個の電気信号は、サンプリング回路２５によって或るタイミングでサンプリングされ、制御部３へと順次送出される。このとき送出される３２個の電気信号が、標本１０Ａの１点（レーザ光の集光点）のスペクトルデータである。
制御部３には、画像処理回路３６と、ＣＰＵ３７と、ＸＹスキャナ駆動回路３８と、グレーティング駆動回路３２Ｃと、遮光板駆動回路３０Ｃと、高圧電源３４Ｐとが備えられる。以下、ＣＰＵ３７には、ＣＰＵ３７の動作プログラムを格納するＲＯＭと、ＣＰＵ３７の動作中の一次記憶に用いられるＲＡＭとが搭載されており、画像処理回路３６には、複数フレーム分のスペクトル画像データ（後述）を格納可能なメモリが搭載されているとして説明する。
ＣＰＵ３７は、ＸＹスキャナ駆動回路３８を介して共焦点顕微鏡１のＸＹスキャナ１６を駆動することにより、レーザ光の集光点で標本１０Ａを２次元的に走査する。また、ＣＰＵ３７は、この走査中にサンプリング回路２５に対し繰り返しサンプリングの指示を与え、標本１０Ａの各点のスペクトルデータを画像処理回路３６へと順次取り込む。ＣＰＵ３７のこの動作によると、標本１０Ａの二次元走査が終了するまでに、画像処理回路３６内のメモリへ、標本１０Ａの１フレーム分のスペクトル画像データ（個々のピクセルは、スペクトルデータとして３２チャンネル分の値を持つ。）が格納されることになる。以下、このように、スペクトル画像データを取得するためのＣＰＵ３７の動作を、「スペクトルイメージング」という。画像処理回路３６は、このスペクトルイメージングで取得されたスペクトル画像データに基づき、必要に応じてモニタ表示用の画像データを生成し、モニタ４へ送出する。
なお、ＣＰＵ３７がスペクトルイメージングを繰り返せば、スペクトル画像データの連続取得（リアルタイムイメージング）も可能である。
また、ＣＰＵ３７は、スペクトルイメージングに当たり、レーザユニット１２内の波長可変フィルタ１２４（又は各レーザシャッタ１００）へ指示を与えることにより、レーザ光のオンオフ制御や、レーザ光の波長切り替え制御を行うことができる。
また、ＣＰＵ３７は、スペクトルイメージングに当たり、グレーティング駆動回路３２Ｃを介してグレーティングステージ２２Ｍを駆動し、また、遮光板駆動回路３０Ｃを介してスライド機構３０Ｍを駆動することにより、スペクトルディテクタ２４の検出波長範囲を変化させることができる。
因みに、スペクトルディテクタ２４の検出波長範囲を拡縮するには、光路に挿入されるグレーティングをグレーティング２２，２２’，２２”の間で切り替えればよい。但し、スペクトルディテクタ２４のチャンネル数は不変なので、その検出波長範囲を拡縮させると、それに応じて波長分解能も変化する。例えば、グレーティング２２が光路へ挿入されたときには、検出波長範囲は８０ｎｍ、波長分解能は２．５ｎｎとなり、グレーティング２２’が光路へ挿入されたときには、検出波長範囲は１６０ｎｍ、波長分解能は５ｎｍとなり、グレーティング２２”が挿入されたときには、検出波長範囲は３２０ｎｍ、波長分解能は１０ｎｍとなる。
また、スペクトルディテクタ２４の検出波長範囲の上限を短波長側に変更したり、検出波長範囲の下限を長波長側に変更したりするには、挿入中のグレーティングの挿入角度を変化させればよい。
また、スペクトルディテクタ２４の検出波長範囲から特定の波長成分を除外するには、スペクトルディテクタ２４の３２個のチャンネルのうち、その特定の波長成分に対応するチャンネルに遮光板３０を配置すればよい。
次に、本システムの標本１０Ａを説明する。
標本１０Ａは、ＧＦＰ、ＲＦＰの２種類の蛍光試薬で多重染色された生体細胞の標本である。図２は、ＧＦＰに固有の特性を示す図であり、図３は、ＲＦＰに固有の特性を示す図である。図２，図３において、点線で示すのは、吸収スペクトルであり、実線で示すのは、放射スペクトルであり、太い直線で示すのは、励起波長である。
先ず、図２に示すとおり、ＧＦＰの励起波長は４８８ｎｍであり、ＧＦＰの放射スペクトルの波長範囲は、約４５０ｎｍ〜約６５０ｎｍである。このようなＧＦＰの標本１０Ａにおける寄与を本システムで知るためには、４８８ｎｍのチャンネルを検出波長範囲から外し、４８８ｎｍのレーザ光で励起しながらスペクトルイメージングを行えばよい。取得されたスペクトル画像データのうち、主として４８８ｎｍより長波長側のデータに、ＧＦＰの寄与を示すデータ（ＧＦＰデータ）が反映される。
一方、図３に示すとおり、ＲＦＰの励起波長は、ＧＦＰのそれよりも長い５４３ｎｍであり、ＲＦＰの放射スペクトルの波長範囲は、約５５０〜約７００ｎｍである。このようなＲＦＰの標本１０Ａにおける寄与を本システムで知るためには、５４３ｎｍのチャンネルを検出波長範囲から外し、５４３ｎｍのレーザ光で励起しながらスペクトルイメージングを行えばよい。取得されたスペクトル画像データのうち、主として５４３ｎｍより長波長側のデータに、ＲＦＰの寄与を示すデータ（ＲＦＰデータ）が反映される。
但し、ＧＦＰとＲＦＰとを同時励起してスペクトルイメージングを行おうとすると、４８８ｎｍのチャンネルと５４３ｎｍのチャンネルとの双方を検出波長範囲から外す必要があるので、ＧＦＰデータの比較的重要な部分（５４３ｎｍの近傍の部分）が欠落する。
また、ＧＦＰとＲＦＰとを別々に励起してスペクトルイメージングを行うとしても、励起波長の短いＧＦＰのスペクトルイメージング（つまり励起に高いエネルギーを要する）を、励起波長の長いＲＦＰのスペクトルイメージング（つまり励起に高いエネルギーを要しない）よりも先に行うと、ＲＦＰデータの取得前にＲＦＰが反応し、その退色が始まってしまうので、ＲＦＰデータを正確に取得することができない。このことは、ＧＦＰの励起波長（図２の太い直線）が、ＲＦＰの吸収スペクトル（図３点線）の波長範囲に含まれることからも明らかである。
なお、標本１０Ａに添加された蛍光試薬の各々の励起波長は、本システムのＣＰＵ３７が認識しているものとする。それらの励起波長の情報は、制御部３に設けられた不図示のインタフェースを介して予め外部から本システムへ入力される。
次に、ＣＰＵ３７の動作手順を説明する。ＣＰＵ３７は、以上の問題を回避するため、以下の手順で動作する。
図４は、ＣＰＵ３７の動作フローチャートである。図４中の各ステップの内容を可視化すると、図５に示すとおりになる。これらの図４，図５に示すとおり、先ず、ＣＰＵ３７は、スペクトルディテクタ２４の検出波長範囲を４９０〜６５０ｎｍ、波長分解能を５ｎｍに設定する（ステップＳ１１）。この検出波長範囲（４９０〜６５０ｎｍ）は、ＧＦＰの放射スペクトルの主な波長範囲と、ＲＦＰの放射スペクトルの主な波長範囲とをカバーし、かつ、ＧＦＰの励起波長（４８８ｎｍ）から外れている。
次に、ＣＰＵ３７は、遮光板３０の遮光先を、５４３ｎｍのチャンネルに設定し、そのチャンネルを検出波長範囲から外す（ステップＳ１２）。この波長は、ＲＦＰの励起波長である。
その状態で、ＣＰＵ３７は、レーザ波長を５４３ｎｍに設定し、スペクトルイメージングを行う（ステップＳ１３）。ＣＰＵ３７は、取得したスペクトル画像データのうち、５４３ｎｍよりも長波長側（５５１ｎｍ〜上限）の全データを、有効データとみなす。因みに、この５４３ｎｍの励起光は、ＲＦＰを励起する一方で、それよりも励起波長の短いＧＦＰを励起しないので、この有効データには、ＲＦＰデータのみが反映されていると考えられる。
続いて、ＣＰＵ３７は、遮光板３０を退避位置に配置する（ステップＳ１４）。これによって、４９０〜６５０ｎｍの全チャンネルが検出波長範囲となる。
その状態で、ＣＰＵ３７は、レーザ波長を４８８ｎｍに設定し、スペクトルイメージングを行う（ステップＳ１５）。ＣＰＵ３７は、取得したスペクトル画像データのうち、４８８ｎｍよりも長波長側の全データ（４９６ｎｍ〜上限）を、有効データとみなす。因みに、この４８８ｎｍの励起光は、ＧＦＰを励起するので、この有効データには、ＧＦＰデータが反映されている。また、４８８ｎｍの励起光は、ＲＦＰを少しだけ励起し、有効データの波長範囲には、ＲＦＰの放射スペクトルの波長範囲も含まれている。よって、この有効データには、ＲＦＰデータも少しだけ反映されていると考えられる。
その後、ＣＰＵ３７は、ステップＳ１３で取得した有効データ（５５１ｎｍ〜上限のスペクトル画像データ）と、ステップＳ１５で取得した有効データ（４９６ｎｍ〜上限のスペクトル画像データ）とを画像処理回路３６内のメモリから読み出し、これらの有効データを合成する（ステップＳ１６）。この合成は、加算（積算）合成であり、これらの有効データのうち、同一チャンネルの同一ピクセルの値同士が加算（積算）される。加算（積算）後に得られるスペクトル画像データ（合成スペクトル画像データ）は、ＧＦＰとＲＦＰとを同時励起したときのスペクトル画像データと同等とみなせる。そこで、ＣＰＵ３７は、合成スペクトル画像データに対し公知のアンミックス演算を施すよう、画像処理回路３６へ指示を与える。このアンミックスにより、合成スペクトル画像データに含まれているＧＦＰデータとＲＦＰデータとが完全に分離され、ＧＦＰの寄与とＲＦＰの寄与とがそれぞれ正確に既知となる。これらの取得した情報は、必要に応じてモニタ４へと出力される。
なお、アンミックスに必要な情報（ＧＦＰの放射スペクトルとＲＦＰの放射スペクトルの情報）は、前述した励起波長の情報と共に、制御部３に設けられた不図示のインタフェースを介して予め外部から本システムへ入力される。
以上、本システムのＣＰＵ３７は、レーザ光の波長を２つの蛍光試薬（ＲＦＰ，ＧＦＰ）の各々の励起波長の間で切り替えながらスペクトルイメージングを２回行い、主にＲＦＰに関するスペクトルデータ（ステップＳ１３の有効データ）と、主にＧＦＰに関するスペクトルデータ（ステップＳ１５の有効データ）とをシーケンシャルに取得する。
したがって、各々のスペクトルイメージングにおいて、その励起波長に対応するチャンネルを検出波長範囲から外したにも拘わらず、ＲＦＰデータの主要部とＧＦＰデータの主要部とを、何れも欠落無く取得することができる。
また、本システムのＣＰＵ３７は、励起波長の長いスペクトルイメージング（ＲＦＰに関するスペクトルイメージング）を先に行ったので、或る蛍光試薬に関するスペクトルイメージングが他の蛍光試薬に干渉する（退色を招く）という事態は、回避される。したがって、２つの蛍光試薬のスペクトルデータは、それぞれ正確に取得される。
また、本システムのＣＰＵ３７は、ステップＳ１５で取得する有効データの波長範囲を、ステップＳ１３で取得する有効データの波長範囲に重複させた上で、両者を合成した。そして、本システムの画像処理回路３６は、合成されたスペクトルデータに対しアンミックス演算を施した。したがって、２つの蛍光試薬のスペクトルデータを、より正確に取得することができる。
なお、本実施形態のＣＰＵ３７は、ステップＳ１５で取得する有効データの波長範囲を、ステップＳ１３で取得する有効データの波長範囲に重複させたが、両者の波長範囲を分離させてもよい。その場合、合成の手順（ステップＳ１６）を省略してもよい。例えば、ＣＰＵ３７は、ステップＳ１３で取得した有効データに基づき、標本１０におけるＲＦＰの空間分布を示す画像を作成し、ステップＳ１５で取得した有効データに基づき、標本１０におけるＧＦＰの空間分布を示す画像を作成し、それらをモニタ４へ表示してもよい。
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態を説明する。本実施形態もスペクトルイメージング蛍光レーザ顕微鏡システムの実施形態である。ここでは、第１実施形態との相違点のみ説明する。相違点は、標本１０Ａに添加された蛍光試薬と、ＣＰＵ３７の動作とにある。
先ず、本実施形態の標本１０Ａに添加された蛍光試薬を説明する。
標本１０Ａに添加された蛍光試薬は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰの３種類であり、ＧＦＰ，ＲＦＰに固有の特性は、第１実施形態で説明したとおりである。
図６は、ＣＦＰに固有の特性を示す図である。図６において、点線で示すのは、吸収スペクトルであり、実線で示すのは、放射スペクトルであり、太い直線で示すのは、励起波長である。図６に示すとおり、ＣＦＰの励起波長は、ＧＦＰ及びＲＦＰのそれよりも短い４４０ｎｍであり、ＣＦＰの放射スペクトルの波長範囲は、約４５０ｎｍから約６００ｎｍである。このようなＣＦＰの標本１０Ａにおける寄与を本システムで知るためには、４４０ｎｍのチャンネルを検出波長範囲から外し、４４０ｎｍのレーザ光で励起しながらスペクトルイメージングを行えばよい。取得されたスペクトル画像データのうち、主として４４０ｎｍより長波長側のデータに、ＣＦＰの寄与を示すデータ（ＣＦＰデータ）が現れる。
次に、ＣＰＵ３７の動作手順を説明する。
図７は、本実施形態のＣＰＵ３７の動作フローチャートである。図７中の各ステップの内容を可視化すると、図８に示すとおりになる。これらの図７，図８に示すとおり、先ず、ＣＰＵ３７は、スペクトルディテクタ２４の検出波長範囲を４４０〜６００ｎｍ、波長分解能を１０ｎｍに設定する（ステップＳ２１）。この検出波長範囲（４４０〜６００ｎｍ）は、ＣＦＰの放射スペクトルの主な波長範囲と、ＧＦＰの放射スペクトルの主な波長範囲と、ＲＦＰの放射スペクトルの主な波長範囲とをカバーし、かつ、ＣＦＰの励起波長４４０ｎｍから外れている。
次に、ＣＰＵ３７は、遮光板３０の遮光先を、５４３ｎｍのチャンネルに設定し、そのチャンネルを検出波長範囲から外す（ステップＳ２２）。この波長は、ＲＦＰの励起波長である。
その状態で、ＣＰＵ３７は、レーザ波長を５４３ｎｍに設定し、スペクトルイメージングを行う（ステップＳ２３）。ＣＰＵ３７は、取得したスペクトル画像データのうち、５４３ｎｍよりも長波長側（５５８ｎｍ〜上限）の全データを有効データとみなす。因みに、この５４３ｎｍの励起光は、ＲＦＰを励起する一方で、それよりも励起波長の短いＧＦＰ，ＣＦＰを励起しないので、この有効データには、ＲＦＰデータのみが反映されていると考えられる。
続いて、ＣＰＵ３７は、遮光板３０の遮光先を、４８８ｎｍのチャンネルに設定し、そのチャンネルを検出波長範囲から外す（ステップＳ２４）。
その状態で、ＣＰＵ３７は、レーザ波長を４８８ｎｍに設定し、スペクトルイメージングを行う（ステップＳ２５）。ＣＰＵ３７は、取得したスペクトル画像データのうち、４８８ｎｍよりも長波長側かつ５４３ｎｍよりも短波長側のデータ（５０３ｎｍ〜５２８ｎｍ）を有効データとみなす。因みに、この４８８ｎｍの励起光は、ＧＦＰを励起するので、この有効データには、ＧＦＰデータが反映されている。また、４８８ｎｍの励起光は、ＲＦＰを少しだけ励起するが、この有効データの波長範囲には、ＲＦＰの放射スペクトルの波長範囲が殆ど含まれない。よって、この有効データには、ＧＦＰデータのみが反映されていると考えられる。
続いて、ＣＰＵ３７は、遮光板３０を退避位置に配置する（ステップＳ２６）。
その状態で、ＣＰＵ３７は、レーザ波長を４４０ｎｍに設定し、スペクトルイメージングを行う（ステップＳ２７）。ＣＰＵ３７は、取得したスペクトル画像データのうち、４４０ｎｍよりも長波長側かつ４８８ｎｍよりも短波長側のデータ（４５５ｎｍ〜４７３ｎｍ）を有効データとみなす（図８参照）。因みに、この４４０ｎｍの励起光は、ＣＦＰを励起するので、この有効データには、ＣＦＰデータが反映されている。また、４４０ｎｍの励起光は、ＧＦＰを少しだけ励起するが、この有効データの波長範囲にはＧＦＰの放射スペクトルの波長範囲が殆ど含まれない。よって、この有効データには、ＣＦＰデータのみが反映されていると考えられる。
その後、ＣＰＵ３７は、ステップＳ２３で取得した有効データ（５５８ｎｍ〜上限のスペクトル画像データ）を画像処理回路３６内のメモリから読み出し、それに基づき標本１０におけるＲＦＰの空間分布を示す画像を作成し、それをモニタ４へ表示する。同様に、ＣＰＵ３７は、ステップＳ２５で取得した有効データ（５０３ｎｍ〜５２８ｎｍのスペクトル画像データ）を画像処理回路３６内のメモリから読み出し、それに基づき標本１０におけるＧＦＰの空間分布を示す画像を作成し、それをモニタ４へ表示する。また、同様に、ＣＰＵ３７は、ステップＳ２７で取得した有効データ（４５５ｎｍ〜４７３ｎｍのスペクトル画像データ）を画像処理回路３６内のメモリから読み出し、それに基づき標本１０におけるＣＦＰの空間分布を示す画像を作成し、それをモニタ４へ表示する（ステップＳ２８）。
以上、本システムのＣＰＵ３７は、レーザ光の波長を３つの蛍光試薬（ＲＦＰ，ＧＦＰ，ＣＦＰ）の各々の励起波長の間で切り替えながらスペクトルイメージングを３回行い、ＲＦＰに関するスペクトルデータ（ステップＳ２３の有効データ）と、ＧＦＰに関するスペクトルデータ（ステップＳ２５の有効データ）と、ＣＦＰに関するスペクトルデータ（ステップＳ２７の有効データ）とをシーケンシャルに取得する。
したがって、各々のスペクトルイメージングにおいて、その励起波長に対応するチャンネルを検出波長範囲から外したにも拘わらず、ＲＦＰデータの主要部とＧＦＰデータの主要部とＣＦＰデータの主要部とを、何れも欠落無く取得することができる。
また、本システムのＣＰＵ３７は、励起波長の長いスペクトルイメージングを先に行ったので、或る蛍光試薬に関するスペクトルイメージングが他の蛍光試薬に干渉する（退色を招く）という事態は、回避される。したがって、３つの蛍光試薬のスペクトルデータは、正確に取得される。
なお、本実施形態のＣＰＵ３７は、ステップＳ２３で取得する有効データの波長範囲（Ａ）と、ステップＳ２５で取得する有効データの波長範囲（Ｂ）と、ステップＳ２８で取得する有効データの波長範囲（Ｃ）とを分離したが、（Ｂ）を長波長側へ拡大して（Ａ）に重複させ、（Ｃ）を長波長側へ拡大して（Ｂ）及び（Ａ）に重複させてもよい。その場合、３つの有効データを合成し、アンミックス演算を施してもよい。
［その他］
なお、以上の各実施形態では、蛍光顕微鏡システムを説明したが、本発明は、標本で生じた蛍光のスペクトルデータを取得するときだけでなく、標本で生じた燐光のスペクトルデータを取得するときにも有効である。
また、以上の各実施形態では、イメージング機能を備えた顕微鏡システムを説明したが、本発明は、標本の代表点（複数又は単一の点）のスペクトルデータを取得するときにも有効である。
また、以上の各実施形態において、ＣＰＵ３７による処理の一部又は全部を、ＣＰＵ以外の専用の回路に実行させてもよい。また、ＣＰＵ３７による処理の一部又は全部を、制御部３に接続されたコンピュータに実行させてもよい。その場合、コンピュータが実行するための処理のプログラムを、予めコンピュータへインストールしてもよい。
本システムの構成図である。 ＧＦＰに固有の特性を示す図である。 ＲＦＰに固有の特性を示す図である。 第１実施形態のＣＰＵ３７の動作フローチャートである。 図４の各ステップの内容を可視化した図である。 ＣＦＰに固有の特性を示す図である。 第２実施形態のＣＰＵ３７の動作フローチャートである。 図７の各ステップの内容を可視化した図である。
符号の説明
１…共焦点顕微鏡，２…スペクトル検出部，３…制御部，４…モニタ，３７…ＣＰＵ，１２…レーザユニット，３０…遮光板，３０Ｍ…スライド機構，３０Ｃ…遮光板駆動回路，２２Ｍ…グレーティングステージ，３２Ｃ…グレーティング駆動回路

Claims (5)

  1. 励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射すると共に、その被観察物から放射される光のスペクトルを検出するスペクトル観察方法であって、
    前記照射する光の波長を前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、前記励起波長の長い物質のスペクトルデータから順次取得し、
    前記各物質のスペクトルデータ取得の際は、前記スペクトルの検出波長から、その物質の励起波長を除外する
    ことを特徴とするスペクトル観察方法。
  2. 請求項１に記載のスペクトル観察方法において、
    前記取得した前記スペクトルデータを合成する
    ことを特徴とするスペクトル観察方法。
  3. 励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段と、
    前記被観察物から放射される光のスペクトルを検出する検出手段と、
    前記照射手段が照射する光の波長を切り替える波長切替手段と、
    を備えたスペクトル観察装置と、
    前記波長切替手段を制御することにより、前記照射する光の波長を前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、前記励起波長の長い物質のスペクトルデータから順次取得する制御装置と、
    前記各物質のスペクトルデータ取得の際は、前記スペクトルの検出波長から、その物質の励起波長を排除する可動式遮光機構と、
    を備えたことを特徴とするスペクトル観察システム。
  4. 励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段と、
    前記被観察物から放射される光のスペクトルを検出する検出手段と、
    前記照射手段が照射する光の波長を切り替える波長切替手段と、
    を備えたスペクトル観察装置と、
    前記波長切替手段を制御することにより、前記照射する光の波長を前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で切り替えながら、前記励起波長の長い物質のスペクトルデータから順次取得する制御装置と、
    前記検出手段の検出波長範囲を切り替える範囲切替手段とを備え、
    前記制御装置は、
    前記範囲切替手段を制御することにより、前記各物質のスペクトルデータ取得の際は、前記スペクトルの検出波長から、その物質の励起波長を排除する
    ことを特徴とするスペクトル観察システム。
  5. 請求項３又は請求項４に記載のスペクトル観察システムにおいて、
    前記制御装置は、
    前記取得した前記スペクトルデータを合成する
    ことを特徴とするスペクトル観察システム。
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