JP4331454B2 - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、蛍光試薬のラインナップの増加及び標識状態の変化とともに、さまざまな検出ファクターを測定することが望まれている。それらは蛍光強度に加え、蛍光のスペクトルや偏向特性を効率よく検出し、取得データとしての定量化も望まれている。更には、装置としての小型化も期待されている。
【０００３】
音響光学素子（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ：以下、本明細書において「ＡＯＴＦ」と称する）を用いた走査型レーザ顕微鏡が知られている（特開２００１−１２４９９７参照）。
【０００４】
この走査型レーザ顕微鏡では、スペクトル選択的要素（ＡＯＴＦ）の後方に光学的な部材が接続されている。そして、ＡＯＴＦの１次回折光光路からレーザ光を入射することによって励起光を選択できる。これにより、ＡＯＴＦが、顕微鏡からの蛍光を０次回折光の光路上で検出器へ導くための高効率のビームスブリッタの機能を果している。更に、この特開２００１−１２４９９７には、下記のような記載がある。ＡＯＴＦの分散性あるいは複屈折率性を利用して、蛍光を異なる例えば２つの偏光成分に分離することができる。この２つの偏向成分のそれぞれの成分を検出することによって、偏光子や検光子を必要としない走査型偏光レーザ顕微鏡にできる。
【０００５】
しかし、特開２００１−１２４９９７によるＡＯＴＦと光学的部材の組合せでは、レーザの励起波長に合わせた波長選択が可能ではあるが、蛍光に対する波長選択となるような分光効果は実現されていない。また、偏光成分の分離はＡＯＴＦが持つプリズムの複屈折性を静的に利用して達成されているが、ＡＯＴＦの有する音響光学効果を積極的に利用していない。このため、特開２００１−１２４９９７では、波長を選択しながら（すなわち、分光しながら）、蛍光の偏光成分を検出することはできない。
【０００６】
従って、特開２００１−１２４９９７で波長を選択するためには、ＡＯＴＦと光学的部材の更に後方にマルチバンドの検出器及び格子分光計、プリズム分光計といった分光計を置くことが必要なり、装置が大型化することは避けられない。
【０００７】
また、ＡＯＴＦを用いた顕微鏡が知られている（ＵＳＰ５，８４１，５７７参照）。
【０００８】
この顕微鏡では、ＡＯＴＦが照明光路中に配置されている。そして、ＡＯＴＦで波長選択された互いに偏光成分が異なる２つの出射光を合成手段を用いて再び重ね合わせて１つの励起光として用いることにより、効率よく試料に励起光を照明することができる。また、観察側にもＡＯＴＦを配置することにより、ＡＯＴＦで波長選択された試料からの蛍光をＣＣＤカメラにて観察することができる。更には、ＵＳＰ５，８４１，５７７には、２つのＡＯＴＦを用いて、分離された異なる偏光成分を持つ光を再び光束として重ね合わせる手法や、ダイクロイックミラーを用いて落射型蛍光照明を行う方法についても記載されている。
【０００９】
しかし、ＵＳＰ５，８４１，５７７は、蛍光観察の照明方法に関し、走査型レーザ顕微鏡で波長選択をしながらスペクトル・データを取得する構成ではない。観察光路中にＡＯＴＦを設けることによって、蛍光観察をＣＣＤカメラで行うことができるが、走査型レーザ顕微鏡に適用した場合には、一方の１次回折光内に含まれる偏光成分のみを検出することによる光損失と、これによる実際のサンプルの蛍光強度を正しく反映できないという問題がある。
【００１０】
更に、ＵＳＰ５，８４１，５７７では、所望としない０次回折光をブロックするために、暗視野用のコンデンサーレンズ、もしくは、光軸上でストッパーとなる部材や、分離された２つの光束を再び１つの励起光として重ね合わせる合成手段等を用いる必要があり、必然的に装置の構成が大型化する。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、構成簡易にして、小型化の促進を図り得、且つ、高効率な分光ができ、更には高速かつ高分解能な分光検出をも実現できる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解決するために次のような手段を講じた。
【００１３】
本発明の第１の局面に係る走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料上に集光して、前記試料からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を前記試料上に２次元的に走査させる光走査手段と、前記蛍光又は反射光の光路上に配置され、入射する蛍光又は反射光から印加される高周波電圧の周波数に対応した波長の光のみを選択して偏向させる音響光学素子と、前記音響光学素子を経由した光を検出する光検出手段と、前記音響光学素子に印加する高周波電圧の周波数を切換設定する周波数走査手段と、を具備することを特徴とする。
【００１４】
本発明の第２の局面に係る走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときには、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部と、前記＋１次回折光を受光する第１の光検出器と、前記−１次回折光を受光する第２の光検出器と、を具備することを特徴とする。
【００１５】
本発明の第３の局面に係る走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときには、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部と、前記＋１次回折光を受光する第１の光検出器と、前記−１次回折光を受光する第２の光検出器と、を具備し、前記レーザ光源は、前記レーザ光が変調されずに前記音響光学素子を透過して、前記対物レンズに導かれるように、前記０次回折光の光路に配置されている。
【００１６】
本発明の第４の局面に係る走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときには、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧の周波数に応じた波長の光を１次回折光に回折させると共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部と、前記１次回折光を受光する光検出器と、を具備し、前記高周波信号制御部によって前記高周波電圧の周波数を掃引し、各周波数における前記光検出器の出力信号を取得することによって、前記蛍光又は反射光のスペクトルデータを取得する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１８】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１９】
（第１の実施形態）
図１は、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡の要部を示す図である。図１において、走査ユニット２０には、コリメータレンズ２１が設けられている。コリメータレンズ２１には、レーザ光源２２から発振されたレーザ光がファイバ２３を介して導かれる。走査ユニット２０に導かれたレーザ光はコリメータレンズ２１により平行光に変換されて、ビームスプリッタ２４の反射光路に導かれる。なお、図１はシステムの基本構成を表しており、レーザ光源２２に複数の波長を持たせるために、マルチラインのレーザとしたり、複数のレーザ光源を用いて構成してもよく、それに応じてダイクロイックミラー２４を複数兼ね備えてもかまわない。
【００２０】
ここで、レーザ光源２２から発振するレーザ光の波長は、Ａｒレーザの４８８ｎｍであるものと仮定し、ビームスプリッタ２４の波長特性は、４８８ｎｍを反射し、４８８ｎｍより長い波長（５００ｎｍ〜７００ｎｍ）は透過するものと仮定する。ビームスプリッタ２４で反射された４８８ｎｍのレーザ光は、光走査手段２５を構成するガルバノメータスキャナである光走査ミラー２５１、２５２により偏向される。光走査ミラー２５２で偏向されたレーザ光は、さらに、瞳投影レンズ２６１、顕微鏡の結像レンズ２６２を介して対物レンズ２６により試料２７上に集光されて照射される。
【００２１】
光走査ミラー２５１、２５２は、レーザ光が互いに直交する方向に偏向するように、レーザ光を走査制御し、試料２７上に集光された光スポットが試料上を２次元に走査する。そして、４８８ｎｍのレーザ光を照射することにより、試料から発する４８８ｎｍより長い波長の蛍光は、レーザ光と逆方向かつ同一の光路（すなわち、対物レンズ２６、結像レンズ２６２、瞳投影レンズ２６１）を進み、光走査ミラー２５２、２５１を反射して、ビームスプリッタ２４の透過光路に導かれる。
【００２２】
ビームスプリッタ２４の透過光路に導かれた蛍光は、反射ミラー１９で反射された後に、共焦点レンズ２８により、共焦点ピンホール２９上に結像される。共焦点ピンホール２９を透過した蛍光は、レンズ３０により平行光に変換される。平行光の光路上には、周波数走査手段を構成する音響光学素子ユニット３１が光路切換えミラー３２を介して配設される。
【００２３】
光路切換えミラー３２は、平行光の光路上の位置３２ａから図中破線で示す位置３２ｂに退避自在に配設されている。光路切換えミラー３２は、位置３２ｂに退避された状態で、当該光路に導かれた蛍光は、蛍光波長域の光を透過し、レーザ波長（ここでは４８８ｎｍ）をカットするバリアフィルタ３３を介して、光電子増倍管を有する光検出器３４に導かれて光量が検出される。
【００２４】
光検出器３４は、通常の走査型レーザ顕微鏡の走査画像を取得するための検出器である。光検出器３４は、１つの光スポットに対応する蛍光光量を、光走査ミラー２５１、２５２の走査に同期して、順次、検出する。そして、各光スポット位置の光量を図示しないモニタの各ピクセル上に表示させることによって２次元画像を得る。ここで得られる２次元画像は、各光スポット位置から発する蛍光のうち、バリアフィルタ３３により抽出された波長の範囲の光量の総和を示した画像であり、スペクトル特性データ等の細かい波長情報を含まない。
【００２５】
音響光学素子ユニット３１は、例えば、音響光学素子３１１（以下、「ＡＯＴＦ」と称する）と、光検出手段としてのスペクトラム特性測定用の光検出器（光電子増倍管）３１２とで構成される。ＡＯＴＦ３１１は、通常、図示しない結晶と、ＲＦトランスデューサとを備えている。ＲＦトランスデューサに所望の周波数の高周波電圧（ＲＦ）が印加されると、結晶の中に所望の周波数の音波が発生する。ＲＦの周波数と入射する光の波長との間で、ブラッグ反射の条件が満たされた波長のみ、１次回折光として、偏向されて、光検出器３１２で検出される。なお、検出器３１２として、光電子変換してシグナルを検出できるＰＭＴ以外のその他の同等の効果を得るデバイスを用いてかまわない。
【００２６】
１つのＲＦの周波数で１次回折光として偏向される光の波長幅は、通常３ｎｍ以下であり、その他の光の波長は、ＡＯＴＦ３１１の結晶を透過して光路に案内される。そこで、ＲＦの周波数を順次、切換え、又は走査させて、各周波数毎の光検出器３１２で検出される光量を測定していくことにより、蛍光のスペクトル特性を検出することが可能となる。
【００２７】
ここで、図１に示す制御部４０は、光走査ミラー２５１、２５２、光検出器３４、光検出器３１２、ＲＦトランスデューサを図示しない指令情報に基づいて制御する。制御部４０は、以下に示す３つの主な機能を備えている。
【００２８】
（１） 光走査ミラー２５１、２５２の走査のタイミングに合せて（同期して）、光検出器３４、光検出器に入射する光量を検出する機能。
【００２９】
（２） ＲＦの周波数の走査のタイミングに合せて（同期して）、光検出器３４、光検出器３１２の光量を検出する機能。
【００３０】
（３） 光走査ミラー２５１、２５２の走査のタイミングに合わせて（同期して）、ＲＦトランスデューサのＲＦの周波数を走査し、かつ、ＲＦトランスデューサのＲＦの周波数の走査のタイミングに合せて（同期して）、光検出器３１２の光量を検出する機能。
【００３１】
上記の構成において、音響光学素子ユニット３１により、スペクトル特性データを測定する動作について説明する。先ず、音響光学素子ユニット３１を使用する場合には、光路切換えミラー３２が、図示しない切換え機構により位置３２ａに移動される。これにより、レーザ光源２２から発したレーザ光が、光走査ミラー２５１、２５２により偏向される。これにより、試料２７上の任意の１点に光スポットが結ばれると、試料２７から発した蛍光は、ビームスプリッタ２４等を介して、共焦点ピンホール２９を透過する。そして、共焦点スポット２９を透過した蛍光は、レンズ３０により平行光に変換され、光路切換えミラー３２により反射されて、ＡＯＴＦ３１１に入射する。
【００３２】
ここで、ブラッグ反射の条件を満たす波長に対するＲＦの周波数の関係は、以下のようになっているとする。４９２ｎｍで１３２ＭＨｚ、４９６ｎｍで１３１ＭＨｚ、５００ｎｍで１３０ＭＨｚ、以下、４ｎｍ波長が長くなる度に１ＭＨｚづつＲＦの周波数が減少していき、６５２ｎｍで９２ＭＨｚ、６５６ｎｍで９１ＭＨｚ、６６０ｎｍで９０ＭＨｚであるものと仮定する。なお、ＲＦの周波数と波長の関係は、実際には、ＡＯＴＦ３１１の結晶の波長による屈折率差等により非線型関係となる場合があるが、ここでは、簡略化のため線型関係として説明する。
【００３３】
ＡＯＴＦ３１１でＲＦトランスデューサによりＲＦの周波数、１３２ＭＨｚを結晶にかけると、この周波数に対応する波長、４９２ｎｍの光が１次回折光として偏向される。その結果、４９２ｎｍ付近の波長の光の強度が光検出器３１２で検出される。そして、ＲＦの周波数を４９６ｎｍの波長に対応する周波数、１３１ＭＨｚを結晶にかけると、４９６ｎｍの光が１次回折光として偏向される。その結果、４９６ｎｍ付近の波長の強度が光検出器３１２で検出される。
【００３４】
以下、同様に、ＲＦの周波数を１ＭＨｚ毎に、６６０ｎｍのＲＦの周波数に対応する９０ＭＨｚまで、順次、切換えて（走査して）、各周波数に対応する、波長の光の強度を光検出器３１２で検出する。以上の工程により、図２に示すように、４９２ｎｍから６６０ｎｍまでの蛍光のスペクトル特性データが取得される。なお、ここで得られたスペクトル特性データは、光スポットが結ばれた試料上の１点から発する蛍光のデータである。
【００３５】
試料の広い範囲（走査画像取得範囲）からのスペクトル特性データを得る場合には、光走査ミラー２５１、２５２を走査して、試料２７上に結んだ光スポットを順次走査しながら、試料２７上の１点の光スポットからの蛍光のスペクトル特性データを求める上述の工程（ＲＦの周波数の走査と光検出器３１２による各ＲＦの周波数に対応する波長の光量測定）を実施する。この際、制御部４０は、光走査ミラー２５１、２５２と、ＲＦトランスデューサの周波数走査と、光検出器３１２による光の測定とを、同期させて制御する。
【００３６】
ここで、各ピクセル毎のスペクトル特性データの取得時間について考える。例えば、５１２×５１２ピクセルの画像で、１つのＲＦの周波数に対応する１つの波長の光検出器での検出時間を１μｓｅｃとし、ＲＦの周波数の切換え時間を１μｓｅｃとする。ＲＦの周波数は、１３２ＭＨｚから９０ＭＨｚまで１ＭＨｚ毎に切換えていくので、１つのピクセルでのデータ取得時間は、（１３２−９０）×２＋１＝８５μｓｅｃとなり、全ピクセルでのデータ取得時間は、８５（μｓｅｃ）×５１２×５１２＝２２．３ｓｅｃとなる。光走査ミラー２５１、２５２の帰線期間等の余裕を考慮しても３０秒以内にはデータが取得される。
【００３７】
なお、上記の説明では、ＲＦの周波数を１ＭＨｚに変化させて、４９２ｎｍから４ｎｍづつ６６０ｎｍまで測定して場合について述べたが、ＲＦの周波数は、ＡＯＴＦ３１１の波長分解能や全体のデータ取得時間、必要なスペクトル範囲、刻み幅等を考慮して適宜決めれば良いことは言うまでもない。そして、励起光であるレーザ波長の４８８ｎｍより長い波長域でデータを取得したのは、蛍光が４８８ｎｍより長い波長で発するからであることはいうまでもない。
【００３８】
また、２種の蛍光色素で染色された２重染色試料を測定する時は、長い波長の励起光が短い波長の励起光による蛍光と重なってくるので、この場合は、長い波長の励起光の波長に対応するＲＦの周波数は抜かして測定した方がよい。これは励起光の反射光は、蛍光波長よりはるかに強度が高いことによる。
【００３９】
上記のように、第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡においては、ＡＯＴＦ３１１を蛍光光路上に配置して、ＡＯＴＦ３１１の高周波電圧の周波数を切換設定している。これにより、それぞれの波長毎にＡＯＴＦ３１１を経由した光量を検出して蛍光のスペクトル特性データを検出することができる。
【００４０】
従って、第１の実施形態では、従来の方法である特開２０００−５６２４４の図６に記載されているような、「プリズム等の分散手段と、分散された蛍光を集光してスペクトル列を結像させる集光手段と、検出する波長範囲を選択するためにスペクトル列結像位置に配置された電気的に制御可能な微小偏向ミラー群からなるデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）」からなる、複雑な構造による蛍光スペクトル特性取得の方法を音響光学素子１つに置き換えることが可能となる。この結果、簡単な構成で正確なスペクトルデータを音響光学素子の周波数を切り換えることで高速に取得でき、かつ、小型化を促進できる。また、特開２０００−５６２４４の図７のように、走査装置部の小型化のために分光部をファイバにより走査装置に接続する構成で生じるファイバ伝送による光損失も抑えることができる。
【００４１】
さらに、第１の実施形態によれば、ＲＦの周波数の切換え速度が１００ｎｓｅｃ〜１μｓｅｃであることから、高速にスペクトル特性のデータを取得することができるので、迅速かつ高精度な検出が実現される。
【００４２】
また、第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡は、音響光学素子ユニット３１を走査ユニット２０から着脱可能に構成している。これにより、通常の走査型レーザ顕微鏡としての蛍光検出動作のみの装置と、通常の蛍光検出と蛍光のスペクトル特性データの双方の検出を選択的に行うことが可能な本実施形態の装置とで、通常の走査型レーザ顕微鏡の部分を共通化できる。このため、装置のシステムアップに容易に対応できる。
【００４３】
なお、ＵＳＰ５，３７７，００３、ＵＳＰ５，５２８，３６８には、ＡＯＴＦを用いて、単色の照明を行うか、または細いバンド幅で観察光を選択して、蛍光観察やラマン分光をＣＣＤのような２次元検出器を用いて行う方法が開示されている。
【００４４】
これらにおいては、ＡＯＴＦの主要部品である複屈折性を持ったプリズム（主にＴｉＯ_２などが用いられる）に周波数が印加された際、プリズム自体に内部歪が発生する。この内部歪は、ＣＣＤのような２次元検出が出来る構成に影響を及ぼす。周波数印加されたプリズムの内部歪に応じて、観察すべきＡＯＴＦを透過した画像に劣化が生じる。
【００４５】
本発明においては、以下の実施形態においても同様に、ＣＣＤのような２次元検出を行うのではなく、試料表面を走査して、試料の一点から発する光の量を検出している。従って、本発明においては、単に光量を検出しているだけなので、このような画像劣化は生じない。
【００４６】
（第２の実施形態）
図３を参照して、第２の実施形態を説明する。図３は、第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。なお、図３においては、図１と同一部分については、同一符号を付して、その説明を省略する。
【００４７】
第２の実施形態では、ＡＯＴＦ３１１を、図１で説明した光路切換えミラー３２の配置位置に配置することにより、ＡＯＴＦ３１１が、光路切換えミラー３２としての機能も有している。
【００４８】
上記の構成において、光検出器３４により通常の走査画像を取得する時には、ＡＯＴＦ３１１にはＲＦの周波数をかけずに、該ＡＯＴＦ３１１を停止させる。これにより、全ての蛍光波長は、ＡＯＴＦ３１１を透過して、バリアフィルタ３３を介して、光検出器３４に導かれて検出される。
【００４９】
そして、蛍光のスペクトル特性データを取得する場合には、第１の実施形態と略同様に波長のＲＦの周波数を音響光学素子３１１にかける。これにより、蛍光波長は、上述したようにＡＯＴＦ３１１により偏向されて光検出器３１２に導かれ、検出される。
【００５０】
第２の実施形態によれば、ＡＯＴＦ３１１に対して全くＲＦの周波数をかけずに光を、光検出器３４で検出するか、ＲＦの周波数をかけて光検出器３１２で検出するかにより、走査画像あるいはスペクトル特性データを取得することが可能となる。これにより、第１の実施形態に比して光路切換えミラー３２が節約できるので、より構成の簡単化が図れる。
【００５１】
上記の第１及び第２の実施形態において、次のような変形が可能である。例えば、第１及び第２の実施の形態では、ＲＦの周波数により回折される１次回折光を光検出器３１２で測定することにより、スペクトル特性データを取得していたが、音響光学素子３１１を透過する０次回折光を、光検出器３４で検出しても良い。この場合、バリアフィルタ３３を透過する蛍光波長の光量の総和から、ＲＦの周波数に対応する蛍光の波長（１次回折光として回折する）の光量を差し引いた光量が、各ＲＦの周波数毎に光検出器３１２により検出されていくことになる。これらの値を、反転処理することにより、スペクトル特性データを得ることができる。このようにすれば、１次回折光を検出する時より、蛍光光量がはるかに大きくなるため、高精度なデータの取得が可能となる。
【００５２】
（第３の実施形態）
図４は、本発明の第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。図４における、走査型レーザ顕微鏡は、光源部５０と、走査光学系５１と、顕微鏡部５２と、共焦点光学系５３と、ＡＯＴＦ３１１と、検出器３１２ａと３１２ｂと、制御部４０と、信号処理部４５を備えている。なお、図４において、図１又は図２と同じ部分には、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００５３】
図４に示す走査型レーザ顕微鏡と、図１のそれとが異なる点は、検出器３１２ａと３１２ｂとで、ＡＯＴＦ３１１による±１次回折光を検出するようにした点である。このため、新たに、信号処理部４５を備えている。
【００５４】
光源部５０からの光は、ダイクロイックミラー２４によって励起光として、走査光学系５１を介して顕微鏡部５２に導かれ、試料２７を励起する。蛍光試薬で標識された試料２７は励起光によって励起される。試料２７より発した蛍光は顕微鏡部５２及び走査光学系５１を介してダイクロイックミラー２４で蛍光として分離される。次に共焦点光学系５３を通過し、ＡＯＴＦ３１１に至る。ＡＯＴＦ３１１は図示されていないが、所望の波長乃至波長幅を選択するためにＡＯＴＦ３１１に特定の周波数を印加する固有のドライバが準備されている。蛍光は、ＡＯＴＦによって選択された波長成分であり、かつ、お互いに直交した偏光成分となる、偏向された±１次回折光と、更に波長選択されず、また、偏向されない成分となる０次回折光の３つの光路に分離される。
【００５５】
±１次回折光はそれぞれ検出器３１２ａ、３１２ｂ（以下、「ＰＭＴ」とも称する）によって受光され光量が検出され、信号処理部４５でＰＭＴ３１２ａ、３１２ｂからのシグナルを制御し、和信号や差信号としてデータを作ることができる。
【００５６】
このように、音響光学素子で印加される周波数に対応した波長として異なる方向に偏向された２つの蛍光もしくは反射光光路にそれぞれ検出器を設け、それら検出信号を、和信号や差信号などの合成信号として扱えば所望の波長選択された蛍光もしくは反射光の総和の蛍光強度等を効率よく取得できる。また独立信号として扱えば所望の波長選択された蛍光もしくは反射光から試料に由来した成分を取得することができる。これらは電気的な操作で高速にでき、かつ切換も簡単に行うことができる。
【００５７】
ＡＯＴＦ３１１の操作は、図示されていないドライバと組み合わせて図５で示すように行われる。
【００５８】
ドライバから印加された周波数に応じ、ＡＯＴＦ３１１から、図５（ａ）で示すような波長特性を有する１次回折光を得ることができる。ドライバからの周波数が波長λ０に一致し、この周波数と波長依存する回折効率の関係によって特定の波長帯域がスペクトルとして得られ、ＡＯＴＦ３１１での波長分解能を決定することができる。これらは、通常、ＡＯＴＦに入射する光の大きさ、広がり、波長、偏光などの特性によって異なるが、ここでは走査型共焦点レーザ顕微鏡を対象としているため、平行光の蛍光ビームを取り扱えばよいので、数ｎｍ〜数十ｎｍレベルの比較的高い分解能を得ることが出来る。また、ＡＯＴＦ３１１の音響光学効果に従って、±１次回折光は上述したように選択されたほぼ同一の波長特性を含み、更には正負それぞれの光路内でお互いに直交した２つの偏光成分へと分離されて、それぞれ検出される。この偏光分離の効果は、一般の偏光ビームスプリッタと類似している。これらにより、ランダム偏光である蛍光を同一波長帯で２つの偏光成分に分離し、選択波長も自由に設定することが可能となる。
【００５９】
加えて、波長に対して図５（ａ）に示すように下限値λ１、上限値λ２を設定し、その帯域に対応した周波数を掃引、すなわち中心波長を走査することによって、分光検出をすることができる。この動作は、機械的な動作を全く用いる必要がなく、電気的な操作によって行われるため、非常に高速に、かつ、振動もなく行うことができる。更には、本実施形態の走査光学系５１と組み合わせることにより、２次元、３次元の画像取得及び分光取得の複合的な検出を高速で達成することが容易になる。
【００６０】
また、選択された以外の波長となる０次回折光は、ＡＯＴＦ３１１内の複屈折率結晶を通過し、迷光を防ぐ光学的なストッパーでトラップされる。このとき０次回折光に含まれる成分は、試料２７から発する蛍光のうち、ＡＯＴＦ３１１で波長選択された図５の特性以外の蛍光成分であり、試料２７からの蛍光の偏光特性も保持されている。このとき、０次回折光には、結晶内の透過率によるわずかな光量ロスが発生する。一般に、ＡＯＴＦの波長分解能に比較して蛍光は広い波長スペクトラムを持っており、加えて、複数の蛍光試薬を用いる場合もあるため、特に図５には明示していない。
【００６１】
ＡＯＴＦ３１１上での特定の波長選択のオン・オフは、電気的な操作によって容易に達成される。これにより、検出したい波長位置、帯域に応じて分光することができる。つまり、励起波長となるレーザ光の漏れ光が検出側へ導かれないよう、レーザの波長位置（周波数）でＡＯＴＦ３１１がアクティブにならないよう電気的に設定し（オフ）、完全にレーザをカットした状態で波長選択、周波数掃引による分光検出を素早く行うこともできる。これらは、複数のレーザに対しても複数の波長位置（周波数）をドライバ上に電気的に設定し、容易に達成することができる。
【００６２】
また、更なるＡＯＴＦ３１１の特徴を図５（ｂ）に示す。
【００６３】
ＡＯＴＦ３１１は、独立した複数の周波数を同時に印加する特性を有する。図５（ｂ）は、３種類の周波数を与えることによって、λ０、λ３、λ４の３つの波長帯を得た一例である。ＡＯＴＦ３１１の１つの周波数に対する波長分解能は狭い波長半値全幅（すなわち高波長分解能）で固定されており、原理的に可変することはできない。そこで、λ０、λ３、λ４をお互いに近づけ、具体的にはＡＯＴＦ３１１に印加する周波数を近づけることによって、３つのスペクトルが包絡線を形成し波長半値全幅を広げることができる。この包絡線を、前述したように下限値λ１、上限値λ２を設定して、その波長域で掃引することも可能である。これにより、容易により波長幅を広くとれ、暗い蛍光を発するサンプルにも対応することができる。印加できる周波数の数はＡＯＴＦ３１１の特性とドライバの組合せによって決定されるものであって、ここ述べた例に限らず、より多くの周波数を印加することも可能である。
【００６４】
上記のように、複数の周波数を同時に音響光学素子に与えることによって、複数の中心波長を選択でき、それらの中心波長を近接させることによって従来音響光学素子で得られる比較的狭い波長分解能より、より広い選択波長幅を設定することができる。更に、それら近接した状態で複数の中心波長が設定された中心波長域で掃引させることによって、比較的暗い蛍光強度の試料でも効率のよいスペクトルデータの取得ができる。なお、このように、複数の周波数を同時に音響光学素子に与えて、より広い選択波長幅を設定する方法は、本実施形態のみでなく、他の実施形態、例えば、第１および第２の実施形態及び以降の実施形態、にも同様に適用可能である。
【００６５】
蛍光は、ほぼ同一の波長特性をもつが、お互いに直交した偏光成分として±１次回折光へ分離される。ＰＭＴ３１２ａ、３１２ｂによってそれぞれの１次回折光が検出されるが、信号処理部４５を介して、少なくとも２種類の演算信号を得ることが出来る。信号処理部４５からＰＭＴ３１２ａ、３１２ｂからの信号を和信号として出力すれば、設定された波長幅から蛍光総和シグナルとして扱うことができる。更にＰＭＴ３１２ａ、３１２ｂからの信号を信号処理部４５を介して差信号もしくは独立信号として出力すれば、実際の蛍光試薬の状態に応じて発生する蛍光偏光シグナルとして扱え、蛍光偏光解析を行うことができる。
【００６６】
図６は共焦点光学系の変形例を示す図である。図６（ａ）は本発明の１つの形態として上げられている共通光路内での共焦点光学系ある。一方で、分光検出では通常さまざまな光が回折されるため、一般には図４のように所望の±１次回折光のみを検出し、迷光を防ぐために検出器３１２ａ、３１２ｂの手前にはスリットもしくはやや大型ピンホールを置く場合多い。これら共焦点光学系とスリットを光路に２つおくと、少なからずケラレによる光量ロスも発生しやすい。そこで、両者の機能を兼ね合わせ、ロスを避けるため、光学系内で図６（ｂ）で示すように回折された±１次回折光光路それぞれに共焦点光学系を配置してももちろんかまわない。これにより、装置としての複雑さは増えるが、共焦点効果と迷光カットの２つの効果をもたせることも可能である。
【００６７】
第３の実施形態では、ＡＯＴＦ３１１を分光検出に用いることによって、機械的な駆動がなく、高効率な分光ができ、更には高速かつ高分解能な分光検出（スペクトルデータの検出）ができる走査型レーザ顕微鏡を達成することができる。更に、蛍光の偏光特性をも検出することができる。選択された同一波長成分・直交する偏光成分をもつ±１次回折光（蛍光成分）をそれぞれ検出することによって、通常と同じ蛍光総和シグナルや蛍光偏光シグナルへ簡単に切換でき、実際のサンプルで発生する蛍光をより詳細に定量化して調べることが可能となる。
【００６８】
従来分光手法自体では比較的装置の大型化させてしまう面があるが、本実施形態では、ＡＯＴＦを用いて検出器を比較的小型にすることができる。
【００６９】
（第４の実施形態）
図７は、本発明の第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。
【００７０】
第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡は、第３の実施形態のそれとほぼ同様の構成を備えている。第４の実施形態では、第３の実施形態において、検出器側に変形を加えている。すなわち、走査型レーザ顕微鏡の主要部として、第３の検出器３１２ｃを備えている。
【００７１】
ＡＯＴＦ３１１では、蛍光が±１次回折光と０次回折光に分離される。±１次回折光は上述した通りだが、０次回折光はＡＯＴＦ３１１を透過し偏向されない成分であり、また、試料２７からの蛍光のうち波長選択されていない成分をもつ。この光路に第３の検出器を設けるが、１つの例として、従来のフィルタ式の検出器でできる。具体的には、ＡＯＴＦ３１１の通過後の０次回折光に、レーザ光をカットし、所望の蛍光のみを抽出するバリアフィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）を有する検出器を備え、ＡＯＴＦ３１１後の迷光の度合いによっては必要に応じて共焦点レンズとピンホールで構成される共焦点光学系を兼ね備えてもよい。第３の検出器３１２ｃは、従来の走査型共焦点レーザ顕微鏡と同様に複数の検出器として設けることも可能である。
【００７２】
すなわち、特別な装置を組み合わせなくとも、分光検出はＡＯＴＦ３１１を用いた±１次回折光の検出で行え、かつ、より広い幅の検出乃至従来と同様な検出はフィルターを用いて行うことができ、両者の切換が容易に可能となる。ここで、フィルターを用いた検出では、従来フィルター検出による走査型レーザ顕微鏡で実施可能な方法はほとんど利用できるといってよい。
【００７３】
図示はしていないが、第３の検出器３１２ｃとして、従来のフィルター式の検出器を例としてあげたが、この０次回折光の光路を用いて、その他外付けの分光器やアバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）、ラインセンサやマルチチャンネルのセンサなどを用いることができ、この光路の使用範囲によってより複合化できることはいうまでもない。
【００７４】
以上により、ＡＯＴＦ３１１による分光検出に加え、０次回折光の光路で偏光されない成分の通常のフィルタ検出も可能となり、例えば、分光検出とフィルター式の検出とを容易に切換できる複合的な（ハイブリッドな）走査型レーザ顕微鏡とすることができる。分光検出と従来のフィルター式の検出の切換も容易であり、また、分光検出によって、より最適なフィルター選択にも簡単に寄与できるなど、目的や使用方法によって広い利用範囲をカバーできるようになる。
【００７５】
このように、第３の検出器を音響光学素子で周波数で偏向されない０次回折光の光路上に配置することによって、波長選択されていない蛍光又は反射光成分を検出することができ、装置として複合的な計測ができる構成をとることができる。
【００７６】
上記のように、音響光学素子によって異なる２つの光路に偏向された蛍光もしくは反射光が少なくとも１つの検出器によって検出され、音響光学素子に印加する周波数を操作することによって、所望の中心波長の選択あるいは中心波長の所望波長域で掃引し、所望の蛍光もしくは反射光を効率よく、高速かつ高精度にスペクトルデータとして取得することができる。また、この比較的簡便な構成にも関わらず汎用性が広く、少ないスペースで構成でき、システムを小型にすることができる。
【００７７】
（第５の実施形態）
図８は、本発明の第５の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。
【００７８】
走査型レーザ顕微鏡の主要部は、レーザ光源２２とコリメータレンズ２１からなる光源部５０、ＸＹの２次元走査を行うガルバノミラー６からなる走査光学系５１、結像レンズ８と対物レンズ９からなる顕微鏡部５２、ピンホール１３を含む共焦点光学系部１４、音響光学素子であるＡＯＴＦ３１１、２つの検出器である光電子倍増管（ＰＭＴ）で構成される検出器３１２ａと３１２ｂ、検出器３１２ａと３１２ｂのシグナルを制御する信号処理部４５から構成される。ここで、第１の実施形態と同様にレーザ光源部５０の導入は光ファイバ経由して行ってももちろんかまわない。また、図８はシステムの基本構成を表しており、レーザ光源２２に複数の波長を持たせるために、マルチラインのレーザとしたり、複数のレーザ光源を用いて構成してもかまわない。
【００７９】
検出器として、光電子変換してシグナルを検出できるＰＭＴ以外のその他の同等の効果を得るデバイスを用いてかまわない。
【００８０】
第５の実施形態の作用・効果は、第３の実施形態とほぼ同様であるが、以下説明する点で異なる。
【００８１】
光源部５０からのレーザ光は、ＡＯＴＦ３１１、共焦点光学系５３を通過し励起光として、走査光学系５１を介して顕微鏡部５２に導かれ、試料２７を励起する。このとき共焦点光学系５３は、励起光に対して１つの空間フィルタとしての役割を果す。蛍光試薬で標識された試料２７は励起光によって励起される。それによって発した蛍光は再び顕微鏡部１０を経て走査光学系５１・共焦点光学系５３を通過し、ＡＯＴＦ３１１に至る。このとき共焦点光学系は蛍光において共焦点効果を得るために機能する。ＡＯＴＦ３１１には、図示されていないが、所望の波長及び波長幅を選択するためにＡＯＴＦ３１１に特定の周波数を印加する固有のドライバが準備されている。サンプルから発した蛍光は、ＡＯＴＦ３１１によって選択された波長成分であり、かつ、お互いに直交した偏光成分となる、偏向された±１次回折光へと分離される。
【００８２】
すなわち、ＡＴＯＦ１５は、０次回折光光路上のレーザ光である励起光と、試料２７より発した蛍光を波長選択して偏向した±１次回折光とを分離するビームスプリッタとしての機能を持つ。このレーザ光源２２からの励起光は、ＡＯＴＦ３１１がもつ０次回折光の光路上で本来進む向きとは正反対の方向からＡＯＴＦ３１１に対して入射している。従来のダイクロイックミラーにコーティングされる誘電体膜における波長特性は、それほど急峻な立ち上がり特性をもたず、最大の透過率が８５％となりやや低く、マルチバンドの対応は多くて３励起波長までなど、コーティング技術上の欠点がある。第５の実施形態の場合、ＡＯＴＦ３１１は励起光に対してプリズムとして働き励起光を透過させるため、基本的にはＡＯＴＦ３１１内の結晶の透過率のみにしか光量のロスは発生しない。より高い効率を求めるため、複屈折結晶の偏光方向に対して、レーザ光源２２からの偏光方向を回転してあわせれば、よりロスを少なくできる。このときレーザ光を偏光保存光ファイバを用いてＡＯＴＦ３１１に導入すれば、ファイバの方向を回転するだけで簡単に偏光方向の合致は達成できる。
【００８３】
このため、高効率で容易に複数の励起波長への対応は、分光検出時の電気的にそれらの波長位置でＡＯＴＦ３１１をアクティブにしなければよく、システムに大幅な追加や変更を加えることなく容易に行うことが出来る。また、±１次回折光の波長選択は、ＡＯＴＦ３１１固有の高い波長分解能で行え、前述したように励起波長の位置近傍でオフできれば、従来にない非常に高い効率で蛍光を分光取得することができる。光の利用効率の面から考えて、共焦点光学系５３を図６（ｂ）のように配置してももちろんかまわない。このようにＡＯＴＦ３１１にビームスプリッタと分光検出の２つの機能を持たせることによって、非常にシンプルな構成にでき、システム自体を小型化することもできるようになる。
【００８４】
０次回折光の光路内に含まれる偏向されない蛍光成分は、レーザ光源に至る前までにダイクロイックミラーを用いて分離し、従来のフィルター式の検出器を設け、複合的な計測を行うことも可能である。また、ＡＯＴＦ３１１を用いることで第３の実施形態、第４の実施形態と同様の作用、機能を持つことができるのはもちろんいうまでもない。
【００８５】
以上により、ＡＯＴＦ３１１にビームスプリッタと分光機能の２つの機能を持たせることによって、高効率の励起光／蛍光の分離が行え、ＡＯＴＦ３１１自身の機能として高速・高分解の分光検出が達成できることはもちろん、システム全体を小型化することが可能にもなる。更には±１次回折光の偏光特性を利用して、蛍光試薬及びサンプルに由来する蛍光偏光の特性をも調べることができるようになり、小型でより複合的な計測を行うことができる。
【００８６】
このように、レーザ光源からのレーザ光を本来音響光学素子から出射される０次回折光の進む向きとは正反対から入射させることができ、音響光学素子に印加される周波数から影響を受けることなく走査光学系と顕微鏡を介して試料にレーザ光を照射することができる。従って、音響光学素子を上述したビームスプリッタの役割として、より高い光の利用効率をもって機能させることができる。この場合、音響光学素子に印加される周波数は単に試料に照射されるべき既知のレーザ波長に対応させないようにすればよく、従来のダイクロイックミラーでは達成できない高Ｓ／Ｎの励起光と蛍光の分離が達成でき、かつ、非常に簡便に複数のレーザ波長にも対応できるというメリットも生じる。
【００８７】
また、上記のような音響光学素子を用いた効率のよいスペクトルデータの取得に加え、音響光学素子から互いに直交する偏光成分である正負の１次回折光が２つの異なる方向に偏向し、少なくとも１つの検出器でそれぞれを検出することによって、試料状態や条件に由来する蛍光もしくは反射光を偏光成分として取得することができる。
【００８８】
よって、本発明は、上記の各実施形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。例えば、本実施形態では、ＲＦの周波数により回折される１次回折光を光検出器３１２で測定することにより、スペクトル特性データを取得していたが、ＡＯＴＦ３１１を透過する０次回折光を、光検出器３４で検出しても良い。この場合、バリアフィルタ３３を透過する蛍光波長の光量の総和から、ＲＦの周波数に対応する蛍光の波長（１次回折光として回折する）の光量を差し引いた光量が、各ＲＦの周波数毎に光検出器３１２により検出される。これらの値を、反転処理することにより、スペクトル特性データを得ることができる。このようにすれば、１次回折光を検出する時より、蛍光光量がはるかに大きくなるため、高精度なデータの取得が可能となる。さらに、上記の各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。
【００８９】
例えば実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。
【００９０】
上述した第３から第５の実施形態において、記述したように、光源として光ファイバを用いたレーザ光の導入を行えば、一般に知られているように、熱や振動に対する回避、良質な点光源化、走査光学系と検出系の小型化を達成することができる。
【００９１】
また、光源として、マルチラインを発生するレーザや複数のレーザを用いてビームを合成するコンパイナを用いて、所望の複数の励起波長を組み合わせてももちろんかまわない。そこに第２のＡＯＴＦを備え、レーザ選択と強度調整の機能を持たせることも可能である。
【００９２】
図示していないが、±１次回折光をミラーなどを用いて１つの検出器に導き、それぞれの光路にシャッターを設けることによって、＋１次回折光と−１次回折光を同時に検出したり、スイッチングしながら交互に検出したりしても良い。両方のシャッターを同時に開ければ蛍光の総和シグナルとなり、シャッターのスイッチングと検出器のタイミングを電気的に同期させ時間的に信号を分離させることによって、異なる２つの蛍光偏光成分を検出できる。
【００９３】
特に反射光を検出する場合については、詳細に明記していないが、１つの例として、試料２７に照射されるレーザ光に散乱が生じ、その物性に応じて散乱光の波長持性を調べるラマン分光法にも本発明は適用できる。この場合レーザ光と散乱光の波長は極めて近接しているが、特に第５の実施形態の構成により、ＡＯＴＦ３１１による高い波長分解能によって、効率よくラマン散乱を検出することができる。このように、本発明は必ずしも蛍光の分光検出に制限されるものではなく、広く一般の分光器として適用できることはいうまでもない。
【００９４】
また、本発明は走査型共焦点レーザ顕微鏡として記載され、走査光学系７を介してレーザ光源２２からの励起光をサンプル面１１でＸ−Ｙ走査するようになっているが、ある１点のみに励起光を照明する基本構成でもＡＯＴＦ３１１を用いることによって同等の作用、効果は得られる。この場合、所望のデータや画像取得を得るために、走査の手段としてステージを駆動させたり、Ｘ−Ｙでないその他の走査手段を組み合わせてもよい。
【００９５】
上記の各実施形態から下記の発明が抽出される。
本発明の第１の局面に係る走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料上に集光して、前記試料からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を前記試料上に２次元的に走査させる光走査手段と、前記蛍光又は反射光の光路上に配置され、入射する蛍光又は反射光から印加される高周波電圧の周波数に対応した波長の光のみを選択して偏向させる音響光学素子と、前記音響光学素子を経由した光を検出する光検出手段と、前記音響光学素子に印加する高周波電圧の周波数を切換設定する周波数走査手段と、を具備することを特徴とする。
【００９６】
第１の局面に係る走査型レーザ顕微鏡の好ましい実施態様は以下の通りである．なお、以下の各実施態様は、それぞれ独立で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用することができる。
【００９７】
（１） 前記レーザ光と前記蛍光又は反射光を分離するビームスプリッタを更に備え、前記ビームスプリッタが、前記対物レンズと前記音響光学素子との間に配置されている。
【００９８】
（２） 前記光検出手段で検出される光は、前記音響光学素子により偏向される１次回折光である。
【００９９】
（３） 前記音響光学素子を透過した０次光を検出する第２の検出器を備える。
【０１００】
（４） 前記周波数走査手段は、高周波電圧の周波数を前記光走査手段の走査に同期させてピクセル毎のスペクトル特性を検出し得るように切換設定する。
【０１０１】
（５） 前記音響光学素子及び前記光検出手段を１つのユニットとして構成し、前記ビームスプリッタにより分離された検出光路に着脱自在に配設する。
【０１０２】
（６） 前記周波数走査手段による走査範囲は、レーザ波長に対応する高周波電圧の周波数を含まない。
【０１０３】
（７） 前記音響光学素子は、前記蛍光又は前記反射光を異なる方向の第１と第２の光路に偏向し、前記検出器は、前記第１と第２の光路上に、それぞれ配置された少なくとも１つの検出器を含む。
【０１０４】
（８） 前記音響光学素子を透過した０次光を検出する検出器を更に備える。
【０１０５】
（９） 前記音響光学素子は、前記蛍光又は前記反射光を異なる方向の第１と第２の光路に偏向すると共に、前記第１と第２の光路以外の第３の光路からレーザ光を入射する。
【０１０６】
（１０） 前記蛍光又は反射光は、前記音響光学素子によって偏向された第１と第２の光路上の蛍光又は反射光は、互いに直交する偏光成分である正負の１次回折光である。
【０１０７】
（１１） 前記偏向された前記第１と第２の光路に設けられた２つの検出器からの信号を和信号もしくは差信号となる合成信号、あるいはそれぞれを独立信号として処理する信号処理部を更に備えた。
【０１０８】
（１２） 前記音響光学素子には複数の中心波長又は周波数の設定ができ、前記複数の中心波長又は周波数を近接又は隣接させることによって、それぞれの中心波長又は周波数によって形成されるスペクトルを部分的に重ねあわせ、より広い波長幅を選択できるようにする。
【０１０９】
（１３） 前記音響光学素子は、前記蛍光又は前記反射光を互いに異なる方向の第１及び第２の光路に偏光するものであり、前記第１及び第２の光路に導かれた前記蛍光又は前記反射光を１つの検出器に導く偏向装置が設けられている。
【０１１０】
（１４） 前記第１及び第２の光路にそれぞれ設けられたシャッタを更に備える。
【０１１１】
（１５） 前記第３光路は、前記音響素子の前記周波数で偏向されない０次回折光の光路である。
【０１１２】
（１６） 前記第３光路上の前記レーザ光は、前記音響光学素子から出射する０次回折光の光路上にあり、かつ、その進む向きが前記０次回折光とは正反対である。
【０１１３】
本発明の第２の局面に係る走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときには、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部と、前記＋１次回折光を受光する第１の光検出器と、前記−１次回折光を受光する第２の光検出器と、を具備することを特徴とする。
【０１１４】
第２の局面に係る走査型レーザ顕微鏡の好ましい実施態様は以下の通りである．なお、以下の各実施態様は、それぞれ独立で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用することができる。
【０１１５】
（１） 前記第１の光検出器の出力信号と前記第２の光検出器の出力信号を加算した値に基づいて前記試料の画像を生成する手段を更に具備する。
【０１１６】
（２） 前記高周波信号制御部によって前記高周波電圧の周波数を掃引し、各周波数における前記第１及び第２の光検出器の出力信号を取得することによって、前記蛍光又は反射光のスペクトルデータを取得する。
【０１１７】
（３） （２）において、前記０次回折光を受光する第３の光検出器を更に具備し、前記音響光学素子に前記高周波電圧を印加しないときには、前記第３の光検出器の出力信号を用いて前記試料の画像を生成する。
【０１１８】
本発明の第３の局面に係る走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときには、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部と、前記＋１次回折光を受光する第１の光検出器と、前記−１次回折光を受光する第２の光検出器と、を具備し、前記レーザ光源は、前記レーザ光が変調されずに前記音響光学素子を透過して、前記対物レンズに導かれるように、前記０次回折光の光路に配置されている。
【０１１９】
本発明の第４の局面に係る走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときには、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧の周波数に応じた波長の光を１次回折光に回折させると共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部と、前記１次回折光を受光する光検出器と、を具備し、前記高周波信号制御部によって前記高周波電圧の周波数を掃引し、各周波数における前記光検出器の出力信号を取得することによって、前記蛍光又は反射光のスペクトルデータを取得する。
【０１２０】
第４の局面において、前記０次回折光を受光する第２の光検出器を更に具備し、前記音響光学素子に前記高周波電圧を印加しないときには、前記第２の光検出器の出力信号を用いて前記試料の画像を生成することが好ましい。
【０１２１】
なお、本発明は、上記の発明の実施の形態に限定されるものではない。本発明の要旨を変更しない範囲で種々変形して実施できるのは勿論である。
【０１２２】
【発明の効果】
本発明によれば、構成簡易にして、小型化の促進を図り得、且つ、高効率な分光ができ、更には高速かつ高分解能な分光検出をも実現できる走査型レーザ顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の要部を示した構成図。
【図２】 図１で取得されるスペクトル特性データの例を示した特性図。
【図３】 本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の要部を示した構成図。
【図４】 第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。
【図５】 擬似的にバンド幅を広くする例を説明するための図。
【図６】 共焦点光学系の変形例を示す図。
【図７】 第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。
【図８】 第５の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…音響光学素子
６…ガルバノミラー
７…走査光学系
８…結像レンズ
９…対物レンズ
１０…顕微鏡部
１１…サンプル面
１３…ピンホール
１４…共焦点光学系部
１５…ＡＴＯＦ
１９…反射ミラー
２０…走査ユニット
２１…コリメータレンズ
２２…レーザ光源
２３…ファイバ
２４…ダイクロイックミラー（ビームスプリッタ）
２５…光走査手段
２６…対物レンズ
２７…試料
２８…共焦点レンズ
２９…共焦点ピンホール（共焦点スポット）
３０…レンズ
３１…音響光学素子ユニット
３２…ミラー
３２ａ…位置
３２ｂ…位置
３３…バリアフィルタ
３４…光検出器
４０…制御部

Claims (25)

1. レーザ光を試料上に集光して、前記試料からの蛍光を取り込む対物レンズと、
   前記レーザ光を前記試料上に２次元的に走査させる光走査手段と、
   前記蛍光の光路上に配置され、入射する蛍光から印加される高周波電圧の周波数に対応した波長の光のみを選択して偏向させる音響光学素子と、
   前記音響光学素子で偏向された蛍光を検出する光検出手段と、
   前記音響光学素子に印加する高周波電圧の周波数を切換設定する周波数走査手段と、を具備することを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. 請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記レーザ光と前記蛍光を分離するビームスプリッタを更に備え、前記ビームスプリッタが、前記対物レンズと前記音響光学素子との間に配置されている。
3. 請求項１又は請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記光検出手段で検出される光は、前記音響光学素子により偏向される１次回折光である。
4. 請求項３に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記音響光学素子を透過した０次光を検出する第２の検出器を備える。
5. 請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記周波数走査手段は、高周波電圧の周波数を前記光走査手段の走査に同期させてピクセル毎のスペクトル特性を検出し得るように切換設定する。
6. 請求項２から請求項５のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記音響光学素子及び前記光検出手段を１つのユニットとして構成し、前記ビームスプリッタにより分離された検出光路に着脱自在に配設する。
7. 請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記周波数走査手段による走査範囲は、レーザ波長に対応する高周波電圧の周波数を含まない。
8. 請求項１又は請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡において、
   前記音響光学素子は、前記蛍光を異なる方向の第１と第２の光路に偏向し、
   前記検出器は、前記第１と第２の光路上に、それぞれ配置された少なくとも１つの検出器を含む。
9. 請求項８に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記音響光学素子を透過した０次光を検出する検出器を更に備える。
10. 請求項１又は請求項８に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記音響光学素子は、前記蛍光を異なる方向の第１と第２の光路に偏向すると共に、前記第１と第２の光路以外の第３の光路からレーザ光を入射する。
11. 請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記音響光学素子によって偏向された第１と第２の光路上の蛍光は、互いに直交する偏光成分である正負の１次回折光である。
12. 請求項８から請求項１１のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記偏向された前記第１と第２の光路に設けられた２つの検出器からの信号を和信号もしくは差信号となる合成信号、あるいはそれぞれを独立信号として処理する信号処理部を更に備えた。
13. 請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項８から請求項１１のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記音響光学素子には複数の中心波長又は周波数の設定ができ、前記複数の中心波長又は周波数を近接又は隣接させることによって、それぞれの中心波長又は周波数によって形成されるスペクトルを部分的に重ねあわせ、より広い波長幅を選択できるようにする。
14. 請求項１１に記載の走査型レーザ顕微鏡において、
    前記音響光学素子は、前記蛍光を互いに異なる方向の第１及び第２の光路に偏向するものであり、
    前記第１及び第２の光路に導かれた前記蛍光を１つの検出器に導く偏向装置が設けられている。
15. 請求項１４に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記第１及び第２の光路にそれぞれ設けられたシャッタを更に備える。
16. 請求項９又は請求項１０に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記第３光路は、前記音響素子の前記周波数で偏向されない０次回折光の光路である。
17. 請求項１０に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記第３光路上の前記レーザ光は、前記音響光学素子から出射する０次回折光の光路上にあり、かつ、その進む向きが前記０次回折光とは正反対である。
18. レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍光を取り込む対物レンズと、
    前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、
    前記蛍光の光路上に配置された音響光学素子と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときには、入射した前記蛍光のうち前記高周波電圧の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射した前記蛍光を０次回折光として透過させ、
    前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部と、
    前記＋１次回折光を受光する第１の光検出器と、
    前記−１次回折光を受光する第２の光検出器と、を具備する走査型レーザ顕微鏡。
19. 請求項１８に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記第１の光検出器の出力信号と前記第２の光検出器の出力信号を加算した値に基づいて前記試料の画像を生成する手段を更に具備する。
20. 請求項１８に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記高周波信号制御部によって前記高周波電圧の周波数を掃引し、各周波数における前記第１及び第２の光検出器の出力信号を取得することによって、前記蛍光のスペクトルデータを取得する。
21. 請求項２０に記載の走査型レーザ顕微鏡において、
    前記０次回折光を受光する第３の光検出器を更に具備し、
    前記音響光学素子に前記高周波電圧を印加しないときには、前記第３の光検出器の出力信号を用いて前記試料の画像を生成する。
22. レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍光を取り込む対物レンズと、
    前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、
    前記蛍光の光路上に配置された音響光学素子と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときには、入射した前記蛍光のうち前記高周波電圧の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射した前記蛍光を０次回折光として透過させ、
    前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部と、
    前記＋１次回折光を受光する第１の光検出器と、
    前記−１次回折光を受光する第２の光検出器と、を具備し、前記レーザ光源は、前記レーザ光が変調されずに前記音響光学素子を透過して、前記対物レンズに導かれるように、前記０次回折光の光路に配置されている走査型レーザ顕微鏡。
23. レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍光を取り込む対物レンズと、
    前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、
    前記蛍光の光路上に配置された音響光学素子と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときには、入射した前記蛍光のうち前記高周波電圧の周波数に応じた波長の光を１次回折光に回折させると共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射した前記蛍光を０次回折光として透過させ、
    前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部と、
    前記１次回折光を受光する光検出器と、を具備し、前記高周波信号制御部によって前記高周波電圧の周波数を掃引し、各周波数における前記光検出器の出力信号を取得することによって、前記蛍光のスペクトルデータを取得する走査型レーザ顕微鏡。
24. 請求項２３に記載の走査型レーザ顕微鏡において、
    前記０次回折光を受光する第２の光検出器を更に具備し、
    前記音響光学素子に前記高周波電圧を印加しないときには、前記第２の光検出器の出力信号を用いて前記試料の画像を生成する。
25. 請求項１８又は請求項２３に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記レーザ光と前記蛍光を分離するビームスプリッタを更に備え、前記ビームスプリッタが、前記対物レンズと前記音響光学素子との間に配置されている。

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