WO2001060359A1 - Activite physiologique d'un derive de benzopyrane issu de la propolis - Google Patents

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WO2001060359A1
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propolis
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Mikako Hirota
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Mikako Hirota
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to the use and production of 2,2-dimethyl-8- (3-methyl-2-buteninole) benzopyran-16-cis-propionic acid represented by the chemical formula (I) as an antitumor agent About the method.
  • Antineoplastic agents are used to treat cancer and are broadly divided into chemotherapeutic agents and immunotherapy agents.
  • Chemotherapeutic agents include alkylating agents (nitrogen mustard, melpheran, cyclophosphamide), anticancer antibiotics (adriamycin, bleomycin, nercarzinostatin), and antimetabolites (metabolic agents).
  • Immunotherapeutic agents having an immunostimulatory effect.
  • Immunotherapeutic agents enhance immunity, act on immune response cells, and exert anticancer effects. Compared with chemotherapeutic agents, immunotherapy has fewer side effects but mild antitumor effects. Therefore, it is used as a rescue therapy.
  • Propolis is a glue made from the mixture of vegetable fats collected by honeybees and their secretions. Since ancient times, it has been used as a folk remedy showing pharmacological activities such as antibacterial and anti-inflammatory activities mainly in Eastern European countries. Recently, propolis has been consumed as a dietary supplement. As a result, an antitumor effect was recognized, and an antitumor active substance was isolated and identified from the extract.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 5-58943 Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 5-271031, Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 9-1143179
  • An object of the present invention is to provide a novel benzopyran derivative, an antitumor agent comprising 2,2-dimethyl-8- (3-methyl-2-butul) benzopyran-16-cis-1-propionic acid as a main component. .
  • the benzopyran derivative of the present invention 2,2-dimethyl-8- (3-methyl-12-butyr) benzopyran-16-cis-propionic acid, is represented by the chemical formula (I).
  • the present invention provides an antitumor agent comprising a benzopyran derivative, 2,2-dimethyl-8- (3-methyl-2-butul) benzopyran-16-cis-propionic acid and a salt thereof as an active ingredient. Used. Salts include pharmaceutically acceptable salts.
  • the present invention provides (1) pulverizing propolis with a mixer, extracting with methanol, removing impurities in a methanol suspension, obtaining a methanol extract of propolis, and then removing a solvent of the obtained methanol extract. Is concentrated under reduced pressure to obtain a methanol extract of propolis.
  • the methanol extract is applied to an adsorption system using a silica gel and a 100% methyl chloride. Gradient elution with a mixture of methyl chloride and methanol (95%: 5% v / v) followed by a mixture of methyl chloride and methanol (90%: 10% v / v).
  • the solvent acetonitril content of the solution was distilled off under reduced pressure while shielding the light, and the resulting residue was converted into a 50% v / v methanol solution, which was used for liquid chromatography using an ODS column to perform liquid chromatography.
  • the silica gel used in step (2) is commercially available. Particularly, silica gel of 75 to 150 ⁇ m (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) is preferable in the present application.
  • step (3) and step (5) are for high-performance liquid chromatography, and commercially available ODS-based silica gel columns can be used for the reversed-phase column.
  • ODS-based silica gel columns can be used for the reversed-phase column.
  • a 5-ODS-H column (Chemcobond) equilibrated with acetonitrile is preferred.
  • FIG. 1 shows the results of liquid cloning chromatography, Z-mass analysis, and ionization (ESI) of the present benzopyran derivative.
  • Figure 2 shows the results of gas chromatography mass spectrometry and ionization (EI, m / z) of the benzopyran derivative.
  • Fig. 3 shows the results of photodiode array (UV measurement) of the benzopyran derivative.
  • the symbol (1) in this figure is the absorbance of the present benzopyran derivative, and the symbol (2) is the absorbance of the photoisomer of the substance.
  • FIG. 4 is a diagram showing the result of 1 H-NMR spectrum (500 MHz) of the present benzopyran derivative.
  • FIG. 4 is a diagram showing the result of 1 H-NMR spectrum (500 MHz) of the present benzopyran derivative.
  • FIG. 5 is a diagram of the result of a “C-NMR spectrum (125.655 MHz) of the present benzopyran derivative.
  • FIG. 6 is a two-dimensional NMR spectrum of the present benzopyran derivative.
  • DOO Norre NO ESY ( 'H-NMR 500 MHz, 13 C - NMR 125.65MH z).
  • diagrams the results of Figure 7 is of the base Nzopiran derivative two-dimensional NMR space-vector HMB C (1 H - NMR 500 H z, 13 C - .
  • NMR 125.65MHz) is a partial view of the results of the invention bEST mODE fOR CARRYING OUT tHE
  • Step 1 250 g of propolis was ground with a mixer, mixed with 1500 mL of 99.5% methanol, and left at room temperature for about one month. Obtained suspension The suspension was filtered under reduced pressure to obtain a methanol extract of propolis. Next, the solvent of the obtained methanol extract was distilled off under reduced pressure.
  • Step 2 Approximately 1 g of the residue obtained in Step 1 is converted into a methanol solution, and is sucked into 100 g of gel. And gradient elution was performed with a concentration gradient of a mixture of methyl chloride and methanol (95%: 5% v / v) and then a mixture of methyl chloride and methanol (90%: 10% v / v). Then, it was spotted on a thin layer plate and developed with a developing solvent of methyl chloride and methanol (97%: 3% v / v), and elution fractions having an R f value of 0.3 were collected.
  • Step 3 The solvent of the fraction obtained in Step 2 was distilled off under reduced pressure to obtain about 20 mg of a residue. The resulting residue was then converted to a 50% methanol solution, and the resulting solution was applied to an ODS silica gel column for high-performance liquid chromatography and equilibrated with acetonitrile, and a 5-ODS-H column (Chemco pound). It was injected and the main fraction was collected.
  • Step 4 The fraction obtained in Step 3 together with the solvent was directly irradiated with ultraviolet light for 10 minutes using a transilluminator with a wavelength of 366 ° C, and the solvent was distilled off under reduced pressure while shielding the acetonitril content of the solvent from light.
  • Step 5 The residue solution obtained in Step 4 was converted to a 50% methanol solution, and the obtained solution was equilibrated with acetonitrile.
  • Step 6 The acetonitrile component of each solution obtained in Step 5 was distilled off under reduced pressure while shielding light, and methyl chloride was added to carry out a liquid separation to obtain an organic solvent layer. It was repeated three times. The collected organic solvent layer was distilled off under reduced pressure while shielding the light, to obtain about 1.1 mg of a residue. Due to the physicochemical properties of this residue, it is 2,2-dimethyl-8- (3-methyl-12-butenyl) benzopyra It was confirmed to be 1-6-cis-propionic acid.
  • the present benzopyran derivative and a photoisomer substance undergo photoisomerization under visible light.
  • the reaction reached a complete equilibrium by UV irradiation of the 366 nm transilluminator, and the UV, mass spectrum, NMR measurement, etc. agreed with the optical equilibrium.
  • This benzopyran derivative is stable under light shielding.
  • This benzopyran derivative is insoluble in water and soluble in methanol, ethanol, acetonitril, chloroform, and ethyl acetate.
  • TM S Fig. 4 shows the results. The assignment of each peak is shown in the table below.
  • Fig. 5 shows the results. The assignment of each peak is shown in the following table c (Table 2) The 13 C-NMR assignments
  • Fig. 6 shows the results.
  • Fig. 7 shows the results.
  • the benzopyran derivative showed a single peak at the retention times indicated under the conditions (1) and (2) above.
  • the benzopyran derivative of the present invention was found to have 2,2-dimethyl-8- (3-methyl-2-buturyl) benzopyran-6-cis-propinoic acid represented by the chemical formula (1) (molecular formula: C 19 H 22 0 3, molecular weight: 2 9 8.3) and was identified.
  • Example 1 Using the present benzopyran derivative obtained in Example 1 as a test substance, a cytotoxicity test was performed using the inhibition of tumor cell proliferation as an index as follows.
  • Human lung cancer cultured cells trypsinized in the logarithmic growth phase (HL C-2 strain) was prepared in 1 X 1 0 5 cells / m L, 0. 0 5 mL each of 9 6-well microtiter plates Ueru Each was seeded and pre-cultured.
  • a MEM- ⁇ medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum and L-glutamic acid supplemented with antibiotics was used as a culture solution.
  • the test substance should be shielded with the same culture medium as appropriate. After dilution to each strain, 0.05 mL was added to the same well to make the total volume 0.5 mL.
  • HLC—2 shares 1 8
  • the benzopyran derivative of the present invention 2,2-dimethyl-8- (3-methyl-12-butyr) benzopyran-16-cis-propenoic acid, exhibits antitumor activity and can be used as an antitumor agent . It is also expected to be an antitumor agent with high safety and few side effects.
  • the benzopyran derivative of the present invention 2,2-dimethyl-8- (3-methyl-2-butur) benzopyran-16-cis-propinoic acid, has an antitumor cell effect on tumor cells as shown in Example 3. Therefore, it is considered that administration in various forms shows a very effective antitumor cell effect.
  • the method of administering the compound may be parenteral or oral, and the composition administered may include a therapeutically effective amount of the compound and a pharmaceutically acceptable diluent, stabilizer, or excipient. Etc. are contained.
  • the dosage form include intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, parenteral administration such as suppositories and ointments, and oral administration using tablets, powders, capsules, granules and the like.
  • the propolis extract has various effects such as anti-inflammatory, anti-ulcer, anti-tumor, macrophage activation, cancer metastasis suppression, active oxygen elimination, virus growth suppression, and hair growth.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-2711031 Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-3166968, etc.
  • the action of the benzopyran derivative of the present invention 2,2-dimethyl-8- (3-methyl-2-butenyl) benzopyran-16-cis-propionic acid, can be expected.

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Description

明 細 書 プロポリ ス由来のベンゾビラン誘導体の生理活性 技術分野
この発明は、 化学式 （ I ) で表される 2， 2 —ジメチルー 8— ( 3 —メチルー 2 —ブテニノレ） ベンゾピラン一 6 —シス一プロぺノィ ック酸の抗腫瘍剤と しての用途及び製造方法に関する。
化学式 （ I )
Figure imgf000003_0001
背景技術
抗腫瘍剤は癌の治療に用いられ、 化学療法剤と免疫療法剤に大別され る。 化学療法剤と して、 アルキル化剤 （ナイ トロジェンマスター ド、 メ ルフェラン、 シク ロフォスフア ミ ド）、 抗癌性抗生物質 （ア ドリ アマイ シン、 ブレオマイシン、 ネルカルチノスタチン）、 代謝拮抗剤 （メ ト ト レキセ一 ト、 5 —フルォロ ウラシル、 6 —メノレカプトプリ ン）、 ホルモ ン剤 （エス ト ロゲン、 アン ドロゲン、 プロスチン）、 植物由来物質 （ビ ンブラスチン、 カンプ トテシン、 エ トポシ ド）、 酵素 （ァスパラギナ一 ゼ）、 その他 （プロカルパジン、 ヒ ドロキシゥ レア、 シスプラチン） 等 が主に臨床上用いられている。 しかし、 化学療法剤は広範な癌に用いら れ、 その効果が認められているものの、 癌細胞だけを選択的に攻撃し、 正常細胞には毒性がなく、 従って副作用がないという、 真の制癌剤はい まだに開発されていない。 その結果、 長期間投与に注意を要しなければ ならない。
最近、 癌の治療効果を期待し、 腫瘍細胞に対する宿主の応答力を変化 させる薬物、 または治療法の研究が提唱され、 開発が始められている。 この一種に免疫賦活力作用がある免疫療法剤が含まれる。免疫療法剤は、 免疫力を昂進させ、 免疫応答細胞に作用し、 抗癌カを発揮する。 化学療 法剤に比べ、免疫療法剤の副作用は少ないが抗腫瘍効果は穏やかである。 そのため捕助的療法剤として使用されている。
前記に示した通り、 従来の抗腫瘍剤には問題点も多い。 それゆえ、 抗 腫瘍効果が高く、 副作用が少なく、 免疫力を昂進する安全性の高い、 安 価な抗腫瘍剤の開発が望まれる。
プロポリスは、 ミツバチが採取した植物性榭脂類と自らの分泌物とが 混ぜ合わされて出来た膠状物質である。古来より東欧諸国を中心に抗菌、 抗炎症作用等の薬理活性を示す民間療法剤として用いられている。 最近 プロポリスは、 健康補助食品として飲用されている。 その結果、 抗腫瘍 効果が認められ、 抽出物より抗腫瘍活性物質の単離、 同定も行われてい る。 （日本特開平 5— 5 8 94 3号、 日本特開平 5— 2 7 1 0 3 1号、 日本特開平 9一 1 4 3 1 7 9号）
本発明も抗腫瘍活性を有する新規生理活性物質を発見すべく、 プロボ リ スよ り抽出精製を行い、 抗腫瘍活性を有する物質として化学式 （ I ) で表される 2 , 2—ジメチルー 8— （ 3—メチルー 2—ブテニル） ベン ゾピラン一 6—シス一プロぺノィ ック酸を見出した。
本発明のベンゾピラン誘導体、 2, 2—ジメチルー 8— ( 3—メチル — 2—ブテニル） ベンゾピラン一 6—シス 一プロべノイツク酸の類似 物質は、 PHYTOCHM I S TRY, 2 5 ( 4 )， 8 8 3— 8 8 9， 1 9 8 6及び， 2 2 ( 1 0 )， 1 9 6 9 S 4 K文献で報告され、 既に多 くの誘導体が知られている。 しかし、 この発明のベンゾピラン誘導体、 2， 2 —ジメチルー 8 — ( 3—メチルー 2 —ブテュル） ベンゾピラン一 6 —シス 一プロぺノィック酸の生理活性作用は未だ知られておらず抗 腫瘍活性を有することは当然のことながら新規な知見である。
本発明は、 新規なベンゾピラン誘導体、 2， 2 _ジメチルー 8— （ 3 —メチルー 2—ブテュル） ベンゾピラン一 6—シス一プロぺノィック酸 を主成分とする抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
さ らにべンゾピラン誘導体、 2， 2—ジメチルー 8— （ 3—メチルー 2—ブテュル） ベンゾピラン一 6 —シス一プロべノイ ツク酸の新規な製 造方法を提供し、 可視光下の光反応により生成する光異性体物質である ことを証明することを目的とする。 発明の開示
本発明のベンゾピラン誘導体、 2， 2—ジメチルー 8— （3 —メチル 一 2 —ブテュル） ベンゾピラン一 6—シス一プロぺノィック酸は化学式 ( I ) で表される。
本発明は、 ベンゾピラン誘導体、 2， 2 —ジメチルー 8— ( 3—メチ ルー 2—ブテュル） ベンゾピラン一 6—シス一プロぺノィック酸及びそ の塩を有効成分として含有してなる抗腫瘍剤と して用いられる。 塩と し ては薬学上許容される塩類が含まれる。
また本発明は、 （ 1 ) プロポリ スをミキサーで粉砕し、 メタノール 抽出を行い、 メタノール懸濁液の不純物を除去し、 プロポリスのメタノ —ル抽出液を得、 次いで得られたメタノール抽出液の溶媒を減圧下濃縮 し、 プロポリスのメタノール抽出物とする工程、 （ 2 ) 前記メタノール 抽出物をシリ力ゲル力ラムによる吸着系力ラムにかけ、 100 %塩化メチ ルから、 塩化メチルとメ タノール （95 % ： 5 % v/v) の混合液、 次に塩 化メチルとメタノール （90 % ： 10 % v/v) の混合液での濃度勾配による 傾斜溶離を行い、 各分画を分取する工程、 （ 3 ) 前記塩化メチル濃度 100 %〜 95 %画分、 展開溶媒塩化メチルとメタノール （95 %: 5 % v/v ) の 溶出区分 （R f 値 0. 3) を集め、 その溶媒を滅圧下濃縮、 次いで得 られた残渣を、 メタノール と蒸留水 （50 % ： 50 % v/v) の混合液に溶 解し、 得られた溶液を OD S系カラムによる液体クマ トグラフィ一にか け、 ァセ トニ トリルと 50mMアンモニゥムフオルメイ ト （52 % ： 48 % v/v) の混合液で溶出し、 主画分を分取する工程、 （4 ) 前記主画分の溶 液をそのまま波長 366 腿 トランスイルミネーターで 10分間紫外線照射 し、 光異性体画分を得る工程、 （ 5 ) 前記画分の溶液の溶媒ァセ トニ ト リル分を遮光しながら減圧下留去し、 次いで得られた残渣を 50% v/v メタノ一ル溶液と し、 O D S系カラムによる液体ク口マ トグラフィ一に 力、け、 ァセ トニト リルと 50mMアンモニゥムフオルメイ ト（50 % ： 50 % v/v) の混合液で溶出し、 遮光しながら光異性体画分を各々分取するェ 程、 （ 6 ) 前記各画分の溶液の溶媒ァセ トニ ト リル分を遮光しながら減 圧下留去し、 100 %塩化メチルを加えて分液し、 有機溶媒層を得、 それ を 3回繰り返し、 集めた有機溶媒層を遮光しながを減圧下澳縮し、 化学 式 （ I ) で表されるベンゾピラン誘導体を得る工程よ りなる。 プロボ リスからべンゾピラン誘導体を抽出 ·精製する製造方法でもある。
工程 （ 2) で使用するシリカゲルは市販のものである。 特に本願には シリカゲル 75〜 150 μ m (関東化学社製） が好ましい。
工程 （ 3) 及び工程 （ 5) で使用するカラムは高速液体クロマ トダラ フィ一用であり、 逆相系カラムと しては市販の O D S系シリ力ゲル力ラ ムが使用可能であり、 特に本願にはァセ トニ ト リルで平衡化した 5— OD S— H カラム （ケムコボンド ） が好ましい。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本べンゾピラン誘導体の液体ク口マ トグラフィ一 Z質量分 析法、 イオン化法 （E S I ) の結果の図である。 第 2図は、 本べンゾピ ラン誘導体のガスクロマ トグラフィー 質量分析法、 イオン化法（E I 、 m/z ) の結果の図である。 第 3図は、 本べンゾピラン誘導体のフォ ト ダイオー ドア レー （UV測定） の結果の図である。 この図の符号 （ 1 ) は、 本べンゾピラン誘導体の吸光度 、 符号 （ 2 ) は、 本物質の光異性 体の吸光度である。 第 4図は、 本べンゾピラン誘導体の 1 H - N M R ス ベク トル（5 0 0 MH z ) の結果の図である。 第 5図は、 本べンゾピラ ン誘導体の "C - NMR スペク トル （ 1 2 5. 6 5 M H z ) の結果の 図である。 第 6図は、 本べンゾピラン誘導体の二次元 NMRスぺク ト ノレ NO E S Y ( 'H-NMR 500 MHz、 13C - NMR 125.65M H z ) の 結果の図である。 第 7図は、 本べンゾピラン誘導体の二次元 NMRスぺ ク トル HMB C ( 1 H - N M R 500 H z , 13C - N M R 125.65MHz ) の 結果の部分図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例に基づき本発明をさらに詳細に説述するために、 添付 の図面とともにこれを説明する。 なお、 下記実施例は単に説明のため のものであり、 本発明を何ら限定するものではない。
実施例 1 プロポリスよりベンゾピラン誘導体の抽出
プロポリス力 ら 2， 2—ジメチル一 8— （ 3—メチルー 2—ブテニル） ベンゾピラン一 6—シス一プロべノイ ツク酸の精製は、 次の [ステップ
1 ] 〜 [ステップ 5 ] を通して実施した。
[ステップ 1 ] プロポリ ス 2 5 0 gをミキサ一で粉砕し、 99.5 %メタ ノール 1 5 0 0 mLと混合し、 約 1 ヶ月間室温下においた。 得られた懸 濁液を減圧濾過してプロポリスのメタノール抽出液を得た。 次いで得ら れたメタノ ール抽出液の溶媒を減圧下留去した。
[ステップ 2 ] ステップ 1で得られた残渣約 1 gをメタノール溶液 と し、 シリ力ゲル 1 0 0 gに吸い込ませた後、 力ラム容量の 3倍量の 100 %塩化メチル 3 0 0 m Lを流し、 塩化メチルとメタノール （95 % ： 5 % v/v) の混合液、 次に塩化メチルとメタノール （90 % ： 10 % v/v) の混 合液での濃度勾配による傾斜溶離を行い、 薄層版にスポッ トし、 塩化メ チルとメタノール（97 % : 3 % v/v )の展開溶媒で展開し、 R f 値 0 . 3 の溶出区分を集めた。
[ステップ 3 ] ステップ 2で得られた画分の溶媒を減圧下留去し、 残渣約 2 0 m gを得た。 次いで得られた残渣を 50 %メタノール溶液と し、 得られた溶液をァセ トニ トリルで平衡化した高速液体ク口マ トダラ フィー用 O D S系シリカゲルカラム、 5—O D S— H カラム （ケムコ ポンド） に注入し、 主画分を分取した。
[ステップ 4 ] ステップ 3で得られた画分を溶媒と ともにそのまま 波長 366讓 トランスイルミネーターで 10 分間紫外線照射し、 この溶液 の溶媒ァセ トニ ト リル分を遮光しながら減圧下留去した。
[ステップ 5 ] ステップ 4で得られた残渣溶液を 50 %メタノール 溶液とし、 得られた溶液をァセ トニ トリルで平衡化した高速液体クロマ トグラフィー用 O D S系シリカゲルカラム、 5— O D S— Hカラム （ケ ムコボンド） に注入し、 遮光しながら光異性体画分を各々分取した。
[ステップ 6 ] ステップ 5で得られた各溶液のァセ トニ トリル分を 遮光しながら減圧下留去し、 塩化メチルを加えて分液し、 有機溶媒層を 得た。 それを 3回繰り返した。 集めた有機溶媒層を遮光しながら減圧下 留去し、 残渣約 1 . l m gを得た。 この残渣の理化学的性質により、 そ れが 2 , 2 —ジメチルー 8— （ 3 —メチル一 2 —ブテニル） ベンゾピラ ン一 6—シス一プロぺノィ ック酸であることを確認した。
実施例 2 ベンゾピラン誘導体の理化学的性質
2— 1 光定常反応
本べンゾピラン誘導体と光異性体物質 （日本特開平 9— 1 4 3 1 7 9 号） は、 可視光下において光異性化を起こす。 実際、 366nm トランスィ ルミネーターの UV照射により、 反応が完全に平衡に達することを確認 し、 UV、 マススぺク トル、 NMR測定等において、 光平衡と一致した。
本べンゾピラン誘導体は、 遮光下では安定である。
2 - 2 溶解性
本ベンゾピラン誘導体は、 水に不溶、 メ タノール、 エタノール 、 ァ セ トニ ト リル、 クロ口ホルム、 酢酸ェチルに可溶である。
2 - 3 マススぺク トノレ
装置 ： AP I 1 6 5 P e r k i n E l m e r
ィォン化法 ： E S I 2 9 7. 3 ( [M-H ] 一 ）
結果を図 1に示す。
2— 4 マススぺク トノレ
装置 ： JEOL J MS -AX 5 0 5 HA
イオン化法 ： E I [M] ( 70 e V)
結果を図 2に示す。
2 - 5 フォ トダイオー ドア レー （UV 測定）
装置 ： JASCO MD - 9 1 0
結果を図 3に示す。
2— 6 *H-NMR スペク トル （ 5 0 0 MHz)
装置 ： JEOL AL PHA— 5 00
サンプル ： 1. l m gZ O. 5 5 m L C D C L 3
内部標準 ： TM S 結果を図 4に示す。 また各ピークの帰属を下表に示す。
1 )
The 1 H -N M R assignments position δ H (ppm) m * J ( Hz )
3 CH = 5.58 d J = 9.8
4 CH = 6,28 d J = 9.8
5 CH = 7.33 s
7 CH = 7.33 s
9 Cih 3.23 d J = 8.0
10 CH = 5.63 m
12 CHa 1.70 bs
13 OL 1.70 bs
14 CH = 6.85 d J = 12.5
15 CH = 5.77 d J = 12.5
16 COOH not recognized
17 CHa 1.40 s
Figure imgf000010_0001
* The multiplicity of couplings is presented by the first-order .Abbreviations are s - singlet， bs - broad singlet ,d - doublet , m - multiplet
Figure imgf000010_0002
2 - 7 13C-NMR スぺク トノレ （ 1 2 5. 6 5 MHz) 装置 ： JEOL AL P HA— 5 0 0
サンプノレ ： 1. l m g ZO . 5 5 m L C D C L 3 内部標準 ： TMS
結果を図 5に示す。 また各ピークの帰属を下表に示す c (表 2 ) The 13 C - NMR assignments
position δ C (ppm)
2 76.8
3 130.5
4 122.3
4a 120.3
126.9
126.3
132.6
8 128.7
8a 152.2
9 28.0
10 122.2
11 132.3
12 17.8
13 25.7
14 146.0
15 114.8
16 168.9
17 28.2
18 28.2 — 8 二次元 NMRスぺク トル NOE S Y ( 1 H - NMR 500 M Hz 、 13C-N MR 125.65MHz )
装置 ： JEOL A L P HA— 5 0 0
サンプノレ ： 1 . l m g / 0. 5 5 m L C D C L 3
内部標準 ： TM S
結果を図 6に示す。
— 9 二次元 NMRスペク トル HMB C ( Ή-NMR 500 M H z 、 13 C -NMR 125.65MHz )
装置： JEOL A L P HA— 5 0 0
サンプル ： 1 . l mgZ 0. 5 5 m L C D C L 3
内部標準： TM S
結果を図 7に示す。
- 1 0 H P L C
装置： Toso-Tokyo C C P S
(1) カラム ： 5— O D S— H 10 X 150 (W) C / N H7 A 55 溶媒： ァセ トニ ト リル Z 5 0 mM アンモニゥムフオルメイ ト ァイ ソクラテック ： 5 0 %ァセ トニ ト リル
流速： 3 m Lノ分
保持時間 ： 2 0分
検出器： U V
波長： 2 5 4 n m
(2 ) カラム ： 5 — O D S— H 1 0 X 1 5 0 (W) C /N H 7 A 5 5
溶媒： ァセ トニ ト リル/ 5 0 mMァンモニゥムフオルメイ ト ァイ ソクラテック ： 5 2 %ァセ トニ ト リル
流速： 3 m LZ分 保持時間 ： 2 0分
検出器： U V
波長 ： 2 54 nm〜 3 70 nm
上記 （ 1 ) 〜 （ 2) の条件でそれぞれ示した保持時間に本べンゾピラン 誘導体は単一のピークを示した。
2— 1 1 フォ トダイオー ドアレー （UV測定）
装置： JASCO MD— 9 1 0
カラム ： S— C 1 8 2 5 0 mm X 4. 6 φ
溶媒： ァセ トニ ト リル Ζ 5 0 mMアンモニゥムフオルメイ ト
グラジェン ト ： 4 0%〜 6 0%ァセ トニ ト リル
流速： 1 m L/分
保持時間 ： 20分
検出器： UV
波長 ： 2 54 n m
これらのデーター解析により本発明のベンゾピラン誘導体は化学式（ 1 ) で示される 2 , 2—ジメチルー 8— （ 3—メチルー 2—ブテュル） ベン ゾピラン一 6—シス一プロぺノイ ツク酸 （分子式： C 19H 2203、 分子 量： 2 9 8. 3 ) と同定した。
実施例 3 培養腫瘍細胞に対する抗腫瘍細胞作用
実施例 1で得られた本べンゾピラン誘導体を被験物質として用いて、 以下のようにして腫瘍細胞の細胞増殖阻害を指標とした細胞毒性試験を 行った。 対数増殖期にある ト リプシン処理したヒ ト肺癌培養細胞 （HL C— 2株） を 1 X 1 05個/ m Lに調製し、 9 6穴マイクロプレー トの 各ゥエルに 0. 0 5 mLずつ播種し、 ー晚前培養した。 培養液には 1 0 %ゥシ胎児血清、 及び抗生物質を加えた L一グルタ ミ ン酸を含む MEM — α培地 （ギブコ） を用いた。 被験物質を同培養液で遮光しながら適宜 各漉度に希釈し、 0. 0 5 m Lずつ同ゥエルに添加し、 全量を 0. l m Lにした。
当該プレー トを炭酸ガスィンキュベータ—内で 3 7 、 7 2時間培養 後、 細胞増殖測定キッ ト （Cell Counting Kit, ドータイ ト） を用いて、 遮 光しながら同呈色試薬を各々 0. O l mL添加し、 3 7 炭酸ガスイ ン キュベータ一内で 1〜 2時間呈色反応した。 次いでマイクロプレー トリ ーダ—により、 波長 450 n mで吸光度測定を行った。 無処理細胞と既 知澳度の被験物質で処理した細胞との吸光度を比較して細胞の増殖阻止 率を次式に従って算出した。
(数 1 )
A - B
增殖阻止率 （％) = 1 00 X 1 00
C - B
A ： 薬剤処理細胞の吸光度
B ： 無細胞穴の吸光度
C ： 無処理細胞の吸光度 得られた増殖阻止率から、 細胞の增殖を 5 0%阻害する被験物質濃度 ( I C 5 o) を算出した。 結果を表 3に示す。 表 3から明らかなように本 ベンゾピラン誘導体は腫瘍細胞に対し、 優れた增殖阻止作用を示した。 ( 表 3) 本化合物のヒ ト腫瘍細胞に対する効果 試験ヒ ト腫瘍細胞 I C 50 ( μ g / m L
H L C— 2株 1 8 本発明のベンゾピラン誘導体、 2， 2—ジメチルー 8— （ 3—メチル 一 2—ブテュル） ベンゾピラン一 6—シス一プロべノイ ツク酸は、 抗腫 瘍活性を示し、 抗腫瘍剤と して使用できる。 また安全性が高く副作用の 少ない抗腫瘍剤と して期待できる。 産業上の利用可能性
本発明のベンゾピラン誘導体、 2 , 2—ジメチルー 8— （ 3—メチル — 2—ブテュル） ベンゾピラン一 6—シス—プロぺノイツク酸は、 実施 例 3に示すよ うに腫瘍細胞に対して抗腫瘍細胞作用を有するので、 様々 な態様で投与することによ り極めて有効な抗腫瘍細胞効果を示すと考え られる。 本化合物を投与するための方法は非経口投与、 または経口投与 が考えられ、 投与される組成物には治療上有効量の本化合物と薬学上許 容される希釈剤、 安定剤、 賦形剤等が含有される。 投与形態と しては、 静脈内注射、 皮下注射、 筋肉注射、 座薬、 軟膏等の非経口投与法、 錠剤、 散剤、 カプセル剤、 顆粒剤等による経口投与法が挙げられる。
現時点では本べンゾピラン誘導体、 2， 2—ジメチルー 8— （3—メ チルー 2—ブテニル） ベンゾピラン一 6—シス 一プロぺノイ ツク酸を ヒ トに投与した場合の安全性は不明である。 しかし、 プロポリスそのも の 1 0〜 1 5 g //k gをィヌ、 ラッ トおよびモルモッ トに数ケ月間経口 投与しても毒性は見られなかった （PRO PO L I S ： 2 ND e d . , Y. DONAD I EU, 1 9 8 3 ) ことより、 ベンゾピラン誘導体をヒ トに投与しても安全性は高いと考えられる。
また前述の如くプロポリス抽出物質には抗炎症、 抗潰瘍、 抗腫瘍、 マ クロファージ活性化、 癌転移抑制、 活性酸素の消去、 ウィルス增殖抑制、 育毛等の様々な作用を有することが報告されており （日本特開平 5— 2 7 1 0 3 1号、 日本特開平 5— 3 1 6 9 6 8号等）、 プロポリスより抽 出された本発明のベンゾピラン誘導体、 2， 2—ジメチル— 8— （ 3— メチルー 2 —ブテニル） ベンゾピラン一 6 —シス一プロぺノィ ック酸に もそれらの作用が期待できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 化学式 （ I ) で表されるベンゾピラン誘導体及びその塩を有効成 分と して含有してなる医薬品
化学式 （ I )
Figure imgf000017_0001
2. 化学式 （ I ) で表されるベンゾピラン誘導体及びその塩を有効成 分と して含有してなる抗腫瘍剤
3. 次の工程を経て、 プロポリ スから化学式 （ I ) で表されるベンゾ ピラン誘導体を抽出 · 精製する製造方法
( 1 ) プロポリスをミキサーで粉砕し、 メタノール抽出を行い、 メタノ ール懸濁液の不純物を除去し、 プロポリ スのメタノール抽出液を得、 次 いで得られたメタノール抽出液の溶媒を減圧下濃縮し、 プロポリ スのメ タノール抽出物とする工程、 （ 2 ) 前記メタノール抽出物をシリカゲル カラムによる吸着系カラムにかけ 100 %塩化メチルから、 塩化メチルと メ タノール （95 %： 5 % v/v )の混合液、 次に塩化メチルとメ タノール (90 %:10 % v/v )の混合液での濃度勾配による傾斜溶離を行い、 各分画 を分取する工程、 （ 3) 前記塩化メチル濃度 100%〜 95%画分、 展開 溶媒塩化メチルとメ タノ ール （95%: 5% v/v ) の溶出区分 （R f 値
0. 3) を集め、 その溶媒を滅圧下濃縮し、 次いで得られた残渣をメ タノールと蒸留水（50%: 50 % v/v )の混合液に溶解し、 得られた溶液を OD S系カラムによる液体ク口マ トグラフィ一にかけ、 ァセ トニ トリル と 50mMアンモニゥムフオルメイ ト（52 %:48 % v/v )の混合液で溶出し、 主画分を分敢する工程、 （4 ) 前記主画分の溶液をそのまま波長 366 nm トランスイルミネーターで 10 分間紫外線照射し、 光異性体面分を得る 工程、 （ 5 ) 前記面分の溶液の溶媒ァセ トニ ト リル分を遮光しながら減 圧下留去し、 次いで得られた残渣 50 % v/vメタノール溶液にし、 OD S 系カラムによる液体クロマ ト トグラフィ一にかけ、 ァセ トニ ト リルと 50mMアンモニゥムフオルメイト（50%:50% v/v ) の混合液で溶出し、 遮 光しながら光異性体画分を各々分取する工程、 （ 6 ) 前記各面分の各溶 液の溶媒ァセ トニ ト リル分を遮光しながら減圧下留去し、 100 %塩化メ チルを加えて分液し、 有機溶媒層を得、 それを 3回繰り返し、 集めた有 機溶媒層を遮光しながら減圧下濃縮し、 化学式 （ I ) で表されるベンゾ ピラン誘導体を得る工程
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