KR100618497B1

KR100618497B1 - 프로폴리스에서 퀘르세틴을 추출하는 방법

Info

Publication number: KR100618497B1
Application number: KR1020050016781A
Authority: KR
Inventors: 이기준
Original assignee: 거창군 (관리부서 : 거창군 농업기술센터); 이기준; 박희찬
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2006-08-31

Abstract

본 발명은 프로폴리스에서 퀘르세틴을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프로폴리스 에탄올 추출물을 얻는 단계; 상기 프로폴리스 에탄올 추출물에 증류수를 넣고, 클로로포름 및 부탄올을 첨가하여 부탄올 분획물을 분류하는 단계; 상기 부탄올 분획물을 230~400 mesh 크기의 실리카 겔이 충진된 칼럼에 넣은 후, 클로로포름:메탄올의 비율이 99:1로 혼합된 혼합용매에서 메탄올의 비율을 순차적으로 높여 클로로포름:메탄올의 비율이 1:1이 되도록 하여 1차 칼럼 크로마토그래피를 실시하여, 9개의 하위 분획물을 얻는 단계; 클로로포름:메탄올의 비율이 49:1인 시점에서 얻은 하위 분획물 3을 230~400 mesh 크기의 실리카 겔이 충진된 칼럼에 넣은 후, 클로로포름:메탄올의 비율이 49:1로 혼합된 혼합용매에서 메탄올의 비율을 순차적으로 높여 클로로포름:메탄올의 비율이 1:1이 되도록 하여 2차 칼럼 크로마토그래피를 실시하는 단계; 클로로포름:메탄올의 비율이 9:1인 시점에서 퀘르세틴을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

퀘르세틴, 칼럼 크로마토그래피, 프로폴리스, 플라보노이드

Description

프로폴리스에서 퀘르세틴을 추출하는 방법{Method for extracting quercetin from a propolis}

도 1은 본 발명에 의한 퀘르세틴의 IR 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도면,

도 2는 본 발명에 의한 퀘르세틴의 질량 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도면,

도 3은 본 발명에 의한 퀘르세틴의 ¹H-NMR 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도면,

도 4는 본 발명에 의한 퀘르세틴의 ¹³C-NMR 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도면,

도 5는 본 발명에 의한 퀘르세틴의 ¹³C-¹H COSY(HMQC) 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도면,

도 6은 본 발명에 의한 퀘르세틴의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도면,

도 7은 본 발명에 의한 퀘르세틴의 HMBC 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 프로폴리스에서 퀘르세틴(quercetin)을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프로폴리스로부터 칼럼 크로마토그래피 방법을 이용하여 항암능력이 있는 퀘르세틴을 추출하는 방법에 관한 것이다.

프로폴리스는 벌집에서 얻어지는 지용성 복합체로서, 꿀벌들이 벌집내에 들어있는 꿀을 보존하기 위하여 벌집의 틈새를 튼튼하게 만들기 위해 사용되는 물질로, 벌이 꽃, 잎, 봉오리 등으로부터 수집하는 왁스와 수지(resin)물질을 벌 자신의 침샘 분비물과 혼합하여 만드는 수지성, 점착성, 고무상의 물질이다.

프로폴리스는 계피나 바닐라 등을 혼합한 것과 같은 독특한 향기가 나며, 50~55 중량%의 수지 및 방향유 물질, 25~35 중량%의 밀납, 10 중량%의 정유, 5 중량%의 화분으로 이루어져 있고, 이외에도 아미노산, 유기산, 화분, 미량원소(알루미늄, 칼슘, 규소, 철, 구리, 망간, 아연, 스트론튬), 비타민, 플라보노이드, 프로비타민, 항균물질, 효소 등 다양한 성분을 5 중량% 함유하고 있다.

프로폴리스의 생리활성에 관하여는 이미 많은 연구가 진행되어 항암, 항균, 항박테리아, 항바이러스, 항염증, 항진균성, 항산화 및 알레르기성 피부염 치료에도 매우 높은 활성을 나타내고 있다. 이와 같이 프로폴리스가 다양한 생리활성을 가지는 주된 이유는, 프로폴리스의 주성분인 플라보노이드에 의한 것으로 이미 입증되어 있다.

프로폴리스에는 약 20여 종류의 플라보노이드가 함유되어 있으며, 신남산 (cinnamic acid) 및 카페인산 에스테르(caffeic acids ester)를 비롯한 많은 종류의 플라보노이드는 인체 내 백혈구나 림프사이트를 자극하여 인터페론 생성을 활성화하고, 체내 면역력을 증강시키는 동시에 항산화, 항염, 항알레르기 효과가 매우 강력한 물질로 알려져 있다.

특히, 플라보노이드의 한 종류인 퀘르세틴(quercetin)은 식품 중에 존재하는 플라보노이드 중에서 대표적인 것으로 항산화 작용을 하여 노화를 억제하고 동맥경화를 방지할 수 있는 효능을 가지고 있는 물질이다.

본 발명의 목적은 프로폴리스로 부터 칼럼 크로마토그래피 기법을 이용하여 퀘르세틴을 효율적으로 추출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 프로폴리스에서 퀘르세틴을 추출하는 방법은 프로폴리스 에탄올 추출물을 얻는 단계; 상기 프로폴리스 에탄올 추출물에 증류수를 넣고, 클로로포름 및 부탄올을 첨가하여 부탄올 분획물을 분류하는 단계; 상기 부탄올 분획물을 230~400 mesh 크기의 실리카 겔이 충진된 칼럼에 넣은 후, 클로로포름:메탄올의 비율이 99:1로 혼합된 혼합용매에서 메탄올의 비율을 순차적으로 높여 클로로포름:메탄올의 비율이 1:1이 되도록 하여 1차 칼럼 크로마토그래피를 실시하여, 9개의 하위 분획물을 얻는 단계; 클로로포름:메탄올의 비율이 49:1인 시점에서 얻은 하위 분획물 3을 230~400 mesh 크기의 실리카 겔이 충진된 칼럼에 넣은 후, 클로로포름:메탄올의 비율이 49:1로 혼합된 혼합용매에서 메탄올의 비 율을 순차적으로 높여 클로로포름:메탄올의 비율이 1:1이 되도록 하여 2차 칼럼 크로마토그래피를 실시하는 단계; 클로로포름:메탄올의 비율이 9:1인 시점에서 퀘르세틴을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기에서, 상기 프로폴리스 에탄올 추출물은 프로폴리스에 70% 에탄올 용매를 첨가하고, 상온에서 3일 간격으로 3시간씩 3회 반복 추출한 후 농축하여 얻어지는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 사용되는 프로폴리스는 경남 거창 일원에서 채취한 국내산 프로폴리스로서, 우선 상기 프로폴리스 2㎏에 70% 에탄올 용매 4ℓ를 첨가하고, 상온에서 3일 간격으로 3시간씩 3회 반복 추출한 후, 회전증발기(rotary evaporator)로 농축하여 약 300g의 프로폴리스 에탄올 추출물을 얻을 수 있었다.

상기와 같은 방법으로 얻은 상기 프로폴리스 에탄올 추출물에 증류수를 넣고 클로로포름(chloroform) 및 부탄올(butanol)을 첨가하고 분류하여, 클로로포름(CHCl₃) 분획물, 부탄올(BuOH) 분획물 및 물 분획물을 각각 얻었으며, 이중 가장 생리활성이 뛰어난 부탄올 분획물을 이용하였다.

상기 부탄올 분획물을 230~400 mesh 크기의 실리카 겔(silica gel)이 충진된 칼럼(column)에 넣은 후, 클로로포름:메탄올의 비율이 99:1로 혼합된 용매에서 상기 메탄올의 비율을 순차적으로 늘려주어, 클로로포름:메탄올의 비율이 1:1이 되도록 하여 1차 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)를 실시한다.

이때, 용출액은 250㎖씩 회수하였으며, 상기 부탄올 분획물으로 부터 9개의 하위 분획물(subfraction)을 얻을 수 있었다. 여기에서, 분획물의 분류기준은 프리코티드 티엘씨 플레이트(precoated TLC plate)를 사용하여 상승 1차원법으로 전개시킨 후, UV254㎚ 조사와, 용출액을 10% 황산으로 발색시키면서 나타나는 티엘씨 패턴(TLC pattern)에 따른 것으로서, 상기 9개의 하위 분획물(subfraction)은 분획물 1 부터 분획물 9 까지 지정되었다.

상기 9개의 하위 분획물 중에서 UV254㎚에서 활동하며, 크로마토그래피 기법에서 Rf값이 0.28인 화합물을 분리하기 위하여, 클로로포름:메탄올의 비율이 49:1인 시점에서 얻은 하위 분획물 3을 230~400 mesh 크기의 실리카 겔(silica gel)이 충진된 칼럼(column)에 넣은 후, 클로로포름:메탄올의 비율이 49:1로 혼합된 용매에서 상기 메탄올의 비율을 순차적으로 늘려주어, 클로로포름:메탄올의 비율이 1:1이 되도록 하여 2차 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)를 실시한다.

최종적으로 클로로포름:메탄올의 비율이 9:1 되는 시점에서 용리되는 노란색 분말의 퀘르세틴을 얻었으며, 상기 퀘르세틴의 순도확인은 프리코티드 티엘씨 (precoated TLC) 1차원 상승법으로 확인하였다.

상기와 같은 방법으로 얻은 퀘르세틴은 플라보놀(flavonol)골격의 C3, C5, C7, C3' 및 C4' 위치에 OH기를 가지고 있는 3',4',5,7-tetrahydroxy-flavonol 이며, 분자량은 302이다.

또한, 퀘르세틴의 분자식은 C₁₅H₁₀O₇이며 아래 화학식 1과 같다.

본 발명에 따른 추출방법으로 추출된 상기 퀘르세틴에 관해 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

실험예 1: IR 스펙트럼(spectrum) 측정

본 실험예에서 측정한 퀘르세틴의 IR 스펙트럼 측정 결과가 도 1에 도시되어 있다.

도 1에 나타난 바와 같이, 퀘르세틴은 3401cm^-1에서 하이드록실(hydroxyl)기, 1662cm^-1에서 카보닐 그룹(carbonyl group), 1611cm^-1 및 1517cm^-1에서 아로마틱(aromatic) C=C의 흡수 피크(peak)를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 질량 스펙트럼(mass spectrum) 측정

본 실험예에서 측정한 퀘르세틴의 질량 스펙트럼 측정 결과가 도 2에 도시되어 있다.

도 2에 나타난 바와 같이, 퀘르세틴은 m/z=302인 지점에서 분자 이온 피크(molecular ion peak)를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 3: ¹ H-NMR 스펙트럼(spectrum) 측정

본 실험예에서 측정한 퀘르세틴의 ¹H-NMR 스펙트럼 측정 결과가 도 3에 도시되어 있다.

도 3에 나타난 ¹H-NMR 스펙트럼의 적분비로부터 퀘르세틴의 수소수가 10개임을 확인할 수 있었다.

또한, 케미컬 쉬프트(chemical shift)값 및 결합 상수(coupling constant)값으로부터 A 고리(A-ring)의 메틴(methine)기의 메타 결합(meta coupling)이 δ6.22(1H, d, J=2.0Hz, H-6)과 δ6.44(1H, d, J=2.0Hz, H-8)에서 나타났고, B 고리(B-ring)의 H-2', H-6' 및 H-5'의 시그널(signal)이 각각 δ7.71(1H, d, J=2.2Hz, H-2'), δ7.57(1H, dd, J=8.5, 2.2Hz, H-6') 및 δ6.92(1H, d, J=8.5Hz, H-5')에서 메타(meta)와 오르토 결합(ortho coupling)을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 4: ¹³ C-NMR 스펙트럼(spectrum) 측정

본 실험예에서 측정한 퀘르세틴의 ¹³C-NMR 스펙트럼 측정 결과가 도 4에 도시되어 있다.

도 4에 나타난 바와 같이, 퀘르세틴의 ¹³C-NMR 스펙트럼에서는 총 15개의 탄소 시그널(carbon signal)이 확인되었으며, δ174.7의 피크 시그널(peak signal)은 카르보닐(carbonyl)기 임을 확인할 수 있었다.

실험예 5: ¹³ C- ¹ H COSY( HMQC ) 스펙트럼(spectrum) 측정

본 실험예에서 측정한 퀘르세틴의 ¹³C-¹H COSY(HMQC) 스펙트럼 측정 결과가 도 5에 도시되어 있으며, 이를 통해 퀘르세틴을 구성하는 각 탄소에 결합된 수소와의 상관관계(cross peak)를 확인할 수 있었다.

실험예 6: ¹ H- ¹ H COSY 스펙트럼(spectrum) 측정

본 실험예는 인접한 수소사이의 상관관계를 확인하기 위하여 실시하였으며, 본 실험예에서 측정한 퀘르세틴의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 측정 결과가 도 6에 도시되어 있다.

이를 통하여, H-2'(δ7.71), H-5'(δ6.92), H-6'(δ7.57)은 서로 상관관계가 있음을 확인할 수 있었고, H-6(δ6.22)와 H-8(δ7.57)의 상관관계 또한 확인할 수 있었다.

즉, H-2'(δ7.71)와 H-6'(δ7.57)의 수소는 서로 메타 결합(meta coupling)을 하고, H-6'(δ7.57)와 H-5'(δ6.92)의 수소는 서로 오르토 결합(ortho coupling)을 하고, H-8(δ7.57)와 H-6(δ6.22)의 수소는 서로 메타 결합(meta coupling)을 함을 확인할 수 있었다.

실시예 7: HMBC 스펙트럼(spectrum) 측정

본 실험예는 퀘르세틴의 보다 구체적인 구조동정 및 제 4차 탄소에 대한 정보를 얻기 위해 실시하였으며, 본 실험예에서 측정한 퀘르세틴의 HMBC 스펙트럼 측정 결과가 도 7에 도시되어 있다.

이를 통하여, δ120.9, δ145.7 및 δ143.9의 4차 탄소 시그널(signal)들은 각각 플라보놀(flavonol)의 B 고리(B-ring)에 위치한 C-1', 3' 및 4'의 시그널임을 알 수 있었고, δ134.6의 탄소 시그널은 C-3임을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 프로폴리스에서 퀘르세틴을 추출하는 방법에 의하면, 기존의 양파 등의 식품에서 얻을 수 있었던 항암작용 및 동맥경화 방지의 효능을 가진 퀘르세틴을 프로폴리스로부터 칼럼 크로마토그래피 기법을 이용하여 효율적으로 획득할 수 있다는 장점이 있다.

Claims

프로폴리스 에탄올 추출물을 얻는 단계;

상기 프로폴리스 에탄올 추출물에 증류수를 넣고, 클로로포름 및 부탄올을 첨가하여 부탄올 분획물을 분류하는 단계;

상기 부탄올 분획물을 230~400 mesh 크기의 실리카 겔이 충진된 칼럼에 넣은 후, 클로로포름:메탄올의 비율이 99:1로 혼합된 혼합용매에서 메탄올의 비율을 순차적으로 높여 클로로포름:메탄올의 비율이 1:1이 되도록 하여 1차 칼럼 크로마토그래피를 실시하여, 9개의 하위 분획물을 얻는 단계;

클로로포름:메탄올의 비율이 49:1인 시점에서 얻은 하위 분획물 3을 230~400 mesh 크기의 실리카 겔이 충진된 칼럼에 넣은 후, 클로로포름:메탄올의 비율이 49:1로 혼합된 혼합용매에서 메탄올의 비율을 순차적으로 높여 클로로포름:메탄올의 비율이 1:1이 되도록 하여 2차 칼럼 크로마토그래피를 실시하는 단계;

클로로포름:메탄올의 비율이 9:1인 시점에서 퀘르세틴을 얻는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로폴리스에서 퀘르세틴을 추출하는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 프로폴리스 에탄올 추출물은,

프로폴리스에 70% 에탄올 용매를 첨가하고, 상온에서 3일 간격으로 3시간씩 3회 반복 추출한 후 농축하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 프로폴리스에서 퀘르세 틴을 추출하는 방법.