CN114805382B

CN114805382B - 一种倍半萜色酮类化合物及其分离和在制备抗胰腺癌药物中的应用

Info

Publication number: CN114805382B
Application number: CN202210538607.XA
Authority: CN
Inventors: 杨军丽; 桑春艳
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2042-05-18
Also published as: CN114805382A

Abstract

本发明公开了一种倍半萜色酮类化合物的结构及分离方法，并通过细胞增殖抑制MTT实验发现，从新疆阿魏中分离出的倍半萜色酮类化合物具有很好的抗胰腺癌活性，可作为活性成分用于制备治疗胰腺癌的药物。倍半萜色酮类化合物的结构式如下：

Description

一种倍半萜色酮类化合物及其分离和在制备抗胰腺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种天然倍半萜色酮类化合物及其分离方法，同时还涉及该天然倍半萜色酮类化合物的抗胰腺癌生物活性及作为制备抗胰腺癌药物活性物质的应用，属于天然药物化学领域。

背景技术

胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）具有很高的侵袭性和致命性，是目前已知预后最差的恶性肿瘤之一。近年来，我国胰腺癌的发病率呈上升趋势，其死亡率居恶性肿瘤的前10位，5年生存率只有10%。胰腺癌患者中大约有80%-85%的患者无法手术切除或者已经发生转移，即使可以局部手术切除的患者，预后仍然很差，通过手术得到控制的患者只有10%~15%。药物治疗是胰腺癌治疗的主要手段之一，但由于耐药性和缺乏药物特异性，药物总体有效率不到20%。为了延长胰腺癌患者的生存期，迫切需要开发寻找更加安全有效的胰腺癌化疗药物。

天然产物作为药物的重要来源，在新药的发现和开发中发挥着重要的作用。60%以上的抗肿瘤药物与天然产物密切相关。虽然小分子靶向药物在癌症治疗中占主导地位。因此，寻找天然活性化合物，发现新型抗胰腺癌药物，有助于推动寻找高效抗胰腺癌药物。新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K. M. Shen）是伞形科阿魏属植物，多年生一次结果的草本，高0.5~1.5米，全株有强烈的葱蒜样臭味。根纺锤形或圆锥形，粗壮，根颈上残存有枯萎叶鞘纤维。新疆阿魏所分泌的具有特殊葱蒜样臭味的油胶树脂，被历代本草及《中华人民共和国药典》收载，具有消积、散痞、杀虫的功效，可用于治疗胃病、消化不良、虫积腹痛等疾病。

发明内容

本发明的目的是提供一种倍半萜色酮类化合物及其分离方法；

本发明的另一目的是对上述分离的倍半萜色酮类化合物的抗胰腺癌活性进行研究，以期用于制备治疗抗胰腺癌的药物。

一、倍半萜色酮类化合物的分离

本发明倍半萜色酮类化合物的分离，包括以下步骤：

（1）将干燥的新疆阿魏根用甲醇室温提取3次，每次7天，合并提取液，蒸发浓缩至无醇味，得到总提取液；

（2）将总提取物用水分散后，分别用石油醚（60~90℃）、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相；

（3）乙酸乙酯相进行硅胶色谱分离，并用石油醚-乙酸乙酯（40:1~1:1）洗脱，依次得到12个组分FA-FL。

对组分FH进行硅胶柱色谱，并用二氯甲烷-乙酸乙酯（50:1）洗脱，得到五个组分FH-1 至 FH-5；

对组分 FH-1进行硅胶柱色谱，并用石油醚-乙酸乙酯（10:1）洗脱，得到 12 个组分 FH-1-1 至 FH-1-12。

对组分FH-1-7用二氯甲烷-乙酸乙酯（60:1）洗脱，得到八个组分FH-1-7-1至FH-1-7-8；

对组分FH-1-7-5用二氯甲烷-乙酸乙酯（40:1）得到四个组分FH-1-7-5-1到 FH-1-7-5-4；

（4）对组分FH-1-7-5-1使用HPLC（C₁₈，MeOH/H₂O= 76/24，流速=4 ml/min）纯化，得到化合物1；

（5）对化合物1使用手性HPLC（Chiral CD-Ph，石油醚:乙酸乙酯=84/16，流速= 3ml/min）纯化，依次得到化合物 (+)-1、化合物 (- )-1。

通过旋光值、紫外光谱UV、圆二色光谱C、光谱IR、红外(KBr)、氢谱¹H 和碳谱¹³C、NMR高分辨质谱HRESIMS对上述分离得到的化合物(+)-1、化合物 (- )-1进行分析，其1H(400 MHz)和13C (100MHz) NMR 数据见表1，并确定其结构式如下：

化合物(+)-1和化合物 (- )-1是无色油状，分子式是C₂₄H₃₀O₅，质谱数据(m/z399.2158, [M + H]⁺399.2158) 可以推算出有5个不饱和度。3424^-1和1723.9 cm^-1处的强红外吸收表明存在羟基和羰基。1D NMR数据表明5,6,8-三取代苯环[δH7.77(d，J=8.5Hz，H-5)，6.50(dd，J=8.5,2.16Hz，H-6)，6.37(d，J=2.04Hz，H-8)和δC129.5(C-5)，110.3(C-6)，162.4(C-7)，103.6(C-8)，114.39C-9)，160.69C-10)]，以及两个三取代烯烃键[5.11(d，J=9.76Hz，H-2，H-6')和 δ_C126.1(C-2'), 129.3(C-6')]。两个H质子[δH3.14(d，J=10.5Hz，H-3)，3.14(d，J=10.52Hz，H-10') 和 δC55.0(C-3)，83.7(C-10')]。1D NMR数据也显示了24个碳信号，包括一个羰基δC 191.34(C-4)、四个甲基[δH 1.19(s，H3-13')、1.29(s，H3-12')、1.51(s，H3-14')和1.53(s，H3-15')]。

通过对2D NMR谱的综合解释，进一步阐明了化合物(+)-1和化合物 (- )-1的平面结构。对¹H-¹H COSY谱的分析表明存在四个相关体系，即CH(10’)-CH(8’)、CH(5)-CH(6)、CH(9’)-CH(1’)、CH(6’)-CH(5’)。HMBC数据在H-5/C-4/ C-7/C-9和 H-6/C-8/C-10, 和 H-8/C-6/C-10 的相关性表明A环的存在（如图1所示)，在H-3/C-/C-2'/C-2/C-1' 、H-2'/ C-4'/C-15'、H₃-15'/C-3'/C-2'/C-4'、H₃-14'/C-7'/C-8'、H-6'/C-14'/C-8'、H-4'/C-6'、H-10'/C-11'/C-8'、H₃-13'/C-10'/C-11'/C-12'和H-12'/C-13'/C-11'的相关性表明，B、C、D环的存在（如图1所示）。绝对构型的测定通过ECD计算（图2-图7）。

二、倍半萜色酮类化合物的抗胰腺癌活性

本实验用人源胰腺癌细胞SW1990细胞、CFPAC-1细胞、Capan-2细胞和PANC-1细胞，取对数生长期的SW1990细胞、CFPAC-1细胞、Capan-2细胞和PANC-1细胞，接种于96孔板（每孔1×10⁴个细胞），待细胞贴壁后，分别加入浓度范围为0.1-100 µM梯度的待测化合物，培养72 h，然后每孔加入10 µL CCK-8溶液继续培养4小时，振荡10 min，酶标仪450 nm测定吸光度值，采用MTT法检测新疆阿魏倍半萜色酮类化合物 (+)-1和 (-)-1对SW1990细胞、CFPAC-1细胞、Capan-2细胞和PANC-1细胞的增殖抑制作用（图6），根据吸光值计算细胞存活率，并计算测试化合物IC₅₀值。其中，紫杉醇（Taxol）作为阳性对照药物。

表2为化合物 (+)-1和(-)-1对胰腺癌SW1990细胞、CFPAC-1细胞、Capan-2细胞和PANC-1细胞的抑制作用。其中，化合物 (+)-1抑制SW1990细胞、CFPAC-1细胞、Capan-2细胞和PANC-1细胞的IC₅₀值为11.77±1.83 µM、6.12±0.52 µM、8.57±0.59 µM、2.24±0.83 µM，化合物(-)-1抑制SW1990细胞、CFPAC-1细胞、Capan-2细胞和PANC-1细胞的IC₅₀值为15.67±1.53 µM、19.13±2.99 µM、14.57±0.65 µM、0.70±0.47 µM；结果显示，化合物 (+)-1和(-)-1对胰腺癌SW1990细胞、CFPAC-1细胞、Capan-2细胞和PANC-1细胞都有显著的增殖抑制作用，表明化合物 (+)-1和(-)-1能够明显抑制胰腺癌细胞的增殖，具有抗胰腺癌潜在作用，具有开发胰腺癌治疗药物的潜能，可作为活性成分用于制备抗胰腺癌药物。即以新疆阿魏倍半萜色酮类化合物为活性组分，以药学或生理学可接受的辅料及常规药物制剂的制备工艺制成内服制剂或注射剂。内服制剂为散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、片剂、口服液。

附图说明

图1为化合物(+)-1、化合物(-)-1的¹H^-1H COSY（黑色加粗) 和HMBC (黑色箭头)。

图2为化合物(+)-1的绝对构型。

图 3为化合物(-)-1的ECD谱。

图 4为化合物(-)-1的CD谱。

图 5为化合物(+)-1的绝对构型。

图 6为化合物(+)-1的ECD谱。

图 7为化合物(+)-1的CD谱。

图 8为化合物 (+)-1和 (-)-1抑制胰腺癌细胞存活率。

具体实施方式

（1）将干燥的新疆阿魏根用甲醇室温提取3次，每次7天，提取液合并，蒸发浓缩至无醇味，得到总提取物；

（2）将总提取物分别用水分散溶解后分别用石油醚、二甲烷氯、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相；

（3）乙酸乙酯相（260 g）在硅胶柱上进行色谱分离，用石油醚:乙酸乙酯（石油醚:乙酸乙酯体积比依次为40:1、30:1、20:1、10:1、8:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1）进行洗脱，依次得到12个组分FA-FL；

对组分FH（61.3g）进行硅胶柱色谱，用二氯甲烷:乙酸乙酯（50:1）洗脱，依次得到五个组分 FH-1至FH-5；

对组分 FH-1（14.05 g）进行硅胶柱色谱，用石油醚:乙酸乙酯（10:1）洗脱，依次得到 12 个组分 FH-1-1 至 FH-1-12；

对组分FH-1-7（393.6 mg）用二氯甲烷:乙酸乙酯（60:1）洗脱，得到八个组分FH-1-7-1至FH-1-7-8；

对组分FH-1-7-5（67mg）用二氯甲烷:乙酸乙酯（40:1）得到四个组分FH-1-7-5-1到FH-1-7-5-4；

（4）对组分FH-1-7-5-1（24 mg）使用HPLC（C₁₈，MeOH/H₂O= 76/24，流速=4 ml/min）纯化，得到化合物1（4 mg，t_R = 65.052 min）；

（5）对化合物1使用手性HPLC（Chiral CD-Ph，石油醚:乙酸乙酯= 84/16，流速=3ml/min）纯化，依次得到化合物 (+)-1（1mg，t_R=26.180min）和化合物(-)-1（0.9mg，t_R=31.917 min)。

化合物[(±)-1]：白色油状；mp 218-221 °C; UV (CH₃CN) λmax (log ε) 204(3.131)nm, 274(2.356) nm; IR (KBr) ν_max = 3424, 2926.9, 1723.9, 1612.2,1463.6, 1272.3, 1272.3, 1111.5, 1022.5, 1000.8, 972.0, 973.7 cm⁻¹; ¹H NMR 和¹³CNMR 数据如表1; 化合物 [(±)-1]的质谱 m/z 399.2158 [M + H]⁺ (C₂₄H₃₀O₅,399.2158)。

(+)-1：白色油状；

+52.381° (c 0.1, CH₃OH); ECD (CH₃OH) λmax (Δε):207(Δε -38.385), 257 (Δε -2.98), 268 (Δε -4.96), 301 (Δε 6.35), 328 (Δε-1.44) nm。

(-)-1：白色油状；

-48.531° (c 0.1, CH₃OH); ECD (CH₃OH)λmax (Δε):208 (Δε 33.67), 249 (Δε 0.77), 271 (Δε 3.67), 300 (Δε -5.54), 327(Δε0.96) nm。

Claims

1.一种倍半萜色酮类化合物，其结构式如下：

。

2.如权利要求1所述一种倍半萜色酮类化合物的分离方法，包括以下步骤：

（2）将总提取物用水分散后，分别用60~90℃石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相；

（3）乙酸乙酯相进行硅胶色谱分离，并用石油醚-乙酸乙酯洗脱，依次得到12个组分FA-FL；

对组分FH进行硅胶柱色谱，并用二氯甲烷-乙酸乙酯洗脱，得到五个组分 FH-1 至 FH-5；

对组分 FH-1进行硅胶柱色谱，并用石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到 12 个组分 FH-1-1至 FH-1-12；

对组分FH-1-7用二氯甲烷-乙酸乙酯洗脱，得到八个组分FH-1-7-1至FH-1-7-8；

对组分FH-1-7-5用二氯甲烷-乙酸乙酯得到四个组分FH-1-7-5-1到 FH-1-7-5-4；

（4）对组分FH-1-7-5-1使用HPLC纯化，得到化合物1；HPLC纯化条件：C₁₈，MeOH/H₂O= 76/24，流速=4 ml/min；

（5）对化合物1使用手性HPLC纯化，依次得到化合物 (+)-1、化合物 (- )-1；手性HPLC纯化条件：Chiral CD-Ph，石油醚:乙酸乙酯=84/16，流速= 3 ml/min。

3.如权利要求2所述一种倍半萜色酮类化合物的分离方法，其特征在于：步骤（3）乙酸乙酯相的洗脱液石油醚-乙酸乙酯中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为40:1~1:1。

4.如权利要求2所述一种倍半萜色酮类化合物的分离方法，其特征在于：步骤（3）组分FH的洗脱液二氯甲烷-乙酸乙酯中，二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为50:1。

5.如权利要求2所述一种半萜色酮类化合物的分离方法，其特征在于：步骤（3）FH-1组分的洗脱液石油醚-乙酸乙酯中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为10:1。

6.如权利要求2所述一种倍半萜色酮类化合物的分离方法，其特征在于：步骤（3）组分FH-1-7的洗脱液二氯甲烷-乙酸乙酯中，二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为60:1。

7.如权利要求2所述一种倍半萜色酮类化合物的分离方法，其特征在于：步骤（3）组分FH-1-7-5的洗脱液二氯甲烷-乙酸乙酯中，二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为40:1。

8.如权利要求1所述倍半萜色酮类化合物在制备抗胰腺癌药物中的应用。

9.如权利要求8所述倍半萜色酮类化合物在制备抗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：以倍半萜色酮类化合物为活性组分，以药学或生理学可接受的辅料及常规药物制剂的制备工艺制成内服制剂或注射剂。

10.如权利要求9所述倍半萜色酮类化合物在制备抗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：所述内服制剂为散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、片剂、口服液。