WO1999006856A2 - Mikroskop mit adaptiver optik - Google Patents

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WO1999006856A2
WO1999006856A2 PCT/EP1998/004801 EP9804801W WO9906856A2 WO 1999006856 A2 WO1999006856 A2 WO 1999006856A2 EP 9804801 W EP9804801 W EP 9804801W WO 9906856 A2 WO9906856 A2 WO 9906856A2
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Ulrich Simon
Martin Gluch
Ralf Wolleschensky
Robert Grub
Andreas Faulstich
Martin VÖLCKER
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Carl Zeiss Jena Gmbh
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    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/06—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the phase of light

Definitions

  • the invention relates to the expansion of common microscopes to include adaptive optics in the observation and / or illumination beam path of a microscope.
  • Adaptive optics are to be understood here as optically effective assemblies for wavefront modulation.
  • the adaptive optics specifically change the phase and / or the amplitude of the light in such a way that that both a shift and shaping of the focus in the object space as well as a correction of any aberrations is brought about.
  • the possible areas of use include confocal microscopy, laser-assisted microscopy, conventional light microscopy and analytical microscopy
  • EPO 0307354 Bl, H Choffat, 1 988/1 992 "Ring arrangement made of bimorph piezo layers for the axial fine adjustment of components, eg microscope objectives" US 5, 1 42, 1 32, B MacDonald, R Hunter, A Smith, 1 990/1 992 "Adaptively Controlled Optical System for Wafer Production (Stepper)”
  • the adaptive element controls the focus and corrects aberrations.
  • the error signal for the correction is obtained from the light reflected from the wafer by interference with the original light.
  • a precise method for aberration correction is not specified DP DE 3404063 C2, A Suzuki, M Kohno, 1 984/1 993 "Curved permeable membrane in the beam path of an imaging system for correcting imaging errors, particularly the lateral focus position"
  • “Wavefront modulator” in the sense of this invention is a device for specifically influencing the phase and / or the amplitude of a light wave. Based on a reflective optical element (deformable mirror, electrostatic control or controlled by a piezo array or as a bimorph mirror) or a transmitting optical one Element (LCD or similar unit). This can be constructed continuously or segmented. In particular, the segments can be adapted to control the respective problem.
  • “Aberrations in the microscope” The aberrations of the microscope objective that occur in a defocused operating mode can be categorized in principle Correctable and uncorrectable parts. The cause of the aberrations can be divided into aberrations caused by the lens, caused by the further imaging optics of the microscope and ultimately caused by the specimen itself.
  • Controlling the wavefront modulator the wavefront modulator is controlled by a computer with the aid of suitable software.
  • the required manipulated variables have either been calculated beforehand (offline) or are calculated from measured variables (online, for example using a wavefront sensor or by measuring the Point brightness in the intermediate image).
  • the object of the invention is to achieve the axial shift of the focus in the object space without changing the distance between the lens and the object.
  • this shift is carried out on the wavefront of the beam path.
  • the axial displacement of the focus in the object corresponds to one spherical change in the wavefront, the lateral displacement of a tilt of the wavefront.
  • aberrations in the beam path are also compensated for by changing the wavefront. These manipulations are carried out in a pupil plane of the beam path.
  • the wavefront in the pupil of the lens or a plane equivalent to the pupil plane must be spherically deformed.
  • a deformation can be achieved by a wavefront modulator, namely a wavefront phase modulator.
  • FIG. 1 and 1a show a schematic imaging beam path of a light microscope with a viewed object, an objective and a tube lens for generating an intermediate image that can be viewed with eyepieces (not shown).
  • a wavefront modulator is arranged between the tube lens and the objective. The wavefront curved after the lens is corrected by the wavefront modulator by compensating the aberrations of the lens.
  • the fixed working distance from the objective front lens to the object eliminates any mechanical influence on the object by the microscope objective. It is e.g. It is only possible to take sectional pictures at different depths of the observation plane on the static, water-immersed object. Such a technique has so far failed due to the mechanical deformation of the object and its surroundings due to mechanical pressure on the specimen.
  • the fixed working distance on the microscope also offers advantages in the analytical examination of samples in the biomedical field.
  • Correction of aberrations resulting from the microtiter plate can be compensated for.
  • the microtiter plate can be optically incorporated into the beam path and the microscope objective (for example the front lens) can be integrated into the microtiter plate
  • FIG. 1 b shows an example of an embodiment of a light microscope with deformable mirrors that correct the wavefront in the direction of the tube nes.
  • a first and a second modulator arrangement are included in the image via a beam splitter between the objective and the tube socket.
  • In front of the modulator arrangements there are still optics for each Pupil adjustment provided Such arrangements will be discussed in more detail in connection with FIG. 7
  • a suitable deformation of the wavefront by the wavefront modulator also makes it possible to correct aberrations by the specimen and the sample environment. This is shown in FIG. 2.
  • the wavefront distorted by aberrations is corrected by the wavefront modulator arranged between the objective and the tube socket spherical components in the wavefront correction are not sufficient, aspherical components must be added.
  • angular actuators are sufficient for the rotationally symmetrical aberrations (all terms of the spherical aberration of higher order).
  • segmented actuators must be used
  • Fig. 4 These can either be integrated with one another in the same wavefront modulator, or two independent modulators can be used in different pupil levels. In the first case, the number of actuators is scaled quadratically with the required resolution, in the latter linearly, which means less control electronics
  • the current common phase modulators are limited in their amplitude and their maximum phase gradient that can be generated. This in turn limits the correction possibilities far from the working point of the lens.
  • Possible solution is the combination of adaptive optics with conventional glass optics. The latter serves to generate a large phase gradient or large wavefront amplitudes , the fine tuning is achieved by the adaptive optics
  • Another advantage of the method lies in the achromatic behavior of a reflection-based wavefront modulator.
  • the entire spectral range from deep UV to hm to the far IR can be phase-modulated. Chromatic aberrations are excluded (apart from absorption effects). This results in new methods of chromatic correction
  • the lighting is set sequentially to different wavelengths, with the wavefront modulator being set to the appropriate optical correction for each of the individual wavelengths.
  • a set of chromatically optimally corrected images is thus obtained which, when superimposed, gives a high-resolution white correction, which is soft when used classic glass optics cannot be achieved in this way
  • a lens with a wavefront modulator can be optimally corrected for any number of wavelengths in the optical spectrum
  • the necessary wave fronts initially have only a rotationally symmetrical character.
  • the adaptive optics In order to generate such wave fronts in the pupil of the microscope objective, the adaptive optics must have a distribution of the actuators with increasing spatial frequency towards the edge (FIG. 4), since at the edge the greatest gradient occurs in the wavefront
  • FIG. 4 shows different actuator structures, with increasing spatial frequency in FIGS. 4a to 4c and with segments in FIG. 4d for correcting astigmatism and coma, for example
  • a wavefront phase modulator can optimize the imaging of the illumination burner (or possibly the laser) into the object plane. Even with critical lighting, uniform illumination of the object space can be set.
  • 3 shows a wavefront modulator between the collector and the condenser, which are arranged downstream of an illumination burner.
  • the lighting intensity in the object plane can be spatially optimized in terms of intensity and homogeneity. In principle, such a pupil intervention is feasible.
  • oblique illumination of the object space can be achieved.
  • variable adaptation optics can be implemented, the focal lengths and imaging ratio of which can be set depending on the beam properties of the laser (s) and the fiber (s) used in order to achieve optimum fiber coupling. Arrangements based on the same principle can also be used when coupling illumination fibers to the microscope optics. Due to the speed of the modulators, time-resolved measurements and multiplexing methods can also be implemented in order to switch between one or more lasers and different fibers.
  • the transmission can be dynamically adjusted through the defining pinhole. Both the position and the diameter of the focus can be varied within wide limits.
  • the illumination laser or lasers can thus be optimally adjusted according to the respective requirements.
  • the contour of the light distribution of the focus can also be adapted to the pinhole. Not only rotationally symmetrical, but also other outlines, such as diamond-shaped or rectangular apertures, which always occur in real pinholes, can be adjusted and optimized for maximum transmission or minimal diffraction losses. Such an optimization can on the one hand be set using previously calculated parameters or regulated during operation to certain parameters to be optimized.
  • the chromatic correction can be adjusted depending on the illuminating laser used.
  • the lighting and the recording optics images can be recorded sequentially at different wavelengths, each optimally chromatically corrected.
  • Fig. 1 and Fig. L a the schematic imaging beam path of a light microscope
  • FIG. 3 shows a wavefront modulator arranged between the collector and the condenser for setting a uniform illumination of the object space
  • FIGS. 4 a to 4 c with increasing spatial frequency and in FIG. 4 d with segments
  • Fig.5 different versions of wavefront modulators, including with electrostatic (Fig.5a), piezo-controlled (Fig.5b) and bimorphic membranes (Fig.5c) as control elements
  • FIG. 5 shows various versions of wavefront modulators as are currently available.
  • transmitting modulators based on LCD as shown in FIG. 5d
  • reflective modulators with movable membranes are available, or reflective modulators with movable membranes.
  • the latter in turn can be differentiated according to the type of their control elements: electrostatic (Fig.5a), piezo-controlled (Fig.5b) and bimorph membranes (Fig.5c) as control elements.
  • electrostatic membrane mirror has advantages because of its numerous advantages.
  • Such a microfabricated monolithic membrane mirror which is shown more clearly in FIG. 6a and FIG.
  • the great advantage of the electrostatic membrane mirror lies in the fact that only a constant potential has to be applied to the actuator electrodes in order to set a parabolic shape.
  • the parabolic shape of the mirror results from constant physical control of the electrodes from the physical behavior of the membrane (constant surface force). So you can achieve a large dynamic in the manipulated variable (mirror stroke) with low dynamics in the control variable, i.e. the applied voltage.
  • FIG. 7 shows a laser scanning microscope with a short pulse laser, in particular for multi-photon excitation, which is explained in more detail below.
  • the detected signal depends on the nth power of the excitation intensity.
  • High intensities are required for stimulation. These high intensities are achieved through the use of short-pulse lasers and the subsequent diffraction-limited focusing with microscope objectives. The aim of the arrangement is therefore to make the focus as small as possible (i.e. ideal) and the pulse length as short as possible in the sample. In this way, high intensities can be achieved in the sample.
  • Nonlinear processes include multi-photon absorption, generation of the second harmonic (SSHG) and second harmonic (SHG) surfaces, time-resolved microscopy, OBIC, LIVA etc.
  • a two-photon laser scanning microscope is known from WO 91/07651, with excitation by laser pulses in the subpicosecond range at excitation wavelengths in the red or infrared range.
  • the publications EP 666473A1, WO 95/301 66, DE 441 4940 are known from WO 91/07651, with excitation by laser pulses in the subpicosecond range at excitation wavelengths in the red or infrared range.
  • AI describe suggestions in the picosecond range and above, with pulsed or continuous laser radiation
  • a method for optically exciting a sample by means of two-photon excitation is described in DE C2 4331 570
  • the utility model DE 29609850 describes the coupling of the radiation from short-pulse lasers into a microscopic beam path via optical fibers.
  • an optical arrangement is provided between the laser and the optical fiber for wavelength-dependent temporal change of the laser pulses, which consists of at least two optical elements, for example prisms or mirrors
  • the time difference of different wavelengths of the laser pulses can be adjusted by changing the distance between the optical elements
  • two-photon fluorescence microscopy basically opens up the following possibilities compared to conventional Em-photon fluorescence microscopy
  • Group Velocity Dispersion (GVD) femtosecond laser pulses have a spectral width of several nanometers.
  • the red-shifted wavelength components propagate faster through a positively dispersive medium (e.g. glass) than the blue-shifted wavelength components Reduction of the peak power or the fluorescence signal
  • a pre-chirp unit (pair of prisms, gratings or a combination of both) represents a negatively dispersive medium, i.e. blue-shifted wavelength components propagate faster than red-shifted ones. With the help of a pre-chirp unit, the group velvet dispersion can be compensated.
  • PTD Propagation Time Difference
  • phase and the amplitude of the light wave in the excitation beam path can be influenced in a targeted manner.
  • a reflective optical element e.g. deformable mirror
  • a transmitting optical element e.g. LCD
  • Wavefront distortion due to scattering and diffraction / refraction can be caused on the one hand by the optics used and on the other hand by the preparation. As with the second effect, the wavefront distortion also leads to deviations from the ideal focus. This effect can also be compensated for with a wavefront modulator (as already shown).
  • the effects GVD, PTD and wavefront distortion are compensated synchronously as a function of the depth of penetration into the specimen in order to be able to achieve short pulse lengths and an ideally small focus in the focus of the specimen, even at high depths of penetration.
  • FIG. 7 A possible construction of the device is shown by way of example in FIG. 7.
  • the radiation from a short pulse laser KPL reaches a pre-chirping unit PCU and from there via beam splitter ST1 and beam splitter ST2, ST3 to two adaptive optical elements AD1, AD2.
  • the first element AD1 (course) is used for the rough adjustment of the wavefront. This makes it possible to shift the focus in the z direction.
  • the second element AD2 (fine) compensates for the wavefront distortions and the PTD effects.
  • the laser light reaches the object via beam splitter DBS, x / y scan unit, SL, TL optics, SP mirror and OL lens.
  • the light coming from the object comes back via beam splitter DBS, lens L, pinhole PH and filter EF to a detector, here for example a photomultiplier PMT, which in turn, like PCU, AD1, and AD2, is connected to a control unit.
  • a detector here for example a photomultiplier PMT, which in turn, like PCU, AD1, and AD2, is connected to a control unit.
  • the adaptive elements AD1, AD2 and the pre-chirping unit can be set until a maximum signal is present at the PMT.
  • the beam path shown is particularly advantageous for an inverse microscope in which the observation is carried out “from below”, the advantage being that the sample remains fully accessible for any manipulations.
  • Fig. 6 already shows the basic structure of an adaptive mirror. It consists of a highly reflective membrane (e.g. silicon nitrate) and a structure with electrodes.
  • the membrane above can be deformed by targeted activation of the individual electrodes and the phase front of the laser beam can thus be influenced.
  • the deformations of the phase front which occur when the pulses pass through the system and the sample can thus be compensated for.
  • the pre-chirp unit can consist of one or more prisms or gratings or a combination of both. 8 shows possible arrangements for this, in FIG. 8a with four prisms, in FIG. 8b with four gratings and in FIG. 8c with prisms and gratings. The mode of operation will be explained in more detail using a prism compressor in FIG. 8a.
  • the spectral width of a femtosecond laser pulse is several nanometers. When the laser beam passes through the first prism, the beam is spectrally broken down into its components. Then the spectral components in the second prism pass through different glass paths. As a result, the red-shifted wavelength components are delayed compared to the blue-shifted ones.
  • the pre-chirp unit thus acts like a negatively dispersive medium and compensation of the GVD is also possible.
  • the wavefront adaptation can advantageously be detected and controlled or set in a defined manner using a wavefront sensor which is connected to the microscope beam path via a beam splitter (not shown).

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Mikroskop mit adaptiver Optik im Beobachtungsstrahlengang, wobei sich vorteilhaft zwischen Objektiv und Tubuslinse ein transmittierender Wellenfrontmodulator befindet oder ein reflektiver Wellenfrontmodulator über Strahlteiler eingekoppelt wird, sowie auf ein Mikroskop mit adaptiver Optik im Beleuchtungsstrahlengang. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Laser - Scanning - Mikroskop mit mindestens einer dem Laser im Strahlengang nachgeordneten adaptiven Optik vorteilhaft mit einer ersten adaptiven Optik zur Grob- und einer zweiten adaptiven Optike zur Feineinstellung, wobei die adaptive Optik als reflektierender Wellenfrontmodulator und der Laser als Kurzpulslaser ausgebildet sein können und weiterhin eine Kombination mit einer Prechirp - Einheit vorgesehen sein kann.

Description

Titel
Mikroskop mit adaptiver Optik
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf die Erweiterung gangiger Mikroskope um eine adaptive Optik im Beobachtungs- und/oder Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops Als adaptive Optik sind hierbei optisch wirksame Baugruppen zur Wellenfrontmodulation zu verstehen Die adaptive Optik verändert die Phase und/oder die Amplitude des Lichtes gezielt derart, daß sowohl eine Verschiebung und Formung des Fokus im Objektraum, als auch eine Korrektur von eventuellen Aberrationen bewirkt wird Die möglichen Einsatzgebiete umfassen die konfokale Mikroskopie, die lasergestutzte Mikroskopie, die konventionelle Lichtmikroskopie und die analytische Mikroskopie
Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung geht von folgenden bisherigen Veröffentlichungen aus
US 4,408,874, W Zmky, L Rosenberg, 1 981 /1 983 „Mechanisch oder pneumatisch deformierbares optisches Element zur asttgmatischen Vergroßerungseinstellung für
Abbildungssystemen in der Lithographie'
EPO 0098969 Bl , J Arnaud, 1 983/1 987 „Deformierbares optisches Element zur astigmatischen Korrektur" Die Dicke der Spiegelmembran variiert über die Flache, so daß beim Durchbiegen durch externe Kräfte die Membran eine zuvor berechnete Form annimmt
EPO 0307354 Bl , H Choffat, 1 988/1 992 „Ringanordnung aus bimorphen Pie zoschichten zur axialen Feinverstellung von Komponenten, z B Mikroskopobjektive" US 5, 1 42, 1 32, B MacDonald, R Hunter, A Smith, 1 990/1 992 „Adaptiv gesteuertes optisches System zur Waferherstellung (Stepper)" Das adaptive Element steuert den Fokus und korrigiert Aberrationen Das Fehlersignal für die Korrektur wird aus dem vom Wafer ruckreflektierten Licht durch Interferenz mit dem ursprunglichen Licht gewonnen Ein genaues Verfahren zur Aberrationskorrektur wird nicht angegeben DP DE 3404063 C2, A Suzuki, M Kohno, 1 984/1 993 „Gekrümmte durchlassige Membran im Strahlengang eines Abbildenden Systems zur Korrektur von Abbil- dungsfehlern, besonders der lateralen Fokusablage"
US 5, 504,575, R Stafford, 1 993/1 996 „Spektrometer, basierend auf räumlichem Lichtmodulator und dispersivem Element" Es werden Fasern und optische Schalter / flexiblen Spiegel verwendet, um das Licht nach Durchgang durch das dispersive Element auf den Detektor zu schalten EPO 1 67877; Bille, Heidelberg Instruments; 1 985 angemeldet: „Ophtalmoskop mit adaptivem Spiegel".
Der Beschreibung der vorliegenden Erfindung liegen folgende Begriffsbestimmungen zu- gründe:
„Wellenfrontmodulator" im Sinne dieser Erfindung eine Einrichtung zur gezielten Beeinflussung der Phase und/oder der Amplitude einer Lichtwelle. Basierend auf einem reflektierenden optischen Element (deformierbarer Spiegel, elektrostatische An- Steuerung oder durch ein Piezoarray angesteuert oder als bimorpher Spiegel) oder einem transmittierendem optischen Element (LCD oder ähnliche Einheit). Dieses kann kontinuierlich oder segmentiert aufgebaut sein. Insbesondere können die Segmente zur Ansteuerung der jeweiligen Problemstellung angepaßt werden. „Aberrationen im Mikroskop": Die bei einem defokussierten Betriebsmode auftreten- den Aberrationen des Mikroskopobjektives lassen sich kategorisieren in prinzipiell korrigierbare und nicht korrigierbare Anteile. Ursächlich können die Aberrationen eingeteilt werden in durch das Objektiv verursachte, durch die weitere Abbildungsoptik des Mikroskops verursachte und letztlich durch das Präparat selbst verursachte Aberrationen. - „Ansteuerung des Wellenfrontmodulators": die Ansteuerung des Wellenfrontmodula- tors erfolgt durch einen Rechner mit Hilfe geeigneter Software. Die erforderlichen Stellgrößen sind entweder zuvor berechnet worden (offline) oder werden aus gemessenen Größen berechnet (online, z.B. durch einen Wellenfrontsensor oder durch Vermessung der Punkthelligkeit im Zwischenbild).
Beschreibung der Erfindung
Sowohl bei der konventionellen Licht- als auch bei der lasergestützten Mikroskopie muß der Fokus des Objektivs mit hoher Präzision sowohl entlang der optischen Achse als auch lateral verschoben werden. Bei konventionellen Mikroskopen geschieht dies durch mechanische Verschiebung des Objekttisches bzw. des Objektives. Zudem sind im Falle einer Beleuchtung mittels Laserstrahlung Verschiebungen im Objektraum notwendig. Es ergibt sich damit die Notwendigkeit einer dreidimensionalen Fokusführung im Objektraum.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die axiale Verschiebung des Fokus im Objektraum ohne Veränderung des Abstandes zwischen Objektiv und Objekt zu erreichen.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, diese Verschiebung an der Wellenfront des Strahlenganges vorzunehmen. Dabei entspricht die axiale Verschiebung des Fokus im Objekt einer sphärischen Veränderung der Wellenfront, die laterale Verschiebung einer Kippung der Wellenfront. Erfindungsgemäß werden auch Aberrationen im Strahlengang durch Veränderung der Wellenfront ausgeglichen. Diese Manipulationen werden in einer Pupillenebene des Strahlenganges vorgenommen.
Um bei der konventionellen Lichtmikroskopie im Beobachtungsstrahlengang eine axiale Verschiebung des Fokus im Objektraum ohne eine Veränderung des Abstandes Objektiv zu Objekt zu erreichen, muß die Wellenfront in der Pupille des Objektivs oder einer zur Pupillenebene äquivalenten Ebene sphärisch verformt werden. Eine solche Verformung kann durch einen Wellenfrontmodulator, nämlich einen Wellenfront-Phasenmodulator, erreicht werden.
Fig.1 und Fig.1 a zeigen einen schematischen Abbildungsstrahlengang eines Lichtmikro- skopes mit einem betrachteten Objekt, einem Objektiv und einer Tubuslinse zur Erzeu- gung eines Zwischenbildes, das mit Okularen (nicht dargestellt) betrachtet werden kann. Zwischen Tubuslinse und Objektiv ist erfindungsgemäß ein Wellenfrontmodulator angeordnet. Die nach dem Objektiv gekrümmte Wellenfront wird durch den Wellenfrontmodulator korrigiert, indem die Abberrationen des Objektivs ausgeglichen werden.
Berechnungen haben gezeigt, daß bei Krümmungsradien der Wellenfront in der Pupille zwischen -3,0m und 1 ,5m der Fokus um mehr als 1 , 5mm verschoben werden kann. Dies ist abhängig vom verwendeten Objektiv; im angegebenen Fall beziehen sich die Angaben auf das Epiplan-Neofluar 20x/0.5. Verschiebungen im Bereich einiger zehn Mikrometer reichen in den meisten Fällen bereits aus. Wie die mathematischen Rechnungen weiter gezeigt haben wird das Intervall einer möglichen Fokusverschiebung mit steigender Vergrößerung des Objektives geringer. Da das Objektiv jedoch nicht für diese sphärisch verformte Wellenfront in der Eintrittspupille berechnet und konstruiert ist, sind Aberrationen durch das Objektiv bei der Defokussierung nicht zu vermeiden.
Eine solche Fokusverschiebung ohne mechanische Beeinflussung des Objektives hat mehrere Vorteile. Zum einen wird durch den festen Arbeitsabstand von Objektivfrontlinse zum Objekt jegliche mechanische Beeinflussung des Objektes durch das Mikroskopobjektiv eliminiert. Es wird damit z.B. erst möglich am statischen, wasserimmergierten Objekt schnittweise Bildaufnahmen mit unterschiedlicher Tiefenlage der Beobachtungsebene durchzuführen. Eine solche Technik scheiterte bisher an der mechanischen Verformung des Objektes und seiner Umgebung durch mechanischen Druck auf das Präparat.
Durch den festen Arbeitsabstand am Mikroskop ergeben sich auch Vorteile bei der analytischen Untersuchung von Proben im biomedizinischen Bereich. Bei der Verwendung von Mikrotiterplatten kann eine Korrektur von Aberrationen, die von der Mikrotiterplatte herrühren, ausgeglichen werden Die Mikrotiterplatte kann optisch in den Strahlengang einbezogen und das Mikroskopobjektiv teilweise (so z B die Front nse) in die Mikrotiterplatte integriert werden
Fig 1 b zeigt beispielhaft eine Ausfuhrung eines Lichtmikroskopes mit deformierbaren Spiegeln, die die Wellenfront in Richtung der Tubus nse korrigieren Eine erste und eine zweite Modulatoranordnung werden über einen Strahlteiler zwischen Objektiv und Tubushnse in die Abbildung einbezogen Vor den Modulatoranordnungen sind jeweils noch Op- tiken zur Pupillenanpassung vorgesehen Auf derartige Anordnungen wird noch in Verbindung mit Fig 7 naher eingegangen
Durch eine geeignete Verformung der Wellenfront durch den Wellenfrontmodulator ist auch eine Korrektur von Aberrationen durch das Präparat und die Probenumgebung mog- lieh Dies ist in Fig 2 dargestellt Hier wird die durch Abberationen verzerrte Wellenfront durch den zwischen Objektiv und Tubushnse angeordneten Wellenfrontmodulator korrigiert Dazu reichen jedoch die sphärischen Anteile in der Wellenfrontkorrektur nicht aus, es müssen asphaπsche Anteile hinzugenommen werden Für die rotationssymmetrischen Aberrationen (alle Terme der sphärischen Aberration höherer Ordnung) reichen πngformi- ge Aktuatoren aus Für die winkelabhangigen Aberrationen müssen segmentierte Aktuato- ren verwendet werden
(Fig 4) Diese können entweder miteinander im selben Wellenfrontmodulator integriert werden, oder man setzt zwei unabhängige Modulatoren in verschiedenen Pupillenebenen ein Im ersten Fall skaliert die Anzahl der Aktuatoren quadratisch mit der geforderten Auflosung, im letzteren linear, was geringeren Aufwand an Ansteuerelektronik bedeutet
Die derzeit gangigen Phasenmodulatoren sind in ihrer Amplitude und ihrem maximal erzeugbaren Phasengradienten begrenzt Dies begrenzt wiederum die Korrekturmoghchkei- ten weitab vom Arbeitspunkt des Objektives Denkbarer Ausweg ist die Kombination von adaptiver Optik mit konventioneller Glasoptik Letztere dient dabei zur Erzeugung eines großen Phasengradienten bzw großer Wellenfront-Amplituden, die Feinabstimmung wird durch die adaptive Optik erreicht
Bei einer Verschiebung zu größerem Fokusabstand tritt, bedingt durch die erforderliche konvexe Wellenfront in der Pupille, eine Vignettierung ein, die zu einer geringeren Lichtausbeute bzw einer verringerten nutzbaren Apertur fuhrt Diese Einschränkung ist konstruktionsbedingt und kann im Prinzip zukunftig bei der optischen Auslegung eines Objektivs berücksichtigt werden Bei der Verschiebung des Fokus entstehen darüber hinaus Aberrationen im Strahlengang, die zu Verzerrungen des Bildes fuhren können Zur Korrektur dieser Aberrationen können der Wellenfront wie oben angedeutet nicht-sphaπsche Anteile überlagert werden Nach mathematischen Berechnungen kann bereits mit geringen rotationssymmetrischen Antei- len der Ordnung r4 und r6 (sphärische Aberration höherer Ordnung) an der Wellenfront eine erhebliche Bildverbesserung erreicht werden (Strehlverhaltnis >98%)
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens hegt im achromatischen Verhalten eines reflektions- basierten Wellenfrontmodulators Bei geeigneter Beschichtung des Membranspiegeis kann der gesamte Spektralbereich vom tiefen UV bis hm zum fernen IR phasenmoduliert werden Chromatische Aberrationen sind (bis auf Absorptionseffekte) ausgeschlossen Daraus ergeben sich neue Verfahren der chromatischen Korrektur in der Bilderzeugung Die Beleuchtung wird dazu sequentiell auf unterschiedliche Wellenlangen eingestellt, wobei für jede der individuellen Wellenlangen der Wellenfrontmodulator auf die geeignete optische Korrektur eingestellt wird Man erhalt so einen Satz von chromatisch optimal korrigierten Bildern, die überlagert eine Weißhchtaufnahme hoher Farbkorrektur ergeben, weiche bei Verwendung klassischer Glasoptik so nicht erreicht werden kann Prinzipiell kann damit ein Objektiv mit Wellenfrontmodulator auf beliebig viele Wellenlangen im optischen Spektrum optimal korrigiert werden
Zur Verschiebung des Fokus und zur Korrektur von sphärischen Aberrationen haben die erforderlichen Wellenfronten zunächst lediglich rotationssymmetrischen Charakter Zur Erzeugung solcher Wellenfronten in der Pupille des Mikroskopobjektivs muß die adaptive Optik eine Verteilung der Aktuatoren mit zum Rand hm zunehmender Ortsfrequenz auf- weisen (Fig 4), da am Rand der größte Gradient in der Wellenfront auftritt
Fig 4 zeigt verschiedene Aktuatorstrukturen, mit zunehmender Ortsfrequenz in Fig 4a bis Fig 4c sowie mit Segmenten in Fig 4d zur Korrektur beispielsweise von Astigmatismus und Koma
Bei einer kameragestutzten Bildaufnahme tritt besonders bei hoher räumlicher Auflosung der Effekt des Pixelmismatchings auf Dabei ist das Mikroskopbild gegen die Kamera verschoben, so daß die einzelnen Bilder des Videosignals räumlich verschoben sind Dieses Problem laßt sich durch einen variablen Kippanteil in der Wellenfront des abzubildenden Signals beseitigen Durch eine geeignete Regelung können die Zitterbewegungen des Bildsignals ausgeregelt und somit ein statisches Bild erzeugt werden
Ein anderes Problem der kameragestutzten Bildaufnahme ist die Bildfeldwolbung Durch die Verwendung eines Wellenfrontmodulators im Abbildungsstrahlengang kann wahrend des Betriebes die Bildfeldwölbung auf Kosten anderer Parameter wie chromatische Korrektur verbessert werden.
Im Beleuchtungsstrahlengang lassen sich bei der konventionellen Lichtmikroskopie durch den Einbau adaptiver Optik eine flexible Auslegung der Optik, Verbesserung der optischen Eigenschaften des Mikroskops sowie neue Beleuchtungstechniken realisieren. In ähnlicher Weise wie im Beobachtungsstrahlengang kann ein Wellenfront-Phasenmodulator die Abbildung des Beleuchtungsbrenners (oder ggf. des Lasers) in die Objektebene optimieren. Ebenso kann bei kritischer Beleuchtung eine gleichmäßige Ausleuchtung des Objektrau- mes eingestellt werden. Fig.3 zeigt einen Wellenfrontmodulator zwischen Kollektor und Kondensor , die einem Beleuchtungsbrenner nachgeordnet sind.
Mit einem Wellenfront-Amplitudenmodulator kann die Beleuchtungsintensität in der Objektebene räumlich bezüglich Intensität und Homogenität optimiert werden. Prinzipiell ist so ein Pupilleneingriff machbar. Durch gezielte Veränderung des Kippanteiles der Wellenfront kann eine schiefe Beleuchtung des Objektraumes erreicht werden.
In der konfokalen Mikroskopie bzw. im Laser-Scan-Mikroskop sind durch die Verwendung von Laserlicht zur Beleuchtung die Anwendungen noch leichter realisierbar als in der klas- sischen Lichtmikroskopie.
So bietet bei der Verwendung eines Lasers in der Beleuchtung der Einsatz eines Wellenfrontmodulators bereits bei der Einkopplung in die Beleuchtungsfaser Vorteile. Hier sind variable Anpassungsoptiken realisierbar, deren Brennweiten und Abbildungsverhältnis abhängig von den Strahleigenschaften der (des) Laser(s) und der verwendeten Faser(n) einstellbar ist, um eine optimale Fasereinkopplung zu erreichen. Anordnungen auf demselben Prinzip können auch bei der Kopplung von Beleuchtungsfasern auf die Mikroskopoptik eingesetzt werden. Durch die Schnelligkeit der Modulatoren sind auch zeitaufgelöste Messungen und Multiplexverfahren realisierbar, um zwischen einem oder mehreren Lasern und verschiedenen Fasern umzuschalten.
Bei der konfokalen Abbildung kann die Transmission durch das definierende Pinhole dynamisch angepaßt werden. Sowohl Lage als auch Durchmesser des Fokus ist in weiten Grenzen variabel. Der oder die Beleuchtungslaser können so optimal gemäß der jeweiligen Anforderungen justiert werden. Weiter kann auch die Kontur der Lichtverteilung des Fokus dem Pinhole angepaßt werden. Nicht nur rotationssymmetrische, sondern auch andere Umrisse, wie rautenförmige oder rechteckige Aperturen, die in real verwirklichten Pinholes immer vorkommen, können damit angepaßt und auf maximale Transmission oder minimale Beugungsverlußte optimiert werden. Eine solche Optimierung kann einerseits sta- tisch durch zuvor berechnete Parameter eingestellt werden oder während des Betriebs auf bestimmte, zu optimierende Parameter geregelt werden.
Wie bei der klassischen Lichtmikroskopie auch läßt sich die chromatische Korrektur abhängig vom verwendeten Beleuchtungslaser einstellen. Durch die Verwendung schneller, synchron angesteuerter Wellenfrontmodulatoren in der Lasereinkopplung, der Beleuch- tungs- sowie der Aufnahmeoptik können sequentiell Bilder bei unterschiedlicher Wellenlänge, jeweils optimal chromatisch korrigiert, aufgenommen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die zugehörigen Zeichnungen zeigen in
Fig.1 und Fig. l a den schematischen Abbildungsstrahlengang eines Lichtmikroskopes
Fig.2 die Korruktur einer durch Abberationen verzerrte Wellenfront mit einem zwischen Objektiv und Tubuslinse angeordneten Wellenfrontmodulator
Fig.3 einen zwischen Kollektor und Kondensor angeordneten Wellenfrontmodulator zur Einstellung einer gleichmäßigen Ausleuchtung des Objektraumes
Fig.4 verschiedene Aktuatorstrukturen, darunter in Fig.4a bis Fig.4c mit zunehmender Ortsfrequenz und in Fig.4d mit Segmenten
Fig.5 verschiedene Ausführungen von Wellenfrontmodulatoren, darunter mit elektrostatischen (Fig.5a), piezogesteuerten (Fig.5b) und bimorphen Membranen (Fig.5c) als Stellelemente
Fig.6 Wellenfrontmodulator mit elektrostatischem Membranspiegel
Fig.7 das Prinzip eines Laser-Scanning-Mikroskops mit einem Kurzpulslaser
Fig.8 den prinzipiellen Aufbau einer Prechirp-Einheit
Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
In Fig.5 sind verschiedene Ausführungen von Wellenfrontmodulatoren dargestellt, wie sie derzeit erhältlich sind. So sind etwa transmittierende Modulatoren auf LCD-Basis, wie in Fig.5d dargestellt, verfügbar oder auch reflektierende Modulatoren mit beweglichen Membranen. Letztere wiederum können nach der Art ihrer Stellelemente unterschieden werden: elektrostatische (Fig.5a), piezogesteuerte (Fig.5b) und bimorphe Membranen (Fig.5c) als Stellelemente. Obwohl sich die Erfindung auf Wellenfrontmodulatoren allgemein bezieht, hat der elektrostatische Membranspiegel wegen seiner zahlreichen Vorteile den Vorzug. Ein solcher mikrofabrizierter monolithischer Membranspiegel, der in Fig.6a und Fig.6b deutlicher mit Membran M und Ansteuerelektroden E dargestellt ist, zeichnet sich durch hohe Ebenheit und gute optische Qualität der reflektierenden Fläche (< λ/20), geringe Baugröße (2mm bis 20mm), hysteresefreie Ansteuerung mit niedrigen Spannungen (< 1 00V), hohe mechanische Grenzfrequenz der Membran (mehrere MHz), großer Hub («l OOμm) und damit kleiner Krümmungsradius (bis herunter zu I m) und in weiten Grenzen variabler Aktuatorstruktur mit hoher räumlicher Dichte aus. Die minimale Aktuator- größe ist letztlich nur durch die Bedingung begrenzt, daß diese größer sein muß als der Abstand Elektrode zu Membran.
Der große Vorteil des elektrostatischen Membranspiegels liegt in der Tatsache, daß zur Einstellung einer parabolischen Form lediglich ein konstantes Potential an die Aktuatore- lektroden angelegt werden muß. Die parabolische Form des Spiegels ergibt sich bei konstanter Ansteuerung der Elektroden aus dem physikalischen Verhalten der Membran (kon- stante Flächenkraft). Man kann also mit geringer Dynamik in der Steuergröße, also der angelegten Spannung, eine große Dynamik in der Stellgröße (Spiegelhub) erreichen.
Fig.7 zeigt ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Kurzpulslaser, insbesondere zur Mehrphotonenanregung, das im folgenden näher erläutert wird.
Im Falle nichtlinearer Prozesse hängt das detektierte Signal von der n-ten Potenz der Anregungsintensität ab. Zur Anregung sind hohe Intensitäten nötig. Diese hohen Intensitäten erzielt man durch den Einsatz von Kurzpulslasern und die anschließende beugungs- begrenzte Fokussierung mit Mikroskopobjektiven. Ziel der Anordung ist es deshalb den Fokus möglichst klein (d.h. ideal) und die Pulslänge möglichst kurz in der Probe zu realisieren. Somit können hohe Intensitäten in der Probe erzielt werden. Nichtlineare Prozesse sind zum Beispiel die Multi-Photonen-Absorption, Generierung der Oberflächen Zweiten Harmonischen (SSHG) sowie der Zweiten Harmonischen (SHG), zeitaufgelöste Mikroskopie, OBIC, LIVA usw.
Die Erfindung nun anhand der Zwei-Photonen Mikroskopie näher erläutert werden. Dabei wird von folgendem Stand der Technik ausgegangen:
Aus WO 91 /07651 ist ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop bekannt, mit Anre- gung durch Laserpulse im Subpicosekundenbereich bei Anregungswellenlängen im roten oder infraoten Bereich. Die Veröffentlichungen EP 666473A1 , WO 95/301 66, DE 441 4940
AI beschreiben Anregungen im Picosekundenbereich und darüber, mit gepulster oder kontinuierlicher Laserstrahlung Ein Verfahren zum optischen Anregen einer Probe mittels einer Zwei- Photonen-Anregung ist in DE C2 4331 570 beschrieben
Das Gebrauchsmuster DE 29609850 beschreibt die Emkopplung der Strahlung von Kurz- pulslasern in einen mikroskopischen Strahlengang über Lichtleitfasern Hier ist zwischen Laser und Lichtleitfaser eine optische Anordnung zur wellenlangenabhangigen zeitlichen Veränderung der Laserpulse vorgesehen, die aus mindestens zwei optischen Elementen, beispielhaft Prismen oder Spiegeln, besteht Mit dieser optischen Anordnung ist der zeitliche Unterschied verschiedener Wellenlangen der Laserpulse einstellbar, indem der Ab- stand zwischen den optischen Elementen verändert wird
Bekanntermaßen eröffnet die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie gegenüber der konventionellen Em-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie grundsätzlich folgende Möglichkeiten
Realisierung einer nicht nearen Anregungswahrschemhchkeit Iih v = ^ xc mit folgenden Vorteilen 3D-Dιskπmιnιerung, d h Tiefendiskriminierung ohne Verwendung einer konfokalen Blende, Ausbleichen bzw Zerstörung der Zellen findet - wenn überhaupt - nur im Fokus statt, Verbessertes Signal- / Rauschverhaltnis, Einsatz neuer Detektionsmethoden, wie z B non-descanned detection, Die NIR-Anregung mit Femtosekunden-Lasern besitzt für die Untersuchung von bio- logischen Präparaten nachstehende Vorzuge Arbeiten im Bereich des optischen
Fensters für biologische Präparate (700-1 400 nm) wegen geringer Absorption, deshalb auch zur Untersuchung von Lebendpraparaten geeignet, niedrige Belastung der Zellen wegen geringer mittlerer Anregungsleistung, hohe Eindringtiefen infolge geringer Streuung, - Die Anregung von sogenannten UV-Farbstoffen ohne Verwendung von UV-Licht bedeutet, daß keine UV-Optiken notig sind,
Bei der Zwei-Photonen-Anregung egen breitbandige Anregungsspektren der Farbstoffe vor, daher ist die Anregung verschiedenster Farbstoffe mit nur einer Anre- gungswellenlange möglich
Beim Durchgang ultrakurzer Pulse durch ein dispersives Medium, z B Glas oder Präparat treten insbesondere folgende Effekte auf
Group Velocity Dispersion (GVD) Femtosekunden-Laseπmpulse besitzen eine spektrale Breite von mehrenen Nanometern Die rot verschobenen Wellenlangenanteile propagieren schneller durch ein positiv dispersives Medium (z B Glas) als die blau verschobenen Wellenlangenanteile Dadurch kommt es zu einer zeitliche Verbreiterung der Pulse und damit zu einer Verringerung der Peakleistung bzw des Fluoreszenzsignales Eine Prechirp-Einheit (Prismen-, Gitterpaar oder Kombination aus beiden) stellt ein negativ dispersives Medium dar, das heißt blau verschobene Wellenlängenanteile propagieren schneller als rot verschobene. Mit Hilfe einer Prechirp-Einheit kann somit die Group Veloci- ty Dispersion kompensiert werden.
Propagation Time Difference (PTD): Die Glaswege entlang des Strahlquerschnittes sind unterschiedlich (siehe Fig4). Dadurch kommt es zu einer räumlichen Vergrößerung des Fokus, wodurch eine Verringerung des Auflösungsvermögens und der Peakleistung bzw. des Fluoreszenzsignales eintritt.
Die Kompensation dieses Effektes kann mit Hilfe eines Wellenfrontmodulators, beispielsweise einem adaptiven Spiegel, erfolgen. Mit einem Modulator dieser Art kann die Phase und die Amplitude der Lichtwelle im Anregungsstrahlengang gezielt beinflußt werden. Als Modulator ist ein reflektierendes optisches Element (z.B. deformierbarer Spiegel) oder ein transmittierendes optisches Element (z.B. LCD) denkbar.
Wellenfrontdistorsion durch Streuung und Diffraktion/ Refraktion: Diese Störungen können zum einen durch die verwendeten Optiken selbst und zum anderen durch das Präparat verursacht werden. Durch die Wellenfrontdistorsion kommt es wie beim zweiten Effekt ebenfalls zu Abweichungen vom idealen Fokus. Auch dieser Effekt kann mit einem Wellenfrontmodulator (wie bereits dargestellt) kompensiert werden.
Die vorgenannten Effekte sind in der Regel abhängig von der Eindringtiefe in das Präparat. Insofern werden mit der erfindungsgemäßen Anordnung die Effekte GVD, PTD und Wellenfrontdistorsion synchron als Funktion der Eindringtiefe in das Präparat kompensiert, um im Fokus des Präparats, auch bei hohen Eindringtiefen, kurze Pulslängen und einen möglichst ideal kleinen Fokus erzielen zu können.
Ein möglicher Aufbau der Vorrichtung ist beispielhaft in Fig7 gezeigt. Die Strahlung eines Kurzpulslasers KPL gelangt in eine Prechirping-Einheit PCU und von dieser über Strahlteiler ST1 und Strahlteiler ST2, ST3 auf zwei adaptive optische Elemente AD1 , AD2. Das erste Elemente AD1 (course) wird für die Grobeinstellung der Wellenfront genutzt. Damit ist es möglich den Fokus in z-Richtung zu verschieben. Mit dem zweiten Element AD2 (fine) wer- den die Wellenfrontdistorsionen und die PTD-Effekte ausgeglichen. Das Laserlicht gelangt über Strahlteiler DBS , x/y - Scaneinheit, Optik SL, TL, Spiegel SP und das Objektiv OL auf das Objekt. Das vom Objekt kommende Licht gelangt zurück über Strahlteiler DBS , Linse L , Pinhole PH und Filter EF auf einen Detektor, hier beispielsweise ein Photomultiplier PMT, der seinerseits wie auch PCU, AD1 , und AD2 mit einer Controleinheit verbunden ist. Hierdurch kann beispielsweise die Einstellung der adaptiven Elemente AD1 , AD2 sowie der Prechirping - Einheit erfolgen, bis am PMT ein maximales Signal anliegt. Besonders vorteilhaft ist der dargestellte Strahlengang für ein inverses Mikroskop, bei dem die Beobach- tung „von unten" erfolgt, wobei der Vorteil darin besteht, daß die Probe für eventuelle Manipulationen im vollen Umfang zugänglich bleibt.
Fig.6 zeigte bereits den prinzipiellen Aufbau eines adaptiven Spiegels. Er besteht aus einer hochreflektierenden Membran (z.B. Siliziumnitrat) und aus einer Struktur mit Elektro- den. Durch eine gezielte Ansteuerung der einzelnen Elektroden kann die darüberliegende Membran deformiert werden und so die Phasenfront des Laserstrahles beeinflußt werden. Es können somit die Deformationen des Phasenfront, die beim Durchgang der Pulse durch das System und die Probe entstehen, kompensiert werden.
Die Prechirp-Einheit kann aus einem oder mehreren Prismen oder Gittern oder aus einer Kombination beider bestehen. Hierzu zeigt Fig.8 mögliche Anordnungen, so in Fig.8a mit vier Prismen, in Fig.8b mit vier Gittern und in Fig.8c mit Prismen und Gittern. Die Funktionsweise soll anhand eines Prismenkompressors in Fig.8a näher erläutert werden. Die spektrale Breite eines Femtosekunden-Laserpulses beträgt mehrere Nanometer. Beim Durchgang des Laserstrahles durch das erste Prisma wird der Strahl spektral in seine Komponenten zerlegt. Anschließend durchlaufen die spektralen Komponenten im zweiten Prisma unterschiedliche Glaswege. Dadurch werden rotverschobene Wellenlängenanteile gegenüber den blauverschobenen zeitlich verzögert. Die Prechirp-Einheit wirkt somit wie ein negativ dispersives Medium und eine Kompensation der GVD ist mit möglich.
Erst durch die Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung können die Vorteile der Anregung nichtlinearer Prozesse vollständig genutzt werden und eine Verwendung von Low-Power Femtosekunden-Lasern auch bei höheren Eindringtiefen in die Probe wird möglich. Es können somit hohe Peakleistungen bei Verwendung von geringen mittleren Anre- gungsleistungen technisch realisiert werden, so daß die Belastung der biologischen Präparate bzw. der Proben gering gehalten, ein hohes Signal-/ Rauschverhältnis und eine hohe Auflösung in axialer und lateraler Richtung erzielt werden.
Für alle beschriebenen Anordnungen kann vorteilhaft über einen Wellenfrontsensor, der über einen Strahlteiler (nicht dargestellt) mit dem Mikroskopstrahlengang in Verbindung steht, die Wellenfrontanpassung erfaßt und kontrolliert bzw. definiert eingestellt werden.

Claims

Ansprüche
1 . Mikroskop, bei dem im Beleuchtungsstrahlengang und/oder im Beobachtungsstrahlengang eine adaptive Optik vorgesehen ist.
2. Mikroskop nach Anspruch 1 , bei dem sich im Beobachtungsstrahlengang zwischen Objektiv und Tubuslinse ein transmittierender Wellenfrontmodulator befindet.
3. Mikroskop nach Anspruch 2, bei dem im Beobachtungsstrahlengang zwischen Ob- jektiv und Tubuslinse mindestens ein reflektiver Wellenfrontmodulator angeordnet ist.
4. Mikroskop nach Anspruch 3, wobei die Einkopplung des reflektiven Wellenfrontmodulators bzw. der reflektiven Wellenfrontmodulatoren über Strahlteiler vorgesehen ist.
5. Mikroskop nach Anspruch 1 , bei dem sich im Beleuchtungsstrahlengang zwischen Lichtquelle und Kondensor ein Wellenfrontmodulator befindet.
6. Mikroskop nach Anspruch 5, bei dem ein transmittierender Wellenfrontmodulator vorgesehen ist.
7. Laser - Scanning - Mikroskop, bei dem der Laserstrahlungsquelle mindestens eine adaptive Optik nachgeordnet ist.
8. Laser - Scanning - Mikroskop nach Anspruch 7, mit einer ersten adaptiven Optik zur Grobeinstellung und einer zweiten adaptiven Optik zur Feineinstellung der Wellenfront.
9. Laser - Scanning - Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 oder 8, bei dem die adaptive Optik als reflektierender Wellenfrontmodulator ausgebildet ist.
1 0. Laser - Scanning - Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 9 mit einem Kurzpulslaser als Laserstrahlungsquelle.
1 1 . Laser - Scanning - Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 10, bei dem der Laserstrahlungsquelle eine Prechirping - Einheit zur Kompensation der Group Velocity Dispersion (GVD) nachgeordnet ist.
2. Laser - Scanning - Mikroskop zur Mehrphotonenanregung mit Kurzpulslaser nach Anspruch 1 0, bei dem der Laserstrahlungsquelle eine Prechirping - Einheit sowie mindestens eine adaptive Optik nachgeordnet sind.
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