CN112442132A - 靶向肿瘤的重组双功能融合蛋白及其应用 - Google Patents

靶向肿瘤的重组双功能融合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了靶向肿瘤的重组双功能融合蛋白及其应用。具体地，本发明提供了一种重组双功能融合蛋白，其包含特异性结合靶分子CD73或TF蛋白的第一结合结构域和特异性结合靶分子TGFβ蛋白的第二结合结构域。本发明还公开了所述抗体融合蛋白的制备方法及其应用。本发明的融合蛋白通过高特异性地阻抑肿瘤微环境中的CD73‑TGFβ或TF‑TGFβ导致增强肿瘤免疫治疗的效果。本发明的融合蛋白具有很高的靶标亲和力及显著的抗肿瘤活性。

Description

靶向肿瘤的重组双功能融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其涉及靶向CD73或靶向组织因子(Tissue factor,TF)的抗体与TGFβ受体(TGFβR)的双功能蛋白，其制备方法和用途。
技术背景
目前，对于肿瘤的研究不单纯的局限于肿瘤细胞本身，肿瘤的微环境也被证明是肿瘤发生和发展的重要基础。研究发现，一些肿瘤细胞高表达的蛋白如CD73、TF、TGFβ能够影响和重塑肿瘤微环境，使之对肿瘤的发生、发展、转移及耐药等具有很重要的作用。
CD73是一种分子量为70kD的ecto-5’-核酸酶(NT5E)，被糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞表面。CD73在多种肿瘤中异常表达，包括非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌等大多数难治型肿瘤。在肿瘤微环境中，ATP/ADP在CD39/CD73的催化作用下生成大量的腺苷(Adenosine，ADO)暴露在细胞周围。肿瘤细胞诱导产生的ADO能够产生免疫抑制，促进肿瘤发生免疫逃逸(Immunological Reviews 2017；276:121-144)。主要机制表现为：1)ADO与CD4+/CD8+效应T细胞表面受体A2AR结合以后，通过cAMP信号通路抑制其增殖，扩增，从而降低了T细胞的细胞毒性；2)ADO能够干扰NK细胞与肿瘤细胞之间的黏附程度，降低NK细胞的细胞毒性；3)ADO通过激活一系列免疫抑制细胞亚群如Tregs、MDSC等促进其增殖，从而增强了肿瘤细胞周围的免疫抑制作用和抗炎功能；4)ADO能够抑制M1型巨噬细胞的分化，激活M2型巨噬细胞。此外，CD73与肿瘤细胞的生长和转移相关，也与肿瘤环境中的血管新生相关。
组织因子(Tissue factor,TF)是分子量47kD的跨膜糖蛋白，在血管受到创伤后激活外源性凝血反应。然而TF在许多肿瘤组织中异常激活表达，其中乳腺癌、胰腺癌、肺癌、食道癌中都有大于80％的异常表达率。近期研究表明，TF在肿瘤中的异常表达是肿瘤具有耐药、免疫侵润抑制和转移的重要原因。TF在肿瘤微环境中能够驱动凝血酶水平的提高，造成纤维蛋白的沉积以及凝结的形成，从而影响肿瘤的微环境，造成肿瘤纤维化作用和肿瘤基质改变(Cancer Res 2019；79:3417-3430)。这些肿瘤特异性的改变导致许多免疫细胞侵润受阻，影响肿瘤对化疗药物以及免疫治疗药物的耐药(Journal of ClinicalInvestigation 2019；129:1785-1800)。肿瘤微环境的改变还导致了诸如MDSC和TAM(肿瘤相关巨噬细胞)水平的提高，降低免疫效应细胞对肿瘤的杀伤活性。TF异常表达也能导致补体***的肿瘤杀伤作用被抑制。此外，TF通过对血管新生的促进作用能帮助肿瘤细胞转移。
TGFβ是上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal-transition,EMT)的一个关键诱导因子。同时，TGFβ在肿瘤微环境中具有很强的免疫抑制的作用，进而对肿瘤发生发展、转移和耐药有重要的调控作用。
目前，本领域关于肿瘤微环境的研究还有一些不足，迫切需要开发新的改善肿瘤微环境的治疗药物，从而降低微环境对肿瘤细胞生长、转移及耐药等方面的支撑，提高肿瘤的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向肿瘤CD73-TGFβ及TF-TGFβ的抗体融合蛋白。
具体地，本发明提供了针对肿瘤微环境的抗体及在其基础上发明的融合蛋白，包括靶向CD73的抗体，双靶向CD73与TGFβ的融合蛋白(抗CD73-TGFβR融合蛋白)，以及双靶向TF与TGFβ的融合蛋白(抗TF-TGFβR融合蛋白)。它们具有改善肿瘤微环境，增加人体自身免疫***对肿瘤的杀伤作用，抑制肿瘤增殖、转移和耐药等作用。
在本发明的第一方面，提供了一种重组双功能融合蛋白，所述重组双功能融合蛋白包含：
第一结合结构域(D1)；和
第二结合结构域(D2)；
其中，所述第一结合结构域特异性结合靶分子CD73或TF蛋白；
所述第二结合结构域特异性结合靶分子TGFβ蛋白。
在另一优选例中，所述D1为特异性结合CD73或TF蛋白的抗体或抗体片段。
在另一优选例中，所述的抗体包括：动物源抗体(如鼠源抗体)、嵌合抗体、人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗体片段包含重链可变区和轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体片段包含单链可变区片段(scFv)、双链可变区片段(dcFv)。
在另一优选例中，所述D2为特异性结合TGFβ蛋白的多肽片段，并且所述多肽片段衍生自TGFβ受体。
在另一优选例中，所述D2为TGFβ受体II的胞外区，较佳地，D2如SEQ ID NO.:33所示。
在另一优选例中，所述D1和所述D2通过连接肽相连。
在另一优选例中，D1为抗体片段，且所述连接肽为抗体恒定区序列。
在另一优选例中，D1为抗体，且所述的连接肽为(G4S)n，较佳地，(G4S)nG，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，较佳地，n＝4，更佳地，所述的连接肽如SEQ ID NO.:32所示。
在另一优选例中，D1为抗CD73单克隆抗体或抗TF单克隆抗体，并且D2通过连接肽连接在D1的选自下组的区域：重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、或其组合。
在另一优选例中，D1为抗CD73单克隆抗体或抗TF单克隆抗体，并且D2通过连接肽连接在D1的重链恒定区末端。
在另一优选例中，所述双功能融合蛋白为同源二聚体。
在另一优选例中，所述双功能融合蛋白(单体)从N端到C端具有式I所示的结构：
Figure BDA0002192980370000021
Figure BDA0002192980370000031
其中，
T1、T2、T3各自独立地为无或TGFβ受体II的胞外区，且至少一个不为无；
L1、L2、L3各自独立地为键或接头元件；
VL代表抗CD73或TF抗体的轻链可变区；
CL代表抗CD73或TF抗体的轻链恒定区；
VH代表抗CD73或TF抗体的重链可变区；
CH代表抗CD73或TF抗体的重链恒定区；
“～”代表二硫键或共价键；
“-”代表肽键；
其中，所述双功能融合蛋白具有同时结合CD73或TF以及结合TGFβ的活性。
在另一优选例中，所述的L1、L2、L3各自独立地为(G4S)4G。
在另一优选例中，所述的T2、T3、L2和L3为无。
在另一优选例中，T1为TGFβ受体II的胞外区。
在另一优选例中，所述的CH包含CH1、CH2和CH3。
在另一优选例中，所述的双功能融合蛋白的两个单体通过CH2和CH3上的二硫键形成二聚体。
在另一优选例中，所述的抗CD73抗体如本发明第二方面所述。
在另一优选例中，所述的抗TF的抗体含有：
(c)如SEQ ID NO.:37所示的抗体重链可变区；和
(d)如SEQ ID NO.:38所示的抗体轻链可变区。
在本发明的第二方面，提供了抗CD73的抗体，所述的抗体含有：
(e)抗体重链可变区；和
(f)抗体轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体还含有重链恒定区，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:9、SEQ IDNO.:10所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:12、SEQ IDNO.:13所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:15、SEQ IDNO.:16、SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18、SEQ ID NO.:19、SEQ ID NO.:20所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:24、SEQ ID NO.:25、SEQ IDNO.:26、SEQ ID NO.:27所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体还含有轻链恒定区，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:11所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:7所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:21、SEQ ID NO.:22、SEQ IDNO.:23所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:28、SEQ ID NO.:29、SEQ IDNO.:30所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体对CD73(如人CD73蛋白胞外区,CD73-ECD)的亲和力EC50为0.06-0.15nM，较佳地为0.083-0.131nM。
本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白的用途，用于(a)制备检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗CD73或TF、和/或TGFβ相关疾病的药物。
在另一优选例中，D1为特异性结合CD73的抗体或抗体片段，且所述检测试剂或试剂盒用于：
(1)检测样品中的CD73蛋白和/或TGFβ蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的CD73蛋白和/或肿瘤细胞分泌的TGFβ蛋白；和/或
(3)检测表达CD73蛋白和/或分泌TGFβ蛋白的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的检测试剂、检测板或试剂盒用于诊断CD73和/或TGFβ相关疾病。
在另一优选例中，所述的药物用于治疗或预防CD73和/或TGFβ高表达的肿瘤、肿瘤迁移、或肿瘤耐药。
在另一优选例中，所述的肿瘤耐药包括：肿瘤免疫治疗药物的耐药、肿瘤靶向治疗药物的耐药、常规肿瘤化疗的耐药，放射治疗的不敏感。
在另一优选例中，所述的药物用于选自下组的用途：
(a)抑制CD73催化腺苷一磷酸(AMP)水解生成腺苷的活性；
(b)特异结合肿瘤细胞，和/或肿瘤微环境中的免疫/基质细胞的CD73；
(c)抑制肿瘤/肿瘤微环境CD73催化AMP水解的活性；
(d)抑制肿瘤生长，提高联合用药的抗肿瘤疗效；
(e)促进免疫细胞的增殖、存活及功能，从而提高肿瘤免疫的效果；
(f)抑制TGFβ诱导的能够促进肿瘤的免疫细胞的功能；
(g)抑制TGFβ诱导产生的肿瘤微环境的免疫侵润抑制作用和纤维化等；
(h)抑制肿瘤的耐药；
(i)抑制肿瘤细胞迁移或转移。
在另一优选例中，所述CD73和/或TGFβ相关疾病选自下组：癌症、自身免疫疾病、代谢相关疾病、纤维化相关疾病、感染疾病、或其组合。
在另一优选例中，所述CD73和/或TGFβ相关的疾病包括：肿瘤的发生、生长、耐药和/或转移。
在另一优选例中，所述的癌症包括实体瘤、血液癌。
在另一优选例中，所述的癌症为CD73和/或TGFβ高表达的肿瘤。
在另一优选例中，所述的CD73和/或TGFβ高表达的肿瘤选自下组：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、***癌癌、直肠癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述的癌症为耐药性肿瘤。
在另一优选例中，所述的CD73和/或TGFβ高表达的肿瘤指肿瘤组织中CD73和/或TGFβ转录本和/或蛋白的水平L1与正常组织中转录本和/或蛋白的水平L0之比，L1/L0≥2，较佳地≥3。
在另一优选例中，所述代谢相关疾病包括：糖尿病、食源性肥胖和脂肪炎症。
在另一优选例中，所述纤维化相关疾病包括：肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、心血管纤维化、脾纤维化、骨髓纤维化和神经***纤维化。
在另一优选例中，所述感染疾病包括：细菌和病毒感染。
在另一优选例中，D1为特异性结合TF蛋白的抗体或抗体片段，且所述检测试剂或试剂盒用于：
(1)检测样品中的TF蛋白和/或TGFβ蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的TF蛋白和/或肿瘤细胞分泌的TGFβ蛋白；和/或
(3)检测表达TF蛋白和/或分泌TGFβ蛋白的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的检测试剂、检测板或试剂盒用于诊断TF和/或TGFβ相关疾病。
在另一优选例中，所述的药物用于治疗或预防TF和/或TGFβ高表达的肿瘤、肿瘤迁移、或肿瘤耐药。
在另一优选例中，所述的肿瘤耐药包括：肿瘤免疫治疗药物的耐药、肿瘤靶向治疗药物的耐药、常规肿瘤化疗的耐药，放射治疗的不敏感。
在另一优选例中，所述的药物用于选自下组的用途：
(a)抑制TF诱导的凝血酶的形成以及纤维蛋白的产生；
(b)特异结合肿瘤细胞，和/或肿瘤微环境中的免疫/基质细胞的TF；
(c)抑制肿瘤细胞表达的TF诱导的凝血酶的形成和下游的信号通路的改变，
以及造成的凝结和血栓形成；
(d)抑制肿瘤细胞迁移或转移；
(e)抑制肿瘤生长，提高联合用药的抗肿瘤疗效；
(f)促进免疫细胞的增殖、存活及功能，从而提高肿瘤免疫的效果；
(g)抑制TGFβ诱导的能够促进肿瘤的免疫细胞的功能；
(h)抑制肿瘤微环境的免疫侵润抑制作用和纤维化等；
(i)抑制肿瘤的耐药。
在另一优选例中，所述TF和/或TGFβ相关疾病选自下组：癌症、血栓类疾病、炎症性疾病、自身免疫疾病、代谢相关疾病、纤维化相关疾病、或其组合。
在另一优选例中，所述TF和/或TGFβ相关的疾病包括：肿瘤的发生、生长、耐药和/或转移。
在另一优选例中，所述的癌症为TF和/或TGFβ高表达的肿瘤。
在另一优选例中，所述的TF和/或TGFβ高表达的肿瘤选自下组：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、***癌癌、直肠癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述的TF和/或TGFβ高表达的肿瘤指肿瘤组织中TF和/或TGFβ转录本和/或蛋白的水平L1与正常组织中转录本和/或蛋白的水平L0之比，L1/L0≥2，较佳地≥3。
本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白、或本发明第二方面所述的抗体；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
本发明的第五方面，提供了一种治疗与CD73和/或TGFβ相关疾病的方法，所述方法给需要的对象施用本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白、或本发明第二方面所述的抗体、或本发明第四方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的方法还包括：给需要的对象施用其他药物或治疗方法进行联合治疗。
在在另一优选例中，所述的其他药物或治疗方法包括：抗肿瘤免疫治疗药物、肿瘤靶向药物、肿瘤化疗药物、肿瘤放射治疗。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤免疫治疗药物包括PD-1、PD-L1单抗。
本发明的第六方面，提供了一种制备抗CD73-TGFβR融合蛋白的方法，包括步骤：
(a)将本发明第二方面所述抗体或TF抗体的重链的表达载体进行双酶切，获取线性载体，再将带有相同酶切位点的Linker和TGFβRII胞外区的DNA片段***到线性载体中，获得融合蛋白重链的表达载体；
(b)将融合蛋白重链的表达载体和本发明第二方面抗体或TF抗体的轻链的表达载体一同转染动物细胞表达融合蛋白。
本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白、或本发明第二方面所述的抗体。
本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。
本发明第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白、或本发明第二方面所述的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
本发明第十一方面，提供了一种重组蛋白，该重组蛋白含有：
(a)如本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白、或本发明第二方面所述的抗体；和
(b)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
本发明的第十二方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白、或本发明第二方面所述的抗体。
本发明的第十三方面，提供了一种抑制肿瘤细胞生长和迁移的方法，包括步骤：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白、或本发明第二方面所述的抗体。
本发明的第十四方面，提供了一种对T淋巴细胞增殖保护作用的方法，包括步骤：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白、或本发明第二方面所述的抗体。
在本发明的第十五方面，提供了一种抑制肿瘤在模型动物体内生长的方法，包括步骤：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的重组双功能融合蛋白、或本发明第二方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述药物可以实施单独给药，或组合用药包括肿瘤免疫疗法、肿瘤靶向药物、细胞毒药物、放射治疗。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是选定的5个靶向人CD73鼠源单克隆抗体对人源CD73-高表达的MDA-MB-231(CD73-P)、CD73-低表达的MDA-MB-453(CD73-N)乳腺癌细胞的的结合活性(图1A)，以及纯化后5个抗体针对MDA-MB-231细胞的结合亲和力(图1B)。
图2为3个嵌合抗体mAb001c、mAb002c、mAb004c对人CD73-ECD抗原亲和力的ELISA测定的结果。
图3为3个嵌合抗体mAb001c、mAb002c、mAb004c对重组人CD73酶催化功能的抑制活性的测定。
图4为3个嵌合抗体mAb001c、mAb002c、mAb004c对乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231表面CD73抗原特异性结合活性。
图5为3个嵌合抗体mAb001c、mAb002c、mAb004c对肺肿瘤细胞NCI-H1299表面CD73抗原特异性结合活性。
图6为3个嵌合抗体mAb001c、mAb002c、mAb004c对乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231表面CD73酶催化水解AMP功能的抑制活性的测定。
图7为3个嵌合抗体mAb001c、mAb002c、mAb004c对肺肿瘤细胞NCI-H1299表面CD73酶催化水解AMP功能的抑制活性的测定。
图8是本发明的CD73(TF)抗体-TGFβR融合蛋白的结构示意图，其中，CD73抗体、TF抗体分别与TGFβ受体II胞外区通过一个(Gly4Ser)4Gly的链接子(linker)融合而成。
图9是分别由CD73抗体-TGFβR、TF抗体-TGFβR融合蛋白重链的表达载体的构建过程示意图，Linker和TGFβR胞外区DNA片段在BspQI和BamHI酶切位点之间***。
图10对抗CD73-TGFβR融合蛋白Hu001-14-TGFβR重链的表达载体质粒分别进行BspQI、BamHI单酶切，BspQI/BamHI双酶切的电泳图(图10A)；SDS-PAGE凝胶分析图(图10B)显示融合蛋白在还原和非还原状态的电泳情况。
图11对抗CD73-TGFβR融合蛋白Hu001-32-TGFβR重链的表达载体质粒分别进行BspQI、BamHI单酶切，BspQI/BamHI双酶切的电泳图(图11A)；SDS-PAGE凝胶分析图(图11B)显示融合蛋白在还原和非还原状态的电泳情况。
图12对抗CD73-TGFβR融合蛋白Hu002-3-TGFβR重链的表达载体质粒分别进行BspQI、BamHI单酶切，BspQI/BamHI双酶切的电泳图(图12A)；SDS-PAGE凝胶分析图(图12B)显示融合蛋白在还原和非还原状态的电泳情况。
图13为ELISA检测抗CD73-TGFβR融合蛋白对人CD73胞外区的亲和力。
图14为检测抗CD73-TGFβR融合蛋白对重组人CD73酶催化功能的抑制活性的测定。
图15为ELISA检测抗CD73-TGFβR融合蛋白对TGFβ1的亲和力。
图16为FACS检测抗CD73-TGFβR融合蛋白对肺肿瘤细胞NCI-H1299表面CD73抗原结合活性。
图17为FACS检测抗CD73-TGFβR融合蛋白对乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231表面CD73抗原结合活性。
图18为检测抗CD73-TGFβR融合蛋白能有效逆转AMP对人T淋巴细胞的增殖抑制作用。试验采用分选获得CD3+人T细胞，将其培养5天后统计细胞增殖率。
图19为抗CD73-TGFβR融合蛋白Hu001-14-TGFβR在体内抗肿瘤活性测试。体内试验采用NCI-H1299非小细胞肺癌细胞与50μg抗体混匀后接种至裸鼠背部皮下，每周观察2～3次。结果显示肿瘤生长曲线(上图)与试验终止时的肿瘤重量(下)。
图20为IHC检测抗CD73-TGFβR融合蛋白Hu001-14-TGFβR对NCI-H1299肿瘤中TGFβ1的抑制活性。
图21为IHC检测抗CD73-TGFβR融合蛋白Hu001c-14-TGFβR对H1299肿瘤微环境中巨噬细胞(TAM)的抑制活性。
图22为抗CD73-TGFβR融合蛋白Hu001-14-TGFβR在体内的抗肿瘤活性。NCI-H441细胞接种后第1天随机分组(n＝6)，静脉给药每周2次，剂量分别12.5mg/kg。结果显示肿瘤生长曲线(上)与试验终止时的肿瘤重量(下)。
图23为抗TF-TGFβR融合蛋白HuSC1-39-TGFβR表达载体质粒分别进行BspQI、BamHI单酶切，BspQI/BamHI双酶切的电泳图(图23A)；SDS-PAGE凝胶分析图(图23B)显示融合蛋白在还原和非还原状态的电泳情况。
图24为ELISA检测抗TF-TGFβR融合蛋白HuSC1-39-TGFβR对人TF胞外区(TF-ECD)的亲和力。
图25为ELISA检测抗TF-TGFβR融合蛋白HuSC1-39-TGFβR对TGFβ1的亲和力。
图26为FACS检测抗TF-TGFβR融合蛋白HuSC1-39-TGFβR对胰腺肿瘤细胞BxPC3表面TF抗原结合活性。
图27为FACS检测抗TF-TGFβR融合蛋白HuSC1-39-TGFβR对乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231表面TF抗原结合活性。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得了数个抗CD73单克隆抗体，其中，人-鼠嵌合抗体mAb001c、mAb002c、mAb004c能够高特异性地结合CD73抗原，ELISA测定其EC50分别为0.024nM、0.016nM、0.038nM。基于mAb001c和mAb002c设计的人源化抗体也具有优异的特性。此外，通过本发明的设计、制备，以及体外和体内验证所获得了2种新型抗体融合蛋白。抗CD73-TGFβR融合蛋白、抗TF-TGFβR融合蛋白均具有双靶标结合亲和力高、特异性强的优势，能用于进一步增强抗肿瘤免疫功能。在此基础上完成了本发明。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组双功能融合蛋白
本发明人非常意外的发现本发明构建的重组双功能融合蛋白，可以通过高特异性地阻抑肿瘤微环境中的CD73-TGFβ或TF-TGFβ导致增强肿瘤免疫治疗的效果。本发明融合蛋白中包含的CD73与TGFβ、以及TF与TGFβ具有协同作用。本发明的融合蛋白具有很高的靶标亲和力及显著的抗肿瘤活性。
本发明的重组双功能融合蛋白包含特异性结合靶分子CD73或TF蛋白的第一结合结构域和特异性结合靶分子TGFβ蛋白的第二结合结构域。
本发明的重组双功能融合蛋白可以是单个多功能多肽，或它可以是彼此共价或非共价结合的两个或更多个多肽的多聚体复合物。
本发明的任何重组双功能融合蛋白或其变体可以使用标准分子生物学技术(例如，重组DNA和蛋白质表达技术)构建，如本领域普通技术人员将知晓。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述特异性结合靶分子CD73或TF蛋白的第一结合结构域D1为抗CD73或TF抗体。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述特异性结合靶分子TGFβ蛋白的第二结合结构域D2衍生自TGFβ受体II，优选为TGFβ受体II的胞外区。
在本发明的另一个优选地实施方式中，所述重组双功能融合蛋白中，D2连接于D1的C端或N端，所述的连接方式可以是头-头相连、头-尾相连、尾-尾相连、或其组合。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述抗CD73或TF单克隆抗体包括通过二硫键连接的四条多肽链(两条重链及两条轻链)，并且D2连接在所述抗CD73或TF单克隆抗体的重链C端，优选地，重链和D2连接形成的多肽的氨基选序列如SEQ ID NO.:34、35、36、39所示；轻链的氨基选序列如SEQ ID NO.:21、29、38所示。
结合结构域
本发明的重组双功能融合蛋白包含至少两个独立的结合结构域(D1和D2)。如本文所用，表述“结合结构域”意指能够特异性结合特定目的蛋白的任何肽、多肽、核酸分子、支架型分子、肽展示分子或含多肽的构建体。
如本文所用，术语“特异性结合”等意指抗原结合结构域与以500pM或更小的解离常数(KD)为特征的特定抗原形成复合物，并且在普通测试条件下不结合其他不相关的蛋白。优选地，“不相关的蛋白”是彼此具有小于95％氨基酸同一性的蛋白质、肽或多肽。
可以在本发明上下文中使用的抗原结合结构域的示例性分类包括抗体、抗体的抗原结合部分、与特定抗原特异性相互作用的肽(例如，肽体(peptibody))、与特定抗原特异性相互作用的受体分子，包含特异性结合特定抗原的受体的配体结合部分的蛋白质、抗原结合支架、和适配体或其部分。
用于确定两个分子彼此是否特异性结合的方法是本领域熟知的并且例如包括平衡透析法、表面等离子体共振法等。
如本文所用，术语“KD”意指特定蛋白质-蛋白质相互作用(例如，抗体-抗原相互作用)的平衡解离常数。除非另外指明，否则本文中公开的KD值指通过表面等离子体共振测定法在25℃确定的KD值。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或融合蛋白可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体或融合蛋白的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
应用
本发明还提供了本发明抗体的用途，例如用于制备诊断制剂、或制备用于预防和/或治疗CD73或TF、和/或TGFβ相关的疾病的药物。所述CD73或TF、和/或TGFβ相关的疾病包括肿瘤发生、生长和/或转移、肿瘤耐药相关疾病、炎症、代谢相关疾病等。
本发明抗体、双功能融合蛋白等的用途，包括(但并不限于)：
(i)诊断、预防和/或***发生、生长和/或转移，尤其是CD73高表达的肿瘤。所述肿瘤包括(但并不限于)：乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、肺癌(如非小细胞肺癌)、胰腺癌、恶性脑胶质瘤、胃癌、肝癌、食道癌、肾癌、结直肠癌、膀胱癌、***癌、子宫内膜癌、卵巢癌、***、白血病、骨髓癌、血管肉瘤等；尤其是三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、恶性脑胶质瘤，更优选为三阴性乳腺癌和/或非小细胞肺癌。
(ii)诊断、预防和/或治疗自身免疫疾病。所述自身免疫疾病包括(但并不限于)：***性红斑狼疮、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、银屑病、多发性硬化症。
(iii)诊断、预防和/或治疗炎症。所述炎症包括(但并不限于)：风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、痛风、莱特尔综合征、牛皮癣性关节病、感染性关节炎、结核性关节炎、病毒性关节炎、真菌性关节炎、肾小球性肾炎、全身性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化。
(iv)诊断、预防和/或治代谢相关疾病。所述代谢相关疾病包括(但并不限于)：糖尿病、食源性肥胖和脂肪炎症。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有本发明的抗体或融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合CD73或TF、和/或TGFβ蛋白分子，因而可用于预防和***等疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明抗体或融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的抗体或融合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的抗体或融合蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
当用本发明的抗体或融合蛋白治疗时，可以通过本领域常规的方法进行递送。例如，它可以通过使用脂质体，水凝胶，环糊精，生物可降解的纳米胶囊，或生物粘附性微球被引入到细胞中。或者，所述核酸或载体可在本地通过直接注射或通过使用输注泵递送。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的CD73抗体能够高特异性地结合CD73抗原，ELISA测定其EC50约为0.06-0.15nM。
(2)本发明融合蛋白中包含的CD73与TGFβ、以及TF与TGFβ具有协同作用。
(3)本发明融合蛋白可以通过高特异性地阻抑肿瘤微环境中的CD73-TGFβ或TF-TGFβ导致增强肿瘤免疫治疗的效果。
(4)本发明的融合蛋白具有很高的靶标亲和力及显著的抗肿瘤活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。细胞株为常规的市售产品或购自ATCC，质粒均为市售产品。
实施例1靶向人CD73的鼠源单克隆抗体的制备和鉴定
步骤①杂交瘤细胞的制备
首先制备人CD73蛋白的胞外区(CD73-ECD)作为抗原。参照NCBI:NP_002517.1氨基酸的第27位到第547位，采用基因克隆技术和哺乳动物载体表达体系获得碳末端多组氨酸标记(C-terminus polyhistidine-tagged)的抗原，具体氨基酸序列如下(SEQ ID NO.:1)：
SEQ ID NO.:1人CD73蛋白的胞外区氨基酸序列
WELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKAHHHHHHHHH H
利用上述制备的CD73胞外区蛋白免疫Balb/c小鼠，CD73胞外区蛋白的用量为50μg/只，以制备免疫脾细胞；适时的制备鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和饲养细胞以备融合之需。
待上述三种细胞准备完毕，通过PEG介导融合免疫脾细胞和SP2/0细胞，进行杂交瘤细胞的制备，并且从中筛选效价高、形态好、呈单克隆生长的细胞继续进行亚克隆筛选，直到连续三次筛选阳性克隆率全为100％，对该细胞株进行扩大培养和建库。
将筛选出来的杂交瘤细胞扩大培养后，收集细胞培养上清并进行纯化，对纯化产物定量并进行检测。
步骤②抗体测序、互补决定区(CDR)的鉴定
经过反复筛选，对选定的5个杂交瘤单克隆抗体进行生物活性和靶向特异性的测定。如图1A所示，采用流式细胞荧光分选仪(FACS)检测单克隆细胞培液的上清，5个抗体均可以特异性的结合人源CD73-高表达的MDA-MB-231细胞(CD73-P)，而对CD73-低表达的MDA-MB-453细胞(CD73-N)无明显结合活性。随后，采用纯化后的抗体样品进行梯度稀释、FACS检测，如图1B所示，mAb001、mAb002、mAb003、mAb004、mAb005针对MDA-MB-231细胞具有优异的结合亲和力，FACS检测其EC50分别为1.24nM、0.65nM、10.7nM、4.69nM、26.07nM。
基于优异的特异性及亲和力，优先选取mAb001、mAb002、mAb004进行抗体测序鉴定。设计引物通过常规PCR技术扩增重链(VH)、轻链(VL)可变区片段，克隆入载体，测序。采用常规测序并通过Kabat数据库分析，得到以下重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)氨基酸序列、互补决定区(CDR)信息(下划线“__”所示为CDR-1/2/3氨基酸序列)。
SEQ ID NO.:2mAb001重链可变区(VH)氨基酸序列
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGKSTLTADKSSSTAFMQLSSLTSEDSAVYFCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:3mAb002重链可变区(VH)氨基酸序列
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.:4mAb004重链可变区(VH)氨基酸序列
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
SEQ ID NO.:5mAb001轻链可变区(VL)氨基酸序列
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGNTSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
SEQ ID NO.:6mAb002轻链可变区(VL)氨基酸序列
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVDGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
SEQ ID NO.:7mAb004轻链可变区(VL)氨基酸序列
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYGATNLAEGVPSRFSGSGLGTQYSLKISSLQSEDFGSYYCQHFWGIPWTFGGGTKLEIK
实施例2人-鼠嵌合CD73抗体的制备和检测
步骤①人-鼠嵌合抗体的制备、嵌合抗体的点突变
通过基因重组技术将3组可变区序列(参见SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:3、SEQ IDNO.:4、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7)克隆入含有人IgG1重链恒定区和Kappa链恒定区的载体，经测序无误后，利用转染技术和哺乳动物表达***(FreeStyleTM293T细胞)将构建的嵌合型抗体表达和纯化，所获得的人-鼠嵌合型抗体，分别编号为mAb001c、mAb002c、mAb004c。
所述抗体的的可变区序列含有数个不利氨基酸，对其进行了点突变改造。以下列出经点突变后的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的氨基酸序列(“__”所示为CDR氨基酸序列)。
SEQ ID NO.:8mAb001-VL-SGS
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGSGSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
SEQ ID NO.:9mAb002-VH-QG
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.:10mAb002-VH-NA
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNARSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.:11mAb002-VL-SG
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVSGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
SEQ ID NO.:12mAb004-VH-QG
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNQGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
SEQ ID NO.:13mAb004-VH-NA
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
以上述点突变模板匹配获得点突变(PTM)克隆到hIgG1载体获得点突变的相应嵌合抗体突变体。
综上所述的人-鼠嵌合抗体和所述抗体突变体的编号、所述抗体的重链和轻链编号由表-1汇总列出。
表-1：人-鼠嵌合抗体及其突变体
Figure BDA0002192980370000161
Figure BDA0002192980370000171
步骤②嵌合抗体对人CD73抗原亲和力的ELISA测定
用包被液将CD73蛋白胞外区(CD73-ECD)稀释成1μg/mL，包被ELISA板，100μL/孔，4℃，过夜。洗去多余抗原，用1％BSA于室温封闭2h，然后加入3倍梯度稀释的各单克隆抗体，100μL/孔，室温孵育1h；洗去未结合的抗体，加入合适浓度辣根过氧化物酶标记的抗鼠的二抗，100μL/孔，室温孵育0.5h。洗去未结合的二抗，加入TMB显色液反应大约15min，加入1NHCL，50μL/孔，终止显色反应，然后在450nm处测定其吸光度，并分析数据。
检测结果如图2所示，mAb001c、mAb002c、mAb004c对CD73-ECD有很强的亲和性，EC50分别0.024nM、0.016nM、0.038nM。
步骤③嵌合抗体对重组人CD73酶催化功能的抑制活性的测定
用抗原稀释液将人重组CD73酶(CD73胞外区)稀释成0.1μg/mL，均匀铺到96孔低吸附培养板中，25μL/孔。将50μL按照3倍梯度从2nM稀释到0.0009nM的CD73抗体加入培养板中，混匀(终浓度为1nM～0.00045nM),37℃孵育1h后，加入25μL含有1.2mM AMP和0.4mM ATP的混合液，37℃孵育1h。取出上述反应液50μL加入另一96孔白板中，向每孔加入50μLCellTiter-Glo试剂，混匀避光反应3-5min，采用酶标仪检测荧光信号强度。
检测结果如图3所示，mAb001c、mAb002c、mAb004c均具有显著抑制重组CD73蛋白酶水解AMP的活性，其IC50分别为0.025nM、0.031nM、0.039nM。
步骤④嵌合抗体对肿瘤细胞表面CD73的结合亲和力
采用CD73-高表达的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、非小细胞肺癌细胞NCI-H1299作为靶细胞，将100μL按照3倍梯度从200nM稀释到0.091nM的受试抗体作为一抗，分别与悬浮于100μLRPMI-1640无血清培养基中的1x105个MDA-MB-231混匀，或将100μL按照3倍梯度从100nM稀释到0.046nM的mAb001c、mAb002c、mAb004c作为一抗与悬浮于100μL RPMI-1640无血清培养基中的1x105个NCI-H1299细胞混匀，然后于4℃孵育1h，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的一抗，再将靶细胞与200μL，2μg/mL，PE标记的二抗4℃孵育30min，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的二抗，最后将细胞重悬在200μL PBS中，通过流式细胞仪测定受试抗体对相应细胞表面CD73的结合亲和力(Binding affinity)。
检测结果如图4所示，mAb001c、mAb002c、mAb004c对MDA-MB-231具有优异的结合亲和力，EC50分别为0.71nM、0.36nM、2.5nM；
检测结果如图5所示，mAb001c、mAb002c、mAb004c对NCI-H1299具有同样优异的结合亲和力，EC50分别为1.0nM、0.39nM、2.2nM；
综上结果说明，本实施例单克隆抗体能够以人源肿瘤细胞的CD73为作用靶点。
步骤⑤嵌合抗体对肿瘤细胞表面CD73酶催化功能的抑制
采用CD73-高表达的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、非小细胞肺癌细胞NCI-H1299作为靶细胞。铺合适数量的肿瘤细胞(经预实验确认)于96孔板中，37℃培养16小时之后，用无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞3次，将50μL按照3倍梯度从200nM稀释到0.091nM的受试抗体加入96孔板中，37℃孵育30min后，加入25μL的0.9mM的AMP，置37℃，5％CO2培养3h(抗体终浓度133.3nM～0.06nM)。取出上述培养上清25μL加入另一个96孔白板中，加入25μL的0.1mM ATP，混匀。向每孔加入50μL CellTiter-Glo试剂，混匀避光反应3～5min，采用酶标仪检测荧光信号强度。
检测结果如图6所示，mAb001c、mAb002c、mAb004c均能显著抑制MDA-MB-231细胞表面CD73催化水解AMP的功能，IC50分别为1.86nM、0.79nM和4.16nM。
检测结果如图7所示，mAb001c、mAb002c、mAb004c抑制NCI-H1299细胞表面CD73催化水解AMP的功能，IC50分别为0.24nM、0.19nM、0.39nM。
实施例3人源化CD73抗体的制备和检测
步骤①人源化CD73抗体的制备
在Germline数据库中收索选取与mAb001c、mAb002c非CDR区匹配最好的人源化模板，然后将抗体的CDR区移植到所选择的人源化模板上，替换人源模板的CDR区，再与IgG1恒定区重组，同时以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变。
具体地，mAb001c的人源化实施获得7个人源化重链的可变区(SEQ ID NO.:14、SEQID NO.:15、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18、SEQ ID NO.:19、SEQ ID NO.:20)，以及3个人源化轻链的可变区(SEQ ID NO.:21、SEQ ID NO.:22、SEQ ID NO.:23)。
SEQ ID NO.:14mAb001-VH_HuG.3
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:15mAb001-VH_HuG.5
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:16mAb001-VH_HuG.6
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:17mAb001-VH_HuG.7
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:18mAb001-VH_HuG.8
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:19mAb001-VH_HuG.9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:20mAb001-VH_HuG.10
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:21mAb001-VK_HuG.1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.:22mAb001-VK_HuG.2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.:23mAb001-VK_HuG.0
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
具体地，mAb002c的人源化实施获得4个人源化重链的可变区(SEQ ID NO.:24、SEQID NO.:25、SEQ ID NO.:26、SEQ ID NO.:27)以及3个人源化轻链的可变区(SEQ ID NO.:28、SEQ ID NO.:29、SEQ ID NO.:30)。
SEQ ID NO.:24mAb002-VH_HuG0
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:25mAb002-VH_HuG1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:26mAb002-VH_HuG2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:27mAb002-VH_HuG3
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVKKAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:28mAb002-VK_HuG1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKAPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.:29mAb002-VK_HuG2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.:30mAb002-VK_HuG3
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFAIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
通过基因重组技术将所设计的人源化可变区序列克隆入含有人IgG1重链恒定区和Kappa链恒定区的载体，经测序无误后，利用转染技术和哺乳动物表达***(FreeStyleTM293细胞)将构建的人源化抗体表达载体。分别组合表达这些人源化的重链及轻链，最终mAb001c-系列获得了了11个人源化抗体，mAb002c-系列获得了12个人源化抗体，各抗体相应的重链和轻链组合如表-2所示。
表-2：人源化抗体
Figure BDA0002192980370000201
步骤②人源化抗体对CD73的亲和力
将表2中的人源化抗体梯度稀释，采用ELISA法测定其对CD73蛋白的亲和力，实验方法参照实施例2。
实验结果如表-3所示,所述2组人源化抗体均对CD73蛋白具有很强的结合亲和力，EC50值为0.02nM～0.13nM。
表-3：人源化抗体对CD73亲和力的ELISA结果
Figure BDA0002192980370000211
步骤③人源化抗体对人CD73酶功能的抑制作用
将表-2中的人源化抗体进行梯度稀释，参照实施例2测定抗体对重组CD73酶活性的影响。
实验结果如表-4所示，所述2组人源化抗体均对CD73酶具有极强的抑制效果，其IC50值为0.02nM～0.3nM。
表-4：人源化抗体的CD73酶抑制活性
Figure BDA0002192980370000212
Figure BDA0002192980370000221
步骤④人源化抗体对肿瘤细胞CD73的结合活性
通过流式细胞仪测定将表2中的人源化抗体对NCI-H1299、MDA-MB-231肺癌细胞表面CD73的亲和力，实验方法参照实施例2。
试验结果如表-5所示，所述2组人源化抗体对NCI-H1299细胞表面CD73具有很高亲和活性，EC50值为0.53nM～1.65nM。
试验结果如表-6所示，所述2组人源化抗体对MDA-MB-231细胞表面CD73具有很高亲和活性，EC50值为0.21nM～0.74nM。
表-5人源化抗体对NCI-H299细胞CD73的结合活性
Figure BDA0002192980370000222
表-6人源化抗体对MDA-MB-231细胞CD73的结合活性
Figure BDA0002192980370000231
实施例4抗体-TGFβR融合蛋白的设计和构建
步骤①融合蛋白的设计
在抗体功能的基础上添加了结合TGFβ的功能，设计抗体与TGFβ受体II胞外区(简称TGFβR)的融合蛋白。如图8所示，融合蛋白由两个主要的部分组成：轻链和重链；其中轻链部分与所对应的抗体的轻链完全相同，重链部分是由抗体的重链和TGFβR由Linker连接而成。抗体重链恒定区(SEQ ID NO.:31；为了防止细胞内对Linker结合部位的剪切，末端的赖氨酸突变成丙氨酸)末端与Linker(SEQ ID NO.:32)的N端相连，然后Linker的C端连接TGFβR(SEQ ID NO.：33)(Science Translational Medicine 2018；16:1-15)。
SEQ ID NO.:31抗体重链恒定区的氨基酸序列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGA
SEQ ID NO.:32Linker的氨基酸序列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
SEQ ID NO.:33TGFβ受体II胞外区的氨基酸序列
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
步骤②融合蛋白重链表达质粒的构建
如图9所示，融合蛋白重链部分的构建在原有的人源化抗体重链表达载体(原始表达载体来自于上海睿智化学，代号为pCP)的基础上，通过在抗体Fc的DNA序列末端的BspQI酶切位点(GCTCTTC/N)和载体上原有的BamHI酶切位点(G/GATCC)，将Linker和TGFβRII胞外区的DNA序列引入到载体中。
将抗体重链的表达载体通过BspQI和BamHI进行双酶切回收，并且对合成的含有Linker和TGFβR的DNA片段利用BspQI和BamHI也进行双酶切。回收目的片段，然后利用T4DNA连接酶进行连接，转化到DH5α的感受态细胞中，涂布氨苄抗性的平板，挑取单菌落。对单菌落进行质粒提取和酶切验证，并且进行测序验证，获得序列正确的载体。
实施例5抗CD73-TGFβR融合蛋白的制备和检测
步骤①融合蛋白的制备
按照实施例4的设计，构建Hu001c-14-TGFβR的重链(SEQ ID NO.:34)、Hu001c-32-TGFβR的重链(SEQ ID NO.:35)和Hu002c-3-TGFβR的重链(SEQ ID NO.:36)。抗CD73-TGFβR融合蛋白由重链和轻链组成，其中Hu001c-14-TGFβR和Hu001c-32-TGFβR的轻链序号为SEQID NO.:21，Hu002c-3-TGFβR的轻链序号为SEQ ID NO.:29，如表-7所示。
表-7：抗CD73-TGFβR融合蛋白
Figure BDA0002192980370000241
SEQ ID NO.:34Hu001c-14-TGFβR融合蛋白重链的氨基酸序列
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*
SEQ ID NO.:35Hu001c-32-TGFβR融合蛋白重链的氨基酸序列
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*
SEQ ID NO.:36Hu002c-3-TGFβR融合蛋白重链的氨基酸序列
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*
融合蛋白重链载体构建结果如图10A、图11A、图12A所示，通过对获取的载体分别进行BspQI、BamHI单酶切以及BspQI/BamHI双酶切，确认了酶切后片段与预期的结果一致。
重链和轻链的表达载体质粒通过脂质体转染到293T细胞中进行蛋白表达。在培养皿中培养5d之后收集表达上清，然后利用蛋白A进行纯化，纯化的蛋白通过SDS-PAGE进行分析。
蛋白纯化的结果如图10A、图11A、图12B所示，对还原和非还原状态的蛋白进行SDS-PAGE分析之后发现，蛋白的电泳分子量与理论分子量基本一致，说明纯化出的蛋白是目的蛋白；利用SDS-PAGE结果分析，Hu001c-14-TGFβR、Hu001c-32-TGFβR和Hu002c-3-TGFβR的蛋白纯度分别为94.5％、96.3％、95.4％。
步骤②融合蛋白对人CD73抗原亲和力的ELISA测定
用包被液将CD73蛋白胞外区(CD73-ECD)稀释成1μg/mL，包被ELISA板，100μL/孔，4℃，过夜。洗去多余抗原，用1％BSA于室温封闭2h，然后加入3倍梯度稀释的单克隆抗体，100μL/孔，室温孵育2h；洗去未结合的抗体，加入合适浓度辣根过氧化物酶标记的抗鼠的二抗，100μL/孔，室温孵育1h。洗去未结合的二抗，加入TMB显色液反应大约10min，加入2M H2SO4，50μL/孔，终止显色反应，然后在450nm处测定其吸光度，并分析数据。
检测结果如图13所示，Hu001c-14-TGFβR、Hu001c-32-TGFβR、Hu002c-3-TGFβR对CD73-ECD有很强的亲和性，EC50分别0.09nM、0.11nM、0.06nM；
步骤③融合蛋白对重组人CD73酶催化功能的抑制活性的测定
参照实施例2的步骤③进行测定抗CD73-TGFβR融合蛋白对重组人CD73酶催化功能的抑制作用。
检测结果如图14所示，Hu001c-14-TGFβR、Hu001c-32-TGFβR、Hu002c-3-TGFβR均具有显著抑制重组CD73蛋白酶水解AMP的活性，其IC50分别为0.052nM、0.083nM、0.032nM；
步骤④ELISA检测融合蛋白对TGFβ的结合亲和力
将TGFβ1作为抗原包被在酶标板上，TGFβ1的浓度为0.5μg/mL。实验方法参考步骤②，其中一抗终浓度为27μg/mL，3倍梯度稀释。
检测结果如图15所示，Hu001c-14-TGFβR、Hu001c-32-TGFβR、Hu002c-3-TGFβR对TGFβ有很强的亲和性，EC50分别为0.4nM、0.26nM、0.55nM。
步骤⑤融合蛋白对肿瘤细胞表面CD73的特异性结合
采用CD73高表达的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、非小细胞肺癌细胞NCI-H1299，测定融合蛋白对细胞表面CD73的结合情况。采用105个肿瘤细胞与融合蛋白(一抗)混匀(终浓度12.5μg/mL,3倍梯度稀释)，然后于4℃孵育1h，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的一抗，再将靶细胞与PE标记的二抗在4℃孵育30min，PBS洗涤细胞三次以去除未结合的二抗，最后将细胞重悬在200μLPBS中，通过流式细胞荧光分选仪(FACS)检测结合率。
检测结果如图16和图17所示，Hu001c-14-TGFβR、Hu001c-32-TGFβR、Hu002c-3-TGFβR对肿瘤细胞表面的CD73有很强的亲和性，对H1299的EC50分别为1.6nM、0.9nM和1.0nM；对MDA-MB-231的EC50分别为1.5nM、1.4nM；。
实施例6抗CD73-TGFβR融合蛋白对T淋巴细胞增殖的保护作用
PBMC的复苏、扩增与分选：首先采用含有500ng/mL CD3/CD28抗体和100IU/mL IL-2的培养基将PBMC复苏培养3-4天，然后采用分选试剂盒(Stemcell,Cat#1795)分选PBMC后获得CD3阳性的T淋巴细胞。
T细胞增殖试验：将上述分选得到的T细胞进行荧光标记，将预先配好的CFSE(carboxyfluorescein succinimidylester)加入细胞悬液(终浓度2.5μM)，使其在37℃标记5min后以PBS洗涤3次。然后，将CFSE-标记的T细胞铺至96孔板中(1-2x104个细胞/孔)，每孔加入50μL按照梯度稀释的抗体和融合蛋白(终浓度10nM～0.0001nM，n＝4)，并加入50μL腺苷单磷酸(AMP，终浓度为0.25mM)，混匀，培养4-5天后收集培养上清，采用流式细胞分选仪(FACS)读取并统计固定体积的细胞数。
结果如图18显示，融合蛋白Hu001c-14-TGFβR、Hu002c-3-TGFβR对人T淋巴细胞具有显著的增殖保护作用，能有效逆转AMP对T细胞的增殖抑制，并且效果相对于Hu001c-14抗体有显著性优势。
实施例7抗CD73-TGFβR融合蛋白的体内抗肿瘤活性
步骤①抗CD73-TGFβR在裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤活性
随机将免疫缺陷型裸鼠(Balb/c,nude)分为若干组，将50μL含有9x106NCI-H1299的细胞悬液与50μL Hu001c-14-TGFβR混匀(终浓度为62.5μg/瘤)后再与100μL基质胶(BD/Corning,Cat#354248)混匀，然后将200μL细胞/抗体-基质胶混合液接种入裸鼠背部皮下(n＝6)。采用hIgG1(终浓度为50μg/瘤)为亚型匹配的阴性对照。观察抗体对皮下瘤生长的抑制作用，每周2-3次测量裸鼠体重及肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线，并最终称取肿瘤的重量，评定活性。
结果如图19所示,Hu001c-14-TGFβR能显著抑制NCI-H1299肿瘤在裸鼠体内的生长。
步骤②抗CD73-TGFβR对肿瘤组织中TGFβ1生成的抑制活性
将步骤①获取的肿瘤样本进行石蜡包埋并切片，将hIgG1组肿瘤和Hu001-14-TGFβR给药组肿瘤放在同一张石蜡切片上，对获取的切片进行IHC染色。首先进行脱蜡和水化，然后利用柠檬酸进行抗原修复，再进行封闭，TGFβ1一抗(proteintech，21898-1-AP)孵育过夜，一抗使用浓度为1：50，二抗(Jackson Immuno,Cat#111-035-003)使用浓度为1：200，最后加入DAB显色液显色之后，再利用苏木素复染，脱水封片。利用显微镜进行成像记录。将获得的IHC成像图片，利用ImageJ软件进行分析，对大约10个代表性的视野进行统计灰度值，最终统计平均值±S.E。
如图20所示，TGFβ1的表达堆积水平在hIgG1组肿瘤中要显著高于Hu001-14-TGFβR给药组。
步骤③抗CD73-TGFβR对肿瘤微环境中MII型巨噬细胞的抑制
对本实施例步骤②使用的相同的石蜡切片进行IHC染色，实验方法参照步骤②，其中CD206(MII型巨噬细胞标志物)的一抗使用浓度为1：200，F4/80(巨噬细胞共标志物)的一抗使用浓度为1：200，二抗(Jackson Immuno,Cat#111-035-003)使用浓度为1:200。
如图21所示，F480/CD206比值在hIgG1组肿瘤中要显著低于Hu001-14-TGFβR给药组，说明Hu001-14-TGFβR能够降低肿瘤微环境中的MII型巨噬细胞水平。
步骤④静脉注射抗CD73-TGFβR对肿瘤生长的抑制活性
将200μL含有5×106NCI-H441的细胞悬液接种到免疫缺陷小鼠(Balb/c,nude)背部皮下。接种当天根据裸鼠体重随机分组(n＝6),Hu001c-14-TGFβR采用12.5mg/kg剂量，每周尾静脉给药两次，共计给药4周；同时设置hIgG1作为阴性对照(10mg/kg剂量)。每周测量2-3次肿瘤体积及裸鼠体重并记录以绘制肿瘤生长曲线。
结果如图22所示，Hu001c-14-TGFβR能显著抑制NCI-H441肿瘤在裸鼠体内的生长。
实施例8抗TF-TGFβR融合蛋白的制备和检测
步骤①抗TF-TGFβR融合蛋白的制备
参照实施例4，抗TF-TGFβR融合蛋白HuSC1-39-TGFβR由重链和轻链组成。重链部分由抗TF的人源化抗体HuSC1-39与TGFβRII胞外区通过Linker组成，HuSC1-39的重链可变区为SEQ ID NO.:37。HuSC1-39-TGFβR的轻链可变区与HuSC1-39的轻链可变区(SEQ ID NO.:38)相同。HuSC1-39的重链可变区和轻链可变区引自CN201610705557.4。
如表-8所示，构建出融合蛋白HuSC1-39-TGFβR。
表-8抗TF-TGFβR融合蛋白
Figure BDA0002192980370000281
SEQ ID NO.:37抗TF抗体HuSC1-39的重链可变区氨基酸序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGMIYPADSETRLNQKFKDQATLSVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAREDYGSSDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.:38抗TF抗体HuSC1-39的轻链可变区氨基酸序列
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKSPKIWIYGISNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKSSFPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.:39HuSC1-39-TGFβR融合蛋白重链的氨基酸序列
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGMIYPADSETRLNQKFKDQATLSVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAREDYGSSDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*
融合蛋白重链载体构建结果如图23A所示，通过对获取的载体分别进行BspQI、BamHI单酶切以及BspQI/BamHI双酶切，确认酶切后片段与预期的结果一致。
融合重链和轻链的表达载体质粒通过脂质体转染到293T细胞中进行蛋白表达。在培养皿中培养5d之后收集表达上清，然后利用蛋白A进行纯化，纯化的蛋白通过SDS-PAGE进行分析。
蛋白纯化的结果如图23B所示，对还原和非还原状态的蛋白进行SDS-PAGE分析之后发现其电泳呈现的分子量与理论分子量基本一致，说明纯化出的蛋白是目的蛋白；HuSC1-39-TGFβR的蛋白检测纯度为91.7％。
步骤②HuSC1-39-TGFβR对人TF抗原亲和力的ELISA测定
用包被液将TF蛋白胞外区(TF-ECD)稀释成2μg/mL，包被ELISA板，ELISA测定的具体方法参照实施例5。
检测结果如图24所示，HuSC1-39-TGFβR对TF-ECD有很强的亲和性，EC50为0.095nM。
步骤③HuSC1-39-TGFβR对TGFβ1亲和力的ELISA测定
将TGFβ1作为抗原包被在酶标板上，TGFβ1的浓度为0.5μg/mL。实验方法参考实施例5，其中一抗终浓度为27μg/mL，3倍梯度稀释。
检测结果如图25所示，HuSC1-39-TGFβR对TGFβ1有很强的亲和性，EC50为0.61nM。
步骤④融合蛋白对肿瘤细胞表面TF的特异性结合
参照实施例5，采用TF高表达的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、胰腺癌细胞BxPC3，测定融合蛋白对细胞表面TF的结合亲和力。
检测结果如图26、图27所示，HuSC1-39-TGFβR对肿瘤细胞表面的TF有很强的特异结合，对BxPC3细胞结合的EC50为5.6nM；对MDA-MB-231细胞结合的EC50为4.7nM。
抗体/抗体融合蛋白序列表
SEQ ID NO.:1人CD73蛋白的胞外区氨基酸序列
WELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKAHHHHHHHHH H
SEQ ID NO.:2mAb001重链可变区(VH)氨基酸序列
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGKSTLTADKSSSTAFMQLSSLTSEDSAVYFCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:3mAb002重链可变区(VH)氨基酸序列
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.:4mAb004重链可变区(VH)氨基酸序列
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
SEQ ID NO.:5mAb001轻链可变区(VL)氨基酸序列
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGNTSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
SEQ ID NO.:6mAb002轻链可变区(VL)氨基酸序列
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVDGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
SEQ ID NO.:7mAb004轻链可变区(VL)氨基酸序列
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYGATNLAEGVPSRFSGSGLGTQYSLKISSLQSEDFGSYYCQHFWGIPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.:8mAb001-VL-SGS
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGSGSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
SEQ ID NO.:9mAb002-VH-QG
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.:10mAb002-VH-NA
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNARSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.:11mAb002-VL-SG
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVSGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
SEQ ID NO.:12mAb004-VH-QG
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNQGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
SEQ ID NO.:13 mAb004-VH-NA
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
SEQ ID NO.:14 mAb001-VH_HuG.3
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:15 mAb001-VH_HuG.5
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:16 mAb001-VH_HuG.6
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:17 mAb001-VH_HuG.7
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:18 mAb001-VH_HuG.8
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:19 mAb001-VH_HuG.9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:20 mAb001-VH_HuG.10
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:21 mAb001-VK_HuG.1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.:22 mAb001-VK_HuG.2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.:23 mAb001-VK_HuG.0
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.:24 mAb002-VH_HuG0
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:25 mAb002-VH_HuG1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:26 mAb002-VH_HuG2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:27mAb002-VH_HuG3
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVKKAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:28mAb002-VK_HuG1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKAPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.:29mAb002-VK_HuG2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.:30mAb002-VK_HuG3
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFAIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.:31抗体重链恒定区的氨基酸序列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGA
SEQ ID NO.:32Linker的氨基酸序列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
SEQ ID NO.:33TGFβ受体II胞外区的氨基酸序列
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
SEQ ID NO.:34Hu001c-14-TGFβR融合蛋白重链的氨基酸序列
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*
SEQ ID NO.:35Hu001c-32-TGFβR融合蛋白重链的氨基酸序列
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*
SEQ ID NO.:36Hu002c-3-TGFβR融合蛋白重链的氨基酸序列
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*
SEQ ID NO.:37抗TF抗体HuSC1-39的重链可变区氨基酸
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGMIYPADSETRLNQKFKDQATLSVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAREDYGSSDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.:38抗TF抗体HuSC1-39的轻链可变区氨基酸
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKSPKIWIYGISNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKSSFPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.:39HuSC1-39-TGFβR融合蛋白重链的氨基酸序列
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGMIYPADSETRLNQKFKDQATLSVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAREDYGSSDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*
序列表
<110> 复旦大学
<120> 靶向肿瘤的重组双功能融合蛋白及其应用
<130> P2019-1220
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Trp Glu Leu Thr Ile Leu His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu
1 5 10 15
Gln Thr Ser Glu Asp Ser Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met
20 25 30
Gly Gly Val Ala Arg Leu Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala
35 40 45
Glu Pro Asn Val Leu Leu Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr
50 55 60
Ile Trp Phe Thr Val Tyr Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn
65 70 75 80
Ala Leu Arg Tyr Asp Ala Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn
85 90 95
Gly Val Glu Gly Leu Ile Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro
100 105 110
Ile Leu Ser Ala Asn Ile Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile
115 120 125
Ser Gly Leu Tyr Leu Pro Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val
130 135 140
Val Gly Ile Val Gly Tyr Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn
145 150 155 160
Pro Gly Thr Asn Leu Val Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro
165 170 175
Glu Val Asp Lys Leu Lys Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu
180 185 190
Gly His Ser Gly Phe Glu Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg
195 200 205
Gly Val Asp Val Val Val Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr
210 215 220
Gly Asn Pro Pro Ser Lys Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile
225 230 235 240
Val Thr Ser Asp Asp Gly Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala
245 250 255
Phe Gly Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly
260 265 270
Asn Val Ile Ser Ser His Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile
275 280 285
Pro Glu Asp Pro Ser Ile Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys
290 295 300
Leu Asp Asn Tyr Ser Thr Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu
305 310 315 320
Asp Gly Ser Ser Gln Ser Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn
325 330 335
Leu Ile Cys Asp Ala Met Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu
340 345 350
Met Phe Trp Asn His Val Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile
355 360 365
Arg Ser Pro Ile Asp Glu Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn
370 375 380
Leu Ala Ala Val Leu Pro Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu
385 390 395 400
Lys Gly Ser Thr Leu Lys Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr
405 410 415
Gly Gln Ser Thr Gly Glu Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val
420 425 430
Tyr Asp Leu Ser Arg Lys Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val
435 440 445
Leu Cys Thr Lys Cys Arg Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp
450 455 460
Glu Val Tyr Lys Val Ile Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp
465 470 475 480
Gly Phe Gln Met Ile Lys Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp
485 490 495
Gln Asp Ile Asn Val Val Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile
500 505 510
Tyr Pro Ala Val Glu Gly Arg Ile Lys Ala His His His His His His
515 520 525
His His His His
530
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ser Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Val Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ser Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Ile Thr Gly Thr Gly Tyr Trp Ser Phe Asp Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Asn Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Asn Thr Ser Gly Thr Glu His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ser Asn Ile Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Gln Asp Tyr Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Leu Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Asn Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Val Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Val Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ser Asn Ile Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Gln Asp Tyr Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Gln Gly Gly Ser Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Ile Thr Gly Thr Gly Tyr Trp Ser Phe Asp Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Ala Gly Ser Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Ile Thr Gly Thr Gly Tyr Trp Ser Phe Asp Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ser Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ser Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Asn Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Asn Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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100 105
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Asn Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Arg Gly Val Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Val Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Val Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Lys Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Val Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ser Asn Ile Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ser Asn Ile Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ser Asn Ile Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
325 330
<210> 32
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly
20
<210> 33
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20 25 30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50 55 60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65 70 75 80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115 120 125
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
130 135
<210> 34
<211> 624
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser
485 490 495
Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe
500 505 510
Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn
515 520 525
Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys
530 535 540
Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile
545 550 555 560
Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe
565 570 575
Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys
580 585 590
Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys
595 600 605
Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
610 615 620
<210> 35
<211> 624
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Asn Ile Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ser Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser
485 490 495
Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe
500 505 510
Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn
515 520 525
Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys
530 535 540
Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile
545 550 555 560
Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe
565 570 575
Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys
580 585 590
Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys
595 600 605
Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
610 615 620
<210> 36
<211> 625
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Glu Ile Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Val Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys
485 490 495
Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys
500 505 510
Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp
515 520 525
Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu
530 535 540
Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn
545 550 555 560
Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp
565 570 575
Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys
580 585 590
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu
595 600 605
Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro
610 615 620
Asp
625
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Tyr Pro Ala Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Gln Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ile Trp Ile Tyr
35 40 45
Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Ser Ser Phe Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 623
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Met Ile Tyr Pro Ala Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Gln Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
485 490 495
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
500 505 510
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
515 520 525
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
530 535 540
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
545 550 555 560
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
565 570 575
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
580 585 590
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
595 600 605
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
610 615 620

Claims (10)

1.一种重组双功能融合蛋白，其特征在于，所述重组双功能融合蛋白包含：
第一结合结构域(D1)；和
第二结合结构域(D2)；
其中，所述第一结合结构域特异性结合靶分子CD73或TF蛋白；
所述第二结合结构域特异性结合靶分子TGFβ蛋白。
2.如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白，其特征在于，所述双功能融合蛋白(单体)从N端到C端具有式I所示的结构：
Figure FDA0002192980360000011
其中，
T1、T2、T3各自独立地为无或TGFβ受体II的胞外区，且至少一个不为无；
L1、L2、L3各自独立地为键或接头元件；
VL代表抗CD73或TF抗体的轻链可变区；
CL代表抗CD73或TF抗体的轻链恒定区；
VH代表抗CD73或TF抗体的重链可变区；
CH代表抗CD73或TF抗体的重链恒定区；
“～”代表二硫键或共价键；
“-”代表肽键；
其中，所述双功能抗体具有同时结合CD73或TF以及结合TGFβ的活性。
3.如权利要求2所述的重组双功能融合蛋白，其特征在于，所述的重链可变区具有SEQID NO.:14、20或24所示的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的重组双功能融合蛋白，其特征在于，所述的轻链可变区具有SEQID NO.:21或29所示的氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的重组双功能融合蛋白，其特征在于，所述的TGFβ受体II的胞外区具有SEQ ID NO.:33所示的氨基酸序列。
6.一种抗CD73的抗体，其特征在于，所述的抗体含有：
(a)抗体重链可变区；和
(b)抗体轻链可变区。
7.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白、或如权利要求2所述的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
8.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白、或如权利要求2所述的抗体；以及
(ii)药学上可接受的载体。
9.如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白、或如权利要求2所述的抗体的用途，其特征在于，用于(a)制备检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗CD73或TF、和/或TGFβ相关疾病的药物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的药物用于选自下组的用途：
(a)抑制CD73催化腺苷一磷酸(AMP)水解生成腺苷的活性；
(b)特异结合肿瘤细胞，和/或肿瘤微环境中的免疫/基质细胞的CD73；
(c)抑制肿瘤/肿瘤微环境CD73催化AMP水解的活性；
(d)抑制肿瘤生长，提高联合用药的抗肿瘤疗效；
(e)促进免疫细胞的增殖、存活及功能，从而提高肿瘤免疫的效果；
(f)抑制TGFβ诱导的能够促进肿瘤的免疫细胞的功能；
(g)抑制TGFβ诱导产生的肿瘤微环境的免疫侵润抑制作用和纤维化等；
(h)抑制肿瘤的耐药；
(i)抑制肿瘤细胞迁移或转移。
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