TWI810163B - 芽孢桿菌屬細菌之培養方法及有用物質之製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於提供一種可有效生產芽孢桿菌屬細菌之芽孢的培養方法，特徵在於：以培養開始時之糖或糖源原料濃度為50.1g/L~100g/L之液體培養基來培養芽孢桿菌屬細菌，且於培養過程中將饋料批式培養基供至前述液體培養基來進行培養，該饋料批式培養基含有糖或糖源原料及含氮化合物，且碳原子與氮原子之重量比(C/N比)為5.5~13.5。
Description
本發明關於一種芽孢桿菌屬細菌之培養方法。
背景技術
於食品、醫藥及畜產等眾多領域之中，芽孢桿菌屬細菌或芽孢桿菌屬細菌所生產之有效成分受到廣泛利用。尤其是就以活菌為有效成分之微生物農藥或整腸劑而言，從耐久性及安定性之層面來看，於芽孢狀態下流通、利用芽孢桿菌屬細菌已視為尋常。
一般來說，芽孢桿菌屬細菌之培養主要使用包含糖等碳源、胺基酸或無機銨鹽等氮源及礦物質等之液體培養基。
非專利文獻1中揭示，藉批式培養法以含有此等成分之液體培養基來培養芽孢桿菌屬細菌時，獲得了3.5E+09spore/ml程度之芽孢。
專利文獻1中顯示，利用含有糖類、酵母萃取、玉米浸漬液乾燥物、大豆蛋白腫及濃縮燒酒粕(各成分分別最多5、10、20、10、20%)之培養基且在包含令對數增殖期後之氧濃度在10%以下之步驟的條件下進行培養，可獲得高濃度之芽孢桿菌屬細菌之芽孢。然而，對芽孢桿菌屬細菌之增殖而言，系統中宜充分存有氧，且芽孢
桿菌屬細菌當中也存在著若於對數增殖期間內在低氧條件下進行培養將會引起生長不良之菌株，因此可應用此一方法之菌有限。
專利文獻2揭示了以含高濃度糖源原料及氮源之培養基培養產生蛋白酶之芽孢桿菌屬細菌來高生產性地生產蛋白酶，但該方法係以批式培養法進行培養，一次所能獲得之蛋白酶量有限。
通常來說，欲一舉獲得更高濃度之芽孢及代謝物時，一般會應用提高培養基中之營養基質濃度來進行培養，一旦增加芽孢桿菌屬細菌可同化之基質來進行培養，菌濃度及代謝物會隨之成比例地增加，但若超過一定濃度來培養，培養系統之供氧能力無法趕上需氧量之增加，會有引發生長不良或培養所需時間趨於長期化等問題。尤其是以葡萄糖超過20g/L之培養基培養芽孢桿菌屬細菌時，芽孢之形成將會受阻，此事已報告在非專利文獻1中。
於是，為了不妨礙芽孢桿菌屬細菌形成芽孢且可一次就獲得高濃度之芽孢桿菌屬細菌之芽孢及代謝物而進行饋料批式培養(半批式培養)。該手法係在適切時機以適切濃度添加在培養過程中消失之營養基質，藉此可獲得較未添加時更高濃度之菌體及代謝物。
非專利文獻1揭示，藉由饋料批式培養，與批式培養時相較，菌體之生產性大幅提升並獲得了高濃度之芽孢桿菌屬細菌之芽孢。然而，該文獻中顯示，含20g/L以上葡
萄糖之培養基將會使芽孢化受阻，雖然降低培養開始時之糖濃度並以使糖源原料及氮源在低濃度下遞移之方式進行饋料批式培養，但因此而使添加時間長期化，最後變得需要長達60小時之培養時間。此外，於此所用之培養基成分係使用組合純化學之化合物而成之培養基，亦即使用全合成培養基，為了產業利用而大規模地培養芽孢桿菌屬細菌來獲得芽孢需龐大成本。因此，雖然希望能使用諸如食品等大規模製程所排出之殘渣或脫脂大豆粉及酵母萃取等製造時不需大費勞力之混合物所構成的原料來進行培養，但就使用含高濃度上述原料之培養基且可有效獲得芽孢桿菌屬細菌芽孢的方法而言，目前尚未有報告例提出。
專利文獻3顯示了一種因應培養過程中之葡萄糖消費而以使葡萄糖之最終濃度為1%之方式固定間隔地批式饋料至培養基的方法，但就芽孢桿菌屬細菌之培養而言，不僅是糖類之批式饋料，而是同時添加含氮化合物較有利於增殖。
專利文獻4顯示一種為了產生3-羥基酪酸而將地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)以含高濃度糖且碳原子與氮原子之重量比(C/N比)為12.4~24所構成之培養基進行饋料批式培養的方法，但為了獲得高濃度芽孢桿菌屬細菌之芽孢，以含超過必要程度之高濃度糖的培養基來進行培養並不適切。
[專利文獻1]日本特開2007-236286號公報
[專利文獻2]日本特開平11-103855號公報
[專利文獻3]日本特開平06-254584號公報
[專利文獻4]日本特表平09-502097號公報
[非專利文獻1]Advances in Microbiology, 2014, 4, 444-454
如上所述，為了以液體培養方式在短時間內獲得高濃度之芽孢桿菌屬細菌之芽孢及代謝物等有用物質，必須在無過與不及地供給芽孢桿菌屬細菌生成高濃度芽孢及代謝物所必須之培養基質的條件下進行培養，而必須找出滿足此等前提之新條件。因此，本發明之課題即在於，針對難以藉一般細菌用液體培養基來獲得高濃度芽孢及代謝物之芽孢桿菌屬細菌，提供一種可有效率地生產芽孢及代謝物等有用物質之培養方法。
本發明為了解決上述課題而精心進行研討，結果發現，藉由對於培養初期之糖源原料濃度較高之培養基供給已將包含糖或糖源原料之碳源與包含銨鹽、氨或脫脂大豆粉及玉米浸漬液等之氮源設定在特定組成比內之培養基並進行饋料批式培養，可不妨礙芽孢桿菌屬細菌
之生長而使其增殖，且可獲得習知方法所無法獲得之高濃度芽孢桿菌屬細菌之芽孢及代謝物等有用物質，終至完成本發明。
本發明係如下述。
[1]一種芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其特徵在於：以培養開始時之糖或糖源原料的濃度為50.1g/L~100g/L之液體培養基培養芽孢桿菌屬細菌，且於培養過程中將饋料批式培養基供至前述液體培養基來進行培養，其中該饋料批式培養基含有糖或糖源原料及含氮化合物，且碳原子與氮原子之重量比(C/N比)為5.5~13.5。
[2]如[1]之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其係將碳原子與氮原子之重量比(C/N比)為5.5~12之饋料批式培養基供予前述液體培養基來進行培養。
[3]如[1]或[2]之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其至培養結束時為止，供自饋料批式培養基之糖或糖源原料之總量係每1L饋料批式培養前之培養基為100g以下。
[4]如[1]至[3]中之任一芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中前述饋料批式培養基之供給係於芽孢桿菌屬細菌之氧消費速度最大之時間點的前後7小時之間進行。
[5]如[1]至[4]中之任一芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中前述饋料批式培養基之供給係於培養開始後3小時~30小時之間進行。
[6]如[1]至[5]中之任一芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中前述饋料批式培養基係將含有糖或糖源原料及含
氮化合物之溶液加熱滅菌而得者。
[7]如[1]至[6]中之任一芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中糖或糖源原料為非還原糖。
[8]如[7]之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中非還元糖係選自蔗糖、海藻糖、蔗果三糖、松三糖、龍膽三糖、新黑麥雙叉寡糖(neo-bifurcose)、真菌四糖(Fungi-tetraose)、車前糖、綿子糖、水蘇糖及黑麥雙叉寡糖所構成群組中之至少一者。
[9]如[1]至[8]中之任一芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中含氮化合物係自下列群組中選出至少一種：由銨鹽及氨構成之無機氮化合物群；及，由胺基酸、胜肽、蛋白質、尿素、脫脂大豆粉、大豆來源成分、酵母來源成分、玉米浸漬液、玉米浸漬液之乾燥粉末、玉米來源成分、動植物蛋白質或其分解物構成之有機氮化合物群。
[10]如[1]至[9]中之任一芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其係將液體培養基之溶氧濃度保持在10%以上。
[11]如[1]至[10]中之任一芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其係將液體培養基之溫度控制在20~60℃之間以控制芽孢桿菌屬細菌之增殖。
[12]如[11]之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其在芽孢桿菌屬細菌之對數增殖期以28~32℃進行培養，之後則於35~39℃下進行培養。
[13]如[1]至[12]中之任一芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中芽孢桿菌屬細菌係選自於由枯草芽孢桿菌
(Bacillus subtilis)、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、單純芽孢桿菌(Bacillus simplex)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)、蜂疫桿菌(Bacillus alvei)、日本甲蟲芽孢桿菌(Bacillus popilliae)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、仙人掌桿菌(Bacillus brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、西姆芽孢桿菌(Bacillus siamensis)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)、Bacillus pichinotyi、酸熱芽孢桿菌(Bacillus acidocaldarius)、Bacillus alkalicola、產氮芽孢桿菌(Bacillus azotoformans)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius)、巴達維亞芽孢桿菌(Bacillus bataviensis)、環庚烷芽孢桿菌(Bacillus cycloheptanicus)、解硫胺素芽孢桿菌(Bacillus aneurinilyticus)、米氏芽孢桿菌(Bacillus migulanus)、Bacillus abyssalis、海岸芽孢桿菌(Bacillus aestuarii)、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)及芽孢桿菌屬菌
(Bacillus sp.)所構成之群組。
[14]一種有用物質之製造方法，其特徵在於：使用如[1]至[13]中之任一培養方法而使有用物質生成於前述液體培養基中。
[15]如[14]之有用物質之製造方法，其中前述有用物質為芽孢桿菌屬細菌之芽孢。
[16]如[14]之有用物質之製造方法，其中前述有用物質為芽孢桿菌屬細菌之代謝物。
[17]如[16]之有用物質之製造方法，其中前述代謝物為環狀脂肽。
[18]如[17]之有用物質之製造方法，其中前述環狀脂肽係選自於由伊枯草菌素(iturin)、表面素(surfactin)、巴斯他汀(plipastatin)、豐原素(fengycin)、桿菌抗黴素(bacillomycin)、地衣素(lichenysin)、藏紅素(kurstakin)、抗黴枯草菌素(mycosubtilin)、黏菌素(colistin)、殺鐮孢菌素(fusaricidin)、paenibacterin、多黏菌素(polymyxin)及pumilacidin所構成群組中之至少1種。
若依本發明，可使芽孢桿菌屬細菌增殖為高濃度，且可以高比率生成芽孢及代謝物等有用物質。
用以實施發明之形態
本發明之芽孢桿菌屬細菌之培養方法特徵在於：以培
養開始時之糖或糖源原料的濃度為50.1g/L~100g/L之液體培養基培養芽孢桿菌屬細菌，且於培養過程中將饋料批式培養基供至前述液體培養基來進行培養，其中該饋料批式培養基含有糖或糖源原料及含氮化合物，且碳原子與氮原子之重量比(C/N比)為5.5~13.5。
藉由使用本發明之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，可使芽孢及代謝物等有用物質以高比率生成於液體培養基中。
於本發明中，就芽孢桿菌屬細菌而言，只要是被分類為芽孢桿菌屬之細菌即不特別受限，可舉例如：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、單純芽孢桿菌(Bacillus simplex)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)、蜂疫桿菌(Bacillus alvei)、日本甲蟲芽孢桿菌(Bacillus popilliae)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、仙人掌桿菌(Bacillus brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、西姆芽孢桿菌(Bacillus siamensis)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)、Bacillus pichinotyi、酸熱芽孢桿菌(Bacillus acidocaldarius)、Bacillus alkalicola、產氮芽孢桿菌(Bacillus azotoformans)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius)、巴達維亞芽孢桿菌(Bacillus bataviensis)、環庚烷芽孢桿菌(Bacillus cycloheptanicus)、解硫胺素芽孢桿菌(Bacillus aneurinilyticus)、米氏芽孢桿菌(Bacillus migulanus)、Bacillus abyssalis、海岸芽孢桿菌(Bacillus aestuarii)、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)或芽孢桿菌屬菌(Bacillus sp.)。
於本發明中，有用物質意指顯示出動植物生長促進作用、殺菌/制菌作用、基因活性化作用等生理活性之物質、各種酵素、乳酸、胺基酸等產業上可活用之物質、納豆及酸酪乳等可作為食品等使用之發酵物本身，具體來說則可舉如芽孢桿菌屬細菌之芽孢及芽孢桿菌屬細菌之代謝物。芽孢桿菌屬細菌之代謝物為透過培養而生產之活菌以外之有效成分，可舉如具抗菌性及界面活性作用之環狀胜肽及蛋白酶、脂酶等酵素。
屬芽孢桿菌屬細菌代謝物之環狀脂肽可舉如：選自於由伊枯草菌素(iturin)、表面素(surfactin)、巴斯他汀(plipastatin)、豐原素(fengycin)、桿菌抗黴素(bacillomycin)、地衣素(lichenysin)、藏紅素(kurstakin)、抗黴枯草菌素(mycosubtilin)、黏菌素(colistin)、殺鐮孢菌素(fusaricidin)、paenibacterin、多
黏菌素(polymyxin)及pumilacidin所構成群組中之至少一者。
用於培養芽孢桿菌屬細菌之培養基至少含有碳源與氮源。
用於培養之碳源可使用芽孢桿菌屬細菌可進行異化之物質，可異化之碳源可例示如芽孢桿菌屬細菌可異化之糖(葡萄糖、乳糖、丙三醇、***糖、核糖、木糖、半乳糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺、纖維雙糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇等)或糖源原料。糖源原料係一可藉包含芽孢桿菌屬細菌在內之眾多微生物所生產之澱粉酶及纖維素酶等酵素而使上述可異化之糖遊離的基質，意指以澱粉、纖維素、果膠、幾丁質等多糖及稻蒿、麥蒿、榖糠、食品廢棄物、建設產生木材及製材工廠殘材等生質材料為例之原料。於此之中，以非還原糖為宜，具體來說則可例示如：選自於由蔗糖、海藻糖、蔗果三糖、松三糖、龍膽三糖、新黑麥雙叉寡糖、真菌四糖、車前糖、綿子糖、水蘇糖及黑麥雙叉寡糖所構成群組中之至少1種非還原糖。
用於培養之氮源可使用芽孢桿菌屬細菌可異化之物質，可異化之氮源可例示如胺基酸、胜肽、動植物蛋白質及其分解物、尿素、脫脂大豆粉等大豆來源成分、酵母來源成分、玉米浸漬液、玉米浸漬液乾燥粉末、玉米來源成分、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨及乙酸銨等銨鹽、氨、硝酸鈉、硝酸鉀、麩胺酸鈉及尿素等含氮化合
物。
就其他培養基成分而言，只要不對芽孢形成或代謝物等有用物質之生產造成不良影響，也可添加通常用於培養芽孢桿菌屬細菌之微量金屬鹽等培養基成分，更可視需要添加胺基酸或維生素等。
培養開始時之培養基所含糖或糖源原料之量為50.1~100g/L。芽孢桿菌屬細菌之培養過程中，藉由以含有如此高濃度之糖或糖源原料之培養基進行培養，可於培養初期獲得增殖現象更活潑之芽孢桿菌屬細菌，另一方面，由於此等糖或糖源原料會於增殖時被有效消費，於培養後期不會殘存，而可有效誘導芽孢形成及代謝物等有用物質之生產。此外，若以小於50.1g/L濃度之培養基來培養，則糖源會在早期就消費殆盡，在未得充分增殖時即進行芽孢化。又，若以較100g/L更高濃度之培養基進行培養，會對生長及芽孢形成造成抑制作用，因此必須以含有上述範圍內之糖或糖源原料的培養基組成來進行培養。
培養開始時之培養基中，含氮化合物之量宜為8~72g/L，培養開始時之培養基的C/N比宜為5.5~13.5。
培養過程中所供給之饋料批式培養基也可使用上述之含糖或糖源原料及含氮化合物之培養基，但於本發明中，饋料批式培養基中之碳原子與氮原子之重量比(C/N比)會調整為5.5~13.5(宜5.5~12)。藉由將C/N比調整在此範圍內，可不妨礙細菌生長而實現高濃度之芽孢生產及代謝物等有用物質之生產。另一方面，以糖或糖源原
料之比率較高(C/N比超過13.5)的培養基進行培養時，糖或糖源原料會於培養末期殘存在培養基中。已知該殘存糖會阻礙芽孢桿菌屬細菌活細胞之芽孢化。又，以氮源化合物之比率較高(C/N比小於5.5)之培養基進行培養時，生長所需之碳源不足而不利增殖。
另，C/N比係如下算出。
C/N比=各培養基成分所含碳含量之合計÷各培養基成分所含氮含量之合計。
培養基成分中，天然系原料之碳含量可各自以全糖量之40%重量及全蛋白質量之50%重量來予以概算。全糖量可在酸中以100℃進行2.5小時水解後藉梭摩基法(Somogyi’s method)而以還原糖濃度形式來予以定量。全蛋白質量則可先以凱耳達法(Kjeldahl method)進行全氮量之定量後乘以換算係數6.25來予以概算。
至培養結束時為止，批式饋料之培養基量並未特別受限，但由饋料批式培養基供給之糖或糖源原料之總量宜設成每1L批式饋料前之培養基在100g以下。
饋料批式培養基宜為將含有非還原糖或含非還原糖之糖源原料及含氮化合物之溶液加熱滅菌所得之物。
就培養基成分而言，通常在培養開始前會施行熱壓釜等之加熱滅菌處理，但在具還原性之糖與氮源共存之條件下，一旦進行熱壓釜處理，其等將成為基質而引發梅納反應，生長所需營養成分將轉換為其他化合物而喪失原本作
為營養源之機能。芽孢桿菌屬細菌會因此變得難以有效增殖而無法獲得充分之菌體及代謝物等有用物質。因此，將糖源與氮源各別進行加熱滅菌，待充分冷卻後將兩者混合再供予培養之方法較為普遍。由於此一混合步驟會將保持在滅菌狀態之系統開放，汙染之風險提高，且所需設備及作業步驟也會增加。
相對於此，本發明之方法則是使用蔗糖等之非還原糖，藉此，即使將碳源與氮源同時加熱滅菌也不會引起梅納反應等，因此培養基之調製容易。
饋料批式培養基之供給可僅供給1次，也可分作多次，例如分2~6次斷續供給，但以配合營養源之消費速度連續供給饋料批式培養基為宜。
饋料批式培養基之供給宜在芽孢桿菌屬細菌增殖活潑且氧及營養源之消費更為活潑之時間點進行。若於培養初期即開始添加則營養濃度提高，增殖變得活潑而急遽消費氧氣，造成氧供給不充分或因滲透壓效果而引發生長不良。又，若在增殖活潑之時期過後進行批式饋料而欲得充分之芽孢及代謝物等有用物質時，則需要更長之培養時間。一般而言，芽孢在營養不足狀態時形成，因此一旦將批式饋料持續到培養後期，培養基中會殘存多量培養基質，芽孢就不會形成。因此，舉例來說，饋料批式培養基之投予宜在微生物之氧消費速度最大的時間點(例如從培養開始起算經過8小時之時間點)的前後7小時之間進行，且宜在培養開始後3小時~30小時之間進行。更宜在
培養開始後5~20小時內開始投予饋料批式培養基，且在培養開始後13~25小時之間結束饋料批式培養基之投予。另，總培養時間可舉例如24~48小時。
另，培養液中之溶氧濃度可藉隔膜賈法尼電極式感測器等來實時監測。
就培養條件而言，僅需是一般使用在芽孢桿菌屬細菌之液體培養的條件即可，但舉例來說，宜控制在20~60℃(宜20~40℃)來調控芽孢桿菌屬細菌之增殖。舉例來說，對數增殖期以28~32℃(宜30℃±1℃)進行培養來調控芽孢桿菌屬細菌之增殖與糖或糖源原料之消費，之後再以35~39℃(宜37℃±1℃)進行培養，可藉此實現效率更佳之芽孢形成。
更進一步來說，培養宜在好氧條件(例如氧濃度10%以上，且宜15~50%)下一邊攪拌一邊進行，培養基之pH以6.5~8.5為宜，7.0~8.0更佳。
另，以上述糖或糖源原料之濃度為50.1g/L~100g/L之液體培養基進行培養前，亦可進行前置培養。
如此，可得高芽孢化率(例如50%以上，且宜80%以上)之芽孢桿菌屬細菌菌體及芽孢桿菌屬細菌之代謝物。此種高芽孢化率之芽孢桿菌屬細菌菌體及芽孢桿菌屬細菌之代謝物可適當進行培養基之濃縮或去除、乾燥等操作後，使用在所欲之目的上。
以下，列舉實施例俾具體說明本發明，但本發明並不侷限於下述實施例。
將實施例、參考例及比較例所使用之培養基組成示於表1。培養基成分中，葡萄糖(Glucose)、蔗糖(Sucrose)、玉米浸漬液(CSL(corn steep liquor))之碳含量分別以全糖量之40%重量及全蛋白質量之50%重量來算出。全糖量係於酸中以100℃、2.5小時進行水解後，以梭摩基法(Somogyi method)定量還原糖濃度。全蛋白質量則先利用凱耳達法(Kjeldahl method)定量全氮量後乘以換算係數6.25來算出。
參考例1 糖源原料之比較(葡萄糖及蔗糖)
於500mL容積之三角燒瓶中，以表1之培養基條件1所載之最終濃度，分別製作含有葡萄糖(和光純藥)、CSL(ROQUETTE)、MnCl2(和光純藥)、KH2PO4(和光純藥)之培養基各100ml，進行熱壓釜滅菌(葡萄糖另行滅菌後以無菌方式混合)。自生長在普通洋菜平板培養基上之枯
草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MBI-600之菌落刮取1接種環，以無菌方式植菌於表1之培養基條件1所載培養基上，再以30℃、150rpm振盪培養1夜，獲得前置培養液。
使用5L容積之培養槽，以表1之培養基條件2(試驗編號2)及3(試驗編號3)所載之最終濃度製作2管2L之培養基，進行熱壓釜滅菌(葡萄糖另行滅菌後以無菌方式混合，蔗糖(和光純藥)則預先與所有培養基成分混合並滅菌)。
將上述所得枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MBI-600之前置培養液100ml分別以無菌方式植菌至5L容積培養槽，於30℃、500rpm條件下開始培養，調整氧供給量使溶氧濃度不低於10%。溶氧濃度係一將溶存於每單位體積培養液中之氧量以百分率表示之數值，為了測量該值，舉例來說，可以桌上型培養装置(MDL-8C)(B.E.MARUBISHI CO.,LTD.製)等之機器來測定。
培養34小時後，就所得培養液以滅菌水稀釋，塗佈於普通肉汁洋菜培養基(榮研化學股份有限公司)並於37℃下靜置1夜培養，計測形成之菌落數來測定菌體數。此外，將先調製出之稀釋液以80℃加熱30分鐘後，同樣塗佈於普通肉汁洋菜培養基，於37℃下靜置1夜培養，計測形成之菌落數以測定耐熱菌數，並從此等結果算出芽孢形成率。茲將其結果示於表2。
於本培養試驗中，以碳源使用葡萄糖且與氮源分別進行滅菌之培養基、以及碳源使用蔗糖且與氮源同時進行滅菌之培養基來培養枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MBI-600時，未見耐熱菌數有很大差異。
實施例1 饋料批式培養法培養下的菌數比較
於500mL容積之三角燒瓶中，分別製作已調整成表1之培養基條件1所載最終濃度的培養基各100ml，進行熱壓釜滅菌(葡萄糖另行滅菌後以無菌方式混合)。對此，自生長於普通洋菜平板培養基上之枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MBI-600之菌落刮取1接種環，以無菌方式植菌並於30℃、150rpm下振盪1夜進行培養，獲得前置培養液。
使用5L容積之培養槽，以表1之培養基條件3所載最終濃度製作2管2L之培養基，進行熱壓釜滅菌(所有培養基成分預先混合後經熱壓釜滅菌)。
使用500mL容積之DURAN培養瓶，以表1之培養基條件4所載最終濃度製作1管0.4L之培養基。以使其可進行批式饋料的方式，將其預先以軟管連接至裝有培養基條件3之培養基的5L容積培養槽，再進行熱壓釜處理(所有培養基成分已預先混合並經熱壓釜滅菌)。
自所得前置培養液分別取100ml以無菌方式植菌至含有上述2L培養基之5L容積培養槽，於37℃條件下開始培養。自培養開始5小時後，每隔2小時對5L容積培養槽中之一者分4次添加培養基條件4之培養基，每次100mL。從開始添加起，將培養溫度降低至30℃進行培養。此時，調控
轉數來調整供氧量，使培養液中之溶氧濃度不低於10%。氧消費速度在培養開始約8小時成為最大。從培養開始經過24小時後，將培養溫度提高到37℃進行培養。
培養34小時後，就所得培養液以滅菌水稀釋後，塗佈於普通肉汁洋菜培養基並於37℃下靜置1夜，計測形成之菌落數來測定菌體數。此外，將先調製出之稀釋液以80℃加熱30分鐘後，同樣塗佈於普通肉汁洋菜培養基，於37℃下靜置1夜培養，計測形成之菌落數以測定耐熱菌數，並從此等結果算出芽孢形成率。茲將其結果示於表3。
於本培養試驗中，以碳源使用蔗糖且全培養基成分同時滅菌之培養基進行饋料批式培養之枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的菌濃度較未進行饋料批式培養者可見約1.5倍之菌濃度增加，耐熱芽孢亦增加。
實施例2 使用將還原糖或非還原糖同時滅菌之培養基的培養試驗
於500mL容積之三角燒瓶中，分別製作已調整成表1之培養基條件1所載最終濃度的培養基各100ml，進行熱壓釜滅菌(葡萄糖另行滅菌後以無菌方式混合)。對此，自生長於普通洋菜平板培養基上之枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MBI-600之菌落刮取1接種環，以無菌方式植菌並於30℃、150rpm下振盪1夜進行培養，獲得前置培養液。
於5L容積培養槽中製作已分別調整成表1之培養基條件2及3所載最終濃度之培養基各2L(葡萄糖及蔗糖已預先與所有培養基成分混合並滅菌)。
使用500mL容積之DURAN培養瓶，製作已分別調整成表1之培養基條件4及5所載最終濃度之培養基各0.4L。
以可進行批式饋料的方式，預先以軟管將培養基條件4之培養基連接到裝有培養基條件2之成分的5L容積培養槽，且將培養基條件5之培養基連接到裝有培養基條件3之成分的5L容積培養槽，進行熱壓釜處理(葡萄糖及蔗糖已預先與所有培養基成分混合並滅菌)。
自所得前置培養液分別取100ml以無菌方式植菌至含有上述2L培養基之5L容積培養槽，於37℃條件下開始培養。自培養開始5小時後，每隔2小時對培養基條件3之培養基添加培養基條件4之培養基，對培養基條件2之培養基添加培養基條件5之培養基，分4次添加，每次添加100mL。從開始添加起，將培養溫度降低至30℃進行培養。此時，調控轉數來調整供氧量，使培養液中之溶氧濃度不低於10%。開始批式饋料時，以培養基條件2培養之培養液的葡萄糖濃度低於40g/L，此外，氧消費速度在培養開始約8小時後成為最大。從培養開始經過24小時後，將培養溫度提高到37℃進行培養。
培養34小時後，就所得培養液以滅菌水稀釋後，塗佈於普通肉汁洋菜培養基並於37℃下靜置1夜，計測形成之菌落數來測定菌體數。此外，將先調製出之稀釋液以80℃
加熱30分鐘後，同樣塗佈於普通肉汁洋菜培養基，於37℃下靜置1夜培養，計測形成之菌落數以測定耐熱菌數，並從此等結果算出芽孢形成率。茲將其結果示於表4。
於本培養試驗中，以碳源使用葡萄糖且全培養基成分同時滅菌之培養基進行饋料批式培養之枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的菌濃度與碳源使用蔗糖來進行饋料批式培養者相較下，耐熱芽孢菌數較少。
實施例3 蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)之饋料批式培養試驗
於500mL容積之三角燒瓶中，分別製作已調整成表1之培養基條件1所載最終濃度的培養基各100ml，進行熱壓釜滅菌(葡萄糖另行滅菌後以無菌方式混合)。對此，自生長於普通洋菜平板培養基上之蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)NBRC 101235之菌落刮取1接種環，以無菌方式植菌並於30℃、150rpm下振盪1夜進行培養，獲得前置培養液。
於5L容積之培養槽中製作已調整成表1之培養基條件2所載最終濃度之培養基各2L共3管(葡萄糖已另行滅菌並
以無菌方式混合)。
使用500mL容積之DURAN培養瓶，製作已分別調整成表1之培養基條件4及5所載最終濃度之培養基各0.4L。以可進行批式饋料的方式，預先以軟管將培養基條件4及5之培養基分別連接到裝有培養基條件2之成分的5L容積培養槽，進行熱壓釜處理(葡萄糖已另行滅菌後以無菌方式混合，蔗糖則預先與所有培養基成分混合並滅菌)。此外，令不進行饋料批式培養之培養基條件2的培養基為對照組。
自所得前置培養液分別取100ml以無菌方式植菌至含有上述2L培養基之5L容積培養槽，於37℃條件下開始培養。自培養開始6小時後，每隔2小時對5L容積培養槽中之2管分別分4次添加培養基條件4或培養基條件5之培養基，每次100mL。從開始添加起，將培養溫度降低至30℃進行培養。此時，調控轉數來調整供氧量，使培養液中之溶氧濃度不低於10%，同時對各發酵槽添加10%鹽酸水溶液及2M氫氧化鈉溶液，將培養中之培養液pH調節為6.7~7.3。開始批式饋料時，以培養基條件2培養之培養液的葡萄糖濃度低於40g/L，此外，氧消費速度在培養開始約8小時成為最大。從培養開始經過24小時後，將培養溫度提高到37℃進行培養。
培養34小時後，就所得培養液以滅菌水稀釋後，塗佈於普通肉汁洋菜培養基並於37℃下靜置1夜，計測形成之菌落數來測定菌體數。此外，將先調製出之稀釋液以80℃加熱30分鐘後，同樣塗佈於普通肉汁洋菜培養基，於37℃
下靜置1夜培養，計測形成之菌落數以測定耐熱菌數，並從此等結果算出芽孢形成率。茲將其結果示於表5。
本培養試驗中對蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)進行饋料批式培養，藉此，與未進行批式饋料之條件相較下，獲得較多之耐熱芽孢。此外，相較於屬還原糖之葡萄糖，將含有屬非還原糖之蔗糖的培養基進行批式饋料者獲得較多之耐熱芽孢。
比較例1 僅碳源之饋料批式培養
於500mL容積之三角燒瓶中，分別製作已調整成表1之培養基條件1所載最終濃度的培養基各100ml，進行熱壓釜滅菌(葡萄糖另行滅菌後以無菌方式混合)。對此，自生長於普通洋菜平板培養基上之枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MBI-600之菌落刮取1接種環，以無菌方式植菌並於30℃、150rpm下振盪1夜進行培養，獲得前置培養液。
使用5L容積之培養槽，以表1之培養基條件2所載最終濃度製作2L之培養基，進行熱壓釜滅菌(葡萄糖已另行滅菌並以無菌方式混合)。
使用500mL容積之DURAN培養瓶，以使葡萄糖成為125g/L之最終濃度的方式製作1管0.4L之培養基。以可進行批式饋料的方式，將其預先以軟管連接至裝有培養基條件2之培養基的5L容積培養槽，再進行熱壓釜處理(葡萄糖已另行滅菌並以無菌方式混合)。
將所得前置培養液100ml以無菌方式植菌至上述培養
基，於37℃條件下開始培養。自培養開始5小時後，每隔2小時分4次添加葡萄糖溶液，每次100mL。從開始添加起，將培養溫度降低至30℃進行培養。此時，調控轉數來調整供氧量，使培養液中之溶氧濃度不低於10%。開始批式饋料時，以培養基條件2培養之培養液的葡萄糖濃度低於40g/L，此外，氧消費速度在培養開始約8小時後成為最大。從培養開始經過24小時後，將培養溫度提高到37℃進行培養。
培養34小時後，就所得培養液以滅菌水稀釋後，塗佈於普通肉汁洋菜培養基並於37℃下靜置1夜，計測形成之菌落數來測定菌體數。此外，將先調製出之稀釋液以80℃加熱30分鐘後，同樣塗佈於普通肉汁洋菜培養基，於37℃下靜置1夜培養，計測形成之菌落數以測定耐熱菌數，並從此等結果算出芽孢形成率。茲將其結果示於表6。
於本培養試驗中得知，僅批式饋料碳源之葡萄糖的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的菌濃度與使用同時含有碳源與氮源之培養基來進行饋料批式培養時(表4之2+5)相較，所得芽孢濃度降低。
實施例4 饋料批式培養法培養下的伊枯草菌素量比較
於500mL容積之三角燒瓶中，分別製作已調整成表1
之培養基條件1所載最終濃度的培養基各100ml，進行熱壓釜滅菌(葡萄糖另行滅菌後以無菌方式混合)。對此，自生長於普通洋菜平板培養基上之枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MBI-600之菌落刮取1接種環，以無菌方式植菌並於30℃、150rpm下振盪1夜進行培養，獲得前置培養液。
使用5L容積之培養槽，以表1之培養基條件2所載最終濃度製作2管2L之培養基，進行熱壓釜滅菌(所有培養基成分已預先混合並經熱壓釜滅菌)。
使用500mL容積之DURAN培養瓶，以表1之培養基條件4所載最終濃度製作1管0.4L之培養基。以可進行批式饋料的方式，將其預先以軟管連接至裝有培養基條件2之培養基的5L容積培養槽，再進行熱壓釜處理(所有培養基成分已預先混合並經熱壓釜滅菌)。
將所得前置培養液各取100ml，以無菌方式植菌至含有上述培養基條件2之培養基2L的5L容積培養槽，於30℃條件下開始培養。自培養開始5小時後，每隔2小時對5L容積培養槽中之一者分4次添加培養基條件4之培養基，每次100mL，再繼續培養。此時，調控轉數來調整供氧量，使培養液中之溶氧濃度不低於10%。氧消費速度在培養開始約12小時後成為最大。
培養54小時後，就所得培養液以滅菌水稀釋後，塗佈於普通肉汁洋菜培養基並於37℃下靜置1夜，計測形成之菌落數來測定菌體數。此外，將先調製出之稀釋液以80℃加熱30分鐘後，同樣塗佈於普通肉汁洋菜培養基，於37℃
下靜置1夜培養，計測形成之菌落數以測定耐熱菌數，並從此等結果算出芽孢形成率。茲將其結果示於表7。
此外，針對所得培養液，使用冷卻離心機(TOMY SEIKO CO.,LTD.製MX-307)，以10,000rpm、20℃進行30分鐘離心分離後回收上清液。
於固相萃取管柱(Nihon Waters K.K.製，Oasis HLB 3cc(400mg)LP Extraction Cartridge)中加入含0.1%TFA之乙腈6mL並使其通過後，加入含0.1%TFA之蒸餾水6mL並使其通過。加入所回收之培養液離心上清液2mL使其通過，再依序使含0.1%TFA之蒸餾水6mL、含0.1%TFA之乙腈/蒸餾水(20：80,v/v)6mL通過並洗淨。接著，使含0.1%TFA之乙腈/蒸餾水(90：10,v/v)5mL通過，回收溶出液。添加含0.1%TFA之乙腈/蒸餾水(90：10,v/v)以使回收液成為5mL，於下列條件下進行HPLC分析。
HPLC：安捷倫科技股份有限公司1260 Infinity
管柱：Nihon Waters K.K.XBridge C18 5μm 4.6 x 250mm
移動相：A：含0.1%TFA之蒸餾水、B：含0.1%TFA之乙腈
0~3分鐘 A80%/B20%
3~12分鐘 A80%/B20%→B100%
12~23分鐘 B100%
23~27分鐘 B100%→A80%/B20%
27~30分 A80%/B20%
流量：1mL/分鐘
溫度：40℃
檢測：UV205nm
注入量：10μL
標準品：Iturin A from Bacillus subtilis(Merck)
濃度：30ppm、120ppm
溶劑：含0.1%TFA之乙腈/蒸餾水(90：10,v/v)
就溶出時間12.1分鐘及12.7分鐘所檢測出之尖峰面積，經由與標準品比較而算出培養液中之伊枯草菌素濃度。
茲將結果示於表7。
於本培養試驗中，經饋料批式培養之枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的菌濃度與未進行饋料批式培養者相較，可見約1.8倍之菌濃度、約2.1倍之伊枯草菌素濃度增加，耐熱芽孢亦增加。
(無)
Claims (11)
- 一種芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其特徵在於：以培養開始時之糖的濃度為50.1g/L~100g/L之液體培養基培養芽孢桿菌屬細菌，且於培養過程中將饋料批式培養基供至予前述液體培養基來進行培養，其中該饋料批式培養基含有糖及含氮化合物，且碳原子與氮原子之重量比(C/N比)為5.5~13.5；至培養結束時為止，供自饋料批式培養基之糖之總量係每1L饋料批式培養前之培養基為100g以下；前述糖係選自由葡萄糖及蔗糖所構成群組中之至少一種；前述含氮化合物係選自由玉米浸漬液及玉米浸漬液之乾燥粉末所構成之有機氮化合物群中之至少一種；前述芽孢桿菌屬細菌係選自於由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、單純芽孢桿菌(Bacillus simplex)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)、蜂疫桿菌(Bacillus alvei)、日本甲蟲芽孢桿菌(Bacillus popilliae)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、仙人掌桿菌(Bacillus brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、西姆芽孢桿菌(Bacillus siamensis)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)、Bacillus pichinotyi、酸熱芽孢桿菌(Bacillus acidocaldarius)、Bacillus alkalicola、產氮芽孢桿菌(Bacillus azotoformans)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius)、巴達維亞芽孢桿菌(Bacillus bataviensis)、環庚烷芽孢桿菌(Bacillus cycloheptanicus)、解硫胺素芽孢桿菌(Bacillus aneurinilyticus)、米氏芽孢桿菌(Bacillus migulanus)、Bacillus abyssalis、海岸芽孢桿菌(Bacillus aestuarii)及多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)所構成之群組。
- 如請求項1之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其係將碳原子與氮原子之重量比(C/N比)為5.5~12之饋料批式培養基供予前述液體培養基來進行培養。
- 如請求項1之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中前述饋料批式培養基之供給係於芽孢桿菌屬細菌之氧消費速度最大之時間點的前後7小時之間進行。
- 如請求項1之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中前述饋料批式培養基之供給係於培養開始後3小 時~30小時之間進行。
- 如請求項1之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其中前述饋料批式培養基係將含有糖及含氮化合物之溶液加熱滅菌而得者。
- 如請求項1之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其係將液體培養基之溶氧濃度保持在10%以上。
- 如請求項1之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其係將液體培養基之溫度控制在20~60℃之間以控制芽孢桿菌屬細菌之增殖。
- 如請求項7之芽孢桿菌屬細菌之培養方法，其在芽孢桿菌屬細菌之對數增殖期以28~32℃進行培養，之後則於35~39℃下進行培養。
- 一種有用物質之製造方法，其特徵在於：使用如請求項1至8中任一項之培養方法而使有用物質生成於前述液體培養基中，前述有用物質為芽孢桿菌屬細菌之芽孢及/或芽孢桿菌屬細菌之代謝物。
- 如請求項9之有用物質之製造方法，其中前述代謝物為環狀脂肽。
- 如請求項10之有用物質之製造方法，其中前述環狀脂肽係選自於由伊枯草菌素(iturin)、表面素(surfactin)、巴斯他汀(plipastatin)、豐原素(fengycin)、桿菌抗黴素(bacillomycin)、地衣素(lichenysin)、藏紅素(kurstakin)、抗黴枯草菌素 (mycosubtilin)、黏菌素(colistin)、殺鐮孢菌素(fusaricidin)、paenibacterin、多黏菌素(polymyxin)及pumilacidin所構成群組中之至少1種。
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| JP2016-199419 | 2016-10-07 | ||
| JP2016199419 | 2016-10-07 |
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