JP3776919B2 - バチルス属細菌を用いた植物病害の防除方法および防除剤 - Google Patents
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Description
(1)植物病原性の細菌、糸状菌またはウイルスの感染または増殖を抑制する能力を有するバチルス属に属する細菌を含む、植物病害の防除剤または防除資材。
(2)植物病原性の細菌、糸状菌またはウイルスの感染または増殖を抑制する能力を有するバチルス属に属する細菌がDAIJU-SIID2550(受託番号FERM P-19591)またはその変異株である(1)に記載の防除剤または防除資材。
(3)植物病原性細菌がアグロバクテリウム属、クラビバクター属、エルウィニア属、シュードモナス属、ラルストニア属、コリネバクテリウム属、クルトバクテリウム属、バークホルデリア属またはキサントモナス属に属する細菌であり、植物病害が該細菌よる病害である(1)または(2)に記載の防除剤または防除資材。
(4)植物病原性糸状菌が空気伝染性糸状菌または土壌伝染性糸状菌であり、植物病害が該糸状菌による病害である(1)または(2)に記載の防除剤または防除資材。
(5)植物病原性ウイルスが、タバコモザイクウイルス、トウガラシマイルドモットルウイルス、トマトモザイクウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、スイカ緑斑モザイクウイルスまたはキュウリ緑斑モザイクウイルスであり、植物病害が該ウイルスによる病害である(1)または(2)に記載の防除剤または防除資材。
(6)(1)〜(5)のいずれかに記載の防除剤または防除資材を植物病原性の細菌、糸状菌またはウイルスの宿主となる植物に施用することを含む植物病害の防除方法。
(7)植物がアブラナ科、ナス科、ウリ科、ユリ科、マメ科、キク科、アカザ科、イネ科、バラ科、ナデシコ科、サクラソウ科、ミカン科、ブドウ科、マタタビ科、カキ科、セリ科、ヒルガオ科、またはサトイモ科に属する植物である(1)に記載の方法。
(8)植物への施用方法が、細菌を植物の種子に塗布する処理、細菌を含む懸濁液に植物の種子を浸漬する処理、細菌を植物の栽培土壌に灌注する処理、細菌を植物の栽培土壌に混和する処理、細菌を植物の茎葉に散布する処理、および、細菌を植物の付傷部に接触させる処理からなる群から選択される少なくとも1つの処理を含む、(6)または(7)に記載の方法。
(9)新規バチルス属細菌DAIJU-SIID2550(受託番号FERM P-19591)株。
バー・グリシネ(Pseudomonas syringae pv. glycinea)のダイズへの感染により引き起こされる斑点細菌病(Bacterial blight)、イネ褐条病菌のトウモロコシへの感染により引き起こされる褐条病(Bacterial brown stripe)、バークホルデリア・アンドロポゴニス(Burkholderia andropogonis)のトウモロコシへの感染により引き起こされる条斑細菌病(Bacterial stripe)、エルウィニア・クリサンテミ・パソバー・ゼア、シュードモナス・マージナリスのトウモロコシへの感染により引き起こされる倒伏細菌病(Bacterial stalk rot)が挙げられるがこれらには限られない。
DAIJU-SIID2550をCM3Agar(Oxoid,英国)に植菌し、30℃で2日間培養した。その後、この菌体をDNA抽出の供試菌体とした。ゲノムDNAの抽出にはPrepMan法(Applied Biosystems、米国)を使用した。抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにより16S Ribosomal RNA遺伝子(16S rDNA)の全塩基配列1500〜1600bpの領域を増幅した。その後、増幅された16S rDNAをシークエンシングし、検体の16S rDNA塩基配列を得た。PCR産物の精製、サイクルシークエンシングには、MicroSeqFull 16S rDNA Bacterial Sequencing Kit(Applied Biosystems、米国)を使用した。サーマルサイクラーにはGeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems、米国)、DNAシークエンサーにはABI PRISM 3100 DNA Sequencer(Applied Biosystems、米国)を使用し、得られた塩基配列断片の結合にはAutoAssembler2.1(Applied Biosystems、米国)を使用した。なお、ゲノムDNA抽出からサイクルシークエンスまでの基本的操作はApplied Biosystems社のプロトコール(P/N4308132Rev.A)に従った。
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにDAIJU-SIID2550として寄託されたバチルス・アミロリクェファシエンス近縁種(受託番号FERM P-19591)(以下BAL菌と呼称)1白金耳を滅菌水9mLに懸濁させ、この懸濁液100μLを、300mL容量の三角フラスコに入れた100mLのAG培地(グルコース(和光純薬工業株式会社)1%、ポリペプトン(日本製薬株式会社)1%、KH2PO4(和光純薬工業株式会社)0.1%、MgSO4・7H2O(和光純薬工業株式会社)0.05%、pH 7.00、高圧滅菌15分間)、または、100mLの2%ショ糖加用ジャガイモ煎汁液体培地(ジャガイモ200gを賽の目に切り、約1Lの蒸留水を加えて30分〜40分弱火で煮沸し、二重のガーゼでろ過する。ろ液に2%ショ糖を加えたのち蒸留水で1Lとする。以下PS培地と呼称)に添加し、振幅10cm、120回/分の往復振とう機を用いて、25℃で144時間振とう培養した。培養開始後0時間、24時間、48時間、72時間、144時間の各時点において培養液1mLを採取した。採取された培養液試料を9mLの滅菌水に加え、良く撹拌して10倍希釈液を調製した。その後順次、試料を1mL採取して9mLの滅菌水に入れる操作を繰り返し、107〜8倍希釈液を調製した (10倍段階希釈法)。各希釈液を、径9cmシャーレ中のYPA培地(ペプトン・イースト・食塩培地)に100μLずつ分注し、コーンラージ棒で均一に塗布し25℃で72時間培養した後、生じたコロニー数を調査することにより、各培養時間におけるBAL菌数(相対値)を求めた(表1)。最大増殖時間は48時間または72時間であった。このことからBAL菌と黒腐病菌とを共存させて培養した場合には、培養後48〜72時間後に最大の防除効果が得られるものと期待される。
BAL菌をYPA斜面培地から1白金耳かき取り、300mL容三角フラスコに入れたAG培地100mLに接種し、振幅10cm、120回/分の往復振とう機を用いて25℃で48時間振とう培養した。この培養液に黒腐病菌懸濁液を100μL接種し、同様の条件で更に48時間振とう培養した。ここで使用した黒腐病菌懸濁液は、2%ショ糖加用ジャガイモ煎汁寒天培地(以下PSA)斜面培地で培養した黒腐病菌を1白金耳かき取り滅菌水9mLに懸濁して調製したものである。対照実験(無処理区)として、BAL菌を接種していないAG培地100mLに黒腐病菌懸濁液を100μL接種して同様に25℃で48時間振とう培養した。各培養液をそれぞれ段階希釈法(実施例1参照)により希釈し、各希釈倍率(10万倍、100万倍、1000万倍)につき100μLずつ径9cmのYPA平板培地に塗布し、25℃で72時間培養し、生育した黒腐病菌のコロニー数を計測した。72時間培養後のコロニー(左:100万倍、右:1000万倍希釈)の様子を図1に示す。図1中、上段が黒腐病菌のみを培養したもの、下段が黒腐病菌とBAL菌とを共存させて培養したものである。黒腐病菌コロニー数計測結果を表2に示す。このように、黒腐病菌をBAL菌と共に25℃で48時間振とう培養したとき、黒腐病菌の増殖は完全に抑制された。
チンゲンサイ種子(品種 冬賞味)34gをガーゼで包み、150倍に希釈したケミクロンG(中性次亜塩素酸カルシウム 有効塩素70%)溶液500mLに10分間浸して種子を消毒した。消毒後、種子を流水で1時間洗浄し、水分を取り除いたあと、35℃で一夜乾燥させた。一方、黒腐病菌をあらかじめ5枚のPSA平板培地で3日間培養しておき、発育した菌を全てかきとって蒸留水100mLに懸濁し菌濃度1×1012cfu/mLの黒腐病菌液を調製した。上記消毒種子17gを黒腐病菌液に20分間浸漬し、35℃で一夜乾燥させて人工汚染種子を作成した。人工汚染種子の汚染程度を確認したところ、汚染菌量は汚染種子1粒あたり105〜6cfuであり、全処理種子汚染率は100%であった。また汚染種子を滅菌土に播種したところ、高率で子葉に病斑があらわれた(図2)。図2左側は、無処理種子(対照実験)を播種した結果、右側が黒腐病菌人工汚染種子を播種した結果である。
黒腐病菌人工汚染種子に対する処理は以下のように行った。1)0.5%ジェランガム(SCOTT LABORATORIES, INC.,)水溶液50mL、または、2)1.5%寒天(和光純薬工業株式会社)水溶液50mLに、あらかじめYPA平板培地2枚で培養したBAL菌を懸濁させ、マグネチックスターラーで均一に攪拌した。この懸濁液50mL中に、実施例3で得られた黒腐病菌人工汚染種子300mgを浸漬し一夜静置したあと取り出して風乾した。対照実験(無処理区)としてBAL菌を混合していない0.5%ジェランガム水溶液50mLまたは1.5%寒天水溶液50mL中に黒腐病菌人工汚染種子を同様に浸漬し、風乾した。風乾後の種子をそれぞれYPA平板培地に置床し、25℃で72時間培養し、種子の周りに黒腐病菌が生育したか否かを調査した。調査結果をもとに、各処理区の被害を次式、
被害=黒腐病菌が周囲に生育した種子の数/置床した種子の総数
により算出した。この被害をもとに、次式により防除価を算出した。
防除価=100−(処理区の被害/無処理区の被害)×100
105℃で20分間滅菌したオカラ100mLに対して1×107cfu/mLのBAL菌培養液1mLを混和し、暗黒下、25℃で48時間培養しBAL菌オカラ培養物を得た。このBAL菌オカラ培養物500mgを滅菌水9mLに懸濁し、実施例1と同様の10倍段階希釈法により得られた各希釈液100μLを径9cmシャーレ中のYPA培地にコーンラージ棒で均一に塗布し、BAL菌オカラ培養物のBAL菌菌数を測定した。また、BAL菌オカラ培養物の一部をとり100℃で一夜乾燥させ、含水率を求めた。BAL菌オカラ培養物中のBAL菌菌数は4.3×109cfu/gであり、含水率は87.6%であった。
実施例5で得られたBAL菌オカラ培養物(水分含量87%)を35℃で一夜乾燥させ、ボールミルで粉砕してBAL菌オカラ培養物粉末とした。1)0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウム(以下CMC、 和光純薬工業株式会社)水溶液50mL、または、2)0.5%ジェランガム水溶液50mLにそれぞれBAL菌オカラ培養物粉末を500mg加え、10分間マグネチックスターラーで攪拌した。黒腐病菌人工汚染種子300mgをガーゼで包み10分間各液に浸漬し、十分に種子表面に付着させ、35℃で一夜乾燥させた。こうしてBAL菌オカラ培養物粉末コート処理種子を調製した。対照実験(無処理区)として、BAL菌オカラ培養物粉末を添加していない0.5%CMC水溶液または0.5%ジェランガム水溶液に黒腐病菌人工汚染種子を浸漬し、乾燥させた。
食用マッシュルーム培養残渣を次の手順により調製した。
切断した生稲藁を食用マッシュルーム栽培一ヶ月前に準備した。C/N比70%前後になるように大豆粕、米糠を補充し、適当な幅と高さに積み上げた。5日おきに散水しながら、腐熟するまで4回切返して堆肥とした。
滅菌土に黒腐病菌を接種して黒腐病菌汚染土(黒腐病菌1×1012 cfu/mL)を調製した。この黒腐病菌汚染土を25℃で1日静置後、この黒腐病菌汚染土1L当たり50gの割合で(10a当たり2,000kgの割合に相当)、上記の食用マッシュルーム培養残渣を混和し、25℃で5日間静置後、土壌中の黒腐病菌数を調査した。対照実験(無処理区)として、黒腐病菌による土壌汚染後、食用マッシュルーム培養残渣を混和しない土壌についても同様に黒腐病菌数を調査した。
防除価=100−(処理区の黒腐病菌数)/(無処理区の黒腐病菌数)×100
により防除価を算出したところ、84.6%であった。結果を表5にまとめる。
BAL菌をAG培地に接種し7日間振とう培養して菌濃度が1×106cfu/mLとなったBAL菌培養液に、黒腐病菌人工汚染種子200mgをガーゼで包み一定時間浸漬した。浸漬時間は10分間、20分間、40分間、60分間とした。浸漬後は種子の水気を切り、広げて35℃で一夜乾燥させた。また比較のために、BAL菌を接種していないAG培地に黒腐病菌人工汚染種子を同時間浸漬し、乾燥させた。
また無処理区として、黒腐病菌人工汚染種子を殺菌土に播種した試験区を用意した。
発病指数0:病徴なし
発病指数1:病斑面積が子葉の半分以下
発病指数2:病斑面積が子葉1枚分
発病指数3:病斑面積が子葉1.5枚分
発病指数4:病斑面積が子葉2枚分
発病指数5:枯死株
発病度=(1n1+2n2+3n3+4n4+5n5)/(5×調査個体総数)
により発病度を算出した。なお、式中の文字n1、n2、n3、n4、n5はそれぞれ、発病指数1、2、3、4、5を示した個体数を表す。
防除価=100−処理区の発病度/無処理区の発病度×100
により防除価を算出した。各処理区の防除価を表6に示す。表6からわかるように、黒腐病菌人工汚染種子をBAL菌培養液に浸漬することにより、黒腐病の発生が抑えられた。またBAL菌培養液への浸漬時間が長いほど効果が高く現れた。また、食用マッシュルーム培養残渣混合土壌を使用した試験区については、BAL菌培養液への浸漬時間が短い試験区(例えば10分間)であっても、BAL菌接種AG培地に60分間浸漬した種子を殺菌土に播種した場合とほぼ同等の防除価が得られた。
4葉期のチンゲンサイ(品種 冬賞味)9株の葉に、AG培地中で振とう培養したBAL菌培養液(菌濃度3×108cfu/mL)を霧吹きで300mL散布した。1時間ほど静置した後、黒腐病菌液を霧吹きで300mL噴霧接種した。この黒腐病菌液は、あらかじめ5枚のPSA平板培地で培養した黒腐病菌を全てかきとり、蒸留水150mLに懸濁して黒腐病菌濃度108cfu/mLの接種用黒腐病菌液としたものである。接種後の植物を湿室(湿度80%)に入れ、20℃で管理した。また比較のために、BAL菌培養液を噴霧接種したのち黒腐病菌を接種しない試験区、および、BAL菌培養液を噴霧していないチンゲンサイ9株に同濃度の黒腐病菌液を噴霧接種した試験区(無処理区)、を用意した。実験開始後26日目の地上部を図6に示す。図6において、左1列は「BAL菌接種+黒腐病菌無接種」、中1列は「BAL菌接種+黒腐病菌接種」(処理区)、右1列は「BAL菌無接種+黒腐病菌接種」(無処理区)の栽培結果である。発病調査は33日後に葉に現れた黒腐病の病徴の有無を評価することで行った。まず発病葉率(調査葉枚数に占める発病葉枚数の割合)を求め、続いて次式
防除価=100−(処理区の発病葉率/無処理区の発病葉率)×100
により防除価を算出した。結果を表7に示す。BAL菌を黒腐病菌接種前にあらかじめ噴霧処理しておくと黒腐病の発病が抑制された。この結果から、BAL菌培養液を黒腐病菌宿主の地上部に予防散布することで黒腐病の発病と伝染が抑制できることがわかる。
慣行的な殺菌・殺虫剤であるアミスター20フロアブル(シンジェンタ、アゾキシストロビン水和剤)・ジマンダイセン水和剤(ディーエーエス菱商、マンゼブ剤)、ロブラール水和剤(八洲化学、イプロジオン水和剤)、リゾレックス水和剤(住友化学、トルクロホスメチル水和剤)、スターナ水和剤(住友化学、オキソリニック酸水和剤)、ダコニール1000フロアブル(エスディーエス、TPN水和剤)、Zボルドー(日本農薬、銅水和剤)、ベンレート水和剤(住友化学、ベノミル水和剤)、リドミルMZ水和剤(シンジェンタ、マンゼブ・メタラキシル水和剤)、ベストガード水溶剤(住化武田、ニテンピラム水溶剤)、DDVP乳剤(日本農薬、DDVP乳剤)、アファーム乳剤(シンジェンタ、エマメクチン安息香酸塩乳剤)、アドマイヤー水和剤(バイエルクロップサイエンス、イミダクロプリド水和剤)、ランネート45水和剤(三共アグロ、メソミル水和剤)、パダンSG水溶剤(住化武田、カルタップ水溶剤)、モスピラン水溶剤(日本曹達、アセタミプリド水溶剤)、エルサン乳剤(日産化学、PAP乳剤)、アクタラ顆粒水溶剤(シンジェンタ、チアメトキサム水溶剤)、コテツフロアブル(日本農薬、クロルフェナピル水和剤)、トレボン乳剤(三井化学、エトフェンプロックス乳剤)をそれぞれ所定の濃度に希釈した薬液を調製し、この薬液にろ紙(東洋濾紙No.2)を浸漬し乾燥させた。続いてこのろ紙に、BAL菌を蒸留水に懸濁(2×108cfu/mL)させた懸濁液を1平方センチメートル当たり44μL噴霧し、再び乾燥させ、25℃、暗黒条件で一夜静置させた。このろ紙を5〜10ミリメートル角に切りYPA培地上で25℃暗黒条件で培養した。
BAL菌をYPA斜面培地から1白金耳かき取り、300mL容三角フラスコに入れたAG培地100mLに接種し、振幅10cm、120回/分の往復振とう機を用いて25℃で48時間振とう培養した。この培養液にかいよう病菌懸濁液を100μL接種し、同様の条件で更に48時間振とう培養した。ここで使用したかいよう病菌懸濁液は、PSA斜面培地で培養したかいよう病菌を1白金耳かき取り滅菌水9mLに懸濁して調製したものである。対照実験(無処理区)として、BAL菌を接種していないAG培地100mLにかいよう病菌懸濁液を100μL接種して同様に25℃で48時間振とう培養した。各培養液をそれぞれ段階希釈法(実施例1参照)により希釈し、各希釈倍率(10万倍、100万倍、1000万倍)につき100μLずつ径9cmのYPA平板培地に塗布し、25℃で72時間培養し、生育したかいよう病菌のコロニー数を計測した。かいよう病菌コロニー数計測結果を表9に示す。またコロニーの様子を図8に示す。このように、かいよう病菌をBAL菌と共に25℃で48時間振とう培養したとき、かいよう病菌の増殖は完全に抑制された。
BAL菌をYPA斜面培地から1白金耳かき取り、300mL容三角フラスコに入れたAG培地100mLに接種し、振幅10cm、120回/分の往復振とう機を用いて25℃で48時間振とう培養した。この培養液に青枯病菌懸濁液を100μL接種し、同様の条件で更に120時間振とう培養した。ここで使用した青枯病菌懸濁液は、PSA斜面培地で培養した青枯病菌を1白金耳かき取り滅菌水9mLに懸濁して調製したものである。対照実験(無処理区)として、BAL菌を接種していないAG培地100mLに青枯病菌懸濁液を100μL接種して同様に25℃で120時間振とう培養した。各培養液をそれぞれ段階希釈法(実施例1参照)により希釈し、各希釈倍率(100万倍、1000万倍)につき100μLずつ径9cmのYPA平板培地に塗布し、25℃で72時間培養し、生育した青枯病菌のコロニー数を計測した。青枯病菌コロニー数計測結果を表10に示す。またコロニーの様子を図9に示す。このように、青枯病菌をBAL菌と共に25℃で120時間振とう培養したとき、青枯病菌の増殖は抑制された。
BAL菌をYPA斜面培地から1白金耳かき取り、300mL容三角フラスコに入れたAG培地100mLに接種し、振幅10cm、120回/分の往復振とう機を用いて25℃で48時間振とう培養した。この培養液に軟腐病菌懸濁液を100μL接種し、同様の条件で更に96時間振とう培養した。ここで使用した軟腐病菌懸濁液は、2%ショ糖加用ジャガイモ煎汁寒天培地(以下PSA)斜面培地で培養した軟腐病菌を1白金耳かき取り滅菌水9mLに懸濁して調製したものである。対照実験(無処理区)として、BAL菌を接種していないAG培地100mLに軟腐病菌懸濁液を100μL接種して同様に25℃で96時間振とう培養した。各培養液をそれぞれ段階希釈法(実施例1参照)により希釈し、各希釈倍率(100万倍、1000万倍)につき100μLずつ径9cmのYPA平板培地に塗布し、25℃で72時間培養し、生育した軟腐病菌のコロニー数を計測した。軟腐病菌コロニー数計測結果を表11に示す。またコロニーの様子を図10に示す。このように、軟腐病菌をBAL菌と共に25℃で96時間振とう培養したとき、軟腐病菌の増殖は完全に抑制された。
白菜葉柄を水道水、蒸留水、70%エタノールの順で洗浄し、水気をキムワイプでふき取り大型ガラスシャーレに入れた。軟腐病菌(Erwinia carotovora subsp. carotovora)をYPA斜面培地で3日間培養し、蒸留水9mlに懸濁して1×107cfu/mlの菌液とした。この菌液1mlにBAL菌培養液1mlを加えよく攪拌した後、木綿針8本を浸し白菜葉柄に傷をつけて接種した。接種後は乾かないようにパラフィンフィルムでガラスシャーレをシールして30℃のインキュベーターに1晩静置した。対照実験(無処理区)として菌液1mlに蒸留水1mlを混合した液を同様に針接種した。調査は被害率を軟化腐敗の見られない葉柄切片を−、軟化腐敗している葉柄切片を+として評価した。また、次式により防除価を算出した。防除価=100−(処理区の発病率/無処理区の発病率)×100。結果を表12に示す。また実験開始後1日目の様子を図11に示す。
人工汚染籾調整のための培養液はイネ苗立枯細菌病菌(社団法人日本植物防疫協会保存菌)をPPG培地(ジャガイモ 200g、リン酸二ナトリウム12水和物(wako) 3g、リン酸二カリウム(wako) 0.5g、ペプトン 5g(日本製薬株式会社) 5g、塩化ナトリウム(wako) 3g、グルコース(wako) 5g、蒸留水 1リットル)で3日間、25℃で振盪培養した。汚染させる籾はあらかじめケミクロンG(日本曹達株式会社)250倍液で30分間浸漬消毒し、その後流水で45分間水洗し乾燥させた籾を使用した。100ml容ビーカーに種子15g、該菌を含む培養液を30ml入れ、真空ポンプ(yamato MINIVAC PS-22)を用い減圧下で汚染させた。
BAL菌培養液の原液と5倍希釈(発芽試験時の最終濃度としては2倍希釈、10倍希釈)したもの及び対照区として蒸留水をサンプルとした。PS培地(ジャガイモ煎汁液に砂糖2%を加用した培地)に懸濁したイネいもち病菌の胞子(砂糖加用オートミール寒天培地で菌荘を生育させBLB照射で形成)とサンプルから各々20μLをホールスライドグラスにとりよく混合し25℃で24時間湿室に静置した後、顕微鏡を用いて発芽管の有無を観察した。サンプル混合24時間後のイネいもち病菌胞子を図13に示す。培養液を混合したものは原液、5倍希釈ともにイネいもち病菌胞子の発芽が抑制されており、発芽した胞子は観察されなかった。
YPA培地(0.5%酵母エキス(日本製薬株式会社)、1%ポリペプトン(日本製薬株式会社)、0.5%塩化ナトリウム、pH 7.00、高圧滅菌20分間)100mLを入れた300mL容量の三角フラスコに、YPA斜面培地で培養したBAL菌を1白金耳植菌した後、25℃で72時間、振とう培養(120回/分)した。得られた培養液の原液、5倍希釈液、10倍希釈液をサンプルとした。また蒸留水を用いて同様に処理したものを無処理区とした。蒸留水に懸濁したイネごま葉枯病菌(PSA培地にイネごま葉枯病菌の前培養菌を植菌し、25℃下で7〜10日間培養して形成)の胞子をサンプル1mLに対して100μL加えてよく撹拌したものをホールスライドグラスに50μLとり25℃で24時間湿室に静置した後、顕微鏡を用いて発芽管の有無及び形状をを観察した。サンプル混合24時間後のごま葉枯病菌胞子を図14に示した。培養液の原液では胞子が発芽せず、5倍希釈・10倍希釈では発芽管の伸長が抑制され膨潤奇形を起こしており、発芽管の伸長は観察されなかった。
人工気象機内で育成した6〜7葉期のイネ(品種:日本晴)にBAL菌培養液あるいは対照区として蒸留水を散布し、25℃、16時間日長下で24時間経過後に、イネごま葉枯病菌(Cochliobolus miyabeanus)胞子懸濁液を噴霧接種した。この胞子懸濁液は、イネごま葉枯病菌(Cochliobolus miyabeanus)を予めPSA培地で培養し、培養シャーレに蒸留水を注ぎ筆で菌叢を擦って胞子を洗い落とし、二重にしたガーゼでろ過した後、胞子濃度が顕微鏡の100倍の視野当たり10個の割合となり、且つTween20を0.02%含むように調製したものである。接種後、イネにプラスチック容器を被せて気温25℃の湿室とし24時間静置した。接種6日後に接種時の完全展開葉の全病斑数と葉面積を計測し1cm2当たりの平均病斑数を算出し、その数値を基に次式、
防除価=100−(処理区の平均病斑数)/(対照区の平均病斑数)×100
により防除価を求めた。結果を表15に示す。BAL菌培養液の防除価は89.7となり、イネごま葉枯病を抑制できることが示された。
キュウリの子葉部を胚軸部分から切り取り、水を含ませたペーパータオルを敷いた容器中に切断面をペーパータオルにつけるように置いた。あらかじめ灰色かび病菌を2%ショ糖加用ジャガイモ煎汁寒天培地(PSA)上で生育させ、BLB照射下で形成させておいた胞子を2%グルコース加用ジャガイモ煎汁培地(PG)に懸濁した。懸濁液の胞子密度を2×107個/mLに調整した後、1区当たり10枚の子葉の中央に50μL滴下しペーパーディスク(東洋濾紙 抗生物質検定用 厚手 径8mm)をその上に接着させた。更にペーパーディスクの上からBAL菌培養液または対照として蒸留水あるいはイプロジオン水和剤(ロブラール) (希釈倍率1000倍)を50μL滴下した後、容器を密閉し20℃、16時間日長下に置いた。
防除価=100−(処理区の平均褐変径)/(蒸留水の平均褐変径)×100
により算出した。接種3日後の子葉の褐変の様子を図12に、褐変径の子葉10枚の平均を表16に示した。培養液を滴下したものは対照区に比較し明らかに褐変径が小さく、従ってキュウリ灰色かび病が抑制されていた。
ビニールハウス内で2004年4月28日に催芽させたキュウリ(品種:松風)を育苗し、本葉2枚展開時の幼苗にBAL菌培養液あるいは対照区として蒸留水またはダコニール1000(希釈倍率1000倍)を十分量散布した。25℃で5時間後経過し散布液が乾いた後に、予めPSA培地で培養し、シャーレに蒸留水を注ぎ筆で菌叢を擦って胞子を洗い落とし、二重のガーゼでろ過し胞子濃度105個/mLに調製したキュウリ褐斑病菌(Corynespora casiicola:武蔵野種苗園 病理バイテク研究室保存菌)胞子懸濁液を噴霧接種した。接種後、キュウリにプラスチック容器を被せて湿室とし気温25℃下で、24時間静置後、25℃で16時間日長下で管理した。接種20日後に接種時の完全展開葉の全病斑数を計測し1枚当たりの平均病斑数を求め、その数値を基に次式、
防除価=100−(処理区の平均病斑数)/(無処理区の平均病斑数)×100
により防除価を求めた。結果を表17に示す。表17において、1−1、1−2、2−1、2−2はそれぞれ、1個体目の第1葉、1個体目の第2葉、2個体目の第1葉、2個体目の第2葉を示す。また各処理区の実験開始後20日目の様子を図16に示す。BAL菌培養液およびダコニール1000の防除価はともに100となり、ダコニール1000と同程度にキュウリ褐斑病を抑制できる。
BAL菌をYPA斜面培地から1白金耳かき取り、300mL容三角フラスコに入れたおから抽出培地100mLに接種し、振幅10cm、120回/分の往復振盪機を用いて25℃で4日間振盪培養した。このBAL菌培養液をカブ(品種 夏蒔13号小蕪、播種日2004年3月10日、接種時生育度 本葉3枚、径75mmクロポリ鉢で20日間栽培)の葉面に小型ハンドスプレーで均一に噴霧し、25℃下の湿室に24時間置いた。予めPSA平板培地で培養しておいた黒斑病菌(Alternaria brassicae、株式会社武蔵野種苗園 病害・バイテク研究室保存菌)の胞子を蒸留水に懸濁し、この懸濁液をカブの葉面に小型ハンドスプレーで均一に噴霧後、25℃下の湿室に24時間置き、病徴が現れるまで20℃で管理した。接種時の胞子懸濁液濃度は、200倍で1視野40個程度になるよう希釈した。対照として、BAL菌培養液の代わりに水を噴霧する区(無処理区)、既存の防除剤としてイプロジオン水和剤の1000倍液を噴霧する区を設けた。調査は、以下の発病指数に基づき、各処理個体につき3枚ずつ行った。
発病指数1:病徴面積が葉面積の25%以下
発病指数2:病徴面積が葉面積の25%〜50%
発病指数3:病徴面積が葉面積の50%以上
発病指数4:枯死株
発病度=(1n1+2n2+3n3+4n4)/(4×調査個体総数)
により発病度を算出した。なお、式中の文字n1、n2、n3、n4はそれぞれ、発病指数1、2、3、4を示した個体数を表す。
算出された発病度から次式、
防除価=100−処理区の発病度/無処理区の発病度×100
により防除価を算出した。
BAL菌をYPA斜面培地から1白金耳かき取り、300mL容三角フラスコに入れたおから抽出培地100mLに接種し、振幅10cm、120回/分の往復振盪機を用いて25℃で4日間振盪培養した。このBAL菌培養液をチンゲンサイ(品種 福賞味、播種日2004年2月12日、接種時生育度 本葉5枚、径75mmクロポリ鉢で30日間栽培)の葉面に小型ハンドスプレーで均一に噴霧し、25℃下の湿室に24時間置いた。更に、25℃下に24時間置いた後、育種圃場でコマツナに自然発病した白さび病菌(Albugo macrospora)の分生子層から採種した遊走子のうを蒸留水に懸濁し、小型ハンドスプレーで噴霧接種後、11℃下の湿室に24時間静置した。接種時の遊走子のう懸濁液濃度は、200倍で1視野30個程度になるよう希釈した。病徴が現れるまで、夜間のみトンネル、加温のハウスで管理した。対照として、BAL菌培養液の代わりに水を噴霧する区(無処理区)を設けた。各処理個体とも接種時の葉身2枚における単位面積当たりの分生子層数を調査した。この調査結果から、処理区の防除価を次式、
防除価= 100−(処理区1cm2の分生子層数/無処理区1cm2の分生子層数)×100
により算出した。
エコブラン資材(千葉製粉株式会社販売のフスマ堆肥:N 29%、P2O5 38%、K2O 2.0%、有機物52.5%、水分35〜40%、pH7.5、CN比10)40g、米ぬか10gをよく混合し、121℃で1時間高圧滅菌し、24時間後に更にもう1度同条件で高圧滅菌を行った。この滅菌資材に滅菌水30ml、珪藻土で10倍希釈したBAL菌オカラ培養粉末(実施例6参照)0.6gを加えよく混和し、30℃下に4日間置いたものをBAL菌培養資材とした。予めPSA平板培地で前培養しておいたカブ萎黄病菌(Fusarium oxysporum f.sp. raphani、株式会社武蔵野種苗園 病害・バイテク研究室保存菌)を5mm角の大きさに切り取り、300mL容三角フラスコに入れたPG培地100mLに接種し、振幅10cm、120回/分の往復振盪機を用いて25℃で5日間振盪培養した。培養液は2重ガーゼでろ過後、3000rpmで10分間遠心分離し、胞子を集めた。この胞子を蒸留水に懸濁、同条件で遠心分離し沈殿を回収することを2回繰り返して洗浄した。この沈殿を蒸留水に懸濁し滅菌土に均一に混合して、カブ萎黄病菌胞子を2×107個/ml含む汚染土を作成、25℃下に24時間置いた後、BAL菌培養資材を500kg/10aになるように十分混和し(1×107cfu/gのBAL菌を含む)、25℃下に6日間置き、カブ(品種 夏蒔13号小蕪)を2004年5月20日に播種、25℃下で管理した。比較のために、滅菌土、BAL菌培養資材を含まない汚染土(無処理区)、汚染土に播種後ベノミル水和剤の1000倍液3L/m2を灌注する化学防除剤区を併せて試験した。播種18日後に子葉の黄化枯死の程度を調査した。
発病度=発病株数/調査個体総数
により発病度を算出した。
算出された発病度から次式、
防除価=100−処理区の発病度/無処理区の発病度×100
により防除価を算出した。
エコブラン資材(実施例13に記載)40g、米ぬか10gをよく混合し、121℃で1時間高圧滅菌し、24時間後に更にもう1度同条件で高圧滅菌を行った。この滅菌資材に滅菌水30ml、珪藻土で10倍希釈したBAL菌オカラ培養粉末(実施例6参照)0.6gを加えよく混和し、30℃下に7日間置いたものをBAL菌培養資材とした。この資材を1t/10aになるよう滅菌土に混合し(5×107cfu/gのBAL菌を含む)、暗黒下25℃に10日間静置した。PSA平板培地で2日間培養した苗立枯病菌(Rhizoctonia solani AG−4,IIIA苗立枯病系、株式会社武蔵野種苗園 病害・バイテク研究室保存菌)をコルクボーラーで打ち抜き、その菌叢片をアイスクリームカップ(縦7cm、横7cm、高さ5cm)の底面に等間隔に3菌叢片ずつ置いた。BAL菌培養資材を混ぜた滅菌土125mlを菌叢片を被覆するように充填し、ベントグラス(雪印製)100mgを播種し、28℃の人工気象室で管理した。対照区として苗立枯病菌無接種の滅菌土(滅菌土)、苗立枯病菌を接種した滅菌土(無処理)も同様に播種、管理した。播種後11日目に、生存株数を調査し、滅菌土における生存株数を各試験区共通の播種株数として、次式より生存株率及び枯死株率を求めた。
枯死株率=100−生存株率
防除価=100−(処理区の枯死株率/無処理区の枯死株率)×100
により防除価を算出した。
TMV病葉4g(生重)を乳鉢に入れ、1/15M リン酸緩衝液 pH6.98 10ml中で磨砕し接種汁液とした。この汁液を50ml容ファルコンチューブ2本に均等に分け、リン酸緩衝液で50mlに調製した。500ml容ビーカーに、乾燥させた殺菌土100ml、米ヌカ1.25g(500kg/10a相当)、汁液50mlを入れた。BAL菌処理区として、おから抽出液で振盪培養した培養液20mlを3000rpmで30分間遠心分離したBAL菌をリン酸緩衝液50mlに懸濁し、上記土壌に入れガラス棒でよく混合した。無処理区としてリン酸緩衝液50mlを混合した。土壌表面をビニールで被覆し、ビーカーをラップで覆い、口を紐で止めて簡易ソーラー法の実用化をふまえて38℃設定のインキュベーター内に静置した。処理してから4日目にそれぞれの処理区から3gの土壌をビーカーに取り、静置し上清を本葉8枚に育ったTMV判別植物であるニコチアナ・グルチノーサ(Nicotiana glutinosa)にカーボランダム法で接種した(植物病理学実験法 佐藤昭二、後藤正夫、土居養二編 講談社)。ニコチアナ・グルチノーサは20℃の人工気象室で管理し、接種後6日目に葉に現れた局部病斑数を数え、葉面積を測定し単位面積あたりの局部病斑数を元にして次式により防除価を算出した。
結果を表22に示す。また図21には発病時の様子を示す。
メロン種子(品種 アールス雅)20粒を9cmシャーレにろ紙1枚敷き蒸留水を4.25ml入れた上に置床し、25℃で2日間催芽させた。25穴セルにクレハ園芸培土を50ml詰め、催芽させた種子を播種し、滅菌土50mlで覆土した。育苗は25℃の人工気象室内で行った。試験に使用した接種源は−30℃で凍結保存しておいたメロンえそ斑点病感染葉(ウイルス起源は長崎県諫早市圃場のウイルス系統)2gを乳鉢に入れ、1/15M リン酸緩衝液 pH6.98 10ml中で磨砕した。磨砕液はガーゼ2重でろ過し、以下の試験に用いた。
結果を表23に示す。また図21には発病時の様子を示す。
Claims (8)
- 植物病原性の細菌、糸状菌またはウイルスの感染または増殖を抑制する能力を有するDAIJU-SIID2550(受託番号FERM BP-10114)を含む、植物病害の防除剤または防除資材。
- 植物病原性細菌がアグロバクテリウム属、クラビバクター属、エルウィニア属、シュードモナス属、ラルストニア属、コリネバクテリウム属、クルトバクテリウム属、バークホルデリア属またはキサントモナス属に属する細菌であり、植物病害が該細菌による病害である請求項1に記載の防除剤または防除資材。
- 植物病原性糸状菌が空気伝染性糸状菌または土壌伝染性糸状菌であり、植物病害が該糸状菌による病害である請求項1に記載の防除剤または防除資材。
- 植物病原性ウイルスが、タバコモザイクウイルス、トウガラシマイルドモットルウイルス、トマトモザイクウイルス、メロンえそ斑点ウイルス、スイカ緑斑モザイクウイルスまたはキュウリ緑斑モザイクウイルスであり、植物病害が該ウイルスによる病害である請求項1に記載の防除剤または防除資材。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の防除剤または防除資材を植物病原性の細菌、糸状菌またはウイルスの宿主となる植物に施用することを含む植物病害の防除方法。
- 植物がアブラナ科、ナス科、ウリ科、ユリ科、マメ科、キク科、アカザ科、イネ科、バラ科、ナデシコ科、サクラソウ科、ミカン科、ブドウ科、マタタビ科、カキ科、セリ科、ヒルガオ科、またはサトイモ科に属する植物である請求項5に記載の方法。
- 植物への施用方法が、細菌を植物の種子に塗布する処理、細菌を含む懸濁液に植物の種子を浸漬する処理、細菌を植物の栽培土壌に灌注する処理、細菌を植物の栽培土壌に混和する処理、細菌を植物の茎葉に散布する処理、および、細菌を植物の付傷部に接触させる処理からなる群から選択される少なくとも1つの処理を含む、請求項5または6に記載の方法。
- 新規バチルス属細菌DAIJU-SIID2550(受託番号FERM BP-10114)株。
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