JP7137802B2 - バチルス属細菌の培養方法および有用物質の製造方法 - Google Patents

バチルス属細菌の培養方法および有用物質の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、バチルス属細菌の培養方法に関する。
食品、医薬、畜産等の多くの分野において、バチルス属細菌またはバチルス属細菌が生産する有効成分が広く利用されている。特に生菌を有効成分とする微生物農薬や整腸剤においては、バチルス属細菌を芽胞の状態で流通、利用することが耐久性や安定性の面から一般的であるとされる。
一般的にバチルス属細菌の培養には主に糖などの炭素源、アミノ酸や無機アンモニウム塩などの窒素源およびミネラルなどを含む液体培地が使用される。
非特許文献1においては、これらの成分を含む液体培地で回分培養法によりバチルス属細菌を培養した際に、芽胞が3.5E+09spore/ml程度得られたことが開示されている。
特許文献1においては、糖類、酵母エキス、コーン浸漬液乾燥物、大豆ペプトンおよび濃縮焼酎かすをそれぞれ最大で5、10、20、10、20％含む培地で、対数増殖期以降の酸素濃度を10%以下にする工程を含む条件で培養することで高濃度のバチルス属細菌の芽胞を得ることができたことが示されている。しかし、バチルス属細菌の増殖には酸素が系中に十分に存在することが望ましく、またバチルス属細菌の中には対数増殖期に低酸素条件下で培養すると生育不良を起こす菌株も存在するため、この方法を適用できる菌は限られている。
特許文献2においては、プロテアーゼを産生するバチルス属細菌を糖源原料および窒素源を高濃度に含む培地で培養し、プロテアーゼを高生産する方法が示されているが、この方法では回分培養法により培養が行われており、一度に得られるプロテアーゼ量には限りがある。
通常、より高濃度の芽胞や代謝物を一挙に得ようとする場合、培地中の栄養基質濃度を上げて培養する方法が一般に適用され、バチルス属細菌が資化し得る基質を増やして培養していくとそれに比例して菌濃度や代謝物は増加するが、ある一定の濃度を超えて培養すると酸素要求量の増大に培養系の酸素供給能力が追い付かなくなって生育不良を起こしたり、培養に要する時間が長期化する等の問題が生じる。特にグルコースが20g/Lを超える培地でバチルス属細菌を培養した場合、芽胞の形成が阻害されることも非特許文献1で報告されている。
そこで、バチルス属細菌の芽胞形成を阻害することなく、一度に高濃度のバチルス属細菌の芽胞や代謝物を得るために、流加培養（半回分培養）が行われる。この手法では培養過程で消失した栄養基質を適切な濃度および適切なタイミングで添加することで、添加しなった場合と比べて高濃度の菌体や代謝物を得ることができる。
非特許文献1では流加培養により、回分培養時よりも大幅に菌体の生産性が向上し、高濃度のバチルス細菌の芽胞が得られたことが開示されている。しかし、この文献においては、グルコースが20g/L以上含まれる培地では芽胞化が阻害されることが示されており、培養開始時の糖濃度を低くし、糖源原料及び窒素源が低濃度で推移するように流加しているが、これにより、添加時間が長期化し最終的に60時間もの培養時間が必要となってしまっている。また、ここで用いられている培地成分は、化学的に純粋な化合物を組み合わせた培地、即ち完全合成培地を用いており、産業利用のために大規模にバチルス属細菌を培養して芽胞を得るためには多大なコストがかかってしまう。そのため、例えば食品などの大規模な製造の工程で排出される残渣、あるいは脱脂大豆粉や酵母エキスなど、製造に大きな労力を要しない混合物からなる原料を用いて培養することが望ましいが、これらを高濃度に含む培地を用いてバチルス属細菌芽胞を効率的に得る方法についてはこれまでに報告例がない。
特許文献3においては、培養中のグルコースの消費に応じて、グルコースを終濃度が1%となるように一定間隔で培地に流加する方法が示されているが、バチルス属細菌の培養においては糖類の流加だけでなく窒素含有化合物を同時に添加する方が増殖に有利である。
特許文献4においては、3-ヒドロキシ酪酸の産生のためにBacillus licheniformisを糖を高濃度に含み、炭素原子と窒素原子の重量比（C/N比）が12.4～24で構成される培地で流加培養を行う方法が示されているが、バチルス属細菌の芽胞を高濃度に得るためには糖を必要以上に高濃度に含む培地で培養することは適切ではない。
特開2007-236286号公報 特開平11-103855号公報 特開平06-254584号公報 特表平09-502097号公報
Advances in Microbiology, 2014, 4, 444-454
上記の通り、高濃度のバチルス属細菌の芽胞や代謝物などの有用物質を液体培養により短時間で得るためには、バチルス属細菌が高濃度の芽胞や代謝物を生成する上で必要な培養基質が過不足なく供給される条件のもと培養する必要があり、これらを満たす新たな条件を見出す必要があった。したがって、本発明は、一般的な細菌用液体培地では高濃度に芽胞や代謝物を得ることが難しいバチルス属細菌について、効率的に芽胞や代謝物などの有用物質を生産できる培養方法を提供することを課題とする。
本発明は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、培養初期の糖源原料の濃度が高い培地に対し、糖または糖源原料を含む炭素源と、アンモニウム塩やアンモニアあるいは脱脂大豆粉やコーン浸漬液等を含む窒素源を一定の組成比内に設定した培地を供給して流加培養を行うことで、バチルス属細菌の生育を阻害することなく増殖させ、かつ、従来の方法では得られなかった高濃度のバチルス細菌芽胞や代謝物などの有用物質を得ることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は以下のとおりである。
[１]培養開始時の糖または糖源原料の濃度が50.1g/L～100g/Lである液体培地でバチルス属細菌を培養し、培養途中で、糖または糖源原料および含窒素化合物を含み、炭素原子と窒素原子の重量比（C/N比）が5.5～13.5である流加培地を前記液体培地に供給して培養することを特徴とする、バチルス属細菌の培養方法。
[２]炭素原子と窒素原子の重量比（C/N比）が5.5～12である流加培地を前記液体培地に供給して培養することを特徴とする、[１]に記載のバチルス属細菌の培養方法。
[３]培養終了時までに流加培地により供給される糖または糖源原料の総量が、流加前の培地１Ｌあたり、100g以下である、[１]または[２]に記載のバチルス属細菌の培養方法。
[４]前記流加培地の供給を、バチルス属細菌の酸素消費速度が最大となる時点の前後７時間の間で行う、[１]～[３]のいずれかに記載のバチルス属細菌の培養方法。
[５]前記流加培地の供給を、培養開始後３時間～３０時間の間で行う、[１]～[４]のいずれかに記載のバチルス属細菌の培養方法。
[６]前記流加培地は糖または糖源原料および含窒素化合物を含む溶液を加熱滅菌して得られたものである、[１]～[５]のいずれかに記載のバチルス属細菌の培養方法。
[７]糖または糖源原料が非還元糖である、[１]～[６]のいずれかに記載の方法。
[８]非還元糖が、スクロース、トレハロース、ケストース、メレチトース、ゲンチアノース、ネオビフルコース、フンギテトラオース、プランテオース、ラフィノース、スタキオースおよびビフルコースからなる群から選択される少なくとも1種である、[７]に記載のバチルス属細菌の培養方法。
[９]含窒素化合物が、アンモニウム塩、アンモニアからなる無機窒素化合物群および、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、尿素、脱脂大豆粉、大豆由来成分、酵母由来成分、コーン浸漬液、コーン浸漬液乾燥粉末、コーン由来成分、動植物タンパク質またはその分解物からなる有機窒素化合物群より少なくとも１種選択される、[１]～[８]のいずれかに記載のバチルス属細菌の培養方法。
[１０]液体培地の溶存酸素濃度を10％以上に保持することを特徴とする、[１]～[９]のいずれかに記載のバチルス属細菌の培養方法。
[１１]液体培地の温度を20～60℃の間で制御しバチルス属細菌の増殖をコントロールする、[１]～[１０]のいずれかに記載のバチルス属細菌の培養方法。
[１２]バチルス属細菌の対数増殖期に２８～３２℃で培養を行い、その後、３５～３９℃で培養を行う、[１１]に記載のバチルス属細菌の培養方法。
[１３] バチルス属細菌がバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス レンタス（Bacillus lentus）、バチルス ラテロスポルス（Bacillus laterosporus）、バチルス アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・サイアメンシス（Bacillus siamensis）、バチルス ロータス（Bacillus lautus）、バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）、バチルス・ピチノティ（Bacillus pichinotyi）、バチルス・アシドカルダリウス（Bacillus acidocaldarius）、バチルス・アルカリコラ（Bacillus alkalicola）、バチルス・アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・バタビエンシス（Bacillus bataviensis）、バチルス・シクロヘプタニカス（Bacillus cycloheptanicus）、バチルス・ アネウリニリティカス（Bacillus aneurinilyticus）、バチルス・ミグラヌス（Bacillus migulanus）、バチルス・アビッサリス（Bacillus abyssalis）、バチルス・アエスツアリイ（Bacillus aestuarii）、バチルス・ポリミグザ（Bacillus polymyxa）、またはバチルス・エスピー（Bacillus sp.）からなる群より選択される、[１]～[１２]のいずれかに記載のバチルス属細菌の培養方法。
[１４][１]～[１３]のいずれか一項に記載の培養方法を用いて、前記液体培地中に有用物質を生成させることを特徴とする、有用物質の製造方法。
[１５]前記有用物質がバチルス属細菌の芽胞である、[１４]に記載の有用物質の製造方法。
[１６]前記有用物質がバチルス属細菌の代謝物である、[１４]に記載の有用物質の製造方法。
[１７]前記代謝物が環状リポペプチドである、[１６]に記載の有用物質の製造方法。
[１８]前記環状リポペプチドが、イツリン、サーファクチン、プリパスタチン、フェンジシン、バシロマイシン、リチェニシン、クルスタキン、マイコサブチリン、コリスチン、フザリシジン、パエニバクテリン、ポリミキシンおよびピュミラシジンからなる群から選択される少なくとも１種である、[１７]に記載の有用物質の製造方法。
本発明によれば、バチルス属細菌を高濃度に増殖させ、高い割合で芽胞や代謝物などの有用物質を生成させることができる。
本発明のバチルス属細菌の培養方法は、培養開始時の糖または糖源原料の濃度が50.1g/L～100g/Lである液体培地でバチルス属細菌を培養し、培養途中で、糖または糖源原料および含窒素化合物を含み、炭素原子と窒素原子の重量比（C/N比）が5.5～13.5である流加培地を前記液体培地に供給して培養することを特徴とする。
本発明のバチルス属細菌の培養方法を用いることにより、液体培地中に高い割合で芽胞や代謝物などの有用物質を生成させることができる。
本発明において、バチルス属細菌としてはバチルス属に分類される細菌であれば特に制限されないが、例えば、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス レンタス（Bacillus lentus）、バチルス ラテロスポルス（Bacillus laterosporus）、バチルス アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・サイアメンシス（Bacillus siamensis）、バチルス ロータス（Bacillus lautus）、バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）、バチルス・ピチノティ（Bacillus pichinotyi）、バチルス・アシドカルダリウス（Bacillus acidocaldarius）、バチルス・アルカリコラ（Bacillus alkalicola）、バチルス・アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・バタビエンシス（Bacillus bataviensis）、バチルス・シクロヘプタニカス（Bacillus cycloheptanicus）、バチルス・ アネウリニリティカス（Bacillus aneurinilyticus）、バチルス・ミグラヌス（Bacillus migulanus）、バチルス・アビッサリス（Bacillus abyssalis）、バチルス・アエスツアリイ（Bacillus aestuarii）、バチルス・ポリミグザ（Bacillus polymyxa）、またはバチルス・エスピー（Bacillus sp.）が挙げられる。
本発明において、有用物質とは、動植物生育促進作用、殺菌・静菌作用、遺伝子活性化作用等の生理活性を示す物質、各種酵素、乳酸、アミノ酸など産業上活用しうる物質、納豆やヨーグルトなど食品等として用いられる発酵物そのものを意味し、具体的には、バチルス属細菌の芽胞や、バチルス属細菌の代謝物が挙げられる。バチルス属細菌の代謝物は、培養により生産される生菌以外の有効成分であり、抗菌性や界面活性作用を有する環状ペプチドや、プロテアーゼ、リパーゼといった酵素が挙げられる。
バチルス属細菌の代謝物である環状リポペプチドとしては、イツリン、サーファクチン、プリパスタチン、フェンジシン、バシロマイシン、リチェニシン、クルスタキン、マイコサブチリン、コリスチン、フザリシジン、パエニバクテリン、ポリミキシンおよびピュミラシジンからなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
バチルス属細菌の培養に使用される培地は少なくとも炭素源と窒素源を含む。
培養に用いる炭素源はバチルス属細菌が異化しうるものを使用することができるが、異化可能な炭素源して、バチルス属細菌が異化しうる糖（グルコース、ラクトース、グリセロール、アラビノース、リボース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、セロビオース、マルトース、スクロース、トレハロース、キシリトールなど）もしくは糖源原料が例示される。糖源原料とは、バチルス属細菌を含む多くの微生物が生産するアミラーゼやセルラーゼ等の酵素により上述の異化しうる糖を遊離する基質であり、デンプン、セルロース、ペクチン、キチンなどの多糖および稲わら、麦わら、もみ殻、食品廃棄物、建設発生木材、製材工場残材などのバイオマスを例とする原料を指す。この中では、非還元糖が好ましく、具体的には、スクロース、トレハロース、ケストース、メレチトース、ゲンチアノース、ネオビフルコース、フンギテトラオース、プランテオース、ラフィノース、スタキオースおよびビフルコースからなる群から選択される少なくとも1種の非還元糖が例示される。
培養に用いる窒素源はバチルス属細菌が異化しうるものを使用することができるが、異化可能な窒素源として、アミノ酸、ペプチド、動植物タンパク質およびその分解物、尿素、脱脂大豆粉などの大豆由来成分、酵母由来成分、コーン浸漬液、コーン浸漬液乾燥粉末、コーン由来成分、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アンモニア、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の含窒素化合物が例示される。
その他の培地成分としては、芽胞形成や代謝物などの有用物質の生産に悪影響を及ぼさない限り、バチルス属細菌の培養に通常使用される微量金属塩等の培地成分を添加してもよく、さらに、必要に応じて、アミノ酸またはビタミン等を添加することができる。
培養開始時の培地に含まれる糖または糖源原料の量は50.1～100g/Lである。バチルス属細菌の培養において、糖または糖源原料をこのような高い濃度で含む培地で培養することで、培養初期に増殖がより活発なバチルス属細菌を得ることができる一方、これら糖または糖源原料は増殖時に効率よく消費されるため、培養後期には残存せず、効率よく芽胞形成や代謝物などの有用物質の生産を誘導することができる。なお、50.1g/L未満の濃度の培地で培養すると、早期に糖源が消費され尽くしてしまい、十分な増殖が得られないうちに芽胞化が進行してしまう。また100g/Lより高濃度の培地で培養すると生育や芽胞形成に対して阻害的に働くため、上記の範囲内の糖または糖源原料を含んだ培地組成で培養することが必要である。
培養開始時の培地に含窒素化合物の量は好ましくは8～72g/Lであり、培養開始時の培地のC/N比は好ましくは5.5～13.5である。
培養途中で供給される流加培地も上記の糖または糖源原料および含窒素化合物を含む培地が使用できるが、本発明においては流加培地中の炭素原子と窒素原子の重量比（C/N比）が5.5～13.5、好ましくは5.5～12となるように調整される。この範囲にC/N比を調整することで、細菌の生育を阻害することなく高濃度の芽胞生産や代謝物などの有用物質の生産が実現できる。一方、糖または糖源原料の比率が多い（C/N比が13.5を超える）培地で培養した場合、培養終期に培地中に糖または糖源原料が残存してしまう。この残存糖はバチルス属細菌生細胞の芽胞化を阻害することがわかっている。また、窒素源化合物の比率が多い（C/N比が5.5未満の）培地で培養した場合、生育に必要な炭素源が不足し増殖に不利である。
なお、C/N比は以下の通り算出される。
C/N比＝各培地成分に含まれる炭素含量の合計÷各培地成分に含まれる窒素含量の合計。
培地成分のうち天然系原料の炭素含量は、それぞれ全糖量の40%重量および全タンパク質量の50%重量として概算できる。全糖量は、酸中で100℃、2.5時間加水分解後、ソモギー法にて還元糖濃度として定量できる。全タンパク質量はまずケルダール法による全窒素量の定量後、換算係数6.25を乗じることで概算できる。
培養終了時までに流加される培地の量は特に制限されないが、流加培地により供給される糖または糖源原料の総量が、流加前の培地１Ｌあたり、100g以下となるようにすることが好ましい。
流加培地は非還元糖または非還元糖を含む糖源原料および含窒素化合物を含む溶液を加熱滅菌して得られたものであることが好ましい。
培地成分については通常、培養開始前にオートクレーブなどの加熱滅菌処理を施すが、還元性を有する糖と窒素源が共存する条件でオートクレーブを行うとそれらが基質となってメイラード反応を起こし、生育に必要な栄養成分が他の化合物へと変換されてしまい、本来の栄養源としての機能を失ってしまう。これにより、バチルス属細菌は効率的な増殖が困難となり、十分な菌体や代謝物などの有用物質が得られなくなってしまう。そのため、糖源と窒素源は別々に加熱滅菌を行い、十分に冷却されたのちに両者を混合し、培養に供する方法が一般的である。この混合工程では、滅菌状態が保たれた系を開放することから、コンタミネーションのリスクが向上し、また、必要となる設備や作業工程も増えてしまう。
これに対し、本発明の方法では、スクロースなどの非還元糖を用いることにより、炭素源と窒素源を同時に加熱滅菌してもメイラード反応等を起こさないため、培地の調製が容易である。
流加培地の供給は、１回のみの供給でもよいし、複数回、例えば、２～６回にわたり断続的に供給してもよいが、栄養源の消費速度に合わせて連続的に流加培地の供給を行うことが好ましい。
流加培地の供給は、バチルス属細菌の増殖が活発で酸素や栄養源の消費がより活発な時点に行うことが望ましい。培養初期に添加を始めると栄養濃度が高くなり、増殖が活発になって急激に酸素が消費されて酸素供給が不十分になったり、浸透圧効果により生育不良を起こしてしまう。また、増殖が活発な時期を過ぎた後に流加を行って十分な芽胞や代謝物などの有用物質を得ようとした場合、より長い培養時間を要してしまう。一般に芽胞は栄養が不足状態になると形成されるため、流加を培養後期まで続けると培地中に培養基質が多量に残存することになり、芽胞が形成されない。したがって、例えば、流加培地の投与を、微生物の酸素消費速度が最大となる時点（例えば、培養開始８時間経過時点）の前後７時間の間で行うことが好ましく、培養開始後３時間～３０時間の間で行うことが好ましい。より好ましくは、培養開始後５～２０時間で流加培地の投与を開始し、培養開始後１３～２５時間の間で流加培地の投与を終了する。なお、トータルの培養時間としては例えば２４～４８時間である。
なお培養液中の溶存酸素濃度は、隔膜ガルバニ電極式センサー等により、リアルタイムでモニタリングができる。
培養条件としては、通常のバチルス属細菌の液体培養に使用される条件であればよいが、例えば、２０～６０℃、好ましくは２０～４０℃に制御し、バチルス属細菌の増殖をコントロールすることが好ましい。例えば、対数増殖期に２８～３２℃、好ましくは３０℃±１℃で培養してバチルス属細菌の増殖と糖又は糖源原料の消費をコントロールし、その後、３５～３９℃、好ましくは３７℃±１℃で培養することにより、より効率のよい芽胞形成が実現できる。
さらに培養は好気条件（例えば、酸素濃度１０％以上、好ましくは１５～５０％）で撹拌しつつ行うことが好ましく、培地のｐＨは６．５～８．５が好ましく、７．０～８．０がより好ましい。
なお、上記糖または糖源原料の濃度が50.1g/L～100g/Lである液体培地で培養する前に、前培養を行ってもよい。
このようにして、高い芽胞化率（例えば、５０％以上、好ましくは８０％以上）のバチルス属細菌の菌体やバチルス属細菌の代謝物が得られる。このような高い芽胞化率のバチルス属細菌の菌体やバチルス属細菌の代謝物は、適宜、培地の濃縮または除去、乾燥等の操作を行ったうえで、所望の目的に使用することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例、参考例、比較例で使用した培地の組成を表１に示す。培地成分のうちGlucose、Sucrose、CSLの炭素含量は、それぞれ全糖量の40%重量および全タンパク質量の50%重量として算出した。全糖量は、酸中で100℃、2.5時間加水分解後、ソモギー法にて還元糖濃度として定量した。全タンパク質量はまずケルダール法による全窒素量の定量後、換算係数6.25を乗じることで算出した。
Figure 0007137802000001
参考例1．糖源原料の比較（グルコースおよびスクロース）
500mL容三角フラスコに作成した表1の培地条件1に記載の終濃度となるよう、グルコース（和光純薬）、CSL（ROQUETTE）、MnCl2（和光純薬）、KH2PO4（和光純薬）を含有させた培地をそれぞれ100mlずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合した）。普通寒天平板培地上に生育させたBacillus subtilis MBI-600のコロニーより１白金耳をとって、表1の培地条件1に記載の培地に無菌的に稙菌し、30℃、150rpmで1晩振とう培養を行い、前培養液を得た。
5L容培養槽を用い、表1の培地条件2（試験番号2）および3（試験番号3）に記載の終濃度となるように2Lの培地を2本作成し、オートクレーブ滅菌を行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合し、スクロース（和光純薬）は全ての培地成分と予め混合して滅菌した）。
上記で得られたBacillus subtilis MBI-600の前培養液よりそれぞれ100mlを、5L容培養槽に無菌的に稙菌し、30℃、500rpmの条件で培養を開始し、溶存酸素濃度が10%を下回らぬよう酸素供給量を調整した。溶存酸素濃度とは、単位体積当たりの培養液に溶存している酸素の量を百分率で表した数値であり、これを計測するために例えば、卓上型培養装置（ＭＤＬ－8Ｃ）（株式会社丸菱バイオエンジ社製）等の機器で測定することができる。
34時間培養後、得られた培養液について、滅菌水で希釈したのち、普通ブイヨン寒天培地（栄研化学株式会社）に塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して菌体数を測定した。また、先に調製した希釈液を80℃で30分加熱したのちに同様に普通ブイヨン寒天培地へ塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して耐熱菌数を測定し、これらの結果から芽胞形成率を算出した。その結果を表2に示す。
Figure 0007137802000002
本培養試験において、炭素源としてグルコースを使用し、窒素源と別に滅菌した培地と炭素源としてスクロースを使用し窒素源と同時に滅菌した培地でBacillus subtilis MBI-600を培養した際、耐熱菌数に大きな差は認められなかった。
実施例１．流加培養法による培養での菌数の比較
500mL容三角フラスコに作成した表1の培地条件1に記載の終濃度となるよう調整した培地をそれぞれ100mlずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合した）。これに対し普通寒天平板培地上に生育させたBacillus subtilis MBI-600のコロニーより１白金耳をとって無菌的に稙菌し、30℃、150rpmで1晩振とう培養を行い、前培養液を得た。
5L容培養槽を用い、表1の培地条件3に記載の終濃度となるように2Lの培地を2本作成し、オートクレーブ滅菌を行った（全ての培地成分は予め混合してオートクレーブ滅菌した）。
500mL容デュラン瓶を用い表1の培地条件4に記載の終濃度となるように0.4Lの培地を1本作成した。これを培地条件3の培地が入った5L容培養槽に流加できるように予めチューブで接続し、オートクレーブを行った（全ての培地成分は予め混合してオートクレーブ滅菌した）。
得られた前培養液よりそれぞれ100mlを、上記2Lの培地を含む5L容培養槽に無菌的に稙菌し、37℃の条件で培養を開始した。培養開始から5時間後に、5L容培養槽のうちの一方に培地条件4の培地を2時間毎に100mLずつ4回に分けて添加した。添加を開始してから培養温度を30℃に下げて培養した。この際、培養液中の溶存酸素濃度が10%を下回らぬよう回転数をコントロールし酸素供給量を調整した。酸素消費速度は培養開始約8 時間後に最大となった。培養開始から24時間経過後、培養温度を37℃に上げて培養した。
34時間培養後、得られた培養液について、滅菌水で希釈したのち、普通ブイヨン寒天培地に塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して菌体数を測定した。また、先に調製した希釈液を80℃で30分加熱したのちに同様に普通ブイヨン寒天培地へ塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して耐熱菌数を測定し、これらの結果から芽胞形成率を算出した。その結果を表3に示す。
Figure 0007137802000003
本培養試験において、炭素源としてスクロースを用い、全培地成分を同時滅菌した培地で流加培養したBacillus subtilisの菌濃度は、流加培養しなかったものと比べおおよそ1.5倍の菌濃度の増加が認められ、耐熱芽胞も増加した。
実施例２．還元糖または非還元糖を同時滅菌した培地を用いた培養試験
500mL容三角フラスコに表1の培地条件1に記載の終濃度となるよう調整した培地を100mlずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合した）。これに対し普通寒天平板培地上に生育させたBacillus subtilis MBI-600のコロニーより１白金耳をとって無菌的に稙菌し、30℃、150rpmで1晩振とう培養を行い、前培養液を得た。
5L容培養槽に、表1の培地条件2および3に記載の終濃度となるようにそれぞれ調整した培地を2Lずつ作成した（グルコースおよびスクロースは全ての培地成分と予め混合して滅菌した）。
500mL容デュラン瓶を用い、表1の培地条件4および5に記載の終濃度となるようにそれぞれ調整した培地を0.4Lずつ作成した。培地条件4の培地は培地条件2の成分が入った5L容培養槽へ、培地条件5の培地は培地条件3の成分が入った5L容培養槽へ流加できるように予めチューブで接続し、オートクレーブを行った（グルコースおよびスクロースは全ての培地成分と予め混合して滅菌した）。
得られた前培養液よりそれぞれ100mlを、上記2Lの培地を含む5L容培養槽に無菌的に稙菌し、37℃の条件で培養を開始した。培養開始から5時間後に、培地条件3の培地には培地条件4を、培地条件2の培地には培地条件5の培地を2時間毎に100mLずつ4回に分けて添加した。添加を開始してから培養温度を30℃に下げて培養した。この際、培養液中の溶存酸素濃度が10%を下回らぬよう回転数をコントロールし酸素供給量を調整した。流加を開始した時、培地条件2で培養した培養液のグルコース濃度は40g/Lを下回っており、また、酸素消費速度は培養開始約8 時間後に最大となった。培養開始から24時間経過後、培養温度を37℃に上げて培養した。
34時間培養後、得られた培養液について、滅菌水で希釈したのち、普通ブイヨン寒天培地に塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して菌体数を測定した。また、先に調製した希釈液を80℃で30分加熱したのちに同様に普通ブイヨン寒天培地へ塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して耐熱菌数を測定し、これらの結果から芽胞形成率を算出した。その結果を表4に示す。
Figure 0007137802000004
本培養試験において、炭素源としてグルコースを用い、全培地成分を同時滅菌した培地で流加培養したBacillus subtilisの菌濃度は、炭素源としてスクロースを用いて流加培養したものと比べて得られる耐熱芽胞菌数は少なかった。
実施例３．Bacillus thuringiensisの流加培養試験
500mL容三角フラスコに表1の培地条件1に記載の終濃度となるよう調整した培地を100mlずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合した）。これに対し普通寒天平板培地上に生育させたBacillus thuringiensis NBRC 101235のコロニーより１白金耳をとって無菌的に稙菌し、30℃、150rpmで1晩振とう培養を行い、前培養液を得た。
5L容培養槽に、表1の培地条件2に記載の終濃度となるように調整した培地を2Lずつ合計３本作成した（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合した）。
500mL容デュラン瓶を用い、表1の培地条件4および5に記載の終濃度となるようにそれぞれ調整した培地を0.4Lずつ作成した。培地条件4および5の培地は培地条件2の成分が入ったそれぞれの5L容培養槽へ流加できるように予めチューブで接続し、オートクレーブを行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合し、スクロースは全ての培地成分と予め混合して滅菌した）。また、流加培養を行わない培地条件2の培地をコントロールとした。
得られた前培養液よりそれぞれ100mlを、上記2Lの培地を含む5L容培養槽に無菌的に稙菌し、37℃の条件で培養を開始した。培養開始から6時間後に、5L容培養槽のうちの2本にそれぞれ培地条件4または培地条件5の培地を2時間毎に100mLずつ、4回に分けてそれぞれ添加した。添加を開始してから培養温度を30℃に下げて培養した。この際、培養液中の溶存酸素濃度が10%を下回らぬよう回転数をコントロールして酸素供給量を調整するとともに、それぞれの発酵槽に10%塩酸水溶液および2M水酸化ナトリウム溶液を添加して培養中の培養液のpHが6.7～7.3となるように調節した。流加を開始した時、培地条件2で培養した培養液のグルコース濃度は40g/Lを下回っており、また、酸素消費速度は培養開始約8時間後に最大となった。培養開始から24時間経過後、培養温度を37℃に上げて培養した。
34時間培養後、得られた培養液について、滅菌水で希釈したのち、普通ブイヨン寒天培地に塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して菌体数を測定した。また、先に調製した希釈液を80℃で30分加熱したのちに同様に普通ブイヨン寒天培地へ塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して耐熱菌数を測定し、これらの結果から芽胞形成率を算出した。その結果を表5に示す。
Figure 0007137802000005
本培養試験において、Bacillus thuringiensisに対して流加培養を行うことで、流加を行わなかった条件に比べ多くの耐熱芽胞が得られた。また、還元糖であるグルコースよりも非還元糖であるスクロースを含む培地を流加した方がより多くの耐熱芽胞が得られた。
比較例１．炭素源のみの流加培養
500mL容三角フラスコに作成した表1の培地条件1に記載の終濃度となるよう調整した培地をそれぞれ100mlずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合した）。これに対し普通寒天平板培地上に生育させたBacillus subtilis MBI-600のコロニーより１白金耳をとって無菌的に稙菌し、30℃、150rpmで1晩振とう培養を行い、前培養液を得た。
5L容培養槽を用い、表1の培地条件2に記載の終濃度となるように2Lの培地を作成し、オートクレーブ滅菌を行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合した）。
500mL容デュラン瓶を用いグルコースを125g/Lの終濃度となるように0.4Lの培地を1本作成した。これを培地条件2の培地が入った5L容培養槽に流加できるように予めチューブで接続し、オートクレーブを行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合した）。
得られた前培養液100mlを、上記培地に無菌的に稙菌し、37℃の条件で培養を開始した。培養開始から5時間後にグルコース溶液を2時間毎に100mLずつ4回に分けて添加した。添加を開始してから培養温度を30℃に下げて培養した。この際、培養液中の溶存酸素濃度が10%を下回らぬよう回転数をコントロールし酸素供給量を調整した。流加を開始した時、培地条件2で培養した培養液のグルコース濃度は40g/Lを下回っており、また、酸素消費速度は培養開始約8時間後に最大となった。培養開始から24時間経過後、培養温度を37℃に上げて培養した。
34時間培養後、得られた培養液について、滅菌水で希釈したのち、普通ブイヨン寒天培地に塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して菌体数を測定した。また、先に調製した希釈液を80℃で30分加熱したのちに同様に普通ブイヨン寒天培地へ塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して耐熱菌数を測定し、これらの結果から芽胞形成率を算出した。その結果を表６に示す。
Figure 0007137802000006
本培養試験において、炭素源であるグルコースのみを流加したBacillus subtilisの菌濃度は、炭素源と窒素源を同時に含む培地を用いて流加培養した時（表４の２＋５）に比べて、得られる芽胞濃度が低くなることがわかった。
実施例４．流加培養法による培養でのイツリン量の比較
500mL容三角フラスコに作成した表1の培地条件1に記載の終濃度となるよう調整した培地をそれぞれ100mlずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った（グルコースは別途滅菌の上無菌的に混合した）。これに対し普通寒天平板培地上に生育させたBacillus subtilis MBI-600のコロニーより１白金耳をとって無菌的に稙菌し、30℃、150rpmで1晩振とう培養を行い、前培養液を得た。
5L容培養槽を用い、表1の培地条件2に記載の終濃度となるように2Lの培地を2本作成し、オートクレーブ滅菌を行った（全ての培地成分は予め混合してオートクレーブ滅菌した）。
500mL容デュラン瓶を用い表1の培地条件4に記載の終濃度となるように0.4Lの培地を1本作成した。これを培地条件2の培地が入った5L容培養槽に流加できるように予めチューブで接続し、オートクレーブを行った（全ての培地成分は予め混合してオートクレーブ滅菌した）。
得られた前培養液よりそれぞれ100mlを、上記培地条件2の培地2Lを含む5L容培養槽に無菌的に稙菌し、30℃の条件で培養を開始した。培養開始から5時間後に、5L容培養槽のうちの一方に培地条件4の培地を2時間毎に100mLずつ4回に分けて添加し、培養を継続した。この際、培養液中の溶存酸素濃度が10%を下回らぬよう回転数をコントロールし酸素供給量を調整した。酸素消費速度は培養開始約12 時間後に最大となった。
54時間培養後、得られた培養液について、滅菌水で希釈したのち、普通ブイヨン寒天培地に塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して菌体数を測定した。また、先に調製した希釈液を80℃で30分加熱したのちに同様に普通ブイヨン寒天培地へ塗布して37℃で1晩静置培養し、形成されたコロニー数を計測して耐熱菌数を測定し、これらの結果から芽胞形成率を算出した。その結果を表７に示す。
また得られた培養液について、冷却遠心機（株式会社トミー精工 MX-307）を用い、10,000rpm、20℃、30分遠心分離を行い、上清を回収した。
固相抽出カラム（日本ウォーターズ株式会社 Oasis HLB 3cc(400mg)LP Extraction Cartridge）に0.1%TFA含有アセトニトリル6mLを加えて通過させたのち、0.1%TFA含有蒸留水6mLを加えて通過させた。回収した培養液遠心上清2mLを加えて通過させ、0.1%TFA含有蒸留水6mL、0.1%TFA含有アセトニトリル/蒸留水（20:80, v/v）6mLを順次通過させて洗浄した。次に0.1%TFA含有アセトニトリル/蒸留水（90:10, v/v）5mLを通過させ、溶出液を回収した。回収液が5mLとなるよう0.1%TFA含有アセトニトリル/蒸留水（90:10, v/v）を加え、以下の条件でHPLC分析を行った。
HPLC： アジレント・テクノロジー株式会社 1260 Infinity
カラム： 日本ウォーターズ株式会社 XBridge C18 5μm 4.6 x 250mm
移動相： A：0.1%TFA含有蒸留水、B：0.1%TFA含有アセトニトリル
0～3分 A 80%/B 20%
3～12分 A 80%/B 20% → B 100%
12～23分 B 100%
23～27分 B 100% → A 80%/B 20%
27～30分 A 80%/B 20%
流量： 1mL/分
温度： 40℃
検出： UV205nm
注入量： 10μL
標品： Iturin A from Bacillus subtilis（Merck）
濃度： 30ppm、120ppm
溶媒： 0.1%TFA含有アセトニトリル/蒸留水（90:10, v/v）
溶出時間12.1分および12.7分に検出されたピーク面積について、標品との比較から、培養液中のイツリン濃度を算出した。
結果を表７に示す。
Figure 0007137802000007
本培養試験において、流加培養したBacillus subtilisの菌濃度は、流加培養しなかったものと比べ、菌濃度はおおよそ1.8倍、イツリン濃度はおおよそ2.1倍への増加が認められ、耐熱芽胞も増加した。

Claims (11)

  1. 培養開始時の糖の濃度が50.1g/L～100g/Lである液体培地でバチルス属細菌を培養し、培
    養途中で、糖および含窒素化合物を含み、炭素原子と窒素原子の重量比（C/N比）が5.5～13.5である流加培地を前記液体培地に供給して培養することを特徴とする、バチルス属細菌の芽胞及び／又は環状リポペプチドを得るためのバチルス属細菌の培養方法であって、培養終了時までに、流加前の培地１Ｌあたり、総量で、100g以下の糖が前記流加培地により供給され、
    前記糖が、グルコースおよびスクロースからなる群から選択される少なくとも1種であり
    、
    前記含窒素化合物が、コーン浸漬液及びコーン浸漬液乾燥粉末からなる有機窒素化合物群より少なくとも１種選択される、バチルス属細菌の培養方法。
  2. 炭素原子と窒素原子の重量比（C/N比）が5.5～12である流加培地を前記液体培地に供給して培養することを特徴とする、請求項１に記載のバチルス属細菌の培養方法。
  3. 前記流加培地の供給を、バチルス属細菌の酸素消費速度が最大となる時点の前後７時間の間で行う、請求項１または２に記載のバチルス属細菌の培養法。
  4. 前記流加培地の供給を、培養開始後３時間～３０時間の間で行う、請求項１～３のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の培養方法。
  5. 前記流加培地は糖および含窒素化合物を含む溶液を加熱滅菌して得られたものである、請求項１～４のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の培養方法。
  6. 液体培地の溶存酸素濃度を10％以上に保持することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の培養方法。
  7. 液体培地の温度を20～60℃の間で制御しバチルス属細菌の増殖をコントロールする、請求項１～６のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の培養方法。
  8. バチルス属細菌の対数増殖期に２８～３２℃で培養を行い、その後、３５～３９℃で培養を行う、請求項７に記載のバチルス属細菌の培養方法。
  9. バチルス属細菌がバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケ
    ファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス レンタス（Bacillus lentus）、バチルス ラテロスポルス（Bacillus laterosporus）、バチルス アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）、バチルス・リケニフォル
    ミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス
    ・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィ
    ラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バ
    チルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・サイアメンシス（Bacillus
    siamensis）、バチルス ロータス（Bacillus lautus）、バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バ
    チルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）、バチルス・ピチノティ（Bacillus pichinotyi）、バチルス・アシドカルダリウス
    （Bacillus acidocaldarius）、バチルス・アルカリコラ（Bacillus alkalicola）、バチルス・アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・バタビエンシス（Bacillus bataviensis）、バチルス・シクロヘプタニカス（Bacillus cycloheptanicus）、バチルス・ アネウリニリティカス（Bacillus aneurinilyticus）、バチルス・ミ
    グラヌス（Bacillus migulanus）、バチルス・アビッサリス（Bacillus abyssalis）、バチルス・アエスツアリイ（Bacillus aestuarii）、バチルス・ポリミグザ（Bacillus polymyxa）、またはバチルス・エスピー（Bacillus sp.）からなる群より選択される、請求
    項１～８のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の培養方法。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の培養方法を用いて、前記液体培地中に有用物質を生成させることを特徴とする、バチルス属細菌の芽胞および環状リポペプチドからなる群より選択される有用物質の製造方法。
  11. 前記環状リポペプチドが、イツリン、サーファクチン、プリパスタチン、フェンジシン、バシロマイシン、リチェニシン、クルスタキン、マイコサブチリン、コリスチン、フザリシジン、パエニバクテリン、ポリミキシンおよびピュミラシジンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１０に記載の有用物質の製造方法。
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