CN112029681B - 一种酒糟腐熟专用液态复合菌剂的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酒糟降解技术领域，具体为一种酒糟腐熟专用液态复合菌剂的制备。制备方法步骤如下：S1、分别将贝莱斯芽孢杆菌UN‑5和真菌里氏木霉进行活化培养；S2、一级种子培养；S3、二级种子培养；S4、将S3中所得贝莱斯芽孢杆菌UN‑5二级种子液和里氏木霉的二级种子液分别接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基培养；S5、将贝莱斯芽孢杆菌UN‑5菌剂和里氏木霉菌剂按比例混合培养后制成复合菌剂。该液态复合菌剂属于活菌制剂，提高了菌剂用于酒糟时的纤维素酶活，提高复合菌剂的耐酸性，底物转化效率高，复合菌剂中的细菌和真菌在酒糟腐熟的不同阶段共同作用提高了底物利用率，缩短酒糟腐熟发酵周期，提高产品质量。

Description

一种酒糟腐熟专用液态复合菌剂的制备
技术领域
本发明属于酒糟降解技术领域，具体为一种酒糟腐熟专用液态复合菌剂的制备。
背景技术
酒糟以其独特的固态发酵方式和固态白酒蒸馏生产而出现，而我国酒糟年产量达数千万吨。酒糟中含有粗蛋白质、粗淀粉、粗脂肪、粗纤维(包括木质素、纤维素和半纤维素)、无灰和无氮提取物，除此之外，酒糟中还含有多种酶、有机酸和大量菌体自溶产生的嘌呤、嘧啶和类脂化合物。研究表明，利用酒糟生产生物有机肥，以其独特的优势，可以为农业废弃物和农作物生产搭建一座桥梁，开辟以“酒糟-生物有机肥-农作物”为循环模式的可持续发展道路。然而，由于酒糟酸度高，酒糟粗纤维难以降解，造成酒糟腐熟周期长、腐熟不彻底等问题，导致酒糟利用率低。这不仅是对资源的极大浪费，更会严重污染环境，无法实现对资源的可持续无污染利用。
生物有机肥是特定功能微生物与动植物残体、农作物秸秆等为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。生物有机肥和饲料的原料主要来源于秸秆、豆粕、棉粕、菜籽饼、酒糟、醋糟、木薯渣、糖渣、糠醛渣、锯末、餐厨垃圾、菜市场尾菜等，这些原料中都含有丰富的纤维素。由于纤维素不易被降解利用，因此现阶段国内施用生物有机肥的积极性不高，使用率相对较低。
传统菌剂中所用菌株多为单一菌种的野生菌株，野生菌株存在生长周期长，纤维素酶活性低等问题，而酒糟中含有大量的粗纤维，降解纤维素是由多种酶系共同作用的结果。酒糟在腐熟过程中会经历升温期、高温期和腐熟期，不同阶段的优势菌种不同，传统的单一菌剂无法满足不同阶段的菌种需求，这些因素对酒糟腐熟有很大的影响，使得酒糟腐熟发酵时间较长、腐熟度不够、容易造成制备的有机肥在施用后出现二次发酵，使作物出现烧根的现象。酒糟酸度高，酒糟中的粗纤维难以降解，目前很少有专门应用于酒糟腐熟的复合菌剂，造成酒糟腐熟周期长、腐熟不彻底等问题，导致酒糟利用率低。
酒糟属于特殊的酸性环境，耐酸性差也是当前菌种在酒糟降解和应用方面的瓶颈，因此有必要开发一种热稳定性高且耐酸性好的复合菌剂应用于酒糟降解腐熟方面，解决酒糟腐熟周期长、腐熟不彻底等问题，提高酒糟利用率。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种酒糟腐熟专用液态复合菌剂。该复合菌剂属于活菌制剂，提高了菌剂用于酒糟时的纤维素酶活，提高复合菌剂的耐酸性，底物转化效率高，复合菌剂中的细菌和真菌在酒糟腐熟的不同阶段共同作用提高了底物利用率，缩短酒糟腐熟发酵周期，提高产品质量。
为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：
一株酒糟腐熟专用菌，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌UN-5，于2020年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020236，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，命名为Bacillus velezensis UN-5。
贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌株可以用于制备降解酒糟的复合菌剂。
利用贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌株制备复合菌剂的方法，包括以下具体步骤：
S1、分别将贝莱斯芽孢杆菌UN-5和真菌里氏木霉进行活化培养；
S2、一级种子培养：将S1中活化后长势好、单菌落大的贝莱斯芽孢杆菌UN-5和里氏木霉菌种分别接种于羧甲基纤维素钠液体富集培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，当液体培养菌密度OD540nm值达到0.6～0.8时停止培养，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液；
S3、二级种子培养：取S2所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液再次分别接种于羧甲基纤维素钠液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃、150r/min条件下培养24h，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液；
S4、将S3中所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液分别接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基中，于37℃、150-180r/min高密度发酵培养24h，当每种菌液中有效活菌数超过5×108/mL培养完成，分别得到贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂；
S5、将贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂按比例混合，并在pH 5.0、150r/min条件下培养28h，制成复合菌剂。
作为优选，S5步骤中贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂的体积比为2:1～3:1，更进一步优选按体积比为2.5:1的比例混合。
以上制备方法中采用的培养基为：
PDA培养基：马铃薯20wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5～2wt％，自然pH，121℃灭菌20mi；
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％、琼脂2wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠液体富集培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨0.3wt％，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.03wt％，pH 6.0，121℃灭菌20min；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠发酵培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨1wt％，牛肉膏0.5wt％，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.05wt％，(NH4)2SO4 0.2wt％，pH自然，121℃灭菌20min。
所述复合菌剂中有效活菌数超过109/ml。
采用该复合菌剂制备有机肥的方法，包括以下步骤：
称取一定量的干酒糟或湿酒糟，向酒糟中添加辅助材料后搅拌均匀；将液态复合菌剂喷洒到混合物中，加入尿素和水，再次搅拌后室温条件下发酵14d-16d，得有机肥。过程中需控制酒糟的含水量在46-56wt％之间，若水量含量较多，则将其自然晾干；若水分含量低，则需加水湿润。
所述的辅助材料为粉碎后的花生壳(粒径为60-100目)，粉碎后的花生壳的添加量为酒糟质量的25％，尿素的添加量以酒糟计为1.0g/kg，水的添加量为使发酵物的水分含量为40-50％为宜。
该复合菌剂应用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中，复合菌剂的接入量为2-4wt％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数不少于109/g，有机质含量不少于50％。
上述方法制备得到的复合菌剂高产纤维素酶，最高为150.4U。
本发明的积极效果体现在：
(一)、该液态复合菌剂属于活菌制剂，提高了菌剂用于酒糟时的纤维素酶活，提高复合菌剂的耐酸性，底物转化效率高，复合菌剂中的细菌和真菌在酒糟腐熟的不同阶段共同作用提高了底物利用率，缩短酒糟腐熟发酵周期，提高产品质量。
(二)、该方法制备得到的复合菌剂，其较强的耐酸性质，适用于酒糟这种酸性环境，使纤维素酶酶活性大大提高，缩短酒糟降解时间，有利于酒糟的腐熟，达到资源的可持续发展，解决酒糟对环境的污染问题。
(三)、本专利利用经诱变育种的酒糟降解优势菌种细菌:贝莱斯芽孢杆菌UN-5和里氏木霉复配制备酒糟腐熟专用液态复合菌剂，提高了施用于酒糟腐熟时纤维素酶活及表达量，并使复合菌剂更好的应用于酸性酒糟的降解，提高酒糟利用率。
(四)、复合菌剂中的贝莱斯芽孢杆菌UN-5和真菌里氏木霉复配，为酒糟腐熟过程中不同阶段提供优势菌种；制备的复合菌剂适应用于酸性、中高温环境方面的酒糟再利用。
附图说明：
图1为耐酸性试验结果分析柱状图
图2为单菌种和复合菌剂有效活菌数结果分析柱状图
图3为单菌种和复合菌剂纤维素酶活结果分析柱状图
图4有机肥有效活菌数结果分析柱状图
图5为实施例1中制备得到的液态复合菌剂
具体实施方式
为了使申请的发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
一株酒糟腐熟专用菌，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌UN-5(后简称UN-5)，于2020年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2020236，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，命名为Bacillus velezensis UN-5。
贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌株可以用于制备降解酒糟的复合菌剂。
真菌里氏木霉优选保藏号为CICC 41027的真菌里氏木霉。
利用贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌株制备复合菌剂的方法，包括以下具体步骤：
S1、分别将贝莱斯芽孢杆菌UN-5和真菌里氏木霉进行活化培养；
S2、一级种子培养：将S1中活化后长势好、单菌落大的贝莱斯芽孢杆菌UN-5和里氏木霉菌种分别接种于羧甲基纤维素钠液体富集培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，当液体培养菌密度OD540nm值达到0.6～0.8时停止培养，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液；
S3、二级种子培养：取S2所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液再次分别接种于羧甲基纤维素钠液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃、150r/min条件下培养24h，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液；
S4、将S3中所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液分别接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基中，于37℃、150-180r/min高密度发酵培养24h，当每种菌液中有效活菌数超过5×108/mL培养完成，分别得到贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂；
S5、将贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂按比例混合，并在pH 5.0、150r/min条件下培养28h，制成复合菌剂。
作为优选，S5步骤中贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂的体积比为2:1～3:1，更进一步优选按体积比为2.5:1的比例混合。
以上制备方法中采用的培养基为：
PDA培养基：马铃薯20wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5～2wt％，自然pH，121℃灭菌20mi；
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％、琼脂2wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠液体富集培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨0.3wt％，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.03wt％，pH 6.0，121℃灭菌20min；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠发酵培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨1wt％，牛肉膏0.5wt％，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.05wt％，(NH4)2SO4 0.2wt％，pH自然，121℃灭菌20min。
所述复合菌剂中有效活菌数超过109/ml。该复合菌剂应用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中，复合菌剂的接入量为2-4wt％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数不少于109/g，有机质含量不少于50％。
实施例1：
利用具体实施方式中的酒糟腐熟专用菌贝莱斯芽孢杆菌UN-5制备酒糟腐熟专用液态复合菌剂的方法，包括以下具体步骤：
S1、分别将贝莱斯芽孢杆菌UN-5和真菌里氏木霉进行活化培养；
S2、一级种子培养：将S1中活化后长势好、单菌落大的贝莱斯芽孢杆菌UN-5和里氏木霉菌种分别接种于羧甲基纤维素钠液体富集培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，当液体培养菌密度OD540nm值达到0.6时停止培养，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液；
S3、二级种子培养：取S2所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液再次分别接种于羧甲基纤维素钠液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃、150r/min条件下培养24h，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液；
S4、将S3中所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液分别接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基中，于37℃、150r/min高密度发酵培养24h，分别得到贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂；
S5、将贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂按体积比为2.5:1的比例混合，并在pH 5.0、150r/min条件下培养28h，制成复合菌剂。
PDA培养基：马铃薯20wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5wt％，自然pH，121℃灭菌20mi；
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％、琼脂2wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠液体富集培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨0.3wt％，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.03wt％，pH 6.0，121℃灭菌20min；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠发酵培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨1wt％，牛肉膏0.5wt％，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.05wt％，(NH4)2SO4 0.2wt％，pH自然，121℃灭菌20min。
所述复合菌剂中有效活菌数超过109/ml。该复合菌剂用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中，具体步骤为：称取一定量宜宾XX白酒生产企业的生产白酒后的废弃物湿酒糟50kg(控制湿酒糟的含水量为50±2wt％，若超过50wt％，即将其自然干燥使含水量控制在范围内，湿酒糟的原始pH值为5.0)，向酒糟中添加粉碎后的花生壳12.5kg，搅拌均匀。将制备得到的液态复合菌剂喷洒到酒糟与花生壳的混合物中，然后添加尿素，再次搅拌后发酵15d得有机肥。复合菌剂的接入量为2.5wt％(以酒糟的质量计)，尿素的添加量为1.0g/kg，控制C/N为26，制得的有机肥中有机质含量为59.35％。有机质的测定方法参照国标NY 525—2012中5.2进行。
实施例2：
利用具体实施方式中的酒糟腐熟专用菌贝莱斯芽孢杆菌UN-5制备复合菌剂的方法，包括以下具体步骤：
S1、分别将贝莱斯芽孢杆菌UN-5和真菌里氏木霉进行活化培养；
S2、一级种子培养：将S1中活化后长势好、单菌落大的贝莱斯芽孢杆菌UN-5和里氏木霉菌种分别接种于羧甲基纤维素钠液体富集培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，当液体培养菌密度OD540nm值达到0.8时停止培养，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液；
S3、二级种子培养：取S2所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液再次分别接种于羧甲基纤维素钠液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃、150r/min条件下培养24h，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液；
S4、将S3中所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液分别接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基中，于37℃、180r/min高密度发酵培养24h，分别得到贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂；
S5、将贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂按体积比为2.5:1的比例混合，并在pH 5.0、150r/min条件下培养28h，制成复合菌剂。
PDA培养基：马铃薯20wt％，葡萄糖2wt％，琼脂2wt％，自然pH，121℃灭菌20mi；
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％、琼脂2wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠液体富集培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨0.3wt％，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.03wt％，pH 6.0，121℃灭菌20min；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠发酵培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨1wt％，牛肉膏0.5wt％，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.05wt％，(NH4)2SO4 0.2wt％，pH自然，121℃灭菌20min。
所述复合菌剂中有效活菌数超过109/ml。该复合菌剂应用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中(制备步骤同实施例1)，复合菌剂的接入量为3wt％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数不少于109/g，有机质含量不少于50％。
实施例3：
利用具体实施方式中的酒糟腐熟专用菌贝莱斯芽孢杆菌UN-5制备复合菌剂的方法，包括以下具体步骤：
S1、分别将贝莱斯芽孢杆菌UN-5和真菌里氏木霉进行活化培养；
S2、一级种子培养：将S1中活化后长势好、单菌落大的贝莱斯芽孢杆菌UN-5和里氏木霉菌种分别接种于羧甲基纤维素钠液体富集培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，当液体培养菌密度OD540nm值达到0.7时停止培养，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液；
S3、二级种子培养：取S2所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液再次分别接种于羧甲基纤维素钠液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃、150r/min条件下培养24h，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液；
S4、将S3中所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液分别接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基中，于37℃、160r/min高密度发酵培养24h，分别得到贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂；
S5、将贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂按体积比为2.5:1的比例混合，并在pH 5.0、150r/min条件下培养28h，制成复合菌剂。
PDA培养基：马铃薯20wt％，葡萄糖2wt％，琼脂2wt％，自然pH，121℃灭菌20mi；
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％、琼脂2wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠液体富集培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨0.3wt％，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.03wt％，pH 6.0，121℃灭菌20min；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠发酵培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨1wt％，牛肉膏0.5wt％，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.05wt％，(NH4)2SO4 0.2wt％，pH自然，121℃灭菌20min。
所述复合菌剂中有效活菌数超过109/ml。该复合菌剂应用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中(制备步骤同实施例1)，复合菌剂的接入量为4wt％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数不少于109/g，有机质含量不少于50％。
若将该实施例中的复合菌剂用于干酒糟中腐熟制备有机肥的步骤中(制备步骤仍同实施例1)，只需将干酒糟加水湿润至规定含水量即可。
对比例1：
采用与实施例1同样的方法进行复合菌剂的制备，仅将芽孢杆菌(CICC10829)替换实施例1中的贝莱斯芽孢杆菌UN-5。
制备得到的复合菌剂中有效活菌数108-0.8×109/ml。该复合菌剂应用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中，复合菌剂的接入量为2wt％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数少于109/g，有机质含量40-42％。
对比例2：
采用与实施例1同样的方法进行复合菌剂的制备，仅改变S5步骤中的培养条件。
S5、将芽孢杆菌菌剂和里氏木霉菌剂按体积比为3:1的比例混合，在pH 7.0、150r/min条件下培养24h，制成复合菌剂。
制备得到的复合菌剂中有效活菌数108-0.8×109/ml。该复合菌剂应用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中，复合菌剂的接入量为2wt％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数少于109/g，有机质含量40-42％。
对比例3：
采用与实施例1同样的方法进行复合菌剂的制备，仅改变培养基。
PDA培养基：马铃薯20wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5wt％，自然pH，121℃灭菌20mi；
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％、琼脂2wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠液体富集培养基：CMC-Na 0.5wt％，蛋白胨0.2wt％，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.05wt％，自然pH，121℃灭菌20min；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.2wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％，自然pH，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠发酵培养基：CMC-Na 0.5wt％，蛋白胨1.5wt％，牛肉膏0.2wt％，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 0.05wt％，(NH4)2SO4 0.2wt％，自然pH，121℃灭菌20min。
制备得到的复合菌剂中有效活菌数少于109/ml。该复合菌剂应用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中，复合菌剂的接入量为2wt％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数少于109/g，有机质含量少于42％。
对比例4：
采用与实施例1同样的方法进行复合菌剂的制备，仅多添加一个菌种，即将贝莱斯芽孢杆菌UN-5和真菌里氏木霉改为贝莱斯芽孢杆菌UN-5、芽孢杆菌(CICC 10829)和真菌里氏木霉一起制备复合菌剂。
制备得到的复合菌剂中有效活菌数超过108/ml。该复合菌剂应用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中，复合菌剂的接入量为3wt％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数不少于108/g，有机质含量为40％左右。
实验1：
1、拮抗作用测定
采用平板对峙法，将UN-5和里氏木霉菌悬液两两交叉划线接种于羧甲基纤维素钠培养基上，37℃恒温培养2d，培养基上两株菌十字交叉处未出现由菌落缩小或消失的现象，说明两株菌不存在拮抗作用。
2、耐酸性测定
分别配置不同pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)的羧甲基纤维素钠培养基，取5mL待测菌悬液分别接种于羧甲基纤维素钠培养基上，37℃恒温培养24小时。在540nm下用紫外分光光度计测定培养前、后的OD540nm值，以培养前、后的OD540nm之差表示菌种的耐酸性(差值越大说明耐酸性越强)，结果表明两株菌耐酸性都较好，适用于酒糟腐熟。
4、有效活菌数的测定
将菌悬液用10倍梯度稀释法稀释至10-10，取10-9、10-8和10-7梯度0.1mL分别涂布于羧甲基纤维素钠培养基，每个浓度做3个平行，与涂布无菌水的平板对比(复合菌剂的有效活菌数以数量级最大的表示)。复合菌剂有效活菌数达到10.3-12.4×108/ml。
实验2：
一、复合菌剂制备条件
分别制备菌株UN-5和里氏木霉菌悬液。
1、菌种配比对菌剂酶活的影响：
制备单菌种菌液，分别取120ml和120ml、80ml和160ml、60ml和180ml、160ml和80ml、180ml和60ml的UN-5与里氏木霉菌液，按1:1、1:2、1:3、2:1和3:1比例混合，37℃、150r/min条件下培养2d，用DNS法测定复合菌剂纤维素酶活，最佳配比在2:1～3:1。
2、培养基pH对菌剂酶活的影响：
调整发酵培养基的pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，取UN-5菌液160ml和里氏木霉菌液80ml按体积2:1比例混合，于37℃、150r/min条件下培养2d，取混合菌液，用DNS法测定复合菌剂纤维素酶活，得到最佳培养pH在4.0～5.0之间。
3、培养时间对酶活的影响：
制备单菌种菌悬液，取UN-5菌液160ml和里氏木霉菌液80ml按2:1比例混合，于37℃、150r/min条件下分别培养12h、24h、36h、48h和60h，用DNS法测定纤维素酶活，得到最佳培养时间范围在24～32h。
三、复合菌剂的制备条件优化
根据单因素试验结果和相关文献，菌种配比、培养基pH和培养时间对复合菌剂纤维素酶活影响较大，根据正交试验原理，在单因素试验基础上试验选择菌种配比、培养基pH和培养时间为自变量，以复合菌剂的纤维素酶活为指标，采用SPSS19.0数据处理***对正交实验数据进行一般线性模型分析，得到最佳制备条件：配比2.5:1、培养pH 5.0和培养时间28h。
四、液态复合菌剂制备
一种用于酒糟腐熟专用液态复合微生物菌剂，包括UN-5和里氏木霉。
所述UN-5为实验室诱变选育出的贝莱斯芽孢杆菌；里氏木霉为CICC 41027。
酒糟腐熟专用液态复合微生物菌剂的制备方法如下：
(1)固体斜面培养：选取高产纤维素酶的细菌UN-5和真菌里氏木霉，将UN-5和里氏木霉分别接种于PDA养基和牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养2d，使菌株充分活化；
(2)一级种子培养：将步骤(1)中活化后长势好、单菌落大的UN-5菌种和里氏木霉菌种分别接种于羧甲基纤维素钠液体富集培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、150r/min条件下培养，在波长540nm下每4小时测定菌体浓度，当液体培养菌密度OD540nm值达到0.6～0.8时停止培养，分别获得一级种子液；
(3)二级种子培养：取步骤(2)所得UN-5和里氏木霉的一级种子液12.5-25ml，按5-10％的接种量分别接种于250ml羧甲基纤维素钠液体培养基和250ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃、150r/min条件下培养24h，分别获得二级种子液；
(4)将步骤(3)中所得UN-5、和里氏木霉的二级种子液按10％的接种量，取25ml以及种子液分别接种于250ml羧甲基纤维素钠发酵培养基中，37℃、150-180r/min高密度发酵培养24h，得到菌剂A和B；其中，菌剂A为UN-5菌剂，菌剂B为里氏木霉菌剂；
(5)将菌剂A 250ml和菌剂B 100ml按2.5:1的比例混合培养，在pH 5.0、150r/min条件下培养28h，复配制成适合酒糟环境的酒糟腐熟专用腐熟剂。
(6)保存条件：制备好的酒糟腐熟专用腐熟剂2-8℃保存7-12天。
(7)方案所用培养基：
PDA培养基：马铃薯20wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5～2wt％，自然pH，121℃灭菌20mi；
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％、琼脂2wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠液体富集培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨0.3wt％，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.03wt％，pH 6.0，121℃灭菌20min；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠发酵培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨1wt％，牛肉膏0.5wt％，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.05wt％，(NH4)2SO4 0.2wt％，pH自然，121℃灭菌20min。
(8)所述复合菌剂有效活菌数超过109/ml，所述复合菌剂应用于酒糟腐熟制备有机肥中，复合菌剂接入量为2-4％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数不少于109/g，有机质含量不少于50％。
(9)菌液中菌体浓度采用光电比浊法测定：吸取2mL菌液，在波长540nm条件下测定OD540nm值。
(10)纤维素酶活的测定采用DNS法：吸取2mL菌液，12 000r/min离心5min，取上清液，即为粗酶液取0.5mL粗酶液，加入1.5mL 1％CMC缓冲液，50℃水浴30min，加入3mL DNS溶液，沸水浴10min，迅速冷却后定容至10mL。对照组加0.5mL灭活的粗酶液代替粗酶液，其他条件不变，540nm波长条件下测定OD540nm值。酶活计算公式H＝D·V1·C/(T·V2)计算菌株纤维素酶活，纤维素酶活以U即IU/mL表示。
实验2：
1、鲜酒糟与干酒糟的成分对比
鲜酒糟初始pH 3.52，如表1所示，鲜酒糟中主要含有水分、无氮浸出物和粗纤维等，干酒糟中主要含有无氮浸出物、粗纤维、粗蛋白、粗淀粉等。
表1鲜酒糟与干酒糟的成分对比
Figure GDA0002752459180000171
(2)、耐酸性对比
采用本方法制备的复合菌剂中使用的两株菌种在pH 3.0条件下仍能生长，而传统菌剂中的菌种在pH为4.0的环境中才能正常生长且长势比UN-5和里氏木霉弱，此复合菌剂中使用的两株菌种耐酸性想较于传统菌剂中使用的菌种更强。具体见图1。
由图1可知，UN-5菌株比里氏木霉的耐酸性更强，在pH 2.0时仍能生长，而里氏木霉对强酸较敏感，在pH 2.0时不能正常生长。在两株菌在低pH下虽仍能生长，但相较于pH较高酸性较弱的环境中生长明显受到了抑制。传统活菌制剂中的菌种在pH为4.0情况下才开始缓慢生长且在酸性条件下长势均未复合菌剂中两株菌种好。原始酒糟的pH在3.0-4.0左右，通过耐酸性试验表明UN-5和里氏木霉由较强的耐酸性，适合投用到酒糟的腐熟发酵中。
(3)、有效活菌数比较
将UN-5和里氏木霉菌液按2.5:1(UN-5:里氏木霉)的配比混合，在pH 5.0条件下培养28h得到复合菌剂即酒糟腐熟专用液态复合菌剂有效活菌数大大提高，结果见图2。
如图2所示，UN-5的有效活菌数得到了12.5亿/g，由于里氏木霉是霉菌单个菌体的较大，同体积内的有效活菌数较UN-5少，因此导致制成的复合菌剂中有效活菌数只有10.3亿/g，传统单一菌剂的有效活菌数为3.1亿/g，复合菌剂中的有效活菌数时传统单一菌剂中的4.03倍
(4)、单菌种与复合菌剂纤维素酶活对比
经优化制备条件后制得的复合菌剂纤维素酶活与传统菌剂比提高较大，结果见图3。
如图3所示，制备的复合菌剂的纤维素酶活最高达到了150.4U，高于UN-5和里氏木霉的单菌种纤维素酶活，传统菌剂的纤维素酶活只有34.6U，复合菌剂的酶活比传统菌剂提高了3.35倍，说明复合菌剂的纤维素酶活提高较大。
(5)使用复合菌剂制备酒糟生物有机肥有效活菌数对比
酒糟施用液态复合菌剂腐熟发酵后的有机肥中有效活菌数比施用传统单一菌剂的有机肥提高了5.94倍。结果见图4
如图4所示，施用复合菌剂后酒糟腐熟堆肥制得的有机肥有效活菌数达到了12.5亿/g，远超过了施用单菌种UN-5和里氏木霉的6.1和2.6亿/g，而施用传统菌剂的酒糟腐熟后有效活菌数数仅有1.8亿/g。说明复合菌剂用于酒糟腐熟制备的生物有机肥中有效活菌数较高，对酒糟的腐熟发酵制成的有机肥肥效有提高作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酒糟腐熟专用液态复合菌剂，其特征在于：该液态复合菌剂包括贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂，所述贝莱斯芽孢杆菌UN-5，分类命名为Bacillus velezensisUN-5，于2020年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020236。
2.如权利要求1所述液态复合菌剂的应用，其特征在于：该菌剂用于降解酒糟。
3.如权利要求1所述菌株进行复合菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、分别将贝莱斯芽孢杆菌UN-5和真菌里氏木霉进行活化培养；
S2、一级种子培养：将S1中活化后长势好、单菌落大的贝莱斯芽孢杆菌UN-5和里氏木霉菌种分别接种于羧甲基纤维素钠液体富集培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，当液体培养菌密度OD540nm值达到0.6～0.8时停止培养，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液；
S3、二级种子培养：取S2所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5一级种子液和里氏木霉的一级种子液再次分别接种于羧甲基纤维素钠液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃、150r/min条件下培养24h，分别获得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液；
S4、将S3中所得贝莱斯芽孢杆菌UN-5二级种子液和里氏木霉的二级种子液分别接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基中，于37℃、150-180r/min高密度发酵培养24h，分别得到贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂；
S5、将贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂按比例混合，并在pH 5.0、150r/min条件下培养28h，制成复合菌剂。
4.如权利要求3所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％、琼脂2wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠液体富集培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨0.3wt％，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.03wt％，pH 6.0，121℃灭菌20min；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.3wt％、蛋白胨1wt％、NaCl 0.5wt％，pH为7.0，121℃灭菌20min；
羧甲基纤维素钠发酵培养基：CMC-Na 1wt％，蛋白胨1wt％，牛肉膏0.5wt％，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 0.05wt％，(NH4)2SO4 0.2wt％，pH自然，121℃灭菌20min。
5.如权利要求3所述复合菌剂的制备方法，其特征在于：S5步骤中，贝莱斯芽孢杆菌UN-5菌剂和里氏木霉菌剂按体积比为2.5:1的比例混合。
6.如权利要求3所述复合菌剂的制备方法，其特征在于：制备得到的复合菌剂中有效活菌数超过109/ml。
7.如权利要求3所述方法制备得到的复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂用于酒糟腐熟制备有机肥的步骤中，复合菌剂的接入量为2-4wt％，加入复合菌剂制得的有机肥有效活菌数不少于109/g，有机质含量不少于50％。
8.采用如权利要求7所述复合菌剂制备有机肥的方法，其特征在于包括以下步骤：称取一定量的干酒糟或湿酒糟，向酒糟中添加辅助材料后搅拌均匀；将液态复合菌剂喷洒到混合物中，加入尿素和水，再次搅拌后室温条件下发酵14d-16d，得有机肥。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的辅助材料为粉碎后的花生壳，粉碎后的花生壳的添加量为酒糟质量的25％，尿素的添加量为1.0g/kg，水的添加量为使发酵物的水分含量为40-50％。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述干酒糟或湿酒糟的含水量控制在46-56wt％。
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